DE3856122T2

DE3856122T2 - Aktivierte und konjugierte Polyaryl-Substrate

Info

Publication number: DE3856122T2
Application number: DE3856122T
Authority: DE
Inventors: Brian Clark
Original assignee: Rorer Pharmaceutical Products Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1987-05-19
Filing date: 1988-05-18
Publication date: 1998-05-14
Anticipated expiration: 2008-05-19
Also published as: JPH0814583B2; EP0294059A2; US5484852A; ES2111517T3; US6361936B1; DE3856122D1; EP0294059B1; EP0294059A3; ATE162810T1; US6391980B1; SG64319A1; CA1320190C; JPS6465456A; US5241012A; GR3026426T3

Description

Diese Erfindung betrifft hoch funktionalisierte feste Substrate, Verfahren für deren Herstellung und die Konjugation der Funktionalitäten an eine breite Vielzahl von Zusammensetzungen. Artikel dieses Typs finden umfassende Anwendung in der Diagnose, Therapie, Verarbeitung als auch andere Anwendungen, in denen die Bindung einer bestimmten Gruppe bzw. Einheit an eine feste Oberfläche gewünscht wird.

Hintergrund

Feste Oberflächen spielen eine bedeutende Rolle bei der Fähigkeit, eine Komponente aus einem Gemisch von Komponenten abzutrennen, eine oder mehrere Einheiten an einer spezifischen Fläche zu lokalisieren, Merkmale verschiedener Molekule, molekulare Aggregation, Zellen oder Gewebe zu untersuchen, oder in anderen Situationen, in denen es von Interesse ist, daß eine Einheit in einer definierten Region, gegebenenfalls in Beziehung zu einem bestimmten Medium, vorliegt. So finden feste Substrate Anwendung in der Diagnostik, für Haptene, Antigene und Nukleinsäuren, Affinitätschromatographie, Apherese, Cytophorese, als auch anderen Anwendungen. Es bestehen viele Merkmale von Interesse für das feste Substrat, wie der Grad der nicht-spezifischen Bindung, die Klarheit, Einfachheit der Herstellung und die Verfügbarkeit. Die Merkmale sind von variierender Bedeutung in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließen wichtige Merkmale die Einfachheit, mit der Funktionalitäten bzw. funktionale Gruppen eingeführt werden können, die Zweckmäßigkeit derartiger Funktionalitäten zur Verknüpfung mit anderen Gruppen, die Wechselwirkung zwischen solchen Funktionalitäten und den an solche Funktionalitäten angehetteten Einheiten, die Dichte der für eine Verknüpfung verfügbaren Funktionalisierung, die Reproduzierbarkeit der Funktionalisierung und die zur Verknüpfung angewandten Verfahren ein. Es ist auch von Interesse, in der Lage zu sein, den Inhalt eines Behälters, wie einer Flasche oder eines Kolbens, leicht einzusehen.
In vielen Situationen ist es stark erwünscht, daß eine hohe Dichte einer bestimmten Einheit auf der Oberfläche vorliegt. Durch Vorsehen einer hohen Dichte kann in einem vorherbestimmten Oberflächenbereich eine größere Anzahl von Wechselwirkungen erreicht werden. Dies ermöglicht die Verwendung kleinerer Volumen, kürzerer Kontaktzeiten, eine größere Intensität des Signals, sowie andere Vorteile.
Es besteht deshalb ein fortgesetztes Interesse an dem Problem der Entwicklung neuer Verfahren und Zusammensetzungen, die Verbesserungen von festen Substraten ermöglichen.
Derartige Verbesserungen können Effekte auf die Empfindlichkeit und Effizienz diagnostischer Assays, die Effizienz der Trennung von Komponenten in einem komplexen Gemisch, die Fahigkeit, bestimmte Einheiten in einen kleinen Oberflächenbereich zu packen, aufweisen als auch andere Verbesserungen.

