EP1330649A1 - Oberflächen mit kovalent gebundenem hydrophilem spacer an hydrogelen - Google Patents

Oberflächen mit kovalent gebundenem hydrophilem spacer an hydrogelen

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Publication number
EP1330649A1
EP1330649A1 EP00975986A EP00975986A EP1330649A1 EP 1330649 A1 EP1330649 A1 EP 1330649A1 EP 00975986 A EP00975986 A EP 00975986A EP 00975986 A EP00975986 A EP 00975986A EP 1330649 A1 EP1330649 A1 EP 1330649A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydrogel
residue
derivatives
organic molecules
carboxylic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00975986A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Erik Wischerhoff
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HOFMANN, ANDREAS
Original Assignee
Jandratek GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jandratek GmbH filed Critical Jandratek GmbH
Publication of EP1330649A1 publication Critical patent/EP1330649A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/808—Optical sensing apparatus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property

Definitions

  • the hydrophilic polymer layer on the surface has the character of a hydrogel, so it is swellable and also flexible. Both properties are desirable for the function of this layer, since receptor molecules are fixed on and in it, which must be linked so flexibly that they are still able to bind analyte molecules after immobilization.
  • the previously known hydrogels on biosensor surfaces therefore have the schematic structure shown in FIG. 1.
  • the surface of the sensor comprises a metal layer 14, to which one or more intermediate layers 13 may be applied.
  • the receptor 11 is bound to the hydrogel 12 via a short, inflexible spacer.
  • the binding of receptor molecules to the hydrogel layer can either be directional or non-directional.
  • the receptor molecule usually has only one residue or possibly only a few (for example less than three) residues of the same type which can be reacted with the optionally derivatized hydrogel.
  • the resulting directional bond is therefore spatially precisely defined.
  • the receptor molecules have to be derivatized before implementation so that they have a suitable reactive residue.
  • the receptor molecule has a large number (for example at least three) of the same type of residues, which can be reacted with the possibly devated hydrogel. Since only one of these residues reacts with the hydrogel, the position of the bond cannot be predicted spatially.
  • the binding site or the binding sites of the receptor is in an undefined steric arrangement to the hydrogel, which in turn impairs the accessibility of these binding sites for analyte molecules and can accordingly influence the binding kinetics of the analyte / receptor interactions.
  • US Pat. No. 5,395,587 uses short- and long-chain spacers to bind biotin as a receptor molecule. However, no influence on the length of the spacer is described. In addition, only the directional connection of receptor molecules and not the non-directional connection is examined.
  • the aim of the invention was to provide an object, preferably a biosensor, to which a large number of receptor molecules can be attached. Pre-treatment of the receptor molecules should preferably not be necessary.
  • the length of the spacer between the hydrogel and the receptor plays a role in the binding behavior of analyte molecules in the case of undirected bonds in objects with a hydrogel layer.
  • This opens up the possibility of providing objects which enable a better binding behavior to certain problem situations.
  • Improved accessibility due to increased flexibility makes the binding behavior of the analyte molecules more uniform despite the non-directional binding of the receptors and the behavior of the two free species in solution is more similar.
  • the invention thus relates to an object with a surface, comprising a hydrogel, obtainable by:
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of an object according to the invention. It differs from the conventional object shown in FIG. 1 in that the receptor is bound to the hydrogel via a long-chain spacer.
  • the invention further relates to a method for producing an object with a functionalized hydrogel surface, comprising the steps: (i) binding organic molecules to the hydrogel, the bound organic molecules each having a chain length of at least 8 atoms and a terminal residue A, selected from amine radical, carboxylic acid group or derivatives thereof; and (ii) reacting the terminal residue A with a receptor molecule with at least three identical residues B, selected from the amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives.
  • the invention further describes the use of an object according to the invention in the detection of analyte molecules.
  • an object with a functionalized hydrogel surface comprising organic molecules bound to the hydrogel, the bound organic molecules each having a chain length of at least 8 atoms and having a terminal radical A selected from the amine radical, carboxylic acid group or their derivatives undirected attachment of a receptor molecule with at least three identical residues B, selected from amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a conventional object with a hydrogel surface, in which the receptors are bound to the hydrogel by short spacers.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of an object according to the invention with a hydrogel surface, in which the receptors are bound to the hydrogel by flexible, long-chain spacers.
  • FIG. 3 shows the time course of the covalent binding of lysozyme in the sensor (b) according to the invention and the comparison sensor (a) in example 1.
  • FIG. 4 shows the time course of the association reaction of a single-chain fragment antibody to lysozyme in the sensor (b) according to the invention and the comparison sensor (a) of example 1.
  • the effect in FIGS. 1 and 2 is removed by calculation due to the changed bulk refractive index when the analyte is added.
  • the effects of changing refractive indices were measured and subtracted on inert, non-functionalized surfaces (i.e. hydrogel without functional groups and receptors).
  • the objects of the invention are found, for. B. as sensors, especially biosensors, used in a wide variety of analytical measurement methods.
  • suitable areas of use for the objects are in affinity-based sensors, such as surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) and quartz scales, and in interferometric measurement methods, for example B. reflection interference contrast microscopy and reflection interference spectroscopy. They are particularly suitable for use in the SPR.
  • SPR surface plasmon resonance spectroscopy
  • interferometric measurement methods for example B. reflection interference contrast microscopy and reflection interference spectroscopy. They are particularly suitable for use in the SPR.
  • the structure of the non-functionalized surface depends on the analytical method in which the object according to the invention is to be used and is known to the person skilled in the art (Journal of Biomedical Materials Research, 18 (953-959) (1984) and J. Chem. So ⁇ , Chem. Commun., 1990, 1526).
