CN1332625A - 纳囊及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及直径大小为50纳米至10微米的纳囊,其壳层至少由两种不同的相互交联的聚合物P1和P2组成。在此壳层下面可能还有一层脂类。本发明的纳囊是通过至少两种不同的水溶性聚合物P1和P2的共价交联在脂质体的表面上制造出来的。一旦聚合物成为交联,该脂质体即被溶解。本发明的纳囊能够携带具有生物活性的化合物。

Description

纳囊及其制造方法
本发明涉及直径大小为50纳米至10微米的纳囊，其壳层至少由两种不同的相互交联的聚合物P1和P2组成。在此壳层下面可能还有一层脂类。本发明的纳囊是通过至少两种不同的水溶性聚合物P1和P2共价交联在脂质体的表面上制造出来的。一旦聚合物成为交联，该脂质体即被溶解。本发明的纳囊能够携带具有生物活性的化合物。
纳囊或纳丸是一种微粒结构，大小范围在50纳米和10微米之间，其中壳层划定了外部介质的内腔的界限。这个性质使纳囊和纳球区分开来；后者是有统一的截面的。具有相同的结构而尺寸较大的构型也为人们所熟悉，因而称之为微囊。脂质体和病毒荚膜是纳囊进一步应用的结构。
对于纳囊的制造已确定了一种优越的方法，就是在相的界面上进行交联反应。这种微粒的可能的用处主要决定于所应用的壳层和制法。根据技术水平，已知的壳层是由交联的蛋白质或界面的聚合体制造的，特别是由丙烯酸的衍生物制成的。
壳层的全部或一部分之所以由蛋白质来组成是有特殊意义的，因为它们能够进行生物相容和降解。所应用的蛋白质是形成构造用的，但是也能携带活性。这样的微粒适合于封装外界物质以及将其他成分结合到表面上。根据投入的蛋白质的天然多样性，表面性质又是高度可变的，从而能适合不同的要求。
过去曾经有人描述也用表层(S-层)-蛋白质来制造膜(英国专利EP0154620)。这些膜是通过在游离溶液中或在脂质体表面上重结晶S-层-蛋白质而产生的。在后一种情况下，预先封装大分子是可能的，脂质体因膜的形成而基本稳定(Kupcu，S.，Sara，M.和Sleytr，U.B.，《生物化学生物物理学报》1235(2)；263-269[1995])。膜在平面结晶时所产生的结构有均匀的细孔，这些细孔特别能用于超滤。
表面上的化学基团有规则的排列，导致与其他大分子形成一个很均匀的分布，特别适用于探测系统。由于只限在生物学系统内使用，其免疫性可能在S-层-蛋白质的膜上受到影响。S-层-蛋白质产生一种强烈的免疫反应，因此可以用作佐剂(美国专利US5043158)。除此以外，S-层-蛋白质本身是不携带活性的。
美国专利US5,498,421；US5,635,207；US5,650,156；US5,665,383；US5,639,473以及US5,512,268都讲述了范围大小达10微米的空心球的制法和利用，其中在一个不与水混合的核心的相界上酿成一个壳层。这个壳层通过二硫化物搭桥而稳定下来，并能用蛋白质制成，尤其是用血色素、清蛋白或其他含硫醇的聚合物制成。不可混合相的乳化经过强烈超声波来促成。此外，这个过程中所形成的过氧化氢，可以导致壳成分的氧化交联。
由血色素制成的微粒是有能力摄取和释放氧气的，但必需以其他希尔氏系数为天然血色素。用它可作血液的代用品。
其他用途则是可将气体或对比剂装入微粒中，按已定型的方法用于药物。有人还描述过别的应用，如果特效物质在内相中未因溶解或乳化而损失其活性的话，则可包装生物特效的物质。因此，本法只能在一定条件下适合于亲水的大分子如蛋白质或核酸的包装。
有人提出，在纳米范围内的其他空心球是在胶体溶解的微粒中反复分离多电解质而获得的(Caruso，F.；Caruso，R.A.和Mhwald，N.[1998]Science 282：1111-1113)。举例来说，将极小的硅胶粒子在一个聚苯乙烯基质中同聚二烯丙基二甲基氯化铵进行交换，即可分离。这个基质随后通过焙烧或脱除溶剂，这样空心球就残留下来了。
大家知道，脂质体和纳囊都能封装有生物活性的化合物，如用于药品成型。它们能将其包装物携带至作用地点或在较长的时间内缓释。外围的膜可以防止所包装的有效物质不致破坏或失效。
包装的有效物质的特性，尤其是它有溶解度和分子量，变化的范围是相当大的。除此之外，脂质体是一个十分适宜的体系，因为它具有携带免疫学的性能，可以包装药剂的特效物质。
特别造形的脂质体能用来给哺乳动物的细胞引进核酸。本技术一个优选的方案，就是应用阳离子产生脂类核酸复合物，借此转移至需要治疗的细胞。转染是简单的，不过有的效果较小，而且也是非特异性的。
另一种赋形是在目标细胞的细胞内的途径上采取对酸碱度敏感的脂质体。在红细胞浆质的酸性的小腔内，将这些脂质体同周围的膜融合起来，并利用此法携带其包装物进入细胞里面。通过这一过程，也能使蛋白质及其他有效物质转运到细胞内部。
脂质体还可用作高度加强信号的探测方法(美国专利US4622294)。在这种情况下，信号的加强是通过与探测物相比数目要大得多的被封入的酶分子来达到的。利用常规脂质体是有缺点的，那就是它对洗涤剂有敏感性，这种洗涤剂是用来抑制非特异性的相互作用而加入的。
