DE2010191C

DE2010191C - Verfahren zur Herstellung eines stabilen Cytochrom c enthaltenden Pra parats

Info

Publication number: DE2010191C
Application number: DE19702010191
Authority: DE
Inventors: Nobuhisa Dr pharm Sokashi Saitama Ogawa (Japan)
Original assignee: Mochida Seiyaku K K , Tokio
Priority date: 1969-03-05
Filing date: 1970-03-04
Publication date: 1973-06-20

Description

instabil ist.

C"v'oehrt'm c verliert insbesondere seine Ak:. .

30 rasch bei rinwirkung von Sauerstoff der Luft .»jci von Licht. Abgesehen von d:.sen äußeren Einfli; -

Die vorliegende Frf'ndung bx-trifft ein Ven'aii:=i: zur is: Cvtochrom c ein hochmolekulares Protein : Herstellung von stabilen, C tochrom c enthaltenden unterliegt daher Konformationsänderungen unter ■■.,-Präparaten. türlichen Bedingungen, was zu einer Abnahme si.:: ■

Cytochrom c ist ein Häm-haltiges Protein, das in 35 Aktivität führt.

fast allen tierischen und pflanzlichen Zellen sowie Verschiedene Methoden wurden bereits zur Stac,. -

Mikroorganismen vorkommt und als wichtiger Faktor sierung von Cytochrom - enthaltenden Präparat·,·-, in der Zellatmung wirkt. Durch Untersuchungen wurde ausgearbeitet.

die biochemische Funktion dieser Substanz im cinzel- Es ist derzeit üblich, ein Reduktionsmittel, wie ■--,-

nen bekannt. Als eine Substanz in der Reihe d<"r Cyto- 40 spiclsueise Natriumsultit oder Ascorbinsäure, zu cw.-.-r chrome, wie Cytochro-n a und Cytochrom b, stellt wäßrigen Lösung von C>->chromc zuzugeben. Z Cytochrom c einen Vitalfaktor bei der Regulierung sätzlich kann ei.-e Aminosäure, ein Peptid, ein Zu, .er der Oxydationsgeschwindigkeit in einem energie- u.dgl. zugesetzt werden, um Konformationsa;.Acerzeugenden Mechanismus dar. Cytochrom c findet rungen zu verhüten Um die obengenannten Präparate daher klinisch in den Fällen von Erkrankungen An- 45 von Cytochrom c in den Handel bringen zu können. Wendung, von denen angenommen wird, daß sie auf ist es erforderlich, solche Lösungen in Ampullen abStörungen der Atmung oder mangelnder Sanrrstoff- zufüllen, wobei die Luft durch Stickstoff ersetzt sein zufuhr zu den Zellen beruhen, wie beispielsweise muß, oder nach Lyophilisation in den Ampullen die Angina pectoris, Herzinfarkt, Gehirnblutung, Gehirn- Luft durch Stickstoff zu ersetzen. Diese Verfahrensthrombose, Vergiftungdurch Drogen, Kohlenmcnoxyd- 50 malnahmen sind wesentlich für die Stabiiisierung der Vergiftung und deren Folgeerscheinungen. ^u injizierenden Präparate. Bei der Herstellung von

Auf Grund seiner pharmakologischen Wirkung innerlich anzuwendenden Arzneimitteln, wie beispielsvvird Cytochrom c als dnes der wichtigsten Mittel in weise Tabletten, Granulaten oder Suppositorien, ist der klinischen Praxis angesehen. Seine Verabreichung selbst das Einbringen von Stabilisatoren, wie beispielserfolgte bisher ausschließlich auf pirenteralem Wege, 55 weise den obengenannter. Reduktionsmitteln, Aminod.h. durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion. säuren, Peptiden und Zucker, nicht ausreichend, um Dies ergibt sich aus der üblichen physiologischen zu verhindern, daß Cytochrom e seine Aktivität verAnsicht, daß Cytochrom c, da es eine hochmolekulare liert. Solche Produkte sind demzufolge für die klinische Verbindung ist, kaum in den Organismus aufgenom- Anwendung nicht geeignet.

men werden kann, wenn es nicht parenteral verab- 60 Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von Cytoreicht wird. chrom c-Präparaten, bei denen die obengenannten

Cytochrom c, das ein aus tierischen Herzen oder aus Nachteile ausgeschaltet sind.

