DE1617279B2

DE1617279B2 - Verfahren zur Herstellung eines die Aspergillopeptidase ARL 1 enthaltenden Präparates aus Aspergillus oryzae und sie enthaltendes Arzneimittel

Info

Publication number: DE1617279B2
Application number: DE1617279A
Authority: DE
Inventors: Axel Frederik Waldemar Eriksson; Joerg H. Prof. Dr.Med. 6000 Frankfurt Juergens; Per Olof Swaerd
Original assignee: Astra AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1965-08-27
Filing date: 1966-08-19
Publication date: 1979-08-09
Also published as: NO133235C; DE1617279C3; FI45164C; CH525251A; US3509024A; NO133235B; SE328534B; DK119790B; FI45164B; IL26344A; NL6612046A; GB1150293A; AT277454B; FI43715B; FI43715C; DE1617279A1; FR6225M

Description

Thromben sind Blutgerinnsel, die sich in einem Blutgefäß oder in einer der Herzkammern bilden und von dort in engere Gefäße wandern und dort Embolie hervorrufen können. Mittel, wie Heparin oder Cumarinderivate, die eine Koagulierung verzögern, verhindern nicht auch die Zusammenballung der Blutplättchen.

Die Isolierung einer Aspergillopeptidase mit der Bezeichnung Protease I ist in Acta Chem. Scand., Band (1963), Seiten 1521,1541, 2230 und 2239 beschrieben. Diese soll fibrinolytische Aktivität besitzen, doch ist sie nicht in der Lage, das Zusammenballen von Blutplättchen zu verhindern.

Ein solches Zusammenballen von Blutplättchen bekommt man bei viele Krankheitsarten, bei größeren chirurgischen Eingriffen und bei Geburten.

Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem bestand somit darin, ein Mittel zu erhalten, das verhindert, daß Blutplättchen sich zusammenballen und aneinander anhaften und daß die so gebildeten Thromben zu einer Embolie führen können.

Zur Lösung dieser Aufgabe enthalten erfindungsgemäß Arzneimittel als Wirkstoff die so bezeichnete Aspergillopeptidase ARL 1, die nach dem folgenden erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird.

Bei diesem Verfahren zur Herstellung eines die so

bezeichnete Aspergillopeptidase ARL 1 mit den nachfolgend angegebenen Merkmalen a) bis p) enthaltenen Präparates geht man so vor, daß man zuerst eine gegebenenfalls gereinigte Lösung von Aspergillopeptidasen, die man durch Züchtung von Aspergillus orizae erhalten hat, mit einem Ionenaustauscher als Adsorbens bei einem pH zwischen 4 und 6 behandelt, dann die adsorbierten Enzyme von dem Ionenaustauscher mit einer Eluierlösung, die auf einen pH von 6 bis 8 gepuffert ist, eluiert und sodann das so erhaltene Enzymgemisch einer weiteren Reinigung durch Gelfiltration, fraktionierte Ausfällung, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese oder Dialyse oder einer Kombination dieser Methoden unterzieht, und daß man bei diesen Verfahrensstufen die Arbeitsbedingungen den Eigenschaften der Aspergillopeptidase ARL 1 so angleicht, daß man ein Enzympräparat von Aspergillopeptidase ARL 1 erhält, welches beim Lösen oder gegebenenfalls nach dem Trocknen beim Wiederlösen in einem einspritzbaren Medium eine Lösung ergibt, durch die eine einzelne Dosis von 0,1 bis 10 mg, vorzugsweise 1 bis 4 mg, als Apergillopeptidase ARL 1 verabreicht werden kann.

Die Eigenschaften der Aspergillopeptidase ARL 1 sind folgende:

a) Protein gleichmäßiger Zusammensetzung,

b) leicht löslich in Wasser, Salzlösung und herkömmlichen gepufferten Lösungen,

c) stabil und die enzymatische Aktivität bei Raumtemperatur in Form eines trockenen Pulvers mehr als 1 Jahr behaltend,

d) stabil in etwa neutraler, wäßriger Lösung bei 4° C praktisch ohne Verlust der enzymatischen Aktivität während mehr als 2 Monaten,

e) stabil in etwa neutraler, wäßriger Lösung bei 37° C praktisch ohne Verlust der enzymatischen Aktivität während mehr als 24 Stunden,

f) mit einem für aromatische Aminosäuren enthaltende Proteine charakteristischen Ultraviolettspektrum,

g) proteolytisch aktiv gegen Kasein, Hämoglobin und .Fibrin,

h) mit einem proteolytischen Optimum mit Hämoglobin bei pH 5,0 bis 5,5,

i) nicht in der Lage, Natriumtosyl-1-argininäthylester und N-Acetyl-1-tyrosinäthylesterzu hydrolysieren,

j) fähig, das Anhaften und Zusammenballen von Blutplättchen zu vermindern,

k) Absorbierbarkeit auf Carboxymethylcellulose bei pH 5,5,

1) Eluierbarkeit daraus durch auf pH 7,5 gepufferte Ammoniumacetatlösung mit einer Molarität höher als 0,005 und vorzugsweise gleich oder höher als 0,01 bis 0,10,

m) wird während der Chromatographie durch Amberlite CG: 50 II, welches äquilibriert und mit 0,01 molarem Phosphatpuffer auf pH 7,5 eluiert wird, aufgehalten,

n) läuft durch eine Hydroxylapatitsäuie, die äquilibriert und mit 0,001 molarem Phosphatpuffer auf etwa 6,80 eluiert wird, ohne irgendeine bemerkenswerte Adsorption,

o) wird während der.Gelfiltration durch Sephadex G : 50 F so verzögert, daß sie in dem Auslauf mit ihrem Maximum bei etwa einem Drittel, des Volumenunterschiedes des Auslaufes für Glukose und des Auslaufes für Dextran von einem Molekulargewicht von 5 :10⁵ erscheint,

Ib 1/ 2/3

ρ) besitzt ein Molekulargewicht, das durch Gelfiltration als geringer bestimmt wurde, als das der Aspergillopeptidase Protease 1, die ein Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000 bei Bestimmung mit der Ultrazentrifuge besitzt. ϊ

Soweit die Aspergillopeptidase ARL 1 diese Eigenschaften besitzt und von Aspergillus oryzae stammt, kann sie bezüglich ihrer übrigen Eigenschaften etwas variieren. ι ο

Als einspritzbares Medium ist im allgemeinen Wasser bevorzugt und kann durch Zugabe beispielsweise von Natriumchlorid, Glukose oder Lävulose isotonisch gemacht werden. In Fällen, in denen die zusätzliche Verwendung anderer Arzneimittel erwünscht erscheint, ι·> können diese den einspritzbaren Lösungen zugesetzt werden, vorausgesetzt, daß sie mit diesen verträglich sind.

