CN1905806A - 带有吸附的或结合的生物分子的胶－壳珠子 - Google Patents

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苏堪塔·本纳吉
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase

Abstract

公开了胶－包被的珠子(包括HydrogelTM－包被的珠子)，其能够分别吸附或吸收蛋白和其它生物分子到胶包被上或到胶包被内。带有吸收或吸附的生物分子的胶包被的珠子适用于检测、纯化或其它目的。珠子可具有许多材料中的任意材料制成的核，所述材料包括橡胶，并以胶壳包被。在吸附后，生物分子可由共价连接保持在胶内，或者由选择环境pH和/或离子强度的条件而保持在胶内，从而不需要进一步的反应来维持。因此，吸附的蛋白将保持结合于其相应配体的能力。

Description

带有吸附的或结合的生物分子的胶-壳珠子
相关申请
本申请要求2003年10月28日提交的美国临时申请60/515,079的优先权。
发明领域
本发明涉及胶包被的珠子。
发明背景
微阵列是综合分析生物分子间相互作用的有力工具，包括蛋白-蛋白和寡核苷酸-寡核苷酸间相互作用。这种分析对鉴定分子和诊断生理或疾病状态有用，并有广泛的潜力。在所有微阵列中，由首先固定化一套阵列格式的生物分子到载玻片上而分析相互作用。然后，用一套荧光-标记的互补配体将载玻片探针化，并标注任何结合。
与DNA阵列相比，装配可用的蛋白阵列通常更困难，技术上更有挑战性。这是因为，蛋白本质上是片段性分子，对暴露于低温和高温、pH极值、疏水表面、高度剪切和脱水等条件敏感。这是必要的，所以在蛋白微阵列的制备、贮存和操作过程中避免这些条件。
对这些问题的一种优选解决方案是把蛋白连接到编码的微珠颗粒，编码的微珠颗粒包括聚合物树脂制成的编码的颗粒(提交于2002年8月23日的美国专利申请No.10/204,799、WO01/98765“使用特异-应用的随机颗粒阵列的多分析物分子分析(multianalyte molecular analysis usingapplication-specific random particle arrays)”，以引用的方式并入本文)。然后编码的捕获-蛋白包被的颗粒以二维(2D)阵列格式装配，并置于预期含有靶蛋白的样品中。然后由荧光检测信号的存在，确定捕获蛋白和靶蛋白间的结合。可以通过解码阵列而确定产生阳性检测信号的特定捕获蛋白。对于把蛋白固定化到微颗粒上，有许多已知和市售的方法(BangsLaboratories Inc.，TechNote#205 Covalent Coupling，2002 and TechNote#204，Adsorption to Microspheres，1999)。大多数通常使用的方法导致蛋白随机共价结合或粘附在微颗粒表面上，这经常带来错误地定向的分子，其不能参与结合。此外，使用不正确的化学作用本身可以化学修饰，并因此使蛋白分子变性。
使用位点-选择性的化学作用把蛋白偶联于表面，可以避免一些上述问题。原则上，这种定向的连接使得蛋白的活性位点易接近，并增加其稳定性(Peluso，P.et al.，Analytical Biochemistry 312(2003)113-124)。然而，这种技术在使用上受限制，因为它们需要另外的蛋白修饰、纯化和浓缩步骤，这对使用大量独特分子是不切实际的。因此，需要选择使得不同类型蛋白固定化并保持它们二级结构和生物活性的表面化学作用和表面拓扑结构。
水凝胶是三维亲水聚合网状物，能够吸收大量的水。它们的高含水量提供了一种“蛋白-友好”的环境，近来它们已经由于潜在的作为微阵列基质的应用而受到注意( www.perkilelmer.com/proteomics：HydroGelApplication Note)。Arenkov等人(Arenkov，P.等人.Analytical Biochemstry，278，123-131(2000))报道了装配在胶垫(100μm×100μm×20μm)中固定化蛋白而产生的阵列，胶垫还连接玻璃载玻片表面。由于是三维阵列结构，蛋白质固定化作用报道为很有效。含水的环境帮助保持蛋白的天然形式，并且蛋白对检测结合反应是自由接近的。此方法的主要缺点是复杂的装配工艺，以及由于运输缺陷，难以把未结合的蛋白从胶垫上移去。
因此这些方法都不能有效地为多重蛋白-配体相互作用提供一个宽阔的平台，多重蛋白-配体相互作用与蛋白结构和功能的广大多样性一致，并允许维持二级和三级蛋白结构。
发明概要
公开了胶-包被的珠子(包括HydrogelTM-包被的珠子)，其能够分别吸附或吸收蛋白和其它生物分子到胶包被上或到胶包被内，适用于检测、纯化或其它目的。尽管生物分子可以吸附或吸收到胶内，每种情况的吸收将由不同机制驱动，从实践的观点来看，每种情况的结果是负载有生物分子的胶，带有用于配体结合的结合位点。结合配体后产生的检测信号将大于生物分子以另一种方法结合于珠子的情况，因为结合位点在吸附/吸收到胶时(此过程此后以方便起见总称为“吸附”)趋向于保持可用。珠子可以是指核-壳珠子(或核-壳颗粒)，具有许多材料中的任意材料制成的核，所述材料包括橡胶，并以胶壳包被。在吸附后，生物分子可以由共价连接保持在胶内，或者由选择周围pH和/或离子强度的情况，从而不需要进一步的反应来维持。
如以上说明的，吸附了蛋白或其它生物分子的胶-壳珠子可以用于检测。尤其是，胶-壳珠子可以吸附蛋白并用于配体检测，配体包括能与吸附的蛋白反应的酶、抗原或抗体。胶层的性质是使得所吸附受体或捕获蛋白的抗原决定基和/或活性不改变或受影响。因此，吸附的蛋白将保持结合于其相应配体的能力。
还公开了一种使用胶-壳颗粒以选择性地从分析物粗制混合物捕获特异核酸或蛋白的工艺，所述分析物例如全血或细胞裂解物。含有全血的样品放在与胶-壳颗粒接触，这种颗粒已经用相关的配体分子官能化。红细胞和白细胞由于其大小而自动地由胶筛选出，只有小于胶中孔的分子能够进入并结合配体。质膜中足够小以进入胶的成分结合配体，此结合可以由常规方法检测。其余成分可以容易地洗去。以这种方式，提高了检测结果的可靠性，由于分离了大的分析物，大的分析物不会发生结合。
胶-壳颗粒也可以用作微反应器，例如用在分离并增加辨别发生在不同珠子上的不同结合反应，如使用ELISA检测。在常规的表面上带有受体-配体复合物的点阵列中，由通常与二级检测剂(二级抗体，链霉亲和素(Streptavidin)或类似物)关联的一种酶的存在检测其结合。在存在合适底物时，关联酶催化荧光或有色的产物在此处形成。然而，这样的产物通常趋向于沿着阵列扩散，并污染相邻点的信号。这阻止了开发具有高特征密度的微阵列，高特征密度在ELISA格式中是有用的。然而，由本发明的胶-壳颗粒，来自结合事件的信号可以利用底物与产物之间的分配系数差保持局限在颗粒的胶壳内。例如，胶-壳可以是两亲性的，具有亲水域和疏水域。亲水域可以作为酶的反应容器，疏水域用于分开荧光产物和疏水产物。这样的化学作用近来报道于文献中(Kiyonaka，S.等人，NatureMaterials，3，58-64(2004))。
胶-壳吸附的蛋白或其它生物分子可以用作一步法检测和纯化同源配体的试剂。在这种方法中，吸附有生物分子的核-壳珠子填充到有开口的固定细胞中，将要检测/纯化的底物的样品穿过此细胞。检测结果可以由可透过的细胞开口原位监控，对于纯化步骤，珠子可以从柱移去，然后用已知方法从珠子洗脱蛋白。
核-壳珠子和它们的各种用途在以下进一步描述。
附图说明
图1示意性地表示蛋白共价偶联和吸附/吸收到胶-壳珠子上。
图2表示来自固定化到胶-壳珠子上的蛋白L在3种不同温度下的信号强度对蛋白L浓度作图。
图3表示来自固定化到胶-壳珠子上的蛋白L的信号强度对蛋白L与珠子培养的时间作图。