已知的空心球有下列缺点：
以应用S-层为基础的空心球显示出一种水性的内腔和一种固定的壳层的渗透性。包装亲水的大分子是有可能的。不过其缺点则是将有用的化合物给局限在S-层的蛋白质上。这些都是不携带活性的，而且有抗原的作用。
依据美国专利US5498421及上述其他美国文献中所介绍的方法，有一种功能性壳层是在相界上由蛋白质产生的。这个结构当然只能适合包装亲水的大分子。壳层的成分相互交联得很结实，其结果是在应用血色素时性质却发生了变化。腔内结构的有用成分局限在具有许多硫醇功能的那些聚合物上，而且储存在所应用的相界面上。
常规脂质体的结构的缺点是它的机械性和体内稳定性极小。微粒在很短的时间内就被网状内皮系统的巨噬细胞吞食，从而离开了循环。
所以，本发明的一项任务乃是要制备一种能克服上述缺点的纳囊。
本发明的成功在于通过具有直径大小在50纳米和10微米之间的纳囊，利用两种不同的水溶性聚合物P1和P2的共价交联，使其显示出来的数量较多的功能基出现在脂质体上而制造出来的。本发明的纳囊的生产方法的特点，是首先将脂质体制造出来，脂质体上用聚合物P1衬层，这样聚合物P1在水溶液中就结合在脂质体的表面，然后作衬层的聚合物P1同与之不同的聚合物P2在水溶液中共价交联，而通过交联也许再衬上其他的聚合物层。
作为开始材料的脂质体的尺寸决定所产生的纳囊。制造这种脂质体的适宜方法是人们所熟悉的。
制造脂质体的一个优先方案包括：将膜的成分溶解在乙醇中，再将该液体同水或水性缓冲液进行混合。从这样获取的多层的脂质体中，经高压匀质器(法国产)处理而制出分开较小单一的或多层紧密的大大小小的囊泡。
这种技术的一个变量是使多层的原料脂质体中途通过异孔膜，这种膜同样能形成单一和多层的大小分布致密的脂质体。
按照另外一种方法，单一层和多层的脂质体可由洗涤剂-脂类-相中通过分离洗涤剂来制造。此乃利用凝胶过滤法或透析法达到的。
依据本发明，应用的脂质体一定能使水溶性的聚合物P1完成结合。水介质中的共价结合法是专业人员全部熟悉的(G.Hermanson：《生物共轭技术》，Academic Press，1996)。它可使含有下列异种功能或同种功能的基团进行结合；氨基-，硫醇基-，肼撑-，羟基-，叠氮氢基-，醛基-，羧基-或在适宜的化合中被其活化的脂类。
脂质体是能够包含这些功能基的。另外的方法是通过脂类成分的化学改性，使这些基团也能在脂质体表面上产生出来。
带有这些基因并适宜成膜或固膜的化合物有：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇以及这些化合物的衍生物，尤其是带有游离的硫醇基、氨基、羧基、活性酯-或醛的功能的一些衍生物。其他合适的化合物是具有上述功能基的两性分子，它们储存在脂类层内，因而不受破坏。此外，还有烷基胺、烷基硫醇和脂肪酸以及由这些脂肪酸活化的酯类。另一些适宜的化合物，则是甾醇衍生物，如胆酸、脱氧胆酸、硫代胆甾醇和类似的化合物。
脂质体的表面因引进反应基团而在化学上被改性。属于此类的是有固膜羧基功能的活性酯及其N-羟丁二酰亚胺酯。此外还有醛的功能，它们是通过用谷氨酸醛来处理固膜的胺的功能或者通过氧化糖苷化的脂类而产生的。属于此类的有硫醇的功能，它们是通过固膜的氨基功能与2-亚氨基酪素纤维的反应而产生的。此类还有固膜的2-吡啶连二硫酸盐、马来酰亚胺或卤化乙酰，它们则是通过合适的异双功能的试剂而产生的。
这种反应基团是有利于按照脂质体的制法而进行生产的，这些基团都局限在脂质体的外面。如果成膜或固膜的成份上的这些反应基团已被用来构成脂质体的话，那么在个别情况下就有可能对包装物分子产生具有缺陷的反应。
氨基-，硫醇基-，肼撑-，醛基-，羧基-，活性酯-，羟基-或叠氮氢基-之间的同功能或异功能上的结合，最好是在有辅料参与的情况下进行。适于此类的是在蛋白质化学上使用的功能的横向交联，如异硫氰酸盐、异氰酸盐、酰基叠氮化物、N-羟基丁二酰亚胺酯、磺酰盐类、醛类、环氧化物、碳酸盐、亚氨酯、碳二亚胺、酐、卤乙酰、烷基卤素化物、马来酰亚胺、氮丙啶、吡啶二硫化物、重氮烷、重氮乙酰、羧基二异吡唑、N-羟基二酰亚胺氯仿类或在适当结合中含有这些功能基的化合物。在氨基和羧基之间，常用的不同组合包含羧基在具有反应活性的酯中衍生化，例如在应用N-羟基丁二酰亚胺的情形。随着这种衍生化接踵而来的，可能是聚合物或脂质体。
螯合的复合物是适合非共价结合的，特别是蛋白质的结合，这样的组合蛋白可能以天然的方式来构成螯合的复合物，如结合脱氧核糖酸的锌指蛋白。但是借助于再结合的脱氧核糖核酸的技术，蛋白质中的螯合作用的顺序也是会适应的。大家知道的一个例子，就是作为组氨酸而闻名的6-组氨酸，乃是在蛋白质的N端或C端上延伸下来的。在有过渡金属离子存在的情况下，这些蛋白质能够结合在螯合化的脂层上。这种脂层可以经过此类两性化合物的内部结构而产生出来，它们在各极的端部含有三腈乙酸或二亚胺乙酸。
如果聚合物P1是一个对脂层有很大亲合力的聚合物的话，那也就不需要什么明显的结合步骤了。
