DE2459915B2

DE2459915B2 - Aktive Verbindung des Plasminogen-Typs, Verfahren zu ihrer Reinigung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2459915B2
Application number: DE2459915A
Authority: DE
Inventors: Jean Oissel Goulay; Jean-Claude Maromme-La- Maine Lormeau; Edmond Paris Vairel
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1973-12-18
Filing date: 1974-12-18
Publication date: 1980-06-19
Also published as: FR2254316A1; DK657074A; DE2459915C3; DK144023C; JPS50116611A; SE431613B; IE40555L; AU508321B2; NL183462C; JPS6042207B2; CA1046406A; CH626808A5; ES433002A1; GB1495289A; SE7415963L; FR2254316B1; BE823522A; NL183462B; NL7416522A; US4115551A

Description

Die Erfindung betrifft eine aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs, ein Verfahren des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs, ein Verfahren zu ihrer Reinigung und die Verwendung diesei" Verbindung zur Bekämpfung von Fibrinolysc-Unterfunktionen.

Das Plasminogen, das auch als Profibrinolysin bezeichnet wird, ist ein Protein, das normalerweise in dem Plasma vorhanden ist und durch Einwirkung eines Aktivators, wie einer Kinasc, in Plasmin (oder Fibrinolysin) umgewandelt werden kann. Aufgrund der Eigenschaft des Plasmins, eine schnelle Lösung von Blutklumpen zu bewirken, ist bereits vorgeschlagen worden, Plasminogen als wirksames Prinzip von thrombolytischcn Arzneimitteln zu verwenden.

Es ist bereits eine Reihe von Verfahren zum Extrahieren von Plasminogen vorgeschlagen worden (siehe die deutschen Offenlegungsschriften 20 57 401, 92 052 und 14 92 054). Vorzugsweise und insbesondere wenn eine Verwendung als wirksames Prinzip in thrornbolytisclien Medikamenten angestrebt wird, muß dieses Plasminogen menschlichen Ursprungs sein. Die in Frage kommenden Pbisminogen-Quellen sind im we sentlichen Blutplasma «nd, bis zum heutigen Tage in geringerem Ausmaß, menschliche Plazentas.

Das Plasma scheint iin der Tat das Ausgangsmaterial der Wahl für die Gewinnung von Plasminogen zu sein. Dieses Material liegt tatsächlich zusammen mit anderen

ίο Proteinen in gelöstem Zustand in dem Plasma vor und kann relativ leicht mit Hilfe von Fraktionierverfahren, insbesondere jenen, die eine fraktionierte Ausfällung anwenden, von den anderen Proteinen abgetrennt werden. So ist bereits vorgeschlagen worden, die bekannte Eigenschaft gewisser Inhibitoren des Plasminogens, die Löslichkeit dieser Verbindungen in einem schwach sauren Medium, insbesondere einem Medium mit einem pH-Wert zwischen 53 und 6 zu steig '-rn/dazu anzuwenden, die Ausfällung einer gewissen Menge von es begleitenden Proteinen in den Plasmapräparaten zu bewirken.

Aufgrund der Tatsache, daß die Plasmas im allgemeinen für andere Verwendungszwecke reserviert sind, hat sich das Interesse auf menschliche Plazentas, insbesondere auf das Plazentablut als mögliche Plasminogen-Quelle gerichtet Es ist jedoch festzustellen, daß die Plasminogenextraktionstechniken, die auf Plasma angewandt werden und die im Laboratorium untersucht worden sind, nicht ohne weiteres auf die Extraktion von

so Plasminogen aus dem Plazentablut angewandt werden können, was zweifelsohne eine Folge der unterschiedlichen Natur der Proteine und der Lipide ist, die das Plasminogen in dem Plazentablut begleiten. Dieses enthält insbesondere Plasmin in erhöhten Mengen. Die Trennung des Plasminogens von Plasmin ist jedoch nur schwer zu bewirken.

Es ist weiterhin fc 'zuhalten, daß sämtliche bekannten Verfahren zur Extraktion von Plasminogen aus menschlichem Plazentablut wäßrige Extraktionsmedien

4» benutzen, insbesondere um die Aktivierung des

Plasminogens über das Plasmin zu verhindern, die durch

die Einwirkung von natürlichen Aktivatoren erfolgt, die in diesem Ausgangsmaterial enthalten sind.

Es sei jedoch in Erinnerung gerufen, daß der pH-Wert

der Extraktionsmedien nicht ohne Wirkung auf die physikalischen Eigenschaften der erhaltenen Plasminogene ist Insbesondere verursacht das Ansäuern des Mediums, und ganz besonders auf pH-Werte unterhalb 5 bis 6, eine Veränderung gewisser physikalischer

5» Eigenschaften des Plasminogens. In -^wissen Fällen sind die Stabilität und die Löslichkeit des in saurem Medium erhaltenen Plasminogens in neutralem Medium stark vermindert, verglichen mit den entsprechenden Eigenschaften des nativcn Plasminogens.

Die Löslichkeit des unter diesen Bedingungen erhaltenen Plasminogens kann sicherlich ein wenig und in reversibler Weise dadurch verbessert werden, daß man dem Medium gewisse Inhibitoren, die gegen die Aktivierung des Plasminogens wirken, zusetzt oder die

Mi lonenstärkc des Mediums modifiziert, insbesondere durch Zuführung von Salzen in bestimmten Verhältnissen. Die Anwesenheil dieser Inhibitoren oder dieser Salze in den erhaltenen Lösungen macht nun die Verwendung dieser Lösungen zur Herstellung von

M Medikamenten schwierig, wenn nicht unmöglich, insbesondere wenn es sich um parenteral zu verabreichende Arzneimittel handelt, leder Versuch, zuvor diese Inhibitoren oder Salze zu entfernen, führt zu einer

erneuten Ausfällung des Plasminogen* aus diesen Lösungen,

Es ist auch, und insbesondere in der FR-PS 13 47 029, ein Verfahren ZW Extraktion eines Mittels, das Plasminogeneigenschaften besitzt, und das insbesondere in der Lage ist, Rinderblut gegen die Einwirkung von Streptokinase empfindlich zu machen, beschrieben worden, das in diesem Fall von gefrorenen und zu Breien verarbeiteten Plazentas ausgeht Es handelt sich jedoch auch in diesem Fall stets um ein Extraktionsverfahren, das in saurem Medium abläuft Man erhält ein Produkt, das in gewissem MaBe löslich gemacht werden kann, insbesondere wenn man zu den oben bereits erwähnten Hilfsmitteln greift Es enthält jedoch erhebliche Mengen von Proteinen, insbesondere Plasmin. Andererseits ist zu beobachten, daß die Anwesenheit dieser anderen Proteine eine nicht zu vernachlässigende Rolle bei der Löslichmachung des Produktes spielt da jeder Versuch, anschließend diese Proteine zu entfernen, von einer Ausfällung der Fraktion begleitet wird, die eine starfe Plasminogenwirkung besitzt