  • non-functionalized surface is used to denote the surface of an object with the hydrogel layer before the organic molecules are attached to the residue A.
  • functionalized surface is used to refer to the surface of an object with the hydrogel layer after the organic molecules have bound to the residue A.
  • the object of the invention has a base surface, comprising, for. B. a glass, semiconductor or metal layer. Metal layers are preferred, especially noble metal layers such. B. of gold or silver such as. B. find use in the SPR.
  • the non-functionalized object has a hydrogel layer on the surface. This layer serves to prevent unspecific adsorption, which falsifies the measurement signal.
  • Hydrogels are water-swellable polymers.
  • the hydrogels can be e.g. B. a polysaccharide, a derivative thereof or a swellable organic polymer such as poly ⁇ N- [tris (hydroxymethyl) methyl] acrylic acid amide ⁇ , polyvinyl alcohol or polyethylene glycol.
  • Polysaccharides are preferred.
  • Amino derivatives or carboxyalkyl derivatives can be mentioned as derivatives, the alkyl radical preferably having 1 to 4 carbon atoms. Examples of polysaccharides are amylose, inulin, pullulan or dextran. Pullulan or dextran and their derivatives are preferred. Dextran and its derivatives are particularly preferred. Carboxymethyldextran is preferably used.
  • the hydrogel layer should be several nanometers thick when dry and swells to a thickness of approx. 100 nm in an aqueous environment, which completely covers the surface.
  • the swollen polymer layer mimics the natural environment of biomolecules and is suitable for preventing denaturation and thus inactivation of the biomolecules.
  • the adsorption of molecules other than the molecules to be analyzed is effectively suppressed.
  • the swollen hydrogel layer is able to compensate for surface irregularities. Biomolecules are also bound in the swollen matrix and not just on the surface. This will reduce the importance of surface irregularities, which otherwise contribute to a poorly defined surface and thus to poorly quantifiable measurement results.
  • Organic molecules which have a radical A are bound to this non-functionalized hydrogel layer.
  • the bound organic molecules have a terminal radical A, selected from the amine radical, carboxylic acid group and their derivatives. Although primary amine residues are preferred, secondary amine residues can be combined with a can also be used.
  • .carboxylic acid groups e.g. B. anhydrides and carboxylic acid halides, such as carboxylic acid chlorides, can be used.
  • the terminal radical A is preferably a carboxylic acid group.
  • the bound organic molecules each have a chain length of at least 8 atoms.
  • the binding behavior of analyte molecules can be influenced over the length of the chain.
  • the chain has 8 to 40 atoms, more preferably 10 to 20 atoms.
  • the chain can be a substituted or unsubstituted, branched or unbranched hydrocarbon chain.
  • the chain is preferably linear.
  • these chains are preferably hydrophilic. Long alkyl chains or aromatic residues in the chain or as substituents thereon are less suitable, since these could also cause non-specific adsorption via hydrophobic interactions.
  • the hydrophilic character of the spacers can be determined by the incorporation of oligoethylene oxide units (KL Prime & GM Whitesides, J. Am.
  • amine residues, carboxylic acid groups and their derivatives can also be used as substituents.
  • the type or number of the substituents used in the invention must not be selected such that they impair the flexibility of the organic molecules, which is important according to the invention.
  • the chain length is the number of C, N, O and S atoms from the hydrogel in the main chain to the terminal residue, which is included. If part of the terminal residue is split off when the receptor molecule is bound, the split-off atoms are not counted. When counting, only the atoms of the organic molecules and the atoms, e.g. B. are due to the derivatization of the hydrogel counted.
  • reaction conditions for coupling the organic molecules to the hydrogel layer vary depending on the compound selected. Examples of these reaction conditions are described below in the preferred embodiments and examples.
  • the receptor molecule is used for the specific binding of the analyte molecule. That's why it's usually a biomolecule.
  • suitable receptor molecules are proteins, nucleic acids and biologically active oligosaccharides or polysaccharides. Proteins are preferred.
  • the invention relates to the non-directional connection of receptors to a hydrogel surface. Consequently, the receptor molecules have at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 10 identical residues B. The maximum number of residues B is not limited, but the receptor molecule should be soluble in the solvent used.
  • the receptor molecule preferably has at most 10,000, more preferably at most 1000 residues B
  • the reactivity of the residues of the same type need not be identical, but is of the same order of magnitude.
  • the residues B are selected from the amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives Do not hinder molecules. Suitable derivatives are, for example, ester derivatives of the acids mentioned with at least one -OH group, in order to enable reaction with the radical A.
  • Analyte molecules react selectively with the receptors used. They are therefore usually also biomolecules. Suitable analyte molecules are proteins, nucleic acids and biologically active oligosaccharides or polysaccharides. Proteins are preferred.
  • the conditions under which the analyte molecule is covalently bound to the receptor vary depending on the system selected. Typically, the binding is carried out at room temperature and in buffered, aqueous solutions which have an analyte concentration in the range from 0.5 to 200 ⁇ g / ml and about 100 mM buffer concentration, for example a phosphate buffer, typically the duration of the reaction is 10 minutes to 2 hours
  • the precious metal surface e.g. gold
  • a monolayer of cysteamine in which the precious metal surface is in an aqueous for 12 to 36 h
  • the polyacrylic acid is typically reacted for 15 minutes to 2 hours with an aqueous solution of a hydrogel.
  • the diagram shows carboxymethyl dextran as an example of the hydrogel.