Mikroorganismen, wie beispielsweise Hefe, extrahier- Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von

tes Protein ist, ist gegenüber dem menschlichen Körper stabilen Cvtochrom c-Präparatcn gefunden, die sich ein Fremdprotein, das gelegentlich auf Grund einer 65 zur oralen Verabreichung eignen. Das erfindungb-Antigen-Antikörper-Reaktion eine Anaphyiaxie her- gemäße Verfahren besteht darin, ein Gemisch von vorruren kann. Seine Verwendung erfordert daher Gelatine und einer wäßrigen Lösung von Cytochrorn c größte Vorsicht. Außerdem wird das durch Injektion zu Relieren und das so erhaltene Gel unter Bedineunüen

_zu trocknen, bei denen das fotochrom c in einem kolloidalen Gelzustand verbleibt. Nach diesem Verfahren erhält man ein gelähnliches verfcsiietc-s Produkt. Beim Trockner, des Lyw.els unter Bedingur.Gcn hoher Temperaturen oder unter Gefrier-Bedingungen ä wird der Gelzustand spontan zerstört.

Mit besonderem Vorteil wird das Gemisch vor dem Trocknen dadurch in Kügelchen übergeführt, daß das Gcmiscii auf eine Temperatur, die" über Zimmertemperatur liegt, jedoch nicht so hoch ist. daß sie die Aktivität des Cytochroms c beeinträchtigt, erwärmt wird und das hierdurch erhaltene flüssige Gemisch in eine Flüssigkeit, die mit Wasser nicht" mischbar ist und die bei einer Temperatur gehalten wird, die

is:
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riser als die Temperatur des Gemisches ist. eingeht wird. Dabei kann das verflüssigte Gemisch -■_irm von Tröpfchen in diese Flüssigkeit eini.ht werden. Hierbei ist es weiterhin vorteilhaft. '.; ligeichen mit einem dehvdratisicrencen Losungs- :-^: zu trocknen.

■üidungsgemäß kann ein staoiles Cytochrom c

: iendes Präparat erh. ·η wu.den. indem ein ues kolloidales Gemisch von Cwochro'Ti c und ;!ie zunächst abgekühlt oder langsam entwässert

um es in ein Lvoge! überzuführen, und ü^--?s

.iieüend durch Entfernung von Wasser getrocknet

wobei es in einem kolloidalen Gel/a>;anci gc-

' wird. Die Zugabe von irgendeine!" .inder^n

"■hsaior als der Gelatine ist dann unnötin.

: !cühafte Ausführungsfonnen des erhndungs-

i'.en Verfahrens sind die folgenden:

(ielatine wird zu einer wäi.iri;'eii Lösung vun ;hrom c zugegeben. Die erhaltene Losung wird ollständigen Auflösung au! eine Temperatur

t. die nicht so hoch ist. daß mc die Aktivität des 35 sitorien chroms c beeinträchtigen wurde (vorzugsweise

iO bis 50⁰C). Dann wird die Lösung in eine

■ igkeit gegossen, die mn Wasser nicht mischbar

■ iid bei niedrigen Temperaturen nicht hochviskos

: oder gefriert, wie beispielsweise ein pflanzliches .·. ti Ricinusöl, Camelliaol oder flüssiges Paraffin), raiöl oder Hexadecylalkohol. und die ! ii-.ur.g dann unter Rühren abgekühlt. Die Lösung kann Lösungsmittel mit schwachem Dehydratationsvernögen begonnen wird und dann stetig /u einem Lösungsmittel mit stärkerem Dehydratationsvermögeri übergegangen wird. Die obengenannten kugelförmigen Granulate können durch geeignete Wahl der Gelatinekonzentralion, der Art des Bewegens. der Art des Eintropfens. der Art der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit und der Temperatur auf den gewünschten Durchmesser gebracht werden.

b) Das obengenannte Gemisch von Gelatine und einer wäßrigen Lösung von Cytochrom c wird dünn verteilt in eine Form gegossen, in der es zu einem Gel abgekühlt wird. Das Gel wird an der Luft bei verhältnismäßig niedriger Temperatur, bei der es seinen kolloidalen Gelzusland beibehält, vorzugsweise bei einer Temperatur unter 20" C. trocknen gelassen oder hngsam unter trockenem Gas entwässert. Die erhaltene trockene feste Substanz wird dann auf die gewünschte Größe ?erl. inert, um ein Granulat zu erhalten.