Aus der DE-OS 2057401 ist ein Verfahren zur Isolierung von nativem hochgereinigtem Plasminogen bekannt gemäß dem eine Plasminogen enthaltende Plasma- oder Serumfraktion an einem Träger adsorbiert und durch Waschen mit einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 vci unspezifischen Begleitproteinen befreit wird. Mit Hilfe dieser Verfahrensweise erhält man jedoch Produkte, deren Reinheit und Aktivität nicht zu befriedigen vermag.

Aus den DE-OS 14 92 052 und 14 92 054 sind relativ komplizierte Verfahren zur Extraktion von Plasminogen aus Serum oder Plasm?, bekamt mit dem ein Plasminogen mit einem solchen Reinheitsgrad erhalten wird, das direkt für die Aktivierui? zu Plasmin verwendet werden kann.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, eine Verbindung vom Plasminogen-Typ menschlichen Ursprungs zu schaffen, die einen höheren Reinheitsgrad als die herkömmlichen Produkte besitzt, im wesentlichen oder vollständig frei ist von Plasmin und selbst in Abwesenheit von Inhibitoren für die Plasminogenaktivierung oder von Mineralsalzen in neutralem Medium vollständig löslich ist und die zur Bekämpfung von Fibrinolyseunierfunktionen verwendet werden kann.

Diese Aufgabe wird nun durch die aktive Verbindung des Plasminogen-Typs gemäß Hauptanspruch gelöst, die Gegenstand der Erfindung ist

Der Unteranspruch 2 betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser erfindungsgemäßen Verbindung.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß es möglich ist, die aktive Verbindung des Plasminogen-Typs, die nach der Entfernung des Plazentabluts von den Plazentabreicn zurückgehalten wird oder sogar daran gebunden ist, zu extrahieren, indem man diese Breie insbesondere bei neutralem pH-Wert in Gegenwart eines Inhibitors der Plasminogenakiivierung auslaugt.

Bei dieser Arbeitsweise erhält man, insbesondere nach der Abtrennung des inhibitors, eine Lösung eines rohen Produkts, die die genannte aktive Verbindung des Plasminogen-Typs enthält, die im folgenden der Einfachheit halber als »Plazenta-Plasminogen« bezeichnet wird.

Es ist interessant festzustellen, daß die Art und Weise, in der das Plasminogen von dem Plazentabrci zurückgehalten wird, in gewissem Maße der Art der Bindung eines Enzyms an einem Substrat for die Affmitätschroroatographie entspricht, bei der das Enzym anschließend mit Hilfe eines spezifischen Inhibitors für dieses Enzym ejuiert wird,

Diese Extraktion kann in Abwesenheit jeglicher Mineralsalze, das heißt somit in Wasser erfolgen. Es ist jedoch festzustellen, daß es von Vorteil ist mit physiologischen Seren zu arbeiten und insbesondere isotonische Chlorid-Lösungen zu verwenden, wozu r^an vorzugsweise eine g/lOOO-Natriumchlorid-Lösung verwendet Man beobachtet tatsächlich, daß die Extraktion der Fremdproteine bei Anwendung dieser Lösungen auf ein Minimum reduziert ist so daß die Möglichkeit besteht mittels dieses Extraktionsverfahrens Fraktio nen zu erhalten, die an Verbindungen solcher Substan zen stark angereichert sind, die die charakteristischen Eigenschaften von Plazenta-Plasminogen besitzen und zu Plasmin aktiviert werden können. Im folgenden sei auf die »potentielle Piasminwirkung« dieser Verbindung oder Substanzen Bezug genommen.

Ein zusätzlicher und wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf der Tatsache, daß es während der eigentlichen Extraktion, das heißt in dem Augenblick, in dem das Material am meisten für eine Aktivierung zugänglich ist einen wirksamen Schutz des Plazenta-PIasminogens gegen seine Aktivatoren bei einem physiologischen pH.-Wert ergibt

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die molare Kon-

H) zentration des verwendeten Inhibitors im allgemeinen zwischen etwa 0,001 ufid 0,1 m, vorzugsweise in der Nähe eines Wertes von 0,035 m.

Die Inhibitoren für die Aktivierung des Plasminogens, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen

Γι Verfahrens von besonderem Interesse sind, sind:

L-Lysin der Formel NU,—CH^—CH^-CH, —CH^-CH,--C(H)H

NH,

MCI - 146.1

/-Aminocapronsäure ilcr Formel

NHj-CH₂-CH₂-CH₂-CH, -CH₂-COOH

MCi = 1.11.1

oder lruns-4-Aminonicthyl-cyclohcxuiicarhonsäiirc der Formel

CH,-CH,

NH, Cl

CH \

CH-COOH

CH,CH,

M(J= 157,20

im) Man erhält somit nach der Abtrennung der Inhibitoren aus der Auslaugflüssigkeit direkt eine Plasminogenlösung mit physiologischem Salzgehalt und physiologischem pH-Wert. Die Durchführung der gleichen Auslaugmaßnahmen in Abwesenheit eines

h'> Plasminogen-Inhibitors ermöglicht nur die Extraktion einer sehr viel geringeren, wenn nicht vernachlässigbaren Menge des Plazenta-PIasminogens, was auch aus den folgenden Beispielen hervorgeht.

