CN1675544A - 用于磁结合测定的自校正系统 - Google Patents

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Abstract

提供了一种自校正磁结合测定(例如，夹层体式，竞争性等)用于检测测试样品中分析物的存在或量。所述磁结合测定包括能够生成检测信号的检测探针(例如荧光非磁性颗粒)和能够生成校正信号的校正探针(例如荧光磁性颗粒)。测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例。

Description

用于磁结合测定的自校正系统
                   本发明的背景技术
目前在分析检测中通常采用各种分析方法和装置以确定测试样品中分析物的存在和/或不存在。例如，免疫测定利用免疫系统的机制，其中响应抗原的存在生成抗体，所述抗原对于有机体来说是致病性的或者异源性的。这些抗体和抗原，即免疫反应物，能够相互结合，从而引起高度特异的反应机制，其可用于确定生物样品中特定抗原的存在或浓度。
目前有几种公知的免疫测定方法，其使用了经可检测组分标记的免疫反应物，从而可以在分析上检测分析物。例如，“夹层体式”检测通常涉及将测试样品与分析物的抗体相混合。这些抗体是移动的并与标记物或探针连接，例如染色乳胶、胶体状金属溶胶或放射性同位素。然后，所述混合物与色谱分离介质接触，所述介质含有分析物的固定抗体的条或带。所述色谱分离介质通常为类似于量杆的条状物。当分析物和标记抗体的复合物到达色谱分离介质上的固定抗体区域，发生结合，所结合的标记抗体定位在所述区域内。其指示了分析物的存在。该方法可以用于获得定量或半定量结果。所述夹层体式检测方法的某些例子参见Grubb等的美国专利申请No.4168146和Tom等的美国专利申请No.4366241。
另一种技术为“竞争性”检测。在竞争性检测中，标记物通常为标记的分析物或分析物类似物，其与样品中存在的任意未标记分析物竞争结合抗体。竞争性检测通常用于检测例如半抗原的分析物，每个半抗原为单价，仅能结合一个抗体分子。竞争性免疫测定装置的例子参见Deutsch等的美国专利申请No.4235601，Liotta的美国专利申请No.4442204和Buechler等的美国专利申请No.5208535。
磁结合测定广泛用于从复杂样品中分离生物物质(例如，蛋白、细胞和微生物)，其原因是，可以非常容易地通过磁场对所述分析测定进行操作，不需要特殊和昂贵的设备。这样，磁免疫测定可以提供一种快速简便的方法以确定物质的存在与否。在上述检测中，采用了各种信号生成机制，包括颜色(吸收和反射)、荧光、化学发光、放射性和酶。
然而，常规的磁免疫测定通常需要对照样品，从而得到校正曲线，用于每次获得分析物的定量信息。尤其是，当分析测试样品中的生物物质的存在与否时，对已知量的物质同时检测多个对照样品，从而在近似相同的条件下校正所述检测。不幸的是，所述校正方法通常不是很方便、成本较高，对测试者来说比较麻烦。
因此，当前需要有一种准确的用于分析测定的校正系统，其易于控制，而且相对较为便宜。
                   本发明的简要描述
根据本发明的一个实施方式，公开了一种自校正的磁结合测定(例如，夹层体式、竞争性等)，用于检测测试样品中分析物的存在或量。所述磁结合测定包括能够生成检测信号的检测探针和能够生成校正信号的磁校正探针，其中测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例(例如，正比或反比)。在某些实施方式中，检测探针、校正探针或它们的组合与特定结合组分结合。所述特定结合组分可以例如选自由以下构成的组，包括抗原、半抗原、抗体及它们的复合物。
通常来说，检测探针和校正探针可以由能够生成可检测信号的任意材料构成。例如，在某些实施方式中，所述探针选自以下组，所述组包括生色团、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目测的标记物、脂质体以及它们的组合。例如，所述检测探针和校正探针可以是荧光化合物，例如荧光颗粒。在一特定实施方式中，检测探针为荧光非磁性化合物，校正探针为荧光磁性颗粒。如果需要，所述荧光磁性颗粒可以与特定结合组分结合或被阻断。
根据本发明的另一实施方式，公开了一种检测测试样品中分析物的存在或量的方法。所述方法包括：
i)提供一种磁结合测定，包括能够生成检测信号的检测探针和能够生成校正信号的磁性校正探针；
ii)使含有所述分析物的测试样品与检测探针和校正探针接触；
iii)采用磁性装置从测试样品中分离出检测探针和校正探针；
iv)激发分离出的检测探针(复合和/或未复合的)和分离出的校正探针(复合和/或未复合的)，其中所述激发使得所述分离出的检测探针发出检测信号，使得分离出的校正探针发出校正信号；
v)测量检测信号的强度和校正信号的强度；以及
vi)比较检测信号和校正信号的强度，其中测试样品中的分析物量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例。
因此，所述分离出的检测和校正探针(复合和/或未复合的)能够指示测试样品中的分析物的存在或量。尤其是，测试样品中分析物的量与检测区内分离出的检测探针(复合和/或未复合的)所产生的检测信号强度成比例，所述检测信号强度经过检测区内分离出的校正探针(复合和/或未复合的)所产生的校正信号强度校正。例如，在一个实施方式中，测试样品中分析物的量与检测信号强度和校正信号强度的商成比例。
可以同时或者单独激发所述分离出的检测探针和校正探针。类似地，可以同时或者单独测量检测信号和校正信号的强度。进一步地，在一个实施方式中，所述方法进一步生成校正曲线，就多个预定分析物浓度对经校正信号强度校正的检测信号强度进行作图，从而得到所述曲线。
以下将对本发明的其它特征和方面进行详细描述。
                   附图的简要说明
在以下说明书部分中，针对本领域的普通技术人员，参考以下附图对本发明进行全面公开，包括最佳方法，其中：
附图1为本发明检测装置的一个实施方式的透视图；
附图2为本发明夹层体式检测的一个实施方式的反应机制图形说明；
附图3为本发明夹层体式检测的另一实施方式的反应机制图形说明；
附图4为本发明竞争性检测的一个实施方式的反应机制图形说明；
附图5为本发明竞争性检测的另一实施方式的反应机制图形说明；
附图6为将抗体共价结合至羧酸盐纳米颗粒的一个实施方式的图形说明；
附图7显示了根据本发明一个实施方式的校正探针(C)和检测探针(FP)的激励(EX)和发射(EM)光谱；
附图8显示了例1中所讨论的标化荧光强度对促黄体生成素(LH)的量之间的关系；
附图9显示了例2中所讨论的标化荧光强度对促黄体生成素(LH)的量之间的关系；
附图10显示了例4中所讨论的标化荧光强度对C反应蛋白(CRP)的量之间的关系。
