DE2042976B2

DE2042976B2 - Verfahren zum Herstellen stabilisierter, weitgehend wasserlöslicher Antigen- und Antikörperpräparate

Info

Publication number: DE2042976B2
Application number: DE2042976A
Authority: DE
Inventors: Howard Hayyin Elmira N.Y. Weetall (V.St.A.)
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1969-09-04
Filing date: 1970-08-29
Publication date: 1979-11-22
Also published as: BE755775A; NL7013059A; DE2042976A1; US3652761A; JPS5011448B1; GB1288328A; CA955523A; AT309675B; FR2060904A5

Description

aufweist, in der Y' ein Amino, Carbonyl, Carboxy, lsocyano, Diazo, Isothiocyano, Nitroso, Sulfhydryl oder Halogencarbonylgruppe, R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halogen, R' >o einen Rest der Gruppe niederes Alkyl, niederes Alkylphenyl und Phenyl bezeichnet und η einen ganzzahligen Wert von 1—3 darstellt, wobei der Siliziumanteil des Silanrnoleküls an den Träger und sein organischer Teil an das Antigen oder den 2-, Antikörper gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silan zunächst an den Träger und sodann das Antigen oder der Antikörper an den Träger-Silankomplex gebunden wird. to

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen stabilisierter, weitgehend wasserlöslicher, über ein Silan an einen anorganischen Träger gebundene Antigen- und Antikörperpräparate.

Die Isolierung und Reinigung von Antikörpern ist Voraussetzung des Studiums ihrer Struktur und Synthese, besonders wenn die Antikörper für bestimmte Antigene untersucht werden sollen. Die zur Isolierung verwendbaren Methoden sind auch zu ihrem Nachweis geeignet. Dies ist besonders in der diagnostischen Medizin, der analytischen Biochemie und verwandten Gebieten von Interesse.

Für die Isolierung und Reinigung stehen bisher im wesentlichen zwei Methoden zur Verfügung. Die physikalischen Verfahren trennen die Moleküle nach ihren physikalischen Eigenschaften, wie z. B. Molekülgewicht, isoelekirischem Punkt, elektrophoreiischer Mobilität und Lösbarkeit in verschiedenen Lösungssystemen. Dabei werden einander ähnliche Moleküle ohne Rücksicht auf ihre spezifischen immunologischen Eigenschaften zusammen isoliert.

Die immunologischen Verfahren basieren auf der allen Antikörpern gemeinsamen Fähigkeit der Umsetzung mit bestimmten Antigenen. Wird ι. B. ein Antigen einem einen bestimmten Antikörper enthaltenden Serum /ugesct/.t, so erfolgt eine Komplcxbildung und Ausfällung von Antigen und Antikörper aus der Lösung: Antigen f Antikörper = Antigen-Antikörper-Komplex.

Nach der Trennung kann das Antigen durch enzyrnatische Aufschließung (z. B. im Falle von Kohlc-(lydrat-Antigenen)oder bei hinreichender Unterschiedlichkeit der Moleküle durch physikalische Trennung isoliert werden. Nachteilig hierbei ist aber, daß sich eine völlige Trennung von Antigen und Antikörper mit Sicherheit nicht erzielen läßt. Obwohl Reinheiten von mehr als 50% an sich möglich sind, verbleibt immer ein Antigenrest

Zur Behebung dieses Nachteils schlägt Campbell (u. a.), Proc, Nat'L Acad. ScL (U. S.) 37,575(1951) vor, das Antigen vor der Umsetzung mit dem Antikörper im Serum an unlösliche Polymere kovalent zu binden, so daß das isolierte Antikörperpräparat keine Antigenreste mehr enthält

Seit dieser Untersuchung von Immunoadsorbentien sind bereits mehrere Polymere als Antigenträger zur Verwendung gelangt, z. B. Zellulose und seine Derivate, Polyaminopolystyrol, Dextrane und Polyaminosäuren. Jeder dieser Träger hat seine eigenen Nachteile, die sich unter den Folgenden Gesichtspunkten zusammenfassen lassen:

(a) Unspezifische Adsorption und Ev.-tion

Bei der Isolierung spezifischer Antikörper hängt die Reinheit von zwei Hauptfaktoren ab, nämlich einmal der Menge des bei der Isolierung mit dem Gegenkörper freiwerdenden, zuvor aus dem Serum auf dem Träger adsorbierten unspezifischen Proteins und zum anderen der Fähigkeit des immunoadsorbitrenden Mittels zum Zurückhalten und Freisetzen des Antikörpers. So ergibt z. B. eine über eine Azo-Verkettung an ein Protein gebundene 1-g-Säule von p-Aminobenzylzellulose etwa 0,2 mg unspezifisches Protein pro ml von durch die Säule geleitetem Serum. Enthält das Serum also 1 mg spezifische Antikörper pro ml, so beträgt die erreichbare theoretische Reinheit maximal 1 mg Antikörper pro 1,2 mg isoliertes Protein oder 83,4%. Werden dagegen 0,01 mg unspezifisches Protein pro ml Serum frei, so ist eine theoretische Reinheit von 99% (I mg Antikörper pro 1,01 mg isoliertes Protein) möglich. Kapazität ist der zweite wichtige Faktor. Die Kapazität von p-Aminobenzylzellulose i z. B. etwa 100 mg Antikörper/g, die von Carboxymethyizeliulose weniger als 15 mg/g.

(b) Durchfluß

Da der Einsatz in Säulen erfolgt und organische Polymere in alkalischen Lösungen quellen, wird der Durchfluß häufig beeinträchtigt, bei Zellulosederivaten sogar soweit, daß eine Verwendung ausscheidet.

(c) Wirkungsgrad

Das heißt, der Prozentsatz der von dem insgesamt aufgegebenen Antikörperzusatz vom Adsorbierungsmittel zurückgehalten wird ist zu hoch.