Es ist zu unterstreichen, daß das in den erhaltenen Lösungen erhaltene Plazenta-Plasminagen in physiologischen Medien löslich ist, da sämtliche Abtrenn- und Auslaug-Maßnahmen bei einem pH-Wert durchgeführt werden, der für eine Beibehaltung dieses Zustandes geeignet ist

Anschließend kann man die Abtrennung des Plasminogen-Inhibitors mit Hilfe klassischer Verfahrensweisen durchführen, was häufig dadurch erleichtert wird, daß die Molekulargewichte der Verbindungen vom Plasminogen-Typ einerseits und des Inhibitors andererseits stark voneinander verschieden sind. Beispielsweise kann man die Abtrennung dadurch bewirken, daß man eine fraktionierte Ausfällung mit Hilfe von Mitteln bewirkt, die die enzymatischen Eigenschaften der Verbindungen des Plasminogen-Typs nicht verändern. Das für diesen Zweck bevorzugte Mittel ist das besonders preisgünstige Ammoniumsulfat, mit dem stark konzentrierte wäßrige Lösungen hergestellt werden können. Man kann natürlich auch irgendein anderes, für diesen Zweck geeignetes Salz einsetzen, beispielsweise Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat oder Natriumsulfat Man kann auch andere Mittel für die fraktionierte Ausfällung verwenden, beispielsweise einen Alkohol, wodurch man das Plasminogen in Form eines Niederschlags von den in Lösung bleibenden Aminosäuren abtrennt

Man kann auch physikalische Trennverfahren verwenden, insbesondere eine Dialyse oder ein Filtrieren über ein Molekularsieb, beispielsweise ein Gel, das unter der Handelsbezeichnung »Sephadex« bekannt ist (und bei dem es sich um ein chemisch vernetztes Dext-an handelt).

Man kann auch Ionenaustauschverfahren in neutralem oder schwach alkalischem Medium, beispielsweise bei einem pH-Wert von 8, durchführen, wodurch der Inhibitor eluiert werden kann, während das Plasminogen auf dem Harz absorbiert bleibt. Es versteht sich, daß die angegebenen verschiedenen Methoden nur die große Leichtigkeit verdeutlichen sollen, mit der die Verbindungen des Plasminogen-Typs aus den Auslauglösungen gewonnen werden können. Die Lösung des rohen Plazenta-Plasminogens enthält außer dem Plazenta-Plasminogen selbst Verunreinigungen, die zum größten Teil - z. B. 90 bis 95% - von proteinischer Natur sind.

Die Abtrennung dieser proteinischen Verunreinigungen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Vorzugsweise führt man aber die Abtrennung folgendermaßen aus: Das Plazenta-Plasminogen und ein großer Teil der Proteine wird fraktioniert ausgefällt, und zwar insbesondere mit Hilfe von Verbindungen, die weiter unten noch charakterisiert werden. Die Ausfällung, die das Plazenta-Plasminogen enthält, löst man in einer wäßrigen Lösung auf, und die erhaltene Lösung wird einer Dialyse unterworfen. Das Dialysat unterwirft man einer zusätzlichen affinitätschromatographischen Reinigung unter Verwendung eines Substrats, auf dem ein Inhibitor der Plasminogenaktivierung, vorzugsweise Lysin, durch kovalente Bindung fixiert ist. Das Plazenta-Plasminogen, das auf dem Substrat zurückgehalten worden ist, wird dann mit einem Inhibitor der Plasminogenaktivierung, vorzugsweise «-Aminocapronsäure, eluiert und schließlich unterwirft man das erhaltene Eluat einer zusätzlichen Dialyse, um die Inhibitoren der vorausgegangenen Operationen abzutrennen; diese vorausgehenden Operationen werden alle bei einem pH-Viert oberhalb von 5 durchgeführt.

Die potentielle Piasminaktivität dieser Plazenta-Plasminogene ist besonders stark, was au? den weiter unten angegebenen pharmakologischen Eigenschaften hervorgeht
Die analytische Untersuchung des Plazenta-Plasmin-

5 ogens hat gezeigt daß dieses hohe Peptid-Gehalte, die im folgenden als »voraktivierte Plasminogene« bezeichnet werden, aufweist die dadurch gebildet werden, daß das vollständige oder »native« Plasminogen Peptidfragmente, die eine Aminosäurenzahl im Bereich von 68

ίο aufweisen und ein Molekulargewicht in der Gegend von 7000 bis 8000 besitzen, an der Seite des Endes der das native Plasminogen bildenden Peptidkette verliert, das eine endständige Aminosäure mit freier NH2-Gruppe, vorzugsweise Glutaminsäure, aufweist Das andere Ende der Peptidkette, die das Plasminogen bildet, besteht nach ROBBlNS et aL, J. biol. ehern, Bd. 242, S. 2333-2342 (1967), vornehmlich aus Asparaginsäure, deren Carboxylgruppe, -COOH, frei ist. Der Rest der Verbindungen mit potentieller Piasminaktivität, die in dem Plazenta-Plasminogen v«i"handen sind, wird, abgesehen von inerten Verunreinigungen, von nativem Plasminogen gestellt.

Bei den voraktivierten Plasminogenen ist eine überwiegende Anwesenheit von Peptidketten festzustei.'en, die eine endständige Aminosäure mit freier NHrGruppe aufweisen, die durch Methionin gebildet wird. Im folgenden wird dieses voraktivierte Plasminogen als »Methionin-Plasminogen« bezeichnet. Ferner sind beträchtliche Mengen eines voraktivierten Plasminogens festzustellen, das eine endständige Aminosäure mit freier NHrGruppe aufweist, die in diesem Fall durch Valin gestellt wird, was zur Folge hat daß diese Produkte im folgenden als »Valin-Plasminogen« bezeichnet werden.

Die Erfindung betrifft somit Zusammensetzungen von Plasminogen-Typ, die erhebliche Mengen, mindestens jedoch etwa 40%, Methionin-Plasminogen enthalten.

Das erfindungsgemäße Plazenta-Plasminogen enthält insbesondere etwa 40 bis 60 Gew.-% Methionin-PIasminogen.

In besonders bevorzugter Weise betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, die Verbindungen mit potentieller Plasmin-Aktivität enthalten und die etwa 40 bis etwa 60 Gew.-% Methionin-Plasminogen, etwa 10 bis etwa 20 Gew.-% Valin-Plasminogen und etwa 20 bis etwa 50 Gew.-% natives Plasminogen enthalten.

Wenn man davon ausgeht daß das Molekulargewicht des nativen Plasminogens etwa 90 000+5000 beträgt, so ist festzuhalten, daß die voraktivierten Plasminogene ein Molekulargewicht im Bereich von 83 000 ±5000 aufweisen.

Schließlich betrifft die Erfindung Plazenta-Plasmin· cjttne der definierten Art die einen Reinheitsgrad aufweisen, der 95% erreichen und sogar übersteigen kann, wobei aL Rest inerte Proteine oder Verunreinigungen vorhanden sind. Diese gereinigten Plazenta-Plasminogene erhält man ausgehend von den genannten rohen Plasminogenen durch klassische Verfahren zur Reinigung von Plasminogen, beispielsweise Verfahrensweisen der Art, wie sie in der folgenden Beschreibung der bevorzugten allgemeinen Verfahrensweise angegeben sind.