Bevorzugt verwendete Ionenaustauscher sind Hydroxylapatit mit einer schwachen Adsorptionskraft für die Aspergillopeptidase ARL 1, ein organisches Polymer mit Carbonsäuregruppen oder Diäthylaminoäthylcellulose. Derartige organische Polymere mit Carbonsäuregruppen sind besonders solche auf der Basis von Polysacchariden, wie Carboxymethylcellulose, oder 2ί Carboxymethyldextran, oder solche auf der Basis von Polystyrol oder Polyacrylamid.

Die bei der Züchtung von Aspergillus oryzae erhaltenen Enzymmischungen enthalten die Aspergillopeptidase ARL 1 gewöhnlich in einer Menge von etwa 1 jo Gewichts-%, berechnet auf trockenes Pulver. Man kann aber auch beachtlich mit Aspergillopeptidase ARL 1 angereicherte Präparate erhalten, wenn man ein rohes, aus dem Kulturmedium von Aspergillus oryzae gemäß der obigen Literaturstelle Acta Chem. Scand. 1963 mit r> Tannin oder Lignin^ ausgefälltes Proteasegemisch mit Carboxymethylcellulose, bei pH.5,5 behandelt und die nachfolgende Eluierung mit Pufferlösungen durchführt, deren Molaritäten von beispielsweise 0,005 oder weniger bis auf Molaritäten von 0,01 bis 0,1 allmählich ansteigen. Die günstigsten Ergebnisse erhält man mit einer Carboxymethylcellulose, die 0,7 bis 03 Milliäquiva- ■ lente Carboxylgruppen pro Gramm Carboxymethylcellulose enthält, als Ionenaustauscher. Die Anreicherung der Aspergillopeptidase ARL 1 kann variiert werden, indem man den pH-Wert variiert, bei dem die Enzyme auf der Carboxymethylcellulose absorbiert werden. Außerdem ist es möglich, bestimmte synthetische Ionenaustauscher, wie jene auf der Basis von Polystyrol oder Polyacrylamid, an Stelle von Carboxymethylcellulose zu verwenden, um den Anteil an Aspergillopeptidase ARL 1 zu steigern.

Die neue Aspergillopeptidase ARL 1 läuft durch eine Calciumphosphatsäule bei einem pH-Wert von 6,80 und bei einer Verwendung einer Phosphatpufferkonzentra- ^r>*, tion von 0,001 m ohne beachtliche Adsorption. Dieses Betragen ist typisch für kleine Moleküle, wie Peptide, und für neutrale und einige basische Moleküle (A. Tiselius et al. Arch. Biochem. & Biophys., Band 65, 1956, Seite 132). Aspergillopeptidase ARL1 wird von w) schwach sauren Ionenaustauschern, wie Amberlite CG :50 II, in Gegenwart eines 0,01 m Phosphatpuffers bei pH 7,5 adsorbiert. Verglichen mit der Protease I des Enzymgemisches wird Aspergillopeptidase ARL 1 stärker sowohl auf synthetischen als auch von Cellulose M hergeleiteten sauren Ionenaustauschern adsorbiert.

Aspergillpopeptidase ARL1 wird mehr als die anderen Komponenten des Enzymgemisches zurückgehalten, wenn dieses aus einer Säule mit vernetzten Gelfiltrationsmaterialien durch Chromatographie auf beispielsweise Sephadex-Säulen (G : 50, G : 75 oder G: 100) eluiert wird. Es ist möglich, die Protease I vollständig von der Aspergillopeptidase ARL 1 zu trennen. Aus der Durchlaufverzögerung kann. man schließen, daß das Molekulargewicht von Aspergillopeptidase tidase ARL 1 geringer als etwa 20 000 bis 30 000, geringer also als das durch Ultrazentrifugieren für Protease I bestimmte Molekulargewichte ist. Außerdem fand man, daß Aspergillopeptidase ARL 1 auf feinem Sephadex G: 50 zu etwa 30% des Unterschiedes zwischen dem Eluiervolumen von Glukose und dem von Dextran mit einem Molekulargewicht von 5xlO⁵ verzögert wird. Dieses letztere Gel verzögert Dextranmoleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 8000 bis 10 000.

Bei der Stärke-Gel-Elektrophorese wandert Aspergillopeptidase ARL 1 als eine einzige breite Spitze mit einer Beweglichkeit von 2,0 bis 2,5 cm pro Stunde bei 35 Volt pro Zentimeter in einem 0,01 m Boratpuffer von pH 8,9. Die Beweglichkeit der Hauptspitze in dem Enzymgemisch unter den gleichen Bedingungen lag bei 0,5 bis 0,8 cm. Die Wanderung ging in beiden Fällen zu dem negativen Pol hin.

Die Aktivität von Aspergillopeptidase ARL 1 gegen Kasein wurde mit der in der obigen Literaturstelle Acta Chem. Scand. 1963 beschriebenen Methode bestimmt. Das Kasein wurde mit Johnson-Lindsay-Puffer gepuffert. Man fand, daß die Hydrolyse bei pH 7,4 direkt proportional der bis zu 0,3 mg vorhandenen Enzymmenge ist. Aspergillopeptidase ARL 1 in einer Menge von-0,1 mg ergibt nach Inkubation mit Kasein bei pH 6,85 während 20 Minuten bei 37°C ein Ansteigen der optischen Dichte um 0,170.