图4A表示来自在各种pH固定化到胶-壳珠子上的蛋白L的信号强度，和在各种pH与胶-壳珠子一起培养的BSA的信号强度。
图4B表示对图4A的柱状图的信号强度对pH作图。
图5表示来自在不同pH固定化到胶-壳珠子上的山羊抗-人IgA抗体-Cy5结合物的信号强度对蛋白与珠子培养的时间作图。
图6表示来自固定化到胶-壳珠子上的不同蛋白的信号强度，此固定化是在不同盐浓度和pH3.0进行的反应。
图7表示来自以不同浓度固定化到胶-壳珠子上的不同蛋白的信号强度，此固定化是在相当低的固定离子浓度和pH3.0进行的反应。
图8表示含有抗-SSA-60、抗-SSB、抗-CENP和抗-Jo-1抗体的混合血清样品与所示抗原板反应的结果，这里抗原已经吸附到胶-壳珠子。
图9表示在pH3.0和不同盐浓度，抗-SCL-70血清与吸附到胶-壳珠子上的SCL-70和Sm反应的结果。
图10表示在pH3.0和不同盐浓度，抗-Sm血清与吸附到胶-壳珠子上的SCL-70和Sm反应的结果。
图11表示使用对链霉亲和素-HRP的荧光生物素靶和BSA对照的荧光信号，其中链霉亲和素-HRP和BSA被动吸附固定化到薄和厚-壳胶-壳珠子。
图12表示来自链霉亲和素-HRP和BSA对照的荧光信号，链霉亲和素-HRP和BSA由被动吸附固定化到薄和厚-壳胶-壳珠子，信号由不同于图11中的一种反应物产生。
图13A表示由特异人类血清检测的胶-壳珠子吸附HLAI类抗原的结果。
图13B表示由抗-I类单克隆抗体检测的胶-壳珠子吸附HLA I类抗原的结果。
图13C表示由特异人类血清检测的胶-壳珠子吸附HLA II类抗原的结果。
图13D表示由抗-II类单克隆抗体检测的胶-壳珠子吸附HLA II类抗原的结果。
图14A表示将蛋白共价固定化到官能化胶-壳的EDAC-介导反应。
图14B表示将蛋白共价固定化到官能化胶-壳的EDAC-NHS-介导反应。
图15A表示由单步骤EDAC反应偶联于官能化胶-壳珠子的中和亲和素(Neutravidin)的结果。
图15B表示由EDAC-NHS步骤偶联于官能化胶-壳的鼠抗-生物素mAb，结合生物素-(dT)5-Cy5.5的结果。
图15C表示由EDAC-NHS步骤偶联于官能化胶-壳的鼠抗-生物素-Fab，结合生物素-(dT)5-Cy5.5的结果。
图15D和15E表示来自由EDAC-NHS步骤偶联于官能化胶-壳的SCL-70，由标记的检测抗体而确定的结果。
图16是醛-介导的蛋白与官能化胶-壳的共价偶联反应。
图17A和17B表示由结合生物素-(dT)5-Cy5.5到鼠抗-生物素抗体而检测的结果，其中鼠抗-生物素固定化到醛胶-壳珠子上。
图17C表示由结合标记的山羊抗-鼠IgG到鼠抗-生物素抗体而检测的结果，其中鼠抗-生物素固定化到醛胶-壳珠子上。
图18表示使用自体-抗原SSB包被的醛胶-壳珠子与SSA/SSB阳性血清反应的结果，并使用标记的抗-人IgG检测结合。
图19是甲苯磺酰基-介导的蛋白与官能化胶-壳的共价偶联反应。
图20表示细胞和珠子在检测格式中的相对位置，这种格式是用于监控和确定由细胞释放细胞因子。
发明详述
制备携带系留的或物理吸取的保持高度生物活性的蛋白或其它生物分子的胶包被(胶-壳)珠子的步骤如下：
(i)分散本发明的胶-壳珠子到合适的缓冲液中(图1A)；
(ii)向珠子悬浮液中加入将要固定化的生物分子含水或缓冲的溶液(图1D)；
(iii)把此混合物置于生物分子固定化的步骤(图1B和图1E)；和
(iv)从珠子分离游离的生物分子并在所选缓冲液中重悬珠子(图1C和图1F)。
任何聚合物都可以用于提供核聚合物颗粒，只要此聚合物颗粒的稳定悬浮液是可用的。合适的聚合物包括同聚物或共聚物，这里共聚物包括两种或多种单体单元形成的聚合物，还包括有时称为“三聚物”的三种或多种单体单元形成的聚合物。疏水的聚合物，包括乙烯基类单体的聚合物，即，含有乙烯基的单体是优选的，包括具有苯乙烯基的单体。优选的一组聚合物包括聚苯乙烯或含有大约50％至大约100％重量比苯乙烯单体单元的聚苯乙烯共聚物。聚合物任意地可以是交联或非交联的。在一个实施例中，微粒由聚苯乙烯与1％二乙烯基苯交联形成，1％是基于微粒的重量比。在另一个实施例中，微粒包括苯乙烯/甲基丙烯酸共聚物，此共聚物含有大约0.6至大约1％微粒重量比的甲基丙烯酸。
合适的聚合材料，以示例而决非限制的方式，包括以下单体的聚合物：
丙烯酸，或其任何酯，诸如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯或丙烯酸缩水甘油基酯；
甲基丙烯酸，或其任何酯，诸如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸十二烷基酯、甲基丙烯酸十六烷基酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸四甘醇酯、甲基丙烯酸缩水甘油基酯或N，N-(甲基丙烯酰氧基羟丙基)-(羟基烷基)氨基乙基酰胺基偶氮烷酮(amidazolidinone)；
烯丙基酯类诸如甲基丙烯酸烯丙基酯；
甲叉丁二酸，或其酯；
丁烯酸，或其酯；
马来酸，或其酯，诸如马来酸二丁基酯、马来酸二辛酯、马来酸二辛酯或马来酸二乙基酯；
苯乙烯，或其取代衍生物，诸如乙基苯乙烯、丁基苯乙烯或二乙烯苯；
包括一个胺官能性的单体单元，诸如甲基丙烯酸二甲基氨基乙基酯或甲基丙烯酸丁基氨基乙基酯；
包括一个酰胺官能性的单体单元，诸如丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；
含有乙烯基的单体诸如乙烯基醚类；二乙烯基硫醚类；乙烯醇类；乙烯基甲酮类；乙烯基卤化物类，诸如氯乙烯；乙烯基酯类，诸如乙酸乙烯酯或叔碳酸乙烯酯；乙烯腈类，诸如丙烯腈或甲基丙烯腈；
亚乙烯基卤化物类，诸如偏二氯乙烯和偏二氟乙烯；
四氟乙烯；
二烯烃单体，诸如丁二烯和异戊二烯；和
烯丙醚类，诸如烯丙基缩水甘油醚。
合适的聚合材料包括以下聚合物，以示例决非限制的方式：多氧化物类，诸如聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)；聚酯类，诸如聚(对苯二酸乙烯酯)；聚氨酯；多磺酸盐；聚硅氧烷，诸如聚(二甲基硅氧烷)；多硫化物；聚乙炔；聚砜；聚磺胺；聚酰胺类诸如聚己内酰胺和聚(己二酰二胺)；聚亚胺；聚尿素；杂环聚合物诸如聚乙烯基吡啶和聚乙烯基吡咯烷酮；天然产生的聚合物诸如天然橡胶、明胶、纤维素；聚碳酸酯；聚酐；和聚烯烃类诸如聚乙烯、聚丙烯和乙烯-丙烯共聚物。
聚合材料可以含有官能基团诸如羧酸酯类、酯类、胺类、醛类、醇类、或卤化物类，它们提供连接期望增强颗粒在化学或生物分析中应用的化学或生物部分的位点。从这种聚合物制备微粒的方法是本领域中熟知的。制备核微粒的代表步骤在以下示例中列出。
胶-壳可以由任何聚合物-包被技术形成。如果形成壳的聚合物比形成核的聚合物表现较高的极性、或较低的界面张力，胶-壳珠子的核-壳形态是热力学上有利的。如果形成壳的聚合物比形成核的聚合物容积率大，核-壳形态也是有利的。因此，核-壳颗粒的合成在壳/核重量比大于1时进行。在一些实施例中，核聚合物是疏水的，胶-壳聚合物是相对亲水的并携带相关的官能团。
可以选择在这些约束内的任何单体或单体的组合作为胶-壳聚合物。乙烯基单体的混合物是优选的。根据本发明一个实施例，甲基丙烯酸甲基酯作为主要组成部分，甲基丙烯酸羟乙基酯作为次要组成部分，用于形成聚苯乙烯或修饰的聚苯乙烯核上的壳。一个这种单体混合物包括重量比大约6％的甲基丙烯酸羟乙基酯、大约5％至大约20％甲基丙烯酸，平衡物为甲基丙烯酸甲基酯。这些单体比聚苯乙烯更加亲水。