  • the organic molecules are built up in two reaction steps. First, the carboxy groups are reacted with 1,2-diaminoethane before the carboxymethyldextrans is attached to the surface. After the hydrogel has been bound to the surface, the terminal carboxylic acid end group is then introduced by reacting the amino group with bromoacetic acid. Usually a 0.5 mol • I "1 to 3 mol • I " 1 bromoacetic acid solution with a pH of about 14 is used for derivatization. Dehvatisation usually takes 10 to 20 hours.
  • the organic molecules can link to the hydrogel in a single reaction step.
  • This functionalization can take place either before or after the attachment of the hydrogel to the surface.
  • the length of the spacer is 8 atoms.
  • the C, N and O atoms of the spacer consisting of -CH 2 -CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH-CH 2 -CO-OH are counted, the O of the -C (O) OH group not being counted , because in the subsequent implementation z. B. is replaced with an amine group of the analyte.
  • Another preferred embodiment is:
  • the reaction with succinic anhydride can take place in a 10 2 to 10 "" 'mol f 1 succinic anhydride solution.
  • the reaction time is usually 4 up to 24 h.
  • Z. B. polar, aprotic solvents such as dry DMSO.
  • reaction with oligoethylene oxide takes place in an aqueous
  • the reaction can take 10 min take up to 2 hours.
  • the sensor according to the invention has the structure described in the first exemplary embodiment.
  • a sensor with a short spacer is used as a comparative example:
  • Lysozyme is used as the receptor in both sensors, and a single chain fragment of a corresponding antibody (HyHel 10 antibody) serves as the ligand.
  • a glass support with a gold surface is placed in a water solution of 2 10 " 2 mol I " 1 cysteaminium hydrochloride solution for 12 h.
  • the support is then rinsed with ultrapure water, incubated for 5 min with 1 N NaOH and rinsed again with ultrapure water.
  • An incubation solution is obtained by mixing an aqueous 5 10 _2 mol r 1 polyacrylic acid solution (molecular weight 30,000) with solutions of 3, 19 mg EDC or 4.1 15 mg NHS, each made in 1 ml ultrapure water.
  • the carrier is incubated for 1 h in this solution and then rinsed with ultrapure water
  • the hydrogel dextran is first devatized according to the following method. 10.00 g (0.062 mol repetition unit). Dextran is dissolved in 50 ml of ultrapure water with 0.99 g NaOH (0.025 mol) and 1.71 g bromoacetic acid (0.012 mol) and added for 24 hours Stirred at room temperature Then the mixture is dialyzed against distilled water for 3 days, the water being changed at least five times. For further reaction, the dialyzed mixture is mixed with 2.40 g of ethyl (3-dimethylamino-propyl) carbodimide (0.0125 mol) and 1.44 g of N-hydroxysuccinimide are added and the mixture is stirred for 12 hours at room temperature.
  • the mixture is then dialyzed again against distilled water for 3 days, the water being changed at least five times. 90% of the water is then removed using a rotary evaporator at reduced pressure and the polymer is introduced into the 10 times the volume of methanol.
  • the yield is 9.06 g (81.5%)
  • the aminodextran obtained is then dissolved in water, so that a 10% by weight solution results.
  • the carrier is placed in this solution for 30 minutes and then rinsed again with plenty of ultrapure water.
  • the carrier is then placed in a solution of 1 mol • 1 ⁇ 1 bromoacetic acid and 2 mol • 1 "1 NaOH for 12 h.
  • the hydrogel is 10 min in 10 mM 4 '- (2-hydroxyethyl) -1 - piperazinethanesulfonic acid buffer (hepespuffer) and 150 mM NaCl at pH 7.4 in the presence of 77 mg-ml ' 1 EDC and 12 mg -ml '1 NHS enabled.
  • a 0.1 mg-ml "1 solution of lysozyme in acetate buffer at pH 4.7 is then contacted with the hydrogel in order to covalently bind the lysozyme to the hydrogel by reaction between the free amino groups of the protein and activated carboxyl groups of the hydrogel.
  • the functionalized sensor is installed in an SPR device.
  • the SPR device used is a self-made with ⁇ / 2 ⁇ construction (analogous to E.
  • FIG. 3 shows the time course of the covalent binding of lysozyme in comparative example (a) and in the sensor (b) according to the invention.
  • the shift of the minimum to higher angles serves as an indicator of the increase in the layer thickness.
  • an analogous behavior is observed when the analyte is bound.
  • a single chain fragment of a lysozyme antibody is used.
  • the association reaction is completed after about 15 minutes, while in the comparison sensor it takes about 60 minutes to reach saturation (see FIG. 4).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Gegenstand mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, erhältlich durch: 1) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsaüregruppe und deren Derivate, aufweisen; und 2) Umsetzen des terminalen Restes mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsaüregruppe, Sulfonsaürerest, Phosphorsaürerest, Phosphonsaürerest und deren Derivate.

Description

OBERFLÄCHEN MIT KOVALENT GEBUNDENEM HYDROPHILEM SPACER AN HYDROGELEN
Wahrend der letzten zehn Jahre hat sich die Technologie der optischen Biosensoren auf der Basis von Oberflachenpiasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) stark entwickelt, so daß heutzutage eine Reihe solcher Gerate einen festen Platz auf dem Markt erobert haben (Biacore, Texas Instruments, Intersens, BioTuL) Die Sensoroberflachen dieser und anderer Biosensoren, die für die Transduktion einer biospezifischen Erkennungsreaktion eines Analyten verantwortlich sind, sind häufig mit einer funktionalisierten Polysacchaπdschicht oder einer Schicht eines anderen hydrophilen Polymeren versehen, die zum einen über funktioneile Gruppen die kovalente Bindung von Rezeptormolekulen ermöglichen (B Johnsson, S Lofas & G Lindquist, Anal Biochem 198 (1991 ), 268), zum anderen die Aufgabe erfüllen, unspezifische Adsorption von Probenbestandteilen zu verhindern (EP-B-589 867 bzw. Deutsche Patentanmeldung 198 17 180.3). Die hydrophile Polymerschicht an der Oberfläche besitzt den Charakter eines Hydrogels, ist also quellbar und zudem flexibel. Beide Eigenschaften sind für die Funktion dieser Schicht erwünscht, da auf und in ihr Rezeptormoleküle fixiert werden, die so flexibel angebunden sein müssen, daß sie nach der Immobilisierung noch zur Bindung von Analytmolekülen in der Lage sind.