Literaturhinweise

Olah et al., J Am. Chem. Soc. (1962) 84: 3687 berichtet über die Nitrierung in Tetramethylensulfon. Die Funktionalisierung von Polystyrol ist in den U.S.-Patenten Nr. 3 956 219; 3 886 486; 3 974 110; 3 995 094 und 4 226 958 beschrieben. Die Verknüpfung über eine Schiff'sche Base an einen festen Träger ist in den U.S.-Patenten Nr. 4 419 444 und 4 217 338 beschrieben.
In der Erfindung werden funktionalisierte feste Artikel, umfassend additionspolymerisierte aromatische Monomere, zur Verfügung gestellt. Die bevorzugten Artikel sind Polynitrilsubstituierte Substrate, erzeugt durch Nitrierung der aromatischen Polymeroberfläche durch ein elektrophiles Mittel, insbesondere ein Nitrierungsmittel, in einem Lösungsmittel, welches im wesentlichen nicht dazu in der Lage ist, das Polymer zu lösen, enthaltend eine geringe Menge eines polaren Koordinationsmittels. Ein wesentlicher Anteil, mindestens 5 %, der Arylkeme ist mit den relevanten (Gruppen), z.B. Nitrogruppen, substituiert. Nitrogruppen können dann zu Nitrilogruppen reduziert werden, insbesondere zu Aminogruppen oder anderen reduzierten Stickstoffgruppen, welche als eine Stelle zur Verknüpfung an eine breite Vielfalt von Molekülen dienen können. Die resultierenden festen Substrate können insbesondere Anwendung für Abtrennungen oder hochdichte Packungen einer Einheit bzw. Gruppe von Interesse finden.
Die EP-A-0 145 386 beschreibt ein Verfahren zur Derivatisierung nur der Oberfläche eines Polymers mit Arylgruppen, durch Eirführen von Substituenten in wenigstens einige der Arylgruppen auf der Oberfläche des Artikels. Die Derivatisierung kann durch Verwenden von Lewis-Säurekatalysatoren oder der Friedel-Crafts-Reaktion erhalten werden. Wie früher erörtert, kann es wünschenswert sein, eine höhere-Substitutonsdichte bereitzustellen.
Wir haben festgestellt, daß eine höhere Dichte der Substitution durch Verwendung einer oxypolaren Verbindung, wie Wasser, in dem elektrophilen Substitutionsschritt erzielt werden kann.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Funktionalisierung eines festen Substrates, umfassend additionspolymerisierte aromatische Monomere, worin die Oberflächen des polymeren Substrats in hohem Maße funktionalisiert werden und worin das resultierende funktionalisierte Substrat optisch klar ist, zur Verfügung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
Kontaktieren der Oberflächen des polymeren Substrates mit einem substituierenden elektrophilen Mittel, das mit einem Anion koordiniert ist, welches in einem Lösungsmittel Ionisation aufzeigt, so daß das elektrophile Mittel ein Kation ist, und wobei das polymere Substrat weder in dem Lösungsmittel löslich ist noch darin gequollen wird, so daß eine Funktionalisierung der Arylgruppen an der Oberfläche mit dem Kation bewirkt wird.
Das Lösungsmittel enthält ferner eine oxypolare Verbindung, die fähig ist, sowohl das Anion als auch das Lösungsmittel von einer Koordination mit dem elektrophilen Mittel zu verdrängen, wobei die oxypolare Verbindung in einem Molverhältnis zu dem elektrophilen substituierenden Mittel von 0,05 bis 1 vorliegt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen durch das obenstehende Verfahren erhältlichen Artikel zur Verfügung, wobei mindestens 5 % der Arylgruppen bis zu einer Tiefe von 100 Å, wie bestimmt durch Elektronenspektroskopie für chemische Analyse (ESCA), mit dem elektrophilen Mittel funktionalisiert sind, und die restlichen Arylgruppen im wesentlichen nicht substituiert sind.
Vorzugsweise sind mindestens 25 % der Arylgruppen auf der Oberfläche mit dem elektrophilen Mittel substituiert.
Vorzugsweise werden funktionalisierte aromatische Substrate zur Verfügung gestellt, wobei im wesentlichen die gesamte Oberfläche eines festen polyaromatischen Substrats funktionalisiert ist. In hohem Maße funktionalisierte Oberflächen werden unter Anwendung elektrophiler Mittel, die fähig zu aromatischer elektrophiler Substitution sind, insbesondere einem Nitrierungsmittel, und eines Lösungsmittels, das verhältnismäßig nicht-polar ist und in dem das Polymer im wesentlichen nicht-mischbar und nicht-angequollen vorliegt, erhalten. In dem Reaktionsmedium ist eine kleine Menge einer polaren Substanz eingeschlossen, insbesondere eine Hydroxylverbindung, welche mit dem elektrophilen Mittel koordinieren kann.
Das feste Substrat wird ein Homo- oder Co-Polymer sein, gewöhnlich nicht-quervernetzt oder mit einem geringen Anteil von Querverknüpfungen (< 2,0 % Polyen-Monomer), worin mindestens 50 Mol-%, üblicher mindestens 80 Mol-%, aromatische additionspolymerisierbare Kohlenwasserstoffmonomere sein werden, insbesondere mit Arylgruppen von 1 bis 3 Ringen und mit 0 bis 1 Alkylsubstituenten aus 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich an einer anderen als der para-Position. Größtenteils wird das Substrat Polystyrol sein, welches gemäß herkömmlichen Wegen hergestellt wird und in einer Vielfalt von Formen erscheint, wie Gefaßen, Mikrotiterplatten, Petrischalen, Platten, Behältern oder angefertigten Artikeln. Anstatt von Behältern kann es sich bei dem festen Substrat z.B. um Teilchen, Hohlfasern, Stränge, geschnittene Fasern oder Membranen handeln. Das Polymer kann z.B. geformt, extrudiert oder zerspant bzw. bearbeitet werden, was gewöhnlicherweise zu einer klaren, relativ glatten Oberfläche führt.
Größtenteils werden elektrophile Mittel angewandt, besonders Nitrierungsmittel, worin das Nitroniumion mit einem Anion koordiniert ist, welches eine signifikante Ionisierung in dem Lösungsmittelmedium ermöglicht, insbesondere ein komplexes Anion, und noch spezieller ein Polyhalogenidanion. Beispielhafte Polyhälogenidanionen schließen Tetrafluorborat, Antimonhexafluorid und Phosphorhexafiuorid ein.
Das Lösungsmittel wird ein solches sein, in welchem das Polymer weder löslich ist noch gequollen wird, insbesondere Tetramethylensulfon (TMS). In dem Lösungsmittel eingeschlossen wird eine polare Koordinierungsverbindung sein, die fähig ist, mit einem Nitroniumion zu koordinieren. Bequemerweise kann Wasser verwendet werden, aber andere Oxyverbindungen, wie Methanol, können ebenfalls Anwendung finden. Die polare Verbindung sollte in der Lage sein, sowohl das Anion als auch das Lösungsmittel von einer Koordination mit dem Nitroniumion zu verdrängen. Die polare Komponente wird vorzugsweise in nicht mehr als einer etwa äquimolaren Menge zu der Nitroniumion-Konzentration, gewöhnlich in der mindestens 0,05-, gewöhnlicher in der mindestens 0,25- und im allgemeinen in der mindestens 0,5-fachen molaren Konzentration des Nitroniumions vorhanden sein.
Das Nitroniumion wird im allgemeinen bei einer Konzentration von mindestens 0,05 M, gewöhnlich mindestens 0,1 M, und gewöhnlich nicht mehr als 0,8 M vorliegen. Die jeweilige Konzentration ist hauptsächlich eine zweckmäßige, solange eine genügende Menge an Reaktant vorliegt, um die polymere Oberfläche im wesentlichen vollständig zu funktionalisieren.
Die Temperatur der Reaktion wird mit der Beschäffenheit des Reagenz variieren, wobei sie im allgemeinen mindestens 4ºC und nicht mehr als 60ºC, gewöhnlich nicht mehr als 40ºC beträgt und vorzugsweise im Bereich von 30ºC bis 40ºC liegt. Die Zeit für die Reaktion wird mit der Temperatur variieren, so daß längere Zeiten mit niedrigeren Temperaturen zusammenhängen werden. Im allgemeinen wird die Reaktion mindestens 1 Stunde und nicht mehr als 48 Stunden dauern, wobei sie im allgemeinen von 2 bis 24 Stunden lang stattfindet.
Das Reaktionsmedium wird mit der Polymeroberfläche kontaktiert, um eine Menge an Reaktant zur Verfügung zu stellen, welche mindestens stöchiometrisch zu den verfügbaren aromatischen Gruppen auf der Oberfläche, gewöhnlich in einem mindestens 1,5fachen Überschuß, ist, wobei ein größerer molarer Überschuß wie angemessen verwendet werden kann. In manchen Fällen ist es wünschenswert, eine Anzahl von Reaktionsgemischen unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von Nitroniumion herzustellen, um das Ausmaß der Funktionalisierung der Obertläche zu optimieren.
Nach Vervollständigung der Reaktion kann die Reaktionsmischung verworfen und die Obertläche gewaschen werden, um jedwede restliche Materialien zu entfernen. Verschiedene Lösungsmittel können für die Reinigung der Oberfläche eingesetzt werden, wie Methanol, Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Wasser, Nitromethan oder dergleichen. Das jeweilige für die Reinigung verwendete Material ist für diese Erfindung nicht kritisch und ist vorwiegend eines nach Wunsch, solange das Polymer darin unlöslich ist und nicht durch das Lösungsmittel gequellt wird.