(d) Lebensdauer und Ausbeute

Als Ausbeute wird bei immunoadsorbierenden Präparaten die Zahl der wiederholten Verwendbarkeit bezeichnet. Sie richtet sich nach dem Prozentsatz des Anlikörperkomplexes der freigesetzt wird und Stellen zur erneuten Verwendung frei macht. Bei nicht umkehrbarer Komplexbildung ist die Ausbeute niedrig und die Lebensdauer kurz. Als weiterer Nachteil tritt oft eine Fraktionierung des Antikörpers auf, wenn nur ein Teil des Antikörperkomplexes frei wird. Dies ist besonders bei Zellulosederivaten und Polystyrolen der Fall, bei Polystyrol werden z.B. )O-45% Antikörper frei, bei Zellulosederivaten 25% (p-Aminobenzylzellulose) bis 78 - 100% (Carboxymethylcellulose).

(e) Biologische Aktivität

Durch Bindung an den Träger kann eine Denaturierung und/oder ein Verlust der biologischen Aktivität des

Antigens oder Antikörpers eintreten.

Die bisher bekannten Antikörperpräparate leiden also an den Nachteilen niedriger Kapazität und Ausbeute, begrenzter Wiederverwendbarkeit und zu kurzer Aktivität, falls keine Gefriertrocknung vorgenommen wird. Es war daher Aufgabe der Erfindung, diese Nachteile zu vermeiden.

ErfindungsgemäQ wurde diese Aufgabe durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst

Antigene stimulieren die Bildung der Antikörper im lebenden Organismus und reagieren mit dem Antikörper in feststellbarer Weise. Ihr Molekülgewicht liegt meist bei 10 000 oder höher. Als Hapten bezeichnet man einen Teil eines Antigens oder eine chemische Verbindung, die zwar nicht fähig zur Antikörperbildung ist, aber mit diesem reagiert Antigene bestehen z. B. aus Proteinen, Bakterien, Blutgruppenantigenen (Proteine und Lipide), Viren, konjugierten und synthetischen Antigenen, Polypeptiden, Nukleinsäuren u. a. m. (vgl. P. L Carpenter, J.Trnunology and Serology, 2. Auflage, >o 19681

Bei Injektion von Antigenen in einen Organismus erzeugt dieser mit den Antigenen reagierende und diese neutralisierende, spezifische Antikörper. Antikörper gehören zu den Proteinen mit der Löslichkeit von >5 Globulinen und der elektrophoretischen Mobilität von Gamma-Globulin. Ihr Molekülgewicht fällt hauptsächlich in die beiden Gruppen der normalen Globuline mit 160 000 und der Makroglobuline mit 1000 000. Der Typus mit niedrigerem Molekülgewicht ist vorwiegend jo im Organismus von Lebewesen (Mensch und Tier) anzutreffen. Schwere Antikörper lassen sich durch Impfung mit Pneumokokkv.n im Körper von Pferden, Kühen und Schweinen so*, ie im Kaninchen durch Impfung mit roten Blutkörpern vo<: Schaf erzeugen. Γι Die menschlichen Isohämagglutinine und verschiedene andere sind hauptsächlich oder gänzlich Makroglobuline. Das Molekülgewicht von Antikörpern unterscheidet sich nicht wesentlich vom Molekülgewicht von Globuli.-nen in normalen Seren der verschiedenen Spezies,
besonderer Bedeutung sind die Gamma-Globuline. Sie bestehen aus einer ununterbrochenen Reihe von Proteinen verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften und einander überschneidenden biologi-. scher Aktivität Sie zeigen starke Unterschiede in der elektrophoretischen Mobilität, werden über einen breiten Bereich von Elektrolytkonzentrationen ausgesetzt, ergeben zahlreiche Fraktionen bei der Alkoholausfällung und besitzen Ablagerungskonstanten von 7 S bis 20 S (S=Svedberg-Einheiten).

Als Träger dienen verfügbare Oxid- oder Hydroxidgruppen aufweisende anorganische Substanzen, die weitgehend wasserunlöslich und schwache Säuren und Basen sind. Sie können nach- ihrer chemischen Zusammensetzung in siliziumhaltige Substanzen und nichtsiliziumhaltige Metalloxide eingeteilt werden. Als siliziumhaltige Träger kommt vorzugsweise Glas in Betracht, entweder in Form von Feststoffpartikeln oder als selbsttragendes Stück, wie z. B. als Scheibe oder Zylinder. Glas hat den Vorteil, daß es in seiner Abmessung stabil ist und beispielsweise durch Sterilisieren gründlich gereinigt werden kann. Als Träger geeignetes poröses Glas ist ohne weiteres verfügbar und bei Corning Glass Works unter der Codebezeichnung 7930 erhältlich. Oerartiges poröses Glas kann mit verschiedenen Porendurchmessern, z. B. nach dem US-Patent 21 06 774 oder dem französischen Patent 15 34 990 hergestellt werden. Andere geeignete anorganische Träger sind kolloidale Kieselerde (S1O2), ferner Wollastonit, ein in der Natur vorkommendes Ca-Silikat, sowie getrocknetes Silikagel, Bentonit usf. Typische nichtsiliziumhaltige Metalloxide sind z. B. Aluminiumoxid, Hydroxyapatit und Nickeloxid. Die in Frage kommenden anorganischen Träger lassen sich entsprechend der folgenden Tabelle zusammenfassen:

Siliciumhaltig	Kristallin	Nichtsiliziumhaltige Metalloxide	Basisches MeO
	ßentonit	Übergangsmetalle	Hydroxy
Amorph	Wollastonit	MeO Saures MeO	Apatit
Glas		NiO AI₂O₃
Silikügel
Kieselsäurekolloid

Die als Kupplungsmittel dienenden Silane sind Moleküle mit zweifacher, verschiedener Reaktivität. Es handelt sich um organisch-funktionelle und siliziumfunktionelle Siliziumverbindungen, deren Siliziumteil eine Affinität für anorganische Substanzen, z. B. Glas oder Aluminiumsilikate und deren organischer Teil eine Affinität für organische Verbindungen besitzt. Hauptaufgabe des Kupplungsmittels ist, das Antigen oder den Antikörper als organische Substanz mit dem Träger als anorganischer Substanz zu kuppeln. Theoretisch ist die mögliche Vielzahl der verwendbaren organisth-funktionellen Silane nur durch die Zahl der bekannten organisch-funktionellen Gruppen und der zur Bindung verfügbaren Stellen am Antigen- oder Antikörper-Molekül begrenzt. Als Kupplungsmittel kommen die zahlreichen Silane der folgenden generellen Formel in Betracht:

In dieser Formel bezeichnet Y' eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, lsocyano. Diazo, hothioeyano, Nitroso, Sulfhydryl, Halocarbonyl; R' einen Rest der Gruppe niedere? Alkoxy, Phenoxy, Halo; und «einen ganzzahligen Wert I - }.

