CN1178580A - 均相溶胶-溶胶测定 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测流体样品中配体的存在或测定其量的方法。该方法包含提供第一试剂,包含具有可检测的物理特性且结合于配体或配体类似物(以竞争性形式)或能特异性地偶联配体的物质(以夹层形式)上的溶胶颗粒,提供第二试剂,包含具有可检测的物理特性的包括结合于能特异性地与配体和/或配体类(如果存在的话)偶联的物质上的溶胶颗粒,混合第一试剂,第二试剂和流体样品并在反应之前,期间或之后检测溶胶颗粒物理特性的改变,它提供了流体样品中配体的定性或定量指标。作为样品中配体的函数,试剂互相偶联,从而产生溶胶颗粒物理特性的改变,该改变与试剂的偶联程度相关。本发明还提供了用于检测流体样品中配体的存在或测定其量的试剂盒。本发明进一步提供了具有可检测的物理特性的免疫学复合物。

Description

均相溶胶-溶胶测定
本发明的领域
本发明涉及使用包括2种分离的溶胶颗粒的均相溶胶颗粒测定来测定流体样品中配体量的方法。更具体地说,本发明涉及一种溶胶颗粒测定,其中一种溶胶结合到配体上,另一种溶胶结合到能与特定配体偶联的物质上。
本发明的背景
在许多分析领域中能检测或定量样品中以非常低浓度存在的物质的方法是重要的工具。包含包括测量如尿和血液的生物流体临床样品中低浓度的分析物的方法和检测样品中少量的药物和诸如杀虫剂和除草剂的化学品的痕量残留的方法。
为了有用,测定流体样品中低水平物质的方法必须高度灵敏和精确。诸如免疫测定的以受体为基础的测定是该方法的例子且通常用于检测诸如血液和尿的生物学流体的临床样品中非常低浓度的物质。免疫测定经过使用与待测物质(例如,第一抗体)特异性反应的抗体来检测这些物质。免疫测定以许多方式进行分类。一种重要的分类是测定系统中的异相/均相差示,另一分类是测定系统中的竞争/夹层差示。在异相系统中,该测定需要通过一种固定的结合配体(例如,一种抗体)从结合到固相的成份中分离游离成份。在均相系统中,该测定不需要分离结合和游离相。在竞争方式中,感兴趣的物质和标准成份竞争诸如抗体上的结合位点,该结合位点在异相系统中存在于或结合在固相上。在夹层测定中,标记成份结合到感兴趣的物质上,而该物质是抗体或结合于抗体上。在异相系统中,抗体是一种固相或结合于固相上。
大多数免疫测定经过实际测量标记物或标记的二级现象,如放射活性,酶活性,荧光,散射光,生物发光或化学发光实现定量初级抗体-抗原反应。这些测定各自存在某些缺陷,如复杂的程序,使用昂贵的设备和有毒试剂。在放射免疫测定(RIA)中,用放射性同位素标记抗原或抗体。RIA测量免疫复合物中放射性标记的量,该复合物是样品中感兴趣的物质或分析物量的一种功能。RIA可使用夹层或竞争测定方式。尽管已证实RIA在许多诊断情况下有用,这类测定有许多缺陷。例如,该测定需要复杂的且昂贵的仪器来测量放射标记。放射性同位素具有有限的保质期,且由于它们是危险品,因此这类测定的使用者需要专业化训练。放射性同位素也需要专业化的处理技术。
已建立了使用非放射性标记物的其它测定,例如,酶联免疫吸附测定(ELISA),免疫荧光测定和化学发光测定。ELISA方式经过测量酶底物反应来检测分析物。例如,酶连接到抗体或抗原上以保护酶活性及连接物免疫学反应性的方式形成一种连接物。选定的酶典型地作用于底物产生有色的或荧光产物。反应期间,加入连接物并结合到感光趣的分析物上(以夹层的方式)或与感兴趣的分析物进行竞争(以竞争性方式)。然后加入酶的底物。结合到分析物上的酶连接物的量与加入的底物的转换相关,而该转换又与分析物的量相关。这些测定相对于放射免疫测定具有某些优点,如快速,低花费和去掉了放射活性物质。然而,ELISA具有酶不稳定和程序复杂的缺点。
在Hansen的美国专利号5 286 452中描述的另一类测定包括向含有多种分析物的样品中加入不同大小的或不同包被的单一亚基球形颗粒,例如:乳胶珠。作为与分析物相互作用的结果该颗粒凝集或不能凝集。在流式颗粒分析仪(FPA)中测定凝集量。经过获得凝集的乳胶珠的散射光可测量结合的程度。由于需要测量通过流动细胞的光散射而限制了该技术。
已知的免疫测定使用金属胶体颗粒作为标记。美国专利号4,313,734公开了一种“溶胶颗粒免疫测定”(SPIA),它使用分散于流体介质或“溶胶”中的胶体金或银颗粒作为标记。(也见J.H.W.Leuveing等,免疫测定杂志,1:77-91(1980))。前面已描述了使用胶体金属颗粒的免疫测定的两种方式。一种方式是竞争性异相方式,其中用配体标记的个体溶胶与自由配体竞争抗配体覆盖的固相上的有限数量的结合位点。为了定量,异相免疫测定需要分离游离部分和结合到固相上的部分。这类测定的一个例子是利用结合到固相上的抗半抗原的免疫球蛋白。例如,如在美国专利4 313 734中所述,试管壁用抗睾酮免疫球蛋白的覆盖。含有感光趣的半抗原(如睾酮)的样品在试管中保温。去掉未结合的样品后,用银标记的半抗原(即,睾酮)进行第二次保温,它结合固相上的未占据的位点。然后分离该金属,并测量吸光率以确定样品中睾酮的量。这一具体测定在超过18小时的时间内需要2步保温并使用未稀释的样品。在Leuvering等,免疫测定杂志,1:77=91(1980)中公开的夹层型测定是使用胶体金属颗粒的异相免疫测定的另一个例子。免疫学成份,例如,抗体固定于固相表面,如微滴度平板的孔表面上。含感兴趣的分析物的样品与孔中的抗体保温。洗去未反应的样品后,与金属标记的抗体进行第二次保温,该抗体结合经第一抗结合到孔表面的分析物。然后在结合或自由相中测量金属的品红色,优选在分离结合标记后的结合相中,它表示样品中分析物的量。
一种异相金胶体测定使用分散的固相成份,例如用免疫学成份标记的乳胶,玻璃或琼脂糖珠,它与结合到金胶体上的另一免疫学成份相互作用以形成含金属的固相,收集该固相用于肉眼观察。结合的量,收集的固相的颜色或沉降的固相的上清取决于样品中分析物的浓度(见cole等,美国专利号4859612)。这些测定称为“金属溶胶捕获免疫测定”,因为它们依赖于含金属固相的分离和测量以显示分析物的存在(见Ditlovo等,美国专利号5,202,267)。分离步骤可以是主动方法,如离心,或被动方法,如依赖于重力的沉降或滤过多孔膜的表面。任一种分离方法都向程序中增加了额外的步骤且增加了测定的分析时间。而且,这些测定仅给出了定性反应;它们不够敏感,不能定量测定样品中的配体量。
已描述了使用一标记的成份来测定溶液中半抗原的蛋白质的浓度。(Leuvering等,免疫学方法杂志,376,175-189,181(1986))。称为均相凝集测定的这些测定不能直接检测某些分子,如半抗原,它在免疫学上是单价的。这些文献描述了一个均相方式,其中免疫学成份,典型地是与感兴趣的分析物反应的抗体用胶体金标记并加入怀疑含有感兴趣的分析物的样品中。这一单一金标记的成份与加到溶液中的多价半抗原连接物反应。例如,Leuvering描述了将半抗原的多个分子附着到一个诸如牛血清白蛋白(BSA)的分子上形成的多价半抗原复合物(Leuvenng等,免疫学方法杂志,62:163-174(1983))。这种BSA-[半抗原]N复合物象多价抗原一样发挥作用并能聚集或凝集用抗半抗原的抗体覆盖的金颗粒。溶液中的游离半抗原抑制用抗体和BSA-半抗原复合物覆盖的金颗粒的混集。分散的金溶胶颗粒具有品红色。然而,当颗粒聚集时,根据聚集的程度溶胶的品红减退或消失。抗体覆盖的金颗粒与分析物的凝集程度,由此产生的溶液或凝集颗粒的颜色与反应混合物中分析物的浓度相关。对于夹层测定,样品中分析物越多,产生的金胶体聚集越大。对于半抗原测定,样品中的分析物越多,产生的金胶体聚集越少。(T.J.C.Gribnau等,染色体杂志,376,175-189,181(1986))。这些测定不需要分离步骤。
在这些测定中,经过保温达2小时后测量溶液中的吸光率来测定凝集程度,由此得到游离半抗原的量。同上,除了必需一段保温时间外,这些测定的局限性在于它们仅对尿样品或血清提取物有用,对金血清样品无用(见T.J.C.Gribnau等,染色体杂志,376:175-189,182(1986))。而且,这些测定不能直接检测以毫微摩尔量存在于血清中的半抗原。
建立一个进行定性测定以确定样品中分析物存在的快速,简单,灵敏和易于观察的方法仍是有用的。定性试验通常用于(例如)筛选生物学样品中滥用药物的存在。一个广泛使用的技术是薄层色谱(TLC)。典型地是,将尿液的小样品上样到用薄层硅胶均匀覆盖的玻璃板的底端。板的底端浸入溶剂中,尿中的成份根据溶剂和成份的光学性质以不同的速率在平板上迁移。干燥后,样品成份与特定试剂反应以观察该成份。将板上的成份位置与在板上相邻尿样建立的药物标准品进行比较以确定该药物是否存在于样品中。该定性方法缓慢。昂贵,劳动强度大且产生有害的溶剂废物。
检测以低浓度存在的环境污染的试验最近变得更普遍。诸如杀虫剂和除草剂的污染物是环境中最感兴趣的。例如,atrazine在一段时间内是普遍感兴趣的一个主题。Atrazine是一种用作除草剂的三嗪,用于控制各种食品庄稼中的了芽前后的一年生草本和阔叶杂草(O′Daly,J.P.等,美国专利号5 391 272)。风,土壤侵蚀,和水冲刷引起这种持久性除草剂出现在供应给农场动物的饲料和水中以及在用于人类消费的产品中。也已知atrazine污染施用它的区域内的饮水。(Lay,J.P.等,臭氧层,13(7):821-832(1984))。在Huber.S.J.,臭氧层,14(11-12):1795-1803(1985)中首先公开了对水中ppt(每1012分之几)范围敏感的人工的,异相的,固相免疫测定系统。
也已经公开了测定土壤、水和食品中atrazine浓度的免疫测定。该测定需要长的培养时间和费力的洗涤步骤。(Bushway,R.J.等,Bull.Environ,Contam.Toxicol.,40:647-654(1989);Bushway,R.J.等,Bull.Euviron,Contam.Toxicol.,42:899-904(1989)。
通常可得到商用系统来测量水中的atrazine残留(Klamp.s.,GITFachz.Lab.,37(10):845-846,848-850(1995))。例如,商业上可获得的EnviroGard定性试验试剂盒和Millipore微滴度平板利用了样品和与微滴度板壁上固定的抗体相连的酶之间的竞争性反应。加入底物后获得蓝色,加入硫酸终止反应时变成黄色。经过比较样品颜色与标准品的颜色或经过450nm下读吸光率来定量atrazine的量。灵敏度是0.1至1.0ppb。EnviroGard试验需要分别加入硫酸的步骤,而硫酸是危险和腐蚀性的。