Durch Elektronenspektroskopie für die chemische Analyse (ESCA) wurde bei der resultierenden polymeren Oberfläche festgestellt, daß ein Verhältnis der polaren Gruppe, z. B. Stickstoff, zu Aryl von mindestens 0,05, vorzugsweise mindestens 0,1, gewöhnlich mindestens 0,15, gewöhnlicher mindestens 0,25, bis zu einer Tiefe von etwa 100 Å vorliegt. Vorzugsweise wird das Verhältnis der polaren Gruppe, z.B. Stickstoff, zu Aryl 0,25 bis 1 betragen.
Das resultierende Oberflächen-nitrierte Polyaryl-Festsubstrat weist eine Anzahl erwünschter Merkmale auf Bei Herstellung gemäß dem obenstehenden Vorgehen ist das resultierende funktionalisierte Polymer klar, so daß es für die Lichttransmission durch das Polymer ohne signifikante Interferenz bzw. Störung eingesetzt werden kann. Somit kann das nitrierte feste Polyarylsubstrat für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, insbesondere wenn es gewünscht wird, Licht durch eine Probe hindurchzuleiten und das Licht den Behälter durchqueren zu lassen, so daß die Menge des durch den Behälter transmittierten Lichts bestimmt wird. Oder es kann erwünscht sein, in-dem Behälter stattfindende Ereignisse, wie Zellproliferation, Plaquebildung, Zell-Lebensfähigkeit oder Agglutination, zu beobachten. Für diese Zwecke wird die Nitrogruppe gewöhnlich modifiziert werden, um eine zweckmäßigere Funktionalität zur Anknüpfung verschiedener Verbindungen bereitzustellen.
In diesen Anwendungen beschäftigt man sich gewöhnlicherweise mit der Auswirkung der Bestrahlung auf eine Probe, wobei eine Probe Licht absorbieren, fluoreszeieren kann, oder alternativ dazu kann eine chemolumineszente Reaktion involviert sein, wobei die Probe Licht emittieren wird.
Die Nitrogruppen sind fahig, Reaktionen durch intermediare reduzierte Zustände zu durchgehen, um eine Nitrilogruppe, wie Nitroso, Oxim, Azoxy, Azo, Hydrazino oder Amino, in Abhängigkeit von den jeweiligen Bedingungen, die angewandt werden, bereitzustellen. In manchen Fällen, worin das Produkt zwei Stickstoffatome aufweist, kann die nitrierte Oberfläche mit einer zweiten Nitroverbindung umgesetzt werden, so daß ein gemischtes Produkt erhalten wird, das durch eine Stickstoflbrücke, die ein bis zwei Stickstoffatome aufweist, verbunden ist, oder alternativ dazu kann eine Aminoverbindung verwendet werden, welche mit einer intermediären teilweise reduzierten Funktionalität, wie Nitroso, reagieren kann, wobei die Nitrosogruppe mit der Aminogruppe reagieren kann, um eine Azogruppe zu bilden. Von besonderem Interesse sind die Diaza(-N-N-)-Gruppen, wie Diazo, Hydrazon, Semicarbazon und Hydrazino.
Die meisten der für die Reduktion von Nitrogruppen verwendeten herkömmlichen Reagenzien können bei den nitrierten Substraten angewandt werden. Diese reduzierenden Mittel schließen katalytischen Wasserstoff, z.B. mit Platin oder Palladium; Zinn(II)-chlorid; Natriumdithionit; Metall, z.B. Zink-, Eisen- oder Zinn-Säure- oder -Wasser-Paare; Al(Hg)-aq. Ethanol; Muminiumhydride; Borhydride; Ammoniumsulfid; Natriumarsenit; und elektrolytische Reduktion ein.
Abhängig von der Natur der Funktionalität können verschiedene Reaktionen ausgeführt werden, um Verbindungen von Interesse an die Oberfläche des festen Substrats zu knüpfen, während die Klarheit des festen Substrats dennoch beibehalten wird. Auf die Reaktion von Nitrosogruppen mit Aminen ist bereits hingewiesen worden. Arylamine gehen bekanntermaßen eine breite Vielzahl von Reaktionen ein. Die Arylamine können unter einer Vielzahl von Bedingungen acyliert werden, wobei das Nicht-Oxo-Carbonyl (Carboxycarbonyl der Funktionalität), wie Acylhalogenide, Anhydride, aktive Ester, wie para-Nitrophenyl, N-Hydroxysuccinimidyl und p-Nitro-o-chlorphenyl, oder mit Aktivierungsmitteln, wie Carbodiimiden, aktivierte Carbonsäuren verwendet werden.
Die Aminogruppe kann mit einer Nitrosoverbindung umgesetzt werden, um eine Azobindung zu bilden. Aminohzlogenide können verwendet werden, um Hydrazine mit der Aminogruppe zu bilden. Aldehyde oder Ketone können umgesetzt werden, insbesondere unter reduzierenden Bedingungen, z.B. Natriumborhydrid, um Imine bzw. alkylierte Amine zu bilden.
Amine können diazotiert werden, wobei die Amine mit einer breiten Vielzahl funktioneller Gruppen, wie Halogeniden, Acylgruppen, Oxygruppen, Mercaptogruppen, Cyangruppen oder Silylgruppen substituiert werden können.
Alternativ dazu kann die Azogruppe mit einer aktivierten aromatischen Verbindung, wie einer phenolischen oder einer N,N-Dialkylanilinverbindung, gekoppelt werden. Darüber hinaus können Tyrosinylverbindungen mit Diazogruppen gekoppelt werden, wobei das Tyrosin Teil eines größeren Moleküls, wie einem Oligopeptid oder Protein, sein kann. Anstatt von Tyrosin können verschiedenen Purine oder Pyrimidine mit der Azogruppe gekoppelt werden, wobei die Purine oder Pyrimidine monomer oder Teil von einzeisträngigen oder doppelsträngigen RNA- oder DNA-Ketten sein können.
Weiterhin kann die Aminogruppe funktionalisiert werden, um verschiedene reaktive Funktionalitäten bereitzustellen, wie Isocyanat, Urethane oder Cyanamide, wobei die Funktionalität mit Alkoholen, Aminen oder Thiolen umgesetzt werden kann, um Urethane und Harnstoffe zu bilden.
Anstatt von Aminogruppen können Hydrazinogruppen, wie angegeben, oder in alternativer Weise durch die Reduktion der Diazogruppe, wobei die Hydrazingruppe auch als eine Verknüpfungsstelle dienen kann, hergestellt werden. Hydrazingruppen können mit einer Vielzahl von Mitteln oxidiert werden, um Diazogruppen zu bilden, oder mit Stickstoffoxiden, um ein Azido zu bilden, wobei die Azidogruppe unter UV-Bestrahlung Nitren bildet. Die hochreaktiven Nitrene werden in eine breite Vielzahl von Verbindungen inserieren, insbesondere ungesättigte Verbindungen, sowohl aliphatische als auch aromatische. So können Aziridine gebildet werden, welche als Stelle für die Verknüpfung einer Verbindung an das Substrat dienen können.
Aufgrund des bedeutenden Interesses an der Kopplung von Peptiden an die Oberfläche wird eine Anzahl spezifischer Verknüpfungsgruppen oder Abstandhalterarme für die Verknüpfung des Peptides oder einer anderen Einheit an die Oberfläche bevorzugt werden. Eine Gruppe von Verknüpfungsgruppen-Reagenzien wird Carboxylgruppen beinhalten, welche zu einer Amidbildung führen. Die Carbonsäuren werden mit einer Vielzahl aktiver Funktionalitäten funktionalisiert werden, um koyalente Bindungen mit Peptiden, wie sie natürlich vorkommen oder modifiziert wurden, um eine Kopplungsstelle zur Verfügung zu stellen, herzustellen.
Die Funktionalitäten für die Verknüpfung schließen Aldehyd, Carboxyester, Halogenacetamid, Mercapto und Dithioether ein. Die Carbonsäuregruppe kann ferner z.B. mit Oxygruppen, Hydroxyl oder Ether, Cyano, von Wasserstoffatomen freiem substituiertem Amino und quaternärem Ammonium substituiert werden. Die Kohlenwasserstoffkette kann aliphatisch oder aromatisch sein.
Spezifische Verknüpfungsreagenzien schließen p-Formylbenzoesäure, N-Succinimidyltartrat, Weinsauremonohydrazid, p-Iodacetamidobenzoesäure, 3-Mercaptopropionsäure und 5-α-Pyridyl-3-dithiopropionsäure ein.
Von Carbonsäure verschiedene Reagenzien können angewandt werden, um stabile Bindungen bereitzustellen, wie Poly(dialdehyde), z.B. Polyglutaraldehyd, wobei die Aminogruppe durch eine Michael-Addition hinzugefügt wird, wodurch Aldehyd- und Olefingruppen für eine weitere Reaktion bestehen bleiben.
Darüber hinaus kann die Aminogruppe effizient diazotiert und die resultierende Diazogruppe auf eine Vielzahl von Wegen verwendet werden. Diazogruppen können mit Oxy- oder Thiofunktionalitäten substituiert werden, um Funktionalitäten herzustellen, welche an eine Vielzahl von Gruppen geknüpft, mit nukleophilen Funktionalitäten, wie Phenolen, Anilinen und Amino zur Bildung einer Brücke umgesetzt oder zu einer Hydrazin- oder Aminogruppe reduziert werden können. Die Brücke kann in Abhängigkeit vom Zweck des Trägers relativ kurz oder lang sein.
Beispielhafte verknüpfende Gruppen schließen Bis-p-hydroxybenzamid von Diaminopolyethylenglykol, worin eine Phenolgruppe an die Diazogruppe gekoppelt ist und die andere Phenolgruppe an Nukleinsauren oder Proteine über ein p--Di(diazo)benzol oder p,p'-Di(diazo)biphenyl gekoppelt sein kann, ein. Die Diazogruppe kann über eine Tyrosylgruppe direkt an ein Protein gekoppelt sein. Die Phenolgruppe kann mit Ethylenoxid verlängert werden, um eine Verknüpfungsgruppe bereitzustellen, welche in einer Aminofunktionalität enden kann. Diese Brücke kann in der in situ-Peptidsynthese Anwendung finden. Die Hydrazingruppe kann, wie auch eine Aminogruppe, an ein Glykol-gespaltenes Glykoprotein gekoppelt werden, um ein Imin oder eine Schiff'sche Base zu bilden, welche zu einem Methylenhydrazin oder -amin reduziert werden kann. Das Hydrazin kann mit -Glyoxylsäure gekoppelt werden, wobei die Carboxylfunktionalität für eine Verknüpfung bestehen bleibt.