Nach weiterer günsiiger Ausgestaltung ist das Kupplungsmittel durch die generelle Formel

Y_nSiR, „

gekennzeichnet, in der Y eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, I lydroxyphenyl und Sulfhy-

dryi, R ein Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halo, und η ein ganzzahliger Wert 1 -3 ist.

Die am leichtesten zugänglichen Kupplungsmittel besitzen die generelle Formel

RCH₂CH₂CH₂ - Si(OCH₃J₃,

in der R eine reaktive organische Gruppe darstellt, die so ausgebildet ist, daß sie der Reaktivität in dem jeweiligen System entspricht. Die möglichen Umsetzungen der organisch-funktionellen Gruppe können der Fachliteratur entnommen werden und bedürfen daher keiner näheren Erläuterung.

Einige wichtige typische Bindungen des Kupplungsmittels mit dem Antigen oder Antikörper seien beispielhaft aufgeführt.

Art der Bindung	Struktur der Bindung	Reaktive Gruppen Enzyme	Kupplungsmittel	S
Bindungstyp	O Il	-COOH	-NH,	-NH, + ClCCl
	Il —C—NH-	-NH,	—COOH
I. Amide	S jj		— N, + Cl
	—N—C-NH-	-NH₂	-R-X
2. Sulfonamide	OH
	—N=N-/j\|	Tyrosin Histidin Lysin	— ROH R-SII
3. Azobindung	R —O —R	—C-ONa
4. Äther	O
	Ii —C — O—R R—S —S —R	—COOH R-SH
5. Ester 6. Disulfid

Nach ^iner Ausführungsform der Erfindung sind die Kupplungsmittel aminofunktionelle Silane wie z.B. N-bela-Aminoäthyl-Gamma-Aminopropyltrimethoxysilan. N-Bela-Aminoälhyl-(Alpha-Methyl-Gamma-Aminopropyl)-Dimethoxymethylsilan oder Gamma-Aminopropyi-Triäthoxysilan. Das Kupplungsmittel wird auf das Glassubslrat aus einer LCsung aufgebracht. Als Lösungsmittel eignen sich hierfür nur die höher siedenden aromatischen und aliphatischen Lösungsmittel. Besonders geeignet sind Toluol, Benzol. Xylol und hoch siedende Kohlenwasserstoffe.

Obwohl die Silane auch in Alkohol und Wasser löslich sind, sollten diese Lösungsmittel vermieden werden, da sie eine gute Bindung beeinträchtigen. Vermieden werden sollten auch die Aldehyde. Ketone. Säuren. I.ster oder Alk>!chloride, da sie zur Umsetzung mit den Silancn neigen.

!!ei der Wahl der optimalen Kupplungsmittel müssen die aktiven Stillen sowie eine Neigung zur Dcnaturic rung des Anlikörpcrmolcküls berücksichtigt werden Auf Antigene trifft dies in dieser Allgemeinheit nicht zu. I)i< fiindiinp darf die Aktivität des Antikörpers nicht Ix einträchtige n Die Methode der Bindung und die All (U' KuppliiMj'smitttls müssen daher entsprechend (·( u älilt weiden. /.. l\ dutch liindung an die Tyrosil odet Sulfhydrylpriippe des Antikörpers. Audi soll die Itiiiduiig bei den AntiVöiper oder Iräpci niilil η !störenden Ί cm; iialui und pll-Werien iilolpcn können. Ferner soll die von dem jeweils verwendeten Kupplungsmittel weitgehend abhängende Art der Bindung unter den Einsatzbedingungen stabil sein. Diese Erfordernisse gelten auch weitgehend für Antigene.

Die Bindung des Antigens oder Antikörpers an den Träger erfolgt als zweistufige Umsetzung. Als erste Stufe wird das Kupplungsmittel an den Träger und als zweite Stufe das Antigen oder der Antikörper an das bereits mit dem Träger verbundene Kupplungsmittel gebunden. Die Menge des gekuppelten Antigens oder Antikörpers hangt offenbar von der zur Umsetzung verfügbaren Oberfläche des Trägers ab. Die Enzyinaktiviiät hängt dabei von nicht /ti scharfen Kupplungsbedingungen. nicht dagegen notwendigerweise von der Struktur der aktiven Stellen ab.

Der Träger wird zunächst gereinigt, um verschiedene, z. B. organische Verunreinigungen zu entfernen, die die verfügbaren Oxid oder 1 lydioxidpruppen besetzen. Die Art der Kcini ·ιιηρ liänpt bis zu einem gewissen Grade «im Träpei ab l'oiöses (ila<- wild /.Il in einer verdünnten Salpi lcisatMvlostiMp pcicinigf. mit deSt. Wassei abpcsptil! und in S.iue is!o1| ,ml etwa 625 eihil/l.

Beim l.insal/ des kupplungsmittel·· in 1 orm einei Lösung muH ir peeipnelei Weise die Umsetzung des Silizium I im \\ ionellen MnU \ fill ei Is en eich ι werden, ζ. Il durch lihilzi'ti dei Lösung auf M) 140 . Nach

bevorzugter Ausgestaltung wird das Silan in Toluol mil einer Konzentration von ca. 0,1 — 10 Gew.-% gelöst und der Träger mit der Lösung vorzugsweise im Rückfluß erhitzt, wobei das Toluol z.B. bei 105° siedet. Die Rückflußdauer beträgt 1 — 16 Std.. wobei 4 Ski. in der Regel genügen.

Nach Bindung des Kupplungsmittels an den Träger kann zur Bildung gewünschter Verbindungen der organisch-funktionelle Teil des Silans modifiziert werden. Die meisten Kupplungsmittel sind im Handel erhältlich, andere in bekannter Weise unschwer darstellbar. So kann /. B. das Diazoderivat aus j'-Aminopropyltriäthoxysilan nach Bindung an den Träger durch Umsetzung mit p-Nitrobcn/oesäurc, Reduktion der Nilrogruppe zum Amin und Dia/otierung mit salpetriger Säure hergestellt werden. Bei gleichem Ausgangsmaterial kann z. B. das Isothiocyanoalkylsilanderivat durch Umsetzung der funktioncllen Aminogruppe mit Thiophosgen hergestellt werden.

