DE1814028A1 - Verfahren zur Bestimmung des Hydroxyprolingehaltes von biologischen Fluessigkeiten und diagnostische Packung fuer diese Bestimmung - Google Patents

Description

Verfahren zur Bestimmung des Eydroxyprolingehaltes von biologischen Flüssigkeiten und diagnostische Packung für diese Bestimmung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroxyprolin in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Urin, Lendenflüssigkeit und interarticulartorischer (Gelenk-) Flüssigkeit. Erfindunssgemäß wird eine Probe mit einem stark sauren Kationaustauscherharz behandelt, welches das freie und peptidgebundene Hydroxyprolin adsorbiert, v-'orauf man das adsorbierte peptidgebundene Hydroxyprolin durch Erhitzen hydrolysiert, es eluiert und mittels einer Farbreaktion bestimmt.

Außerdem umfaßt die Erfindung eir.e diagnostische Packung, die hauptsächlich besteht aus einer Flasche mit dem genannten Harz, einem Rohr zur Durchführung der Adsorption und Hydrolyse, einer Flasche nit einer Standard nie η ce an Hydroxyprolin und einem Reagens zur Durchführung einer Farbreaktion.

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Das erfindungsgemäße Verfahren" ist die erste praktisch ^>f durchführbare und' genaue Methode, te.i welcher die Könzerittfä-<■'■' tion der zu bestimmendem "Substanz^ Sie" Hydrolyse und die Reinigung wesentlich verbessert Worden si'nd. Auf diese Weise ■ ' ■■ lassen sich Abweichungen' beim'•Collägeri-MetabolismUs-leicht ·' verfolgen. - '. . ■ ; ■

Hydroxyprolin ist eine für 'Collagen -charakteristische Aminosäure·, da sie¹ in diesem-Protein- 'nauptsächlich gefunden¹- · wird und 'zwar in einem Anteilsverhältnis von mehr als To $."■

- Collagen ist einer der wicht'igsten Eiweißstoffe -im Saugetierorganismüs. Beim Menschen stellt es etwa die Hälfte der ^! gesamten KÖrperprote-ine dar und ist 6in Hauptbestandteil der Haut, der'Sehnen, der Knochen, "der "Knorpel und des^: Bindegewebes. ■■"■'■ ·" - ' '■ " · ■

Die Zusammensetzung des 'Gollag'fens hinsichtlich seiner Aminosäuren ist sehr typisch; es ist verhältnismäßig arm äri " Aminosäuren, die für' die menschliche"Nahrung wesentlich sind, jedoch sehr reich an G-lycin, Prolin und Hydroxyprolin. '

In den letzten Jahren wurden hinsichtlich der Chemie des Collagenmetäbdlismus wesentlich intensivere Forschungen durchgeführt, wodurch eine besonders tiefe Einsicht in diesen Mechanismus gewonnen werden konnte.

Untersuchungen mit gekennzeichneten Verbindungen haben gezeigt, daß das Hydroxyprolin gebiidet wird durch Hydroxylierunie: von Prolin, das bei den primitiven Vorstufen der ' Collagenmoleküle peptidgebunden iät. Jm Gegensatz '""¹Zu Proiih r kann Hydroxyprolin nicht zur Bildun« von neuem Collagen be-

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nutzt werden. Dies deutet darauf hin, daß das in biologischen Flüssigkeiten anwesende Hydroxyprolin aus Abbauprozessen stammt. Sieht man also ab von Faktoren, die beispielsweise aus der Einnahme von hydroxyprolinhaltigen Nahrungsmitteln stammen, so gibt die Menge an Hydroxyprolin in biologischen Flüssigkeiten ein Maß für den endogenen Collagenabbau.

Unter normalen physiologischen Bedingungen greifen der Collagenaufbau und der Collagenabbau ineinander, d.h. ein An- μ stieg an Collagenaufbau ist begleitet von einer Zunahme des Collagenabbaus. Der Gehalt des Blutes an Bestandteilen, die Hydroxyprolin enthalten und die Ausscheidung von hydroxyprolinhaltigem Material durch den Urin sind im allgemeinen nicht konstant, sondern hängen stark vom Alter ab. In den Wachstumsperioden, d.h. während der ersten Lebensjahre und im Jünglingsalter sind diese Yferte, berechnet je Kilogramm Körpergewicht, merklich höher als bei Erwachsenen. Obgleich innerhalb der Altersgruppe starke individuelle Abweichungen stattfinden können, kann die Bestimmung des Hydroxyprolingehaltes von biologischen Flüssigkeiten von Wichtigkeit sein, z.B. zur Ermittlung von Störungen und Verzögerungen im Wachstum.