Die Mercaptogruppe kann ein Thiol für die Verknüpfung bereitstellen, oder die Diazogruppe kann durch eine Mercaptogruppe substituiert werden, um einen Thioether zu bilden, wie durch Umsetzen der Diazogruppe mit Dithioerythritol.
Auch andere Brücken- oder Verknüpfungsgruppen, welche unterschiedliche synthetische Szenarien anwenden, können verwendet werden. Die Literatur birgt eine umfassende Vielzahl von Reagenzien und Verfahren zur Kopplung von Molekülen, wie Proteinen, Lipiden, Sacchariden, Nukleinsäuren und kleinen natürlich vorkommenden oder synthetischen Molekülen, an Funktionalitäten auf einer Oberfläche.
Bei den Brücken- oder Verknüpfungsgruppen kann es sich um eine einzelne bifunktionelle Gruppe, ein Oligomer oder ein Polymer, wie Poly(aminosaure), Polyurethan, Polyharnstoff, Polyalkylenoxid, Polyester, Polyamid oder Nukleinsäure, handeln. In manchen Situationen kann es erwünscht sein, daß eine spaltbare Bindung vorliegt, so daß ein gebundenes Molekül von der Oberfläche freigesetzt werden kann. Es können Verknüpfungen verwendet werden, welche z.B. durch Reduktion, Oxidation, Hydolyse, zweckmäßigerweise unter Einsatz enzymatischer Katalyse, gespalten werden. Die Verknüpfungsgruppe kann deshalb spezifische Erkennungsstellen für solche Enzyme, wie Dipeptidasen, z.B. KEX1, Collagenase, Papain, Neuraminidase, Amylase, andere Endosaccharidasen, Endonukleasen, Phosphatase, Pyrophosphatase, wobei die Bindung z.B. ein Amid, einen Ether oder Phosphatester beinhaltet, einschließen. Chemisch spaltbare Bindungen schließen z.B. Disulfide, Peroxide, Acetale, Azo- Bindungen, und Carboxylatester ein. Die spaltbare Verknüpfungsgruppe wird ausgewählt, um die Gegenwart derselben oder ähnlicher spaltbarer Gruppen, die in dem freizusetzenden Rest vorhanden sind, zu vermeiden.
Die vorliegenden Produkte können durch Kopplung an eine breite Vielzahl von Substanzen umfassende Anwendungen z.B. in Diagnose, Therapie, Verarbeitung und Synthese finden. Die verschiedenen Gruppen von Interesse können direkt an die an das Aryl-Kohlenstoffatom gebundene Funktionalität geknüpft werden, oder ein Abstandshalter- oder Linkerarm kann verwendet werden. Die Abstandshalter finden Anwendung, wo eine raumliche Behinderung von Belang sein kann, wo die Abtrennung der Gruppe vom festen Substrat von Interesse ist, oder wo das Einhalten des Abstands eine Umgebung von Interesse für die Gruppe schaffen kann, wie Polarität oder Ladung. Gewöhnlich werden die Verknüpfungsgruppen eine Kette von 1 bis 30 Atomen oder länger, gewöhnlicher 1 bis 20 Atomen, aufiveisen und können z.B. Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor einschließen. Die jeweilige Wahl des Abstandshalter- oder Linkerarms wird z.B. von den im verknüpfenden Arm beinhalteten funktionellen Gruppen, den Eigenschaften von Interesse, Zweckmaßigkeiten der Synthese und der Abstandshalterlänge abhängen.
Wie bereits angegeben, kann eine breite Vielzahl von Molekülen mit unterschiedlichen Funktionen an die Oberfläche geknüpft werden, effektiverweise in einer monomolekülaren Schicht oder polymolekularen Schicht, falls gewünscht, und in einer breiten Vielfalt von Anwendungen eingesetzt werden. Die vorliegenden Techniken sorgen für eine gewünschte Ausrichtung der an die Oberfläche gebundenen Moleküle, welche in vielen Situationen deren Verfügbarkeit für Bindung und/oder Bearbeitung bzw. Manipulation verbessert.
Die Verbindungen, welche verknüpft werden, schließen Liganden wie Haptene und Antigene, Rezeptoren, wie Antikörper, Enzyme, natürlich vorkommende Rezeptoren, wie Oberflächenmembranproteine, Lectine, Blutproteine, z.B. Thyroxin-bindendes Globulin, komplexierende Mittel, wie Kryptanden, Kronenether, Porphyrine, Phthalocyanine, Nukleinsäuren, sowohl RNA als auch DNA oder Oligonukleotide, Farbstoffe, Fluoreszenzstoffe, Chemolumineszenzstoffe, Enzyme, wobei die Enzyme eher als Katalysatoren statt als Rezeptoren verwendet werden, Enzymsubstrate, Inhibitoren oder Cofaktoren oder andere Moleküle ein, welche von Interesse für den Nachweis der gleichen oder unterschiedlichen Moleküle sein können oder für die Manipulation, Isolation, Reaktion, Wechselwirkung oder ein anderes Phänomen verwendet werden können, wobei ein Ergebnis von Interesse erzeugt wird.
Die Literatur weist ein umfassendes Repertoir von Gruppen auf, welche verwendet werden können, um nahezu jede Funktionalität über eine Aminofunktionalität an eine feste Oberfläche zu knüpfen. Das U.S.-Patent Nr.3 817 837 beschreibt eine große Zahl von Funktionalitäten, welche zur Verknüpfung von Proteinen oder Haptenen an Aminofunktionalitäten eingesetzt werden können. Andere Bezugsstellen, die z.B. die Verknüpfung an Affinitätssäulen, Oberflächen zur Apherese, Oberflächen zur Diagnose, Oberflächen zur Chromatographie oder Oberflächen zur Reaktion zeigen, können in Bezugsstellen gefunden werden, die in solchen Katalogen, wie dem BRL-Katalog, Bio-Rad-Katalog, Sigma-Katalog, Pierce-Katalog und Pharmacia-Katalog, zitiert werden. Es ist offensichtlich, daß die jeweilige Weise, in welcher die Verbindung von Interesse an die Oberfläche gebunden wird, in breitem Maße variiert werden kann. In besonderen Situationen kann ein Abstandshalterarm gegenüber einem anderen auf Gründ besonderer Eigenschaften ausgewählt werden.
Das vorliegende feste Substrat kann die Ausrichtung von Immunoglobulinen ermöglichen, entweder als Fab-Fragmente oder Fab'-Fragmente, oder als intakte Immunoglobuline. Zum Beispiel können die Aminogruppen des Substrats iodacetyliert werden, gefolgt von einer Reaktion mit den verfügbaren Mercaptogruppen des trunkierten Immunoglobulins. Alternativ dazu können die intakten Immunoglobuline mit einem Glykol-Spaltungsmittel, z.B. Periodat, oxidiert werden und das resultierende Dialdehyd mit einer Aminogruppe oder Hydrazin umgesetzt werden, um eine Schiffsche Base oder ein Imin zu bilden.
Nukleinsäuren können an das feste Substrat unter Verwendung eines Polyalkylenglykolarms verknüpft werden, wobei das Alkylen 2 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen wird, und die Kette 2 bis 100, gewöhnlich 2 bis 30 Alkylenoxy-Einheiten aufweisen kann. Die verknüpfende Gruppe kann durch Verwenden der Diazo-Funktionalität auf dem festen Substrat mit einem diacylierten α, ω-Diaminopolyethylenglykol, z.B. dem m-Dimethylaminobenzoylderivat von Diaminopolyethylenglykol, erreicht werden. Die Dimethylamino-aktivierte Aroylgruppe kann als eine Verknüpfungsstelle verwendet werden, wenn eine kovalent an die Diazogruppe gebunden wird, während die andere bestehen gelassen wird, um zur Verknüpfung mit einer anderen Verbindung verwendet zu werden. Auf diese Weise können Phenylendiamin, Benzidin oder eine andere Aryldiaminoverbindung diazotiert werden, um eine Verknüpfung zwischen dem Dimethylaminoaroyl und einer Nukleinsäure zu bilden. Die Verwendung der Diazogruppe zur Anknüpfung von Nukleinsäuren an die Oberfläche ist bereits erörtert worden.
Es werden jetzt die Anwendungen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden. Die erste zu betrachtende Anwendung sind Diagnostika. Feste Oberflächen beinhaltende Diagnostika werden größtenteils als heterogen bezeichnet, da sie einen Abtrennungsschritt beinhalten, obwohl es eine zunehmende Anzahl diagnostischer Protokolle gibt, worin eine feste Oberfläche ohne die Notwendigkeit für einen Abtrennungsschritt beteiligt ist. Bei Diagnostika kann die Bindung von Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaares, umfassend Ligand und Rezeptor, welche miteinander binden, um einen Komplex zu bilden, von Interesse sein, wobei die homologen Miglieder des spezifischen Bindungspaares eine hohe Assoziationskonstante für einander besitzen, gewöhnlich größer als 108 1/Mol.
Die Haptene werden im allgemeinen 150 bis 5000 Dalton, gewöhnlich bis zu 2000 Dalton groß sein und können z.B. natürlich vorkommende Hormone, natürlich vorkommende Arzneimittel, synthetische Arzneimittel, Schmutzstoffe bzw. Umweltschadstoffe, Affektormoleküle, Wachstumsfaktoren, Lymphokine, Aminosauren, Oligopeptide, chemische Intermediate, Nukleotide oder Oligonukleotide einschließen. Diagnostika für derartige Verbindungen können sich auf den Nachweis von Arzneimittelmißbrauch, die Überwachung einer therapeutischen Dosierung, den Gesundheitszustand, den Krankheitsnachweis, z.B. Endotoxine, richten. Proteine sind in einer breiten Vielzahl von Diagnostika von Interesse, wie beim Nachweis von Zellpopulationen, des Bluttyps, von Pathogenen, von Immunantworten auf Pathogene, von Immunkomplexen, von Sacchariden oder natürlich vorkommenden Rezeptoren. Rezeptoren können Anwendung bei der Bindung z.B. an Haptene, Proteine oder andere Rezeptoren finden, oder beim Nachweis der Gegenwart von Pathogenen, des Spiegels eines besonderen Proteins in einer physiologischen Flüssigkeit, des Vorhandenseins von Haptenen in einer breiten Vielzahl von Proben, wie physiologischen Flüssigkeiten, Luft, Prozeßflüssen oder Wasser. Nukleinsäuren können auch Anwendung beim Nachweis z.B. von spezifisch an Nukleinsäuren bindenden Proteinen oder von komplementären Strängen finden.