Neben der Verwendung von Hydrogelen ist es ebenfalls üblich, Rezeptormoleküle über flexible Moleküle - sogenannte Spacer - direkt kovalent an Sensoroberflächen zu binden. Von Bindungsexperimenten an Monoschichtsystemen, die aufgrund ihres Aufbauprinzips wesentlich unflexibler sind als Hydrogele, ist bekannt, daß die Spacerlänge sowohl für die Reaktivität funktioneller Gruppen als auch für das spezifische Bindungsverhalten maßgeblich ist (D. D. Schlereth, J. Electroanal. Chem. 425 (1997), 77; L. Bertilsson, H. J. Butt, G. Nelles, D. D. Schlereth, Biosensors & Bioelectronics 12 (1997), 839; T. Wink, S. J. van Zuilen, A. Bult, W. P. van Bennekom, Analyst 122, 43R (1997)).
Anders als bei solchen unquellbaren und nur moderat flexiblen Monoschichtsystemen wurde der Spacerlänge zwischen Hydrogel und Rezeptoren bisher keine Beachtung geschenkt. Ein Einfluß der Kettenlänge auf das Bindungsverhalten der Ligandmoleküle an den Rezeptor wurde nicht vermutet, da das Hydrogel an sich ohnehin flexibel ist. Die bisher bekannten Hydrogele auf Biosensoroberflächen haben daher den in Figur 1 gezeigten schematischen Aufbau. Die Oberfläche des Sensors umfaßt eine Metallschicht 14, auf die ggf. eine oder mehrere Zwischen- schichten 13 aufgebracht sind. Der Rezeptor 1 1 ist über einen kurzen, unflexiblen Spacer an das Hydrogel 12 gebunden.
Die Anbindung von Rezeptormolekülen an die Hydrogelschicht kann entweder gerichtet oder ungerichtet erfolgen. Bei einer gerichteten Anbindung weist das. Rezeptormolekül meistens nur einen Rest oder evtl. nur wenige (z. B. weniger als drei) gleichartige Reste auf, die mit dem ggf. derivatisiertem Hydrogel umgesetzt werden können. Die entstehende gerichtete Bindung ist folglich räumlich genau definiert. Häufig müssen die Rezeptormoleküle vor der Umsetzung derivatisiert werden, damit sie einen geeigneten, reaktiven Rest aufweisen. Bei einer ungerichteten Anbindung dagegen weist das Rezeptormolekül eine Vielzahl (z. B. mindestens drei) gleichartiger Reste auf, die mit dem ggf. de vatisierten Hydrogel umgesetzt werden können. Da nur einer dieser Reste mit dem Hydrogel reagiert, ist die Lage der Bindung räumlich nicht vorhersehbar. Als Konsequenz befindet sich die Bindungsstelle bzw. die Bindungsstellen des Rezeptors in einer Undefinierten sterischen Anordnung zum Hydrogel, was wiederum die Zugänglichkeit dieser Bindungsstellen für Analytmoleküle beeinträchtigt und dementsprechend die Bindungskinetik der Analyt/Rezeptorwechselwirkungen beeinflussen kann.
In der US-Patentschrift US-A-5,395,587 werden zur Anbindung von Biotin als Rezeptormolekül kurz- und langkettige Spacer verwendet. Es wird jedoch kein Einfluß der Länge des Spacers beschrieben. Es wird zudem ausschließlich die gerichteten Anbindung von Rezeptormolekülen und nicht die ungerichtete Anbindung untersucht.
Ziel der Erfindung war es, einen Gegenstand, bevorzugt einen Biosensor, bereitzustellen, an den eine Vielzahl von Rezeptormolekülen angebunden werden können. Vorzugsweise sollte keine Vorbehandlung der Rezeptormoleküle nötig sein.
Überraschenderweise zeigte sich, daß bei Gegenständen mit einer Hydrogelschicht die Länge des Spacers zwischen Hydrogel und Rezeptor für das Bindungsverhalten von Analytmolekülen bei ungerichteten Bindungen eine Rolle spielt. Dies eröffnet die Möglichkeit, Gegenstände bereitzustellen, die ein an bestimmte Problem- Stellungen verbessertes Bindungsverhalten ermöglichen. Durch verbesserte Zugänglichkeit auf Grund erhöhter Flexibilität wird das Bindungsverhalten der Analytmoleküle trotz ungerichteter Bindung der Rezeptoren einheitlicher und dem Verhalten der beiden freien Spezies in Lösung ähnlicher.
Die Erfindung betrifft somit einen Gegenstand mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, erhältlich durch:
(i) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A. ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; und (ii) Umsetzen des terminalen Restes mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.
In Figur 2 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Gegenstandes gezeigt. Er unterscheidet sich von dem herkömmlichen in Figur 1 gezeigten Gegenstand, dadurch daß der Rezeptor über einen langkettige Spacer an das Hydrogel gebunden ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche, umfassend die Schritte: (i) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; und (ii) Umsetzen des terminalen Restes A mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.