Bei pathalogischen Zuständen, insbesondere denjenigen, die mit spezifischen Zerstörungen in Collagengeweben einhergehen, ist die Bestimmung von Hydroxyprolin von noch größerer Wichtigkeit. Eine Anzahl von Krankheiten, z.B. solche wie neoplastische Wucherung in Collagengeweben, sind begleitet von erhöhtem Collagenaufbau und -abbau, wobei die Körperflüssigkeiten einen mehr oder weniger erhöhten Gehalt an hydroxyprolinhaltigem Material aufweisen, je nach der Geschwindigkeit, mit der diese Tumoren wachsen. Das gleiche gilt für eine Anzahl von anderen Syndromen, z.B. für die Pagetsche Krankheit, das Marfan-Sycdrom und eine unvollständige Knochenbildung

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(Osteogenesisimperf e.cta), die oft erblich auftreten und mittels einer Bestimmung von Hydroxyprolin in den Körperflüssigkeiten rasch lokalisiert werden kann, so daß eine frühe, Behandlung möglich wird. Bestandteile mit einem verringerten Hydroxyprolingehalt werden gefunden bei verschiedenen Formen von Zwergwuchs und im Frühstadium der Unterernährung. Sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung durch Medikamente oder besondere Ernährung ist bei diesen ernsten Störungen die Bestimmung des Hydroxyprolins von äußerster Wichtigkeit.

Die bisher bekannten chemischen Methoden zur Bestimmung von Hydroxyprolin in biologischen Flüssigkeiten sind im allgemeinen sehr kompliziert, was hauptsächlich auf folgende Ursachen zurückzuführen ist!

1. In den meisten Fällen ist das Hydroxyprolin vorwiegend, an Peptid gebunden. Zur Durchführung der Bestimmung muß aber die Aminosäure im freien Zustand

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drastische Bedingungen zu erreichen ist.

2. Das zerstörte Collagen wird zum größten Teil im Körper abgebaut, so daß der Hydroxyprolingehalt der Körperflüssigkeiten verhältnismäßig gering ist und in vielen Fällen eine Konzentrierung nötig wird»

3· Neben freiem und peptidgebundenem Hydroxyprolin enthalten die Körperflüssigkeiten viele andere Bestandteile, welche die Bestimmung so weit stören können, daß eine Reinigung vor oder während der Durchführung der Bestimmung nötig wird.

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Unter den "bisher bekannten Verfahren zur Schätzung von Hydroxyprolin nimmt die von Moore und Stein ausgearbeitete und in Anal. Chem. 3o, 1185-119o (1958) beschriebene, chromatographische Methode einen wichtigen Platz ein. Mit Hilfe dieser Methode, von der es zahlreiche Varianten gibt und zu deren Durchführung eine Vielzahl von automatisierten Vorrichtungen benutzt werden, kann das Hydroxyprolin in reinem Zustand isoliert und gefärbt werden, beispielsweise mit einem Reagens, das Ninhydrin enthält. Die so gebildete gefärbte J Substanz wird colorimetrisch bestimmt und gibt ein Maß für die Menge an Hydroxyprolin in der betreffenden Probe. Für Zwecke der klinischen Chemie ist diese Methode jedoch keineswegs attraktiv, mindestens wenn es sich nur um die Bestimmung von Hydroxyprolin handelt, da sie teuer und so zeitraubend ist, daß wöchentlich nur einige wenige Bestimmungen durchgeführt werden können.

Andere bekannte quantitative Bestimmungsmethoden verwenden ebenfalls die eolorimetrische Technik, die auf einer mehr oder weniger spezifischen Färbung des freien Hydroxyproline beruht. Auch hierbei wird jedoch die Bestimmung durch , die oben'erwähnten umstände beeinträchtigt. Oft unterscheiden sich die Bestimmungen lediglich in den Maßnahmen, die ergriffen werden, um die störenden Einflüsse auszuschalten.