Zum Isolieren von Antigen oder Antikörper aus einer Lösung wird das Antigen oder der Antikörper mit dem organisch-funktionellen Teil des Silans umgesetzt. Die wässerige Antigen- oder Antikörpcrlösung wird dann mit dem behandelten Träger bei einer in der Regel unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur in Kontakt gebracht.

Nach einer Kontaktdauer von ca. 1 -72 Std. ist das Antigen oder der Antikörper an den Träger gebunden und ein etwaiger Überschuß wird entfernt. Wichtig dabei ist, den pH-Wert der Lösung in einem die irreversible Denaturierung des Antigens oder Antikörpers vermeidenden Bereich zu halten. Die Kupplungsrckation kann u.U. auch einen bestimmten pll-Bcreich nötig machen, da z. B. die Azobindung am besten bei pH 8-9 erfolgt Anschließend wird das gekuppelte Antigen oder der Antikörper an der Luft geirocknet. jedoch nicht bis zur Exsiccation, und gelagert. Die Lagerung kann auch in Wasser oder einer gepufferten Lösung bei oder unter Zimmertemperatur erfolgen.

Anhand der folgenden Beispiele sei die Erfindung erläutert:

Beispiel I

Eine Probe von porösem Glaspulver mit 96% Kieselsäuregehalt (35OÄ±5OÄ Porengrößc. 16m-7g Oberfläche) wurde in HNO₁. 0.2 N. bei 80" unter ständiger Schallbehandlung wenigstens 3 Std. lang gewaschen. Das Glas wurde mehrere Male mit dest. Wasser durch Abdekantieren nachgewaschen und dann über Nacht in Gegenwart von O> auf 625 erhitzt.

Das Glas wurde gekühlt und in eine Flasche mil rundem Boden gegeben. Je 2 g des Glases wurden 150 ml einer 10ⁿ/oigen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Toluol zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht im Rücklauf erhitzt und mit Azeton gewaschen. Das erhaltene Umsetzungsprodukt (nachfolgend als Aminoalkylsilanderivat bezeichnet) wurde an der Luft getrocknet und gelagert.

Das Aminoalkylsilanderivat wurde nun in 100 ml 10% Thiophosgen in Chloroform gegeben und mehrere Stunden im Rücklauf erhitzt. Das Produkt wurde gründlich in Chloroform gewaschen um Thiophosgenrückstände zu entfernen. Das Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde an der Luft getrocknet und sofort danach zur Bindung verwendet. Hierzu wurden 4 g zu 15 ml NaHCO. Lösung. pH 9. enthaltend 29 mg Serratia marcescens Immunogiobulin gegeben. Die Komponenten wurden 2 Std. bei Zimmertemperatur gerührt und dann gründlich mit dest. Wasser gewaschen. Das Produkt wurde bis zur Verwendung in dest. Wasser bei y aufbewahrt.
Zur Vornahme von Agglutinationsmessungen von

's Serratia marcescens mit unlöslich gemachtem iiiutiutioglobulin wurden eine Reihe von Ringobjektivträgerti präpariert. In jede von neun Mulden des Träger« wurden 0.05 ml von Verdünnungen des Organismus mil zunehmendem Logarithmus von 10¹VmI bis lOVml

in verdünnt in 0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7, gegeben. Jeder Probe wurden 0.05 ml des unlöslich gemachten Antikörpers in einer Suspension vor 15-17 mg Glas/ml in 1% NaCl zugesetzt. Die Umsctztingsteilnchmer wurden mit 180 Umdrehungen.

ι < Min. 15 Min. lang in einer klinischen Zentrifuge rotiert 10 Sek. lang auf einen Vibrator gestellt und mikrosko pisch mit 40maliger Vergrößerung untersucht.

Die Ergebnisse zeigen eine feststellbare Mindestzah von etwa 5x10* Organismen. Ersetzt man Serrati;

-¹" marcescens durch Salzlösung oder Bacillus subtilis odei die Immunoglobulinpartikel durch Glasteilchen, so trit keine Agglutination ein.

Der Versuch wurde 15 Tage später mit frischer Organismen und den gleichen, aber bei 5" gelagertei

:"' behandelten Glas mit gleichen Ergebnissen wiederholi Eine Erhöhung der Umsetzungsdauer erhöhte dii Empfindlichkeit nicht.

Die beschriebene Agglutination erfolgt über eini Komplexbiklung der gebundenen Antikörpermoleküli

in mit den Bakterienzellen, die dabei als Verkettungsniitte wirken, so daß viele Partikel zusammengeballt werden I ehlen die Bakterien, bzw. das Antigen, so können dii Partikel auch nicht zusammenballen oder agglutinieren Der Versuch zeigt also, daß die Glaspartikel durcl

Γι Behandlung mit bestimmten Antikörpern sensitivier wurden, und zum Nachweis spezifischer Antigeni geeignet sind.

Beispiel Il

ι 2 g des Amirioalkylsilanderivats von porösem GIa gemäß Beispiel I. aber mit 780 Ä± 50 A Porengröße wurden I g p-Nitrobenzoylchlorid in Chloroforn zugesetzt und 12 Std. im Rücklauf erhitzt. Da; Umsetzungsgut wurde gründlich in Chloroform gewä

4-, sehen, in 500 ml 5 g Natriumdithionit enthaltendes dest Wasser gegeben und 30 Min. erhitzt. Das p-Aminoben zoesäureamid des AminoalkyKilan-Glases (im folgen den mit Aminoarylsilanderivat bezeichnet) wurde mil dest. Wasser gewaschen, mit Azeton nachgewascher

mi und an der Luft getrocknet. Es wurde dann in 0.1 N HC durch Zusatz eines Überschusses von festem NaNO: be 0' diazotiert. Das als Diazoarylsilanderivat bezeichnen Produkt wurde 0,25 g menschlichem Gamma-Globulin (FiGG) zugesetzt. Die Umsetzung erfolgte über Nachi

ü bei 5°. Danach wurde das chemische gebundene Gamma-Globulin mit dest. Wasser gewaschen und bei Zimmertemperatur gelagert.