Die Erfindung beschreibt weiter die Verwendung eines erfindungsgemäßen Gegenstandes bei der Detektion von Analytmolekülen.
Desweiteren wird die Verwendung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche umfassend an das Hydrogel gebundene organische Moleküle, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder und deren Derivate, aufweisen, zur ungerichteten Anbindung eines Rezeptormoleküls mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate, beschrieben. Verzeichnis der Figuren
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Gegenstandes mit einer Hydrogeloberfläche, bei dem die Rezeptoren durch kurze Spacer an das Hydrogel gebunden sind.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Gegenstandes mit einer Hydrogeloberfläche, bei dem die Rezeptoren durch flexible, langkettige Spacer an das Hydrogel gebunden sind.
Figur 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der kovalenten Bindung von Lysozym bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b) und dem Vergleichssensor (a) des Beispiels 1.
Figur 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Assoziationsreaktion eines Einzelketten- fragmentantikörpers an Lysozym bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b) und dem Vergleichssensor (a) des Beispiels 1.
Um eine klarere Darstellung des relevanten Effektes zu ermöglichen, ist in den Figuren 1 und 2 der Effekt durch den veränderten Bulk-Brechungsindex bei Zugabe des Aπalyten rechnerisch entfernt. Die Effekte durch veränderte Brechungsindices wurden an inerten, nicht funktionalisierten Oberflächen (d. h. Hydrogel ohne funktioneile Gruppen und Rezeptoren) gemessen und subtrahiert.
Die erfindungsgemäßen Gegenstände finden z. B. als Sensoren, vor allem Biosensoren, bei den verschiedensten analytischen Meßverfahren Verwendung. Beispiele für geeignete Einsatzgebiete der Gegenstände sind in der affinitäts- basierenden Sensorik, wie die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und Quarzwaagen sowie bei interferometrischen Meßmethoden, z. B. Reflektions- interferenzkontrastmikroskopie und Reflektionsinterferenzspektroskopie. Besonders eignen sie sich zum Einsatz in der SPR. Der Aufbau der nicht funktionalisierten Oberfläche richtet sich nach dem analytischen Verfahren, in dem der erfindungsgemäße Gegenstand angewendet werden soll, und ist dem Fachmann bekannt (Journal of Biomedical Materials Research, 18 (953-959) (1984) und J. Chem. Soα, Chem. Commun., 1990, 1526). Im Rahmen der Erfindung wird der Begriff "nicht funktionalisierte Oberfläche" verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht vor der Anbindung der organischen Moleküle mit dem Rest A zu bezeichnen. Der Begriff "funktionalisierte Oberfläche" wird verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht nach der Anbindung der organischen Moleküle mit dem Rest A zu bezeichnen. Der erfindungsgemäße Gegenstand besitzt eine Grundoberfläche, umfassend z. B. eine Glas-, Halbleiteroder Metallschicht. Bevorzugt sind Metallschichten vor allem Edelmetallschichten z. B. aus Gold oder Silber wie sie z. B. in der SPR Verwendung finden.
Der nicht funktionalisierte Gegenstand weist eine Hydrogelschicht an der Oberfläche auf. Diese Schicht dient zur Verhinderung unspezifischer Adsorptionen, die das Meßsignal verfälschen. Hydrogele sind mit Wasser quellbare Polymere. Bei den Hydrogelen kann es sich z. B. um ein Polysaccharid, ein Derivat davon oder um ein quellbares organisches Polymer wie Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-acrylsäure- amid}, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglykol handeln. Bevorzugt sind Polysaccharide. Als Derivate sind Aminoderivate oder Carboxyalkylderivate zu nennen, wobei der Alkylrest bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist. Beispiele für Polysaccharide sind Amylose, Inulin, Pullulan oder Dextran. Bevorzugt sind Pullulan oder Dextran und deren Derivate. Besonders bevorzugt ist Dextran und dessen Derivate. Bevorzugt wird Carboxymethyldextran verwendet.
Die Hydrogelschicht sollte trocken mehrere Nanometer dick sein und quillt im wäßrigen Milieu zu einer Dicke von ca. 100 nm auf, wodurch die Oberfläche vollständig bedeckt wird. Die gequollene Polymerschicht ahmt die natürliche Umgebung von Biomolekülen nach und ist geeignet, eine Denaturierung und somit Inaktivierung der Biomoleküle zu verhindern. Zusätzlich wird die Adsorption von anderen als den zu analysierenden Molekülen wirksam unterdrückt. Außerdem ist die gequollene Hydrogelschicht in der Lage, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche auszugleichen. Die Anbindung von Biomolekülen findet auch in der gequollenen Matrix und nicht nur unmittelbar an der Oberfläche statt. Hierdurch verringert sich die Bedeutung von Oberflächenunebenheiten, die sonst zu einer schlecht definierten Oberfläche und dadurch zu schlecht quantifizierbareπ Meßergebnissen beitragen.
Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit Hydrogelen sind bekannt (J. of Biomedical Materials Research, 18, 953 (1984), DE-A 198 17 180). Beispielsweise wird eine entsprechend vorbereitete Oberfläche (DE-A 198 17 180, EP-B-0 589 867) zwischen 1h und 5h, typischerweise 3h, in eine entsprechende, frisch bereitete wäßrige Hydrogellösung hergestellt aus Hydroxypolymer gegeben. Die Konzentration des Hydroxypolymers in der Lösung liegt zwischen 10 und 500 mg-ml"1.
