CN101392034B - 一种葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束由葡聚糖和磷脂酰乙醇胺组装而成；制备步骤：活化的葡聚糖干粉分散于N，N-二甲基甲酰胺；磷脂酰乙醇胺氯仿加三乙胺中，再加至活化葡聚糖分散液中，氩气下室温搅拌过滤除杂，减压真空蒸发得液态葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物粗产物；粗产物在柠檬酸钠缓冲液中透析除N，N-二甲基甲酰胺，冷冻干燥，再以甲醇/盐酸溶液流动相进行反向液相色谱纯化，减压真空蒸发除流动相，冷冻干燥纯化所得葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物干粉溶于N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下滴加离子水，透析袋中进行透析，得葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束。本方法条件温和，操作简单，原料易得，重复性实用性强，广泛适用于药物载体。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域的聚合物胶束及其制备方法，具体涉及一种葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束及其制备方法。
背景技术
多糖类高分子聚合物在自然界中蕴藏量大，广泛分布于动植物和微生物中，来源丰富，种类繁多，价格低廉。作为药物的载体材料，多糖具有性质稳定、安全无毒、具有很好的生物可降解性和生物相容性以及容易在其结构上进行化学或者生化方面的调整等优点。
近年来亲水性多糖已发展成为极有前景的药物载体，它可使大分子顺利通过上皮组织，增强黏膜药物的生物利用度(Gautrot JE，Zhu XX，Journal of biomaterialsscience-polymer edition 17(10)：1123-1139 2006；.Janes，K.A.，Calvo，P.，Alonso，M.J.Polysaccharide colloidal particles as delivery systems for macromolecules.Advanced DrugDelivery Review，，47，83-97，2001)。葡聚糖是具有线状主链的一类多糖，主要可以被霉菌等降解，是一种常用的多糖类药物制剂材料，具有很好的生物可降解性和生物相容性以及容易在其结构上进行化学或者生化方面的调整等特点(Casadei MA，Cerreto F，Cesa S，Giannuzzo M，Feeney M，Marianecci C，Paolicelli P，International journal of pharmaceutics325(1-2)：140-146 NOV 15 2006；Hennink WE，De Jong SJ，Bos GW，Veldhuis TFJ，vanNostrum CF，International journal of pharmaceutics 277(1-2)：99-104 JUN 11 2004；Tiyaboonchai W，Woiszwillo J，Sims RC， Middaugh CR，International journal ofpharmaceutics 255(1-2)：139-151 APR 14 2003；Iskakov RM，Kikuchi A，Okano T，Journal ofcontrolled release(1-3)： 57-68APR 23 2002；)，它广泛应用于药物载体和医用材料中。磷脂酰乙醇胺是磷脂质的一种，亦曾称脑磷酯(Kepha-lin)。在生物界所存在的磷脂中，磷脂酰乙醇胺的含量仅次于卵磷酯，在大肠菌中，其约占总磷脂的80％。组成脂肪酸因生物不同而异，在微生物和卵黄中的，构成的饱和脂肪酸比动物组织中多。在生物界还存在着含有单甲基乙醇胺、二甲基乙醇胺的衍生物。这些都通过S-腺苷甲硫氨酸使磷脂酰乙醇胺甲基化而形成的，研究表明在微生物中，磷脂酰乙醇胺是通过磷酯酰丝氨酸的脱羧作用形成的。在动物中，它是通过胞苷二磷酸乙醇胺和1，2-甘油二酯的反应生成的。通过磷酯酶A的作用生成溶血磷脂酰乙醇胺。
众所周知，如果聚合物中同时具有亲水和疏水两部分组成，那么这种两亲性聚合物在水溶液中就可以自组装形成聚合物纳米胶束，聚合物纳米胶束作为药物载体发展于20世纪90年代，是由两亲性聚合物在水溶液中自发形成的一种自组装结构，亲水性片段形成外壳，疏水性片段形成内核，构成独特的核-壳结构。具有载药量高、载药范围广，稳定性好、体内滞留时间长、独特的体内分布以及增加药物的稳定性、提高生物利用度和降低毒副作用等特点。
两亲性聚合物胶束因具有核-壳结构、临界胶束浓度低、热稳定性好等特点在药物释放体系等领域具有广泛的应用前景。
近十几年，由两亲型共聚物材料组成的胶束给药体系以其突出的优点以及在肿瘤药物、基因药物、抗传染药物等方面的极大应用前景而受到了国际医药界的广泛关注。两亲型共聚物胶束体系是目前研究的最多和最成熟的聚合物胶体给药体系(Janes，K.A.，Calvo，P.，Alonso，M.J. Polysaccharide colloidal particles as delivery systems formacromolecules.Advanced Drug Delivery Review，2001，47，83-97；PanyamJ.，LabhasetwarV.，“Biodegradable nanoparticles for drug and dene delivery to cells and tissure”，AdvancedDrug Delivery Review，2003，55，329-347)。大量研究表明，两亲型聚合物给药系统的载体能够自聚集成为独特核壳结构的胶束(Torchilin，V.P.Structure and design of polymericsurfactant-based drug delivery systems.J Control Release，2001，73，137-172；Torchilin，V.P.，Lukyanov，A.N，Gao，Z.