Von besonderem Interesse ist die Bindung von Mikroorganismen und Zellen, einschließlich Viren, prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, einzelliger und vielzelliger Organismenzellen, z. B. Pilzen, Tieren, Säugern, oder Fragmenten davon. Gewöhnlicherweise werden diese großen Aggregationen nicht-kovalent über spezifische Bindungspaarmitglied-Komplexe an die Oberfläche gebunden. Indem eine hohe Dichte von an die Oberfläche gebundenen Bindungsmitgliedern vorliegt, kann eine Zelle oder ein Virus durch eine große Zahl von Bindungspaarmitgliedern komplexiert werden, welche eine sehr starke Verankerung der Zelle, des Virus, oder des Fragments bereitstellen. Das System kann dann einer heftigen Behandlung ohne Sorge über die Verdrängung der spezifisch gebundenen Einheit unterzogen werden, während die nicht-spezifisch gebundenen Materialien leicht entfernt werden können.
Es existiert eine große Anzahl von Protokollen für den Nachweis der verschiedenen Analyten von Interesse. Die Protokolle können die Anwendung eines signalerzeugenden Systems beinhalten, das ein markiertes Konjugat beinhaltet, welches direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. Diese Techniken können z.B. Farbstoffe, Enzyme, Enzymsubstrate oder Cofaktoren, Enzyminhibitoren, Fluoreszenzstoffe, Chemolumineszenzstoffe oder Teilchen anwenden.
Für die vorliegend beschriebenen Zwecke liefert die Markierung vorzugsweise ein mit der Gegenwart des Analyten in der Probe zusammenhängendes Signal, welches zum Nachweis elektromagnetischer Strahlung, insbesondere Licht im ultravioletten, sichtbaren oder inftaroten Bereich, führt. Durch Anwendung des vorliegenden festen Substrats kann das Licht durch das feste Substrat hindurch nachgewiesen werden, anstatt daß eine Reflektion efforderlich ist, welche normalerweise mit signifikanten Fehlern behaftet ist. Darüber hinaus können interne Totalreflektion beinhaltende Techniken angewandt werden, wie beschrieben im U.S.-Patent Nr.3 939 350. Andere Patente von Interesse, sowöhl inländische als auch ausländische, welche Protokolle von Interesse beschreiben, schließen die U.S.-Patente Nr.3 654 090, 3 850 752, 4 347 312, EP-A-2963 und die darin zitierten Referenzen ein.
Assays können gemaß den verschiedenen Protokollen durchgeführt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Probe mit dem vorliegenden festen Substrat kontaktiert, und verschiedene Arbeitsschritte können durchgeführt werden, wie die Zugabe verschiedener Reagenzien, Inkübationen oder Waschschritte. Das Endergebnis der Assays wird die Veränderung in der Menge eines Produkts sein, welches Licht absorbiert oder erzeugt, entweder durch Lichtabsorption oder durch Lichtemission im Verhältnis zur Gegenwart oder Menge des Analyten von Interesse. Gewöhnlich erfolgt dies als Ergebnis der Bildung eines spezifischen Bindungskomplexes zwischen komplementären Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaares, wobei eines der Mitglieder als Brucke zur Bildung eines "Sandwich" dienen kann, oder es kann ein einzelner Komplex vorliegen, oder Komplexe können an Komplex- Bindungproteine gebunden werden, wie an das S. aureus-Protein A, den Rheumatoid-Faktor oder für Immunkomplexe spezifische Immunoglobuline.
Bei Vorliegen fluoreszenter Marker, wie fluoreszenter Teilchen oder fluoreszenter konjugierter Antikörper, kann die Probe mit Licht bestrahlt werden, das durch die Fluoreszenzstoffe absorbiert wird, und das emittierte Licht kann gemessen werden. Wenn Mikrotiter- Vertiefungen vorliegen, kann man zum Beispiel das durch die Seiten der Vertiefungen emittierte Fluoreszenzlicht messen, wobei der aus dem aktivierenden Licht resultierende Hintergrund wesentlich minimiert wird. Wenn Farbstoffe als die Markierung eingesetzt oder als Ergebnis einer Reaktion, z.B. einer enzymatisch katalysierten Reaktion, hergestellt werden, kann das Licht durch die Probe und den Behälter hindurchgelassen bzw. transmittiert und als Anzeige der Gegenwart des Analyten gemessen werden, da ein verhältnismaßig geringes Ausmaß der Absorption durch den Behälter besteht. Somit können hochempfindliche Assays mit dem vorliegenden System angewandt werden.
Bei Nukleinsäure-Assays unter Beteiligung einer Hybridisierung kann man in ännlicher Weise die notwendigen Schritte ausführen, um zu ermitteln, ob komplementäre Sequenzen vorhanden sind, und durch Anwendung einer breiten Vielzahl von Protokollen für eine gefärbte oder fluoreszente Markierung oder ein Produkt der Markierung sorgen, welches die Gegenwart oder Abwesenheit der komplementären Sequenz anzeigen wird.
Zum Beispiel könnte man die Oberfläche unmittelbar vor Durchführung des Assays durch Diazotierung der Aminofunktionalitäten aktivieren, die Nukleinsäureprobe zu der aktivierten Oberfläche hinzugeben, so daß sie kovalent gebunden wird, und dann Sonden anwenden, die eine zu der Sequenz von Interesse komplementäre Sequenz besitzen und zum Beispiel durch Aufweisen einer Biotin-Markierung funktionalisiert sind. Nach Vervollständigen des Hybridisierungsschrittes könnte man ein an Avidin konjugiertes Enzym zugeben, welches an jegliches über Hybridisierung an die Oberfläche gebundenes Biotin binden würde. Nach Abwaschen von nicht-spezifisch gebundenem Avidin könnte das Substrat für das Enzym zugegeben werden, und die Bildung von Produkt würde die Gegenwart und Menge der komplementären Sequenz anzeigen.
Die vorliegenden Behälter können auch zum Nachweis von Pathogenen eingesetzt werden. Monoklonale Antikörper können an die Oberfläche geknüpft werden, um als Einfang- Antikörper zu dienen. Die Probe wird dann zugegeben, und Zeilen mit dem vom Antikörper erkannten Epitop werden an den Antikörper auf der Oberfläche binden. Nicht-spezifisch gebundene Zellen werden abgewaschen, wodurch im wesentlichen nur spezifisch gebundene Zellen übrig bleiben. Danach werden dem Behälter markierte monoklonale Antikörper zugegeben, welche spezifisch für ein anderes Epitop als das vom Einfang-Antikörper erkannte Epitop sind. Nach Inkübation, um eine Reaktion zwischen den Antikörpern und Zellen zu ermöglichen, werden nicht-spezifisch gebundene Antikörper abgewaschen und die Gegenwart der Markierung, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Eine Variation besteht in der Anwendung eines von einem Zellrezeptor erkannten Antigens. Das Antigen wird an die Oberfläche gebunden, um die Zellen einzufangen, und ein markiertes Antigen wird verwendet, um die Zellen zu markieren. Der Rezeptor könnte ein Oberflächen- Immunoglobulin (sIg) sein. Auf diese Weise könnte die Gegenwart von spezifisch gebundenen Zellen bestimmt werden, wobei das Antigen von Interesse komplementär zu dem an der Oberfläche gebundenen Rezeptor wäre, und Zellen mit dem für ein solches Antigen spezifischen sIg könnten bestimmt werden. Anstelle des Vorliegens eines Antigens, könnte man Antikörper gegen das an die Oberfläche gebundene Antigen benutzen, um das Antigen nicht-kovalent an die Oberfläche zu binden.
Die den Gegenstand darstellenden festen Substrate können auch z.B. für Affinitätssäulen oder -chromatographen verwendet werden, wobei eine besondere Substanz an die Oberfläche gebunden ist, und eine Komplexbildung oder ein anderes Bindungsereignis kann nachgewiesen werden. Mit den vorliegenden festen Substraten kann man visuell entlang der Länge einer Säule Beobachtungen anstellen und die jeweilige Stelle, an der Komplexbildung auftritt, ermitteln. Diese Technik kann auch zur Diagnose angewandt werden, wobei verschiedene Antigene oder Rezeptoren an unterschiedlichen-- Stellen längs der Säule gebunden werden können, gefolgt von der Einführung der Probe durch die Säule, gefolgt vom Zugeben des Signal-erzeugenden Systems, z.B. eines Enzym-gebundenen spezifischen Bindungspaar- Mitglieds und eines Entwicklers, und dem Nachweisen der Bereiche der Farbbildung.
Die den Gegenstand darstellenden festen Substrate können auch Anwendung bei der Isolierung verschiedener Produkte von Interesse, wie Blutplasmaproteinen, Wachstumsfaktoren, Gerinnungsfaktoren oder Anti-Gerinnungsfaktoren, finden, welche dann durch verschiedene Salzlösungen aus dem Komplex fteigesetzt werden können.
Die festen Substrate können für eine Vielzahl anderer Zwecke angewandt werden, wann immer man wünscht, eine hohe Dichte von orientierten Molekülen an einer Oberfläche bereitzustellen oder Ereignisse sichtbar zu machen oder die leichte Transmission von Licht vorzusehen, wenn eine Substanz nicht-diffiisorisch an eine feste Oberfläche gebunden wird.
Die nachstehenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angegeben.