Sowohl die Arbeitsweise at als auch die Arbeitsweise b) ist zur Durchführung des e^rrmdungsgemäßen Verfahrens gut geeignet. Die Arbeitsweise a) hat der, Vorteil, daß leicht gleichförmige kugelförmige Körner erhalten werden kennen und dann auf diese Körner leicht ein Enieraluberzug oder magenresistenter t'be:- zug aufgebracht werden kann.

Zur oralen Verabreichung können die erhaltenen Granulate als Gianulatpraparate nut einem Lnteralüberzug zur Verhinderung einer Zersetzung von Cvtochrom c durch Magensäure und Pepsin verwendet werden. Sie können aber auch unter Druck zu üblichen Tabletten geformt werden, /u denen ein Excipiens zugegeben werden kann, oder sie können zu Supnodurch Suspendieren des Granulats ohne Enteraluberzug in einer Suppos.;.oriengrundmjsse. wie beispielsweise geschmolzenes gehärtetes öl. Kakaobutter oder Polväthvlenclv kol. und Gießen der Suspension in eine Form verarbeitet werden.

Die so hergestellten Cuochrom c-Präparate werden als innerlich einzunehmende Arzneimittel in Form Granulaten oder Tabletten oder als Suppo-

von

auch in die obengenannte Flüssigkeit eingetropft sitorien verwendet. Im Vergleich mit den Präparaten, die injiziert werden, fuhren sie nicht so leicht /:u einer

weiden, ^im gelartige Tröpfchen zu bilden. Diese gel- 45 Anaphylaxie. Die nach dem erfindungsgemäUen Verfahren hergestellten stabilen Cvtochr >m c-Präparai; sind sehr viel besser als die üblicher. Präparate und sowohl vom medizinischen als auch vom pharmazeutischen Standpunkt aus außerordentlich wertvoll Der erfindungsgemäße Stahilisierungsmechanismui für Cy'ochrom c ist nicht völlig geklärt, doch wird der folgende Mechanismus angenommen: Das gelierte Gemisch der wäßrigen Lösung von Cytochroim c mit Gelatine wird entwässert, während es in kolloidalem

artigen Tröpfchen werden abfiltriert, um sie abzutrennen, und umer vermindertem Druck oder trockener Luft bei einer Temperatur, die die Autrechterhaltung des kolloidalen Gelzustands gewährleistet, fehalten, um sie langsam zu trocknen. Es kann sr ei: \ollständir, verfestigtes kugelförmiges Granulat erhalten werden. Die Kühltemperatur, bei der die Kügelchen gehalten werden sollen, variiert in Abhängigkeit der Gelatinekonzentration, muß jedoch so sein,

daß die Beibehaltung des kolloidalen Gelzustands 55 Gelzus'und gehalten wird. Die Moleküle des C'yto-

!.ichergestellt ist. Vorzugsweise liegt die Temperatur chroms c werden hierdurch in einem verteilten Zu-

uiiler 20 C. stand in dem Gelatinegel gehallen. Sie werden daher

Die obige Trocknung kann mit bekannten Lösungs- äußeren Einflüssen, wie Sauerstoff oder Licht, nicht

mitteln für eine Dehydration, wie beispielsweise direkt ausgesetzt und sind wirksam vor diesen ge-

Aceton oder Alkohol, vorgenommen werden, doch 60 schützt, so daß das Cytochrom c-MoIekül einen

muß die anfängliche Trocknung unter Verwendung starken Widerstand gegen Aktivitätsverlust aufweist,

eines Lösungsmittels vorgenommen werden, das ein Bei dem eründungsgemäßen Verfahren ist die