Die Erfindung betrifft schließlich Arzneimittel, die die genannten Plazenta-Plasminogene zusammen mit

ti einem injizierbaren, sterilen, flüssigen Träger oder einer sterilen Perfusionsflüssigkeit enthalten.

Ganz allgemein kann man mit Vorteil die im folgenden angegebene allgemeine Verfahrensweise

anwenden, die insbesondere auf menschliche Plasmas anwendbar ist. Wenn im folgenden auf die Extraktion von Plasminogen Bezug genommen ist. so ist damit natürlich auch das oben definierte »Plazenta-Plasmin· ogen« umfaßt.

Die bei Erhalt eingefrorenen Plazentas werden bei — 20⁰C gelagert. Dann werden sie in gefrorenem Zustand mechanisch zu einem Brei verarbeitet. Der erhaltene Brei wird dann dadurch aufgetaut, daß man ihn unter mechanischem Rühren mit einem Wasserbad mit einer Temperatur von +30⁰C bis +40⁰C in Berührung bringt. Das Auftauen wird beendet, wenn der Brei eine Temperatur oberhalb TC, vorzugsweise + 4°C erreicht.

Die erhaltene fluide Masse wird bei 2500 UpM zentrifugiert, um das Plazentablut zu entfernen, das eine geringe Menge Plasminogen, jedoch eine erhebliche M^nivp von Proteinen und Pissirün enthält.

Der abgesaugte Brei wird dann 3 Stunden in einer isotonischen Chloridlösung bei einer Temperatur zwischen 0°C und +2O⁰C, vorzugsweise bei +4"C, ausgelaugt.

Dieses Auslaugbad enthält in geringer Molarität einen der oben beschriebenen Inhibitoren, vorzugsweise mit einer molaren Konzentration von mehr als 0,001 Mol/l, vorzugsweise mit einer Konzentration von 0,0035 MoI/!. Es erfolgt keine Korrektur des pH-Wertes des Materials, der somit bei 7,2 verbleibt.

Nach Ablauf der Auslaugzeit zentrifugiert man das Material bei 2500 UpM, um den Brei von der Extraktionsflüssigkeit abzutrennen.

Man erhält in dieser Weise pro Kilogramm eingesetzter Plazenta einen Liter der Extraktionsflüssigkeit, die 120 UCA (caseinolytische Einheiten) enthält, was 15 mg reinem Plasminogen entspricht. Die angewandte Bestimmungsmethode ist unter der Bezeichnung »caseinolytische Methode« bekannt.

Das in diesen erhaltenen Lösungen vorhandene Plasminogen kann unter Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen gewonnen und gereinigt werden. Vorteilhafterweise bewirkt man eine fraktionierte Ausfällung der in der Lösung enthaltenen Proteine und des Plasminogens mit Hilfe von Ammoniumsulfat. Durch die Zugabe einer Ammoniumsulfatmenge, die 20% der Sättigungskonzentration dieses Salzes in der Lösung entspricht (wobei es sich versteht, daß eine Lösung zu 100% gesättigt ist, wenn sie 540 g Ammoniumsulfat pro Liter enthält) bewirkt eine Ausfällung eines Teils der Proteine der Lösung. Durch Steigern des Prozentsatzes der Sättigung an Ammoniumsulfat bis auf 40% wird das Plasminogen ausgefällt Diese Maßnahmen erfolgen bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9,5, vorzugsweise bei einem neutralen pH-Wert Das ausgefällte Plasminogen wird anschließend wieder in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert in der Gegend von 6,5 bis 9,5 gelöst, was eine zusätzliche dialytische Reinigung ermöglicht insbesondere um verbliebenes Ammoniumsulfat abzutrennen. Das DiaJysat wird anschließend einer Endreinigung durch Affinitätschromatographie unterworfen, die beispielsweise in Gegenwart des Dinatriumsahzes der Äthylendiamintetraessigsäure mit Hilfe einer Säule erfolgt, die ein Substrat wie Agar-Agar-Gel, enthält an dem über eine kovalente Bindung Lysin, ein bevorzugter Inhibitor der Piasmir.ogen-Aktivierurig, gebunden ist Anschließend wird das Plasminogen durch Elution mit Hufe eines Puffers gewonnen, der vorzugsweise einen pH-Wert von 6 bis 9 aufweist und einen Inhibitor der

Aktivierung, vorzugsweise «-Aminocapronsäure, enthält. Gewünschtenfalls kann man das Eluat einer weiteren zusätzlichen Reinigung mit Hilfe einer Dialyse zuführen, insbesondere um den Inhibitor abzutrennen. Ganz allgemein können diese Maßnahmen unter Anwendung jener Bedingungen durchgeführt werden, die in der Literatur beschrieben sind, wobei es sich jedoch versteht, daß als Betriebsbedingungen solche ausgewählt werden, die es ermöglichen, in allen Fällen

ίο bei pH-Werten oberhalb 5 zu arbeiten.

Man erhält in dieser Weise ein Produkt mit einer erhöhten Plasminogenaktivität, deren Plasminogengehalt oberhalb 4 UCA pro Milligramm liegt und das einen Plasmingehalt von weniger als 0,04 UCA/mg aufweist.

Es ist zu bemerken, daß die in den obigen Ausführungen angegebenen Plasminogengehalte nach der Aktivierung mit Urokinase bestimmt sind und daß

entsprechen.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Plazenta-Plasminogen ist dadurch gekennzeichnet, daß es nach der Reinigung:

Bei der Elektrophorese eine Bande ergibt. ₇. in Wasser, in isotonischen Chloridlösungen und "' Puffern üblicher Zusammensetzungen mit neutralem pH-Wert löslich ist, Bei neue, «lern pH-Wert stabil ist, keine pyrogene Wirkung zeigt, wenn es in einer Dosis von lOUCA/kg an Kaninchen verabreicht wird, und keine Toxjzität besitzt, wenn es in einer Dosis von 10 UCA pro Maus an Mäuse verabreicht wird.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens

j5 ergibt sich durch den Vergleich der Ergebnisse, die mit dem in dem folgenden Beispiel 1 durchgeführten

Maßnahmen erreichbar sind und die einerseits in Gegenwart und andererseits in Abwesenheit eines Inhibitors für die Aktivierung des Plasminogens

durchgeführt werden.