最近,O′Daly等,美国专利号5,391,272描述了一种电化学免疫测定来检测在10-20ppb范围内敏感的atrazine。这一具体的试验缺乏灵敏性且需要昂贵的仪器。
考虑到以杀虫剂和除草剂形式在环境中广泛使用的化学品,需要一种简单的、定量的和精确的方法来测量这些化学品的水平,这些化学品可能以低浓度存在于土壤、食品和水样品中。
还有些情况是同时测量样品中超过一种分析物或配体的存在是有用的。例如,同时施用抗惊厥药品用于治疗癫痫发作。(G.Moriarty,临床化学,L.Kaplan和A.Pesce编辑,605-606(1989))。因此,建立一个能测定相同样品中小浓度的2个不同物质的测定方法将是有用的。
因此,需要建立一个简单和快速地测定流体样品中分析物浓度,特别是低浓度的半抗原的方法。该测定应对任何可匀浆成流体介质的样品是有用的。特别是希望能测定全血清样品中的分析物。还需要建立不使用毒素或昂贵试剂的方法。还更高地要求具有不需分离或收集步骤的方法。而且,常常需要增加测定的灵敏性,使能够定量流体样品中的配体,如半抗原。
本发明的概述
本发明提供了一种测定流体样品中配体量的方法,其灵敏度足以定量毫微摩尔范围的半抗原,且不需分离或收集步骤。
本发明的一个方面是用于在流体样品中检测配体存在或测定其量的方法、包含:(a)提供第一试剂,包含具有可检测的物理特性的结合于配体或配体类似物(以竞争性方式)上的溶胶颗粒或一种能与配体特异性偶联的物质(以夹层方式);(b)提供具有可检测的物理特性的第二试剂,包含结合于能与如果存在的配体和/或配体类似物特异性偶联的物质上的溶胶颗粒;(c)混合第一,第二试剂和流体样品,作为样品中配体存在的结果所述的试剂互相偶联,从而产生溶胶颗粒物理特性的改变,该变化与试剂的偶联程度相关;(d)检测反应前,期间或之后溶胶颗粒的物理特性的改变,该检测提供了流体样品中定性或定量的配体指标。第一试剂中能与配体特异性地偶联的物质与第二试剂中能与配体特异性地偶联的物质可以是相同或不相同的。
可检测的物理特征的一个例子是光的吸收率。在该例子中,各试剂在特定波长下具有最大吸光率。第一试剂,第二试剂和流体样品的混合物的吸光率根据第一和第二试剂的溶胶颗粒和偶联程度而发生改变,而改变是混合物中配体量的函数。
在本发明的一个实施方案中,第一试剂,第二试剂和流体样品大约同时混合。在另一实施方案中,第一和第二试剂混合,经过一段预定时间后,加入样品。在另一实施方案中,加入该样品和第一或第二试剂,经过预定的一段时间后加入未与样品一起加入的试剂。
用于本发明的溶胶颗粒包括具有可检测的物理特征的任意颗粒,且包括金属,荧光团或生色团。
溶胶颗粒的大小和组成决定了它吸收的波长。优选的溶胶颗粒的颗粒大小具有达到在溶液中沉降的大小的范围。优选的是,溶胶颗粒是金属,包含金、银、铜、铁或铝,最优选金。优选的金属溶胶颗粒具有从大约5nm到大约200nm范围的颗粒大小。更优选的是,溶胶颗粒具有从大约40nm到大约100nm的大小,最优选从大约60nm到大约80nm。对于荧光团和生色团,优选的溶胶颗粒具有达到1微米的大小。
在本发明方法的一个优选的实施方案中,可检测的物理特性是克分子吸光率。本发明的一个该方法包含使用处于或接近溶胶颗粒最大吸光率处的波长测量反应的吸光率来检测分析物的存在或测定其量。第一和第二试剂的溶胶颗粒可以相同或不同。当需要使吸光率变化达最大时,优选两种试剂中的每一溶胶各具有基本上相同的吸光率最大值,特别是对于所使用的溶胶类型。当试剂在基本上相同的波长下吸光时,由于各偶联相互作用能潜在地产生光谱改变,因此能使吸光率减少达最大。吸光率减小达最大有利于测量吸光率的改变,提供足够灵敏的测定以定量样品中低浓度的小配体。另外,可使用吸光率测定以产生定性结果,指示样品中感兴趣的一种配体的存在。
优选的是在各溶胶颗粒中的金属,生色团或荧光团相同。在优选的实施方案中,为了使用金胶体,吸光率最大值优选在510至600nm之间。最优选的是,金胶体在570nm和580nm之间具有最大吸光率。
优选的实施方案包括用于检测和测定小半抗原,例如,但不限于激素,如甲状腺素(“T4”)以及治疗药物,如地谷新(digoxin),苯巴比妥和phenytoin,滥用药物和环境污染,如杀虫剂和除草剂,如atrazine的测定。
本方法的试剂是稳定的且相对于稳定性较小的放射性同位素和酶标记具有优势。由于在进行测定中不涉及危险物质,如放射性同位素或有毒化学品,因此不需要采用特别的处理技术。
本发明还提供了用于检测流体样品中配体存在或测定其量的试剂盒,该试剂盒包括第一试剂,包括具有可检测的物理特征且结合于(i)配体或配体类似物(以竞争性方式)或(ii)能特异性地与配体偶联的物质(以夹层方式)上的溶胶颗粒,该试剂盒还包括第二试剂,包含具有可检测的物理特性且结合于能与如果存在的配体和/或配体类似物特异性偶联的物质上的溶胶颗粒,作为样品中配体存在的函数所说的试剂可互相偶联从而产生物理特性的改变,该变化与试剂的偶联程度相关。能特异性地与配体偶联的第一试剂的物质与能特异性地与配体偶联的第二试剂的物质可以相同或不同。在试剂盒的一个优选的实施方案中,溶胶颗粒包含金属,优选金,银,铜,铁和铝,最优选金。溶胶颗粒的优选大小范围从大约5nm到大约200nm。更优选的是,溶胶颗粒大小从大约40nm到大约100nm,最优选从大约60nm到大约80nm。
一个实施方案提供了用于检测样品中抗原或半抗原的免疫测定,其中第一试剂配体是一种抗原或半抗原。能特异性地与配体偶联的第二试剂的物质是该抗原或半抗原的抗体。在该免疫测定的一个例子中,溶胶颗粒是金属,如金,试剂的颗粒具有可检测的克分子吸光性。混合物吸光率取决于溶胶结合的抗体和溶胶结合的抗原或半抗原的偶联程度,是样品中抗原或半抗原的函数。当两个试剂反应时,第一试剂和溶胶结合的抗原或半抗原在样品中缺乏抗原或半抗原时与第二试剂的溶胶结合的抗体偶联,在混合物中产生克分子吸光率的最大变化,例如减少。当含感兴趣的抗原或半抗原的样品与溶胶颗粒反应时,抗原或半抗原与溶胶结合的抗原竞争地结合溶胶结合的抗体上的结合位点,克分子吸光率的改变不如上面大。抗原或半抗原的总量经过比较试剂和样品混合物的吸光率与校准曲线来测定。涉及两种分离的溶胶颗粒相互作用的这类测定的描述术语是溶胶-溶胶颗粒免疫测定,或“SSPIA”。
在产生定性结果的本发明的一个实施方案中,第一试剂,具有明显可检测的物理特性的,结合到配体或配体类似物上的溶胶颗粒与第二试剂,具有明显可检测的物理特性的,结合到级特异性地偶联配体或配体类似物的物质上的溶胶颗粒在溶液中合并,然后经过预定时间期间限后,加入怀疑含有感兴趣的配体的样品。第二试剂的溶胶颗粒结合到多出的能特异性地偶联配体或配体类似物的物质上。在预定时间期间,第一和第二试剂颗粒偶联。在预定时间期间第一和试剂偶联使溶液具有明显可检测的物理特征,例如,失去颜色。第二试剂的结构使得如果样品中配体低于阈值量时,配体被试剂吸附而不明显改变明显可检测的物理特性。在该实施方案中,当存在超过阈值量的配体时,配体取代第一试剂并与第二试剂的溶胶颗粒偶联以产生溶液物理特性上的可见变化,例如,颜色。经过使用偶联到溶胶上的低结合亲和力的异相半抗原或作为选择,经过使用低结合亲和力的抗体可增强该测定的灵敏性。该实施方案对于测定滥用的药物,如苯异丙胺,大麻素,可卡因,鸦片制剂和phencycidine是有用的。
在定性的竞争性测定的另一个实施方案中,分别干燥第一试剂,具有明显可检测的物理特性的结合到配体或配体类似物上的溶胶颗粒,和第二试剂,具有明显可检测的物理特性的结合到能特异性地偶联配体或配体类似物的物质上的溶胶颗粒并以干燥的形式混合且经过加入流体样品溶解。如果存在的配体超过阈值量,则观察到物理特性,例如,颜色。如果配体不存在或以低于阈值量存在,观察到物理特性的改变,例如,失去颜色。
在以夹层形式的定性测定的另一实施方案中,第一和第二试剂均包含具有明显可检测的物理特征的溶胶颗粒,能特异性地偶联配体或配体类似物的物质结合于其上。能特异性地偶联配体的第一试剂的物质与能特异性地偶联配体的第二试剂的物质可以相同或不同。如果配体存在于样品中,第一和第二试剂的溶胶颗粒经过均与配体偶联而偶联,产生缺乏明显可检测的颜色的溶液。如果配体不存在,溶胶颗粒不偶联且产生颜色上可观察的变化。这种实施方式也能用于定量方式。
本发明还提供了具有可检测的物理特性的免疫学复合物。一个优选的复合物包括结合于配体或配体类似物上的第一溶胶颗粒和结合于能特异性地偶联如果存在的配体或配体类似物的物质上的第二溶胶颗粒,第一和第二溶胶颗粒分别具有可检测的物理特性,其中物理特性的性质根据结合到第一溶胶颗粒上的配体和能特异性地偶联配体或配体类似物且结合于第二溶胶颗粒上的物质的偶联而改变。
另一优选的复合物包含(I)具有可检测的物理特性的结合于能特异性地与如果存在的配体或配体类似物偶联的物质上的第一溶胶颗粒,和(ii)具有可检测的物理特性的结合于能特异性地与该配体或配体类似物偶联的物质上的第二溶胶颗粒,其中两种颗粒均偶联到该配体或配体类似物上。该复合物的物理特性的性质与单独的溶胶颗粒的物理性质不同。能特异性地偶联配体或配体类似物的第一试剂的物质与能特异性地偶联配体或配体类似物的第二试剂的物质可以相同或不同。
在本发明的免疫学复合物的优选的实施方案中,溶胶颗粒包含一种金属,优选金、银、铜、铁或铝,最优选金。
本发明还提供了检测流体样品中多种配体的存在或测定其量的方法,包含:(a)提供对各种所说的多种配体的第一试剂,包含一种溶胶颗粒,它结合于(i)配体或配体类似物上(以竞争性形式)或(ii)能特异性地偶联配体的物质上(以夹层形式);(b)提供对各种所说的多种配体的第二试剂,包含结合于能特异性地结合配体和/或配体类似物的物质上的溶胶颗粒,相应于各种所说的配体的第一和第二试剂的溶胶颗粒具有专一的可检测的物理特征,并与相应于其它配体的溶胶颗粒的物理特性能区分;(c)混合该试剂和流体样品,作为样品中多种配体存在的函数,所说的试剂互相偶联,从而产生物理特性的变化,该变化与试剂的偶联程度相关;(d)检测或测定反应期间或之后溶胶颗粒的物理特性,该检测或测定提供了流体样品中多种配体的定性或定量指标。能特异性地与配体偶联的第一试剂的物质与能特异性地偶联配体的第二试剂的物质可以相同或不同。
在用于检测流体样品中多种配体存在或测定其量的方法的一个实施方案中,物理特性是克分子吸光率,与各种多个配体相应的溶胶颗粒是具有不同克分子吸光率的不同金属。