，Papahadjopoulos-Sternberg，B.Immunomicelles：targetedpharmaceutical carriers for poorly soluble drugs.Proc Natl Acad Sci U SA.，2003，13，6039-6044；Dreher MR，Liu W，Michelich CR，Dewhirst MW，Yuan F，Chilkoti A.Tumorvascular permeability，accumulation，and penetration of macromolecular drug carriers.J NatlCancer Inst.200 6，98：335-44.)，由于聚合物胶束具有的“核-壳”结构类似于生物体中脂蛋白和病毒的结构在某种意义上具有一定的仿生性，而且聚合物胶束的较高稳定性决定了其在浓度极稀时仍能稳定存在，胶束表面的亲水性外壳可降低巨噬细胞对粒子的识别和吞噬能力，延长其在血液中的循环时间，可保护药物免遭生理环境的破坏，在体内缓慢释放；胶束的粒径小，能通过毛细胞血管直接进入器官和细胞内部，被更有效的吸收；胶束给药系统的广泛给药方式是其它任何剂型都无法比拟的，它可通过口服、注射(静脉注射、肌肉注射、皮下注射)、透皮等方式加入人体血液循环系统等显著优点。
由于葡聚糖具有生物降解性和亲水性，磷脂酰乙醇胺具有疏水性，所以用葡聚糖和磷脂酰乙醇胺作为基本材料制备的两亲性共聚物可组装形成纳米胶束作为药物载体，由于葡聚糖的亲水性可以避免被网状内皮细胞捕获，有效地延长了药效，降低了毒性，提高了生物利用度和生物活性。
葡聚糖能产生立体位阻层，从而减弱血中各种成分的作用，特别是血浆蛋白的调理作用以及随后的RES(网状内皮细胞)摄取作用，同时脂蛋白的交换、磷脂酶的水解等均受到有效抑制；提高膜表面亲水性：葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物有很长的极性基团，能提高载体表面的亲水性，从而提高了MPS(巨噬细胞系统)对其吸收破坏作用的能垒，有效组织了载体表面与血白蛋白的调理作用，并降低了载体的MPS的亲和作用。由于葡聚糖层的存在，使得该种物质作为载体键合配体物质时在体内外稳定性有了很大改变，增加再分散性；延长了在体循环中的时间，可减少被MPS摄取的速度和程度，并降低对这个主要宿主防御系统的不良反应。
本发明中，我们提出了一种简单易行的制备两亲性葡聚糖衍生物(葡聚糖-磷脂酰乙醇胺)胶束及其制备方法，该聚合物及其胶束制备过程重复性好，在药物载体上具有广泛的应用性。
发明内容
本发明的目的在于：针对葡聚糖和磷脂酰乙醇胺具有的生物降解性、生物相容性的特点，而提出一种新的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束，其特征在于，其为具有生物降解性、物相容性的葡聚糖和磷脂酰乙醇胺的两亲性材料组装而成的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束；该葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束为大小125～161nm的圆球形结构规整的胶束粒子，其临界胶束浓度为1.02×10-2～6.52×10-2mg/ml。
所述磷脂酰乙醇胺为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺、二油酯酰磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
所述的葡聚糖分子量为1.5kDa、5kDa或70kDa。
本发明提供的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束的制备方法，其具体步骤如下：
(1)以下述比例制备活化的葡聚糖
将0.54-9.9g葡聚糖溶于50ml体积比为1∶1的二甲基亚砜和吡啶混合溶液中；
然后将40mg的4-二甲氨基吡啶和1.0-4.0g对-硝基苯基氯甲酸酯添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应1-8小时后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，产物干燥后在-20℃下储存得活化的葡聚糖干粉；
所述活化的葡聚糖干粉状中葡聚糖与对-硝基苯碳酸酯的重量百分比为70％∶30％；
(2)将磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成磷脂酰乙醇胺的浓度为50mg/ml的磷脂酰乙醇胺氯仿溶液；
(3)步骤1中活化的葡聚糖干粉在N，N-二甲基甲酰胺中分散得活化的葡聚糖分散液，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％；
(4)以下述比例制备液态葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物粗产物
取4ml步骤(2)所得磷脂酰乙醇胺氯仿溶液，加入至1ml三乙胺；将含三乙胺的磷脂酰乙醇胺溶液加入至20ml活化后的活化的葡聚糖分散液中，所述活化的葡聚糖分散液的活化葡聚糖含量为1.0g，在氩气下，室温搅拌反应24小时；然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物粗产物；
(5)将上述步骤(4)中得到的液态葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃下透析去除N，N-二甲基甲酰胺；
(6)将透析后得到的产物冷冻干燥，之后，用体积比为70∶30的甲醇和0.01M盐酸溶液作为流动相，对透析后得到的冷冻干燥产物进行反向高效液相色谱纯化；再通过减压真空蒸发除去流动相，经过冷冻干燥，得纯化的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物干粉；在-20℃下进行干粉储存；所述冷冻干燥纯化后的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物中葡聚糖与磷脂酰乙醇胺的重量百分比为70％∶30％；
(7)以下述比例用相分离-透析法制备葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束