在本说明书和附图中重复使用的参考标记代表本发明的相同或相似特征或元件。
                 代表性实施方式的详细描述
                          定义
在本文中，术语“分析物”通常是指待检测物质。例如，分析物可以包括抗原性物质，半抗原，抗体以及它们的组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括出于治疗目的以及违法目的服用的药物)、细菌、病毒颗粒、以及上述物质的代谢物或者抗体。某些分析物的特定例子包括铁蛋白；肌酐激酶MIB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；鲁米那；酰胺咪嗪；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼丁；促黄体生成素(LH)；卵泡刺激素(FSH)；雌二醇，黄体酮；IgE抗体；维生素B2微球蛋白；糖化血红蛋白(Gly，Hb)；皮质醇；洋地黄毒甙；N-乙酰普鲁卡因胺(NAPA)；普鲁卡因胺；风疹病毒抗体，例如风疹病毒IgG和风疹病毒IgM；弓形虫抗体，例如弓形虫IgG(Toxo-IgG)和弓形虫IgM(Toxo-IgM)；睾丸激素；水杨酸盐；对乙酰氨基酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝病毒核心抗原的抗体，例如抗乙肝病毒核心抗原IgG和IgM(抗-HBC)；人类免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人类T细胞白血病毒1和2(HTLV)；乙肝病毒e抗原(HBeAg)；抗乙肝病毒e抗原的抗体(抗-HBe)；甲状腺刺激素(TSH)；甲状腺素(T4)；总三碘甲状腺氨酸(总T3)；游离三碘甲状腺氨酸(游离T3)；癌胚抗原(CEA)；和α甲胎蛋白(AFP)。滥用的药物和被控制的物质包括但不限于，苯丙胺；甲基苯异丙胺；巴比妥类，例如异戊巴比妥，司可巴比妥，戊巴比妥和巴比妥；苯二氮，例如甲氨二氮卓和安定；大麻成分，例如大麻粉和大麻毒品；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鸦片剂，例如海洛因、吗啡、可待因、二氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、14-羟基二氢可待因酮、氧吗啡酮和鸦片；苯环己哌啶；和丙氧酚。其它潜在的分析物参见Tom等的美国专利No.4366241。
本文中，术语“测试样品”通常是指怀疑含有分析物的材料。所述测试样品可以从其来源直接应用，或者对其进行预处理从而修饰样品的特征。测试样品可以来自任何生物来源，例如生理液体，包括血液、唾液、接触镜液体、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、raucous、滑液、腹膜液、羊水等。在使用前可以对测试样品进行预处理，例如从血液制备血浆、稀释粘性液体等等。处理的方法涉及过滤、蒸馏、浓缩、对干扰组分的灭活以及加入试剂。除了生理液体之外，也可以使用其它液体样品，例如水、食物等等，从而进行环境或食品生产检测。另外，怀疑含有分析物的固体材料也可以用作测试样品。在某些情况下，对固体测试样品进行修饰从而形成液体介质或释放分析物是有利的。
                         详细描述
现在对本发明的不同实施方式进行详细参考，以下描述了一个或几个例子。本发明对每个例子进行了解释，但不是对本发明的限制。实际上，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，对本发明进行各种修改和变化对于本领域技术人员来说，是显而易见的。例如，举例或者描述的作为实施方式一部分的特征可以用于另一实施方式中，从而得到其它实施方式。因此，在以下权利要求及其等同物的范围内，本发明包括了上述修改和变化。
总的来说，本发明涉及自校正的磁结合测定(例如，夹层体式、竞争性等)，用于检测测试样品中分析物的存在或量。所述磁结合测定包括能够生成检测信号(例如，荧光非磁性颗粒)的检测探针和能够产生校正信号(例如，荧光磁性颗粒)的校正探针。测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例(例如，正比或反比)。已经发现，所述自校正系统提供了一种准确、便宜而且易于控制的方法，用于确定测试样品中分析物的存在。
例如参照附图1-2，对可以根据本发明形成的流式夹层体式检测装置20的一个实施方式进行详细描述。如图所示，检测装置20包括多孔膜23，其可选择地由刚性材料21支撑。通常，所述多孔膜23可以由多种材料中的任一种构成，测试样品能够通过所述材料。例如，用于形成多孔膜23的材料可以包括但不限于，天然、合成或者经合成修饰的天然生成的材料，例如多糖(例如纤维素材料，例如纸和纤维素衍生物，例如醋酸纤维素和硝酸纤维素)；硅土；无机材料，例如去活性的氧化铝、硅藻土、MgSO4、或其它均匀分散在多孔聚合物基质中的无机细小分离材料，聚合物例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物、和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；布料，包括天然形成(例如棉花)和合成的(例如尼龙和人造丝)；多孔胶，例如硅胶、琼脂糖胶、葡聚糖和白明胶；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺；等等。在一特定实施方式中，所述多孔膜23由硝酸纤维素和/或聚酯砜材料构成。应这样理解，术语“硝酸纤维素”是指纤维素的硝酸酯，其可以是单独的硝酸纤维素，或者硝酸和其它酸的混合酯，例如具有1至7个碳原子的脂族羧酸。
检测装置20还可以含有芯吸垫28。所述芯吸垫28通常接受迁移经过整个多孔膜23的液体。如本领域所公知的，芯吸垫28可以帮助促进毛细管作用以及液体流经膜23。
为了开始检测测试样品中的分析物，用户可以直接将测试样品施加至多孔膜23的一部分，样品可以经过该部分迁移至一个或多个检测和校正区(如下所述)。或者，首先将测试样品施加于加样垫(未示出)，所述加样垫与多孔膜23流体连接。可以形成加样垫的一些适当材料包括但不限于，硝酸纤维素、纤维素、多孔聚乙烯垫、和玻璃纤维滤纸。如果需要，所述加样垫可以含有一个或多个测定预处理试剂，所述试剂可以是扩散性或非扩散性的附着在加样垫上。
在所描述的实施方式中，测试样品从加样垫(未示出)迁移至结合垫22，所述结合点与加样垫的一端流体连接。结合垫22由测试样品能够通过的材料构成。例如，在一个实施方式中，结合垫22由玻璃纤维构成。尽管只显示了一个结合垫22，但是应这样理解，在本发明中也可以采用其它的结合垫。