在用于检测流体样品中多种配体的存在或测定其量的方法的另一实施方案中,物理特性是克分子吸光率,相应于多种配体中每一个的溶胶颗粒是不同大小且具有不同克分子吸光率的溶胶颗粒。
本发明进一步提供了制备结合于配体或配体类似物上的试剂溶胶颗粒的方法,包含:(1)将配体或配体类似物连接到选自第一蛋白质,树状体或第一多聚体的载体分子上形成配体连接物;(2)将配体连接物与溶胶颗粒结合形成配体结合的溶胶;(3)用选自第二蛋白质,去污剂或第二多聚体的封闭剂稳定配体结合的溶胶颗粒。在一个优选的方法中,第一蛋白质包含兔γ球蛋白。优选的是,封闭剂选自非脂肪干乳或酪蛋白。
附图的简要描述:
图1是本发明的方法的一个实施方案的示意图。
图2是根据本发明的总T4测定的吸光率对T4浓度布点的校准曲线。
图3是用于本发明的一个方法中的T4结合的金和金颗粒的吸光率光谱。
图4是在缺乏T4对抗-T4结合的金溶胶和T4结合的金溶胶的混合物吸光率光谱对时间的曲线。
图5是根据本发明的地谷新测定的校准曲线。
图6是根据本发明的苯巴比妥测定的校准曲线。
本发明的详细描述
本发明用于检测流体样品中配体存在或测定其量的方法涉及使用至少2种包含不同溶胶颗粒的试剂。第一种试剂包含结合于感兴趣的配体或具有相似反应性的该配体的类似物上的溶胶颗粒(用于竞争性形式)或一种能特异性地偶联配体的物质(用于夹层形式)。第二试剂包含结合于能特异性地偶联配体和配体类似物(如果使用配体类似物)的物质上的溶胶颗粒。能特异性地偶联第一和第二试剂的配体的物质可以相同或不同。
第一和第二试剂的溶胶颗粒具有可检测的物理特性,例如吸光率,当结合于包含第一试剂的颗粒上的配体或类似物与结合于能特异性地偶联配体或类似物的第二试剂的颗粒上的物质偶联时,物理特性改变。本发明的方法包含将第一和第二试剂与流体样品反应。作为样品中配体存在的函数,结合于一种试剂溶胶颗粒上的配体或配体类似物与另一试剂的颗粒偶联,从而产生物理特性的改变,它与试剂的偶联程度相关。该方法进一步包含检测溶胶颗粒的物理特性以提供流体样品中配体定性或定量的指标。
本文使用的术语“配体”指与另一分子偶联的分子(配体的例子包括:特异性结合的蛋白质,抗原,抗体,半抗原),广义上用于包括所有大小的分析物。术语“配体类似物”指功能和反应性上相似于感兴趣的配体但有结构差别的分子。本文使用的术语“抗-配体”指能特异性地偶联配体的任意分子或其任意片段。本文使用的术语“溶胶颗粒”指包含溶胶的颗粒。
本发明利用了由两种分离的溶胶颗粒凝集引起的光谱变化。见图1,它显示了一种竞争性方式。经过将溶胶结合的配体或配体类似物偶联到溶胶结合的抗-配体上实现溶胶颗粒的凝集。本发明的一个优选的实施方案是均相测定,它使用了两个基本上具有相同的最大吸光率的分离的溶胶颗粒。溶胶颗粒的偶联产生对各偶联事件而的最大信号(即,最大吸光率减小)。使用两种颗粒比仅使用一种溶胶颗粒产生更强烈的信号,因而有助于测量光谱变化。本发明的方法产生了测定反应的放大,因而形成了比以前已知的均相溶胶颗粒测定更灵敏的测定。
在本发明的一个优选的方法中,样品中配体的量经过在处于或靠近溶胶颗粒最大吸光率处测量含2种溶胶颗粒和样品的混合物的溶液的吸光率的改变来测定。反应的总吸光率变化与样品中配体的量相关。在不存在游离配体时,更多的颗粒偶联产生吸光率的最大减小。在存在游离配体时,互相偶联的溶胶颗粒越少,随后观察到吸光率减少越小。因此存在于样品中的配体量可经过测量当配体或抗配体结合的溶胶颗粒存在于含样品的溶液中时吸光率的改变来测定。
本发明的溶胶包含具有可检测的物理特性的任意物质。该物理特性的例子包括,但不限于克分子吸光率,荧光或光散射。能产生光谱变化的任何溶胶可在本发明中发挥功能。溶胶颗粒优选包括金属,染料或荧光物质。两种分离的结合的颗粒的偶联产生吸光率,荧光或浊度的变化。在一个优选的实施方案中,该颗粒是金属。优选的金属包括金,但其它金属溶胶,如银、铜、铁、铝或其它也是合适的。
在本发明中有用的溶胶的大小和组成决定其吸收的波长。本领域的技术人员经过产生特定组成和大小的颗粒可生产在特定波长下吸光的溶胶。溶胶颗粒可根据本领域已知的方法来构建(例如,见Beesley.J.E.分子生物学方法,Vol.10:免疫学方案,M.Manson编辑,pp 163-168(1992);Frens,G.,自然:物理科学,241:20-22(1973);Turkevich.J.,等,Disc.Faraday Soc.,11:55-75(1951))。
优选的是,根据下列程序构建从金胶体制备的溶胶颗粒。制备的胶体金的小“种”颗粒的最大吸光率优选在从大约510到大约520nm的范围内,更优选从大约510至514nm,但最优选在512nm处。种生长成更大的溶胶颗粒。溶胶颗粒优选的大小范围从大约5nm到大约200nm,更优选从大约40nm到大约100nm,最优选从大约60nm到大约80nm。经过改变种和金的浓度可控制胶体的生长以调节颗粒出现最大吸光率时的波长。例如,具有5nm直径的颗粒在大约510nm处最大吸光,而大约90nm的颗粒在大约590nm处最大吸光。图3显示了金粒和T4标记的金溶胶的吸收率光谱,证实了其最大吸光率的差异。优选的是,金颗粒生长的大小相应于在大约510nm至大约650nm范围内的最大吸光率,更优选从540至600nm,最优选从大约570至580nm。
应明白当在本发明的方法中使用胶体金溶胶时510至650nm的波长范围是优选的范围。其它金属溶胶在该范围外具有不同吸光率最大值且同样有用。还应明白根据本文的教导在本发明中有用的其它溶胶的吸光率最大值可用本领域已知的方法易于测定。
制备溶胶颗粒时,使用不引起金颗粒絮凝的反应容器是重要的。经过使用硅化玻璃反应容器,或更优选的是由诸如聚乙烯或聚丙烯制成的塑料反应容器可防止絮凝。
本发明的溶胶颗粒结合于配体(或配体类似物)或抗配体上。在本发明的一个实施方案中,当配体是半抗原时,为了制备结合的溶胶,配体首先共价附着于合适的载体分子(如蛋白质,树状体(例如见美国专利号4,507,466、4,568,737、4,694,064本文以参考文献引用)或其它多多聚体)上以形成配体连接物。在一个实施方案中,载体分子是兔γ-球蛋白。
将配体附着于载体上形成配体连接物的重要方面包括配体分子上的特定连接位点,配体和载体之间的桥连或间隔物的类型(如果有的话),附着到载体上的配体量以及连接化学。特定配体的连接化学的选择可用已知方法确定。(例如,见Michael Brinkley,生物连接化学,3:2-13(1992);Bernard F.Erlanger,药物学回顾,25:271-280(1973))。
然后将配体连接物结合到溶胶颗粒的表面上。下列因素对于制备配体结合的溶胶是重要的:配体连接物浓度,溶胶组成和浓度,pH,离子强度,以及连接物的长度或蛋白质包裹时间。优选的这些因素是生产各具体的配体结合的溶胶所必需的。本领域的技术人员易于实施这种优选。
也选择这些相同的因素,即抗配体浓度、溶胶组成和浓度、pH、离子强度和包裹时间用于制备抗配体结合的溶胶。用于本发明的合适的抗配体包括抗体或抗体片段(单克隆或多克隆的)。制备抗体片段,如F(ab′)2、F(ab′)和F(ab)的方法是熟知的。(例如,见P.Parham,实验免疫学手册,卷1:免疫化学,D.M.Weir编辑,14,1-14.23(1986);D.R.Stanworth.和M.W.Turner.实验免疫学手册,卷1:免疫化学,D.MWeir编辑,12.1-12.46(1986))。
然后经过加入封闭剂稳定配体或抗配体结合的溶胶颗粒以减小颗粒间的非特异性相互作用。这些试剂在本领域是已知的,且包括蛋白质,去污剂以及诸如PEG和PVP的多聚体。对于金溶胶,非脂肪干乳和酪蛋白是优选的封闭剂最优选酪蛋白。以对已知诱导聚集的试剂的抗性,如对金溶胶是钠离子可监测稳定过程。
稳定后,用本领域已知的众多方法中的一种可去掉未结合两种类。两个优选的方法是溶胶颗粒的离心和超滤。使用离心时,优选经避免过多的引力来限制溶胶絮凝。对于不同类型和大小的溶胶优选合适的离心条件。当制备小量溶胶颗粒,离心是优选的方法。
对于各具体的配体测定,根据许多不同的因素选择结合于配体或抗配体上的溶胶颗粒的量。这些因素包括测定效果参数,如灵敏性,特异性,精确性和准确度。其它重要的因素包括检测系统(例如,分光光度计)的线型范围以及附着于溶胶颗粒上的配体或抗配体的量。一般来说,各溶胶的量首先以要领域已知的方法来调节以产生最适剂量/反应曲线,具体实施例在表1中显示:
                            表1
                    测定混合物的金溶胶量
  金溶胶   T4测定 T4测定 苯巴比妥测定   地谷新测定
  半抗原标记的   1.27   0.77   0.74     0.68
  IgG标记的   0.54   0.34
  F(ab’)标记的   0.39 0.19
在表1中,金溶胶的含量如果稀释成1ml,以λmax下的最终吸光率(在1ml.比色皿中)表达。例如,如果12.3μl苯巴比妥-rgG金溶胶用于测定混合物,储液溶胶溶液在λmax(580nm)下光密度为60.1,使用的溶胶量最终吸光率为(60.1)×(0.0123)=0.74。
本发明的方法对于测量任意感兴趣的配体有用。本发明的方法对于测量小配体或半抗原特别有用。下面部分列出了在全血清中可应用该测定的物质:扑热息痛,N-乙酰普鲁卡因酰胺,氨基羟丁基卡那霉素A,阿米替林,戊巴必妥,仲丁巴必妥,咖啡因,氨甲酰氮卓,可卡因,可待因,皮质醇,苯甲二氮卓,毛地黄毒苷,地谷新,乙琥胺,庆大霉素,导眠能,环己烯巴必妥,ibuprofen,利度卡因盐酸盐,甲琥胺,吗啡,netimicin,nortriptyline,14-羟基二氢可待因酮,戊巴比通,phencyclidine,苯巴比妥,phenytom,去氧苯必妥,普鲁卡因酰胺,丙氧吩,奎尼丁,水杨酸,司可巴必妥,茶碱,甲状腺素,托普霉素,Valproic acid和万古霉素。该测定用于检测大型蛋白质,如人绒毛促性腺激素(HCG),铁蛋白,C-反应性蛋白(CRP),载脂蛋白,肝类抗原和免疫球蛋白。
本测定对于检测和测量非生物学流体的样品中的低含量的物质有用。例如,本测定在检测和测定土壤,冰和食品的环境样品中的低水平的污染物有用。下面部分例举了该测定有用的除草剂,杀虫剂和其它污染物的例子:阿特拉津,氯丹,chlorneb(和其它含氯杀虫剂),DTT,Demetor,二嗪农(和其它有机磷杀虫剂),二乙基邻苯二酸盐(和其它邻苯二酸酯),乐果,二甲基邻苯二酸盐,乐果,Etridiazole,六氯苯,马拉硫磷,甲基对硫磷,草达灭,三九一一,毒草安,西玛三嗪,Trifkurilin和2,4-D(和其它苯氧酸除草剂)。
