CH637991A5

CH637991A5 - Verfahren zur herstellung einer leichten (b) plasmin-kettenfraktion mit einem aktiven serinproteasezentrum.

Info

Publication number: CH637991A5
Application number: CH1165677A
Authority: CH
Inventors: Kenneth C Robbins; Louis Summaria
Original assignee: Reese Res Found
Priority date: 1976-09-24
Filing date: 1977-09-23
Publication date: 1983-08-31
Also published as: SE454047B; SE454048B; FR2365583B1; DE2742529C2; SE8301795L; NL7710451A; SE442304B; SE8301795D0; CA1094449A; JPS5352606A; GB1533205A; DK421577A; FR2365583A1; US4082612A; DE2742529A1; SE7710653L; CH637992A5; SE8301794D0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinproteasezentrum.

Es ist bekannt, dass unter der Einwirkung einer als Fibrin bekannten Plasmakomponente Blutgerinnsel entstehen. Es ist auch bekannt, dass Materialien, welche die Neigung haben, Fibrin zu lösen (fibrinolytische Materialien) wirksam sind in bezug auf die Verminderung oder Eliminierung von Blutgerinnseln in dem Kreislaufsystem, wo ein grosser Schaden entstehen kann durch Kreislaufblockierungen, die durch nicht aufgelöste Blutgerinnsel hervorgerufen werden können.

Das menschliche Blut enthält Plasminogen, bei dem es sich nicht um ein Enzym, sondern um einen Enzymvorläufer handelt. Bestimmte Aktivatoren wandeln das Plasminogen in Plasmin um, das in der Lage ist, Fibrin zu lösen und Blutgerinnsel aufzubrechen. Plasmin ist ein proteolytisches Enzym mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum und es hat die Fähigkeit, Protein aufzulösen, auch sich selbst aufzulösen. Plasmin und viele seiner Komplexe sind deshalb bei der Lagerung in gelöster Form ohne Zugabe von stabilisierenden Materialien, wie Leupeptin (Acetyl-L-Leucin-L-Leucin-L-argininal), instabil. Die proteolytische Aktivität von Plasmin und seinen Komplexen kann zu nachteiligen Sekundäreffekten führen, wenn solche Materialien in den Blutstrom eingeführt werden, da durch die proteolytische Aktivität Serumproteine zerstört werden können, wie z.B. Gerinnungs- und Komplementkomponenten.

Bei der Streptokinase, die von Streptococcus-Kulturen stammt, handelt es sich um einen Aktivator, der in der Lage ist, Humanplasminogen in Humanplasmin umzuwandeln. Er ist auch in der Lage, Katzen-Plasminogen in Katzen-Plasmin umzuwandeln, er ist jedoch verhältnismässig inaktiv in bezug auf die Umwandlung von anderen Säugetier-Plasminogenen.

Wenn Streptokinase Humanplasminogen zugesetzt wird, besteht ihre erste Wirkung darin, sich mit einem Teil des Plasminogens in stöchiometrischen Mengen zu verbinden unter Bildung eines Komplexes. Der Streptokinase-Plasminogen-Komplex dient dann als Katalysator für die Umwandlung des restlichen Plasminogens in Plasmin. Streptokinase verbindet sich auch stöchiometrisch mit Plasmin unter Bildung eines Komplexes, der einen Katalysator für die Umwandlung von Plasminogen darstellt.

Streptokinase ist, wie oben angegeben, verhältnismässig inaktiv in bezug auf die Umwandlung von anderen Säugetier-Plasminogenen als Human- und Katzenplasminogenen und wandelt deshalb Rinder-Plasminogen nicht in Rinder-Plasmin um. Andererseits sind der Streptokinase-Human-plasminogen-Komplex und der Streptokinase-Human-plasmin-Komplex aktiv bei d'er Umwandlung von Rinder-Plasminogen in Rinder-Plasmin.