Dehydratationsvermögen besitzt, das durch Zugabe unerläßliche Bedingung für die Stabilisierung von

von Wasser gesteuert wird. Andernfalls wird, wie Cytochrom c, das Gemisch von Gelatine und wäßriger

bekannt, nur dr<* Körneroberfläche trocken und fest, r-$ Lösung von Cytochrom c durch Entfernung des

was dazu führt, daß der kolloidale Gelzustand auf- Wassers zu trocknen, während das Gemisch in

g"hoben wird. Es ist daher zweckmäßig, die Dehy- kolloidalem Gelzustand gehalten wird. Daü dies

dratation in der Weise vorzunehmen, daß mit einem möglich ist, geht aus den folgenden Ergebnissen hervor.

Bei der Herstellung des obengenannten lyophilisierten Cytochroms c zur Injektion wurde Gelatine zu der wäßrigen Lösung von Cytochrom c vor der Lyophilisation zugegeben, um eine Verminderung des lyophilisierten Produkts zu verhindern und hierdurch dessen kommerziellen Wert zu verbessern. Es wurde gefunden, daß Gelatine unter den Bedingungen der Lyophilisation nicht zur Stabilisierung von Cytochrom c beiträgt, wie in der nachfolgenden Tabelle! gezeigt ist. Dies kann durch die Tatsache bewiesen werden, daß, wenn die Cytochrom c enthaltende Ampulle unvollständig verschlossen ist, das Eindringen von Luft und Feuchtigkeit das Cytochrom c verfärbt und die Aktivität des Cytochrom c stark herabgesetzt wird. Es ist daher im Falle des üblichen lyophilisierten Produkts mit Gelatine notwendig, daß der obengenannte Stabilisator zugesetzt wird und das Produkt vollständig von äußeren Einflüssen durch sorgfältiges Verschließen in einer Ampulle oder einem anderen Behälter abgeschlossen wird. Es ist auch zweckmäßig, die Luft in der Ampulle durch Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff, zu ersetzen.

Es ist besonders bemerkenswert, daß im Gegensatz hierzu die erfindungsgemäß erzielte Stabilisierungs wirkimg auf Cytochrom c sehr erheblich ist, wobei bei der Verwendung der gleichen Gelatine weder eine Zugabe \on anderen Stabilisatoren noch ein Verschließen des Behälters erforderlich ist. In Tabelle I sind die Ergebnisse der Lyophilisation einer Lösung von gereinigtem Cytochrom c aus Pferdeherz angegeben, die die relative Stabilität von Cytochrom c im Falle von Cytochrom c allein, C'\iochrom c, zu dem Gelatine zugegeben wurde, und Cyio- chrom c, zu welchem Natriumbisulfit zugegeben wurde, und von Cytochrom c, zu welchem Natriumbisulfit und Gelatine zugegeben wurde, zeigen. 1 ml der in Tabelle I angegebenen wäßrigen Lösungen wurde in Ampullen gegeben. Nach Lyophilisation wurden

iS die Ampullen verschlossen und in einer temperaturgeregelten Umgebung bei 45° C aufbewahrt. Anschließend wurde die Änderung der Aktivität geprüft. Die Aktivität wurde mit Hilfe des Warburg-Manometers gemessen. Proben wurden zu einem System von

ao Ascorbinsäure und Cytochromoxydase zugegeben, um den Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Die Zahlenwerte bei den Versuchsdaten geben die Restaktivität in. Prozent, berechnet aus dem Sauerstoff verbrauch des Cytochroms c, an.

Tabelle I

Proben

Zeitspanne Luft nicht durch Stickstoff

ersetzt 1 Woche 10 Wochen 30 Wochen

Luft durch Stickstoff ersetzt 1 Woche I 10 Wochen | 30 Wochen

Cytochrom c, 15 mg Cytochrom c, 15 mg; Getatine, 5 mg Cytochrom c, 15 mg; Gelatine, 50 mg

Cytochrom c, 15 mg; Natriumbisulfit, 1 mg

Cytochrom c, 15 mg; Natriumbisulfit 1 mg + Gelatine, 5 mg ...