因此，膜蛋白质的组成和外围应当是一个合适的聚合物P1，但也有些聚合物因补充调整而提高其对膜的亲合力。对它调整的方法包括给予带功能化烷基的聚合物，如用长链脂肪酸的N-羟基丁二酰亚胺酯进行处理或以磷脂共价结合。通过现有的氨基-，硫醇基-或羧基-，在同或异二功能交联的辅助下，这样的结合是能够达到的，所以溶液中因有洗涤剂而含有磷脂。葡糖化的蛋白质经氧化作用产生了醛的功能，可以用其结合固定脂类的氨基功能。在这里，辅剂是不必要的。
类似的改性也可能发生在其他天然的或合成的聚合物上。
如果在制造时掺入两性的共聚单体的话，合成的聚合物就能提高对膜的亲合力。
蛋白质也能利用分子生物学的方法来改变其性质，使之成为整合或周围的膜蛋白质。
在脂层上P1的静电集中法对采取结合步骤是很有利的。脂类层对此可给以合适的离子成份。合适的成份指的是烷基碳酸、烷基磺酸、烷基胺、烷基铵盐、磷酸酯以及长链醇类，然而也有带天然的或合成的脂类的，例如磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺或胆甾醇、磷脂酰肌醇、心磷酯或神经鞘脂类所荷载的衍生物。
本发明制成的纳囊是会达到高负荷的脂质体和聚合物的。另一方面，要尽可能地抑制粒团的凝聚。所以脂层和聚合物在必要时应具有不同的功能基。由于这个缘故，含硫醇基的脂层用许多不含硫醇基的聚合物来衬层，另外还要用没有游离的硫醇基功能的蛋白质来衬层。就是在应用蛋白质作聚合物P1时，这也不是总能实现的。在这种情况下，异双功能的试剂有利于作为辅料，因为它能使稳定的中间产物分离，于是有可能产生定向的反应。
在结合后，聚合物P1上可能有剩余物，要采取适宜的措施如渗析法、正切透析法、漂浮法、凝胶过滤法或超滤法分离之。
下一步是聚合物P1通过与之不同的一个聚合物P2进行共价交联。因此采用的辅料和方法是与P1共价固定的一些辅料和方法相当的。如果P1和P2本身能够达到共价化合的话，那就可以用不同辅料了。举例来说，若P1或P2是一个多功能的醛，而另一方是一个多功能的胺或肼，则是如此。
P1和P2均为水溶性的聚合物，它们大多数都有的功能基是氨基-、羧基-、硫醇基-、肼撑基-、羟基-、叠氮氢基-、醛基-或活化酯基-。
特别是多糖都列入此类，如藻朊酸、壳聚糖酐、果胶、粘朊酸、多甘露糖酸、肝素、阿拉伯橡胶、卡拉亚橡胶、黄原酸橡胶、脆鹿角菜、槐角树胶、以及这些化合物的盐类和羧化、胺化、硫化、肼化、或氧化的葡聚糖、淀粉、聚果糖、菊粉或琼脂糖。
属于此类的还有戊二酸醛及其他多功能醛类的聚合化的产物。此外，还有天然的或合成的蛋白质、肽、同聚合物或异聚合物，它们则是由可以支配许多游离的氨基-、羧基-或硫醇基的氨基酸制成的。
属于此类的还有聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟基乙基丙烯酸盐、聚羟基甲基丙烯酸盐、聚氮杂环丙烷以及分枝的聚乙撑二醇，它们都支配着许多游离的氨基-、羧基-或硫醇基。这些功能基是可以通过共聚合作用或通过补充改性来接合的。
汉森(Analytical Biochemistry 76：37[1976])或奥康奈尔和勃拉迪(Analytical Biochemistry 76：63[1976])曾经对产生这些共聚合物的优选方案进行过描述。而且当时用可以分裂的二丙烯聚合了聚丙烯酰胺。对此汉森采用的是N，N’-(丙烯酰)-胞胺，并对产生的凝胶进行了还原分解。因此，在丙烯的基础上制出了多硫醇，这对本发明提出的交联来说是有特殊意义的。奥康奈尔和勃拉迪用两个连位的羟基功能补入了一个双功能的丙烯酰胺，然后再对它进行了氧化分解。由此而产生了一个多价醛，从而建立起交联的壳层。
此外，列入此类的还有进行化合的混合形式，如糖化蛋白、后转译变性蛋白、蛋白复合体及其他天然物质，以及由糖、丙烯酸盐和所用化合物制成的共聚合物，只要这些化合物都必须是水溶性的，而且本身不形成微团或泡状结构。
属于此类的还有改性的聚合物P1或P2，它们有能力形成螯合的复合物，或者对脂层有亲合力。迄今所提到的聚合物中，凡用化学方法制造的衍生物皆属此类。此外还有那些合成的聚合物，它们包含二性的或一个螯合化的共聚单体。具有螯合化性质的基因技术所改变的蛋白质也列入此类。
在应用方面，一个重要的情况是聚合物P1或P2之一为蛋白质。
首先的方案是这种蛋白质为白蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、抗体、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白原、纤维结合素、胶原蛋白、玻璃蛋白原、蛋白质A、蛋白质G、抗生素蛋白、链抗生素蛋白、伴刀豆球蛋白A、小麦繁殖凝集素或提取素。
若聚合物P1或P2之一显示出一种纤维状的结构，则是有利的。许多碳水化合物的情形，或丙烯酸及其衍生物的聚合物的情形都是如此。
聚合物也可能有荧光性质，或者通过改性而获得这种性质。具有这样性质的合适的物质是绿色荧光蛋白。其他的蛋白质或碳水化合物也可以变成荧光物质。这种改性的合适的方法是专业人员所熟悉的，它包括活性荧光团共价结合到聚合物的相应基团上，或者使荧光化金属离子同聚合物的螯合化基团构成复合物。纳囊也能用补充荧光化物质的方法来进行改变。