Beispiel 1

Extraktionseffekt der Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens

Man verarbeitet 1500 g menschliche Plazenta, die bei -20⁰C gefroren ist, mit Hilfe einer Zerkleinerungseinrichtung (des Typs Stephan) zu einem Brei. Die erhaltene Masse wird durch manuelles Rühren in einem

so Behälter aus rostfreiem Stahl aufgetaut der mit einem Wasserbad mit einer Temperatur von 40⁰C in Berührung steht Das Auftauen erfolgt im Verlaufe von 40 Minuten, wobei die Endtemperatur der Masse +6° C beträgt

Das Plazentablut wird dann von der aufgetauten Masse abgetrennt, indem man diese während einer Stunde bei 2000UpM in einer auf +4° C abgekühlten Becherzentrifuge zentrifugiert Man erhält 740 ml (790 g) Plazentablut, das 290 g

Proteine und eine Plasminogenmenge von weniger als 70 UCA enthält

Der erhaltene Brei (700 g) wird in drei gleiche Teile (Teil 1, TeO 2 und Teil 3) aufgeteilt Diese drei Teile werden gleichzeitig und unter den gleichen Bedingun gen mit Ausnahme der Zusammensetzung des Auslaug bades wie folgt behandelt:

Man laugt den Teil 1 in 50OmI eines wie folgt zusammengesetzten Auslaugbades aus:

Destilliertes Wasser 500 ml

NaCI 4,5 g Phenol (Pakteriostatisches

Mittel) 0,5 g

Temperatur des Bades +5° C;

der Teil 2 wird in gleicher Weise in ein Bad der foijenden Zusammensetzung eingebracht:

Destilliertes Wasser

NaCI

Phenol

ε-Aminocapronsäure

500 ml 4,5 g 0,5 g 2,5 g

(das heißt 0,038 m) + 5° C;

Temperatur des Bades

der Teil 3 wird schließlich in dem folgenden Bad ausgelaugt:

Destilliertes Wasser

NaCI

Phenol

trans-4-Aminomethylcyclo-

hexancarbonsäure

Temperatur des Bades

500 ml 4,5 g 0,5 g

2,5 g

(das heißt
0,032 m)

+ 5⁰C.

Die drei erhaltenen Dialysate besitzen die folgenden Eigenschaften:

Dialysat Nr. 1:

Volumen = 80 ml; pH-Wert = 7,5; Leitfähigkeit = 998 μ Siemens (950 μπιΐιοβ)

Dialysat Nr. 2:

Volumen = 82 ml; pH-Wert - 7,5; Leitfähigkeit = 987 μ8ίεΓηεη5(940 μπιΐκ«)

Das Auslaugen dieser drei Teilproben erfolgt parallel in drei Bechergläsern mit einem Fassungsvermögen von 1 I bei einer Temperatur von 4°C unter intermittierendem manuellen Rühren während 3 Stunden. Der pH-Wert wird unverändert belassen und beträgt in den drei Fällen 7,2.

Nach Ablauf der Auslaugzeit werden die drei Suspensionen gleichzeitig während einer Stunde bei 2500UpM in auf +4° C abgekühlten Zentrifugen zentrifugiert.

Die Breie werden verworfen und man erhält überstehende Flüssigkeiten mit folgenden Volumina:

Volumen 1 = 500 ml Volumen 2 = 500 ml Volumen 3 = 505 ml.

Die drei überstehenden Flüssigkeiten werden unter mechanischem Rühren durch Zugabe von 240 g kristallisiertem Ammoniumsulfat pro Liter auf 40% der Sättigungskonzentration dieses Salzes gebracht. Das Rühren wird in allen drei Fällen nach Beendigung der Salzzugabe während 20 Minuten fortgesetzt. Der pH-Wert wird unverändert belassen und beträgt in den drei Fällen 6,9.

Die drei Lösungen werden dann gleichzeitig während einer Stunde und 30 Minuten bei 2500 UpM in auf +4° C abgekühlten Zentrifugen zentrifugiert. Die drei überstehenden Flüssigkeiten werden verworfen und man erhält drei Niederschläge mit folgendem Gewicht:

Niederschlag 1 = 23 g Niederschlag 2 = 23,2 g Niederschlag3 = 24 g

Die drei Niederschläge bestehen etwa aus 90% Mutterlauge und 10% Proteinen.

Die drei Niederschläge werden dann jeweils in 50 ml eines 0.1 m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst und dann 3 Stunden gegen strömendes, kaltes, entmineralisiertes Wasser dialysiert Eine Enddialyse erfolgt während 15 Stunden bei +4"C gegen 401 eines 0,01 m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7JS.

Dialysat Nr. 3:

Volumen = 94 ml; pH-Wert = 7.5; Leitfähigkeit = 1029 μ5ίβιπεη8 (980 μηιηοβ).

Die Plasminogenaktivitäten dieser Dialysate sind die r> folgenden:

Dialysat 1 = 0,16 UCA/ml χ 80 ml - 12,8 UCA Dialysat 2 = 0,85 UCA/ml χ 82 ml = 69,5 UCA nioiycoi 3 _ QJ5 iJCA./m! χ 94 m! = 70,5 UCA.

2» Diese Werte verdeutlichen die Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren erreichbarsind.

In dem folgenden Beispiel ist die Stufe der Extraktion eines Plazenta-Plasminogens, ausgehend von Plazenta

r> in größerem Maßstab, beschrieben.

Beispiel 2 A Extraktion des Plasminogens

Man verarbeitet 500 kg bei -20⁰C gefrorene, menschliche Plazenta mit Hilfe einer Zerkleinerungseinrichtung (vom Typ Palmann) zu einem Brei.

Die erhaltene Masse wird dadurch aufgetaut, daß man sie in einer Mischeinrichtung (Typ Werner) mit Doppelmantel rührt, durch den man Wasser mit einer Temperatur von +40" C strömen läßt.

Das Auftauen erfordert 2 Stunden und 30 Minuten und die Endtemperatur der Masse beträgt +4°C.

Dann wird das Plazentablut durch Zentrifugieren der aufgetauten Masse in 5 Durchgängen ä 15 Minuten hsi 2500 UpM in einer Zentrifuge (des Typs Rousselet) abgetrennt. Man erhält in dieser Weise 238 kg Brei und 260 kg Blut.