为了有利于检测测试样品中分析物的存在与否，可以在结合垫22上施加不同的检测探针41。当探针被包含在结合垫2上时，当分析物从加样垫经过结合垫22时，这些探针41能够结合分析物。一旦与分析物结合，探针41在随后可以用于确定分析物的存在与否。检测探针41可以用于装置20的检测和校正。然而，在其它实施方式中，还可以在结合垫22上施加独立的校正探针43，与检测探针41一起同时进行校正和检测，从而消除通常由常规检测校正系统导致的不精确性。但是，应当这样理解，检测探针41和/或校正探针43可以一起或者单独施加于装置20的任意位置，而不需要施加至结合垫22上。进一步地，应当这样理解，检测探针41和/或校正探针43可以施加至相同或不同结合垫上。
通常能够产生可视觉检测或通过仪器装置检测的信号的任意物质可以用作检测探针41和/或校正探针43。各种适当的物质包括生色团；催化剂；荧光化合物；化学发光化合物；磷光化合物；放射性化合物；直接目测的标记物，包括胶体金属(例如金)和非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物，或有机聚合物乳胶颗粒；脂质体或其它含有信号生成物质的囊泡；等等。例如，Litamen等的美国专利No.4275149中公开了适合用作探针的酶，出于所有目的，该申请在本文中结合并引用。酶/底物系统的一个例子为碱性磷酸酶和底物硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-引哚磷酸盐，或其衍生物或类似物，或者底物4-甲基umbelliferyl-磷酸盐。其它适当的探针在Jou等的美国专利申请No.5670381和Tarcha等的美国专利申请No.5252459中进行了描述，出于所有目的，所述申请全文在本文中结合并引用。
在某些实施方式中，检测探针41和/或校正探针43可以含有生成可检测信号的荧光化合物。所述荧光化合物可以是荧光分子、聚合物、树状物、颗粒等等。某些适当荧光分子的例子例如包括但不限于，荧光素、铕螯合物、藻胆蛋白、若丹明和它们的衍生物及类似物。而且，某些商业可得的适当荧光颗粒的例子包括Molecular Probes公司出售的荧光羧化微球，其商品名为“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)，以及“Texas Red”和5-及6-羧基四甲基若丹明，它们同样由Molecular Probes公司出售。
不论采用那种方法使探针具有产生信号的能力，通常所需要的是，检测探针41和/或校正探针43为磁响应探针。通常，如果材料受施加的磁场的影响，例如，其被吸引或排斥或具有可检测的磁易感性或诱导，则认为该材料为“磁响应的”或“磁性的”。例如，可用于使探针具有磁属性的适当磁性响应材料的某些例子包括但不限于，顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料和变磁性材料。特定的例子为金属，例如铁、镍、钴、铬、锰等；镧系元素，例如钕、铒等；合金，例如铝、镍、钴、铜等的磁性合金；氧化物，例如氧化铁(Fe3O4)、氧化亚铁(Fe2O3)、氧化铬(CrO2)、氧化钴(CoO)、氧化镍(NiO2)、氧化锰(Mn2O3)等；复合材料，例如铁氧体等；以及固溶体，例如氧化铁的磁铁矿等。
在某些实施方式中，检测探针41和/或校正探针43为荧光的和磁性的。荧光磁性探针是本领域公知的，通常包括磁响应组分和荧光组分。在某些实施方式中，例如，可以将一个或多个荧光染料加至磁性颗粒上形成探针，而在其它实施方式中，可以将荧光染料加至非磁性颗粒上，所述非磁性颗粒和磁性颗粒结合。某些荧光染料的适当例子包括但不限于，单次甲基染料、三次甲基染料、五次甲基染料、喹啉染料、基于方形酸的染料等等。作为单次甲基染料的吡啶通常具有蓝色或蓝绿荧光发射，而喹啉通常具有绿色或黄绿荧光发射。所述三次甲基染料基本上向红色波长漂移，而五次甲基染料漂移地更远，通常显示红外荧光发射。所述荧光染料的特殊例子包括但不限于，酞菁、2，3-萘亚甲基菁、squaraine和克酮酸衍生物。其它适当的荧光磁性颗粒的例子见Luotola等的美国专利No.4731337和Chandler等的No.6268222，出于所有目的，所述中请的全文在本文中引用并结合。
当检测探针41和/或校正探针43为颗粒时，如上所述，根据不同因素，例如所选择的颗粒的类型、膜的孔径以及膜的组成，所述颗粒状探针的平均直径通常可以根据需要而改变。例如，在某些实施方式中，所述颗粒状探针的平均直径为大约0.01微米至大约1000微米，在某些实施方式中为大约0.01微米至大约100微米，在某些实施方式中为大约0.01微米至大约10微米。在一特定实施方式中，所述颗粒状探针的平均直径为大约1微米至大约2微米。通常，所述颗粒的形状基本为球形，但是其它形状也适用于本发明，包括但不限于，盘状、杆状、条状、不规则形等等。如本领域技术人员应知晓的，颗粒的组成、形状、大小和/或密度可以广泛变化。
检测探针41和/或校正探针43能够结合(共价或非共价)或物理吸附分析物。但是，通常所需要的是，以某种方式对探针进行修饰，从而所述探针更加易于结合分析物。在这种情况下，检测探针41和/或校正探针43可以用特定结合组分90a和/或90b进行修饰，所述特定结合组分粘附其上形成探针结合物。
特定结合组分通常是指特定结合对中的一个组分，所述结合对即两个不同分子，其中一个分子与第二个分子化学和/或物理结合。例如，免疫反应性特定结合组分可以包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基(aptamer)、抗体以及它们的复合物，包括由重组DNA方法或肽合成形成的复合物。抗体可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白或它们的混合物或片段，以及抗体和其它特定结合组分的混合物。上述抗体的制备和用作特定结合组分的适用性的细节是本领域技术人员公知的。
其它常见的特定结合对包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列(包括在DNA杂交检测中使用的探针和捕获核酸序列，用于检测靶核酸序列)、互补肽序列(包括用重组方法形成的肽序列)、效应物和受体分子、激素和激素结合蛋白、酶协同因子和酶、酶抑制剂和酶，等等。而且，特定结合对包括的组分可以是原始特定结合组分的类似物。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即分析物类似物，只要其与分析物具有至少一个相同的表位。