Die Aktivität von Aspergillopeptidase ARL 1 gegen Fibrin wurde nach dem Verfahren von Dyer und Kader (Blood Band 23, 1964, Seite 729) demonstriert. Dieses Verfahren wurde auch dazu verwendet, die Hemmung durch Diisopropylfluorposphat zu untersuchen. Aspergillopeptidase ARL 1, sowie auch Protease I, wurde gehemmt. In dieser Hinsicht ähneln sie Enzymen, die die Aminosäure Serin an ihren aktiven Stellen enthalten, wie Trypsin und Chymotrypsin.

Das pH-Optimum für Aspergillopeptidase ARL 1 mit Hämoglobin als Substrat wurde bestimmt und mit dem von Protease I verglichen. 100 γ Aspergillopeptidase ARL 1-Lösung mit einem Gehalt von 1 mg/ml wurden in eine Reihe von Teströhrchen mit einem Gehalt an 2 ml Hämoglobinlösung (hergestellt nach der Methode of Biochemical Analysis II, Seite 248) mit verschiedenem pH und nach deren Äquilibrierung in einem Temperaturbad bei 37°C überführt. Nach einer lOminütigen Inkubationszeit bei 37° C wurde eine Probe von 1 ml aus einem Röhrchen entnommen und zu 4 ml einer 5%igen Lösung von Trichloressigsäure so schnell wie möglich zugesetzt. Nach innigem Vermischen ließ man das Gemisch bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen, bevor es zentrifugiert wurde. Das Zentrifugat wurde dann durch Watte filtriert. Die Extinktion des Klarfiltrates wurde auf einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 280 ΐπμ gemessen. Man fand, daß das pH-Optimum für Aspergillopeptidase ARL 1 bei 5,0 bis 5,5 liegt, während das von Protease I bei etwa 7,0 bis 7,5 liegt. Zur Untersuchung der hydrolytischen Aktivität von Aspergillopeptidase ARL 1 gegenüber Natriumtosyl-1-argininäthylester und N-Acetyl-1-tyrosinäthylester verwendete man einen pH-Regler. Das

Experiment wurde bei 30⁰C und einem pH-Wert von 7,4 durchgeführt. Als Reagenz wurde eine 0,05 m Lösung von NaOH verwendet, was einer Empfindlichkeit von 0,25 Miktromol gebildete Säure pro Skaleneinheit des Meßinstrumentes entspricht. Die eine Versuchslösung enthielt 0,5 mMol Natriumtosyl-1-argininäthylester und 0,2 mg Enzym in 10,0 ml Wasser, und die andere Versuchslösung enthielt 0,1 mMol N-Acetyl-1-tyrosinäthylester und 0,2 mg Enzym in 10,0 ml 10%igem Äthanol. In 10 Minuten konnte eine Hydrolyse der Verbindungen beobachtet werden. Beide Verwendungen werden von Protease I nicht hydrolysiert.

Aspergillopeptidase ARL 1 die ein UV-Spektrum mit den charakteristischen Eigenschaften für Proteine mit einem Gehalt an aromatischen Aminosäuren besitzt, ist in Wasser, Salzlösung und Pufferlösungen leicht löslich. In trockener Pulverform ist sie mehr als 1 Jahr ohne Verlust der enzymatischen Aktivität, d. h. ohne Verlust ihrer Eigenschaft, das.Anhaften und Zusammenballen von Blutplättchen zu verhindern, stabil. Beispielsweise sind wäßrige Lösungen bei 4° C monatelang und bei 37° C mehr als 24 Stunden ohne Verlust der enzymatischen Aktivität stabil.

Die intravenösen Toxizitäten von Protease I und Aspergillopeptidase ARL1 wurden bestimmt. Man fand, daß der LDso-Wert männlicher Albinomäuse für erstere 17,5 mg/kg und für letztere 9,5 mg/kg Körpergewicht beträgt.

Adenosindiphosphat (ADP) spielt eine wesentliche Rolle beim Zusammenballen von Blutplättchen und nimmt daher eine Schlüsselposition bei solchen Prozessen, wie Thrombose, ein. Daher wurde der Einfluß von Aspergillopeptidase ARL 1 auf die ADP-induzierte Zusammenballung von Kaninchenblutplättchen in zwei Versuchen in vitro studiert.

Im ersten Versuch verwendete man gewaschene Blutplättchen, die aus dem Blut durch Zentrifugieren isoliert und am Ende in einem künstlichen Medium suspendiert wurden. In dem anderen Versuch ließ man die Blutplättchen in ihrem natürlichen Milieu, dem Plasma, nachdem dieroten Blutzellen durch Zentrifugieren entfernt worden waren. In beiden Versuchen wurde nach Zusatz \on ADP ein Zusammenballen als eine Änderung der Trübheit oder optischen Dichte verzeichnet, und man beobachtete, wie vorausgehender Zusatz des Aspergilloproteasepräparates nach der Erfindung in vitro die ADP-Wirkung veränderte.

Bei einem dritten Versuch wurde Aspergilloprotease ARL 1 nicht in vitro zugesetzt, sondern dem Tier vor dem Sammeln der Blutproben und der Gewinnung von blutplättchenreichem Plasma verabreicht. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Enzyminjektion wurde die Zusammenballung der Blutplättchen als Reaktion auf ADP-Zusatz photometrisch wie oben geprüft, und eine Änderung gegenüber den Werten der Vorbehandlng wurde dem verabreichten Enzym zugeschrieben.