珠子的大小可以如适于计划的目标用途而选择。典型地，颗粒尺寸可以从直径大约0.1至大约100微米，典型地从大约0.5至大约50微米，更典型地从大约1至大约10微米。优选地，珠子是“单分散性的”，即，一套珠子具有狭窄的尺寸范围，优选地显示平均直径的变异系数(“CV”)为不超过5％。
由根据已知的步骤在核或壳中合并合适的磁性材料，胶-壳珠子可以表现为磁性地响应。根据一个这种方法，颗粒以铁磁流体包被，诸如实例17中所示的铁磁流体。此处使用的“磁性响应”是指对使用磁场做出响应而改变位置或定向的能力。
由于结合了荧光染料，胶-壳珠子可以表现荧光。染料可以包括任何赋予光学上可检测的颜色或荧光的染料。颜色或荧光可以由裸眼检测，或以显微镜或其它光学工具辅助检测。当使用多于一种染料时，可以选择染料使它们具有大致不同的吸收光谱、发射光谱或发射寿命。
合成胶-壳珠子以后，相关的生物分子置于与胶-壳珠子接触。当胶-壳与含有一种诸如生物分子的溶质的溶液接触时，生物分子在胶和周围的液体之间分配。生物分子在带电、pH-敏感的胶中的分配系数，由溶液特性影响，诸如pH、温度和离子强度，并由材料特性影响，诸如胶成分、电荷密度、交联、和水凝胶的聚合片段。这些参数任意之一的改变会影响三种主要机制，这些机制促进在带电水凝胶中的分配：尺寸排阻、静电学、和小范围相互作用诸如疏水性。大生物分子在胶中的分配依赖于胶的多孔性。然而，胶中的多孔性或孔径不能容易地确定，因为通常使用的制作方法不能导致大的、永久的孔。更准确的说，多孔性是柔性、易变的、含水的聚合物链之间临时间隔的结果。因此，较高的膨胀无疑有利于用于大生物分子的较高分配系数。对于肉眼可见的胶的一个问题是，分子进出胶的运输通常由扩散控制并因此是个缓慢的过程。然而，在目前的情况下，运输进出胶-壳是快速的，因为扩散的典型时间是与壳厚度的平方成比例的，壳厚度只是一微米的小部分。除了多孔性，静电学和动电学效果对蛋白在带电胶中的分配起重要作用。膨胀的带电胶与蛋白之间的相互作用力可以是净-吸引或净-排斥的，取决于pH小于还是大于蛋白质的pI，以及蛋白的电荷是否与胶相反。由于静电相互作用，高的胶电荷密度和蛋白与胶的相反电荷有利于较高的分配。
根据本发明，相关的生物分子的固定化可以由以上描述的物理吸取步骤进行，然后是使用任何熟知的偶联反应共价偶联(见图1B)，偶联反应诸如碳二亚胺偶联、醛偶联或甲苯磺酰基酯偶联(见以下)。可以使用其它使用酯类、醇类、胺类、硫醇类、卤化物类、酰肼类或环氧化物类的方法，如由本领域中熟知的方法。
可选地，在起始生物分子吸取之后，可以使用刺激物-敏感的胶-壳开始瓦解转变，有效地捕获吸取的生物分子(见图1E)。刺激物-敏感的胶与不连续的平衡体积的转变一起对它们环境中小变化响应。这样的胶可以根据它们响应的刺激物分类，诸如：温度-、pH-、离子强度-、光-、电-或磁场-敏感。这种胶已经广泛地研究，作为组织工程和药用蛋白受控的释放的骨架(N.A.Peppas：药物和药学中的水凝胶(Hydrogels in Medicineand Pharmacy)，Vol.1.基本原理(Fundamentals)，CRC Press，Boca Raton，FL，1986，180 pages，N.A.Peppas：药物和药学中的水凝胶(Hydrogels inMedicine and Pharmacy)，Vol.2.聚合物(Polymers)，CRC Press，Boca Raton，FL，1987，172 pages以及N.A.Peppas：药物和药学中的水凝胶(Hydrogelsin Medicine and Pharmacy)，Vol.3.性质和应用(Properties and Applications)，CRC Press，Boca Raton，FL，1987，196 pages)和作为用于分离和纯化蛋白的色谱支撑介质(Sassi，A.P.等人，AIChE Journal 42(8)：2335-2353(1996))。在瓦解的胶中，低程度的膨胀也有利于蛋白的高分配，但这种稳定的分配由不同的机制驱动。在皱缩的胶层中聚合物浓度的增加导致吸引的聚合物-蛋白相互作用(主要的小-范围相互作用诸如疏水相互作用)。文献中已经报道了多种方法来调整pH敏感胶的瓦解转变pH。例如，为了合并疏水部分到基于聚丙烯酸的胶中，瓦解发生的pH可以调整为从5至7(Philippova，O.等人.Macromolecules，30，8278-8285(1997))。此外，由于疏水相互作用的分配通常导致不可逆的捕获水凝胶中的蛋白分子(Sukhishvili，S.A.，and Granick S.J.Chem.Phys.110，20，10153-10161(1999))，这使得任何分配后用于固定化蛋白的共价反应不必要。
实施例
I.制备颗粒
实例1-制备聚合物核颗粒
适于以水凝胶包被的聚合物颗粒如下制备。装有回流冷凝、1个N2进口-出口接头和搅拌器的250ml圆底玻璃烧瓶，置于恒温水浴。向烧瓶加入4.2g聚乙烯吡咯烷酮(Aldrich，MW～29,000)和106g乙醇(Aldrich，200检验，99.5％)的溶液。烧瓶内容物加热到70℃，加入26g苯乙烯(Aldrich，99+％)和0.156g甲基丙烯酸(Aldrich，99％)。苯乙烯和甲基丙烯酸也由真空蒸馏新鲜纯化。由加入溶解在10g乙醇中的0.265g 2，2’-偶氮二异丁腈(Aldrich，89％)而开始聚合作用。搅动速度为200rpm，反应时间为24h。在反应的末尾，冷却体系到室温。按重量测量的单体转化率为81.7％。乳胶在1,000rpm离心15min，移去上清液。通过在乙醇中重悬和离心而把聚合物颗粒净化3次。然后，聚合物重悬在0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.02％二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠盐(Fluka，99.0％)在蒸馏水中1∶1的混合物中，混合并在2,000rpm离心20min。重复此操作，最终把颗粒悬浮于乳化剂溶液的同样混合物中。乳胶固体含量为16.9％。得到单分散性的聚苯乙烯颗粒的平均直径由SEM测量为2.78±0.06μm，CV2.0％。
为了制造较大直径的核颗粒，使用与以上相同的步骤，除了在起始聚合反应时使用10g乙醇中的0.25g 2，2’-偶氮二异丁腈。22小时后，由冷却而终止反应，转化的单体测量为89.0％。净化乳胶并最终制成21.9％固体。由SEM测量的颗粒直径为3.08±0.11μm，CV3.5％。
实例2-合成壳/核重量比为1.0的胶-壳颗粒(厚-壳)
以上制备的颗粒使用以下步骤用水凝胶包被，以得到厚-壳核壳珠子。向颗粒直径2.78μm、固体含量16.9％的49.4g乳胶颗粒(以上实例中制备的)加入含有6％甲基丙烯酸羟乙酯、20％甲基丙烯酸以及0.21g t-丁基过氧-2-己酸乙酯(Luperox 26，ATOFINA)的8.33g甲基丙烯酸甲酯。混合物置于250ml螺帽玻璃瓶中，并摇动至少0.5h。然后，加入溶解在16.67g混合物中的0.21g CuCl2.2H2O，此混合物是0.2％PVP和0.02％二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠盐在蒸馏水中的1∶1混合物。之后加入0.27g甲醛次硫酸钠盐(Aldrich)、3.3g溶液中的0.014g双胺四乙酸乙烯酯-铁钠复合体(Aldrich)，这种溶液是同样的0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.02％二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠盐的1∶1混合物。瓶子置于45℃的水浴摇动器。反应进行6h。乳胶过滤通过100μm尼龙过滤器，在1000rpm离心20min。除去上清液，用0.1％pH10的吐温溶液净化颗粒多次，由在滚筒中混合10h然后离心和倾滤。最终颗粒悬浮在0.1％吐温溶液。平均颗粒直径为3.29±0.06μm，CV为1.9％。