85 81 88

96 96

58 56 60

87 85

88 88 90

98 97

70 72 73

93 92

64 65 68

91

Die Ergebnisse zeigen, daß die Gelatine in dem lyophilisierten Produkt nicht zur Stabilisierung von Cytochrom c beiträgt.

Diese fehlende Wirkung von Gelatin:· für die Stabilitierung von Cytochrom c bei der Lyophilisation scheint dadurch bedingt zu sein, daß keine koexistierende Beziehung z—ischen Cytochrom c und Gelatin«, nach der Lyophilisation vorhanden ist

Wie bereits ausgeführt wurde, beruht die vorliegende Erfind ig darauf, daß Cytochrom c allmählich absorbiert «erden kann, wobei seine wirksame Konzentration im Blut langer andauert als im Falle der Injektion und die Wirksamkeit nicht geringer als bei Injektionen ist. Eine genauere Erläuterung soll an Hand des in der Zeichnung gezeigten Diagramms erfolgen.

Die Kurven zeigen den Durchschnitt von fünf Messungen der Änderungen der Konzentration von Cytochrom c im Serum bei Versuchen, bei denen 20 mg einer Lösung von Cytochrom c aus Ffcrdeberz in die Vene und in das Doudenuni einer etwa 200 g ■wiegenden Ratte eingeführt wurden. Auf der Abszisse ist die Zeit nach der Verabreichung aufgetragen und aui der Ordinate die Menge an Cytochrom c in (ig, die in 1 ml Serum festgestellt wurde. Bei intravenöser Verabreichung (gestrichelte linie} beträgt der Wert nach 1 Stunde nach Verabreichung etwa 2 μ&'ΐηΐ und das Cytochrom c verschwindet innerhalb von 6 Stunden vollständig, so daß die Dauer der wi.' samen Konzen tration im Blut kurz ist. Bei oraler Verabreichung in das Duodenum (ausgezogene linie) wird die Konzentration über 1 μg/ml etwa 2,5 Stunden gehalten, und es ist noch etwas Cytochrom c im Blutstrom, selbst nach 6 Stunden» vorhanden. Diese experimenteller

so Ergebnisse beweisen, daß Cytochrom c durch du Wandungen des Intestinaltrakts durchgehen und ir den Blutstrom eintreten kann and daß, da diese Durchsang verhältnismäßig langsam ist, eine wirksam! Konzentration an Cytochrom c im Blut für eine ver häitJiismäßig lange Zeitspanne aufrechterhalten wer den kann.

Die bei dem vorliegenden Versuch angewendet quantitative Analyse der Cytochrom c-Konzentratio: ist ein neues Verfahren, das zur Messung von Spuret mergen an Cytochrom c im Serum ausgearbeiti wurde (N.Ogawa, H.Tajima, K.Ttjim und T. Kinothita, JonrneJ of Japanese Bit chemical Society, Bd. 42 [1970], S. 718). Dieses Ve fahren, for das bier keine Rechte beansprucht werdet zeichnet sich durch eine Empfindlichkeit aus, die 101 bis lOOOmal heiser ate diejenige der üblichen Messung der respiratorischen Aktivität oder der Messung d Absorptionsspektrums ist, se daß es möglich ist. eil

spurenmenge von nur 0,05 μg Cytochrom c pro Milliliter nachzuweisen.

Das neue Verfahren ist das folgende: Cytochrom c wird an Schafs-Erythrocyten, .die mit Formaldehyd und Gerbsäure zur Bildung von sensibil inerten roten Blutkörperchen behandeil sind, absorbiert. Diese sensi'-lisierten roten Blutkörperchen können rr.it dem Antikörper von Cytochrom c reagieren und eine Agglutination einleiten. Wenn jedoch mehr als 0,05 μg an freiem Cytochrom c in diesem P.eaküonssystem vorhanden ist, wird die Hämagglutination inhibiert. Auf diese Weise kann durch gleichzeitige Durchführung von Reaktionen in Verdünnungsreihen der Proben und in den Standardverdünnungsreihen von Cytochrom c und Vergleich des Grads der Inhibierung der Agglutination die Menge an Cytochrom c in der Probe bestimmt werden.