所述特定结合组分90a和/或90b通常可以采用各种公知的技术附着于探针41和/或43上。例如，采用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基、环氧基以及其它反应或连接功能团将特定结合组分90a和/或90b(例如微粒)共价连接至探针41和/或43上(例如微粒)，以及通过剩余游离基和游离阳离子发生蛋白耦合反应从而将特定结合组分共价连接至探针上。表面功能基团还可以结合作为功能化的共聚单体，这是由于微粒的表面可以具有相对高的极化基团表面浓度。另外，虽然微粒探针通常在合成后进行功能化，在特定情况下，例如聚苯硫酚，微粒能够直接与蛋白共价连接，不需要进一步的修饰。例如，附图6中描述了本发明的共价结合探针的一个实施方式。如图所示，结合的第一步是采用碳化二亚胺活化探针表面的羧基。第二步，活化的羧酸基团与抗体的氨基反应从而形成酰胺结合。可以在缓冲液中进行活化和/或抗体耦合，例如磷酸盐缓冲液(PBS)(例如，PH为7.2)或2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，例如PH5.3)。如图所示，然后用例如乙醇胺阻断所得到的探针，从而形成探针共轭物。除了共价结合之外，本发明中还可以采用其它连接方法，例如物理吸附。
再次参照附图1-2，开始时可以将含有分析物的测试样品施加至加样垫上。然后，所述测试样品从加样垫迁移至结合垫22，其中分析物与检测探针41和/或校正探针43混合。根据所选择的探针类型，分析物可以与检测探针41和/或校正探针43结合从而形成复合物49(见附图2)。例如，在一个实施方式中，含有分析物的测试样品与(1)荧光非磁性颗粒41混合和(2)荧光磁性颗粒43混合，所述荧光非磁性颗粒41与第一结合组分90a结合，所述荧光磁性颗粒43与第二结合组分90b结合。在上述例子中，分析物与荧光非磁性颗粒41和荧光磁性颗粒43形成夹层体式复合物49。而且，由于结合垫22与多孔膜23流体连接，复合物49可以从结合垫22迁移至多孔膜23上的检测区31。
在检测区31处，复合物49和任意游离的结合荧光磁性颗粒43被磁性装置60捕获，并采用常规技术从其余样品中分离除去。例如磁场发生器可用于产生磁场，其引发磁响应探针的响应。适当的磁场发生器包括但不限于，永磁体和电磁体。所述磁分离过程通常涉及将样品与液体介质中的磁性颗粒混合，从而通过亲和反应结合分析物，然后，通过施加磁场从样品介质中分离未结合的磁性颗粒和分析物复合物。如果不是所有磁性颗粒，除了胶体颗粒外，大部分磁性颗粒及时沉降。因此，可以搅拌所述液体介质，使颗粒悬浮充足时间，从而发生生物亲和结合反应。已知的搅拌方法包括振荡、涡旋、摇动、旋转或者在部分充满的容器中进行类似操作。某些适当磁分离装置的商业上可购得的例子包括纽约Daynal公司，Lake Success生产的Dynal MPC分离器系列，所述装置在容纳测试介质的容器外部设置永磁体，其仅仅用于分离。单独对测试介质中的磁性颗粒进行混合从而用于亲和结合反应。此外，其它捕获磁性颗粒的方法参见Liberti等的美国专利申请No.5200084、Tuunanen等的No.5647994、Wang等的No.5795470以及Siddiqi等的No.6033574，出于所有目的，所述申请的全文在本文中结合并引用。
一旦被捕获，可以用常规技术测量复合和未复合的荧光磁性颗粒43和复合物49的荧光信号。例如，在一个实施方式中，颗粒43和复合物49可用同样外部源进行激发。在该实施方式中，所述源提供位于激发波长处的辐射，从而使颗粒43发出光，所述光的波长不同于复合物49所发出的波长。这样，可以单独测量复合物49和颗粒41的存在。另外，还可以采用单独的外部源单独测量颗粒43和复合物49。
通常而言，荧光为特定荧光化合物发生的三阶段过程的结果。在第一阶段，由外部源提供能量，例如白炽灯或激光，能量被荧光化合物吸收，得到激发的电子单重态。在第二阶段，激发态持续一有限时间，在此期间，荧光化合物发生构型改变，同时还与其分子环境发生多种相互作用。在此时间内，激发态的能量部分被消耗，产生松弛态，由此产生荧光发射。第三阶段为荧光发射阶段，发射能量，将荧光化合物返回至基态。发射出的能量低于其激发能(灯或激光)，因此具有较长的波长。这种能量或波长的漂移或不同使得发射能能够被检测出来，并与激发能分离开。
荧光检测通常利用波长过滤将发射光子同激发光子区分开来，以及检测器将发射光子记录下来并生成可记录的输出，所述输出通常为电信号或摄影图像。通常有四种类型的公认检测器：分光荧光计和微板读数器；荧光显微镜；荧光扫描仪；和流式细胞计。本发明中采用的一个适当荧光检测器为Fluorolog III分光荧光计，其由新泽西州的SPEX Industiries，Inc.of Edison出售。
尽管不需要，特别需要的检测和校正探针对的选择原则包括：(1)吸收光谱或荧光光谱之间很少或没有光谱重叠，从而可以分别测量发射强度；(2)当检测和校正探针紧邻放置在一起时，检测和校正探针之间没有显著的荧光能量转移，从而它们可以独立发射；和(3)具有相对较长的发射波长(例如大于大约600nm)，从而生物液体的自荧光对荧光测量具有最小的影响。例如，附图7显示了示例性的校正探针和检测探针，它们的激发光谱具有很少的重叠，从而校正探针和检测探针可以独立地被激发。
进一步地，如果需要，在本发明中还可以采用称为“时间分辨荧光检测”的技术。时间分辨荧光检测设计用于减少来自发射源或来自散射过程(来自激励辐射的散射)的背景信号，其利用了特定荧光材料的荧光特性，例如铕(Eu(III)和铽(Tb(III))的镧系螯合物。在非常短的波长激发所述螯合物之后，其可以显示较强的红色漂移、窄带、寿命较长的发射。通常，由于生色团邻近所述分子中的镧系元素，因此所述螯合物具有强的紫外吸收波段。在生色团的光吸收之后，所述激励能量从被激发的生色团转移至镧系元素。之后为所述镧系元素的荧光发射特性。采用脉冲式激励和按时选通的检测，以及窄波带发射滤光器，能够仅仅对来自镧系螯合物的荧光进行特定检测，而排除来自样品中其它物质的发射，所述发射通常存在时间较短或具有较短的波长发射。其它用于测量荧光的时间分辨技术参见Davidson的美国专利申请No.5585279和Hemmila等的No.5637509，出于所有目的，所述申请的全文在本文中结合并引用。
不论所采用的测量荧光的技术，通过比较捕获的荧光非磁性颗粒41和捕获的荧光磁性颗粒43的荧光信号，可以确定分析物的绝对量。所述捕获的荧光非磁性颗粒41的荧光强度Is可以与捕获的荧光磁性颗粒43的荧光强度Ic进行比较。被捕获的荧光磁性颗粒43的总量是预定的而且已知的，从而可以用于校正。例如，在一个实施方式中，分析物的量与Is和Ic的比率成正比。基于检测区31所位于的强度范围，可以确定分析物的总浓度范围。因此，可以同时在近似相同的条件下进行校正和样品检测，从而提供可靠的定量或半定量结果，同时其灵敏度增加。