将0.2g冷冻干燥纯化后的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物溶于6ml的N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加到14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液，装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时，得到葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束。
所述活化的葡聚糖的制备过程中，其中的反应物对-硝基苯基氯甲酸酯和葡聚糖的摩尔比为：5∶1-50∶1。
所述的葡聚糖分子量为1.5kDa、5kDa或70kDa。
所述的磷脂酰乙醇胺为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺、二油酯酰磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
本发明提供的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束及其制备方法，其优点：
(1)原料为具有生物降解、生物相容的葡聚糖和磷脂酰乙醇胺组成，它们都为可用于人体的药物载体材料，具有良好的生物相容性和安全性；
(2)该胶束中葡聚糖的亲水性可以避免被网状内皮细胞捕获，有效地延长了药效，降低了毒性，提高了生物利用度和生物活性；
(3)该胶束由于临界胶束浓度(CMC)很低，形成的胶束稳定，粒径小，具有长循环性，可用于包载各种亲、疏水药物，是具有发展前途的药物载体；
(4)制备方法简单，重复性好，在药物载体上具有广泛的应用性。
附图说明
图1为本发明的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺成胶束(实施例1)透射电镜图.
具体实施方式：
实施例1：
1、活化葡聚糖
将0.54g葡聚糖(分子量为1.5kDa)溶于50ml二甲基亚砜和吡啶混合溶液(1∶1，V/V)中，然后把4-二甲基氨基吡啶(40mg)和对-硝基苯基氯甲酸酯(2.0g)添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应，1h后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，所得产物纯化干燥后，在-20℃下保存得活化的葡聚糖干粉；
2、将二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成浓度为50mg/ml的二硬酯酰磷脂酰乙醇胺氯仿溶液；
3、步骤1中活化的葡聚糖干粉在N，N-二甲基甲酰胺中分散得活化的葡聚糖分散液，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％；
4、将步骤2中的二硬酯酰磷脂酰乙醇胺氯仿溶液(50mg/ml)取4ml，然后加入1ml三乙胺。将含三乙胺的磷脂酰乙醇胺溶液加入到20ml活化后的葡聚糖1.0g分散液中，在氩气下，室温搅拌反应24小时。然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物；
5、将步骤4中得到的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃下透析除去N，N-二甲基甲酰胺，透析后产物冷冻干燥；
6、将步骤5中冷冻干燥后的物质用反向高效液相色谱纯化(用甲醇/0.01M盐酸溶液，(70∶30，v/v)作为流动相)。流动相通过减压真空蒸发除去，纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷磷脂酰乙醇胺经过冷冻干燥，在-20℃下作为干粉储存。
7、用相分离-透析法制备聚合物胶束。将0.2g纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于6ml N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加到14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时得到共聚物胶束。然后对胶束进行动态光散射、透射电镜及荧光光谱测定观察，结果表明：动态光散色射测定其粒径为131nm，分散指数为0.08；透射电镜观测粒子为规整的圆球形；荧光光谱测定其临界胶束浓度为5.43×10-2mg/ml。
实施例2：
1、活化葡聚糖的制备：将2.97g葡聚糖(分子量为1.5kDa)溶于50ml二甲基亚砜和吡啶混合溶液(1∶1，V/V)中，然后把4-二甲基氨基吡啶(40mg)和对-硝基苯基氯甲酸酯(2.0g)添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应，1h后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，所得产物纯化干燥后，在-20℃下保存。
2、将二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成浓度为50mg/ml的溶液。
3、步骤1中活化的葡聚糖可以在N，N-二甲基甲酰胺中分散，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％。
4、将步骤2中的二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶液(50mg/ml)取4ml，然后加入1ml三乙胺。将含三乙胺的磷脂酰乙醇胺溶液加入到20ml活化后的葡聚糖(1.0g)分散液中，在氩气下，室温搅拌反应24小时。然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物。
5、将步骤4中得到的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃透析，透析后产物冷冻干燥。
6、将冷冻干燥后的物质用反向高效液相色谱纯化(用甲醇/0.01M盐酸溶液，(70∶30，v/v)作为流动相)。流动相通过减压真空蒸发除去，纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷磷脂酰乙醇胺经过冷冻干燥，在-20℃下作为干粉储存。