实例3-合成壳/核重量比为0.5的胶壳颗粒(薄-壳)
制造薄-壳核壳珠子的步骤与以上描述的类似，除了核颗粒直径为3.08μm(如在前实例中描述的)，成份的特定量不同。总之，如在前实例中制备的57.2g乳胶(21.9％固体)与含有6％甲基丙烯酸羟乙酯、20％甲基丙烯酸以及0.107g t-丁基过氧-2-己酸乙酯的4.17g甲基丙烯酸甲酯。加入溶解在16.67g混合物中的0.1g CuCl2.2H2O，此混合物是0.2％PVP和0.02％二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠盐在蒸馏水中的1∶1混合物。之后加入0.15g甲醛次硫酸钠盐、3.3g溶液中的0.007g双胺四乙酸乙烯酯-铁钠复合体，这种溶液是同样的1∶1乳化剂混合物。乳胶颗粒直径为3.23μm±0.08，CV为2.7％。
II.在各种条件下蛋白向胶-壳珠子的被动吸附
在以下实例中，蛋白被吸收到包被在珠子上的水凝胶中。可见，对于在一定条件(低pH和低盐浓度、或高盐浓度)下的吸附，蛋白可以保持在水凝胶壳中，不会被动地扩散出，即使改变了条件。可以选择pH和离子强度以在一个范围内，这个范围不会影响吸附的蛋白与其配体的相互作用。
实例4-蛋白依赖于温度的被动吸附到薄-壳珠子上
使用重组的蛋白L(来自Sigma Chemical Co.的“Pro-L”)进行实验以检查温度对蛋白被动吸附至薄-壳珠子上的效应。洗涤不同的荧光-着色的薄-壳珠子，并与Pro-L以每mg珠子25、100、400和1600μg的浓度混合。反应在500μL PBS(磷酸缓冲盐，pH＝3，由HCl调节)中进行，在三种温度条件下各反应4小时-室温(大约25℃)、37℃、和50℃。然后在室温以500μL贮存缓冲液(PBS，pH＝7.2、0.1％BSA和0.1％叠氮化物)培养Pro-L包被的珠子过夜将其封闭。这些珠子单独贮存于4℃，直到使用它们。
因为蛋白L对人类免疫球蛋白具有高结合亲和力，偶联效率由测量人IgG与各类珠子的结合活性而间接地监控。混合Pro-L包被的珠子并装配在硅芯片上，然后芯片接触一个人血清样品(来自SLR Research的AAB224，1-50稀释)以允许Pro-L与人类IgG分子相互作用。移去非-特异性结合的抗体后，使用一种山羊抗-人IgG特异抗体-Cy5结合物以观察捕获的抗体。使用装有CCD相机的显微镜得到解码和检测图片。提取并分析检测信号。图1表示：(1)抗体结合活性以依赖浓度的方式增加，在以每mg珠子1600μg Pro-L偶联的珠子观察到最高活性；(2)抗体结合活性还以依赖温度的方式增加，在50℃包被的珠子观察到最高活性，50℃是测试的最高温度。信号强度反映了偶联到各珠子上的蛋白量。
这些结果说明，较高的温度条件(直到大约50℃)促进蛋白吸附到薄-壳珠子上。
蛋白L偶联到薄-壳珠子的步骤：
1.添加10μL 1％珠子(10μg)到含有500μL PBSLT的离心管，涡旋混合。
2.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
3.在500μL PBSLT中重悬珠子，涡旋混合。
4.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
5.在500μL PBS(pH＝3)中重悬珠子。
6.向各管加入合适量的蛋白L。涡旋混合。
7.在合适温度下培养4小时，同时旋转。
8.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
9.以500μL贮存缓冲液洗涤一次。
10.重悬于500μL贮存缓冲液中，室温下过夜培养，同时旋转。
11.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
12.以500μL贮存缓冲液洗涤一次。
13.重悬于初始体积的两倍体积中。
14.贮存于4℃备用。
实例5-蛋白依赖于时间的被动吸附到胶-壳珠子上
进行实验以检查时间对蛋白L(Pro-L)被动吸附至薄-壳珠子上的效应。洗涤不同的荧光-着色的薄-壳珠子，重悬于500μL PBS(pH＝3)，并与Pro-L以每mg珠子100μg的浓度混合，由添加64μL至总体积为564μL。反应在37℃培养箱中进行，同时旋转15min、30min、1hr、2hr、3hr和4hr。然后在室温以500μL贮存缓冲液(PBS，pH＝7.2、0.1％BSA和0.1％叠氮化物)培养Pro-L包被的珠子过夜将其封闭。这些珠子单独贮存于4℃，直到使用它们。
混合Pro-L包被的珠子并装配在硅芯片上，然后芯片接触一个人类血清样品(来自SLR Research的AAB224，1-50稀释)以允许Pro-L与人类IgG分子相互作用。移去非-特异性结合的抗体后，使用一种山羊抗-人IgG特异抗体-Cy5结合物以观察捕获的抗体。使用装有CCD相机的显微镜得到解码和检测图片。提取并分析检测信号。图2表示抗体结合活性与蛋白吸附的时间长度相关。抗体结合活性在15min开始显现，在培养4小时后得到峰值，4小时是测试的最长时间。
实例6-蛋白依赖于pH的被动吸附到胶-壳珠子上
使用Pro-L和人类血清样品评估pH对蛋白L(Pro-L)被动吸附至薄-壳珠子上的效应。蛋白由被动吸附偶联于不同的荧光-着色的薄-壳珠子。反应在不同pH(即3、5、7、9和11)的磷酸缓冲盐中在37℃进行4小时。然后在室温以含有BSA的贮存缓冲液(PBS，pH＝7.2、0.1％BSA和0.1％叠氮化物)培养Pro-L包被的珠子60min。Pro-L偶联的珠子重悬于贮存缓冲液，单独贮存于4℃直到使用它们。
混合以Pro-L偶联的珠子并装配在硅芯片上，然后芯片以两个人类血清样品在室温培养30min。移去非-特异性结合的抗体后，珠子芯片与荧光标记的检测抗体(山羊抗-人IgG特异抗体-Cy5结合物)一起在室温培养15min以观察各珠子捕获的IgG分子。使用装有CCD相机的显微镜得到解码和检测图片。然后提取并分析检测信号。图4A表示在pH3偶联的珠子观察到最高的IgG-捕获活性，任何BSA(阴性对照)包被的珠子没有观察到显著的活性。这些结果说明，低离子强度(pH＝3)促进被动吸附。
类似地，在另一个关于厚-壳珠子的实验中，荧光标记的蛋白(山羊抗-人IgG特异抗体-Cy5结合物)在酸性缓冲液(pH＝3)进行的被动吸附与在中性(pH＝7)或碱性(pH＝11)缓冲液中偶联的比较，导致显著高的荧光信号强度。因为染料-蛋白复合体是固定化的并观察到没有第二步检测，信号强度反映了偶联于各珠子的实际蛋白量(数据未显示)。
使用来自Molecular Probes，OR的Bodipy-FL标记的亲和素(avidin)(一种具有高达pI值10的蛋白)进行了一个类似的实验。简略之，500μg洗涤过的薄胶-壳珠子与500μg标记的蛋白一起培养，此蛋白悬浮在500μl在合适pH(pH由稀释的HCl或NaOH调节)的50mM NaCl溶液中。混合物培养1小时，然后由离心分离珠子，洗涤珠子并贮存在磷酸缓冲盐中。为了分析，取出一小部分珠子，装配在芯片上并记录它们的绿色荧光。图4B表示珠子上的绿色荧光记录为pH的函数的绘图。如前可见，在pH＝3有明显的增加的蛋白摄取迹象。
所有实验证据都支持：蛋白到薄或厚壳珠子的被动吸附在酸性缓冲条件下比中性或碱性缓冲条件下更好地得到。因此，酸性缓冲液用在其它蛋白的被动吸附。
Pro-L在不同pH水平偶联薄-壳珠子的步骤：
1.添加10μL 1％珠子(10μg)到含有500μL PBSLT的离心管，涡旋混合。