如果需要，Is与Ic的比率可以在已知分析物浓度范围内对分析物的浓度进行作图，从而得到校正曲线。为了确定未知测试样品中分析物的量，所述信号比率可以根据校正曲线转换为分析物浓度。应注意的是，所述复合和未复合荧光磁性颗粒的捕获效率对于任意给定样品通常是相同的。因此，捕获效率的变化对来自一个样品接一个样品的结果没有显著干扰，这是因为采用了荧光强度比率(即Is/Ic)而不是绝对荧光。还应注意的是，还可以对Is和Ic之间的其它数学关系和分析物浓度进行作图，从而得到校正曲线。例如，在一个实施方式中，可以对Is/(Is+Ic)的值和分析物浓度进行作图，从而得到校正曲线。
本发明还考虑了其它不同的实施方式。例如，参照附图3，可以对上文所述的附图1中的检测装置20进行修改，从而形成另一夹层体式检测模式。在一个实施方式中，例如可以一开始将含有分析物的测试样品与(1)和第一结合组分190a结合的荧光非磁性颗粒141a，(2)荧光磁性颗粒143，(3)和第二结合组分190b结合的非荧光磁性颗粒141b混合。在该特定实施方式中，所述荧光磁性颗粒143可以被阻断剂阻断，例如β-酪蛋白，从而防止与分析物的非特异性结合，从而使得所述颗粒143仅仅作为校正探针。进一步地，第一特定结合组分190a和第二特定结合组分190b可以是分析物的类似物。
术语“阻断剂”是指附着于探针表面上的试剂，从而其“阻断”或防止非分析物材料结合至所述表面。阻断剂可以包括但不限于，β-酪蛋白、白蛋白例如牛血清白蛋白、pluronic或其它表面活性剂、聚乙二醇、聚乙烯醇、或上述化合物的硫化衍生物以及其它本领域技术人员公知的任意阻断材料。
再次参照附图3，所述分析物、结合荧光非磁性颗粒141a和结合非荧光磁性颗粒141b形成夹层体式复合物149。由于结合垫22与多孔膜23流体接触，所述复合物149可以从结合垫22迁移至多孔膜23上的检测区31。在检测区31，复合物149和任意未结合颗粒143和/或141b被磁性装置60捕获，并从其它样品中分离出来。如上所述，通过比较捕获的荧光非磁性颗粒141a的荧光强度Is和捕获的荧光磁性颗粒143的荧光强度Ic，可以确定分析物的绝对量。特别是，捕获的荧光磁性颗粒143的总量是事先确定而且已知的，从而可以用于校正。因此，该实施方式中分析物的量与Is和Ic的比率成正比。
而且，参照附图4，可以对上文所述的附图1中的检测装置20进行修改，从而形成竞争性检测。在一个实施方式中，例如，可以一开始将含有分析物的测试样品与(1)和第一结合组分290a结合的荧光非磁性颗粒241，(2)和第二结合组分290b结合的荧光磁性颗粒243混合。在该特定实施方式中，第一结合组分290a可以与分析物相同，而第二结合组分290b可以是分析物的类似物。
一旦混合，分析物与结合的荧光非磁性颗粒241竞争结合的荧光磁性颗粒243，从而形成了分析物和荧光磁性颗粒243的复合物249a以及荧光磁性颗粒243和荧光非磁性颗粒241的复合物249b。由于结合垫22与多孔膜23流体连接，复合物249a和249b可以从结合垫22迁移至多孔膜23上的检测区31。在检测区31处，复合物249a和249b以及任意未结合颗粒243被磁性装置60捕获，并与其它样品分离。如上所述，通过比较捕获的荧光非磁性颗粒241的荧光强度Is和捕获的复合或未复合的荧光磁性颗粒243的荧光强度Ic，可以确定分析物的绝对量。特别是，捕获的荧光磁性颗粒243的总量是事先确定而且已知的，从而可以用于校正。因此，该实施方式中分析物的量与Is和Ic的比率成正比。
参照附图5，可以对上文所述的附图1中的检测装置20进行修改，从而形成另一竞争性检测模式。在一个实施方式中，例如，可以一开始将含有分析物的测试样品与(1)和第一结合组分390a结合的荧光非磁性颗粒341a，(2)荧光磁性颗粒343，(3)和第二结合组分390b结合的非荧光磁性颗粒341b混合。在该特定实施方式中，第一结合组分390a可以与分析物相同，而第二结合组分390b可以是分析物的类似物。进一步地，可以用阻断剂阻断荧光磁性颗粒343，例如β-酪蛋白，从而防止与分析物的非特异性结合，从而使得所述颗粒仅仅作为校正探针。
一旦混合，所述分析物与结合的荧光非磁性颗粒341a竞争结合的非荧光磁性颗粒341b，从而形成了分析物和非荧光磁性颗粒341b的复合物349a以及非荧光磁性颗粒341b和荧光非磁性颗粒341a的复合物349b。由于结合垫22与多孔膜23流体连接，复合物349a和349b可以从结合垫22迁移至多孔膜23上的检测区31。在检测区31处，复合物349a和349b以及任意未结合颗粒343和/或341b被磁性装置60捕获，并与其它样品分离。如上所述，通过比较捕获的荧光非磁性颗粒341a的荧光强度Is和捕获的荧光磁性颗粒343的荧光强度Ic，可以确定分析物的绝对量。特别是，捕获的荧光磁性颗粒343的总量是事先确定而且已知的，从而可以用于校正。因此，该实施方式中分析物的量与Is和Ic的比率成反比。
尽管上文已经对检测装置结构的不同实施方式进行了描述，但是应当这样理解，本发明的检测装置通常具有任意所需要的结构。例如，可以形成如附图4所示和上文所述的竞争性检测装置，除了颗粒241是荧光磁性颗粒，颗粒243是荧光非磁性颗粒。同样，可以形成如附图5所示和上文所述的竞争性检测装置，除了颗粒341a为非荧光的磁性颗粒，颗粒341b为荧光的非磁性颗粒。另外，除了流式基于膜的检测装置，本发明中还可以使用其它类型的检测装置，例如毛细管、基于流体和基于溶液的检测装置。Lambotte等的美国专利申请No.5395754，Jou等No.5670381和Malick等No.6194220中还描述了其它不同的检测装置结构，出于所有目的，所述中请的全文在本文中结合并引用。
而且，尽管上文已经描述了尤其涉及荧光在校正和检测中的应用的各种实施方式，但是，其它公知的检测机制也同样适用于本发明。例如，在某些实施方式中，检测和/或校正探针可以为化学发光或磷光化合物。化学发光探针，例如可以通过采用适当的本领域公知的反应物进行激发。本发明还考虑了其它的实施方式和结构。
因此，本发明人已经发现可以利用对磁性颗粒的操控建立对分析物的分离和检测。尤其是，在一完整系统中结合磁分离和检测技术(例如，荧光)。进一步地，所述系统为自校正的，从而当采用常规外部校正技术时不需要使用对照校正样品。在一个实施方式中，通过采用荧光磁性探针实现了自校正。在同一样品中可以分别测量所述荧光磁性颗粒和荧光非磁性颗粒发出的荧光。由于磁性颗粒的数量是预先确定的，因此当确定捕获的荧光非磁性探针的量以及随后的分析物量时，所述系统是自校正的。而且，由于在相同条件下对校正和检测探针发出的荧光进行同时测量，可以避免来自多种变化的潜在干扰，例如温度和仪器的不稳定性，从而提高了检测的可靠性和一致性。
参照以下例子可以更好地理解本发明。
                       实施例1
显示了本发明利用如附图3所示的夹层体式检测测定分析物存在的能力。开始，将以下组分加入六个Eppendorf小瓶中：
(1)25微升共价结合的非荧光磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中3毫克)；