Experimente

In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen aus geformtem bzw. gegossenem Polystyrol wird eine 0,5 M Nitrotetrafluorboratlösung in Tetramethylensulfon (TMS) eingebracht, und die Reaktion wird 6 Stunden lang bei 37ºC voranschreiten gelassen. Am Ende dieser Zeit wird die Reaktionsmischung verworfen, und die Vertiefungen werden mit Methanol gewaschen. In diese Platten wird danach eine 1 M Lösung Zinn(II)-chlorid in 6 N wäßriger Chlorwasserstoffsäure eingebracht und die Reaktion wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur voranschreiten gelassen, um die Nitrogruppen zu Aminogruppen zu reduzieren. Die resultierenden Aminogruppen werden durch Zugabe einer 1%igen Natriumnitritlösung in 1 N wäßriger Chlorwasserstoffsäure bei 4ºC und 20 Minuten langes Voranschreitenlassen der Reaktion diazotiert, wobei nach dieser Zeit die Reaktionsmischung abgewaschen wird und eine Lösung eines tyrosinhaltigen Proteins bei 0,1, 1,0 oder 10 mg/ml in 0,1 M Borat, pH 9,3, bei 4ºC zugegeben wird. Die Reaktion wird 16 Stunden lang voranschreiten gelassen, wodurch das Protein kovalent an die Oberfläche gebunden wird.
Das obenstehende Reaktionsvorgang wurde wiederholt, wobei Wasser in das Nitrierungsmedium bei einer Konzentration von 0,5 M, in äquimolarer Konzentration zu dem Nitroniumion, eingeschlossen wurde.
Um die Anzahl eingeführter Funktionalitäten auszüwerten, wurde die Elektronenspektroskopie für die chemische Analyse angewandt. Anstatt ein Protein mittels eines Tyrosins kovalent zu verknüpfen wurde der Farbstoff 3,6-Disulfönatnaphtol-l verwendet. In dieser Analyse wird die Oberfläche mit weichen Röntgenstrahlen bestrahlt, wobei die ausgestoßenen Elektronen eine Funktion der Art des von dem Röntgenstrahl getroffenen Atoms sind. Die Anzahl von Elektronen einer gegebenen Energie reflektiert die Anzahl von Atomen eines gegebenen Typs.
Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse. Tabelle 1 ESCA-Analyse einer chemisch modifizierten geformten Polystyrol-Obertläche (100 Å Tiefe)
In der nächsten Untersuchung wird die Bindung von ³&sup5;S-Methionin-markiertem Avidin an aktivierte T25-Kolben bzw. -Flaschen verdeutlicht.
A. [³&sup5;S-met]-markiertes Avidin-t-boc-[³&sup5;S-Methionin]-N-succinimidylester (Amersham, 830 Ci/mmol), wurde verwendet, um die &epsi;-Aminogruppen von Lysinresten von Avidin unter Anwenden der Reaktionsbedingungen des Herstellers zu markieren. Das markierte Avidin wurde in einer Lösung von 10 mg/ml Avidin (Sigma) in 0,1 M Boratpuffer, pH 9,3, verdünnt, wodurch eine spezifische Endaktivität von 428 dpm/µg erhalten wurde.
B. Diazotierung von T-25-Flaschen mit Oberflächen-Anilingruppen und kovalentes Anheften von [³&sup5;S-met]-markiertem Avidin.
25 Flaschen wurden mit 5 ml 0,5 M Nitrotetrafluorborat in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,5 M Wasser in TMS bei 37ºC 16 Stunden lang nitriert. Nach Dekantieren des Reaktionsmediums und gründlichem Waschen mit destilliertem Wasser wurden 5 ml 1 M Zinn(II)-chlorid in 6 N HCl zugegeben und die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur voranschreiten gelassen. Die Flaschen wurden mit 0,01 N HCl gewaschen, um die Aminfunktionalisierte Oberfläche bereitzustellen.
Die Aminogruppen wurden dann durch Zugabe von 5 ml 2 % Natriumnitrit in kaltem (4ºC) 1 N HCl diazotiert, gefolgt von 20 Minuten langem sanftem Schütteln auf einem Plattformrotator bei 4ºC. Die resultierenden Diazonium-funktionalisierten Flaschen wurden mit kalter 0,01 N HCl gespült und 2,5 ml kaltes 10 mg/ml [³&sup5;S-met]-markiertes Avidin in 0,1 M Borat puffer, pH 9,3, wurden zugegeben. Nach 16 Stunden langem sanften Schütteln bei 4ºC wurde der Flascheninhalt abgesaugt, und die Flaschen wurden mit 0,1 M Boratpuffer bei Raumtemperatur gespült, bis die Gesamtzählimpulse in der Waschlösung unter 2000 dpm lagen. Etwa 3 von 4 Untereinheiten des gebundenen Avidins wurden durch 48 Stunden lange Behandlung mit 2,5 ml 6 % Natriumdodecylsulfat (SDS) / 0,1 M Dithiothreitol (DTT) bei Raumtemperatur entfernt. Basierend auf den in dem SDS/DTT-Eluat gewonnenen dpm und der spezifischen Aktivität des [³&sup5;S-met]-markierten Avidins wurde die Menge des kovalent an die aktivierte T25-Flasche gebundenen Avidins berechhet. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2 Quantifizierung der Immobilisierung von ³&sup5;S-Avidin auf aktivierter Polystyroloberfläche
¹Nicht-kovalent gebundene Untereinheiten von tetramerem ³&sup5;S-Avidin wurden durch 16 Stunden lange Behandlung mit 6 % SDS/0, 1 M DTT freigesetzt.
Ein Avidinmolekül bedeckt etwa 4000 Å² = 4 X 10&supmin;¹³ cm²
In der nächsten Untersuchung wurde Polyglutaraldehyd als die Brückengruppe verwendet.
Polyglutaraldehyd (PG) wurde gemäß dem Verfahren von Rembaum et al., J. Immun. Methods (1978) 24: 239 hergestellt. Das Produkt wurde bei 90º vakuumgetrocknet, um die Dehydratation zu vervollständigen und restliches monomeres Glutaraldehyd zu entfernen. Das getrocknete PG wurde in trockenem TMS bei 37ºC gelöst, um eine Lösung von 10 mg/ml zu erhalten. In Amin-funktionalisierte T-25-Flaschen wurden 5 ml der TMS-Lösung gegeben, und die Flaschen wurden bei 37ºC 16 Stunden lang inkubiert. Nach Spülen mit warmem TMS und destilliertem Wasser wurden 2,5 ml [³&sup5;S-met]-markiertes Avidin in 0,1 M Boratpuffer, pH 9,3, zugegeben, und die Flaschen wurden 16 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach gründlichem Waschen mit 0,1 M Boratpuffer, pH 9,3, wurden [³&sup5;S-met]-markierte Avidinuntereinheiten mit 6 % SDS/0, 1 M DTT wie zuvor beschrieben freigesetzt, und eine Zählung der Radioaktivität vorgenommen. Die berechnete Menge des gebundenen Avidins in der PGbehandelten Flasche ist in der obenstehenden Tabelle ersichtlich.