Eine Kolonne wurde mit 1 g HGG-Glas beschickt und in 1 % NaCl Lösung equilibriert. Es wurde 1 ml vom

wi Anti-FIGG-Serum vom Kaninchen zugesetzt, das Serum durch die Kolonne geleitet und mit 1% NaCI Lösung herausgewaschen. Der Ablauf wurde zur Bestimmung des Antikörpers gesammelt. Der mit dem HGG zum Komplex gebundene Antikörper wurde mit

b5 0.05 M Glyzin-HCl, pH 23 herausgewaschen und zut Bestimmung des Antikörpers gesammelt

Die Konzentration des Antikörpers wurde durch quantitative Ausfällungsanalyse entsprechend Kabat

Experimental lininunochemistry, 2. Auflage (I96I), vorgenommen, mit kaltem, 0,01 M boraigepufferter Salzlösung (BBS), pH 8 für die Wäschen. Der Proieingesamlgehalt wurde mit der Methode nach Lowry u. a„ ). Biol. Chem., 19J, 265 (1951) ermittelt. Die kovalent gebundene Proteinmenge betrug ohne Rücksicht auf die Bindungsmelhode bei allen Versuchen

10

14—18 mg/g Glas. Die Lagerung der Antikörper- oder Antigenpräparate für mehr als 90 Tage in 0,01 m boratgepufferter Salzlösung, pH 8, beeinträchtigte die Aktivität nicht.

Die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen sind in der Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I

Isolierung von Kaninchen-Anti-I ICiCi auf I IGG-Glaskoniposilum

Antikörper· /us.it/')	Antikörper im Ablauf	Gesamt-Anti- körper im Ivluat	Kolonnen- Wirkiingsgr.id^h)	Antikörper- Reinheit¹)	Gewonnener Antikörper von Kolonne
I nil, 1	Imul	ί mil)	('%)	(%)	(''·'«)
5JH	O	5.78	100	93,5	100
5.78	O	4.90	100	98,5	83
5.78	0,91	4,80	84,5	87,5	99
11.56	5.36	5,58	53,6	94,5	90

') Antikrirperkon/entralinn im Serum, Abiaul und liluat wurden durch c|uantiuitise Ausfa'llungsanalyse ermiltel ""l '> des an der Komplexbildung teilnehmenden Antikörper/usat/es.

') '■< des im sauren [-.luat enthaltenen, durch ein spezifisches Antigen auslallbaren Proteins.

Der Wirkungsgrad schwankte von 5 3.6% Antikörper bei der höchsten Beschickung bis /u 100% bei der niedrigsten. Anlikörperreinheit war in allen Versuchen über 90%. Insgesamt 5.78 mg Antikörper wurden aus der Kolonne mit spezifischem Antiserum herausgewaschen. Die Aktivität des gebundenen Antigens hatte auch nach mehrmonatiger Lagerung im Boratpuffer bei 4' oder Trocknen bei Zimmertemperatur nicht abgenommen.

Beispiel III

7 g des gemäß Beispiel I hergestellten Isothiocyanoalkylsilanderivats wurden je 150 mg je einer zuvor durch Ammoniumsulfat-ausfällung bereiteten Probe von Anti-HGG-Globulin bzw. Anti-L-Asparaginase vom Kaninchen zugesetzt, mit festem NaHCOj und NaCOj auf pFI 9 eingestellt und 4 Std. bei Zimmertemperatur reagieren gelassen und die Umsetzung über Nacht bei 5° fortgesetzt. Das Produkt wurde bei 5° in 0,01 M boratgepufferier Salzlösung, pH 8, gelagert (BBS).

Das Antikörper-Glasderivat wurde mehrmals mit 1% NaCI Lösung 0,05 M Glyzin-HCl, pH 2,3 und 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7 (PBS) gewaschen und 3 g in 20 ml von menschlichem Gamma-GIobulin, gelöst in 0,01 M PBS, pH 7, enthaltend 4,2 mg Protein gegeben, das Ganze bei Zimmertemperatur gerührt und nach Zusatz von Antigen nach 5,10 und 15 Min. Proben entnommen, diese filtriert und das in Lösung yerbleiben.de Protein spektrophotometrisch bei 280 μ bestimmt. Das Antigen wurde mit 0,05 M Glyzin-HCl, pH 2,3, herausgewaschen. Die Tabelle Ii zeigt die Ergebnisse.

ι, r.ibelle Il

Komplexbildung von I ICiCi /um Antikrirper-Cilas-Koniposituni

im Iniinunoausornen/niiHci duri.ii Ansat/veriahren

Zeit	An,,, in	ι ick;	Gewonnen¹¹)
		adsorbiert')
(Min )		(%)	(·.„)
	0,17	52	100
10	0.15	62	100
15	0.15	62	100

') ■■■ % lies 4,2 mg Antigen/.usalzes, der die spezifische Komplexbildung eingeht.

^b) = % des komplexgebundenen Antigens das bei Dissoziierung mit 0,05 M Glyzin-HCl, pH 2,3, frei wird.

Der gleiche Versuch wurde mit Glukoseoxidase, ω einem unspezifischen Antigen, wiederholt. Es wurde kein Protein adsorbiert

Das Präparat wurde 40 Tage in 0,01 M bratgepufferter Salzlösung, pH 8, bei 6° gelagert 2 g wurden dann in eine Kolonne gegossen und mit 1% Salzlösung bi gewaschen und 0.6 mg HGG in 3 ml Salzlösung zugesetzt. Der Ablauf wurde gesammelt und quantitativ analysiert Die Ergebnisse sind in der Tabelle III wiedergegeben.

Tabelle III

Isolierung von NGO durch Kolonnenverfahren auf Antikörper-Olas-Kompositum

Antigen	Antigen-	Mit Säure	Ausbeute von
	komplex-	herausge	Kolonne'¹)
	bi'diing/	löstes Anti
	Kolonne	gen
(mg)	(mg)	(mg)	(mg)
0,60	0,34	0,34	100
0,60	0,39	0,29	74
0,60	0,38	0,37	97,3
l,00^b)

i — Vn UCS 111 UCl IMJKjiniC MJIM(JICA gCflÜnUCnCM. Hii-LM l.lÜMljil

gewonnenen Antigens.