游离的核酸并不是一种合适的聚合物。
因为在脂质体的表面上的聚合物P1显示出比起游离溶液中的局部的浓度来要高得多，所以在表面上的交联就进行得很顺利。P1的剩余物在游离的溶液中同样也能和聚合物P2交联，而且形成颗粒。游离的P2和游离的P1-P2颗粒可以通过渗析法、正切透析法、漂浮法、凝胶过滤法或超滤法同衬层的脂类进行分离。
在衬层和交联之后，可以获得空心球，其中有一内脂膜，由聚合物外壳包围着。此壳改变了脂质体的表面性质，同时也提高了它的稳定性。
在本发明的优选项目中，纳囊被制造出来，其中脂质体在交联后即行溶解。这主要是能用洗涤剂清洗的缘故。
此外，问题还是要把P1或P2这些聚合物给释放出来，使它们只在脂层上结合，而不是相互结合，对未充分交联的结构还要分离。本纳囊是通过沉淀法、凝胶过滤法或超滤法来分离溶解产物的。合适的洗涤是烷基化的糖类，如辛基葡糖甙、胆酸盐及其衍生物、烷基磺酸或多氧乙烯山梨醇。
按照本发明的意义，在纳米范围内的空心球是由两种聚合物P1和P2组成的。造形的脂质体可以保存下来，也可以除去。生产的空心球的大小则决定于入口处所用的脂质体。
本发明描述的纳囊适用于封装具有生物活性的化合物，例如医药的有效物质、蛋白质或核酸。
在这种情况下，应用的是已经含有要封入的物质的脂质体。对于这种脂质体的制法，专业人员是很熟悉的。要封装的化合物只有一种限制，那就是不能对脂质体的整体性有不利的影响，例如洗涤剂。P1和P2在脂质体内参与其他反应步骤时，封入的化合物是保留下来的。
本发明所介绍的纳囊能够封装合成的化合物、蛋白质、肽、维生素、激素、碳水化合物或核酸以及这些化合物的混合物，比方说，把它们用作抗生素、杀真菌剂和抗病毒素、抗体、细胞静止素、免疫抑制剂、兴奋剂、麻醉剂、抗抑郁剂、抗糖尿病药、抗高血压药、抗凝血药、消炎剂、消除忧愁剂、镇静剂、抗心律不齐药、抗关节炎特效药、气管松弛剂、低血糖和低血脂特效药，以及剌激红细胞生成的特效药物。
纳囊壳层的渗透性经过脂质体清洗后，可以显著提高。这个过程包括洗涤剂分子和混合微团穿过壳层。在纳囊内部发生反应的产物和基质也能以同样方式进行交换。参与这种反应的序列组成主要是纳囊及其内在的高分子量的酶类活性物质，其脂质体则用洗涤剂洗去。酶或核糖酶特别适合作这种封装的物质。
本发明的这种造形的另一方案是保持脂层。在这种造形中，只有通过脂层扩散的那些物质才能进行交换。
本发明的一种特殊造形是应用制造壳层的聚合物，不仅形成结构，而且也携带活性。例如，这样的外壳对其他分子具有结合性质或催化性质。在蛋白质里是存在有这种形成结构并携带活性性质的聚合物的。
本发明的一个造形方案，是用血色素来制造外壳的结构。生产的纳囊可用作血的代用品。
这种造形的另一个目的，则是使制造壳层用的一些蛋白质常常表现为能辨认并与其他蛋白质相结合。适合这一目的的蛋白质有外源凝集素、结合生物素或结合抗体的蛋白质。此项发明所生产的纳囊便能辨认蛋白质的葡糖化、抗原决定基团或生物素基团，而且在结合这些蛋白质时有高度特异性。这样的纳囊对于生化诊断是很有意义的。不过，有这种结构的纳囊也能当作医药使用，有的放矢。
因此，高度特异的分子是特别能同细胞表面相互作用的。在这种意义上，互补成双的是抗体与固膜的抗原、外源凝集素或选择素与固膜的葡糖化，以及激素与其感受器，诸如此类。
按照模块式建造结构是有益处的，一方面，它可对少量的壳层用几个特异性指标就可以生产，另一方面，它可以很经济地提出最近确定的特异成分。
除此以外，这些成分是不同使用交联的化学药品发生接触的，因此没有灭活之虞。保持结构的价值，也就是说，在表面上结合的特异成分的数量是便于用滴定来改变的。这种成分的高密度和高抗体的亲抗原性乃是同等重要的，在若干相互影响而不利于结合稳定性时，它也能使稳定的相互作用成为可能，正如在MHC-络合物和T-细胞感受器之间它所发生的情况一样。
本发明的另一有利造形是纳囊在产生后用其他物质改性。这种造形的一个重要方案是用聚乙烯乙二醇改变纳囊的表面。这样的衬层使微粒作药物使用时的携带性得到改善。
图1是本发明制造纳囊的模示图。
脂质体(1)首先以聚合物P1衬层(2)。然后该层通过另一聚合物P2而被交联(3)。这种造形的脂质体可用洗涤剂除去(4)。
本发明的纳囊的主要用途是作生物有效物质的集装箱和运输工具。
特别优越之处在于：在经过壳层时能够用它交换有酶的活性的基质和产品。
按本发明的意义，纳囊具有扩散明显的结构，这种结构可使尺寸很大的分子从脂层溶解出来的时候得到交换。然而，酶这样的大分子即被壳层保留下来。本发明的纳囊的其他应用是封装酶类后使其反应产生催化作用，以便其基质和产品能经过壳层。在纳囊中包装这样一个生物学上的大分子，从技术角度来看是有优点的，这就是扩散的途径极小，因此在结合时也提高了封装的酶的特异活性。此外，还能避免交联剂在出现化学固定作用时的影响。