2.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
3.在500μL PBSLT中重悬珠子，涡旋混合。
4.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
5.在不同pH(3、5、7、9、11)的500μL PBS中重悬珠子。
6.向各管加入合适量的蛋白L。涡旋混合。
7.在37℃培养4小时，同时旋转。
8.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
9.以500μL 贮存缓冲液洗涤一次。
10.重悬于500μL贮存缓冲液中，室温下培养60min，同时旋转。
11.在10000rpm下旋珠子3min，并弃去上清液。
12.以500μL贮存缓冲液洗涤一次。
13.重悬于初始体积的两倍体积中。
14.贮存于4℃备用。
实例7-低盐对蛋白被动吸附至胶-壳珠子上的效应
为了检查盐对蛋白固定化的效应，蛋白L、SSA-60和Jo-1偶联于具有不同盐浓度的PBS缓冲液中的不同荧光-编码的薄-壳珠子。所有这些缓冲液都用HCl调节pH至3。反应在37℃在三种不同盐浓度条件下进行4小时-普通PBS(0.1M磷酸钠；0.15M氯化钠)、1-10稀释的PBS(10mM磷酸钠；15mM氯化钠)和1-50稀释的PBS，然后在室温在含有BSA的贮存缓冲液中培养60min。混合珠子并装配在硅芯片上，然后芯片与合并的人类血清样品一起培养，此样品含有抗-SSA-60和抗-Jo-1抗体、或只含有缓冲液作为阴性对照。移去非-特异性结合的抗体后，珠子芯片与山羊抗-人IgG特异抗体-Cy5结合物一起在室温培养15min。得到解码和检测图片，提取并分析检测信号。
如图5所示，使用低盐缓冲液偶联的珠子比在普通PBS偶联的具有显著高的抗体反应，说明被动吸附在低离子强度环境中较有利。类似地，对于包括HLA I类、II类抗原、人类IgG、鼠IgG、SSB、和CENP的蛋白，在低盐和酸性缓冲条件下它们固定化到珠子上，得到较高的抗体反应(结果未显示)。
实例8-由被动吸附偶联的抗原板，用于自体-抗体筛选和疾病阳性血清样品的滴定曲线
为了评价被动吸附的蛋白用于自体-抗体筛选的可行性，通过由在低盐和低pH条件下被动吸附偶联自体-抗原——SSA-60、Sm、Sm/RNP、Jo-1、CENP、和SSB到薄-壳珠子上，而建立一个6-抗原板。在以含有0.1％(W/V)的贮存缓冲液进行封闭步骤后，单独贮存这些珠子在4℃，直到使用它们。
以各种抗原偶联的珠子合并并装配在硅芯片上。使用这些芯片和预-设定的抗-Jo-1阳性血清样品得到抗体滴定曲线。以1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243、1∶729、1∶2187、1∶6561的比率制备一系列稀释的血清样品。然后把这些稀释的样品与8个芯片在室温下一起培养30min。移去非-特异性结合的抗体后，使用山羊抗-人IgG特异抗体-Alexa结合物以观察结合的IgG抗体。收集解码和检测图片，然后提取并分析检测信号。图6表示：(1)Jo-1-偶联的薄-壳珠子引起带有背景最小活性的特异反应，如对所有其它抗原-偶联的薄-壳珠子观察到的，说明特异性抗体-抗原相互作用；(2)抗-Jo-1反应的强度以依赖浓度的方式增加。
此外，含有抗-SSA-60、抗-SSB、抗-CENP、和抗-Jo-1抗体的合并的血清样品与以6-抗原板包被的芯片反应。如图7所示，对以SSA-60、SSB、CENP、和Jo-1偶联的珠子观察到强的特异性反应，但对以sm、sm/RNP或阴性对照(h-SA；人类血清白蛋白)包被的珠子未观察到。
实例9-蛋白-芯片检测步骤
使用Cy5-抗体结合物的蛋白-芯片检测步骤A：
1.向各芯片加入15μL制备的血清样品。把芯片放在增湿室内。在室温下培养30min，同时摇动。
2.移去血清样品；立刻以15-20μL洗涤缓冲液(带有0.25％(V/V)吐温-20的普通PBS)洗涤各芯片3次。
3.加入15μL1-100稀释的山羊抗-人IgGγ特异抗体-Cy5结合物。把芯片放在潮湿室内。在室温下培养15min同时摇动。
4.移去检测抗体；立刻以15-20μL洗涤缓冲液洗涤各芯片3次。
5.向各芯片加入10μL普通PBS。在顶上放一个盖片。
6.使用装有CCD相机的显微镜得到图像。
7.数据提取和分析。
使用Alexa-抗体结合物的蛋白-芯片检测步骤B：
1.向各芯片加入15μL制备的血清样品。把芯片放在增湿室内。在室温下培养30min，不摇动。
2.移去血清样品；立刻以15-20μL洗涤缓冲液(带有0.25％(V/V)吐温-20的普通PBS)洗涤各芯片3次。
3.加入15μL1-50稀释的山羊抗-人IgGγ特异抗体-Alexa结合物。把芯片放在潮湿室内。在室温下培养15min同时不摇动。
4.移去检测抗体；立刻以15-20μL洗涤缓冲液洗涤各芯片3次。
5.向各芯片加入10μL普通PBS。在顶上放一个盖片。
6.使用装有CCD相机的显微镜得到图像。
7.提取和分析数据。
实例10-高盐对蛋白被动吸附至胶-壳珠子上的效应
还检查了高盐对蛋白吸附到薄-壳珠子的效应。两种抗原——SCL-70和Sm(ImmunoVision，Arizona)偶联于在不同盐浓度的PBS缓冲液中的不同荧光-编码的薄-壳珠子。这些缓冲液都用HCl调节pH至3。特定地，反应于37℃在5种不同盐浓度条件(5倍、1倍、0.2倍、0.04倍、和0.008倍PBS)下进行4小时。5倍浓缩缓冲液是在pH7.2的0.5M磷酸钠、0.75M氯化钠。然后以含有0.1％BSA的贮存缓冲液封闭珠子。合并这些珠子并装配在硅芯片上。
为了评估这些珠子的抗体结合活性，使用两个较好-特征的血清样品(抗-Sm阳性或抗-SCL-70阳性)。用检测缓冲液以1∶10的比率稀释这些样品，然后与芯片一起在室温培养30min。移去非-特异性结合的抗体后，芯片与山羊抗-人IgG特异抗体-Alexa结合物一起在室温培养15min。第二次洗涤步骤之后，得到解码和检测图片，提取并分析检测信号。如图8所示：(1)对以SCL-70抗原偶联的珠子观察到特异性抗-SCL-70反应，但对以Sm偶联的未观察到；(2)抗-SCL-70反应的强度是依赖盐浓度的，最高活性在以5倍PBS偶联的珠子得到。类似地，最高抗-Sm活性在以5倍PBS偶联的珠子得到。见图9。
实例11-酶固定化到胶-壳珠子和固定化对酶活性的效应
进行实验以确定固定化到水凝胶核壳珠子上的酶是否会失去酶活性。使用偶联于辣根过氧化物酶的链霉亲和素(链霉亲和素-HRP)作为模型酶来表现核壳珠子的特征。熟知的是，链霉亲和素对生物素和生物素化的分子有高亲和力。辣根过氧化物酶已经广泛用于标记、共轭于二级抗体以检测氧化反应中的抗原-抗体复合体，氧化反应诸如化学发光检测。有已知的检测链霉亲和素和辣根过氧化物酶在共轭的蛋白复合体中活性的方法。
链霉亲和素-HRP由被动吸附固定化于颜色-编码的薄和厚-壳核珠子。简要地说，750μg蛋白结合物与1mg颜色-编码的薄和厚-壳珠子一起在37℃过夜培养于偶联缓冲液(3mM氯化钠、2mM磷酸钠，pH3.0)中，同时恒定旋转。使用牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照蛋白。在蛋白官能化之后，使用添加0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲盐(PBS；0.1M磷酸钠、0.15mM氯化钠，pH 7.2)(PBST)。然后所有官能化的珠子混合到一个测试管中以装配到芯片上。用PBST中的1％牛血清白蛋白(BSA)在使用前封闭芯片结合位点。