Man bringt den Brei in ein Auslaugbad der folgenden Zusammensetzung eiaii:

Physiologisches Serum	5001
E-Aminocapronsäiure	2500 g
	(0,038 m)
Phenol (bakteriositatisches
Mittel)	500 g
	(1 Promille)
Badtemperatur	+4⁰C

Man rührt das Ganze während 3 Stunden bei +4° C Der pH-Wert des Mediums wird nicht verändert und beträgt 7,2.

Die Extraktionsflüssigkeit wird dann durch Zentrifugieren in 5 Durchgängen ä 15 Minuten bei 2500 UpM auf einer Zentrifuge (des Typs Rousselet) abgetrennt Die Extraktionsflüssigkeit besitzt dann eine Temperatur von 8° C einen ρ H-Wert von 7,2 und ein Volumen von 5101.

B Reinigung des Plasminogens

Die Reinigung des in der erhaltenen Lösung enthaltenen Plasminogens kann wie folgt bewirkt werden: Die angewandte Reinigungsmethode ist eine Variante

der Methode, die unter der Bezeichnung »Affinitätschromatographie« bekannt ist.

Die Extraktionsflüssigkeit wird zunächst in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, beispielsweise eines im Handel utner der Bezeichnung »Solka Floe BW 20« (Klarfiltration) bekannten Materials, klarfiltriert oder mit großer Geschwindigkeit zentrifugiert, nachdem man eine Ammoniums>i!fatmenge zugesetzt hat, die 20% der Sättigung entspricht. Diese Klarfiltration oder Zentrifugation erfolgt mit dem Ziel, die feinen Teilchen des Breis zu beseitigen, die in der Lösung enthalten sein können.

Die Extraktionsflüssigkeit wird dann mit Ammoniumsulfat auf 40% der Sättigung gebracht, um das Plasminogen auszufällen.

Die Klarfiltration (oder Zentrifugation) und die Ausfällung erfolgen bei einem pri-Wert zwischen 5,5 und 9,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 (das heißtdem pH-Wert, der sich ohne Zugabe von Säure oder Base in dem Medium natürlich einstellt).

Der erhaltene Niederschlag wird erneut in einer Lösung von einem der oben beschriebenen Inhibitoren (mit einer Molarität zwischen 0,001 m und 0,05 m) in kaltem, entmineralisiertem Wasser derart gelöst, daß sich eine Leitfähigkeit von weniger als 21 000 μ8ίεηιεη5 (20 000 μπιΐιος), vorzugsweise von weniger als 12 600 ^Siemens (12 000 μΐηΐκκ) ergibt.

Der pH-Wert wird dann auf einen Wert zwischen 5,2 und 7, vorzugsweise auf einen Wert von 5,5 gestellt. Durch Filtrieren entfernt man das zuvor zugesetzte Filterhilfsmittel sowie inaktive Verunreinigungen.

Das erhaltene Filtrat wird dann auf einen pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und dann einmal durch Zugabe des gleichen Volumens kalten, entmineralisierten Wassers verdünnt

Dann fällt man das aktive Material aus der erhaltenen Lösung aus, indem man diese auf 40% des Sättigungswertes von Ammoniumsulfat einstellt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen.

Er wird in einem Phosphatpuffer mit einer Molarität von 0,1 bis 05 m, vorzugsweise 0,3 m, einem pH-Wert von 65 bis 9, vorzugsweise /,5, gelöst, und dann 7 bis 8 Stunden gegen kaltes, entmineralisiertes Wasser dialysiert, so daß man eine Leitfähigkeit erreicht, die zwischen 6300 und 10 500 μ5ϊεπιεη5 (6000 bis 10 000 umhos) liegt

Dann wird das Dialysat zentrifugiert oder klarfiltriert, um die im Verlaufe der Dialyse aufgetretenen unlöslichen Substanzen zu entfernen.

Zu der klarfiltrierten oder zentrifugierten Lösung gibt man 1 Promille (Gewicht/Volumen) des Dinatriumsal-Z8S der Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu und stellt den pH-Wert der Lösung' mit Hilfe von Natriumhydroxid und Orthophosphorsäure auf einen Wert zwischen 6 und 9, vorzugsweise auf einen Wert von 75 εϊη.

Die Lösung wird dann auf eine Säule gegossen, die ein Agar-Agar-Gel enthält, an das durch kovalente Bindung Lysin gebunden ist und das mit einem Phosphatpuffer mit einer Molarität von 0,05 bis 0,4 m, vorzugsweise 0,15 m, und einem pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise 75 (Puffer Nr. 1) zuvor ins Gleichgewicht gebracht worden ist Nachdem die gesamte Lösung auf die Säule aufgetragen ist, spült man die Säule mit dem Puffer 1, bis in dem austretenden Material keine Proteine mehr vorhanden sind. Der Spülpuffer wird dann durck einen Phosphatpuffer mit einer Molarität von 0,05 bis 0,4 m, vorzugsweise 0,1 m, und einem pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise einen pH-Wert von 7,5 (Puffer Nr. 2), ersetzt. Die Säule wird anschließend mit dem Puffer Nr. 2 εΐυίεπ, der 0,01 m bis 0,5 m, vorzugsweise 0,2 m, ε-Aminocapronsäure enthält.

-, Das Eluat wird gewonnen und enthält praktisch das gesamte extrahierte Plasminogen. Es wird anschließend 24 Stunden gegen einen Puffer mit gering8r Molarität und einem pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise gegen einen 0,01 m-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von

ίο 7,5 dialysiert und dann gefriergetrocknet.

In dieser Weise erhält man zwischen 100 und 120 UCA Plasminogen pro kg eingesetzter Plazenta.

Ausgehend von der obigen rohen Lösung erhält man 5,2 g eines gefriergetrockneten Pulvers mit den

i> folgenden Eigenschaften:

Plasminogengehalt Plasmingehalt

Proteinuehalt

4,4 UCA/mg = < 0,04 UCA/mg = /S20/_n(Hjp restlichen 48% werd8n durch Phosphate gestellt).

Dieses Pulver zeichnet sich durch eine vollständige Löslichkeit bei pH-Werten von etwa 7 in destilliertem Wasser, isotonischen Chloridlösungen und Puffern üblicher Zusammensetzung aus und besitzt ganz allgemein sämtliche Eigenschaften, wie sie oben bereits angegeben sind.