In der Praxis wurde eine Chromatographie des geprüften Serums unter Verwendung eines schwach sauren Ionenaustauscherharzes vom Ammoniumtyp durchgeführt. Das Cytochrom c wurde aus dem Serum abgetrennt, und die niedrigmolekulare Komponente wurde durch Dialyse entfernt. Die quantitative Analyse wurde dann unter Verwendung der obigen Hämagglutinationsinhibierungsreaktion durchgeführt. Immunologische Methoden, wie beispielsweise Blutgruppenbestimmung oder Identifizierung von Virusstämmen, zeichnen sich bekanntlich durch außeroidentlich hohe Spezifität aus. Es gibt viele Variationen dieser Methode, unter denen eine geeignete Methode für einen gegebenen Zweck ausgewählt werden kann.

Die obengenannte Methode der Hämagglutinationsinhibierungsreaktion ist unter den verschiedenen Arten dieser immunologischen Methode bemerkenswert empfindlich und eine ausgezeichnete Methode zur quantitativen Analyse von Spuren von Proteinhormon in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Gonadotropin oder Wachstumshormon. Bei der vorliegenden Erfindung wurde bei Anwendung dieser empfindlichen und spezifischen Methode in Anbetracht der Tatsache, daß Cytochrom c ein stark basisches Protein ist, das Verfahren der selektiven Extraktion und Reinigung von Cytochrom c aus dem geprüften Serum durch Chromatographie gewählt. Die Ergebnisse dieser quantitativen Analysen sind daher außerordentlich

ίο genau und reproduzierbar und zeigen die Änderung der Konzentration des verabreichten Cytochroms c im Blut genau.

Die obigen experimentellen Ergebnisse sind ein Beweis dafür, daß die Wirksamkeit von oral verab-

ts reichtem Cytochrom c ebenso gut ist wie diejenige bei Verabreichung durch Injektion.

Dies wird genauer durch den folgenden Versuch der erhöhten Wirkung auf Leukocyten gezeigt. Es ist bekannt, daß intravenös injiziertes Cyto-

ao chrom c bei der Heilung von Patienten in den häufigen Fällen einer durch Verabreichung von Antitumormitteln. wie beispielsweise Triithylenthiophosphoramid oder Mitomycin C, verursachten Leukopenie wirksam ist. In der nachfolgenden Tabelle II sind die

as Ergebnisse von Versuchen zusammengestellt, bei denen 35 mg Cytochrom c je Kilogramm Körpergewicht und je Tag an Kaninchen mit Leukopenie verabreicht wurden, nachdem die Leukopenie durch Verabreichung von Triäthylenthiophosphoramid experimentell erzeugt worden war. Die Wiederherstellung der Anzahl der Leukocyten bei diesen Tieren wurde mit der Anzahl an Leukocyten in einer KoniroHgruppe von Kaninchen verglichen. Bei diesem Versuch wurde ein Cytochrom c-Granulat, das erfindungsgemäß aus Pferdeherzmuskel hergestellt und mit einem Enteralüberzug versehen war, den Kaninchen oral verabreicht.

Tabelle II

Verabreichungstage 8

Anzahl der Leukocyten
Gruppe, der Granulat mit Enteralüberzug verabreicht wurde
Kontrollgruppe

1590
1760 2960
2970

3460
2900

5460 2860

6400 4690

Die in der Tabelle II angegebenen Werte sind Durchschnittswerte für 6 Tiere in jeder Gruppe.

Die Tiere der Kontrollgruppe erholten sich zwar von Natur aus mit einer feststellbaren Erhöhung der Anzahl der Leukocyten, doch war die Erholung in der Tcslgruppe, der das erfindungsgemäß erhaltene Granulal von Cytochrom c mit Enteralüberzug verabreicht wurde, schneller, was die Beschleunigung der Leukocytcnbildung durch Cytochrom c zeigt. Wenn der Erholungsprozeß als zwei Gruppen von dreidimensionalen Probenvektoren in den gleichen Zeitrrihcn dargestellt und die Hauptpopulationsvektoren statistisch verglichen werden, so kann zwischen beiden eine Signifikanz in einem Grad von weniger als 5% festgestellt werden.