7、用相分离-透析法制备聚合物胶束。将0.2g纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于6ml N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时得到共聚物胶束。然后对胶束进行动态光散射、透射电镜及荧光光谱测定观察，结果表明：动态光散色射测定其粒径为137nm，分散指数为0.09；透射电镜观测粒子为规整的圆球形；荧光光谱测定其临界胶束浓度为5.29×10-2mg/ml。
实施例3：
1、活化葡聚糖的制备：将0.54g葡聚糖(分子量为1.5kDa)溶于50ml二甲基亚砜的吡啶混合溶液(1∶1，V/V)中，然后把4-二甲基氨基吡啶(40mg)和对-硝基苯基氯甲酸酯(2.0g)添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应，8h后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，所得产物纯化干燥后，在-20℃下保存。
2、将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成浓度为50mg/ml的溶液。
3、步骤1中活化的葡聚糖可以在N，N-二甲基甲酰胺中分散，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％。
4、将步骤2中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶液(50mg/ml)取4ml，然后加入1ml三乙胺。将含三乙胺的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶液加入到20ml活化后的葡聚糖(1.0g)分散液中，在氩气下，室温搅拌反应24小时。然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物。
5、将步骤4中得到的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃透析除去N，N-二甲基甲酰胺，透析后产物冷冻干燥。
5、将冷冻干燥后的物质用反向高效液相色谱纯化(用甲醇/0.01M盐酸溶液，(70∶30，v/v)作为流动相)。流动相通过减压真空蒸发除去，纯化后的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺经过冷冻干燥，在-20℃下作为干粉储存。
6、用相分离-透析法制备聚合物胶束。将0.2g纯化后的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶于6ml N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加到14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时得到共聚物胶束。然后对胶束进行动态光散射、透射电镜及荧光光谱测定观察，结果表明：动态光散色射测定其粒径为125nm，分散指数为0.06；透射电镜观测粒子为规整的圆球形；荧光光谱测定其临界胶束浓度为6.52×10-2mg/ml。
实施例4：
1、活化葡聚糖的制备：将9.9g葡聚糖(分子量为5kDa)溶于50ml二甲基亚砜和吡啶混合溶液(1∶1，V/V)中，然后把4-二甲基氨基吡啶(40mg)和对-硝基苯基氯甲酸酯(2.0g)添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应，1h后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，所得产物纯化干燥后，在-20℃下保存。
2、将二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成浓度为50mg/ml的溶液。
3、步骤1中活化的葡聚糖可以在N，N-二甲基甲酰胺中分散，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％。
4、将步骤2中的二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶液(50mg/ml)取4ml，然后加入1ml三乙胺。将含三乙胺的磷脂酰乙醇胺溶液加入到20ml活化后的葡聚糖(1.0g)分散液中，在氩气下，室温搅拌反应24小时。然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物。
5、将步骤4中得到的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃透析除去N，N-二甲基甲酰胺，透析后产物冷冻干燥。
6、将冷冻干燥后的物质用反向高效液相色谱纯化(用甲醇/0.01M盐酸溶液，(70∶30，v/v)作为流动相)。流动相通过减压真空蒸发除去，纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺经过冷冻干燥，在-20℃下作为干粉储存。
7、用相分离-透析法制备聚合物胶束。将0.2g纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于6ml N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加到14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时得到共聚物胶束。然后对胶束进行动态光散射、透射电镜及荧光光谱测定观察，结果表明：动态光散色射测定其粒径为150 nm，分散指数为0.09；透射电镜观测粒子为规整的圆球形；荧光光谱测定其临界胶束浓度为3.10×10-2mg/ml。
实施例5：
1、活化葡聚糖的制备：将1.98g葡聚糖(分子量为5kDa)溶于50ml二甲基亚砜和吡啶混合溶液(1∶1，V/V)中，然后把4-二甲基氨基吡啶(40mg)和对-硝基苯基氯甲酸酯(4.0g)添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应，4.5h后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，所得产物纯化干燥后，在-20℃下保存。