Ganz allgemein kann man somit davon ausgehen, daß das aus Plazentabreien extrahierte Plasminogenprodukt

ίο einen Plasminogengehalt von mehr als 4 UCA/mg und είηεη Plasmingehalt von weniger als 0,04 UCA/mg aufweist.

Das in dieser W8ise erhaltene Plazenta-Plasminogen besitzt eine bedeutende pharmakologische Wirkung

)"> und ausgezeichnete therapeutische Eigenschaften.

Die pharmakologische Untersuchung des Plasminogens mit Hilfe der von F. Courbier et al. (Ann. Chir, 1963, 17, Nr. 5-6, Seiten 331-338) beschriebenen Methoden an Hunden, bei denen man akute εχρεπιηεη-

4i) teile Art8rienthrombosen hervorgerufen hat, zeigt, daß das Plasminogen eine schnelle Verminderung des Volumens der Blutklumpen und in der Mehrzahl der Fälle eine vollständige Lösung der Blutklumpen zur Folge hat.

4> Es ist in dieser Hinsicht von Interesse festzuhalten, daß eine Menge des erfindungsgemäßen Produktes, die 13 mg Proteine enthält und einen Titer von 100 UCA aufweist, bei der oben angegebenen pharmakologischen Untersuchung eine Aktivität besitzt, die im wesentlichen

to analog derjenigen ist die man mit einer Menge des gemäß der FR-PS 13 47 029 erhaltenen Produkts erreicht, das 240 mg Proteine enthält

■si Vergleichsbeispiel

Zur Verdeutlichung des erfindungsgemäß erzielbaren technischen Fortschritts gegenüber dem Stand der Technik, der aus der DE-OS 20 57 401 bekannt ist

to wurden Vergleichsversuche durchgeführt bei denen das native hochgereinigte Plasminogen dieses Standes der

Technik der erfindungsgemäßen Verbindung des Plas-

minogen-Typs gegenübergestellt wurde.

Bei diesen Vergleichsversuchen wurde eine affinrtäts-

b5 dkomatographische Abtrennung der Produkte aus Humanplasma vorgenommen, wobei als Adsorptionsmedium ein unlöslicher Träger verwendet wurde, der in der ε-Stellung der Carboxylgruppe eine Aminosäure

trägt. Ee handelt sich bei diesem Adsorptionsmediuin um Sepharose-Lysin der nachfolgenden Struktur:

Fsephamse |-NH-CH-CH₂-CH₂-CH₂-CO()H COOH

Dieses Adsorptionsmedium unterscheidet sich von dem in Beispiel 1 des genannten Standes der Technik verwendeten Materials dadurch, daß es anstelle des Propylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymerisats den Sepharoserest trägt. Das verwendete Adsorptionsmaterial hat sich jedoch für die Durchführung der Vergleichsversuche als sehr geeignet erwiesen, zumal es auf das eigentliche Trägermaterial weniger ankommt denn auf die gebundene Aminosäure. '

Bei der Durchführung der Verfahrensweise des genannten S'.ai'ides der' TcCmüiiC würucii im weScntiiCiiEn die Maßnahmen des Beispiels 1 angewandt, wobei die genauen Bedingungen die folgenden waren:

Präparat Nr. 1

Man führt 200 ml citrathaltiges Humanplasma bei + 4°C durch eine Säule von 10 ml Sepharose-Lysin (30 μΜοΙ Lysin/ml Sepharose), die man zuvor mit einem 0,15 m Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,4 äquilibriert hat. Die nicht spezifisch zurückgehaltenen Plasmaproteine werden mit 400 ml des genannten Phosphat-Puffers ausgewaschen. Dann wird das Plasminogen mit einem 0,1 m Trishydroxymethylaminomethan-Puffer mit einem pH-Wert von 10,0 eluiert, der mit DL-Lysinhydrochlorid auf eine Konzentration von 0,05 m gebracht worden ist.

Man stellt den pH-Wert des Eluats (24 ml) mit 2 m Chlorwasserstoffsäure auf den Neutralpunkt. Dann fällt man das Plasminogen durch Zugabe eines Volumens einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung und zentrifugiert bei +4⁰C.

Man löst den Niederschlag erneut in 2 ml eines 0,1 m Phosphat-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5 und dialysiert während 12 Stunden bei +4⁰C gegen 51 dieses gleichen Puffers.

Das erhaltene Dialysat (8 ml) ist sehr trüb und wird durch Zentrifugieren und durch Filtration über ein Membranfilter (Millipore 0,45 μΐπ) geklärt

Die Eigenschaften des erhaltenen Produkts sind nachstehend angegeben. Die hierbei verwendeten physikalischen Kenndaten besitzen die folgenden Bedeutungen:

Der »Plasminogentiter« entspricht.der Plasminaktivität des Präparats nach der Aktivierung des Plasminogengehalts des Präparats in Gegenwart von Urokinase (einem spezifischen Aktivator der Aktivierung von Plasminogen in Plasmin).

Der »Plasmintiter« wurde direkt bei der Herstellung des Plasminogen ohne vorhergehende Aktivierung ermittelt

Die Piasminaktivität wird dadurch gemessen, daß man eine Hydrolyse des Acetyl-glycyl-lysyl-methylesters unter dem Einfluß des zu untersuchenden Präparats bewirkt Diese Hydrolyse wird über die Freisetzung von Säurefunktionen verfolgt, die mit Hilfe eines pH-Meßgeräts gemessen werden. Die angegebene Dimension »1 μΚβϋΙ« entspricht der Piasminmenge, die 1 μΜοΙ des genannten Substrats bei 37° C in 1 Sekunde umwandelt

Charakteristische Eigenschaften des Präparats Nr. 1:

Plasminogentiter: 0,45 μΚ^βΙ/ίτ^ Protein Plasmintiter: 0,08 μΚβΙβΙ/η^ Protein

(entsprechend 17%)

Elektrophorese: Polydispersion: 3 Hauptbanden,

2 Nebenbanden.

Löslichkeit: Löslich in Wasser und üblichen Puffern bei neutralem pH-Wert. Präparat Nr. 2 Man bereitet das Material nach der oben bezüglich

des Präparates Nr. 1 beschriebenen Verfahrensweise, bewirkt jedoch die Elution mit Hilfe von 0,05 m

Lysinlösung, die mit einer 2 m Schwefelsäurelösung auf

einem pH-Wert von 2,5 eingestellt worden ist.