为了检验链霉亲和素-HRP向珠子的固定化，芯片与一个寡核苷酸一起培养，此寡核苷酸含有以生物素和Cy5.5染料分别在5’和3’末端标记的5胸腺嘧啶碱基。培养之后，用PBST洗涤芯片以除去未结合的寡核苷酸，使用荧光显微镜检查来自珠子的信号。证实Cy5.5荧光信号在链霉亲和素-HRP偶联的珠子上，说明蛋白复合体由珠子固定化，未失去HRP活性(图10)。
可以使用已知的方法确定链霉亲和素-HRP偶联的核壳珠子上的HRP活性，诸如Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)的酪胺(tyramide)信号扩增技术。在酪胺信号扩增中，辣根过氧化物酶(HRP)催化荧光标记的酪胺的活化以产生高度反应的、短寿命的酪胺根，其能够共价结合于附近蛋白的酪氨酸残基。概述实验为，芯片上的链霉亲和素-HRP官能化珠子与酪胺试剂(Molecular Probes，Inc.如目录#T-20912、T-20916)一起培养，然后根据已知方法确定珠子芯片上的荧光信号。来自链霉亲和素-HRP薄和厚-壳珠子的信号强度比BSA-包被的对照珠子的显著高，说明珠子上有过氧化物酶活性(图11)。
 实例12-固定化在胶-壳珠子上的人类白细胞抗原与互补抗体反应
此处描述的核壳珠子可以用于检测人类白细胞抗原(HLA)特异性的同种抗体。人类I类和II类分子是在组织和细胞中表达的两种独特类的HLA抗原。根据实例4描述的方法，把从人类细胞分离的I类和II类分子固定化于颜色编码的核壳水凝胶珠子。平行地，一个无关的蛋白偶联于另一型颜色核壳珠子作为阴性对照。在偶联后，混合所有官能化的珠子并装配在硅芯片上的随机平面阵列。然后芯片与I类或II类-特异性人类血清或鼠单克隆抗体一起培养。结合于芯片上的HLA抗原的抗体使用荧光标记的人类或鼠-特异性二级抗体检测，并由荧光显微镜检查。
如图12A、12B、13A、13B所示，I类和II类-特异性人类抗体分别从包括固定化的I类和II类抗原的核壳珠子鉴别。由在检测中使用I类和II类-特异性鼠单克隆抗体而进一步证实人类抗体结合的特异性(图12B、13B)。因此，固定化到核壳珠子上的I类和II类HLA可以用于抗原-抗体检测中的板反应抗体(PRA)检测，这种检测对确定移植或输血的相容性是有用的。
III.蛋白与胶-壳珠子的共价结合
实例13-蛋白偶联于羧化-修饰的胶-壳珠子
带有游离胺基团的分子如蛋白质，可以使用一步法碳二亚胺(EDAC)反应(见图14A)偶联于羧化的珠子。然而，对于较大的分子，可以添加水溶性的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺以增加偶联效率(见图1B)N-羟基化合物形成的活性酯中间物代替以其它方式形成的o-酰基异脲(acylisourea)中间物，后者是很不稳定的。NHS酯对水解更稳定，并对将要偶联的蛋白的胺有高度反应性。
A.蛋白偶联的步骤(EDAC-反应)
在2ml小瓶中，包含10mg羧化-官能化的HydrogelTM-壳微粒的部分与1ml 10mM硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)混合。然后由离心分离颗粒，并虹吸弃去上清。然后，分离的小球在0.1M MES缓冲液(pH＝4.5)中洗涤2次，最终重悬于600μl同样溶液。在一个单独小瓶中，预先-计划量的蛋白溶解于300μl MES缓冲液，此溶液缓慢地加到聚合物微粒的悬浮液中。悬浮液用一个探查超声波仪短暂地超声波处理。然后，向颗粒溶液加入150μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(Aldrich-Sigma，Milwaukee，WI)(EDAC)溶液(200mg/ml)。混合物在室温反应2小时，然后分离蛋白-官能化聚合物微粒，在偶联缓冲液中洗涤1次，在硼酸盐缓冲液中洗涤2次，最终重悬于并贮存于贮存缓冲液(PBS pH＝7.4、0.1％(w/v)BSA、0.5％(w/v)吐温20、10mM EDTA和0.02％(w/v)NaN3)在2-8℃。见图14A。
B.蛋白偶联的步骤(EDAC-NHS反应)
1.向1.5mL Eppendorf管加入1mL PBST。
2.向管转移50μL 1％羧化珠子(0.5mg)，涡旋混合。
3.在7500rpm离心2min并弃去上清液。
4.用1mL PBST洗涤1次，1mL偶联缓冲液(0.1M MES、0.15M NaCl溶液，pH6.0)洗涤1次，弃去上清液。
5.加入30mg EDAC和6mg NHS至3mL偶联缓冲液，完全混合并向管中加入1mL此溶液。
6.在室温反应15min，同时底至底地混合。
7.在7500rpm离心2min并弃去上清液。
8.用1mL PBST洗涤2次，1mL偶联缓冲液洗涤1次，弃去上清液。
9.在0.5mL偶联缓冲液中溶解所需量的蛋白(包括蛋白量的详情)，充分混合。
10.转移步骤9中的500μL蛋白溶液到含有步骤8的珠子的管，充分混合，在4℃过夜培养蛋白与珠子悬浮液的混合物，同时轻柔混合。
11.回到室温。由向500μL体积的反应溶液加入50μL乙醇胺而终止反应。
12.在室温培养30min，同时底至底地混合。
13.用1mL PBST洗涤2次，弃去上清液，把珠子以珠子浓度为10mg/mL(1％固体)重悬于50μL贮存缓冲液(含有0.1％BSA、0.1％吐温20、和0.1％NaN3的0.1M PBS)。见图14B。
使用上述步骤把多种生物素-结合蛋白偶联于珠子。使用一步法EDAC反应把中和亲和素(一种生物素-结合蛋白，Pierce Chemicals，Rockford，IL)偶联于薄和厚-壳核珠子。使用EDAC-NHS步骤把鼠抗-生物素mAb和抗-生物素-Fab(生物素-结合完整和片段IgG，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)偶联。所有珠子都如以下列出的测试捕获活性。
带有结构5’-/5Cy55/TTTTT/3BioTEG/-3’的生物素化的寡核苷酸从IDT(Coralville，IA)得到。也取出预先以NeutrAvidinTM或其它生物素-结合蛋白包被的珠子。结合反应在50μl蛋白-包被的颗粒溶液在0.5ml反应缓冲液(PBS、0.1M磷酸钠和0.15M NaCl，pH7.2)中的1％溶液中进行，生物素化的寡核苷酸以溶液浓度26.5ng/μL存在。反应混合物在室温培养30分钟，同时涡旋。一旦完成结合反应，由离心收集颗粒，用PBST(150mMNaCl、100Mm磷酸钠、带有0.05％吐温-20，pH7.2)洗涤3次，重悬于0.2ml PBS。然后把寡核苷酸-官能化的编码的胶-壳颗粒装配在硅基质上，使用荧光显微镜和内部开发的检测图像软件分析荧光强度(来自5’Cy55荧光团标签)。结果表示于图15A、15B和15C。在所有情况中，为了对比，还把同样批的蛋白偶联于市售的类似大小的颗粒(Bangs Laboratories，Fishers，Indiana)。结果表示，胶-壳珠子比市售的珠子表现好，或在最差的情况下与市售的珠子表现一样好。
单独地，使用EDAC-NHS步骤把亲和力纯化的SCL-70蛋白(Immunovision，Springdale，AR)偶联于胶-壳珠子。在此情况下也为了对比，还把同样批的蛋白偶联于市售的类似大小的颗粒(Bangs Laboratories，Fishers，Indiana)。珠子与如前所述的SCL-70阳性血清反应。结果表示于图15D和15E。
实例14-蛋白与醛-修饰的胶-壳珠子偶联
A.偶联带有氨基-二醇配体的-COOH胶-壳颗粒
制备pH调节过的3-氨基-1，2-丙二醇配体[Sigma-Aldrich]在100mMMES缓冲液(pH＝4.5)中的溶液，配体浓度在0.5至1M。(一旦溶解，游离碱需要浓缩酸溶液滴定以使pH回到4.5。)取100μl 1％珠子悬浮液、成团，以500μl配体溶液洗涤2次。重悬于1ml配体溶液，涡旋并充分混合。