An diese nicht funktionalisierte Hydrogelschicht werden organische Moleküle, die einen Rest A aufweisen, gebunden. Die gebundenen organischen Moleküle weisen einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe und deren Derivate, auf. Obwohl primäre Aminreste bevorzugt sind, können sekundäre Aminreste mit einem ebenfalls verwendet werden. Neben .Carbonsäuregruppen können z. B. Anhydride und Carbonsäurehalogenide, wie Carbonsäurechloride, verwendet werden. Bevorzugt ist der terminale Rest A eine Carbonsäuregruppe.
Die gebundenen organischen Moleküle besitzen jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen. Über die Länge der Kette kann das Bindungsverhalten von Analytmolekülen beeinflußt werden. Bevorzugt hat die Kette 8 bis 40 Atome, stärker bevorzugt 10 bis 20 Atome. Die Kette kann eine substituierte oder nicht substituierte, verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette sein. Die Kette ist bevorzugt linear. Bevorzugt sind diese Ketten ihrerseits hydrophil. Lange Alkylketten oder aromatische Reste in der Kette oder als Substituenten daran sind weniger geeignet, da diese über hydrophobe Wechselwirkungen auch unspezifische Adsorption verursachen könnten. Der hydrophile Charakter der Spacer kann durch den Einbau von Oligoethylenoxideinheiten (K. L. Prime & G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 115 (1993), 10714, A. J. Pertsin, M. Grunze & I. A. Garbuzova, J. Phys. Chem. B 102 (1998), 4843) oder durch die Integration von hydrophilen Resten wie Amidgruppen eingestellt werden. So können z. B. bis zu 70 % der Kohlenstoffatome zur Erhöhung der Hydrophilie der Kette durch N, S oder nicht peroxidischem O, bevorzugt N oder nicht peroxidischem O, ersetzt sein. Bevorzugt sind 10 bis 50 % der Kohlenstoffatome durch die genannten Heteroatome ersetzt. Mögliche Substituenten sind wie Alkyl- oder Alkylenreste, und bekannte hydrophile Substituenten wie Hydroxygruppen und carbonylisch gebundene Sauerstoffatome, vorzugsweise sind die Substituenten hydrophil. Sofern sie nicht als terminale Reste A verwendet werden können Aminreste, Carbonsäuregruppen und deren Derivate ebenfalls als Substituenten verwendet werden. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Substituenten dürfen weder in Art noch Zahl so ausgewählt werden, daß sie die erfindungsgemäß wichtige Flexibilität der organischen Moleküle beeinträchtigen.
Die Kettenlänge ist die Anzahl der C, N, O und S Atome ab dem Hydrogel in der Hauptkette bis zum terminalen Rest, wobei dieser eingeschlossen ist. Wird ein Teil des terminalen Restes bei der Anbindung des Rezeptormoleküls abgespalten, so werden die abgespaltenen Atome nicht mitgezählt. Bei der Zählung werden nur die Atome der organischen Moleküle und die Atome, die z. B. durch die Derivatisierung des Hydrogels bedingt sind, mitgezählt.
Die Reaktionsbedingungen zur Kopplung der organischen Moleküle an die Hydrogelschicht variieren in Abhängigkeit von der gewählten Verbindung. Beispiele für diese Reaktionsbedingungen werden nachstehend in den bevorzugten Ausführungsformen und den Beispielen beschrieben.
Das Rezeptormolekül dient zur spezifischen Anbindung des Analytmoleküls. Deshalb ist es in der Regel ein Biomolekül. Beispiele geeigneter Rezeptormoleküle sind Proteine, Nucleinsäuren und biologisch aktive Oligo- oder Polysaccharide. Bevorzugt sind Proteine. Die Erfindung betrifft die ungerichtete Anbindung von Rezeptoren an eine Hydrogeloberfläche. Folglich weisen die Rezeptormoleküle mindestens 3, bevorzugt mindestens 5, stärker bevorzugt mindestens 10 gleichartige Reste B auf. Die maximale Anzahl der Reste B ist nicht beschränkt, das Rezeptormolekül sollte jedoch in dem verwendeten Lösungsmittel löslich sein. Bevorzugt weist das Rezeptormolekül höchstens 10000, stärker bevorzugt höchstens 1000 Reste B auf Die Reaktivität der gleichartigen Reste muß nicht identisch sein, liegt aber in derselben Größenordnung Die Reste B werden aus Aminrest, Carbonsauregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsaurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate ausgewählt Mögliche Derivate dürfen die Reaktion mit dem terminalen Rest A der organischen Moleküle nicht behindern, Geeignete Derivate sind z B Esterderivate der genannten Sauren mit mindestens einer -OH Gruppe, um die Reaktion mit dem Rest A zu ermöglichen Es ist selbstverständlich, daß aktivierte Formen, die z B aus der Umsetzung von Aminresten mit Ethyl-3,3'- dimethylaminopropylcarbodumid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) erhalten werden, ebenfalls verwendet werden können
Analytmoleküle reagieren selektiv mit den verwendeten Rezeptoren Sie sind deshalb ebenfalls meistens Biomolekule Geeignete Analytmoleküle sind Proteine, Nucleinsauren und biologisch aktive Oligo- oder Polysaccharide Bevorzugt sind Proteine
Die Bedingungen, bei der die kovalente Anbindung des Analytmolekuls an den Rezeptor erfolgt, variieren in Abhängigkeit von dem gewählten System Typischerweise erfolgt die Anbindung bei Raumtemperatur und in gepufferten, wassrigen Losungen, die eine Analytkonzentration im Bereich von 0,5 bis 200 μg/ml und eine etwa 100 mM Pufferkonzentration, z B eines Phosphatpuffers, aufweisen Typischerweise betragt die Dauer der Umsetzung 10 Minuten bis 2 Stunden
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform ist in dem folgenden Schema gegeben (siehe auch das Beispiel)
n COOH
Zunächst wird die Edelmetalloberfläche (z. B. Gold) mit einer Monoschicht aus Cysteamin belegt, in dem die Edelmetalloberfläche 12 bis 36 h in eine wässrige
Lösung von 10"3 bis 5 • 10"2 mol • I"1 Cysteaminiumhydrochlorid gegeben wird. Anschließend wird die Monoschicht mit Polyacrylsäure umgesetzt und diese mit EDC und NHS aktiviert. Typischerweise erfolgt diese Umsetzung mit einer Lösung bestehend aus 10~2 bis 10"' mol • P1 Polyacrylsäure mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 20 000 bis 500 000 und entsprechende Mengen EDC und NHS, die äquimolar zu den COOH-Gruppen des Polymers sind. Als Lösungsmittel dient vorzugsweise ein polares Lösungsmittel, wie DMSO und/oder Wasser. Die Reaktionsdauer beträgt in der Regel 30 min bis 2 h.