Das erhaltene Plasminogen wird anschließend ausgefällt, diäiySieri UiIu geklärt, wie c5 üben bcZÜgiiCn ucs

Präparats Nr. 1 angegeben ist. Eigenschaften des erhaltenen Präparats Nr. 2:

Plasminogentiter: 1,1 μΚβίβΙ/ιτ^ Protein Plasmintiter: 0,06 μΚβίβΙ/π^ Protein (entsprechend 5,5%)

Elektrophorese: Polydispersion: 2 Hauptbanden,

2 Nebenbanden.

Löslichkeit: Das Produkt ist in Wasser bei

neutralem pH-Wert und in Puffern jo mit einer Ionenstärke von weniger

als 0,05 unlöslich.

Eigenschaften der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung des Plasminogen-Typs: Plasminogentiter: 2 bis 2,5 μΚβίβΙ/π^ Protein Plasmingehalt: weniger als 5% Elektrophorese: Monodispersion Löslichkeit: Löslich in Wasser und üblichen

Puffern mit neutralem pH-Wert.

Aus den obigen Vergleichsversuchen ist zu erkennen, daß das Verfahren der DE-OS 2057 401 zu einem Plasminogen führt, das eine wesentlich geringere Reinheit besitzt als die erfindungsgemävio aktive

Verbindung des Plasminogen-Typs. Im besten Fall

besitzt das erhaltene Produkt eine Reinheit von 40%, während das erfindungsgemäße Material eine Reinheit von 75 bis 90% aufweist.

Im Fall der Elution bei einem basischen pH-Wert ist

so der Gehalt an freiem Plasmin wesentlich höher (17% gegenüber den 1 bis 2% bei der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung).

Die Löslichkeit wird stark verändert, wenn die Elution bei einem sauren pH-Wert erfolgt

Es ist weiterhin festzuhalten, dsö das nach der Lehre des genannten Standes der Technik erhaltene Plasminogenpräparat äußerst instabil ist und bereits nach einer Lagerzeit von 24 Stunden weitgehend zu Plasmin aktiviert wird, eine Tatsache, die dem erheblichen

ω Plasmingehalt des vorbekannten Materials zuzuschreiben ist

Das Präparat Nr. 2 unterscheidet sich von dem Präparat Nr. 1 lediglich dadurch, daß die Elution des Plasminogens bei einem sauren pH-Wert durchgeführt

es wurde. Man erhält in dieser Weise ein Endprodukt mit einem wesentlich geringeren Piasmingehalt Der Nachteil ist jedoch der, daß das erhaltene Produkt in Wasser bei neutralem DH-Wert und in Puffern mit eerineer

Ionenstärke unlöslich ist Dies ist eint erheblicher Nachteil, da das in dieser Weise erhaltene Produkt des Standes der Technik nicht in Form einer Lösung injiziert werden kann.

Ganz allgemein ist das Plazenta-Plasminogen zur Behandlung von Fibrinolyseunterfunktionen geeignet.

Die Anwendung menschlichen Plaszenta-Plasminogens ist von Vorteil, insbesondere im Fall der folgenden klinischen Indikationen:

a) Akute Atembeschwerden bei Neugeborenen und Frühgeborenen, die einen vollständigen oder teilweisen Plasminogen-Mangel aufweisen, ein Syndrom, das im allgemeinen mit einer Fibrin-Abscheidung im Bereich der Lungenbläschen verbunden ist;

b) Venenembolien und -thrombosen, insbesondere bei jenen Patienten, deren Plasminogenverbrauch größer als die Bildung dieser Verbindung in der Leber ist, wobei die Verabreichung des Piasminogens dazu empfohlen wird, die fraglichen Patienten auf eine thrombolytische Behandlung mit einem Arzneimittel, wie Streptokinase oder Urokinase, vorzubereiten;

c) Mikroembolien von im wesentlichen zerebraler Art;

d) akute^ubakute und chronische ZwischengefäQkoagulationen lokaler und verbreiteter Art mit extensiver Tendens, die durch einen Plasminogenmangel verursacht sind.

Die Verabreichung des Plazenta-Plasminogens kann durch kontinuierliche venöse Perfusionen iii Mengen

ίο von 1000 bis 1200 UCA, die über eine Dauer von 24 bis 36 Stunden verteilt werden, oder durch langsame intravenöse Injektion erfolgen (wobei sich die angegebenen Werte auf einen Menschen mit einem mittleren Gewicht von 60 kg beziehen).

Für Säuglinge wendet man Dosen von 200 UCA alle 6 Stunden an, die durch langsame Perfusion in einer 9/1000 isotonischen Chloridlösung, die auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert ist, im Verlaufe von 24 Stunden verabreicht werden.

Bei diesen Verabreichungsformen verwendet man die Lösungen des Piasminogens in einem pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial, insbesondere einem physiologischen Serum, wozu man insbesondere ein Glucoseserum verwendet

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Claims

Patentansprüche;

1. Aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs, die bei neutralem pH-Wert in Wasser löslich ist, im wesentlichen frei von Plasmin ist und zu mindestens 40 Gew.-% native Plasminogenfragmente aufweist, aus denen ein PeptJdfragment mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 8000 N-terminal abgespalten ist, erbältlich durch Auslaugen eines von Plazentablut befreiten Plazentabreis im Temperaturbereich von 0 bis 20⁰C, mit einer Lösung, die

a) einen pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise einen neutralen pH-Wert aufweist, und

b) eine Aminosäure enthält, weiche die Aktivierung des Plasminogens inhibiert, in einer Konzentration von mehr als 0,001 Mol.

2. Aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in b) als Aminosäure L-Lysin, ε-Aminocapronsäure oder trans-4-Aminomethylcydohexancarbonsäure eingesetzt wird.

3. Verfahren zur Reinigung der nach den Ansprüchen 1 und 2 erhaltenen aktiven Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Verbindung vom Plasminogen-Typ fraktioniert ausfällt,

b) die erhaltene Ausfällung, die die Verbindung vom Plasminogen-Typ enthält, mit einer wäßrigen Lösung aufnimmt,

c) die erhaltene wäßrige Lösung dialysierl.

d) das erhaltene gereinigte Dialysat einer Affinitälschromatographie unterwirft und

".) das Eluat der Affinitätschromalographic nochmals dialysiert,

wobei alle Verfahrensschritte bei einem pH-Wert von oberhalb 5 durchgeführt werden.

4. Verwendung der aktiven Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Bekämpfung von Fibrinolyseunterfunktionen.