Bei Verwendung gewaschener Blutplättchen von Kaninchen, suspendiert in gepufferter Salzlösung, verursachte ADP mit dem Zusatz von Calciumionen eine starke Zusammenballung der Blutplättchen. Der Zeitablauf des Prozesses wurde durch Ablesen der optischen Dichte in Intervallen von 1 Minute verfolgt. Man fand, daß nach etwa 10 Minuten eine maximale Zusammenballung auftrat, und bei läneren Beobachtungen konnte keine weitere Steigerung mehr verzeichnet werden. Wenn der Wert für maximale Zusammenballung bei 15 Minuten, verursacht durch eine bestimmte Konzentration an Calcium und ADP, verglichen wurde, beobachtete man, daß der vorausehende Zusatz von Aspergillopeptidasepräparat nach der Erfindung in kleinen Konzentrationen (10-' — 10-^g/ml) die ADP-Wirkung hemmte. Diese Wirkung trat erst nach einer kurzen Latenzzeit auf, doch wenn sie einmal vorhanden war, wurde die Hemmung durch längere Vorinkubation nicht mehr erhöht. Die Hemmung der durch ADP induzierten Zusammenballung erfordert keine Calcium-

lü ionen, da sie auch in einem Medium zu erhalten ist das das wirksame Calciumchelierungsmittel Äthylendiamintetraessigsäure enthält. Als ein weiteres Charakteristikum dieser Hemmwirkung des Enzyms beobachtete man, daß die mit Enzym behandelten Blutplättchen, wenn die Enzymwirkung erst auftrat, wiederholt ohne wesentlichen Verlust ihrer Widerstandsfähigkeit gegen ADP-Zusatz gewaschen werden konnten.

Wenn man in vitro Aspergillopeptidasepräparat nach der Erfindung zu ungewaschenen in Plasma suspendierten Blutplättchen zusetzte, war es auch möglich, zu demonstrieren, daß dieses Enzympräparat eine Widerstandsfähigkeit gegen nachfolgenden ADP-Zusatz verursachte, obwohl die erforderlichen Konzentrationen wesentlich höher lagen als in dem oben erwähnten Versuchssystem. Die Existenz einer kurzen Latenzzeit bei der Wirkung des Enzyms wurde auch in diesem System festgestellt.

Wenn das Aspergillopeptidasepräparat intravenös Tieren verabreicht wurde, war seine Wirkung auf die

jo durch ADP induzierte Zusammenballung nicht zu beobachten, bis 24 bis 28 Stunden nach der Verabreichung vergangen waren. Der Grund für diese Diskrepanz zwischen den Ergebnissen in vivo und in vitro hinsichtlich der Latenzzeit ist bis jetzt noch nicht bekannt. Einmal aufgetreten, bestand die durch ADP induzierte Zusammenballung jedoch 3 bis 4 Tage. ^;

Die Wirkung des Enzympräparates nach der Erfindung wurde auch klinisch bei 28 Patienten untersucht, von denen einige normale, die meisten aber pathologisch erhöhte Zusammenballungswerte zeigten (normaler Wert 37%). Die Methode der Bestimmung der Zusammenballung bestand darin; daß man Plasmaproben reproduzierbaren, die Blutplättchen zusammenballenden Bedingungen während einer bestimmten Zeit unterzog, worauf die Plasmaprobe filtriert wurde. Die Zahl der Thrombozyten wurde vor und nach dem Verfahren elektronisch berechnet Das Verfahren ist im einzelnen von J. Jürgens in Lift Sciences, Band 7 (1966), Seiten 1379 bis 1387 beschrieben. Der Unterschied ist ein Maß der Zusammenballung. Die Zahl der entstandenen Thrombozyten wird in Prozent der ursprünglichen Zahl ausgedrückt und wird nachfolgend als Aggregationswert bezeichnet. Die Aspergillopeptidasepräparate nach der Erfindung wurden durch langsame intravenöse Injektion oder durch intravenöse Infusion verabreicht. Man fand, daß die Verabreichung von 120 bis 150 mg des Enzympräparates zu einer deutlichen Verminderung der Blutplättchenzusammenballung führte. In einigen Fällen war sogar eine Dosis von 60 mg ausreichend, um die erwünschte Wirkung zu erzielen. Ein Ansteigen der Dosis auf 180 bis 200 mg verursachte eine anhaltendere Wirkung. Durch wiederholte Verabreichung von beispielsweise 150 mg alle 4 bis 6 Tage war es möglich, für eine sehr lange Zeit niedrige Aggregationswerte zu erhalten. Bei diesen Versuchen wurde das Präparat sehr gut vertragen, ohne daß ernsthafte Nebenwirkungen auftraten.

Wenn Aspergillopeptidasepräparate nach der Erfin-

dung in der Therapie zur Verhinderung der Bildung von Thromben und Embolie verwendet werden, sollte man sie durch langsame intravenöse Injektion oder intravenöse Infusion verabreichen. Bei Verwendung eines Enzymgemisches, in dem Aspergillopeptidase ARL 1 in einer Menge von etwa 1 bis 2 Gewichts-%, berechnet auf trockenes Pulver, vorhanden ist, variiert die Dosis im allgemeinen zwischen 50 und 200 mg, und diese Dosis sollte alle 4 bis 6 Tage verabreicht werden, um eine ausgedehnte Wirkung zu erzielen.

In den Zeichnungen erläutern

Fig. 1 und Fig.2 die Wirkung einer einzelnen intravenösen Dosis von je 120 bzw. 150 mg des Aspergillopeptidasepräparates nach der Erfindung auf drei Patienten und

F i g. 3 die Wirkung wiederholter intravenöser Dosen von 150 mg des Aspergülopeptidasepräparates auf einen Patienten. -

Die folgenden Experimente dienen der Erläuterung des Einflusses der Aspergillopeptidase ARLl auf das Anhaften und Zusammenballen von Blutplättchen.