Die Farbreaktion verläuft gewöhnlich in zwei Stufen. In der ersten Stufe wird das Hydroxyprolin zu einer Verbindung mit Pyrrolstruktur, nämlich Pyrrol-2-carbonsäure und/oder Pyrrol oxydiert. Als Oxydationsmittel sind Wasserstoffperoxyd (s. Neuman & Logan in J. Biol. Chem. 184-, 299 /~195o__7) und das Natriumsalz von N-Ghlor-p-toluolsulfonamid (s. Stegemann in Z. Physiol. Chem. 311, 41 </~1958_7) üblich. Nachdem der

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Überschuß an Oxydationsmittel entfernt wurde, wird als weiteres Reagens p-Dimethylaminobenzaldehyd in einem organischen Lösungsmittel zugefüet, so daß man einen roten Ohromophor erhält. Die Menge dieses Chromophors wird spektrophotometrisch bestimmt und gibt ein Maß für die Menge an Hydroxyprolin in der untersuchten Probe.

Eine der meist angewandten Varianten dieser cölorimetrischen Methoden ist das von Proekop und TJdenfriend in Anal, φ Biochem. 1, 228 (i960) beschriebene Verfahren, das darin besteht, daß die Hydrolyse in einem Autoklaven mit konzentrierter Salzsäure 3 Stunden lang bei 124°C durchgeführt wird. Bei dieser Arbeitsweise erhält man eine große Anzahl von die Bestimmung störenden Produkten, wodurch eine sehr intensive Reinigung des Hydrolysates notwendig wird. Zu diesem Zweck konzentriert man die betreffende biologische Flüssigkeit- und entfernt die Salzsäure in einem Rotary-Evaporator, wobei die störenden Bestandteile an einem Entfärbungsharz adsorbiert werden. Das durch Oxydation des Hydroxyproline gebildete Ghromogen wird unter genau standardisierten Bedingungen extrahiert.

Die Hydrolyse, die Konzentrierung und die Reinigung der

biologischen Flüssigkeit sind nicht einfache Routinearbeiten, so daß es ohne weiteres einzusehen ist, daß das oben erwähnte Verfahren und ähnliche Methoden nicht zur Verwendung in dem chemischen laboratorium einer Klinik geeignet sind.

Diesem Stand der Technik gegenüber ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Hydroxyprolingehaltes einer - biologischen Flüssigkeit dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der Flüssigkeit mit einem das anwesende fre'ie und peptidgebundene Hydroxyprolin adsorbierenden stark sauren Kationaus-

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tauscherharz behandelt, worauf man durch Erhitzen eine Hydrolyse des adsorbierten peptidgebundeneri Hydroxyprolina bewirkt, das Hydroxyprolin eluiert und die im Eluat anwesende Menge mittels einer Farbreaktion bestimmt.

Es handelt sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um eine für die Praxis geeignete und absolut sichere Prüfung, bei welcher das Einengen der zu untersuchenden Substanz, die Hydrolyse und die Abtrennung der nicht spezifischen Chromogene außerordentlich vereinfacht wurden und die in vielen Fallen in einem einzigen analytischen Arbeitsgang durchgeführt werden kann.

Das bei diesem Verfahren wichtigste Reagens ist oder enthält ein stark saures Kationenaustauscherharz. Dieses Reagens wird vermischt mit der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, so daß das freie und das peptidgebundene Hydroxyprolin vollkommen an dem Harz adsorbiert wird. Das beladene Harz kann von der biologischen Flüssigkeit beispielsweise durch Sedimentiereri oder Zentrifugieren getrennt werden und wird

²P relndsen und ^ . „ dann gewaschen, um das Harz/zu konzentrieren. Man kann die Bestimmung auch in Anwesenheit der Flüssigkeitsprobe durchführen, falls diese keine störenden Faktoren 'enthält. Das Harz wird ggf. resuspendiert und dann erhitzt, beispielsweise 3 bis 24 Stunden auf 9o bis T2o°C, um das hydroxyprolinhaltige Material an der Oberfläche des Kationenaustäuschers vollkommen zu hydrolysieren. Nachder Hydrolyse ist das gesamte Hydroxyprolin als freie Aminosäure an das Harz gebunden, von dem es mit einer alkalischen Flüssigkeit, wie Natronlauge, Kaliumborat, einer Sodalösung oder Ammoniak eluiert wird. Beim Eluieren erfolgt zusätzlich eine gründliche Reinigung, da ein großer Anteil aer anderen Komponenten der biologischen Flüssigkeit auf dem Harz adsorbiert bleibt. .··.■..-