(2)15微升共价结合的荧光非磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中2毫克)；
(3)10微升被β-酪蛋白阻断的荧光磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中3毫克)；以及
(4)0，10微升(每毫升1微克)，20微升(每毫升1微克)，40微升(每毫升1微克)，40微升(每毫升2毫克)和80微升(每毫升2毫克)的促黄体生成素(LH)分析物。
在每个Eppendorf小瓶中加入适当量的PBS缓冲液从而使终体积达到150微升。在室温下孵化所述样品10分钟，并进行轻微振荡。然后用Dyanl公司的磁分离器分离磁性颗粒。弃去每个小瓶的上清液，将磁性颗粒重新悬浮于1.5毫升PBS中。将300微升所述荧光磁性颗粒悬浮液用于每个荧光测量中。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog III Spectrofluorometer利用直角模式测量样品的荧光。对于荧光磁性颗粒，激励波长为470纳米，发射波长为560纳米，而对于荧光非磁性颗粒，激励波长为570纳米，发射波长为605纳米。所述积分时间为0.2秒。
附图8显示了作为每个样品中LH剂量的函数的标化和校正荧光强度。标化强度由样品的经测量的荧光强度除以对照样品的荧光强度得到。所述对照样品是不含有分析物的样品。
实施例1中使用的颗粒由以下形成：
非荧光磁性颗粒
125微升的10％经羧化修饰的顺磁性颗粒(0.35微米，Estapor超顺磁性微球，来自Bang’s Laboratories公司)用1.5毫升碳酸盐缓冲液清洗一次，并采用磁分离器用PBS清洗两次。清洗过的颗粒重新悬浮于0.6毫升PBS和15毫克碳化二亚胺中(来自Polysciences公司)。在振荡器上将所述混合物在室温(RT)下反应30分钟。经活化的颗粒用硼酸盐缓冲液清洗两次。所述活化颗粒再次悬浮于1.2毫升硼酸盐缓冲液中。之后，在活化颗粒中加入30微升LHβ-单克隆抗体(9.8mg/ml，来自Fitzgerald Industries International，Inc.)。将反应混合物置于振荡器上在室温下反应过夜。然后收集活化颗粒，在1毫升0.1摩尔乙醇胺中孵化15分钟，并轻微振荡。然后，用PBS清洗所述颗粒两次，在4℃下在含有0.1摩尔PBS、0.15摩尔NaCl、1％β-酪蛋白、5％甘油和0.1％NaN3的缓冲液中存储。
荧光非磁性颗粒
所述荧光非磁性颗粒根据上述过程共价结合，除了所述结合组分为LHα-单克隆抗体(9.8mg/ml，来自Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.)，而不是LHβ-单克隆抗体。所使用的颗粒为FluoSpheres经羧化修饰的微球，来自Molecular Probes公司。所述颗粒的粒度为0.5微米，激励波长为580纳米，发射波长为605纳米，发出红色荧光。
荧光磁性颗粒
在Eppendorf管中加入100微升2.76％荧光超顺磁性颗粒(来自Polysciences，Inc.of Warrington，宾夕法尼亚州)的固体悬浮液和1毫升硼酸盐缓冲液(0.1摩尔，PH＝8.5)。所述颗粒的平均直径为1至2微米，为含有铁的微球，其聚苯乙烯表面可以进行被动吸附和与蛋白质发生功能化基团反应。采用Dynal公司的磁分离器分离颗粒，并重新悬浮于200微升的10毫克每毫升β-酪蛋白溶液中(0.1摩尔的硼酸盐缓冲液中)。所述悬浮液孵化30分钟，并进行轻微振荡。重复上述步骤两次。分离的颗粒在200微升PBS中重新悬浮，并在4℃下存储。
促黄体生成素(LH)
促黄体生成素(LH)来自Fitzgerald Industries International，Inc.。
                         实施例2
显示了本发明利用如附图1所示的夹层体式检测装置检测分析物存在的能力。开始，将以下组分加入六个Eppendorf小瓶中：
(1)5微升共价结合的荧光非磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中2毫克)；
(2)15微升物理吸附的结合荧光磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中3毫克)；和
(3)0，5，10微升，20，40和100微升(每毫升2微克)的促黄体生成素(LH)分析物。
在每个Eppendorf小瓶中加入适当量的PBS缓冲液从而使终体积达到150微升。在室温下孵化所述样品25分钟，并进行轻微振荡。然后用Dyanl公司的磁分离器分离磁性颗粒。弃去每个小瓶的上清液，将磁性颗粒重新悬浮于1.5毫升PBS中。将300微升所述荧光磁性颗粒悬浮液用于每次荧光测量中。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog III Spectrofluorometer利用直角模式测量样品的荧光。对于荧光磁性颗粒，激励波长为470纳米，发射波长为560纳米，而对于荧光非磁性颗粒，激励波长为570纳米，发射波长为605纳米。所述积分时间为0.2秒至1秒。
附图9显示了作为每个样品中LH剂量的函数的标化和校正荧光强度。
实施例2中使用的颗粒由以下形成：
荧光非磁性颗粒
如实施例1所述形成所述荧光非磁性颗粒。
荧光磁性颗粒
从宾夕法尼亚州的Polysciences，Inc.of Warrington获得2.76毫克的荧光超顺磁性颗粒(水溶液中含有2.5％的固体)。用硼酸盐溶液清洗所述颗粒三次，并用Dynal公司的磁分离器进行分离。清洗过的颗粒重新悬浮于200微升硼酸盐缓冲液中，加入82微克β-促黄体生成素(β-LH)单克隆抗体(1毫克每毫升，来自Fitgerald IndustriesInternational，Inc.)。轻微混合所述混合物在室温下过夜。然后用磁分离器收集所述颗粒，并用200微升β-酪蛋白(100毫克每毫升硼酸盐溶液)孵化30分钟，并轻微振荡，从而阻断非特异性结合位。经阻断的颗粒用PBS清洗两次，并存储于0.1M PBS中。
促黄体生成素(LH)
促黄体生成素(LH)来自Fitzgerald Industries International，Inc.。
                         实施例3
对自校正磁结合测定与非校正磁结合测定进行比较。
无自校正
开始，将以下组分加入5个Eppendorf小瓶中(表I中的瓶No.2-6)
(1)15微升共价结合的非荧光磁性颗粒(在0.1摩尔的PBS缓冲液中每毫升3毫克)；
(2)15微升共价结合的荧光非磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中2毫克)；