Das obenstehende Experiment wurde unter Verwendung von [³&sup5;S-Methionin] anstelle von Avidin wiederholt. Die Polyglutaraldehyd-derivatisierten Kolben wurden mit 5 ml 0,1 M [³&sup5;S- Methionin] und 238 dpm/mmol, hergestellt aus [³&sup5;S-Methionin (Amersham), 1250 Ci/mmol] unter Verdünnung in "kaltem" 0,1 M Methionin in 0,1 M NaHCl&sub3; bei 37ºC 16 Stunden lang inkubiert. Nach Waschen mit 0,5 M NaCl wurden die Flaschen mit destilliertem Wasser gespült, getrocknet und zerbrochen. Die Flaschenbodenstücke wurden gesammelt, gewogen und ausgezählt. Aus dem bekannten Gewicht des Flaschenbodens (3,2 g/25 cm²), der spezifischen Aktivität des [³&sup5;S-Methionin] und den gewonnen Zähleinheiten wurde die Menge des kovalent an den Flaschenboden gebundenen Methionins als 43 nmol/cm² berechnet.
Die nächste Untersuchung beinhaltete die Anwendung von Immulon2-Platten (Dynatech).
Eine Lösung von Nitroniumtetrafluorborat (Fluka, 0,5 M) in Tetramethylensulfon (TMS, Phillips) wurde hergestellt und auf 0,9 % H&sub2;O gebracht. Die Lösung wurde über ein Transtar 96 (Costar)-Abgabesystem innerhalb einer mit einer Drierite-Trocknungssäule und einem Umwälzgebläse ausgestatteten Handschuh-Box auf die Dynatech-Immulon2-Platten mit 96 Vertiefungen gegeben. Für jede Vertiefung der Platte wurden 100 µl der TMS-Lösung zugegeben, und die Platte wurde mit einem Klebstoff-unterschichteten Celluloseacetatdeckel (Dynatech) verschlossen und 6 Stunden lang bei 37ºC unter sanftem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Plattenverschluß entfernt und die nitrierende Lösung wurde ablaufen gelassen, gefolgt von Waschen mit reichlichen Mengen an H&sub2;O.
Die vorstehend hergestellte nitrierte Platte wurde trockengeschüttelt, und in jede Vertiefung wurden 200 µl 1,0 M SnCl&sub2; in 6 N HCl zugegeben. Die Platte wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt und mit reichlichen Mengen an H&sub2;O gewaschen. Die Platten konnten bei 4ºC über 0,2 N HCl (200 µl/Vertiefung) aufbewahrt oder direkt nach der H&sub2;O-Waschung eingesetzt werden.
Die derivatisierte Aminplatte wurde trockengeschüttelt und auf 4ºC gekühlt. Eine Lösung von 2 % NaNO in 1 N HCl wurde bei 4ºC hergestellt (unter Bildung schädlicher Gerüche), und 200 µl dieser Lösung wurden den Platten mit 96 Vertiefungen zugegeben. Nach 30 Minuten langem Schütteln bei 4ºC wurde die Platte trockengeschüttelt, mit kaltem (4ºC) 0,01 N HCl gespült und mit verschiedenen Proteinbeschichtungslösungen behandelt.
³&sup5;S-markiertes menschliches IgG (Sigma) in 0,1 M Borat (Na+), pH 9,2, wurde in Verdün nungen von 10, 1,0, 0,1 und 0,01 mg/ml hergestellt. Die Lösungen von 1,0, 0,1 und 0,01 mg/ml wurden auch mit Vorhandensein von 0,2 % Tween 20 hergestellt. Die zuvor beschriebene derivatisierte Diazoniumplatte wurde unmittelbar nach der Herstellung mit den Proteinlösungen bei 4ºC behandelt. Auf genau die gleiche Weise wurde ebenfalls eine nichtderivatisierte Immulon2-Platte bei 4ºC beschichtet. Nach einer 96 Stunden langen Inkubation wurde die überschüssige Beschichtungslösung von den Platten entfernt und die Vertiefungen wurden mit PBS (7 x 15 ml) über den Verlauf von 48 Stunden bei 4ºC gespült. Die Vertiefungen wurden in Szintillationsfiüssigkeit gebracht und ausgezänlt. Die folgende Tabelle 3 stellt die Ergebnisse dar. Tabelle 3 Bindung von ³&sup5;S-markiertem humanem IGG an Dynatech-Immulon2- und diazotierte Immulon2-Mikrotiterplatten
a Oberflächenbereich in einer Mikrotitervertiefung ist 1,264 cm²
Die nächste Untersuchung beinhaltete die Bindung eines Immunoglobulins an eine aminofunktionalisierte Polystyroloberfläche über die Verwendung von Hydrazon-Verknüpfungen.
Dem Verfahren von O'Shannessy et al., Immunol. Lett. (1985) 8: 273-277, folgend wurde eine 2 mg/ml IgG-Lösung (mono- oder polyklonal) in 0,1 M Acetat (Na+), pH 5,5, auf 4ºC gekühlt. Die Lösung wurde mit einer angemessenen Menge von 0,25 M NaIO&sub4; in H&sub2;O behandelt, um die IO&sub4;--Gesamtkonzentration auf 10 mM zu bringen, und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 4ºC sanft geschüttelt. Das Rohprodukt wurde durch eine G-10-Rotationsbzw. Zentrifugationssäule (0,1 M Acetat, pH 5,5) (10 ml Bettvolumen/ 1 ml Reaktionsgemisch) gereinigt. Das Leervolumen enthält typischerweise 70 % des Originalproteins im gleichen Volumen. Die Aldehydlösungen wurden sofort verwendet, um eine Oxidierung zur Säure zu verhindern.
Zu der obenstehend beschriebenen oxidierten IGG-Lösung wurde ausreichend Weinsäuredihydrazid (Lutter et al FEBS Lett. (1974) 48: 288-292) zugegeben, um die Konzentration an Weinsäuredihydrazid auf 0,5 M zu bringen. Nach 30 Minuten unter Schütteln wurde die Lösung klar. Die Reaktion wurde nach 2 Stunden durch Passieren der Lösung durch eine G10- Rotationssäule (0,1 M Acetat, pH 5,5) (10 ml Bettvolumen/ 1 ml Reaktionsgemisch) angehalten, gefolgt von einer Dialyse bei 4ºC (0,1 M Acetat, pH 5,5, 11 während 8 Stunden und 2 1 während 8 Stunden). Die endgültige Reinigung wurde mit einer G1 0-Rotationssäule (0,1 M Acetat, pH 5,5) (10 ml Bettvolumen/ 1 ml dialysierte Lösung) errreicht. Man stellte fest, daß das Leervolumen 50 % des ursprünglichen oxidierten Proteins mit einem etwas größeren Volumen enthielt. Die Lösung wurde auf 0,1 mglml (A²&sup8;&sup0; = 0,160) verdünnt und verwendet, um die Aldehydoberfläche zu beschichten (siehe unten).
Eine Lösung von 0,25 Terephthalaldehyd in Eisessig wurde einer wie obenstehend beschrieben hergestellten Aminopolystyrol-Oberfläche (0,15 ml/cm²) ausgesetzt. Die Reaktion fand 2 Stunden lang bei Raumtemperatur statt. Die Lösung wurde dann entfernt und die Oberfläche 15 Minuten lang mit absolutem Ethanol (1 ml/cm²), insgesamt 6mal, gewaschen. Die Oberfläche ergab einen positiven Schiff-Test. Nach einmaligem Spülen mit Puffer (1 ml/cm², 0,1 M Acetat, pH 5,5) wurde die Oberfläche unverzüglich mit dem IgG-Hydrazid behandelt.
Das IgG-Hydrazid (0,1 mg/ml, 0,1 M Acetat, pH 5,5) wurde durch 14 Stunden langes sanftes Schütteln oder Rollen bei Raumtemperatur auf die zuvor hergestellte Aldehydoberfläche aulbeschichtet (0,10 ml/cm²). Die Proteindepletion konnte durch die Verminderung der Absorption des IgG-Hydrazids bei 224 nm verfolgt werden. Die Oberfläche wurde 5mal mit PBS gespült (1 ml/cm²) und bis zum Bedarf bei 4ºC aufbewahrt.