Experiment A

Blut erhielt man aus einem mit Äther anästhesierten Kaninchen mit Hilfe einer in eine Halsarterie eingeführten Kunststoffkanüle. Das abgenommene Blut wurde unmittelbar mit 0,075 Volumenteilen 0,077 m Natriumäthylendiamintetraessigsäure, eingestellt auf pH 7,4, in einem Kunstoffzentrifugenröhrchen vermischt. Bei allen nachfolgenden Operationen wurden silikonisierte Glasgeräte verwendet. Das Blut wurde in einer gekühlten Zentrifuge:(5°C) währen 12 Minuten zentrifugiert, um die. roten Blutzellen zu entfernen. Die oberen drei Viertel der überstehenden Flüssigkeit, die die Blutplättchen enthielten wurden wiederum zentrifugiert, wobei sich die Blutplättchen absetzen. Das Sediment wurde durch erneute Suspendierung in. einem Gemisch gewaschen, das 0,154 m Natriumchlorid, 0,154 m Trishydrochloridpuffer von pH 7,4 und 0,07 m Äthylendiamintetraessigsäure in den Verhältnissen 90 :8 :2 enthielt -Das Zentrifugieren,wurdei 12 Minuten wiederholt. Die Blutplättchen -wurden schließlich in trisgepufferter Salzlösung (0,154 m Natriumchlorid und 0,154 m Trispuffer von pH 7,4 im Verhältnis von 9:1) suspendiert, um etwa 5000 Blutplättchen pro Kubikmillimeter zu ergeben. Solche Blutplättchensuspensionen wurden nicht mehr als 5 Stunden in Eis aufbewahrt.

Für den Versuch wurden 3,0 ml der Suspension in eine silikonisierte Kolorimeterröhre gegeben, die in ein Klett-Summerson-Kolorimeter eingesetzt wurde. Es wurde mit Hilfe eines silikonisierten Glasstabes gerührt, der in einen bei 1000 U/Min, arbeitenden Synchronmotor eingesetzt war. Jede Minute wurde bei· 620 ιτιμ abgelesen. Ein 4,5-minütiger Kontrollversuch fand statt, bevor irgendwelche Zusätze zugegeben wurden. Zu der leeren Lösung wurden die nötigen Zusätze in Mengen von 10 μΐ zugegeben. Calciumionen setzte man in der Form einer Lösung von CaCb zu, um eine Endkonzentration in der Versuchsprobe von 1,1 mMol zu erhalten. Beispielsweise wurde ADP bis zu einer Konzentration von 8 μg/ml zugegeben. Die Wirkung von 1,001 und 0,01 μg Enzympräparat pro Milliliter Suspension Minuten vor der ADP-Zugabe wurde mit einer Kontrollprobe verglichen, in der Salzlösung an Stelle des Enzyms zugesetzt wurde.

Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgeführt, wobei die Angaben die maximale Zusammenballung Minuten nach der ADP-Zugabe wiedergeben:

Zusatz

Prozent Zusammenballung

Kontrollprobe (CA ⁺ +, ADP)
Enzympräparat 0,001 μg,
CA⁺+,ADP
Enzympräparat 0,01 μg,
CA + + ,ADP

61 2 5

ίο

Experiment B

Eine Blutplättchensuspension wurde, wie in Experiment A hergestellt. Äthylendiamintetraessigsäure wurde bis zu einer Konzentration von 1,5 mMol zu der Suspension zugesetzt. Enzympräparat A wurde in Dosen von 0,001,0,01 und 0,1 mg^g Suspension mit den Blutplättchen 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach sie zentrifugiert, abgelagert, danach einmal gewaschen und wie Experiment A wieder suspendiert wurden. Als Kontrolle wurde eine suspensionsprobe in gleicher Weise behandelt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Enzym weggelassen wurde. Calciumionen und ADP wurden 5 Minuten nach dem Einlegen der Proben in das Kolorimeter zugesetzt.

Zusatz	Prozent -·'.'.
	Zusammenballung
Kontrollprobe (Ca+ +, ADP)	52
Enzympräparat 0,001 y/ml,
Ca++,ADP	2
Enzympräparat 0,01 y/ml,
Ca++, ADP	15
Enzympräparat 0,1 y/ml,
Ca++,ADP	15

Experimente

Blutplättchensuspensionen wurden wie in Experiment A beschrieben hergestellt. Das Enzympräparat: wurde bis zu einer Konzentration von 0,001 μg/ml Suspension mit den Blutplättchen- bei Raumtemperaturi5:Minuten : lang inkubiert. Nach dieser Zeit wurden verschiedene Proben zentrifugiert und, wie in Experiment A beschrieben, einmal, zweimal und dreimal vor der Endsuspendierung gewaschen. Die Wirkung der Calciumionen und der ADP wurde gemessen. Als Kontrolle wurde eine Probe der Blutplättchensuspension ohne Enzym dreimal vor dem Versuch gewaschen.

Behandlung

Prozent Zusammenballung

Kontrolle, dreimal gewaschen
(Ca++,ADP) 51

Enzympräparat, einmal gewaschen, Ca++,ADP 20

Enzympräparat, zweimal gewaschen. Ca++,ADP 19

Enzympräparat, dreimal gewaschen, Ca++,ADP 17

Experiment D

Für die Herstellung von blutplättchenreichem Plasma wurde Blut, wie in Experiment A beschrieben, gesammelt, mit der Ausnahme, daß 3,8%iges Trinatriumcitrat als Antikoagulans verwendet und mit dem Blut im Mengenverhältnis von einem Teil Citrat zu neun Teilen Blut vermischt wurde. Zentrifugieren wurde bei

909 532/8

ίο ι/

Raumtemperatur während 15 Minuten durchgeführt. Von der resultierenden blutplättchenreichen darüber stehenden Flüssigkeit wurden die obersten drei Viertel für den Versuch verwendet. In diesem Versuch brauchen keine Calciumionen hinzugesetzt zu werden, während ADP in einer Endkonzentration von 8 μg/ml Plasma verwendet wurde. Die Zusammenballung wurde wie in Experiment A geschätzt. Enzympräparat A wurde bis zu einer Endkonzentration von 10,25 und 50 μg/ml Plasma 10 Minuten vor der Zugabe von ADP zugesetzt. Der Grad der Hemmung im Vergleich zu der Kontrollprobe ohne Enzym wurde berechnet.

geschätzt. Man setzte Aspergillopeptidase ARL 1 zu der Suspension 10 Minuten vor der ADP-Zugabe zu.