(3)20微升促黄体生成素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及
(4)20微升PBS。
对照的Eppendorf小瓶仅仅含有20微升PBS(表I中的瓶No.1)。
在室温下孵化所述样品20分钟，并轻微振荡。然后用Dynal公司的磁分离器分离所述磁性颗粒。弃去每个小瓶的上清液，将磁性颗粒重新悬浮于1.5毫升PBS中。将300微升荧光磁性颗粒悬浮液用于每次荧光测量。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog IIISpectrofluorometer利用直角模式测量样品的荧光。在不同天内进行荧光测量，激励波长为570纳米，发射波长为605纳米。
表I列出了每天的相对荧光数据。
                               表I：荧光测量
瓶 No.1  No.2  No.3  No.4  No.5  No.6 标准差％
第1天 13  254  215  263  285  291  11
第2天 12  235  207  300  263  299  15
第3天 12  183  176  213  270  266  20
第4天 18  265  226  275  282  293  10
第5天 9  207  193  246  236  244  10
第6天 14  227  202  252  262  274  12
标准差％ 23  13  8  11  6  7
具有自校正
开始，将以下组分加入5个Eppendorf小瓶中(表II中的瓶No.9-13)
(1)15微升共价结合的非荧光磁性颗粒(在0.1摩尔的PBS缓冲液中每毫升3毫克)；
(2)15微升共价结合的荧光非磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中2毫克)；
(3)20微升被β-酪蛋白阻断的荧光磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中3毫克)
(4)20微升促黄体生成素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及
(5)20微升PBS。
对照的Eppendorf小瓶仅仅含有20微升PBS(表II中的瓶No.8)。
在室温下孵化所述样品20分钟，并轻微振荡。然后用Dynal公司的磁分离器分离所述磁性颗粒。弃去每个小瓶的上清液，将磁性颗粒重新悬浮于1.5毫升PBS中。将300微升荧光磁性颗粒悬浮液用于每次荧光测量。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog IIISpectrofluorometer利用直角模式测量样品的荧光。对于荧光磁性颗粒，激励波长为470纳米，发射波长为560纳米，而对于荧光非磁性颗粒，激励波长为570纳米，发射波长为605纳米。表II列出了每天的相对荧光数据。
                                      表II：荧光测量
瓶 No.8  No.9  No.10  No.11  No.12  No.13   标准差％
第1天 31/32  352/47  344/43  300/41  318/44  369/39     12
第2天 31/42  324/42  329/41  323/46  338/47  418/43     14
第3天 28/39  307/40  333/42  282/42  288/40  425/46     12
第4天 30/41  267/36  292/36  271/41  281/38  356/43     8.8
第5天 21/29  252/33  292/34  258/38  275/36  328/37     10
第6天 21/25  237/33  307/38  265/40  288/35  358/39     12
标准差％ 13  3  3  4  5  6
从对两个系统每组样品的比较可以看出，甚至在经过细心控制的条件下，自校正系统的标准差(Std.Dev％)明显小于无自校正的标准差。由于自校正系统较少依赖于测量条件，预计在未经过仔细控制的条件下，所述自校正系统的标准差将更加小于无自校正的标准差。
实施例3中使用的颗粒由以下形成：
非荧光磁性颗粒
如实施例1所述形成所述非荧光磁性颗粒。
荧光非磁性颗粒
如实施例1所述形成所述荧光非磁性颗粒。
荧光磁性颗粒
如实施例2所述形成所述荧光磁性颗粒。
促黄体生成素(LH)
促黄体生成素(LH)来自Fitzgerald Industries International，Inc.。
                        实施例4
显示了本发明利用如附图3所示的夹层体式检测装置测定分析物存在的能力。开始，将以下组分加入六个Eppendorf小瓶中：
(1)30微升共价结合的非荧光磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中2毫克)；
(2)20微升共价结合的荧光非磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中2毫克)；
(3)15微升被β-酪蛋白阻断的荧光磁性颗粒(每毫升PBS缓冲液中1毫克)；以及
(4)0，5，10，20，50和100微升(0.2微克每毫升PBS)的C反应蛋白(CRP)分析物。
在室温下孵化所述样品20分钟，并轻微振荡。然后用Dyanl公司的磁分离器分离磁性颗粒。弃去每个小瓶的上清液，将磁性颗粒重新悬浮于1.5毫升PBS中。将300微升所述荧光磁性颗粒悬浮液用于每次荧光测量中。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的FlourologIII Spectroiluorometer利用直角模式测量样品的荧光。对于荧光磁性颗粒，激励波长为470纳米，发射波长为560纳米，而对于荧光非磁性颗粒，激励波长为570纳米，发射波长为605纳米。所述积分时间为0.2秒至1秒。附图10显示了作为每个样品中CRP剂量的函数的标化荧光强度。
实施例4中使用的颗粒由以下形成：
非荧光磁性颗粒
125微升的10％经羧化修饰的顺磁性颗粒(0.35微米，Estapor超顺磁性微球，来自Bang’s Laboratories公司)用1.5毫升碳酸盐缓冲液清洗一次，并采用磁分离器用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次。清洗过的颗粒重新悬浮于0.6毫升PBS和15毫克碳化二亚胺中(来自Polysciences公司)。在振荡器上将所述混合物在室温(RT)下反应30分钟。经活化的颗粒用硼酸盐缓冲液清洗两次。所述活化颗粒再次悬浮于1.2毫升硼酸盐缓冲液中。之后，在活化颗粒中加入30微升抗C反应蛋白(抗-CRP1)单克隆抗体(Mab A5804，2mg/ml，来自BiosPacific公司)。将反应混合物置于振荡器上在室温下反应过夜。然后收集活化颗粒，在1毫升0.1摩尔乙醇胺中孵化15分钟，并轻微振荡。然后，用PBS清洗所述颗粒两次，在4℃下在含有0.1摩尔PBS、0.15摩尔NaCl、1％β-酪蛋白、5％甘油和0.1％NaN3的缓冲液中存储。