In einem Folgeschritt wird die Polyacrylsäure typischerweise 15 min bis 2 h mit einer wäßrigen Lösung eines Hydrogels umgesetzt. In dem Schema ist als Beispiel für das Hydrogel Carboxymethyldextran gezeigt. In dieser Ausführungsform werden die organischen Moleküle in zwei Reaktionsschritten aufgebaut. Zunächst werden vor der Anbindung des Carboxymethyldextrans an die Oberfläche die Carboxygruppen mit 1 ,2-Diaminoethan umgesetzt. Anschließend wird nach der Anbindung des Hydrogels an die Oberfläche die terminale Carbonsäure-Endgruppe durch Umsetzung der Aminogruppe mit Bromessigsäure eingeführt. Üblicherweise dient eine 0,5 mol • I"1 bis 3 mol • I"1 Bromessigsäurelösung mit einem pH-Wert von etwa 14 zur Derivatisierung. Die Dehvatisierung dauert in der Regel 10 bis 20 h. Es ist selbstverständlich möglich, die organischen Moleküle auch in einem einzigen Reaktionsschritt mit dem Hydrogel zu verknüpfen. Diese Funktionalisierung kann entweder vor oder nach der Anbindung des Hydrogels an die Oberfläche erfolgen. In dieser bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge des Spacers 8 Atome. Gezählt werden die C, N und O Atome des Spacers bestehend aus -CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CO-OH, wobei das O der -C(O)OH Gruppe nicht mitgezählt wird, da es bei der anschließenden Umsetzung z. B. mit einer Amingruppe des Analyten ersetzt wird. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist:
Die Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid kann in einer 10 2 bis 10""' mol f1 Bernsteinsäureanhydridlösung erfolgen. Die Reaktionsdauer beträgt üblicherweise 4 bis 24 h. Als Lösungsmittel dienen z. B. polare, aprotische Lösungsmittel, wie trockenes DMSO.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist weiterhin:
Typischerweise erfolgt die Umsetzung mit Oligoethylenoxid in einer wassrigen
Lösung mit einer Oligoethylenoxidkonzentration im Bereich von 10"2 bis 5 10"1 mol r1 und einer aquimolaren Menge EDC und NHS Die Umsetzung kann 10 min bis 2 h dauern. Vorzugsweise besitzt das Oligoethylenoxid n = 4 bis 15 Wiederholungseinheiten.
Beispiel
Um den Effekt des längeren Spacers zu verdeutlichen, werden zwei Sensoren für die Oberflächenplasmonenresonanz hergestellt. Der erfindungsgemäße Sensor besitzt die in dem ersten Ausführungsbeispiel beschriebene Struktur. Als Vergleichsbeispiel wird ein Sensor mit einem kurzen Spacer verwendet:
Als Rezeptor wird in beiden Sensoren Lysozym verwendet, als Ligand dient ein Einzelkettenfragment eines korrespondierenden Antikörpers (HyHel 10-Antikörper). Zunächst wird ein Glastrager mit einer Goldoberflache 12 h in eine wassπge 2 10" 2 mol I"1 Cysteaminiumhydrochloπdlosung gegeben Anschließend wird der Trager mit Reinstwasser gespult, 5 min mit 1 N NaOH inkubiert und wieder mit Reinstwasser gespult Eine Inkubationslosung wird durch Mischen einer wassrigen 5 10_2 mol r1 Polyacrylsaurelosung (Molekulargewicht 30 000) mit Losungen von 3, 19 mg EDC bzw 4,1 15 mg NHS, jeweils in 1 ml Reinstwasser, hergestellt Der Trager wird 1 h in diese Losung inkubiert und dann mit Reinstwasser gespult
Das Hydrogel Dextran wird zunächst nach dem folgenden Verfahren deπvatisiert 10,00 g (0,062 mol Wiederholungseinheit) Dextran werden mit 0,99 g NaOH (0,025 mol) und 1 ,71 g Bromessigsaure (0,012 mol) in 50 ml Reinstwasser gelost und 24 h bei Raumtemperatur gerührt Dann wird der Ansatz 3 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser mindestens fünfmal gewechselt wird Zur weiteren Umsetzung wird der dialysierte Ansatz mit 2,40 g Ethyl-(3- dιmethylamιnopropyl)carbodιιmιd (0,0125 mol) und 1 ,44 g N-Hydroxysuccinimid versetzt und 12 h bei Raumtemperatur gerührt Dann wird der Ansatz erneut 3 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser mindestens fünfmal gewechselt wird Anschließend wird 90 % des Wasser mit einem Rotationsverdampfer bei reduziertem Druck entfernt und das Polymer durch Eintragen in das 10fache Volumen Methanol gefallt Die Ausbeute betragt 9,06 g (81 ,5%)
'H-NMR (D2O, 200 MHz), δ [ppm]: 3,25 (m,Hh); 3,35 (m, Hg) 3,5 bis 4, 1 (mehrere m, Hb, Hc, Hd, He, Hb., Hc>, Hd., Hβ-, 5,05 (d, Ha, Ha ), 5,2 und 5,4 (breite Signale, Hf)
Anschließend wird das erhaltene Aminodextran in Wasser gelöst, so daß eine 10 Gew.-%ige Lösung resultiert. Der Träger wird 30 min in diese Lösung gegeben und im Anschluß wieder mit viel Reinstwasser gespült. Danach wird der Träger 12 h in eine Lösung von 1 mol • l~1 Bromessigsäure und 2 mol • I"1 NaOH gegeben.