在两个单独的离心管中，分别称量20mg和10mg EDAC(称量前把EDAC置于室温)。向含有20mg EDAC的离心管加入1ml以上制备的珠子悬浮液，涡旋并溶解EDAC，在室温底至底地旋转30分钟。把内含物转移到含有10mg EDAC的第二个离心管，在室温底至底地旋转1hr。
成团；用PBST洗涤3次，并贮存在PBST(1ml，0.1％)中在2-4℃备用。
B.氨基-二醇偶联的胶-壳的氧化
制备在20mM PBS(来自Pierce的5倍稀释的标准BuPH)中的高碘酸钠(NaIO4)。为了制备50ml母液，称量～1.3g高碘酸钠并溶解在50ml20mM PBS中。
取1ml以上制备的珠子悬浮液，用500μl高碘酸钠溶液洗涤1次，重悬于1ml同样溶液。避光，在室温下底至底地旋转30分钟。
培养完成后，成团并以PBST洗涤2次，贮存于同样溶液。[每次洗涤后超声波短暂(～10秒)处理]
C.蛋白偶联到醛胶-壳
制备新鲜的氰基-硼氢化钠(NaCNBH3)溶液：称量32mg氰基-硼氢化钠到0.5ml 10mM氢氧化钠(NaOH)中[注意：NaCNBH3有毒，应该在罩子下操作，溶液也要在超过1小时前制备]。见图16。
取在步骤B制备的珠子，成团并以500μl PBS洗涤2次。加入300μlPBS，然后加入200μl预设浓度的蛋白溶液(配制或在PBS中提供)(～1mg/ml)。充分混合，加入10μl硼氢化物溶液，避光并在室温底至底地旋转反应2小时。培养后，以封闭缓冲液洗涤2次，并重悬于500μl同样溶液。贮存于2-4℃备用。
图17A、17B和17C表示使用固定化到醛珠子上的单克隆鼠抗-生物素抗体(Jackson Immunoresearch，Westgrove，PA)的检测结果。使用生物素化的Cy5.5标记的寡核苷酸(5’-/5Cy55/TTT TT/间隔物/生物素/-3’)(IDT Inc.，Coralville，IN)和山羊-鼠IgG(H+L)F(ab’)2(Cy5标记的)(Jackson Immunoresearch，Westgrove，PA)进行两种检测。使用无抗体的对照珠子(空白3-氨基-1，2-丙二醇官能化的珠子)作为阴性对照。在所有情况中，检测信号是特异性的，背景结合低。还进行一个测试，由把抗-生物素包被的珠子暴露于山羊抗-人IgG(Fcγ)完整分子(Cy5标记的)抗体(Jackson Immunoresearch，Westgrove，PA)。非特异结合是可以忽略的。
图18表示使用亲和力纯化的自体-抗原SSB(Immunovision，Springdale，AR)的检测结果。珠子与SSA/SSB阳性血清(1∶250稀释)反应，使用抗-人IgG(Fcγ)完整分子(Cy5标记的)抗体(Jackson Immunoresearch，Westgrove，PA)检测结合。进行两次完全相同的反应，在每种情况都包括无-抗原的对照珠子(空白3-氨基-1，2-丙二醇官能化的珠子)以得到非-特异结合。
实例15-蛋白偶联于甲苯磺酰基修饰的胶-壳
A.合成甲苯磺酰基化的配体
对位-甲苯磺酰氯和乙醇胺来自Sigma-Aldrich。向10ml无水二氯甲烷加入190mg甲苯磺酰基氯和60μl乙醇胺，并加入250μl吡啶。无色溶液迅速变成黄色；然后颜色慢慢减弱，溶液再次变成无色。反应在室温进行3小时，然后蒸发混合物至干燥，得到粘性糊状物作为终产物。
B.配体偶联于羧化的胶-壳
制备在100mM MES缓冲液(pH＝4.5)中的pH已调节的2-氨基-1-乙基甲苯磺酸酯(ethanetosylate)溶液，配体浓度在0.1至1M。把100μl 1％珠子悬浮液成团，用MES缓冲液洗涤2次，然后重悬在1ml配体溶液中，涡旋并充分混合。分别向两个单独的离心管中称量20mg和10mg EDAC(EDAC在称量前置于室温)。加入步骤1中制备的1ml珠子悬浮液到含有20mg EDAC的离心管中，涡旋以溶解EDAC，底至底地在室温旋转30分钟。把内容物转移到含有10mg EDAC的第二个离心管中，底至底地在室温旋转1hr。成团后，用PBST洗涤3次，并在2-4℃贮存在PBST(1ml，0.1％)备用。
C.偶联蛋白
在2ml小瓶中，含有10mg甲苯磺酰基-官能化的核-壳微粒的等份与1ml100mM硼酸盐缓冲液(pH＝9.0)混合。然后由离心分离颗粒，虹吸出上清液。之后，分离的小球在100mM硼酸盐缓冲液(pH＝9.0)中洗涤2次，最终重悬于600μl同样溶液。在一个单独小瓶中，预先计算量的蛋白溶解于300μl硼酸盐缓冲液，把此溶液缓慢地加入聚合物微粒的悬浮液中。用探查超声波仪对悬浮液短暂地超声波处理。混合物在37℃过夜反应，之后分离蛋白-官能化的聚合物微粒，在硼酸盐缓冲液中洗涤2次，最终重悬于并贮存于贮存缓冲液(PBS pH＝7.4、0.1％(w/v)BSA、0.5％(w/v)吐温20、10mM EDTA和0.02％(w/v)NaN3)在2-8℃。见图19。
实例16-用于细胞因子监控的胶-壳珠子阵列
此处描述的胶-壳珠子的另一可能用途是对细胞-分泌的细胞因子进行多重检测。策略包括把带有固定化在胶上的抗体的编码的胶-壳微粒的阵列装配在基质上。然后适当刺激的细胞(也以阵列格式)接触微粒阵列(层叠于微粒上)，在潮湿的37℃ CO2培养箱中接触指定的时间段。细胞比微粒大，所以每个细胞趋向于接触多个不同微粒，每个微粒能够检测不同的细胞产物。
在培养阶段中，细胞分泌细胞因子，它们分开紧邻分泌细胞的固定化的抗体官能化珠子，细胞因子被捕获。可以为了分开而优化壳化学作用，从而排斥其它大分子。移去细胞、洗掉任何未结合的基质后，向阵列加入对所选细胞因子特异性的混合的荧光标记的二级抗体。洗涤以除去任何未结合的二级抗体之后，使用标准的荧光显微镜对阵列作图，细胞因子分泌的区域和类型由不同编码的微粒上记录的荧光强度确定。细胞和珠子在检测格式中的相对位置(释放细胞因子之前和之后)示于图20。
这种检测比常规格式的细胞因子分析的优势在于，每个细胞可以接触多个微粒，每个微粒检测一种不同的细胞因子。以这种方式，从特定细胞分泌的细胞因子可以以多重和高产量方式鉴别，这在目前还是不可能的。
实例17-制造磁性胶-壳珠子
本发明的胶-壳珠子可以由多种方法任意之一呈现磁性。例如，胶-壳可以注入母体的磁性天然盐溶液。加入试剂和任意氧化剂或加热把金属盐转变为磁性氧化物的晶体，其包含遍布在胶壳中(见Chang M.美国专利4,873,102)。磁性胶-壳珠子也可以由一种两步工艺制造。工艺中的第一步包括(i)合成表面已经适当修饰的胶-壳珠子(ii)表面以超顺磁性磁纳米颗粒修饰。一旦合成，纳米颗粒就与珠子一起混合，导致胶-壳珠子上纳米颗粒沉积和结合。磁性纳米颗粒修饰过的表面是市售的，来自诸如Molecular Probes(Eugene，Or)、Micromod(Rostock，Germany)、Chemicell(Berlin，Germany)和Miltenyi Biotech Inc.(Auburn，CA)，或由本领域中已知方法制备(Wilson K.S.等人，European Cells and MaterialsVol.3 Suppl.2，(2002)206-209；Gruttner，C.and Teller，J.Magn.Magn.Mat.194(1999)8-15)。可以使用本领域中已知的任意方法(Radtchenko I.L.等人.Adv.Mater.2001，13，No.22(1684-1687)；Graf C.等人.Langmuir 2003，19，6693-6700；Margel等人.美国专利6,103,379；Caruso，F.等人.Adv.Mater.1999，11，950-953；Caruso，F.等人.Chem.Mater.2001，13，109-116)制造包被珠子的纳米颗粒。