2、将二油酯酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成浓度为50mg/ml的溶液。
3、步骤1中活化的葡聚糖可以在N，N-二甲基甲酰胺中分散，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％。
4、将步骤2中的二油酯酰磷脂酰乙醇胺溶液(50mg/ml)取4ml，然后加入1ml三乙胺。将含三乙胺的磷脂酰乙醇胺溶液加入到20ml活化后的葡聚糖(1.0g)分散液中，在氩气下，室温搅拌反应24小时。然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态的葡聚糖-二油酯酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物。
5、将步骤4中得到的葡聚糖-二油酯酰磷脂酰乙醇胺粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃透析，透析后产物冷冻干燥。
6、将冷冻干燥后的物质用反向高效液相色谱纯化(用甲醇/0.01M盐酸溶液，(70∶30，v/v)作为流动相)。流动相通过减压真空蒸发除去，纯化后的葡聚糖-二油酯酰磷脂酰乙醇胺经过冷冻干燥，在-20℃下作为干粉储存。
7、用相分离-透析法制备聚合物胶束。将0.2g纯化后的葡聚糖-二油酯酰磷脂酰乙醇胺溶于6ml N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时得到共聚物胶束。然后对胶束进行动态光散射、透射电镜及荧光光谱测定观察，结果表明：动态光散色射测定其粒径为142nm，分散指数为0.09；透射电镜观测粒子为规整的圆球形；荧光光谱测定其临界胶束浓度为4.36×10-2mg/ml。
实施例6：
1、活化葡聚糖的制备：将6.9g葡聚糖(分子量为70kDa)溶于50ml二甲基亚砜和吡啶混合溶液(1∶1，V/V)中，然后把4-二甲基氨基吡啶(40mg)和对-硝基苯基氯甲酸酯(1.0g)添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应，1h后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，所得产物纯化干燥后，在-20℃下保存。
2、将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成浓度为50mg/ml的溶液。
3、步骤1中活化的葡聚糖可以在N，N-二甲基甲酰胺中分散，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％。
4、将步骤2中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶液(50mg/ml)取4ml，然后加入1ml三乙胺。将含三乙胺的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶液加入到20ml活化后的葡聚糖(1.0g)分散液中，在氩气下，室温搅拌反应24小时。然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物。
5、将步骤4中得到的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃透析，透析后产物冷冻干燥。
6、将冷冻干燥后的物质用反向高效液相色谱纯化(用甲醇/0.01M盐酸溶液，(70∶30，v/v)作为流动相)。流动相通过减压真空蒸发除去，纯化后的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺经过冷冻干燥，在-20℃下作为干粉储存。
7、用相分离-透析法制备聚合物胶束。将0.2g纯化后的葡聚糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶于6ml N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加到14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时得到共聚物胶束。然后对胶束进行动态光散射、透射电镜及荧光光谱测定观察：结果表明：动态光散色射测定其粒径为153nm，分散指数为0.06；透射电镜观测粒子为规整的圆球形；荧光光谱测定其临界胶束浓度为2.88×10-2mg/ml。
实施例7：
1、活化葡聚糖的制备：将6.9g葡聚糖(分子量为70kDa)溶于50ml二甲基亚砜的吡啶混合溶液(1∶1，V/V)中，然后把4-二甲基氨基吡啶(40mg)和对-硝基苯基氯甲酸酯(1.0g)添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应，8h后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，所得产物纯化干燥后，在-20℃下保存。
2、将二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成浓度为50mg/ml的溶液。
3、步骤1中活化的葡聚糖可以在N，N-二甲基甲酰胺中分散，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％。
4、将步骤2中的二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(50mg/ml)取4ml，然后加入1ml三乙胺。将含三乙胺的二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶液加入到20ml活化后的葡聚糖(1.0g)分散液中，在氩气下，室温搅拌反应24小时。然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物。
5、将步骤4中得到的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺聚合物的粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃透析，透析后产物冷冻干燥。