Bei beiden Sensoren wird das Hydrogel 10 min in 10 mM 4'-(2-Hydroxyethyl)-1 - piperazinethansulfonsäure-Puffer (Hepespuffer) und 150 mM NaCI bei pH 7,4 in Anwesenheit von 77 mg-ml'1 EDC und 12 mg-ml'1 NHS aktiviert. Anschließend wird eine 0, 1 mg-ml"1 Lösung Lysozym in Acetatpuffer bei pH 4,7 mit dem Hydrogel kontaktiert, um das Lysozym durch Reaktion zwischen den freien Aminogruppen des Proteins und aktivierten Carboxylgruppen des Hydrogels kovalent an das Hydrogel zu binden.
Der funktionalisierte Sensor wird in ein SPR-Gerät eingebaut. Bei dem verwendeten SPR-Gerät handelt es sich um einen Eigenbau mit Θ/2Θ-Aufbau (analog E.
Kretschmann und H. Raether, „Radiative Decay of Non-Radiative Surface Plasmons Exicted by Light". Z. Naturforsch. , Band 23a, S. 2135 (1968)), der über einen Infrarotlaser (Wellenlänge 784 nm) als Lichtquelle verfügt.
Figur 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der kovalenten Bindung von Lysozym bei dem Vergleichsbeispiel (a) und bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b). Die Verschiebung des Minimums zu höheren Winkeln dient als Indikator für die Zunahme der Schichtdicke.
Die beobachtete Verschiebung in SPR-Minimumswinkel (ΔΘpι) zeigt, daß der erfindungsgemäße Sensor eine geringere maximale Funktionalisierungsdichte aufweist (ΔΘpι = 0, 18°) als der Vergleichssensor (ΔΘpt = 0,31 °). Wesentlich ist aber, daß die Geschwindigkeit beider Bindungssreaktionen sich voneinander unterscheiden. Bei dem erfindungsgemäßen Sensor ist die Bindungsreaktion nach etwa 20 Minuten abgeschlossen, während bei dem Vergleichssensor nach dieser Zeit erst 71 % der möglichen Belegungskapazität erreicht ist. Dieses Verhalten läßt auf eine schlechtere Zugänglichkeit zumindest eines Teils der terminalen Reste bei dem Vergleichssensor schließen.
Ein analoges Verhalten wird bei der Anbindung des Analyten beobachtet. In dem Beispiel wird ein Einzelkettenfragment eines Lysozymantikörpers verwendet. Der erfindungsgemäße Sensor zeigt wiederum eine geringere absolute Belegungsdichte (ΔΘpi = 0,08°) als der Vergleichssensor (ΔΘpι = 0,31 °). Bei dem erfindungsgemäßen Sensor, bei dem die Rezeptormoleküle über flexible, langkettige Spacer gebunden sind, ist die Assoziationsreaktion nach ca. 15 Minuten abgeschlossen, während bei dem Vergleichssensor bis zum Erreichen der Sättigung etwa 60 Minuten vergehen (s. Figur 4).
Beide Ergebnisse deuten auf eine deutliche Verbesserung der Reaktivität bei den erfindungsgemäßen Sensoren hin. Die Zugänglichkeit terminaler Reste und kovalent gebundener Rezeptoren wird also durch flexible, langkettige Spacer merklich erhöht.

Claims

Patentansprüche
Gegenstand mit einer Oberflache, umfassend ein Hydrogel, erhältlich durch (i) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlange von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsauregruppe und deren Derivate, aufweisen, und (II) Umsetzen des terminalen Restes mit einem Rezeptormolekul mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest,
Carbonsauregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsaurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate
Gegenstand nach Anspruch 1 , wobei die Kette eine substituierte oder nicht substituierte, verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette ist, in der bis zu 70 % der Kohlenstoffatome durch N, S oder nicht peroxidischem O ersetzt sein können
Gegenstand nach Anspruch 1 oder 2, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlange von 8 bis 40 Atome besitzen
Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Rezeptormolekul mindestens 5 Reste B aufweist
Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 4 wobei der Gegenstand ein Biosensor ist
Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen eines Gegenstandes mit einer Oberflache, umfassend ein
Hydrogel,
(b) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlange von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsauregruppe oder deren Derivate, aufweisen, und (c) Umsetzen des terminalen Restes A mit einem Rezeptormolekul mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsauregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsaurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate
Verwendung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche, umfassend an das Hydrogel gebundene organische Moleküle, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlange von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsauregruppe oder deren Derivate, aufweisen, zur ungerichteten Anbindung eines Rezeptormolekuls mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsauregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsaurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate Verwendung eines Gegenstandes nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Detektion von Analytmolekulen
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Detektion mit einem Oberflachen- resonanzspektrometer, Quarzwaage, Reflektionsinterferenzspektrometer oder Reflektionsinterferenzkontrastmikroskop durchgeführt wird
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