上面列出的用于举例而不打算限制本发明的范围。
在一些优选的实施方案中,该测定是竞争性测定。在其它实施方案中,该测定是夹层测定。试剂和样品可大约同时加入或按需要的特定顺序加入。试剂反应产生的物理特性的变化可用本领域已知的来检测。例如,当测量吸光率时,用诸如在分光光度计或能测量吸光率改变的任意其它检测系统中进行测量的方法可实现检测。
优选检测物理特性的改变在反应的前30分钟内测量。可按端点测定进行该方法,它对于定性测定特别有用。对于定量测定,优选该方法根据反应的速率进行。在一个优选的实施方案中,以一定的间隔进行测量,例如,在反应的前10分钟内每分钟或每一分半钟进行,以确定该时间内的反应速率。表1包括显示溶液中配体结合的溶胶颗粒(T4-兔γ-球蛋白(T4-rgG)金溶胶)与抗配体结合的溶胶颗粒(抗-T4 rgG金溶胶)反应的吸光率随时间减少的数据。
                     表2
    图谱号 混合溶胶后的分钟数 在570nm下的吸光率
    1     0     1.358
    2     5     1.287
    3     10     1.250
    4     20     1.151
图4显示了相应于表1中值的吸光率图谱,证实了由于更多的配体结合的溶胶颗粒与抗配体结合的溶胶颗粒偶联而吸光率减少。
本发明的另一方面是在包含对各个所感兴趣的配体具有不同可检测的物理特性的溶胶颗粒的流体样品中检测超过一种配体的存在或测定其量。该方法的一个优选的实施方案包括使用具有不同大小的溶胶颗粒并测量物理特性的改变,例如,在相应于不同大小的颗粒的不同吸光率最大值的波长下吸光率的改变。例如,处于或靠近530nm具有吸光率最大值的金颗粒可用作感兴趣的一个分析物(例如苯巴比妥)的溶胶颗粒,处于或靠近590nm具有吸光率最大值的金颗粒可用作另一感兴趣的分析物(例如,phenytoin)的溶胶颗粒。
用于检测流体样品中超过一种配体的存在或测定其量的方法的另一实施方案包括加入由不同材料制成的,对各种感兴趣的配体具有不同物理特征的溶胶颗粒。例如,不同的金属用于各配体,如金和银,这些颗粒设计成在不同的波长下具有吸光率最大值。该实施方案在生色团,荧光团或比浊检测系统中也有用。
在定性均相测定方式中使用金溶胶提供了容易应用于定性观察解释的快速、灵感和简单的试验。在本发明的另一实施方案中,结合于多出的抗特异性配体的抗体上的金溶胶颗粒和结合于配体连接物上的金溶胶在溶液中混合,允许进行偶联。这一反应产生溶胶的聚集,肉眼观察基本上无色。对感兴趣的各配体选择多出的抗体使存在样品中的配体量能被溶胶吸附而不破坏聚集。当感兴趣的配体以特定水平或浓度存在时,该配体破坏溶胶偶联,改变最大波长吸光率并增加溶液的克分子吸光度。经过使用偶联到溶胶上的低结合亲和力的异相半抗原,或另外,经过使用低结合亲和力的抗体可增强该测定的灵敏性。对于金溶胶以形成品红色检测摩尔吸光度的增加。例如,在测定尿样品滥用药物存在的定性试验中,可选择吸附的药物量特定药物的NIDA阈值浓度相匹配,如苯异丙胺(1000ng/ml),大麻素(100ng/ml),可卡因(300ng/ml),鸦片制剂(300ng/ml)和phencyclidine(25ng/ml)。超过这些水平时,游离的药物取代结合于溶胶颗粒上的抗体偶联位点上的溶胶结合的药物。如果观察到品红颜色,则药物试验呈阳性。
在以竞争性方式进行定性试验的另一实施方案中,根据本领域已知的方法(例如,冻干)分别干燥包含结合于配体上的溶胶的试剂和包含结合于抗感兴趣的配体的抗体上的溶胶的试剂,混合干燥的试剂。使含有未知量的感兴趣的配体的流体样品溶解干燥的混合物。如果在样品中存在阈值量的配体,它与结合于溶胶上的配体竞争结合于溶胶颗粒上的抗体的偶联位点并防止抗体结合的溶胶与配体结合的溶胶聚集,分离的溶胶保留它们的颜色。如果无配体,或在样品中存在低含量的配体,溶胶聚集并使去可观察的颜色。例如,在药物试验中,待测样品溶解抗药物的抗体结合的溶胶与药物或其类似物结合的溶胶的混合物。如果存在的药物超过某一阈值量,则观察到颜色。如果样品不含药物,或以低于阈值量存在,则颜色消失。
在以夹层方式进行定性测定的另一种类型中,第一和第二试剂的颗粒结合于能偶联配体或配体类似物的物质上。如果配体存在于样品中,两种试剂的溶胶颗粒经过都与配体偶联而偶联。这将产生失去观察上可检测的颜色的溶液。当配体不存在样品中时,试剂不经过配体发生偶联。缺乏配体导致溶液的颜色无可见的变化。
本发明的另一方面是用于检测流体样品中配体存在或测定其量的试剂盒。本发明的方法所用的试剂稳定,具有长货架寿命且对于生产和使用不昂贵。因此,这些试剂适于试剂盒组合物。本发明的试剂盒包含对实施本发明的方法所必需的试剂。该试剂盒优选的实施方案包括含有结合于配体上的溶胶颗粒的第一试剂和含有结合于能特异性地偶联配体的物质上的溶胶颗粒的第二试剂,第一和第二试剂的溶胶颗粒具有可检测的物理特性。各试剂的量取决于所感兴趣的配体以及待测样品的性质。本领域的技术人员能根据本领域已知的方法和本文包含的内容作出决定。而且,该试剂盒不受试剂形式,即粉末、流体或片剂的限制。在本领域中应明白可提供这类试剂用于根据许多不同形式中任意一种的试剂盒。
提供的下面的实施例是为了更清楚地说明本发明的各个方面而不是用来限制本发明的范围。实施例I:金粒的制备
所有操作使用塑料的容器,测量装置和试管进行。向90ml纯水中加入HAuCl4三水合物(2.54×10-5mol,0.5ml 2%的水溶液,AldrichChemical Compsny)并充分搅拌1分钟。
加入柠檬酸三钠二水合物(3.40×10-5mol;1ml 1%的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入氢硼酸钠(1.98×10-5mol,1ml 0.75mg/ml溶于柠檬酸三钠)并充分搅拌混合物5分钟。金粒通过0.2微米滤膜(醋酸纤维素)过滤并在室温下贮存。在下文中,相应于最大吸光率的波长称为“λmax”。典型的金粒的λmax在512至514nm下观察,吸光率从0.75至0.85(在1cm比色皿中)实施例II-测量总T4a)试剂的制备
1.制备T4-辛二酸N-羟基琥珀酸(NHS)酯
L-甲状腺素(“T4”)(0.49g,0.63mmol)加入10ml N,N-二甲基甲酰胺(“DMF”)中(在4A型分子筛上干燥)。用干燥管(氯化钙)套住反应管并避光。加入三乙胺(176μl,1.26mmol)和二琥珀酸亚胺辛二酸(0.35g,0.95mmol),搅拌悬液加热至40℃ 30分钟。15分钟后悬液变成清亮的溶液。再搅拌混合物1小时,同时反应液冷却到室温。在不超过40℃的温度下经真空蒸馏去掉DMF以产生亮棕色油状固体。残留物溶于氯仿∶甲醇1∶1中,经过硅胶上用氯仿∶甲醇∶乙酸9∶1∶0.1展开的预制TLC纯化产品。从板上切下Rf=0.5的主带,研磨并用氯仿∶甲醇3∶2进行萃取。在真空中去掉溶剂,产生的残留物用氯仿研磨。在真空中去掉氯仿以产生白色固体的最终产品(0.23g,0.22mmol)。分析产物的NHS酸含量。T4辛二酸衍生物与乙二胺的反应释放N-羟基琥珀亚胺(NHS)。在260nm下监测其形成。使用NHS的E=10,000LM-1cm-1以克分子基础测定NHS酯%。具有该消光系数的NHS酯含量为73%。产品贮存于-20℃避光保存。
2.1.制备T4-rgG连接物
兔γ-球蛋白(“rgG”)(Cohn Fractions II,III,Sigma化学公司)以20ng/ml的浓度溶于25mM磷酸钠,50mM氯化钠,pH7.4(PBS)的溶液中。用PBS超滤(Amicon,YM-10膜),接着进行0.2微米过滤,rgG浓度调节成10mg/ml。T4辛二酸以10mg/ml溶于DMF中并以4份相等的等分试样加入rgG中,使T4-辛二酸:rgG的最终摩尔竞争比为3∶1。竞争比率使用以T4-辛二酸的NHS酯百分数为基础的相关因子。混合物在室温下避光放于摇动混合器中过夜。经过用PBS超滤(Amicon,YM-10膜)去掉未结合的T4-辛二酸,当流出物的A254不超过0.015时判断为完全去掉。
使用以rgG作为内部标准的BSA校准器经蛋白质测定(BCA,Pierce)确定T4-rgG连接物的蛋白质浓度。
T4附着于rgG上导致干扰蛋白质吸收光谱。尽管不能定量,经过测量A280/A300的比率监测T4附着于rgG上。对于PBS中的天然rgG该比率典型地是6.0至6.5,而T4-rgG连接物典型地显示出5.3至5.7的比率。产品在-20℃贮存。
3.离心制备T4-rgG金溶胶
所有操作使用塑料器皿进行。向900ml纯化水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol,10ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)且充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(2.88×10-5mol,20ml 10mg/ml的水溶液)且充分搅拌1分钟。加入金粒(400μl)且充分搅拌溶液5分钟。发现使用凝胶填充的电极(Fisher Scientific)测量的溶液pH为大约2.5。用0.2M K2CO3调节pH为7.5至7.6。用纯水将T4-rgG(4.0mg)稀释成90ml,加入调节过pH的金溶胶,充分搅拌30分钟。加入脱脂奶粉(CARNAT10N)使奶粉终浓度为0.04%,在室温下避光搅拌混合物过夜。
在558nm下观察金溶胶的λmax为2.1(1cm)的吸光率。试验了溶胶对Na+离子絮凝的稳定性。向1ml溶胶中加入0.1ml 10%NaCl,加盐后3和10分钟时监测从400至750nm吸光率光谱。在这些条件下该溶胶保留λmax时其100%的吸光率。
经过在2000xg下20至25℃离心15分钟去掉未结合的T4-rgG连接物。吸出并弃去上清,沉淀分别重悬于100ml 10mM HEPES,0.1BSA,0.01%迭氮化物,pH7.5中,接着在2000xg下离心15分钟。按所述重复洗涤,溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中并在2-8℃下贮存。
在570nm下观察金溶胶的λmax为28.3的光密度(在1cm比色皿中)。