Zusatz Prozent Zusammenballung

Zusatz

Prozent
Zusammenballung

10

15 Kontrollprobe (Ca⁺ +, ADP)
Aspergillopeptidase ARL 1,
10->g/ml,Ca++,ADP 51

Aspergillopeptidase ARL 1,
10-^g/ml,Ca⁺⁺,ADP 0

Aspergillopeptidase ARL 1,
10-^g/ml,Ca++,ADP 0

Aspergillopeptidase ARL 1,
10-<^g/ml,Ca++,ADP 0

20

Enzympräparat 10 μg/ml, ADP 24

Enzympräparat 25 μg/ml, ADP 47

Enzympräparat 50 μg/ml, ADP 62

Experiment E

5 ml Blut wurden von einem männlichen Albinokaninchen mit einem Gewicht von 2,2 kg abgenommen. Das Blut wurde mit Citrat und blutplättchenreichem Plasma, 25 Zusatz das wie in Experiment D hergestellt worden war, vermischt Die'Wirkung der zugesetzten ADP auf die Blutplättchen in dem Plasma in vitro wurde wie in Experiment B gemessen. Danach wurden 4,0 mg/kg Enzympräparat durch Infusion intravenös verabreicht und blutplättchenreiches Plasma zu verschiedenen Zeiten nach dieser Behandlung gesammelt. Die Zusammenballung in vitro nach ADP-Zugabe wurde wie oben ermittelt

r> Experiment G

Blutplättchenreiches Plasma wurde wie in Experiment A hergestellt, und die Wirkung von ADP wurde wie dort ermittelt Zum Vergleich der Wirksamkeit bei der Reduzierung der Zusammenballung wurden Aspergillopeptidase ARL 1 und Enzympräparat 10 Minuten vor der ADP-Zugabe zugesetzt.

Prozent Zusammenballung

Kontrollprobe (ADP) 55

Enzympräparat 50 μg/ml, ADP 45 Aspergillopeptidase ARL 1,

5^g/ml,ADP 15

	Prozent
	Zusammenballung
Vorder Injektion	56
4 Stunden nach der Injektion	55
1 Tag nach der Injektion	34
2Tage nach der Injektion	39
3 Tage nach der Injektion	38"
4 Tage nach der Injektion	44
7 Tage nach der Injektion	59

40

Zum Studium der Wirkung über eine lange Zeit hinweg verabreichte man einem männlichen Albinokaninchen mit einem Gewicht von 4,15 kg intravenös 4,0 mg/kg Enzympräparat. Am fünften Tag wurde eine ^r>o zweite Dosis von 4,0 mg/kg des Enzyms verabreicht.

	Prozent
	Zusammenballung
Vorder Injektion	61
1 Tag nach der Injektion	51
3 Tage nach der Injektion	40
4 Tage nach der Injektion	39
5 Tage nach der Injektion	52
Zweite Injektion
6 Tage nach der ersten Injektion	40
7 Tage nach der ersten Injektion	20

Experiment F

Blutplättchensuspensionen wurden wie in Experiment A hergestellt, und die Wirkung von ADP wurde wie dort Zur Erläuterung der Wirkung von Aspergillopeptidase ARL 1 bei Menschen wurden die folgenden Versuche ausgeführt:

120 mg Enzympräparat in der Form eines sterilen, trockenen Pulvers wurden in 500 ml einer 5%igen Levuloselösung aufgelöst und durch intravenöse Infusion mit einer konstanten Geschwindigkeit während einer Stunde einem Patienten verabreicht, dessen Blutplättchen-Aggregationswert vor der Behandlung bestimmt worden-war. Nach Beendigung der Infusion wurde die Wirkung auf die spontane Zusammenballurig durch Studium der Plasmaproben in regelmäßigen Abständen verfolgt.

In Fig. 1 der Zeichnung sind die Ergebnisse für drei Patienten aufgeführt. Vor der Behandlung zeigten ein Patient einen normalen und zwei Patienten einen pathologisch erhöhten Aggregationswert. In all den Fällen beobachtete man ein merkliches Abfallen der Zusammenballung mit einer maximalen Herabsetzung am vierten Tag nach der Verabreichung.

In gleicher Weise wurden 150 mg Enzympräparat verabreicht, und die Wirkung wurde wie oben beschrieben beobachtet. F i g. 2 der Zeichnung zeigt die Ergebnisse an drei Patienten, die mit dieser Dosis behandelt wurden. Man beobachtete eine bemerkenswerte Erniedrigung des Aggregationswertes.

Ein Patient mit einer stark erhöhten Zusammenballung der Blutplättchen, bei dem daher die Gefahr bestand, daß er einen Thrombus oder Embolie bekam, wurde mit wiederholten Dosen von 150 mg behandelt, worauf die Wirkung auf.die Zusammenballung bestimmt wurde.

Die Ergebnisse sind in F i g. 3 der Zeichnung gezeigt. Eine merkliche Verminderung der Zusammenballung wird schon nach der Verabreichung der ersten Dosis beachtet, und durch Verabreichung weiterer Dosen ist

iO 1 / Li

es möglich, die Zusammenballung ohne Schwankungen über eine lange Zeit hin auf einem niedrigen Stand zu halten.