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Soll ausschließlich der Gehalt an freiem Hydroxyprolin bestimmt werden, so muß das Harz nicht hydrolysiert werden. In diesem Falle reicht eine selektive Eluierung des Hydroxyproline von dem Harz aus. Zum Schluß kann in dem Eluat das Hydroxyprolin durch irgendeine bekannte Farbreaktion bestimmt werden, z.B. durch die'in der oben angeführten Literatur erwähnte Methode.

Die Auswahl des Harzes ist äußerst wichtig, da diese Substanz fähig sein muß, aus der biologischen Flüssigkeit die hydroxyprolinhaltigen Komponenten rasch und vollkommen zu binden. Außerdem muß das Harz fähig sein, das Hydroxyprolin vollständig aus seiner Peptidbindung zu befreien. Selbstverständlich darf das Harz bei der angewandten Hydrolysetemperatur sich nicht zersetzen und es muß außerdem im Stande sein, diejenigen Faktoren auszuschalten, welche die Farbreaktion stören. Schließlich darf es selbst die Farbreaktion nicht beeinträchtigen.

Im Hinblick auf diese Anforderungen verwendet man vorzugsweise ein Harz aus der Reihe der sulfonierten Polystyrole. Die Harze mit einer Matrix aus sulfonierter Cellulose, Dextran oder Polyphenol haben sich auch als brauchbar erwiesen, insbesondere bei niedrigeren Hydrolysetemperaturen.

Was die Beschaffenheit des Harzes betrifft, so verwendet man es vorzugsweise in fein verteiltem Zustand, um das hydroxyprolinhaltige Material aus der biologischen Flüssigkeit rasch und völlig zu binden. Es kommt nicht in erster Linie darauf an, ob man ein Harz mit sphärischen Teilchen oder ein Granulat verwendet, aber im Hinblick auf die größere Oberfläche je Gewichtsmenge ist die Verwendung eines Granulates bevorzugt.

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Das Harz muß sehr kleine Teilchen aufweisen. Im Hinblick auf die Oberflächenwirkung des Harzes ist eine Teilchengröße bevorzugt, die 2oo /U nicht überschreitet. Die untere Grenze ist bestimmt durch die Fähigkeit der Harzteilchen, zu sedimentieren. Bevorzugt sind Harze mit einer Teilchengröße zwischen 2o und 2oo /U.

Der Vernetzungsgrad der Polystyrolmatrix des Harzes ist nicht ausschlaggebend. Bevorzugt ist, allgemein gesprochen, A ein mäßig vernetztes Harz mit 2 bis 1 ο ^ Vernetzungen, das einerseits möglichst schwer löslich ist und andererseits ausreichend große Poren aufweist, um einen raschen Austausch von Collagenpeptiden und Hydroxyprolin zu ermöglichen. Ggf. kann das sulfonierte Polystyrolharz auf die Oberfläche eines inerten Trägers aufgebracht werden, beispielsweise auf Infusorienerde, wie Bentonit oder andere Filterhilfen. Allerdings ist dann die Bindefähigkeit je Gewichtsmenge im allgemeinen niedriger als bei den sphärischen Harzen und Granulaten selbst.

Selbstverständlich muß das zu verwendende Harz so rein sein wie möglich. Außerdem sollte es so weit wie möglich von einheitlicher Teilchengröße sein. Um dies zu erreichen, wird f das Harz zunächst gesiebt, um die sehr feinen und groben Teilchen auszusondern. Dann wird es sorgfältig gewaschen. Zu diesem Zweck wird es mit wäßriger Lauge, z.B. einer lösung von 2n-Natriumhydroxyd, erhitzt, dann abgekühlt und mit Wasser bis zur neutralen Reaktion der Waschflüssigkeit gewaschen. Anschließend wird das Harz mit einer verdünnten Mineralsäure, z.-B. Salpetersäure oder ^-Chlorwasserstoffsäure, behandelt. Während dieser Behandlung geht der Kationenaustauscher in die saure Form über und wird außerdem von störenden Metallionen, wie Kupferionen, befreit. Zum Schluß wird das Harz mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis die Waschflüssigkeit neutral reagiert.