4.制备抗-T4 IgG金溶胶
所有操作使用塑料器进行。向90ml纯水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-5mol,1ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟氨(2.88×10-4mol,2ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(40μl),溶液充分搅拌5分钟。用0.2MK2CO3将pH调到7.5。用纯水将抗T4 IgG(OEM Concepts Inc.,0.2mg)稀释成9.0ml,加入调节了pH的金溶胶中,充分搅拌60分钟。加入脱脂奶粉(Carnation),使奶粉终浓度为0.04%,在室温下搅拌混合物过夜。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的抗T4IgG。吸出并弃去上清,沉淀分别重悬于25ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物,pH7.5的溶液中,接着以2000xg离心15分钟。按上面所述重复洗涤,溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中并在2-8℃下贮存。在564nm下观察金溶胶的λmax,光密度为28.0(在1cm比色皿中)。
5.测定平均颗粒大小
按实施例II.4(抗-T4 IgG金溶胶的制备)所述制备溶胶但改变金粒的量。用电子显微镜分析溶胶以测定溶胶颗粒的平均大小。如表3所示。
                        表3
    金粒量(μl)     溶胶λmax(nm)     样品数(n) 平均颗粒大小(nm)
    20     590     69     90.6
    40     560     111     71.2
    60     552     77     64.2
    160     540     127     46.2
6.抗T4 F(ab′)2片段的制备
将抗-T4 IgG(OEM Concepts Inc.)的缓冲液换成(用YM-10膜,Amicon)0.1M乙酸钠,0.1M NaCl,pH4.2。将抗体浓度调成4.0mg/ml。加入胃蛋白酶(2%w/w),使消化在37℃进行21.5小时。经过加入1M Tris,pH8.5(12.5%v/v)终止消化。将消化混合物上样到AcA 44(BioSepra Inc.)柱上,用0.1M磷酸钠,0.1MNaCl,5nM EDTA,pH6.0洗脱。以起始IgG为基础,F(ab′)2的回收率为50%,SDS/PAGE显示该产品无IgG污染。产品贮存于-80℃。
7.制备抗-T4·F(ab′)2金溶胶
所有操作使用塑料制品进行。向180ml纯水中加入HAuCl4三水合物(1.02×10-4mol,2ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)且充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(5.76×10-4mol,4ml 10mg/ml的水溶液)且充分搅拌1分钟。加入金粒(60μl)且溶液充分搅拌5分钟。用0.2MK2CO3将pH调成7.6。用纯水将抗-T4 F(ab′)2(0.3mg)稀释成9ml,加入pH调节的金溶胶,充分搅拌15分钟。加入酪蛋白(钠盐,Sigma化学公司)使终止浓度为0.04%在室温上搅拌混合物过夜。
在572nm下观察金溶胶的λmax,吸光率为2.1(在1cm比色皿中)。试验溶胶对Na+离子絮凝的稳定性。向1ml溶胶中加入0.1ml 10%NaCl,加入盐后3和10分钟时监测400至750nm的吸光率光谱。在这些条件下溶胶保留100%的λmax处的吸光率。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的抗T4F(ab′)2。吸出并弃去上清液,沉淀分别重悬于20ml 10mM  HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物,pH7.5中,接着在2000xg下离心15分钟。按上面所述重复洗涤,将溶胶重悬于最小体积的相同缓冲中并在2-8℃贮存。在564nm处观察金溶胶的λmax,光密度为39.0(在1cm比色皿中)。
b).总T4测定的方案
制备试验缓冲液,使试验混合物含有终浓度为50mM的甘氨酸,pH9.0,0.2mM 8-苯胺-1-萘硫酸,110mM碘化钾,0.2%卵清蛋白,6.3%甘露醇,0.6%L-亮氨酸和0.3%Di-Pac(97%蔗糖)。向各小杯(光径长度(“l”)=0.5cm)中加入溶于测定缓冲液的T4-rgG金溶胶,随后加入溶于测定缓冲液的抗-T4 IgG金溶胶或抗T4F(ab′)2金溶胶,接着加入含T4的样品(校准品,对照或未知)。最终测定体积为300μl,样品体积为3μl。调节测定中的各溶胶的浓度使起始双色吸光率不超过2.0。两种溶胶的比例产生最适校准曲线反应性。以0、2.5、5.0、10.0、15.0和25.0μg/dL(0-322nM)将T4称重加入除去了T4的人血清中制备标准品。以10分钟的时间间隔取双色(450/575nm)吸光率读数得到吸光率的减少作为L-甲状腺素浓度的函数。校准曲线的测定结果在表4中提供。测定反应性是双色吸光率×10,000。
                           表4
  μg/dL T4  抗-T4 IgG测定反应性  抗-T4 F(ab′)2测定反应性
    0     2919     6522
    2.5     2512     6113
    5.0     2276     5852
    10.0     1626     4696
    15.0     1086     3434
    25.0     498     1955
这资料在图2中以图示提供,显示了使用抗T4 IgG和抗-T4 F(ab′)2的校准曲线。这些结果显示,F(ab′)2片段比全IgG具有更大的反应性。将未知样品的吸光率与这些校准曲线进行比较以测定样品中总T4的浓度。
实施例II:测量地谷新
a)试剂的制备
1.地谷新rgG连接物的制备
(+)-地谷新(19.7mg,0.025mmol)在55℃溶于3.94ml甲醇中。加入来自100mg/ml贮液(溶于水中)的过碘酸钠(27mg,0.13mmol),反应混合物在室温下避光搅拌过夜。氧化在末端毛地黄毒素糖的糖残基上导入二醛。
将兔γ-球蛋白(rgG,Cohn Fraction II,III,Sigma化学公司)的缓冲液变为(用YM-10膜,Amicon)0.1M K2CO3,pH9.0,蛋白质浓度调节为10.0mg/ml。将过碘酸盐氧化的地谷新(3.33×10-4mmol)加入到rgG(25mg,1.67×10-4mmol)中,并避光放于摇动混合器上2小时。制备溶于0.1N NaOH中的10mg/ml的硼氢化钠溶液。使发生Schiff碱性还原30分钟。将混合物上样到脱盐柱(Pharmacia PD-10)上,用25mM磷酸钠,50mM氯化钠,pH7.4洗脱,合并含蛋白质的馏分。使用以rgG作为内部标准的BSA校准品以蛋白质测定(BCA,Pierce)确定地谷新-rgG连接物的蛋白质浓度。产品贮存于2-8℃。
2.地谷新-rgG金溶胶的制备
所有操作使用塑料制品进行。向900ml纯水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol,10ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(2.88×10-3mol,20ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(300μl)并充分搅拌溶液5分钟。用0.2MK2CO3将pH调成7.5。用纯水将地谷新-rgG(8.0mg)稀释成90ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌15分钟。加入酪蛋白(钠盐,Sigma化学公司)使终止浓度为0.1%,在室温下避光搅拌混合物过夜。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的地谷新-rgG连接物。吸出并弃去上清沉淀分别重悬于100ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物pH7.5中,接着以2000xg离心15分钟。溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中并在2-8℃贮存。
在572nm下观察金溶胶的λmax,光密度为57.3(在1cm比色皿中)。
3.制备抗地谷新F(ab′)2片段
抗地谷新腹水(Beckman Instruments,Inc.,)在蛋白琼脂糖上纯化以分离IgG部分。半抗地谷新IgG的缓冲液换成(用YM-10膜,Amicon)0.1M乙酸钠,0.1M NaCl,pH4.2。且将抗体浓度调成5.8mg/ml。加入胃蛋白酶( 2%w/w)且在37℃进行消化23小时。经过加入1M Tris,pH8.5(20%v/v)终止胃蛋白酶消化。将混合物上样到AcA 44(BicoSepra Inc.)柱上,并用0.1M磷酸钠,0.1M NaCl,5mM EDTA,pH6.0洗脱。F(ab′)2的回收率相对于起始IgG为50%。产品贮存于-80℃。
4.抗地谷新F(ab′)2金溶胶的制备
所有操作使用塑料制品进行。向180ml纯水中加入HAuCl4三水合物(1.02×10-4mol,2ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(5.76×10-4mol,4ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(60μl)且溶液充分搅拌5分钟。用0.2MK2CO3将pH调成7.6。用纯水将抗地谷新F(ab′)2(0.2mg)稀释成18ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌15分钟。加入酪蛋白(钠盐,Sigma化学公司)使最终浓度为0.04%,室温搅拌混合物过夜。