^h) Durch die Kolonne geleitetes unspe/ilisthes Protein (Glukoseoxiiiase).

Aus diesen Daten ergibt sich eine Komplexbildung von etwa 0,62 mg HGG. Hiervon konnten insgesamt 0,45 mg mit Säure herausgewaschen werden, so daß 0,16 mg in der Kolonne verblieben. Die anfänglich zugesetzte HGG-Konzentration betrug 0,81 mg/ 10,81 mg Gesamtprcteinmenge oder 7,5%. Die endgültige HGG-Konzentration nach der Elution betrug annähernd 32%, also eine Zunahme um das 4,4fache.

Das zuvor 47 Tage in 0,01 M BBS, pH 8, bei 4-6° gelagerte Derivat wurde zur Bestimmung der maximalen Antigcnkapazität geprüft. Eine 1%-Lösung von HGG in Salzlösung wurde durch die Kolonne geleitet, bis die HGG-Konzentration im Ablauf der im Zulauf gleich war. Das überschüssige HGG wurde mit Salzlösung herausgewaschen und die Kolonne mit Glyzinpuffer eluiert. Insgesamt 4,83 mg HGG wurden aus 2 g Kolonne gewonnen, also das Doppelte wie bei dem 47 Tage früher gemiiß Tabelle Il vorgenommen abschp.iusweisen Versuch mit <

crlrirhrn Präparat.

Beispiel IV

Es wurde eine Dissoziierung von 74-100% des Antigen-Antikörperkomplexes erreicht. Eine Lösung von menschlichem G amnia-Globulin-Rinderserum-Albumin (1:1 w/w) wurde in 1% Salzlösung enthaltend insgesamt 1 mg Protein/ml bereitet. Eine Gesamtmenge von 1 ml wurde durch eine 2 g Kolonne geleitet, mit 1% Salzlösung und Gly/inpuffer ausgewaschen.

Mit dem Eluat wurde die Papier-Elektrophorese in Barbitalpuffer. pH 8,6. bei 200 V während 2 Std. vorgenommen. Die Ergebnisse zeigten eine geringe Spur von Rindersenimalbumin (BSA). Die Elution des Proteins vom Papier und die spektralphotometrische Schätzung zeigten ,-.ber, daß mindestens 80% des gesamten isolierten Proteins HGG war. Das Derivat wurde bei 6" in in boratgepufferter Salzlösung gelagert. 60 Tage später wurde ein weiterer Trennungsversuch durchgeführt, wobei der I ml Lösung BSA 0,81 mg zuvor bereitetes HGG-S¹⁵ zugesetzt wurden. Die Mischung wurde wie zuvor in der Kolonne behandelt und die Lösungen mit einem Baird-Atomic Gasstromproportionalmesser gezählt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

Trennung von BSA und MGG-S³' auf Antikörper-Glas-Kompositum

ti	Antigen im Ansatz (cpm)	Gesamt- Protein- zusatz (mg)	Ablauf (cpm)	(mg)	Eluat (cpm)	(mg)
is I	13,010 13,010 13,010	9,81 9,81 9,81	3119 3098 3352	8,0 7,9 8,4	7335 7350 7350	1,43 1,50 1,45

Mit dem Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde nach Beispiel III vorgegangen und 62 g aus Kaninchenglobulin gewonnener Anti-L-Asparaginase mit 2 g Isothiocyanoalkylsilanderivat umgesetzt. Das nicht umgesetzte Globulin wurde gesammelt und die Gesamtmenge Protein spektralphotometrisch gemessen. Insgesamt waren 13 mg Globulin pro g des porösen Glasträgers gebunden.

Nun wurde eine 2 g Kolonne von gebundener Anti-L-Asparaginase bereitet und nacheinander mit 0,05 M Glyzin-HCI, pH 2,3, 0,1 M phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7 und 1% NaCI Lösung gewaschen. Ein Asparaginaseextrakt von E. coii wurde dann durch die Kolonne geleitet und der Ablauf gesammelt. Die Kolonne wurde mit !% NaC! gewaschen, bis bei einem 10 mm Zellendurchlauf bei 280 ΐημ kein LJV-adsorbierendes Material feststellbar war.

Die L-Asparaginase wurde mit dem 0,05 M Glyzinpuffer. pH 2,3, eluiert und sofort mit verdünnter NaOH Lösung neutralisiert.

Der Originalextrakt, der Ablauf und das Eluat wurden auf Enzymaktivität geprüft und die Proteinkonzentration mit der obenerwähnten Methode nach Lowry u. a. bestimmt.

Die Tabelle V zeigt eine Zunahme der Enzymaktivität nach einem Durchlauf von Rohextrakt, im Bereich von mindestens 270% bis höchstens 726%, also etwa 10% der Aktivität des ursprünglichen immunisierenden Antigens.

Immunologische Untersuchungen zeigen, daß die mit der L-Asparaginase präparierten Antiseren die Antikörper für wenigstens drei im E. coli-Extrakt feststellbare Antigene enthält, und zwar ein größeres und zwei geringere. Bei dem ersteren handelt es sich wahrscheinlich um das Enzym. Es war in allen Antikörperproben nachweisbar. Die beiden geringeren Antigene waren im immunisierenden Antigen kaum feststellbar, aber gut nachweisbar im Extrakt und in geringerem Maße auch in den saueren Eluaten.

Die mit dem Rohextraktversuch der Probe 3 der Tabelle V erzielten Ergebnisse wurden 50 Tage nach den vorigen Versuchen erhalten, zeigen also eine langdauernde Stabilität der gebundenen Antikörper.