Alternative Vorgehensweise

Eine 0,5 M Lösung von Weinsäuredihydrazid in 0%iger wäßriger Essigsäure wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur auf die zuvor hergestellte Aldehydoberfläche aufbeschichtet (0,15 ml/cm²). Die Lösung wurde ablaufen gelassen, und die Oberfläche wurde mit reichlichen Mengen H&sub2;O gewaschen.
Eine 0,1 mg/ml Lösung von oxidiertem IGG in 0,1 M Acetat, pH 5,5, wurde auf die zuvor hergestellte Aldehyd/Hydrazid-Oberfläche durch 18 Stunden lange Inkubation unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur aufbeschichtet (0,10 ml/cm²). Die Lösung wurde ablaufen gelassen, und die Oberfläche wurde 5mal mit PBS (1 mi/cm²) gewaschen und bis zum Bedarf bei 4ºC aufbewahrt.
In der nächsten Untersuchung wurden Polystyrolkügeichen mit Immunoglobulin funktionalisiert.
Unter Befolgen des zuvor beschriebenen Vorgehens wurden Polystyrolkügelchen (Durchmesser 1/4 und 1/8 Inch, spiegelnde Oberflächenbeschaffenheit) aminfunktionalisiert. Ein Teil der Kügelchen wurde diazotiert, und 3 Gruppen von Kügelchen, unbehandelt, aminfunktionalisiert und diazotiert, wurden 16 Stunden lang bei 4ºC mit 10 mg/ml [³&sup5;S-met]-markiertem humanen IgG [35 S-IgG] in 0,1 M Boratpuffer, pH 9,2, inkübiert. Nach der Reaktion wurden die [³&sup5;S-IgG]-markierten Kügelchen bei 4ºC erschöpfend mit 0,5 M NaCl enthaltendem 0,1 M Boratpuffer, pH 9,2, gewaschen. Das Waschen wurde fortgesetzt, bis die die Gesamt- Waschzähleinheiten pro 2 Stunden Waschgang unter 200 dpm für unbehandelte Kügelchen und 2000 dpm für diazotierte Kügelchen fielen. Die Menge an [³&sup5;S-IgG], spezifische Aktivität 1,48 dpm/mg, wurde durch Auszählen der Kügelchen direkt in Opti-Fluor (Packard) ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Tabelle 4 Bindung von ³&sup5;S-IgG an aktivierte Polystyrolkügelchen
*1 in.=2,54cm
In der nächsten Untersuchung wurden Antikörper an amintunktionalisierte T-25-Flaschen gebunden, welche hohe Spiegel an verfügbaren Bindungsstellen bereitstellten.
In einer T-25-Flasche wurden 50 mg p-Formylbenzoesäure (FBA) und 450 mg Tosylat-Ncyclohexyl-N'-(N"-methylmorpholino-2-ethyl)-carbodiimid in 10 ml TMS vereinigt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang ultraschallbehandelt. Die FBA-funktionalisierten Flaschen wurden mit Bernsteinsäuredihydrazid (0,2 M) in Eisessig 2 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Plattformschüttler kontaktiert. Die Flaschen wurden dann 5mal mit destilliertem Wasser, 3mal mit 0,1 M Boratpuffer, pH 9,2, 3mal mit destilliertem Wasser, 3mal mit Isopropanol und 3mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Flaschen wurden mit Acetat- Puffer (0,1 M, pH 5,5) bei Raumtemperatur bis zur Verwendung aufbewahrt.
Monoklonaler Anti-Leu 1-Antikörper wurde wie obenstehend beschrieben oxidiert und konjugiert, um das Hydrazon wie obenstehend beschrieben zu bilden. Die resultierenden Anti-Leu-1-konjugierten Flaschen wurden dann in der folgenden Untersuchung verwendet.
An Monocyten verarmte periphere Blut-Lymphocyten (PBL) wurden wie folgend aus menschlichem Blut präpariert. "Buffy coat"-Zellen wurden zu 75 mi HBSS-E ("Hank's Balanced Salt Solution" mit 1 mM EDTA) gegeben und gut vermischt. Die Blut-HBSS-E-Lösung wurde dann in 4 Aliquots geteilt und in 50 cm³ große klinische Zentrifugenröhrchen gebracht. Die Lösung wurde mit etwa 14 mi vorgewärmtem Histopaque unterschichtet. Die Zellen wurden 30 Minuten lang bei 1500 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert (J6B6-Zentrifuge). Die Grenzschicht wurde abgenommen und die Zellen einmal mit HBSS-E gewaschen. Nach 1 Ominütiger Zentrifugation bei 1000 Upm bei Raumtemperatur wurde der Uberstand abgesaugt, und die Zellen wurden gekühlt. Die Zellen wurden dann 2 weitere Male gewaschen, dann in HBSS-CMF (Hank's; calcium- und magnesiumfrei) plus 1 % Serum ohne EDTA resuspendiert und dann in T-75-Flaschen überführt. Die Flaschen wurde auf ihren Seitenflächen 30 Minuten lang bei 37ºC inkübiert, um den Monocyten die Adhäsion an die Obertläche zu gestatten. Nach 30 Minuten wurden die nicht-adhärierenden Zellen durch sanftes Schwenken des Inhalts der Flaschen entfernt. Die Flaschen wurden zweimal mit HBSS-CMF gewaschen und die nicht-adhärierenden Zellen durch 10minütige Zentrifugation bei 1000 Upm bei Raumtemperatur abgesammelt. Die Zellen wurden dann in HBSS-E mit 1 % Serum resuspendiert. Die Zellen wurden danach in T-25-Flaschen eingesetzt, und zwar 2,5 x 10&sup7; Zeilen pro Flasche. Die Flaschen wurden auf ihren Seitenflächen 1 bis 2 Stunden lang bei Raumtemperatur bei sanftem Schwenken der Zellsuspension in 20- bis 30-Minuten-Intervallen inkubiert. Am Ende der Inkübationsdauer wurde die nicht-adhärierende Zellsuspension entfernt und die Flasche dreimal mit HBSS-E gewaschen, um verbleibende nicht-adhärierende Zellen zu entfernen.
Nach 1,5 Stunden langer Inkübation bei Raumtemperatur mit der wie obenstehend hergestellten Anti-Leu-1-Oberfläche unter alle 20 Minuten stattfindendem Mischen wurden nichtadhärierende Zellen für die Färbung wiedergewonnen. Adhärente Zellen wurden gezänlt. 25 x 10&sup6; wurden bei 99 % Lebensfahigkeit eingeführt. 20 x 106 Zellen wurden an die Flaschen gebunden. Die nicht-adhärenten Zellen wurden durch Fluoreszenz-aktiviertes Zeilsortieren (FACS) analysiert, was eine Depletion um 98,7 % bzw. 95 % von Leu-1- bzw. Leu-4-positiven Zellen zeigte. Nach Elution mit 4 mM Magnesiumchlorid wurden einige der Flaschen mit 20 x 10&sup6; PBL (Monocyten-depletiert) wiederverwendet Es wurde eine Depletion um 99 % und 91 % von Leu-1- und Leu-4-positiven Zellen erreicht.
Aus den obenstehenden Ergebnissen ist es offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung eine wesentliche Verbesserung gegenüber zuvor verfügbaren festen Substraten, insbesondere z.B. wie Behälter, Objektträger, Kügelchen oder Vertiefungen, zur Verfügung stellt. Durch Anwendung der beschriebenen Verfahren können hohe Konzentrationen von Substanzen auf die Oberfläche in einer nicht-diffüsorischen Art aufgebracht werden, um das Zurückhalten der Substanzen auf der Oberfläche zu gewährleisten. So können kleine Volumina für eine hohe Wirksamkeit und Empfindlichkeit bei der Bestimmung oder Isolierung einer breiten Vielzahl von Verbindungen von Interesse eingesetzt werden. Die Aminofunktionalität ist eine sehr vielseitige Funktionalität, so daß verhältnismäßig einfache Vorgehensweisen zur Verknüpfung verschiedener Funktionalitäten an die Oberfläche, entweder direkt oder über einen Abstandshalterarm, entwickelt werden können. Dank der Fähigkeit, eine hohe Klarheit zu erzielen, können Reaktionen beobachtet werden, kann Zellwachstum beobachtet werden und kann durch die Oberfläche hindurch transmittiert und gemessen werden, was eine größere Effizienz und Empfindlichkeit ermöglicht. Darüber hinaus können gewünschte Orientierungen von Liganden und Rezeptoren erzielt werden, um hohe Spiegel von Epitopen und Bindungsstellen bereitzustellen.
Aus den obenstehenden Ergebnissen ist offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung wesentlich verbesserte feste Substrate zum Einsatz in einer breiten Vielzahl von Anwendungen zur Verfügung stellt. Ein hoher Anteil der auf der Oberfläche vorhandenen verfügbaren Arylgruppen kann funktionalisiert werden, so daß eine große Zahl von Komponenten von Interesse entweder kovalent oder nicht-kovalent an die Oberfläche gebunden werden kann, um feste Oberflächen mit einem hohen Grad an Funktionalisierung bereitzustellen. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von diagnostischen, therapeutischen oder verarbeitenden Verfahren mit größerer Effizienz unter Verwendung kleiner Volumina und mit verbesserten Ergebnissen durchgeführt werden.
Anzahl von Atomen

Claims

1. Verfahren zur Funktionalisierung eines festen Substrates, umfassend additionspolymerisierte aromatische Monomere, worin die Oberflächen des polymeren Substrates in hohem Maße funktionalisiert werden und worin das resultierende funktionalisierte Substrat optisch klar ist, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

Kontaktieren der Oberflächen des polymeren Substrates mit einem substituierenden elektrophilen Mittel, das mit einem Anion koordiniert ist, welches in einem Lösungsmittel Ionisation aufzeigt, so daß das elektrophile Mittel ein Kation ist, und wobei das polymere Substrat weder in dem Lösungsmittel löslich ist noch darin gequollen vorliegt, so daß eine Funktionalisierung der Arylgruppen an der Oberfläche mit dem Kation bewirkt wird, wobei das Lösungsmittel ferner eine oxypolare Verbindung enthält, die fähig ist, sowohl das Anion als auch das Lösungsmittel von einer Koordination mit dem Kation des elektrophilen Mittels zu verdrängen, und wobei die oxypolare Verbindung in einem Molverhältnis zum Kation des elektrophilen Mittels zwischen 0,05 und 1 vorliegt.

2. Artikel, erhältlich durch das Verfahren von Anspruch 1, wobei mindestens 5 % der Arylgruppen bis zu einer Tiefe von 100 A, wie bestimmt durch Elektronenspektroskopie zur chemischen Analyse (ESCA), mit dem elektrophilen Mittel funktionalisiert sind, und die restlichen Arylgruppen im wesentlichen nicht substituiert sind.

3. Artikel von Anspruch 2, worin mindestens 25 % der Arylgruppen bis zu einer Tiefe von 100 Å mit dem elektrophilen Mittel substituiert sind.

4. Artikel von Anspruch 3, worin mindestens 100 % der Arylgruppen bis zu einer Tiefe von 100 Å mit dem elektrophilen Mittel substituiert sind.

5. Artikel von Anspruch 4, wobei es sich bei dem Polyaryladditionspolymer um Polystyrol handelt.

6. Artikel von mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das elektrophile Mittel in eine polare Gruppe umgewandelt worden ist.

7. Artikel von Anspruch 6, worin ein Ligand, Rezeptor oder eine Nukleinsäure kovalent direkt oder über einen Abstandshalterarm an die polare Gruppe gebunden ist.

8. Artikel von Anspruch 7, wobei der Ligand, Rezeptor oder die Nukleinsäure ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ist.

9. Verfahren zum Nachweis oder zur Entfernung eines Analyten aus einer Probe, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer den Analyten enthaltenden Probe mit einem Artikel von Anspruch 8, wobei der Analyt fähig ist, an das spezifische Bindungspaarmitglied gebunden zu werden, und das Nachweisen oder Rückgewinnen des an den Artikel gebundenen Analyten umfaßt.

10. Verfahren von Anspruch 9, wobei der Analyt eine Zelle oder ein Mikroorganismus ist.

11. Verfahren von Anspruch 9, wobei der Analyt ein Arzneimittel, ein Schmutzstoff bzw. Umweltschadstoff, ein Effektormolekül, ein Wachstumsfaktor, ein Lymphokin, eine Amino säure, ein Oligopeptid, ein chemisches Intermediat, ein Nukleotid oder ein Oligonukleotid ist.