在558nm下观察金溶胶的λmax,吸光率为2.2(在1cm比色皿中)。试验该溶胶对Na+离子絮凝的稳定性。向1ml溶胶中加入0.1ml 10%NaCl,在加入盐后的3和10分钟时监测从400到750nm的吸光率光谱。在这些条件下溶胶保留在λmax下的100%的吸光率。
经过在20至25℃下以2000xg离心未结合的抗地谷新F(ab′)2。吸出并弃去上清,各沉淀重悬于20ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化钠pH7.5中,接着在2000xg下离心15分钟。溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中并在2-8℃贮存。
在562nm下观察金溶胶的λmax,光密度为57.2(在1cm比色皿中)。
b)地谷新测定方案
制备测定缓冲液使测定混合物含终浓度为50mM的甘氨酸、pH9.0,110mM碘化钾,0.2%卵清蛋白,0.07%rgG,6.3%甘露糖,0.6%L-亮氨酸和0.3%Di-Pac(97%蔗糖)。向各小杯(1=0.5cm)中加入溶于测定缓冲液的地谷新rgG金溶胶,接着加入溶于测定缓冲液的抗-地谷新F(ab′)2金溶胶,随后加入含地谷新的样品(校准品,对照或未知样)。最终测定体积为300μl,样品体积为20μl。调节该测定中各溶胶的浓度使起始双色吸光率不超过2.0,2种溶胶的比例给出了最适校准曲线反应性。以0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0ng/ml(0至5.1nm)将地谷新加入人血清中制备校准品。以10分钟的时间间隔取双色(450/575nm)吸光率读数以得到吸光率减少作为地谷新浓度的函数。校准曲线的测定结果在表5中提供。测定反应性是双色吸光率×10,000。
             表5
    ng/ml地谷新     测定反应性
    0     3323
    0.5     3077
    1.0     2923
    2.0     2621
    3.0     2492
    4.0     2117
图5显示了从这些获得的地谷新测定的校准曲线图。将未知样品的吸光率与该校准曲线进行比较以测定样品中地谷新的浓度。实施例IV-苯巴比妥的测量
a)试剂的制备
1.苯巴比妥-rgG连接物的制备
将苯巴双妥戊酸(13.8mg,0.042mmol)加入到0.7ml N,N-二甲基甲酰胺(用4A型分子筛干燥)中。用干燥管(氯化钙)套住搅拌的反应器并在冰/水浴中冷却。加入三乙胺(8.7μl,0.062mmol)并搅拌10分钟。加入氯甲酸异丁酯(8.1μl,0.062mmol),反应混合物在冰/水浴中冷冻搅拌30分钟。在加入的几分钟内观察沉淀。反应的结果产生混合的苯巴比妥戊酸的酸酐。
将兔γ-球蛋白(rgG,Cohn Fraction II,III,Sigma化学公司)的缓冲液换为(Amicon,YM-10)0.1M K2CO3,pH9.0,蛋白质浓度调成10.0mg/ml并在冰/水浴中冷却。混合的苯巴比妥戊酸酐(2.0×10-3mmol)以4个相等的等分试样加入到rgG(30mg,2.0×10-4mmol)中并在冰/水浴中搅拌2小时。将混合物上样到脱盐柱(Pharmacia PD-10)上并用25mM磷酸钠,50mM氯化钠,pH7.4洗脱,合并含蛋白质的馏分并经0.2微米过滤。经过用0.1M K2CO3,pH9.0超滤(Amicon,YM-10膜)继续去掉未结合的苯巴比妥戊酸并以流出物的A248不超过0.015判断为完全去掉。使用以rgG作内部标准的BSA校准品经蛋白质测定(BCA,Pierce)确定苯巴比妥-rgG连接物的蛋白质浓度。产品在2-8℃贮存。
2.苯巴比妥-rgG金溶胶的制备
所有的操作使用塑料制品进行。向900ml纯水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol,10ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(2.88×10-3mol,20ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(300μl),并充分搅拌溶液5分钟。用0.2M K2CO3将pH调成7.5。用纯水将苯巴比妥-rgG(5.0mg)稀释成90ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌15分钟。加入酪蛋白(钠盐,Sigma化学公司)使终浓度为0.1%,且混合物在室温下搅拌过夜。
试验溶胶对Na+离子絮凝的稳定性。向1ml溶胶中加入0.1ml 10%NaCl,在加盐后的3和10分钟监测从400至750nm吸光率光谱。在这些条件下溶胶保留在λmax下其吸光率的95%以上。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的苯巴比妥-rgG连接物。吸出并弃去上清,沉淀分别重悬于100ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物,pH7.5中。接着在2000xg下离心15分钟,溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中,并在2-8℃下贮存。
在580nm下观察金溶胶的λmax,光密度为60.1(在1cm比色皿中)。
3.抗苯巴比妥IgG金溶胶的制备
所有操作使用塑料制品进行。向180ml纯水中加入HAuCl4三水合物(1.02×10-4mol,2ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(5.76×10-4mol,4ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(60μl)并充分搅拌溶液5分钟。用0.2MK2CO3将pH调成7.5。用纯水将抗-苯巴比妥IgG(OEM Concepts Inc.,0.4mg)稀释成18ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌15分钟。加入酪蛋白(钠盐,Sigma化学公司)使终浓度为0.1%,混合物在室温下搅拌过夜。
试验了溶胶对Na+离子絮凝的稳定性。向1ml溶胶中加入0.1ml 10%NaCl,在加入盐后的3和10分钟监测从400到750nm的吸光率光谱。在这些条件下溶胶保留其λmax下吸光率的95%以上。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的抗苯巴比妥IgG。吸出并弃去上清,将沉淀分别重悬于20ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化钠,pH7.5中,接着在2000xg下离心15分钟。溶胶以最小体积重悬于相同缓冲液中并在2-8℃下贮存。
在584nm下观察金溶胶的λmax,光密度为76.1(在1cm比色皿中)。
b)苯巴比妥测定的方案
该方案与用于总T4测定的方案相同,除了:
1)测定缓冲液不含8-苯胺-1-萘磺酸;和
2)苯巴比妥校准品为0、5、10、20、40和60μg/ml(0至260μM)。
校准曲线的测定结果在表6中提供。
                 表6
    μg/ml苯巴比妥  测定反应性
    0     8766
    5     7762
    10     7090
    20     6332
    40     5296
    60     4775
图6显示了从这些结果获得的苯巴比妥测定的校准曲线图。将未知样品的吸光率与这一校准曲线进行比较以测定样品中苯巴比妥的浓度。
实施例V Atrazine的测量
a)试剂的制备
1.Atrazine-rgG连接物的制备
经过使用Atrazine(2-氯-4-乙胺-6-异丙胺-s-三嗪)的氨基与rgG的羧酸基之间的常规碳二亚胺反应实现该连接。
将兔γ-球蛋白(Cohn Fraction II,III,Sigma化学公司)溶于PBS中。用PBS超滤(Amicon,YM-10膜),接着进行0.2微米过滤,将rgG浓度调成10mg/ml。在0.11mg N-羟基琥珀亚胺和0.19mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)存在下将Atrazine(14.3μl 10mg/ml atrazine溶于DMF中)加入1ml rgG中。用稀HCl将混合物调成pH5.5并在室温下放干摇动混合器上过夜。经过用PBS超滤(Amicon,YM-10膜)去掉未结合的atrazine并以流出物的A254不超过0.015判断为完全除去。
使用以rgG作为内部标准的BSA校准品经蛋白测定(BCA,Pierce)确定Atrazine-rgG连接物的蛋白质浓度。
2.Atrazine-rgG金溶胶的制备
所有的操作使用塑料制品进行。向900ml纯水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol,10ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(2.88×10-3mol,20ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(400μl)并充分搅拌溶液5分钟。用0.2M K2CO3将pH调成7.5至7.6。用纯水将Atrazine-rgG(4.0mg)稀释成90ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌30分钟。加入脱脂奶粉(Carnation)使奶粉终浓度为0.04%。在室温下避光搅拌混合物过夜。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的Atrazine-rgG连接物。吸出并弃去上清,沉淀分别重悬于100ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物pH7.5中。接着以2000xg离心15分钟。按上面所述重复洗涤,将溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中并在2-8℃下贮存。测定金溶胶的λmax