Tabelle V	Enzym	üesamt-	Protein	Aktivitäts	Aktivität.v
Reinigung von L-Asparaginase	aktivität	aktivjtiit	konzentration	zuwachs	ausbeutc
Probe	(F.inheiten/mg)	(!Einheiten)	(mg/ml)	(%)	(%)
	0,28	214	6,00	_	_
	0,20	175	4.50	-	81.6
1. Rohextrakt	2,00	13	0,32	726	6,1
Ablauf	0,122	162	9.20	-	-
l-liiat	0,08	65	3.X0		40
2. Rohextrakt	0,32	7.5	0.50	270	5,0
Ablauf	0,36	266	5,4
I-tuat	0,22	230	5.3	-	86,5
3. Rohextrakt	2,50	30	0.30	/00	i 1,3
Ablauf
F.luat

Die folgenden nachgereichten Beispiele 5-111 zeigen die Möglichkeit, weitere Antigene und Antikörper über verschiedene Silane und /um Teil andere Träger, wie nicht siliziurnlialtige Metalloxide, chemisch zu binden. Das in einigen Beispielen als Träger verwendete poröse Glas kann mit gesteuertem Bereich der Porenweite z.B. nach USPS 34 85 687. 35 49 254 hergestellt oder im Handel als CPG Glas (Controlled Pore Glass) bezogen werden. Die Bedeutung einer Voreinstellung der Porenweite ergibt sich unter dem Gesichtspunkt einer zum F.intritt der kovalenten Bindung wesentlichen Eindringung des Antigens oder Antikörpers in alle Poren zur Besetzung möglichst vieler freier Stellen einer möglichst großen Oberfläche bei kovalenter Bindung an den organischen Teil des dort mit seinem Siliziumteil an den Träger gebundenen Silans. Hierzu muß die durchschnittliche Porenweite mindestens so groß wie die größte Abmessung des im Einzelfall zu bindenden Antigens oder Antikörpers sein, damit diese in die Poren eindringen können und quantitativ maximal über die freien Stellen des organischen Kupplerteils atomar gebunden werden.

Beispiel V Bindung eines Haptens (Thyronin) an poröses Glas

Thyronin wurde in de: folgenden Weise an poröses Glas gebunden.

4 ml einer 12,5%igen Glutaraldehydlösung wurden

1 g Alkylamin-Glas mit einer durchschnittlichen Porengröße von 750 Ä zugesetzt. Das poröse Glas wurde mit einer Porengröße, die der größten Abmessung des zu bindenden Haptens mindestens gleich war, gewählt; sie betrug im Durchschnitt 750 Ä. Dieses poröse Glas (im Handel erhältlich als Corning GZO 3900 CPG) wurde zur Alkylaminierung wie im Beispiel I behandelt, wobei die Umsetzung während Vh Std. bei Zimmertemperatur im Vakuum vorgenommen wurde. Das Trägerglas wurde gründlich mit dest. Wasser gewaschen und die Flüssigkeit abgegossen.

Nunmehr wurde der Träger mit dem Hapten, bestehend aus 50 mg Thyronin und weiteren 50 mg Thyronin gekennzeichnet mit einem Jodisotop, I¹³⁵ in

2 ml 0,1 M Boratpuffer mit dem pH-Wert 11. umgesetzt. Nach 24 Std. bei Zimmertemperatur im Vakuum wurde die Umsetzung unterbrochen, das Produkt abgegossen.

dreimal mit 10 ml 0,1 M Borat. pH 11. und anschließend zehnmal mit 10 ml 0.5 M NaCI gewaschen, und das Waschprodukt auf I ^r> überprüft. Nach der Wäsche wurde das Glas im Gamma-Spektrometer gezählt; es enthielt 9-10 mg Thyronin pro g Glas.

Beispiel Vl

Bindung eines Polysaccharids

(lösliche Carboxymcthylzellulosc)

an ein nicht siliziiimhaltiges Metalloxid

(Hydroxjapatit).

10 g Hydroxyapatitpulver (Korngröße

200-400 mesh. 0.037-0.074 mm) wurden einer 10°/oigen Lösung von !vAminopropyltricthoxysilan in Toluol zugesetzt, d'c Suspension 18 Std. im Rücklauf gemischt und mit Toluol und Azeton gewaschen. Das Alkylaminderivat wurc¹" zunächst an der Luft getrocknet und dann 6 Std. im Ofen auf 115" erhitzt.

1 g Carboxymethylcellulose wurden in 100 ml 0.05 M Phosphatpuffer mit dem pH 4 gelöst und dem Träger zugesetzt. Weiter zugesetzt wurden 1 g t-O'clohexyl-S-(2-Morpholenoäthyl)-Carbodiimidc. Metlio-pToluolsulfonat. Die Umsetzung wurde bei Zimmertemperatur während 18 Std. durchgeführt. Das Endprodukt wurde vor Vervi endung sehr gründlich gewaschen.

Beispiel VIA
Bindung von Dextran an Hydroxyapatit

In ähnlicher Weise wie im Beispiel Vl wurde Dextran an Alkylaminhydroxyapatit kovalent gebunden. Hierzu wurde zunächst der Träger mit Toluoldiisothiocyanat in Chloroform (Volumenverhältnis 10 :90) umgesetzt. Das Produkt wurde mit Chloroform gewaschen, rasch an der Luft getrocknet und mit einer 1% Detranlösung, pH 9, 6-12 Std. umgesetzt. Das Produkt wird vor Verwendung gewaschen.

Beispiel VII

Bindung eines Hapten-Proteinkonjugats
(Rinderserum Eiweiß—Sulfanilsäure)

1 meq Sulfanilsäure wurden in 100 ml 2 N HCI suspendiert und mit 1,1 mg festem Natriumnitrit (NaNOj) versetzt. Die Umsetzung wurde in einem

Eisbad bei 0° 30 Min. fortgesetzt Das Umsetzungsprodukt wird unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 83 — 94 langsam einem 1 g Rinderserum Eiweiß, gelöst in 20 ml dest Wasser, zugesetzt Der pH-Wert wird mit 50% NaOH Lösung aufrechterhalten. Auch diese Umsetzung yird im Eisbad bei 0° fortgesetzt Nachdem die gesamte, diazotierte Sulfanilsäure zugesetzt ist wird die Lösung während 24 Std. auf 0-4° gehalten, erschöpfend mit dest Wasser dialysiert und gefriergetrocknet

10 g poröses, mit Zirkonoxid überzogenes, Alkylamin-G!as wird mit Glutaraldehyd aktiviert in dem es bei pH 7 mit 2^% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphtpuffer umgesetzt wird. Die Umsetzung wird 60 Min. bei Zimmertemperatur fortgesetzt Das Produkt wird gewaschen, und 1 g des Konjugats Rinderserum Eiweiß-Sulfanilsäure, gelöst in 25 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, zugesetzt Die Umsetzung wird über Nacht bei Zimmertemperatur fortgesetzt Das Produkt wird gründlich gewaschen und ist dann verwendungsfähig.