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Ein großer "Vorteil des erfindungsgemäß zu verwendenden Harzes ist es, daß das hydroxyprolinhaltige Material unter wesentlich milderen Bedingungen völlig hydrolysiert wird als bei den bekannten Methoden. Bei Verwendung von sulfonierten Polystyrolharzen ist es nicht nötig, starke oder verdünnte Salzsäure anzuwenden, die bei Temperaturen über 1oo°C ernsthafte und störende Zersetzungsreaktionen von Bestandteilen der biologischen Flüssigkeit verursachen würde. Die Hydrolyse verläuft schon bei 60⁰C, jedoch bei dieser Temperatur ist die Dauer der Hydrolyse zu lang für eine rasche Bestimmung. Oberhalb 1oo°C, z.B. bei 12o°Cv kann die Hydrolyse manchmal innerhalb weniger Stunden beendet sein, dies stellt jedoch andere Ansprüche an die Hydrolysegefäße, die aus Sicherheitsgründen aus extra starkem und teuerem Material bestehen sollten. Als in der Praxis besonders geeignete Hydrolysetemperatur erwiesen sich 9o bis loo C. Bei dieser Temperatur kann die Hydrolyse über Nacht in billigen Hydrolyserohren durchgeführt werden, und es sind keine besonderen Vorsichtsmaßregeln notwendig.

Das zum Schluß zuzusetzende Reaktionsmittel kann in den verschiedensten Formen verwendet werden. Der saure Kationen-r austauscher kann in Form einer Suspension in destilliertem Wasser oder in einem Puffer angewandt werden. Man kann das Harz auch trocknen und die zur Bestimmung notwendige Menge in einem Hydrolyserohr oder einer Kapsel verteilen. Man kann aus dem Harz auch Tabletten herstellen, die/biologischen Flüssigkeiten rasch zerfallen. Das zu diesem Zweck benutzte Bindemittel kann beispielsweise aus saccharidhaltigen Bestandteilen bestehen, darf aber selbstverständlich kein Hydroxyprolin oder andere Bestandteile, welche die Bestimmung beeinflussen, enthalten, insbesondere aber auch keine ionisierbaren Substanzen.

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In manchen Fällen muß die biologische Flüssigkeit einer Vorbehandlung unterworfen werden. So ist beispielsweise Serum sehr reich an hochmolekularen, kein Hydroxyprolin enthaltenden Proteinen, die zwar vom Harz gebunden, jedoch nicht völlig hydrolysiert werden. In diesem Falle muß die biologische Flüssigkeit auf übliche Weise von den hochmolekularen Proteinen befreit werden.

Um die Durchführung des erfindungsgemäßen Bestimmungsver- * fahrens in der Praxis, insbesondere in der Klinik, zu erleichtern, wurde das Reagens in eine diagnostische Packung eingebracht, die im wesentlichen die folgenden Requisiten enthält:

1) Eine Flasche mit dem oben beschriebenen Harz, beispielsweise in Form einer Suspension oder eines trockenen Fulvers, wobei das letztere auch in abgemessenen Mengen in Kapseln verteilt oder zu Tabletten verpreßt sein kann. Das Harz kann auch gleich in die unter 2) erwähnten Hydrolyseröhren verpackt sein.

2) Eine Anzahl Hydrolyseröhren mit rundem Boden und luftdichtem Verschluß, z.B. einer Schraubkappe mit Gummi- oder Tefloneinlage.

3) Eine oder mehrere Standardlösungen von Hydroxyprolin oder leichtlösliche Pulver oder Tabletten, die eine genau abgemessene Menge an Hydroxyprolin enthalten.

4) Eine oder mehrere Flaschen mit stabilen Reagentien zur Durchführung einer Farbreaktion auf Hydroxyprolin.

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Die Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Ein granuliertes, sulfoniertes Polystyrolharz, das in der trockenen Natriumform eine Teilchengröße von 53 bis 62/U hatte und 8 $> Vernetzungen enthielt, wurde mit Natronlauge, Salpetersäure und Salzsäure vorbehandelt und dann bis zur neutralen Reaktion ausgewaschen. Dann wurde es in destilliertem Wasser suspendiert, so daß man eine Suspension mit 25o mg Trockenstoffe je ml erhielt. Die Suspension wurde in Mengen von je 1 ml in Glasröhrchen mit Schraubkappen von 1o ml Inhalt verteilt.