3.抗-Atrazine IgG金溶胶的制备
所有的操作使用塑料制品进行。向90ml纯水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-5mol,1ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(2.88×10-4mol,2ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(40μl)且溶液充分搅拌5分钟。用0.2MK2CO3将pH调成7.5。用纯水将atrazine IgG(Biodesign,Inc.,0.2mg)稀释成9.0ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌60分钟。加入脱脂奶粉(Carnation)使奶粉最终浓度为0.04%。室温搅拌混合物过夜。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的atrazine-rgG。吸出并弃去上清,各沉淀重悬于25ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物pH7.5中,接着以2000xg下离心15分钟。按上面所述重复洗涤,溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中并在2-8℃贮存。然后测定金溶胶的λmax
a)Atrazine测定的程序
制备测定缓冲液使测定混合物含终浓度为50mM的甘氨酸、pH9.0,0.2%卵清蛋白,6.3%甘露糖,0.6%L-亮氨酸和0.3%Di-Pac(97%蔗糖)。测定缓冲液还含有选定浓度的离液剂,如碘化钾。向各小杯(l=0.5cm)中加入溶于测定缓冲液的atrazine-rgG金溶胶,接着加入溶于测定缓冲液的抗-atrazine IgG金溶胶,随后加入含atrazine的样品(校准品,对照或未知样)。最终测定体积为300μl,样品体积为3μl。调节该测定中各溶胶的浓度使起始双色吸光率不超过2.0,2种溶胶的比例给出了最适校准曲线反应性。以0至1000ppb将atrazine加入测定缓冲液中制备校准品。在10分钟内取双色(450/575nm)吸光率读数得到吸光率的减少作为atrazine浓度的函数。这些结果用于绘制校准曲线。将未知样品的吸光率改变与该曲线进行比较以确定样品中atrazine的浓度。实施例VI.同时测定苯巴比妥和Phenytoin
通过使用对各分析物在不同波长下吸光的溶胶颗粒实现同时测定苯巴比妥和phenytoin。溶胶可以由不同的金属(如金和银或金与铁)组成或是相同金属的溶胶颗粒但具有不同的直径使其视觉上或化学测量上可分辨或分析。
a)试剂的制备
1.用于苯巴比妥测定的金溶胶的制备
用于苯巴比妥测定的金溶胶的制备按实施例IV.a所述进行。
2.用于phenytoin测定的银溶胶的制备
所有操作使用塑料的容器,测量装置和试管进行。通过使用银溶胶实现phenytoin测定。例如,根据M.Moeremans等,分析生物化学,145:315-321(1985)的方法制备在394nm具有最大吸光率的溶胶银。
3.制备phenytoin-rgG连接物
经过使用二苯基乙内酰脲-3-羧丙基-N-羟基琥珀亚胺酯(Boehringer Mannheim)将phenytoin附着于载体蛋白,例如rgG上。
兔γ-球蛋白(Cohn Fractions II,III,Sigma化学公司)以20mg/ml的浓度溶于25mM磷酸钠,50mM氯化钠,pH7.4(PBS)中。用PBS超滤(Amicon,YM-10膜),接着进行0.2微米过滤并将rgG浓度调成10mg/ml。二苯基乙内酰脲-3-羧丙基-N-羟基琥珀亚胺酯以19mg/ml溶于DMF中,并以4份相等的等分试样加入rgG中使最终摩尔竞争比率为:酯∶rgG为10∶1。混合物在室温下避光放于摇动混合器上过夜。经过用PBS超滤(Amicon,YM-10膜)去掉未结合的phenytoin,当流出物的A248不超过0.015时判断为完全除掉。
使用以rgG作内部标准的BSA校准品经蛋白质测定(BCA,pierce)确定phenytoin-rgG连接物的蛋白质浓度。
4.Phenytoin-rgG银溶胶的制备
所有操作使用塑料制品进行。用0.2M  K2CO3将银溶胶(吸光率单位(“AU”)1.2,900ml)pH调成7.5。用纯水将Phenytoin-rgG(8mg)稀释成90ml,加入调节了pH的银溶胶,充分搅拌30分钟。加入酪蛋白(钠盐,Sigma化学公司)使终浓度为0.1%。混合物地室温下避光搅拌过夜。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的Pheneytoin-rgG连接物。吸出并弃去上清,沉淀分别重悬于100ml 10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物,pH7.5中,接着在2000xg下离心15分钟。按上面所述重复洗涤,溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中,并在2-8℃贮存。然后测定银溶胶的λmax
5.制备抗-Phenytoin IgG银溶胶
所有操作使用塑料制品进行。用0.2M K2CO3将银溶胶(AU 1.2,900ml)pH调成7.5。用纯水将Phenytoin-rgG(2mg)稀释成90ml,加入调节了pH的银溶胶,充分搅拌30分钟。加入酪蛋白(钠盐,Sigma化学公司)使终浓度为0.1%。混合物地室温下搅拌过夜。
经过在20到25℃下以2000xg离心15分钟去掉未结合的抗Pheneytoin-rgG。吸出并弃去上清,将沉淀分别重悬于25ml 10mMHEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物,pH7.5中,接着在2000xg下离心15分钟。按上面所述重复洗涤,将溶胶以最小体积重悬于相同缓冲液中,并在2-8℃下贮存。测定银溶胶的λmax
b)苯巴比妥和Phenytoin测定的方案
制备试验缓冲液,使试验混合物含有终浓度为50mM的甘氨酸,pH9.0,110mM碘化钾。向各小杯(l=0.5cm)中加入溶于测定缓冲液的苯巴比妥-rgG金溶胶,随后加入溶于测定缓冲液的抗-苯巴比妥IgG金溶胶,溶于测定缓冲液中的phenytoin-rgG银溶胶,接着加入溶于测定缓冲液中的抗phenytoin IgG银溶胶,接着加入含苯巴比妥和phenytoin的样品(校准品,对照或未知)。最终测定体积为300μl,调节样品体积使产生最适校准曲线反应性调节测定中的各溶胶的浓度使起始双色吸光率不超过2.0且两种溶胶对的比例产生最适校准曲线反应性。以0、5、10、20、40和60μg/ml(0-260μM)将苯巴比妥称重加入人血清中以及以0、2.5、5、10、20和40μg/ml(0至160μM)将phenytoin称重加入人血清中制备校准品。苯巴比妥和Phenytoin的校准溶液可都在相同溶液中或在2个分开的溶液中。
用同时能监测多种波长的分光光度计在10分钟内监测575nm(苯巴比妥)下吸光率的改变和在394nm(Phenytoin)下吸光率的改变以得到吸光痃的减少作为苯巴比妥和phenytoin浓度的函数来实现两种分析物的同时测定。这些结果用于绘制校准曲线。将未知样品中吸光率的改变与该曲线进行比较以确定样品中苯巴比妥和phenytoin的浓度。化学测定(Partial Least Squares或基本成份分析)用于补偿重叠光谱改变的影响。
实施例VII:Methamphetamine(d-N,α-dimethylphenethyamine)
           的两性测量
a)制备试剂
1.Methamphetamine-rgG连接物的制备
经过使用methamphetamine(d-N,α-dimethylphenethyamine)上的氨基与rgG上的羧酸基团间的常规碳二亚胺反应实现连接。
将兔γ-球蛋白(Cohn Fractions II,III,Sigma化学公司)溶于PBS中。用PBS超滤(Amicon,YM-10膜),接着进行0.2微米过滤,将rgG浓度调成10mg/ml,在10mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)存在时将Methamphetamine(1ml,10mg/ml的DMF溶液)在室温下放于摇动混合器上过夜。经过用PBS超滤(Amicon,YM-10膜)去掉未结合的methamphetamine,当流出物在methamphetamine的λmax下紫外吸光率不超过0.015时判断为完全去掉。
经过蛋白质测定(BCA,Pierce),使用以rgG作内部校准的BSA校准器测定methamphetamine-rgG连接物的蛋白质浓度。
2.制备methamphetamine-rgG金溶胶
所有操作使用塑料制品进行。向900ml纯水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol,10ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(2.88×10-3mol,20ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(400μl)并充分搅拌溶液5分钟。用0.2MK2CO3将pH调成7.5至7.6。用纯水将Methamphetamine-rgG(4.0mg)稀释成90ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌30分钟。加入脱脂奶粉(Carnation)使奶粉终浓度为0.04%,在室温下避光搅拌混合物过夜。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉末结合的methamphetamine-rgG连接物。吸出并弃去上清,沉淀分别重悬于100ml10mM HEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物pH7.5中,接着以2000xg离心15分钟。按上面所述重复洗涤,溶胶重悬于最小体积的相同缓冲液中并在2-8℃贮存。测定金溶胶的λmax