Beispiel 1

A: 85 g eines mit Tannin aus einem Kulturmedium von Aspergillus oryzae ausgefällten Proteasegemisches wurden in 725 ml Wasser zusammen mit 29 g Natriumacetat gelöst, dann wurde der pH auf 6,5 mit NaOH eingestellt. Nach 45minütigem Rühren der Suspension ι ο und Zugabe von 8,5 g Dibenzyläthylendiacetat wurde zentrifugiert Das Sediment wurde mit 150 ml Wasser gewaschen und noch einmal zentrifugiert. Die Lösungen der beiden Zentrifugierungen wurden vereinigt und nach Zugabe von 18 g Celite als Filterhilfe filtriert. Das Filtrat, 990 ml, wurde 17 Stunden gegen 851 Wasser dialysiert und anschließend auf 1700 ml Wasser verdünnt. Nach Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 5,5 mit Essigsäure setzte man 255 g mit Ammoniumacetat auf pH 5,5 äquilibrierte Carboxymethylcellulose zu. Die Carboxymethylcellulose wurde mit den adsorbierten Enzymen abgetrennt und dreimal mit 170 ml Wasser von pH 5,5 gewaschen. Diese Carboxymethylcellulose wurde nacheinander und getrennt mit Mengen von je 640 ml wäßriger Lösungen von 0,005 m, 0,01 m, 01 m Ammoniumacetatlösungen behandelt, die alle auf pH 7,5 eingestellt waren. Für jede Behandlung wurde das System mit 5 g Celite als Filterhilfe filtriert. Die Filtrate wurden getrennt der Gefrierrocknung unterzogen. Für jede Behandlung erhielt man ein trockenes, jo pulverartiges Präparat mit einem höheren Prozentgehalt an Aspergillopeptidase ARL 1 als in jedem der vorausgehenden Präparate. Die Gesamtmenge an trockenem Pulver nahm jedoch mit der Zeit ab. In der ersten erhaltenen Enzymmischung betrug die Konzentration von Aspergillopeptidase ARL 1 etwa 1%. In dem vierten Präparat variierte sie zwischen 40 und 60%. Die Gesamtmenge an Material in den vier Präparaten betrug etwa 2,6 g. 1,3 g, 0,36 g und 0,59 g. Wenn an Stelle einer Ammoniumacetatlösung eine mit Phosphat gepufferte Lösung verwendet wurde, mußten die Filtrate ^sorgfältig dialysiert werden, bevor sie der Gefriertrocknung unterzogen wurden, wobei wesentliche Verluste an Aspergillopeptidase ARL 1 auftraten.

B: Vier Hydroxylapatitsäulen mit einer Länge von 17 bis 20 cm und einem Durchmesser von etwa 1 cm wurden verwendet (der Hydroxylapatit wurde nach A. Tiselius et al. Archives of Biochemistry and Biphysics, Band 65, 1956, Seite 132 hergestellt). Nachdem die · Säulen mit 0,001 m Phosphatpuffer auf pH 6,80 äquili- so briert worden waren, wurden 30 mg der ersten gemäß Beispiel 1-A erhaltenen Enzymmischung, die außerdem mit Diäthylaminoäthylcellulose bei pH 6,0 mit 0,025 m Ammoniumacetat, gelöst in 3 ml des Puffers, behandelt worden waren, in jede der Säulen eingefüllt. Die Eluierung wurde mit dem Puffer durchgeführt, und der Auslauf wurde in Fraktionen von etwa 3 ml aufgefangen. Die Extinktion der Fraktionen wurde bei der Wellenlänge von 280 ΐημ bestimmt. Einen Peak erhielt man gleich nach dem Leervolumen der Säule. t>o Alle zu diesem Peak gehörenden Fraktionen wurden zusammengegossen und in einem Rotationsverdampfer auf '/5 des Anfangsvolumens konzentriert. Diese Lösung wurde anschließend auf eine Sephadex G : 50-Säule gegeben, die etwa 27 g mit 0,04 m Phosphatpuffer t^ auf pH 6,80 äquilibriertes Sephadex enthielt (das Leervolumen dieser Säule wurde mit Hilfe eines blaugefärbten Dextranderivates mit einem Molekulargewicht von 500 000 bestimmt und betrug etwa 40 ml, das Auslaufvolumen von Glukose betrug etwa 135 ml). Beim Eluieren der Säule mit dem 0,04 m Puffer erschien Aspergillopeptidase ARL1 bei 60 bis 80 ml. Alle Fraktionen wurden auf ihre antigenen Eigenschaften untersucht. In einer Reihe von Versuchen variierte die isolierte Menge an Aspergillopeptidase ARL 1 zwischen 0,5 und 2,0%.

In einigen Fällen wurde die Gelfiltrationsstufe weggelassen, und es war auch dann möglich, reine Aspergillopeptidase ARL1 zu erhalten. In solchen Fällen wurde die Lösung dialysiert, bevor sie auf die Hydroxylapatitsäule aufgegeben wurde. Nach 16 Stunden Dialyse wurde die Lösung auf die Hydroxylapatitsäule gegeben und wie oben beschrieben behandelt.

Ähnliche Ergebnisse erhielt man, wenn man ein handelsübliches Calciumphosphät an Stelle des oben genannten Hydroxylapatitpräparates verwendet.

Beispiel 2

Zwei Sephadex G:50-Säulen, beide mit einer Querschnittsfläche von 8 cm² und mit einer Länge von 47 bzw. 93 cm, wurden mit einem Aufzeichnungsabsorptiometer ausgestattet. Die Säulen wurden äquilibriert und anschließend mit einem 0,001 m Phosphatpuffer für pH 6,80 und mit einem Gehalt von 9 g NaCl pro Liter eluiert. Nachdem die beiden Säulen so miteinander verbunden worden waren, daß der Auslauf aus der kleineren Säule in die größere Säule eintrat, wurden 302 mg des Ausgangsmaterials von Beispiel 1-B, gelöst in 4,9 ml Puffer auf die kleine Säule aufgegeben. Wenn das erste Absorptiometer 3 Peaks für »hohes Molekulargewicht« aufgezeichnet hatten, wurden die beiden Säule gelöst, und die Komponenten mit hohem Molekulargewicht wurden aus der größeren Säule als drei gut getrennte Peaks eluiert. Der dritte Peak war die Aspergillopeptidase ARL 1.; /

Beispiel 3

Ein mit Tannin aus dem -Kulturmedium von Aspergillus oryzae ausgefälltes Proteasegemisch wurde mit Carboxymethylcellulose bei pH 5,5 behandelt. Ein rohes Gemisch wurde von der Carboxymethylcellulose mit 0,005 m Ammoniumacetatpuffer von pH 7,5 eluiert. Das Produkt war ein Enzymgemisch. 30 mg eines trockenen Pulverpräparates hiervon wurden in 3 ml Puffer gelöst, 16 Stunden dialysiert und dann auf eine Hydroxylapatitsäule der gleichen Größe wie in Beispiel 1-B aufgegeben, nachdem die Hydroxylapatitsäule äquilibriert und anschließend mit 0,001 m Phosphatpuffer von pH 6,80 eluiert worden war. Bei dem Leervolumen erschien eine kleine Komponente von mutmaßlich niedrigem Molekulargewicht unmittelbar gefolgt von Aspergillopeptidase ARL 1.