6、将冷冻干燥后的物质用反向高效液相色谱纯化(用甲醇/0.01M盐酸溶液，(70∶30，v/v)作为流动相)。流动相通过真空蒸发除去，纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺经过冷冻干燥，在-20℃下作为干粉储存。
7、用相分离-透析法制备聚合物胶束。将0.2g纯化后的葡聚糖-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于6mlN，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加到14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时得到共聚物胶束。然后对胶束进行动态光散射、透射电镜及荧光光谱测定观察，结果表明：动态光散色射测定其粒径为161nm，分散指数为0.09；透射电镜观测粒子为规整的圆球形；荧光光谱测定其临界胶束浓度为1.02×10-2mg/ml。
Claims (7)
1.一种葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束，其特征在于，其为具有生物降解性、生物相容性的葡聚糖和磷脂酰乙醇胺的两亲性材料组装而成的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束；该葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束为大小125～161nm的圆球形结构规整的胶束粒子，其临界胶束浓度为1.02×10-2～6.52×10-2mg/ml。
2.根据权利要求1所述的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺、二油酯酰磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
3.根据权利要求1所述的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束，其特征在于，所述的葡聚糖分子量为1.5kDa、5kDa或70kDa。
4.一种如权利要求1所述的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以下述比例制备活化的葡聚糖
将0.54-9.9g葡聚糖溶于50ml体积比为1∶1的二甲基亚砜和吡啶混合溶液中；
然后将40mg的4-二甲氨基吡啶和1.0-4.0g对-硝基苯基氯甲酸酯添加到上述溶液中，-10℃搅拌反应1-8小时后，将反应液用乙醇沉淀，并用乙醇洗，产物干燥后在-20℃下储存得活化的葡聚糖干粉；
所述活化的葡聚糖干粉状中葡聚糖与对-硝基苯碳酸酯的重量百分比为70％∶30％；
(2)将磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成磷脂酰乙醇胺的浓度为50mg/ml的磷脂酰乙醇胺氯仿溶液；
(3)步骤1中活化的葡聚糖干粉在N，N-二甲基甲酰胺中分散得活化的葡聚糖分散液，所述活化的葡聚糖分散液中所述活化的葡聚糖含量为5％；
(4)以下述比例制备液态葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物粗产物
取4ml步骤(2)所得磷脂酰乙醇胺氯仿溶液，加入至1ml三乙胺；将含三乙胺的磷脂酰乙醇胺溶液加入至20ml活化后的活化的葡聚糖分散液中，所述活化的葡聚糖分散液的活化葡聚糖含量为1.0g，在氩气下，室温搅拌反应24小时；然后，产物过滤除杂质，过滤后的产物进行减压真空蒸发除氯仿得到液态葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物粗产物；
(5)将上述步骤(4)中得到的液态葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物粗产物放入到pH＝5.1柠檬酸钠缓冲溶液中4℃下透析去除N，N-二甲基甲酰胺；
(6)将透析后得到的产物冷冻干燥，之后，用体积比为70∶30的甲醇和0.01M盐酸溶液作为流动相，对透析后得到的冷冻干燥产物进行反向高效液相色谱纯化；再通过减压真空蒸发除去流动相，经过冷冻干燥，得纯化的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物干粉；在-20℃下进行干粉储存；所述冷冻干燥纯化后的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物中葡聚糖与磷脂酰乙醇胺的重量百分比为70％∶30％；
(7)以下述比例用相分离-透析法制备葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束
将0.2g冷冻干燥纯化后的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物溶于6ml的N，N-二甲基甲酰胺中，边搅拌边滴加到14ml去离子水中，最后形成的带蓝光乳液，装入透析袋中，放入31去离子水中分多次透析48小时，得到葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束。
5.根据权利要求4所述的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束的制备方法，其特征在于，活化的葡聚糖的制备过程中，其中的反应物对-硝基苯基氯甲酸酯和葡聚糖的摩尔比为∶5∶1-50∶1。
6.根据权利要求4所述的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束的制备方法，其特征在于，所述的葡聚糖分子量为1.5kDa、5kDa或70kDa。
7.根据权利要求4所述的葡聚糖-磷脂酰乙醇胺聚合物胶束的制备方法，其特征在于，所述的磷脂酰乙醇胺为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺、二油酯酰磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
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