本发明还有另一个用途，就是将发放信号的系统如辣根-过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光标示的大分子封装在纳囊中，这种纳囊会对其他物质显出特异性的结合性质。该系统适合于探测上述其他的一些物质，特别是可在医学或生物化学上作诊断用。对脂质体而言，一个有利的事实，则是纳囊对洗涤剂是稳定的，尤其是对此法中的非特异性结合的那些洗涤剂，如Tween20或Triton X-100都有抑制作用。
本发明的一项应用方案，是使纳囊本身作为发放信号系统的携带者。优点在于制备的纳囊的聚合物具有荧光性质。此外，P1和/或P2的荧光衍生物也可以用来建造纳囊或者按其制法建造有共价结合荧光物质的纳囊。
这里所描述的结构，无论在药物传递方面，在矢量转移和沉积系统方面或在补酶疗法方面，都适合作为药物特效药的携带者。因此，本发明的对象也是利用本发明制造纳囊的方法去制药，纳囊就是为(上述的)有效物质的应用而服务的。探测系统和生化诊断上的另一用途，是对洗涤剂而言在结构上具有特大优点的稳定性，因为采用这些物质一般都是为了抑制非特异性的相互作用。
本发明的纳囊还有一种用处，就是使纳囊获得特异性，而能结合到哺乳动物的目标细胞上。纳囊在这种应用上的意义，是在其表面有一类或几类配体，这些配体的补体结合伙伴就存在于目标细胞的表面上。带有这些性质的纳囊是治疗学上的使者，它能将这些配体导向固定于作用地点。如果对包装所转运的物质有利的话，空心球的内部脂层是可以保存下来的。
本发明的一个实用项目，是使纳囊包含一种能触发免疫反应的物质。
本发明的这个造形还有一个优先方案，就是用纳囊把有效物质转运到哺乳物细胞的胞浆内。这些纳囊所处的状态，是让自己被哺乳动物的细胞吞噬。用本发明作这种造形的纳囊由一个壳层组成，该壳层可被红细胞浆的水解酶裂解。除此以外，壳层是由脂质体制造的，脂质体膜能够同吞噬的囊泡的膜相融合。本发明研制的这种造形基于一个有利的事实，即这种融合并不会把裂解的红细胞浆质的活性给释放到细胞内部。为了这种应用目的，纳囊能载运不同的有效物质。不过，上述的转动法也有一个特殊的优点，就是在转运时不仅有常见的膜的生物学大分子，如蛋白质、肽、抗体、酶、寡核苷酸、脱氧核糖核酸、核糖核酸、激素，而且还有抗生素、杀真菌剂、抗病毒素以及细胞静止素。
按照这里所描述的发明，纳囊是一种亲水的、渗透的和洗涤时稳定的结构，它是由交联的聚合物组成的，这些聚合物因有许多可利用的成分而呈现出非常大的应用特异性。本发明显著拓宽了这些物质的系列，使它们在药物目标、矢量转运、沉积形式方面或在酶的辅助治疗方面能够用作材料的携带者。另外，应用的成分不仅能形成结构，而且也能携带活性。所说的空心球或以具有抗原作用的物质制成，或不引起免疫反应的一些物质制成。
如果利用这里所介绍的结构去封装酶的活，那么由于组织结构的扩散明显而能保证封装的活性保持很高的使用价值。况且在微米和亚微米的范围内，选择尺寸的扩散途径极短。在制备期间，囊壳所封装的物质可以防止在化学上有横向的交联作用，不会因为有这些药品而导至灭活。所以，这里研制的大分子包装乃是最最理想的。
实施例
所应用的缩略符号
PC            磷脂酰胆碱
PS            磷脂酰丝氨酸
HEPES         N-[2-羟乙基哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)]
MES           2-(N-吗啉)-乙基磺酸
Sulfo-SMCC    磺基丁二酰亚氨基-4-[N-顺丁烯二酸亚氨基甲基]-
              环己烷-1-羧化物
BSA           牛血清蛋白
EDC           1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺
CHAPS         3-[(胆酰胺丙基)-二甲基氨]-2-羧丙烷磺酸
DeoxBigCHAP   N，N’-双(3-葡糖氨基丙烷)-脱氧胆酰胺
EDTA          乙二胺四乙酸
实施例1       BSA-藻朊酸盐-纳囊的制法
脂质体的制法
作为基质而使用的脂质体是通过透析一种由PC(47.5mol％)、PS(2.5mol％)和脱氧胆酸钠(50mol％)的含水的混合物而制成的。混合物用150mM的氯化钠在水中透析。
以P1衬层
若以BSA衬层可采用下列最终浓度：脂质体4mg/ml，BSA 10mg/ml，EDC 10mg/ml和MES 50mM pH5.1。把BSA固定在脂质体的表面上至少在37℃下需要一小时，随后通过添加200mM的乙酸钾来终止反应。再经过漂浮则可分离所封入BSA和EDC的剩余产物。
以P2衬层
为了使P1层交联，在衬层脂质体内加入200μg/ml藻朊酸钠和50mMMES-缓冲液pH5.1。交联从添加10mg/ml EDC开始，并在37℃下历时两小时。如上所述，反应随着添加200mM的乙酸钾而终止。
脂质体的洗除
为脱除脂质体可将衬层的脂质体用1％CHAPS进行处理。这样获得的洗涤的稳定的结构在其大小上是符合原始材料的。通过用光散射来测定所加的洗涤剂的前后结果，形成胶囊的效率值约在30-60％之间。