Das Enzym wurde weiterhin gereinigt und durch Gelfiltration auf Calciumphosphät gereinigt.

Die Säule mit den Abmessungen 2 χ 109 cm wurde mit entionisiertem Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/Std. eluiert. Der mittlere Teil des Hauptpeaks wurde aufgefangen und lyophilisiert. Man erhielt ein farbloses Pulver. Ausbeute 1,5%. Die Carboxymethylcellulose wurde anschließend mit Ammoniumacetatpuffer von höherer Molarität (0,01 bis 0,1 m) eluiert, wobei man trockene Pulverpräparate mit einem beachtlich höheren Gehalt an Apergillopeptidase ARL 1 erhielt, wenn auch in kleineren Mengen.

Beispiel 4

Eine Säule von Amberlite CG: 50 II wurde äquilibriert und anschließend mit 0,01 m Phosphatpuffer von pH 7,50 eluiert. 58 mg trockenes Pulverpräparat eines Eluates (erhalten durch eine zweite Eluierung der Carboxymethylcellulose von Beispiel 3 mit 0,01 m Ammoniumacetatpuffer von pH 7,5) wurden in 1 ml 0,01 m Phosphatpuffer von pH 7,50 gelöst, gegen 500 ml dieses Puffers während eines Tages dialysiert und auf die Säule gegeben. Bei einem Eluiervolumen, 3 bis 4mal so groß wie das Leervolumen, wurde Aspergillopeptidase ARL1 isoliert. Die Ausbeute betrug etwa 30 Gewichts-% der gesamten zugesetzten Menge.

Das Betragen von Aspergillopeptidase ARL 1 (erhalten nach Beispiel 3) bei der Gelelektrophorese wurde untersucht. Die verwendete Apparatur ist in Bull. Soc. Chim. Biol., Band 43 (1961), Seite 943 beschrieben.

Der Puffer besaß die folgende Zusammensetzung: 1,42 g Borsäure, 0,37 g NaOH pro Liter entionisiertes Wasser mit pH 8,9.

Die hydrolysierte Stärke war ein handelsübliches Produkt das speziell für die Gelelektrophorese hergestellt wird. Die Konzentration der Stärke in den Gelstreifen betrug 15%. Die Menge an Aspergillopeptidase ARL 1, die auf das Elektropherogramrn aufgegeben wurde, betrug 0,5 mg, gelöst in 2,5 μΐ entionisierten Wassers oder Puffer. Die verwendete Spannung betrug 35 Volt pro Zentimeter, und die Zeit der Durchführung der Elektrophorese betrug 1 Stunde.

Zur Entdeckung der Proteine nach der Elektrophorese wurden die Streifen in ein Bad getaucht, das folgende Substanzen enthielt: 0,1 g Amidoschwarz, 45 ml Glycerin, 45 ml Wasser und 10 ml Essigsäure. Die Streifen

ίο wurden in dem Gemisch von Glycerin, Wasser und Essigsäure mehrere Stunden gewaschen.

Die Verteilung der proteolytischen Aktivität in dem Elektropherogramm erhielt man durch Zerschneiden der Gelstreifen in Abschnitte von 2 mm Breite. Die Streifen wurden in Versuchsröhrchen gegeben, worauf 3 ml eines 0,2 η Phosphatpuffers von pH 6,0 zugegeben und darauf die Streifen in einem Mischer zerrissen wurden. Die proteolytische Aktivität in jedem Röhrchen wurde nach der Kaseinasemethode bestimmt (Acta Chem-Scand. 17,1963, Seite 1521).

Die proteolytische Aktivität fiel mit der gefärbten Zone in dem Elektropherogramm zusammen. Nur eine gefärbte Zone konnte entdeckt werden. Die Entfernung, ( über die die Aspergillopeptidase ARL 1 gewandert war, lag zwischen 2,0 und 2,5 cm zu dem negativen Pol hin.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines die so bezeichnete Aspergillopeptidase ARL 1 mit den in der Beschreibung für dieses Enzym angegebenen Merkmalen a) bis p) enthaltenden Präparates, dadurch gekennzeichnet, daß man zuerst eine gegebenenfalls gereinigte Lösung von Aspergillopeptidasen, die man durch Züchtung von Aspergillus oryzae erhalten hat, mit einem Ionenaustauscher als Adsorbens bei einem pH zwischen 4 und 6 behandelt, dann die adsorbierten Enzyme von dem Ionenaustauscher mit einer Eluierlösung, die auf einen pH von 6 bis 8 gepuffert ist, eluiert und sodann das so erhaltene Enzymgemisch einer weiteren Reinigung durch Gelfiltration, fraktionierte Ausfällung, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese oder Dialyse oder einer Kombination dieser Methoden unterzieht, und daß man bei diesen Verfahrensstufen die Arbeitsbedingungen den Eigenschaften der Aspergillopeptidase ARL 1 so angleicht, daß man ein Enzympräparat von Aspergillopeptidase ARL 1 erhält, welches beim Lösen oder gegebenenfalls nach dem Trocknen beim Wiederlösen in einem einspritzbaren Medium eine Lösung ergibt, durch die eine einzelne Dosis von 0,1 bis 10 mg, vorzugsweise 1 bis 4 mg, als Aspergillopeptidase ARL 1 verabreicht werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher für die Behandlung der Aspergillopeptidasenlösung Hydroxylapatit mit einer schwachen Adsorptionskraft für die Aspergillopeptidase ARLl, ein organisches Polymer mit Carbonsäuregruppen oder Diäthylaminoäthylcellulose verwendet.

3. Arzneimittel, enthaltend die nach Anspruch 1 oder 2 gewonnene Aspergillopeptidase ARL 1 als Wirkstoff.