Beispiel VIII

Eine Nucleinsäure (Deoxyribunucleinsäure, DNA),
gebunden an Aluminiumoxid, AI2O3

100 ml einer Lösung von 10% Thiophosgen in Chloroform wurden 12 g Alkylamin-Aluminiumoxid zugesetzt und über Nacht im Umlauf gehalten. Das Alkylamin-Aluminiumoxid war entsprechend der beschriebenen Silanisicrung von porösem Glas hergestellt worden. Das Isothiocyanatderivat wurde mit Chloroform gewaschen, rasch an der Luft getrocknet und sofort verwendet. Die gesamte Menge wurde 50 ml einer DNA Lösung, 1 mg/ml in mit NajCOj gepuffertem Wasser. pH 10, zugesetzt, nachdem die DNA Lösung 5 Min. gesiedet hatte und rasch in Eiswasser abgekühlt worden war. Während der Umsetzung wurde der Ansatz bewegt, auf Zimmertemperatur und einem pH-Wert von 9-10 gehalten. Die Umsetzung verlangsamte sich nach 10 —30 Min., wurde aber für eine weitere Stunde forlgesetzt. Das Produkt wurde mit 200 ml dest. Wasser gewaschen und die gesammelte Waschlösung spektralphotometrisch auf DNA untersucht. Der anfallende nasse Kuchen wurde mit Azeton gewaschen, getrocknet, und ein Teil auf Phosphor analysiert.

Es konnte so die an das Aluminiumoxid kovalent gebundene DNA Menge bestimmt werden, indem nämlich

1. eine Probe der Wäsche mit dest. Wasser mit dem Spektralphoiometer bei λ = 260 nm untersucht und

2. ein Teil des Präparats nach der Azetonwäsche und Trocknen quantitativ auf Phosphor analysiert wurde. Das Ergebnis zeigte 20% bzw. i i,4% DNA an den Träger gebunden.

Beispiel IX
Stabilisierung von Insulin Antiserum

Eine Menge von 1 g Trockengewicht, mit kaltem dest. Wasser gewaschen, diazotiertes, Arylamin-porösei Glas (96% Kieselsäure) mit einer durchschnittlicher Korngröße von 1 μ und 550 A Porengröße wurde ir kleinen Prisen unter I Jmrühren in 1 ml Antiporcin-Insulinserum vom Meerschweinchen in einem Eiswasserbac gegeben. Vor Zusatz des diazotierten, porösen Glasde rivats wurde das Antiserum mit kalter 0,1 N NaOH aul einen pH Wert von 8-84 eingestellt: während dei gesamten Umsetzung wurde dieser pH-Wert aufrechterhalten und ständig gerührt Die Umsetzung wurde 2 Std. fortgesetzt um den pH-Wert auf 8 - 84 ze stabilisieren und auf Diazoniumstellen mit Beta-Naph thol zu prüfen. Die Umsetzung wurde über Nacht im Kühlschrank fortgesetzt das Produkt mehrmals mil 0,01 M Boratpuffer, pH 84. in NaCl gewaschen und als

2n nasser Kuchen oder schwere Aufschlämmung in einem verstöpselten Glas im Kühlschrank aufbewahrt

Beispiel X
Stabilisierung von Digoxin Antiserum

10 ml 24% Glutaraldehydlösung in 0,1 M NatriumphosphatDuffer, pH 7, wurden über 1 g Trockengewichi poröses Alkylaminglas mit durchschnittlicher Korngröße von 1 μ und Pcengröße von 550 Ä gegossen, da;

3« Ganze in einen Trockenbehälter gebracht und 60 Min angesaugt. Das Produkt wurde viermal mit dest Wassei gewaschen und in Abschnitten unter Rühren zu 1 m Anti-Digo;<inserum der Ziege in einem Eiswasserbad gegeben. Das Serum v/er zuvor auf pH 7 eingestellt

r> worden. Die Umsetzung wurde wenigstens 2 Std fortgesetzt. Der Komplex wurde viermal mit kaltem 0,01 M Boratpuffer, pH 8,5. in NaCI gewaschen. Dei nasse Kuchen wurde in einem verschlossenen Glas im Kühlschrank aufbewahrt.

Beispiel Xl

I g Trockengewicht poröses Arylamin-Glas, Korn größe 1 μ, Porenweite 550 Ä, wurde in einem Eisbad irr Vakuumtrocknen diazotiert, dann mehrmals mit dest

4) kaltem Wasser gewaschen und alsbald abschnittsweise I ml Anti-Estriol vom Schaf in einem Becherglas irr Eisbad unter ständigem magnetischem Rühren züge setzt. Während der Umsetzung wurde der zuvor mil kalter 0,1 N NaOH eingestellte pH von 8-84 auf

-><> rechterhalten. Wiederholt wurden Proben zur Prüfung auf Diazoniumstellen entnommen. Nach Stabilisierung des pH auf 8-8,5 (in der Regel ca. 2 Std.) wurde die Mischung über Nacht in einen Kühlschrank gesetzt. Das Produkt wurde gründlich mit kaltem Phosphatpuffer

Vi pH 7.4, in 0,9% Natriumchlorid gewaschen und in einer Serumflasche als Aufschlämmung in 3 ml Phosphatpuf ter, enthaltend ü.02% NaNi. im Kühlschrank aufbe wahrt.

909 547/4!

Claims

Patentansprüche:

I. Verfahren zum Herstellen stabilisierter, weitgehend wasserunlöslicher Antigen- und Antikörper-Präparate durch kovalente Bindung des Antigens oder Antikörpers an einem Träger, dadurch gekennzeichnet, daß Antigen oder Antikörper an einen freie Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisenden, anorganischen Träger wie porösem Glas oder dergleichen oder ein nicht siliziumhaltiges Metalloxid, Aluminiumoxid, Hydroxyapatit oder dergleichen über ein Silan gebunden wird, welches die allgemeine Formel

io