Eine Probe von 24-Stunden-Urin (1o5o ml) einer Patientin von 37 Jahren, die an Mammacarcinom litt, wurde über einen Faltenfilter filtriert. In zwei der oben beschriebenen Röhrchen, als (1) und (2) numeriert, wurde je 1 ml Urin einpipettiert. Außerdem wurde in Röhrchen (1) o,1 ml Wasser und in Röhrchen (2) o,1 ml einer Lösung mit looyug Hydroxyprolin einpipettiert. Die Röhrchen wurden sorgfältig verschlossen, 1o Minuten geschüttelt und dann nebeneinander 18 Stunden in einem Ofen auf 95°C gehalten. Dann wi fließendem Leitungswasser abgekühlt.

einem Ofen auf 95°C gehalten. Dann wurden die Röhrchen in

Nachdem die Röhrchen geöffnet worden waren, wurden 4,1 ml 2n Natronlauge zugegeben, worauf die Röhrchen 3o Minuten geschüttelt wurden. Nachdem sich das Harz abgesetzt hatte, wurden aus der überstehenden Flüssigkeit jedes Röhrchens 2 ml in 2 Reagensgläser mit korrespondierender Numerierung einpipettiert. In die Reagensgläser wurden dann nacheinander eingefüllt ι 1ml o,o5-molare Kupfersulfatlösung und 1 ml" 6

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Wasserstoffperoxydlösung. Die Oxydation des Hydroxyproline verlief bei Raumtemperatur innerhalb 5 Minuten. Das überschüssige Wasserstoffperoxyd wurde abgetrieben, indem man die Röhrchen 1o Minuten in einem Wasserbad von 7o C hielte Dann wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und 4 ml 3n Schwefelsäure zugegeben, so daß sich Pyrrol-2-carbonsäure bildete. In Jedes der Röhrchen wurden dann 2 ml einer 5 folgen lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd in n-Propanol zugegeben, worauf die Röhrchen im Wasserbad auf 7o°C erwärmt und dann j in laufendem Leitungswasser abgekühlt wurden. Der gebildete rote Chromophor wurde gemessen in einem Colorimeter gegen destilliertes Wasser bei 553 Nanometer. Die erhaltenen Resultate wurden bezeichnet mit E₁ und E₂. Dann wurden o,1 ml 3o $iges Wasserstoffperoxyd in jedes der Reagensgläser eingefüllt, um spezifisch den Chromophor zu zerstören. Nach 5 Minuten wurden beide lösungen bei 553 Nanometer gemessen. Die optischen Dichten, die innerhalb der Versuchsgrenzen gleich waren, betrugen Ε_Ώ.

Der Gesamtgehalt an Hydroxyprolin (X /Ug/ml) in der Probe wurde nach folgender Formel berechnet:

E — E

χ _ -J 1 χ ioo (/Ug/ml)

E₂-E₁ /

Das mit der Probe der Patientin erhaltene Resultat betrug 25,7 /Ug/ml, so daß die Ausscheidung auf 27 mg je Tag anstieg, was innerhalb der Grenzen für die normalen Werte liegt. Es ergab sich mithin keine Indikation einer aktiven Knochenmetastase.

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Beispiel 2

Ein sphärisches, sulfoniertes Polystyrolhars mit 4 $ Vernetzungen wurde in trockener saurer Form gesiebt, so daß man eine Teilchengröße von o,o38 bis o,o75 mm erhielt. Nach dem Waschen und Trocknen gemäß Beispiel 1 wurde das Harz in Mengen von 275 + 1o mg auf Kapseln verteilt.

Bei einer 25 Jahre alten Patientin, die an Periarteritis nodosa litt, wurde die Hydroxyprolinurie an einigen aufeinanderfolgenden Tagen gemäß folgendem Schema gemessen?