实施例2    用外源凝集素和藻朊酸盐制造胶囊
脂质体的制法
将820mg PC溶解在1ml的乙醇中，再将42mg PC和490mg脱氧胆酸钠溶解在2.5ml的水中。令两种溶液合而为一，并以150mM NaCl补至40ml。脂质体在SephadexG-25型交联葡聚糖仪内经过凝胶过滤可在150mMNaCl中制出。所获得的脂质体通过漂浮在超速离心机内进行浓缩，用超声波短暂处理后，再经过孔宽0.22微米的滤器无菌过滤。
以P1衬层
将5ml的脂质体同1ml MES缓冲液(500mM pH5)和0.3ml的NaCl溶液(5M)混合一起，再将35mg伴刀豆球蛋白A(SIGMA，VI型)和75mg的EDC混合一起，并将混合液在37℃下酝酿成熟3小时。反应随添加2mlHEPES(1M pH8)和0.2ml乙酸钾溶液(5M)而终止。以P1衬层的脂质体经漂浮在超速离心机中进行分离，即可在5ml MES-缓冲液(100mM pH5)中接收。
以P2交联
将2.5ml以伴刀豆球蛋白A衬层的脂质体同0.1ml藻朊酸钠(10mg/ml)和50mg EDC相混合。在该混合液中用100mM MES-缓冲液pH5和200mM NaCl补至4ml，经过一夜酝酿成熟。加入1ml HEPES(1M pH8)和0.2ml乙酸钾(5M)以及每份各含5ml的CaCl2和MnCl2(各为1M)结束反应。
脂质体的洗去和纳囊的分离
用2.5mg DeoxyBigCHAP对上述物质进行处理。空心结构的分离则可利用蔗糖梯度通过超速离心机沉降。纳囊以0.5M的蔗糖层进行沉淀，并在界面上保留2M蔗糖溶液。这样获得的试样不含有可测出的类脂质和1mg/ml蛋白质。应用的伴刀豆球蛋白A在内部结构上对壳层仍有结合力，而且还能结合葡糖化的蛋白质。
实施例3    将葡糖化蛋白质结合在以伴刀豆球蛋白A-藻朊酸盐制造的纳囊上的方法
按照盘茨奈尔等人1995年5月19日在《细胞》81(4)：561-70上所介绍的方法，将酒酵母制成的次级-综合体洗净。再将2…20μl依据实施例2制造的纳球和20μl次级-综合体用80μl缓冲液(50mM HEPES pH7.5，0.5％DeoxyBigCHAP)清洗，并且在4℃下酝酿成熟12小时。令得到的纳球沉降(用贝克曼100.3旋转器转30分钟，速度75,000rpm)，利用SDS-PAGE对次级-综合体的分布进行分析。5μl制备的纳球可使所提供的半数以上的次级-综合体达到结合。
实施例4    在纳囊内包装过氧化物酶
正如实施例2所提到的那样，将脂质体通过凝胶过滤制造出来，然后在最终溶液中加入1mg/ml辣根-过氧化物酶(POD)。未包装的过氧化物酶用漂浮法进行分离。1.3％的开始的酶量和25％加入的类脂体仍存在于漂浮相中。按照实施例2，用伴刀豆球蛋白A和藻朊酸盐接收衬层。
用100μl脂质体的纳囊和100μl没有衬层的脂质体分析包装物。这时两个样品各用100μl的洗涤液(2％DeoxyBIGChap，100mM的HEPES pH7.5和150mM的乙酸钾)进行混合，并在一个超速离心小管中(0.8ml为Beckman SW55)以350μl蔗糖溶液中等密度(0.8M蔗糖，50mM HEPES pH7.5，150mM乙酸钾和0.2％DeoxyBIGChap)和100μl的蔗糖溶液高密度(2M蔗糖，50mM HEPES pH7.5，150mM乙酸钾和0.2％DeoxyBIGChap)作为下层，再以55,000rpm的速度离心一小时。
从2M和0.8M蔗糖之间的相界中收集到纳囊，再将游离出来的蛋白质和分离的壳层从最上面的样品的隆起层去掉。下表列出了没有衬层的脂质体和纳囊中蛋白质、类脂体和过氧化物酶的分布范围。
只有在脂质体衬以伴刀豆球蛋白A和藻朊酸盐层之后，才有一个显著的份额(大约25％)的过氧化物酶以及大约15％的蛋白质在沉降的相中出现。
  脂质体，上相   脂质体，下界层     纳囊，上相     纳囊，下界层
类脂体的分布     100％     0％     100％     0％
蛋白质的分布     97％     3％     87.5％     12.5％
过氧化物酶的分布     100％     0％     73％     27％
实施例5    应用含硫醇的脂质体制造BSA-藻朊酸盐-纳囊的方法
脂质体的制法
将400mg PC和7.5mg十八烷基硫醇溶解在1ml的乙醇中，然后在搅拌下注入40ml的缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.5)。所得脂质体悬浮液在800巴压力下用高压均质器进行处理，最后通过0.45μm滤器施压。
以P1衬层
如上所述，将脂质体用所指定的缓冲剂在5mg/ml的类脂体内予以稀释。然后，加BSA(2mg/ml)和Sulfo-SMCC(2mM)。混合液在室温下经一夜酝酿成熟。
以P2交联
令0.9ml的上述反应的混合液与下列溶液混合：