Außerdem hat ein Vergleich praktischer klinischer Versuche zwischen dem erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrom c und injiziertem Cytochrom c ergeben, daß das erfindungsgcnäß erhaltene Cytochrom c nicht weniger wirksam als das injizierte Cytochrom c ist. Außerdem wurde bei zahlreichen klinischen Versuchen von keinem Fall einer Anaphylaxis, wie sie bei Injektionen beobachtet wird, berichtet, wenn erfindungsgemäß erhaltenes Cytochrom c verwendet wurde. Erfindungsgemäß kann daher der schwere Nachteil von Injektionen von Cytochrom c ausgeschaltet werden. Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

25 g gereinigtes Cytochrom c aus Pferdeherzmuskel wurden in 370 ml destilliertem Wasser gelöst, und 75 g Gelatine wurden zu der erhaltenen Lösung zugegeben, die anschließend auf etwa 40⁰C unter gelegentlichem Bewegen erwärmt wurde, wobei ein allmähliches Lösen auftrat. Ein graduierter Zylinder mit einem Fassungsvermögen von 1500 ml wurde mit 1200 ml Ricinusöl gefüllt. Die obere Schicht des

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Ricinusöls in dem Zylinder wurde auf 20 bis 30° C erwärmt, während die untere Schicht bei 5° C oder bei etwa diesem Wert durch Außenkühlung mit Eis oder mit einem anderen Mittel gehalten wurde. Dann wurde das Gemisch von Gelatine und Cytochrom c langsam zu der oberen Schicht des Ricinusöls in dem Zylinder unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch von Gelatine und Cytochrom c im oberen Teil des Zylinders wurde in Form von kugelförmigen Teilchen verteilt und während des Absinkens abgekühlt, wobei sich die Teilchen am Boden als gelierte Körnchen absetzten. Der größere Teil des Ricinusöls wurde dann durch Dekantieren abgetrennt, und das Wasser wurde bei einer Temperatur von unter 2O⁰C unter einem Druck von 1 mm Hg unter gelindem Rühren verdampft. Nach Entfernung des größeren Teils des Wassers wurden die Körnchen gesammelt, dreimal mit Aceton zur Entfernung des Ricinusöls gewaschen und in einem mit Phosphorpentoxyd gefüllten Exsikkator vollständig getrocknet.

Beispiel 2

10 g gereinigtes Cytochrom c aus Candida utilis, einem Hefestamm, wurden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. SO g Gelatine wurden zu der erhaltenen »5 Lösung zugegeben, die anschließend auf 40⁰C unter gelegentlichem Bewegen zur Begünstigung der allmählichen Auflösung erwärmt wurde. Unmittelbar nach der vollständigen Auflösung wurde die Lösung in eine 100 · 300-mm-Form mit einer Tiefe von 10 mm gegossen und abkühlen gelassen.

Nach vollständiger Gelierung wurde das Produkt in einem Niedrigtemperaturtrockner bei etwa 20⁰C getrocknet. Nach Trocknen wurde es auf die gewünschte Korngröße zerkleinert. Die folgenden Prüfungsergebnisse zeigen die Stabilität der erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrom c-Präparate.

Die in der nachfolgenden Tabelle III angeführte Probe besteht aus kugelförmigen Körnchen, die nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 erhalten war. Die in den nachfolgenden Tabellen IV und V angeführten Proben sind Tabletten aus den Granulaten, die nach den Beispielen 1 bzw. 2 erhalten wurden und dann zu Tabletten mit Lactose als Excipiens in üblicher Weise verarbeitet waren.

Die nachfolgenden Tabellen geben die Restaktivität

in Prozent, gemessen in der gleichen Weise wie in Tabelle I, an.