荧光非磁性颗粒
所述荧光非磁性颗粒根据如上过程共价结合，除了所述结合组分是抗C反应蛋白(抗-CRP2)单克隆抗体(2mg/ml，来自BiosPacific公司)，而不是抗-CRP1。所使用的颗粒为FluoSpheres经羧化修饰的微球，来自Molecular Probes公司。所述颗粒的粒度为0.5微米，激励波长为580纳米，发射波长为605纳米，发出红色荧光。
荧光磁性颗粒
在Eppendor管中加入100微升2.76％荧光超顺磁性颗粒(来自Polysciences，Inc.of Warrington，宾夕法尼亚州)的固体悬浮液。所述颗粒的平均直径为1至2微米，为含有铁的微球，其聚苯乙烯表面可以进行被动吸附和与蛋白质发生功能化基团反应。然后在Eppendorf管中向颗粒加入1毫升硼酸盐缓冲液(0.1摩尔，PH＝8.5).采用Dynal公司的磁分离器分离颗粒，并重新悬浮于200微升的10毫克每毫升的β-酪蛋白溶液中(0.1摩尔的硼酸盐缓冲液)。所述悬浮液孵化30分钟，并轻微振荡。重复上述步骤两次。分离的颗粒在200微升PBS中重新悬浮，并在4℃下存储。
C-反应蛋白(CRP)
所述C-反应蛋白 (CRP)来自BiosPacific公司。
尽管根据特定实施方式对本发明进行了详细描述，但是应当注意的是，本领域技术人员在理解上述的同时，可以很容易地想到对这些实施方式的修改、变化及等同物。因此本发明的范围应为以下权利要求及其任意等同物的范围。

Claims (35)

1.一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的自校正磁结合测定，所述磁结合测定包括能够生成检测信号的检测探针和能够生成校正信号的校正探针，其中测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例。
2.如权利要求1所述的测定，其中所述检测探针、校正探针或它们的组合与特定结合组分结合。
3.如权利要求2所述的测定，其中所述特定结合组分选自由以下构成的组，所述组包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基、抗体和它们的复合物。
4.如权利要求1所述的测定，其中所述检测探针和校正探针选自由以下构成的组，所述组包括荧光化合物、化学发光化合物、磷光化合物和它们的组合。
5.如权利要求4所述的测定，其中所述检测探针和校正探针为荧光化合物。
6.如权利要求5所述的测定，其中所述荧光化合物为颗粒。
7.如权利要求1所述的测定，其中所述检测探针为荧光非磁性颗粒。
8.如权利要求1所述的测定，其中所述校正探针为荧光磁性颗粒。
9.如权利要求8所述的测定，其中所述荧光磁性颗粒与特定结合组分结合。
10.如权利要求8所述的测定，其中所述荧光磁性颗粒被阻断。
11.如权利要求1所述的测定，其中所述检测探针能够结合分析物。
12.如权利要求1所述的测定，进一步包括非荧光磁性颗粒。
13.如权利要求12所述的测定，其中所述非荧光磁性颗粒能够结合分析物。
14.如权利要求1所述的测定，其中测试样品中分析物的量与检测信号强度和校正信号强度的商成比例。
15.如权利要求1所述的测定，其中所述检测为夹层体式检测。
16.如权利要求1所述的测定，其中所述检测为竞争性检测。
17.一种用于检测测试样品中分析物的存在或量的自校正磁结合测定，所述磁结合测定包括能够生成检测信号的荧光非磁性检测探针和能够生成校正信号的荧光磁性校正探针，其中测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例。
18.如权利要求17所述的测定，其中所述检测探针、校正探针或它们的组合与特定结合组分结合。
19.如权利要求17所述的测定，其中所述检测为夹层体式检测。
20.如权利要求19所述的测定，其中测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成正比。
21.如权利要求17所述的测定，其中所述检测为竞争性检测。
22.如权利要求21所述的测定，其中测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成反比。
23.一种检测测试样品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括：
i)提供磁结合测定，包括能够生成检测信号的检测探针和能够生成校正信号的校正探针；
ii)使含有所述分析物的测试样品与检测探针和校正探针接触；
iii)采用磁性装置从测试样品中分离出检测探针和校正探针；
iv)激发分离出的检测探针和分离出的校正探针，其中所述激发使得所述分离出的检测探针发出检测信号，使得分离出的校正探针发出校正信号；
v)测量检测信号的强度和校正信号的强度；以及
vi)比较检测信号和校正信号的强度，其中测试样品中的分析物量与经校正信号的强度校正的检测信号强度成比例。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述检测探针和校正探针为发出荧光的。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述检测探针和校正探针为化学发光的。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述检测探针和校正探针为发出磷光的。
27.如权利要求23所述的方法，其中在第一发射波长测量所述检测信号。
28.如权利要求27所述的方法，其中在第二发射波长测量所述校正信号。
29.如权利要求28所述的方法，其中第一发射波长不同于第二发射波长。
30.如权利要求23所述的方法，其中所述检测探针为非磁性的。
31.如权利要求23所述的方法，进一步包括就多个预定分析物浓度对经校正信号强度校正的检测信号强度作图，从而得到校正曲线。
32.如权利要求23所述的方法，其中所述检测为夹层体式检测。
33.如权利要求23所述的方法，其中所述检测为竞争性检测。
34.如权利要求23所述的方法，其中所述分离的检测探针和分离的校正探针同时被激发。
35.如权利要求23所述的方法，其中同时测量检测信号和校正信号的强度。
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