Eine Probe des 24-Stunden-Urins wurde filtriert und mit destilliertem Wasser (1:4) verdünnt. Je zwei Milliliter des verdünnten Urins wurden in 2 Röhrchen mit Verschraubung einpipettiert und diese mit (1) und (2) bezeichnet. Zu dem Röhrchen (1) wurden o,1 ml destilliertes Wasser, zu dem Röhrchen (2) o,1 ml einer Lösung von Gelatinehydrolysat, die je ml 1,2o5 mg Hydroxyprolin in Form von Peptiden enthielt, zugegeben. Nun wurde in jedes Röhrchen noch der Inhalt einer Kapsel mit Harz eingefüllt, worauf die Suspension kräftig geschüttelt wurde. Uach Verschließen wurden die beiden Röhrchen in einen Ofen bei 9o G eingebracht, wobei sie nach 2 und nach 4 Stunden wieder kräftig geschüttelt wurden.

Die Eluierung, die Farbreaktion und die Messung erfolgten gemäß Beispiel 1.

Die tägliche Ausscheidung (Y mg/Tag) wurde berechnet nach der Formel:

Y = 2 x (Volumen 24-Stunden-Urin) χ ™—-—■ χ o_s12o5(mg/

^h2 " ^Ä1 Tag)

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Nach 3 Tagen, an denen aufeinanderfolgend höhere Werte von 76,6 - 8o,4 - 72,8 mg gefunden worden waren, wurde der Patientin ein Steroidpräparat in einer solchen Dosis verabreicht, daß am 1o., 11. und 12. Tag eine Hydroxyprolinausscheidung von 43,8 - 4-1,3 - 27,9 mg erhalten wurde.

Beispiel 3

Ein pulverisiertes, sulfoniertes Styrolharz mit einer Teilchengröße von 63 bis 87 /U und einem Vernetzungsgrad von μ 5 <$> wurde gemäß Beispiel 1 gereinigt und gewaschen. Das feuchte Harz wurde innig mit Cellulosepulver (1o $> des Trockengewichtes des Harzes) und einer Stärkelösung (enthaltend 5 $> Stärke, berechnet auf das Trockengewicht des Harzes) vermischt. Die pastose Masse wurde im Vakuum getrocknet, pulverisiert und gesiebt und das trockene Pulver wurde in eine Tablettenmaschine eingebracht, in der daraus Tabletten von 31 ο + 2,5 mg hergestellt wurden.

Aus dem Blut eines Patienten, der an einer rheumatoiden Störung litt, wurde heparinisiertes Plasma hergestellt, das dann unter Zugabe des doppelten Volumens an kaltem Äthanol bei O⁰C deproteinisiert wurde. Nach Abtrennen der ausgeschiedenen j| Plasmaproteine wurde die überstehende Flüssigkeit mit destilliertem Wasser im Volumenverhältnis 1:1 verdünnt.

Je 6 ml der verdünnten Flüssigkeit wurden dann in vier Hydrolyseröhrchen, bezeichnet mit A, B, C und D, einpipettiert, in welcheii je eine Harztablette eingebracht worden war. Nach 15 Minuten wurde die Suspension gründlich geschüttelt, dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgezogen.

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Dem Inhalt der Röhrchen A und B wurden je 2 ml destilliertes Wasser, demjenigen der Röhrchen C und D je 2 ml einer Standardlösung mit 25 /Ug Hydroxyprolin je ml zugefügt, worauf die Röhrchen verschraubt und gut geschüttelt wurden. Die Röhrchen A und C wurden dann über Nacht in einem Kühlschrank bei +4⁰C, die Röhrchen B und D in einem Glyc'erinheizbad bei 1o5°C gehalten.

Am nächsten Morgen wurden die 4 Röhrchen auf völlig gleiche Weise weiterverarbeitet. Das Harz.wurde zentrifugiert, zweimal mit je 4 ml destilliertem Wasser gewaschen und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5o angesäuert. Die überschüssige Flüssigkeit wurde abgezogen, wobei Vorsorge getroffen wurde, daß keine Harzteilchen aus den Röhrchen entwichen. Dann wurde das Harz unter Zugabe von 1o ml Kaliumboratpuffer (pH 8,7) je Röhrchen 3o Minuten eluiert. Nach dem Zentrifugieren wurden je 2 ml der überstehenden Flüssigkeit in ein anderes, entsprechend markiertes Reagensglas eingebracht. Das Anfärben wurde durchgeführt nach Oxydation mit 2 ml einer o,o2-molaren wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von N-Chlor-ptoluolsulfonamid. Ein Überschuß dieses Salzes wurde eliminiert durch Zugabe von ίο ml wäßriger o,63-molarer Perchlorsäure. Dann wurden 2 ml 2o $iger p-Dimethylaminobenzaldehyd in Äthylenglykolmonomethyläther zugegeben und die Röhrchen 2o Minuten in einem Wasserbad von 7o°C erwärmt und abgekühlt. Die optische Dichte der Lösungen wurde bestimmt gemäß Beispiel 1.