在这个特定实例中，采用逐层聚电解质包被方法(Caruso，F.等人.Chem.Mater.2001，13，109-116)的变更来制造磁性胶-壳颗粒。制备含有1mg/ml聚丙烯胺盐酸化物(分子量15,000，Aldrich，Milwaukee，WI)和聚丙烯酸钠盐(分子量8,000，Aldrich，Milwaukee，WI)的两种单独溶液。取5mg洗过的羧化胶-壳珠子(直径～3.4μm，如上述合成的)到1.5mleppendorf管中，加入500μl 1mg/ml的聚丙烯胺溶液。涡旋悬浮液并底至底地旋转30分钟而混合。然后由离心分离珠子，弃去上清液。用DI水由离心和再分散循环洗涤小球2次。之后向小球加入500μl聚丙烯酸溶液，由涡旋混合悬浮液。然后如以上描述地处理悬浮液。继续聚丙烯胺和聚丙烯酸的交替循环，直到沉积了5层。沉积了第5层聚丙烯胺之后，离心分离珠子，用DI水彻底洗涤小球，并分散于500μl DI水中。向珠子悬浮液中加入10μl多聚糖包被的羧基官能化纳米颗粒(如供应的)(Chemicell，Berlin，Germany)，涡旋混合并底至底地旋转过夜而混合。然后离心分离珠子，确保没有纳米颗粒或集合的纳米颗粒与小球中最终的珠子在一起。用DI水彻底洗涤小球，重悬于PBST(带有0.1％吐温(v/v)的PBS溶液，含有叠氮化钠作为防腐剂)。颗粒是磁性的，由置于一个磁性颗粒集中器(Promega，Madison，WI)时颗粒迁移到样品管的一边而证明。合适的迁移时间是2分钟。
应该理解的是，此处使用的术语、表达和实例只是示范性的，并非限制，本发明的范围仅由所附的权利要求限定，并包括权利要求的主旨的所有等价物。权利要求中的工艺和方法步骤可以以任何顺序进行，包括在权利要求中列出的顺序，除非权利要求中另外指定。

Claims (28)

1.一种检测特定结合分子的方法，包括：
提供具有核和壳的珠子，其中所述壳包括一种离子胶，其中一种生物分子固定化于所述离子胶中；
将所述珠子与所述结合分子接触；并
基于检测来自所述结合分子关联标记的信号，确定结合是否发生。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物分子是一种蛋白或一种寡核苷酸。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述生物分子是一种蛋白，所述结合分子是抗体、抗原或酶。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述生物分子是一种寡核苷酸，所述结合分子是一种寡核苷酸。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述标记是以一种结合于所述抗体、抗原或酶的标记的二级抗体、或另一标记的分子。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述离子胶是HydrogelTM。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述蛋白由所述蛋白与所述离子胶的官能团之间共价结合而固定化。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述共价结合是由使用EDAC-介导的偶联反应，在所述HydrogelTM的羧基与所述蛋白的氨基酸支链上存在的易接近游离胺基团之间形成酰胺键。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述羧基首先连接于同源或异源-双功能配体，然后所述配体的官能团用于共价连接所述蛋白，从而形成所述共价结合。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白在pH大约3、离子浓度小于大约100mM的条件下固定化。
11.根据权利要求10所述的方法，其中用于确定离子浓度而监控的所述离子是钠离子。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述离子浓度大于大约1M。
13.如权利要求12所述的方法，其中用于确定离子浓度而监控的所述离子是钠离子。
14.一种检测和纯化蛋白-结合分子的方法，包括：
提供在透明柱内的多个具有核和壳的珠子，其中所述壳包括一种离子胶，其中蛋白固定化于所述离子胶中；
将所述珠子与所述蛋白-结合分子接触；
基于检测来自所述蛋白-结合分子关联标记的信号，确定所述蛋白-结合分子与所述蛋白之间的结合是否发生，而不从所述柱移去珠子；并
移去所述珠子并从所述珠子移去所述蛋白-结合分子。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白-结合分子是包括抗体、抗体片段、抗原或酶的蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述离子胶是HydrogelTM。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述蛋白由所述蛋白与所述离子胶的官能团之间共价结合而固定化。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述共价结合是由使用EDAC-介导的偶联反应，在所述HydrogelTM的羧基与所述蛋白的氨基酸支链上存在的易接近游离胺基团之间形成酰胺键。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述羧基首先连接于同源或异源-双功能配体，然后所述配体的官能团用于共价连接所述蛋白，从而形成所述共价结合。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白在pH大约3、离子浓度小于大约100mM的条件下固定化。
21.根据权利要求20所述的方法，其中用于确定离子浓度而监控的所述离子是钠离子。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述离子浓度大于大约1M。
23.如权利要求22所述的方法，其中用于确定离子浓度而监控的所述离子是钠离子。
24.一种监控分子反应的方法，包括：
提供多个具有核和壳的珠子，其中所述壳包括一种具有亲水域和疏水域的两亲性胶，其中亲水生物分子固定化于所述两亲性胶的亲水域，疏水生物分子固定化于所述两亲性胶的疏水域；
将所述珠子与结合于亲水生物分子的分子、及结合于疏水生物分子的分子接触；并
基于检测来自所述分子关联标记的信号，确定所述分子与所述生物分子之间的结合是否发生。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述分子是包括抗体、抗体片段、抗原或酶的蛋白。
26.一种允许胶中的生物分子与某些分子之间发生一定反应、并阻止其它分子间反应的方法，包括：
提供多个具有核和壳的珠子，其中所述壳包括一种包含生物分子的胶，大于一定尺寸或带有指定电荷的分子不能进入所述胶；
将所述珠子与分子样品接触，从而所述样品中的一些分子进入所述胶并与所述生物分子反应，但其中其它分子被排除在外。
27.如权利要求26所述的方法，还包括基于检测来自所述分子关联标记的信号，确定所述分子与所述生物分子之间的反应是否发生。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述分子是包括抗体、抗体片段、抗原或酶的蛋白。
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