3.抗Methamphetamine-rgG金溶胶的制备
所有操作使用塑料制品进行。向90ml纯水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-5mol,1ml 2%的水溶液,Aldrich化学公司)并充分搅拌1分钟。加入盐酸羟胺(2.88×10-4mol,2ml 10mg/ml的水溶液)并充分搅拌1分钟。加入金粒(40μl)并充分搅拌溶液5分钟。用0.2M K2CO3将pH调成7.5。用纯水将抗-Methamphetamine-rgG(Biodesign,Inc.,0.2mg)稀释成9.0ml,加入调节了pH的金溶胶,充分搅拌60分钟。加入脱脂奶粉(Carnation)使奶粉终浓度为0.04%,混合物在室温下搅拌过夜。
经过在20至25℃下以2000xg离心15分钟去掉末结合的抗-methamphetamine-rgG。吸出并弃去上清,将沉淀分别重悬于25ml 10mMHEPES,0.1%BSA,0.01%迭氮化物pH7.5中,接着以2000xg下离心15分钟。按上面所述重复洗涤,溶胶以最小体积重悬于相同缓冲液中并在2-8℃贮存。然后测定金溶胶的λmax
b)Methamphetamine测定的方案
测定1:使两种金溶胶(methamphetamine-rgG金溶胶和抗-methamphetamine金溶胶)在pH7.4,0.05M的磷酸缓冲液中达到平衡。选择的抗体量超过1000ng/ml methamphetamine的当量。methamphetamine的均相定性测定由离液剂(选定其浓度使减小非特异性溶胶相互作用),过量的自由rgG(也选择来防止样品与methamphetamine-rgG溶胶间的非特异性反应)和反应的金溶胶组成。
在合适的干净容器中混合已知体积的尿样(3μl)和测定试剂(300μl)时,如果在尿样中存在超过1000ng/ml的药物时,methamphetamine-rgG金溶胶和抗-methamphetamine金溶胶分散。在575nm下溶液的吸光率会增加,引起溶液变成品红色且由此表明存在methamphetamine。
测定2:分别干燥溶胶(methamphetamine-rgG金溶胶和抗-methamphetamine金溶胶),与缓冲剂,离液剂,和rgG一起干燥保存于干净的塑料容器中。根据本领域已知的方法(如冻干)来干燥溶胶和其它成份。当已知体积的尿样(3μl)和水(300μl)在试剂容器中混合时,如果在尿液中存在的药物不超过1000ng/ml时,methamphetamine-rgG金溶胶和抗-methamphetamine金溶胶会聚集。在575nm下溶液的吸光率会减少,引起溶液变清,表明不存在methamphetamine。品红颜色的保留将表明在尿样液中存在超过1000ng/ml的药物。
本发明具体参考其优选的实施方案进行了描述。然而,在本发明的实质和范围内本领域的技术人员根据本说明书作出修改和改进将是可预料到的。

Claims (44)

1.一种检测流体样品中配体的存在或测定其量的方法,该方法包含:
(a)提供第一试剂,包含具有可检测的物理特性且结合于(i)配体或配体类似物或(ii)能特异性地与配体偶联的物质上的溶胶颗粒;
(b)提供第二试剂,包含具有可检测的物理特性且结合于能特异性地偶联配体和/或配体类似物的物质上的溶胶颗粒;
(c)混合第一试剂,第二试剂和流体样品,作为样品中配体存在的函数(function),所说的第二试剂与第一试剂偶联;以及
(d)在反应期间或之后检测或测定溶胶颗粒物理特性的改变,该检测或测定与试剂的偶联程度相关且提供了流体样品中配体的定性或定量指标。
2.权利要求1的方法,其中能特异地与配体偶联的第一试剂和物质与能特异性地偶联第二试剂的配体的物质可以相同或不同。
3.权利要求1的方法,其中配体是一种抗原,能特异性地偶联配体的物质是一种抗该抗原的抗体。
4.权利要求1的方法,其中的溶胶颗粒包含一种金属。
5.权利要求4的方法,其中的金属包含金、银、铜、铁或铝。
6.权利要求1的方法,其中的溶胶颗粒包含金。
7.权利要求6的方法,其中的溶胶颗粒具有大约5nm到大约200nm范围的颗粒大小。
8.权利要求1的方法,其中的第一试剂,第二试剂和流体样品在大约同时混合。
9.权利要求1的方法,其中混合第一试剂和第二试剂,然后在预定的时间期间后加入样品。
10.权利要求1的方法,其中第一试剂和第二试剂均是干燥的且以干燥的形式混合并经过加入流体样品溶解。
11.权利要求1的方法,其中物理特性是克分子吸光度,第一和第二试剂的溶胶颗粒在一个波长范围内吸光且在该范围内具有最大吸光率,其中物理特性的改变是溶胶吸光率光谱的改变。
12.权利要求1的方法,其中第一和第二试剂的溶胶颗粒是结合于选自生色团和荧光团的可检测分子上的多聚体。
13.权利要求1的方法,其中配体包含T4,地谷新、苯巴比妥、atrazine或人绒膜促性腺激素。
14.权利要求1的方法,其中的物理特性是散射光。
15.权利要求14的方法,其中的检测或测定包含比浊检测。
16.一种检测流体样品中配体存在的方法,包含:
(a)提供第一试剂,包含具有明显可检测的物理特性的结合于配体或配体类似物上的溶胶颗粒;
(b)提供第二试剂,包含具有明显可检测的物理特性且结合于能特异性地偶联配体或配体类似物的物质上的溶胶颗粒;
(c)在溶液中混合第一和第二试剂使第一和第二试剂偶联,这使得与混合前的第一和第二试剂相比溶液产生不同的明显可检测的物理特性;
(d)加入样品;
(e)观察溶液的物理特性;
(f)将物理特性与样品中配体的存在与否相关联。
17.权利要求16的方法,其中能特异性地偶联配体或配体类似物的物质的量是当样品中配体的低于阈值量时,配体被溶胶吸附而不破坏聚聚集,当配体高于阈值量时,配体破坏聚集,在溶液的物理特性上产生明显的改变。
18.权利要求17的方法,其中的配体是滥用的药品。
19.权利要求18的方法,其中的配体选自ampheramine、大麻麦、可卡因、鸦片制剂和phencyclidine。
20.一种检测流体样品中配体的存在或测定其量的试剂盒,包含:
(a)第一试剂,包含具有明显可检测的物理特性且结合于(i)配体或配体类似物或(ii)能特异性地与配体偶联的物质上的溶胶颗粒;
(b)第二试剂,包含具有明显可检测的物理特性且结合于能特异性地偶联配体或配体类似物的物质上的溶胶颗粒,作为样品中配体存在的函数,所说的第二试剂与第一试剂偶联从而产生物理特性的变化,该变化与该试剂的偶联程度相关。
21.权利要求20的试剂盒,其中能特异性地与配体偶联的第一试剂的物质与能特异性地偶联配体的第二试剂的物质可以相同或不同。
22.权利要求20的试剂盒,其中的溶胶颗粒包含一种金属。
23.权利要求22的试剂盒,其中的金属包含金、银、铜、铁或铝。
24.权利要求23的试剂盒,其中的溶胶颗粒具有从大约5nm到大约200nm范围的颗粒大小。
25.权利要求20的试剂盒,其中物理特性是克分子的吸光度,第一和第二试剂的溶胶颗粒在一定的波长范围内吸光且在该范围具有最大吸光率。
26.权利要求25的试剂盒,其中的检测或测定包含使用溶胶颗粒最大吸光率处的波长测量反应的吸光率。
27.一种具有可检测的物理特性的免疫学复合物,包含:
(a)具有可检测的物理特性且结合于(i)配体或(ii)能特异性地偶联配体的物质上的第一溶胶颗粒;和
(b)具有可检测的物理特性且结合于能特异性地偶联配体的物质上的第二溶胶颗粒,其中物理特性的性质根据第一和第二溶胶颗粒的偶联而改变。
28.权利要求27的免疫学复合物,其中能特异性地与第一试剂的配体偶联的物质与能特异性地偶联第二试剂的配体的物质可以相同或不同。
29.权利要求27的免疫学复合物,其中的溶胶颗粒包含一种金属。
30.权利要求29的免疫学复合物,其中的金属包含金、银、铜、铁或铝。
31.权利要求29的免疫学复合物,其中的溶胶颗粒具有从大约5nm到大约200nm范围的颗粒大小。
32.权利要求31的免疫学复合物,其中的物理特性是克分子吸光度。
33.权利要求32的免疫学复合物,其中的配体是T4、地谷新、苯巴比妥、人绒膜促性腺激素或atrazine。
34.一种检测流体样品中多种配体的存在或测定其量的方法,其中该方法包括:
(a)提供针对所说的多种配体中每一种的第一试剂,包含结合于(i)该配体或配体类似物或(ii)能特异性地偶联该配体的物质上的溶胶颗粒;
(b)提供针对所说的多种配体中每一种的第一试剂,包含结合于能特异性地偶联配体或配体类似物的物质上的溶胶颗粒,相应于各种所说的配体的第一和第二试剂的溶胶颗粒具有专一的可检测的物理特性,它与相应于其它配体的溶胶颗粒的物理特性能区分开;
(c)混合该试剂与流体样品,作为样品中多种配体存在的的函数,所说的试剂互相偶联,从而产生物理特性的改变,该改变与试剂的偶联程度相关;且
(d)在反应期间或之后检测或测定溶胶颗粒的物理特性,该检测或测定提供了流体样品中多种配体的定性或定量指标。
35.权利要求34的方法,其中的能特异性地偶联第一试剂的配体的物质与能特异性地偶联第二试剂的配体的物质可以相同或不同。
36.权利要求34的方法,其中的相应于多种配体中每一种的溶胶颗粒包含一种金属。
37.权利要求36的方法,其中的金属包含金、银、铜、铁或铝。
38.权利要求36的方法,其中的物理特性是克分子吸光度且其中相应于多种配体中每一种的溶胶颗粒是具有不同克分子的吸光度的不同金属。
39.权利要求36的方法,其中的物理特性是克分子吸光度,且其中相应于多种配体中每一种的溶胶颗粒是不同大小且具有不同克分子吸光度的相同金属的溶胶颗粒。
40.权利要求38的方法,其中的多种配体包含苯巴比妥和phenytoin。
41.一种制备结合于配体或配体类似物上的溶胶颗粒试剂的方法,包含:
将配体连接到选自第一蛋白质,树状体或第一多聚体的载体分子上形成配体连接物;
将配体连接物结合到溶胶颗粒上形成配体结合的溶胶;且
用选自第二蛋白质,去污剂或第二多聚体的封闭剂稳定配体结合的溶胶颗粒。
42.根据权利要求41的方法,其中的第一蛋白质包含免γ球蛋白。
43.根据权利要求42的方法,其中的封闭剂选自脱脂奶粉或酪蛋白。
44.根据权利要求43的方法,其中的封闭剂是酪蛋白。
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