Aus den optischen Dichten der Röhrchen A und C errechnete sich der Gehalt an freiem Hydroxyprolin zu 14 /Ug je ml Plasma; aus den optischen Dichten der Röhrchen B und D ergab sich ein Gehalt an freiem peptidgebundenem Hydroxyprolin von 42 /Ug je. ml Plasma. Der Gehalt an peptidgebundenem Hydroxyprolin beträgt demnach bei diesem Patienten 28 /Ug je ml Plasma.

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Die Diagnose einer mäßigen Knochenschädigung als Ergebnis einer rheumatischen Störung wurde "bestätigt durch Röntgenuntersuchung des Patienten.

Beispiel 4 Diagnosepackung

Ein sulfoniertes Polystyrolharz mit sphärischen Teilchen von durchschnittlich 4o /U und 2 $ Vernetzung wurde nacheinander behandelt mit Salpetersäure, Natronlauge und Salzsäure, bis zur neutralen Reaktion gewaschen und getrocknet. Das Pulver wurde dann auf Kapseln mit einem Inhalt von 2oo + 5 mg Harz verteilt.

Nun wurde eine Packung hergestellt, die enthielt:

A. 12 Röhrchen aus Borsilicatglas mit rundem Boden und Schraubkappen mit Teflonauskleidung. Volumen der Röhrchen: 11 ml;

B. Eine Kunststoffflasche, die 1oo Kapseln des Harzes enthielt;

C. Eine Glasflasche mit Schraubkappe, versehen mit einer Marke für 1o ml, welche 1o mg Hydroxyprolin in der Hydrochloridform enthielt;

D. Eine braune G-lasfJasche von 2oo ml mit n-Propanol;

E. Eine Kapsel mit 1o g p-Dimethylaminobenzaldehyd.

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Diese Packung enthält sämtliche wichtigen Chemikalien für die Bestimmung des Hydroxyprolingehaltes von biologischen Flüssigkeiten. Im Laboratorium, wo die Bestimmung durchgeführt wird, sollten ferner verfügbar sein: 3o $iges Wasserstoffperoxyd, o,o5-molare Kupfersulfatlösung, 3n Schwefelsäure und 2n Natriumhydroxydlösung (Natronlauge).

Beispiel 5 ' "

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Eine der in Beispiel 4 beschriebenen Packung/wurde geöffnet. Die Kapsel mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (E) wurde gelöst in n-Propanol (D). Das Standard-Hydroxyprolin (C) wurde bis zur Marke mit destilliertem Wasser aufgefüllt und zusammen mit dem Reagens (D + E) in einem Kühlschrank bei etwa 4⁰C aufbewahrt. Dann wurde eine 6 folge Wasserstoffperoxydlösung, 3n Schwefelsäure und 2n Natronlauge bereitet. Der Gesamtgehalt an Hydroxyprolin im Urin wurde gemäß Beispiel 1 bestimmt, wobei jedoch anstelle der Harzsuspension eine Kapsel mit Harz gemäß Beispiel 4 dem zu untersuchenden Urin zugefügt wurde.

Patentansprüche

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Claims (4)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Bestimmung des Hydroxyprolingehaltes einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der Flüssigkeit mit einem das anwesende freie und peptidgebundene Hydroxyprolin adsorbierenden, stark sauren Kationenaustauscherharz behandelt, worauf man durch Erhitzen eine Hydrolyse des adsorbierten peptidgebundenen Hydroxyproline bewirkt, das Hydroxyprolin eluiert und die im Eluat anwesende Menge mittels einer Farbreaktion bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Austauscherharz ein sulfoniertes Harz, insbesondere eulfoniertes Polystyrol verwendet, das vorzugsweise 2 bis 1o $ Vernetzungen aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet , daß man das Austauscherhärz in einer Teilchengröße vcn 2o bis 2oo Ai verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet , daß man die Hydrolyse durch Erhitzen auf 9o bis 1oo°C bewirkt.

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