0.1ml 的MES-缓冲液，500mM pH5
0.8ml NaCl溶液，5M
0.1ml 藻朊酸钠，4mg/ml
0.1ml EDC，100mg/ml
在室温下进行交联两小时。
内部脂质体的溶解
按照上述诸例，内部脂质体的溶解是通过加入洗涤剂完成的。利用散射光强度在加入洗涤剂前后的变化，可以推断出特别稳定的囊壳的形成情况。主要是加1％胆酸钠来溶解脂质体。
实施例6    用带有离子的脂质体制造纳囊
脂质体的制法
将400mg PC、7.5mg十八烷基硫醇和9.7mg的十六基三甲基溴化铵溶解在1ml的乙醇中，然后在搅拌下注入40ml的缓冲液(10mM HEPES，150mMNaCl，5mM EDTA，pH7.5)。再将所得的脂质体悬浮物在800巴的压力下用高压匀质器加以处理。最后在压力下通过0.45μm的滤器过滤。
脂质体的衬层、交联和溶解按照实施例5的方法操作。通过(带有负离子的)BSA在带有正离子的脂质体上的浓缩，可能产生一个快速反应，反应时间可降至两小时。
实施例7    用血色素和藻朊酸盐制造纳囊
脂质体的制法
将400mg PC和7.5mg十八烷基硫醇溶解在1ml的乙醇中，随后在搅拌下注入40ml的缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.5)。再将所得的脂质体悬浮物在800巴的压力下用高压匀质器加以处理，然后在压力下通过0.45μm的滤器过滤。
以P1衬层
如上所述，将脂质体连同已知的缓冲液稀释在5mg/ml类脂体中。随后加入血红素(2mg/ml)和Sulfo-SMCC(2mM)。令该混合液在室温下经过一夜酝酿成熟。
以P2交联
令0.9ml上述反应的混合液，用下列溶液进行混合：
0.1ml的MES-缓冲液，500mM pH5
0.8ml的NaCl溶液，5M
0.1ml的藻朊酸钠，4mg/ml
0.1ml的EDC，100mg/ml
在室温下进行交联两小时。
正如实施例5一样，所产生的壳层的特殊稳定性通过附加洗涤剂和光散测定即可完成。
实施例8    用血色素和壳聚糖酐制造纳囊
脂质体的制法与实施例7相同，并以血色素衬层。
以血色素衬层结束后，在0.9ml的上述反应的混合液中加入下列液体：
0.1ml的MES-缓冲液，500mM pH5
0.08ml的NaCl溶液，5M
0.08ml的由虾蟹制成的壳聚糖酐，85％脱酰，5mg/ml
0.1ml的EDC，100mg/ml
在室温下进行交联两小时。
正如实施例5一样，所产生的壳层的特殊稳定性通过附加洗涤剂和光散射测定即可完成。
实施例9    用其他蛋白质和壳聚糖酐制造纳囊
按照实施例8，在同样条件下，以伴刀豆球蛋白A或胶原蛋白或清蛋白循环进行。
实施例10    用丙烯酸盐制造纳囊
脂质体的制法和实施例5相同，以BSA衬层。
有硫醇反应活性的丙烯酸盐的制法
产生具有游离硫醇功能的丙烯酸盐，是通过还原分解二硫化物交联的聚丙烯酰胺凝胶来完成的。汉森曾经介绍过有关制造和分解这种凝胶体的操作规程(《分析生物化学》76：37-44[1976])。根据这项规程制造的硫醇的聚丙烯酰胺至少有5％的取代度。
具有硫醇反应活性的丙烯酸盐的交联
如上所述，在脂质体内加入具有硫醇反应活性的丙烯酸盐，正如实施例5、实施例7或实施例9一样，它们都是以蛋白质衬层的。此外，聚合物的最终浓度为400μg/ml。就象实施例5一样，可以证实经脂质体洗掉的壳层的特殊稳定性。
实施例11    不用蛋白质制造的纳囊
依照实施例5制备脂质体。
以P1衬层
以实施例5所应用的缓冲剂，将脂质体稀释至5mg/ml的类脂质。接着加入壳聚糖酐(0.25mg/ml)和Sulfo-SMCC(2mM)。令混合液在室温下经过一夜酝酿成熟。
以P2交联
按照实施例10的方法，加入400μg/ml的含硫醇的聚丙烯酰胺进行混合反应。混合液在室温下经几个小时酝酿成熟，然后即可按照实施例5的方法证实壳层通过脂质体清洗的特殊稳定性。
以一种蛋白质衬层
实施例12    用固膜的蛋白质制造纳囊
BSA的改性
将50mg的BSA溶解在2.5ml的缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl，40mM脱氧胆酸钠，pH7.5)中，接着再加入1.25mg的十六烷酸-N-羧基丁二酰亚胺酯。混合液在室温下经两小时酝酿成熟，然后将未结合的十六烷酸-N-羧基丁二酰亚胺酯及其水解产物在Sephadex G25型交联葡聚糖仪中经凝胶过滤进行分离。在这种情况下，应用的是上述的缓冲液，但只包含4mM的脱氧胆酸钠。
脂质体的制法
将400mg PC溶解在1ml乙醇内，并迅速在40ml的缓冲液(20mM的磷酸钠，150mM的NaCl，pH7.5)中进行稀释。所得的脂质体悬浮物在800巴的压力下用高压均质器进行处理，最后在压力下通过0.45μm的滤器过滤。
以改性的BSA衬层
将脂质体用改性的蛋白质混合，并以缓冲液(20mM磷酸钠，150mMNaCl，pH7.5)加满到50ml。然后，再加同量的脱氧胆酸钠，使最终浓度为10mM。轻轻摇动该溶液，在室温下经两小时酝酿成熟。最后在20mM磷酸盐、150mM NaCl、pH7.5下进行透析，以除去洗涤剂。