Tabelle III

Probe

Erfindungsgemäß erhaltenes Granulat

Lagerungsdauer bei 45° C 1 Woche I 10 Wochen | 30 Wochen

92

91

Tabelle IV

Probe

Erfindungsgemäß erhaltene Tabletten

Lagerungsdauer bei 45⁰C 1 Woche j lOWochen | 30Wochcn

93

89

Tabelle V

Probe

Erfindungsgemäß
erhaltene Tabletten

Lagerungsdauer bei 45" C

4 Wochen

7 Wochen

12 Wochen

96

24 Wochen

41 Wochen

94

Wie aus den Tabelle III bis V ersichtlich ist, bei-.alten die erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrom c-F; äparate trotz der Tatsache, daß ein Stabilisator, w>e er für übliche Cytochrom c-Präparate unerläßlich st, nicht verwendet wird, ihre Aktivität über eine v;hr lange Zeitspanne bei Lagerung bei 45°C bei. Bei eMcm Vergleich der Stabilität gegenüber derjenigen -on üblichen lyophilisierten Präparaten, die sich zur Injektion eignen, wie sie in Tabelle I angegeben sin:! ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß erhaltenen Präparate den üblichen Präparaten zur Injektion, £U denen Stabilisatoren zugegeben wurden und eil. in Ampullen, in denen die Luft durch Stickstoff ersetzt wurde, enthalten sind, äquivalent sind. Wie die Kurven in dem Diagramm der Zeichnung zeigen, können die erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrom c-Präparate ihre Konzentration im Blut für viele Stunden auf einem erheblichen Spiegel beibehalten.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

1 2 verabreichte Cytochrom c sehr rasch ausgeschieden. Patentansprüche: Seine Konzentration im Blut fällt innerhalb von 15 Minuten nach Verabreichung um 5070 ab. Ls ist

1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen bekannt, daß die wirksame Konzentration von Q io-Cytochrom c enthaltenden Präparats, dadurch ί chrom c im Blut nur fur eine kurze Zeitspanne vorgekennzeichnet, daß ein Gemisch von handen ist und der größere Teil des; Cytochrom =, c Gelatine und einer wäßrieen Lösung von Cyto- unaussenutzt aus dem Körper ausgeschieden wird, chrom c geliert und das erhaltene Gel unter Bedin- Um diese schweren Nachteile von Cytochrom . gungen getrocknet wird, bei denen das Cyto- auszuschalten, die dessen Brauen u-ifAci ι _3l^k c :.-chrom c in einem kolloidalen Gelzustand verbleibt. io schränken und vermindern, wurden nun Tiervers;., rc

2. Verfahren nach Anspruch 1, daHnrr.h sekenn- bezüalich der praktischen Absorptionsrate ivid -j,-r zeichnet, daß das Gemisch vor dem Trocknen da- Wirksamkeit von Cytochrom c bei oraler Verab ν-durch in Kügelchen übergeführt wird, daß das chung. die sicherer als die Verabreichung du- ■■■ Gemisch auf eine Temperatur, die über Zimmer- Injektion ist, durchgeführt. Es würde angenomn temperatur liegt, jedoch nicht so hoch ist, daß sie 15 daß der Körper auf diese Weise verabreichte C>: die Aktivität des Cytochroms c beeinli acht igt. chrome nur sehr schwer absorbieren würde, erwärmt wird und das hierdurch erhaltene flüssige Es wurde jedoch gefunden, daß im Gegensat, Gemisch in eine Flüssigkeit, die mit Wasser nicht der üblichen physiologischen Regel Cytochn· mischbar ist und die bei einer Temperatur gehalten durch die Intestinalwände langsam absorbiert wcwird. Jie niedriger als die Temperatur des Ge- 20 kann, seine wirksame Konzentration im Blut la : mibches ist, eingebracht wird. als im Falle einer Injektion vorhanden bleibt und

3 Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- Wirksamkeit nicht geringer als im Falle einer Inje·.. ■ zeichnet, daß das verflüssigte Gemisch in Form von ist. Hierauf beruht die vorliegende Erfindung Tröpfchen in diese 1 üssigkeit eingebracht wird. wurde festgestellt, daß die klinische Brauchbar

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- 25 von Cwochromc durch dessen orale Verabreic· zeichnet, daß die Kügelchen mit einem dehydraü- erhöht werden kann. Die praktische Durchfiihi sierenden Lösungsmittel getrocknet werden. ist jedoch schwierig, d.: Cvtochrom c außerordeiV