以藻朊酸盐交联
在衬层的脂质体内加200μg/ml的藻朊酸钠和50mM的MES-缓冲液pH5.1，以便使BSA层交联。交联从加入10mg/ml的EDC开始，在37℃下进行两小时。反应随着附加200mM的乙酸钾而终止。
通过洗涤剂对内部脂层的溶解和散射光强度的比较，可以确定壳层的特殊稳定性。
实施例13    PEG-改性的纳囊
纳囊是按照实施例10的方法用含硫醇的丙烯酸盐制造的。未装入的聚合物通过漂浮法进行分离，所用缓冲液包括10mM的HEPES、150mM NaCl以及5mM EDTA，pH7.5。在漂浮的纳囊内加入等量的缓冲液，使其脂类浓度达到5mg/ml。再在此溶液内加0.5mg/ml的α-甲氧基-ω-马来亚氨基-聚乙烯基乙撑二醇，并在室温下经两小时酝酿成熟。
实施例14    具有荧光作用的纳囊
脂质体的制法
一切处理均在暗室内进行。将400mg的PC和7.5mg的十八烷基硫醇溶解在1ml的乙醇中，随后在搅拌下注入40ml缓冲液(10mM HEPES，150mMNaCl，5mM EDTA，20mM Calcein，pH7.5)。所得的脂质体悬浮物在800巴的压力下用高压均质器进行处理，再在压力下通过0.45μm-滤器过滤。未被封入脂质体的灰质通过Sephadex G25型交联葡聚糖仪经凝胶过滤法分离。为此可用一种包含10mM HEPES、150mM NaCl、5mM EDTA、pH7.5的缓冲液。
脂质体的衬层按照实施例5的方法实行。本实施例所封入的灰质的浓度要能导致散射的荧光本身熄灭。该熄灭效应在灰质排出后即消失在周围介质。这样的纳囊可用来测定不同介质的稳定性，特别是生物系统，如胃内容物、肠内容物、血清、淋巴。

Claims (16)

1.一种制造纳囊的方法，该囊的直径为50纳米至10微米，其特征为，制造成这样的脂质体，这些脂质体以一个聚合物P1作衬层，这样在水溶液中聚合物P1就被结合在脂质体的表面，然后使产生的聚合物P1同一个与之不同的聚合物P2在水溶液中共价交联，有时通过交联还能产生其他聚合物层。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征为，在聚合物交联后，脂质体就被溶解，主要是用洗涤剂洗掉。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征为，从脂质体出发，它们所携带的有生物活性的化合物或深测系统的化合物，在使用此法时都保留在纳囊内。
4.根据权利要求1至3之一所述的方法，其特征为，P1和P2是作为水溶性聚合物而使用的，它们显示的功能基有氨基-，羧基-，硫醇基-，肼撑基-，羟基-，叠氮氢基-，醛基-和/或活性酯基或这些基团的复合物，而其本身却不形成微团或泡状结构。
5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征为，聚合物P1同脂质体的交联或聚合物P1同聚合物P2的交联是利用辅助剂的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征为，作为辅助剂而使用的有异硫氰酸盐、异氰酸盐、酰基叠氮、N-羟基丁二酰亚胺酯、磺酰盐类、醛、环氧化物、碳酸盐、亚胺酸酯、碳化二亚胺、酐、乙酰化卤素、烷基卤素化合物、马来酰亚胺、氮丙啶、吡啶二硫化物、重氮烷、重氮乙酰、羰基二异吡唑、N-羟基丁二酰亚胺三氯甲烷或在适宜的结合中含有这些功能基的化合物。
7.根据权利要求1至3之一所述的方法，其特征为，显示水溶性的聚合物P1或P2有螯合性质或螯形化合的性质。
8.根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征为，聚合物P1和/或P2是蛋白质。
9.根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征为，聚合物P1和/或P2是碳水化合物。
10.根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征为，水溶性的聚合物P1和或P2是合成的聚合物。
11.根据权利要求1至10之一所述的方法，其特征为，所获得的纳囊在其表面上改性，特别是用聚乙烯乙二醇、蛋白质、肽或激素，而主要的是用聚乙烯乙二醇。
12.一种直径为50纳米至10微米的纳囊，其特征为，纳囊的壳层至少由两种不同的相互交联的聚合物P1和P2组成。
13.根据权利要求12的纳囊，其特征为，有一种附加的脂层存在，该层上还有聚合物层。
14.一种纳囊，其是由权利要求1至11之一或多项所述的方法制备的。
15.权利要求12至14之一所述的纳囊应用于以有效物质制药。
16.权利要求12至14之一所述的纳囊应用于作生物化学诊断。
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