Es ist bekannt, dass Plasmin durch Spaltung der Piasminmoleküle an ihren Disulfxd-Bindungen zwischen den Ketten (einer oder zwei Disulfidbindungen pro Molekül) in eine schwere (A) Kettenfraktion und eine leichte (B) Kettenfraktion aufgespalten werden kann, und es ist bekannt, dass die schwere (A) Kettenfraktion und die leichte (B) Kettenfraktion voneinander getrennt werden können. Rickli und Ota-vasky geben in «Eur. J. Biochem.», 59,441-447 (1975), an, dass die Fraktionen durch Adsorption der schweren (A) Kettenfraktion an einem L-Lysin-substituierten Polyacrylamid-Adsorbens und Eluieren der leichten (B) Kettenfraktion voneinander getrennt werden können. Die Autoren machen keine Angabe über irgendwelche Eigenschaften der eluierten leichten (B) Kettenfraktion, durchgeführte Tests haben jedoch gezeigt, dass die bei diesem Verfahren gebildete leichte (B) Kettenfraktion, wenn sie mit Strepotkinase in einen Komplex überführt wird, einen Komplex bildet, der in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin praktisch inaktiv ist. Die schwere (A) Kettenfraktion kann keinen Streptokinasekomplex bilden.

Aus Sicherheitgründen können therapeutische Materialien, die von menschlichem Blut abgeleitet sind, die Plasminogen und Plasmin umfassen, nicht in den Blutstrom eines Patienten injiziert werden, weil durch eine solche Injektion Virenverunreinigungen, wie z.B. der Heptatitis-Virus, in den Blutstrom des Patienten übertragen werden können. Die Food and Drag Administration der USA schreibt vor, dass jedes Material, das aus menschlichem Blut gewonnen worden ist, 10 Stunden lang auf 60°C erhitzt werden muss, um eventuelle Hepatitis-Viren zu inaktivieren, bevor von ihr das Material oder irgendein Derivat davon für den Verkauf als Arzneimittel, das in den Blutstrom injiziert werden soll, freigegeben wird.

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Wenn man einen Streptokinase-Plasmin-Komplex der vorstehend beschriebenen Wärmebehandlung unterwirft, ändert sich sein Charakter und er wird in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin inaktiv. Wenn man Plasminogen der vorstehend beschriebenen Wärmebehandlung unterzieht, bevor man es in Plasmin umwandelt und bevor man es mit Streptokinase in einen Komplex überführt, ändert sich ebenfalls der Charakter des dabei erhaltenen Komplexes. Obgleich sein Streptokinasekomplex noch die Aktivität in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin aufweist, wird seine Proteinkomponente durch die Wärmebehandlung so denaturiert, dass Antigen- und Pyrogen-Reaktionen auftreten können, wenn der Komplex in den Blutstrom eines Patienten injiziert wird. Aus diesen Gründen wurden Streptokinase-Plasmin-Komplexe bisher nicht als übliche therapeutische Behandlung zum Auflösen von Blutgerinnseln bei menschlichen Patienten verwendet.

Erfindungsgemäss wird eine leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum hergestellt. Es wurde gefunden, dass das katalytische Serinpro-tease-Zentrum in dem Plasminmolekül sich auf der Seite der leichten (B) Kette desselben befindet, dass jedoch durch die Verfahren, die bisher zur Aufspaltung des Plasminmoleküls und zur anschliessenden Trennung der leichten (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion angewendet wurden, das katalytische Serinprotease-Zentrum an der leichten (B) Kettenfraktion inaktiviert wird, so dass die leichte (B) Kettenfraktion ebenso inaktiv wird wie die schwere (A) Kettenfraktion (die kein derartiges katalytisches Zentrum aufweist).

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinproteasezentrum ist dadurch gekennzeichnet, dass man Plasmin mit einem reversiblen aktiven Serinproteasenzen-trums-Inhibitor mischt, an den Disulfidbindungen zwischen den Ketten die Piasminmoleküle in der Mischung reduziert unter Bildung eines Gemisches, das schwere (A) und leichte (B) Kettenfraktionen enthält, und anschliessend die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt.

Es wurde ferner gefunden, dass bekannte reversible aktive Serinprotease-Zentrumsinhibitoren, wie Leupeptin, die Desaktivierung oder Vergiftung des katalytischen Serinpro-tease-Zentrums in der leichten (B) Kettenfraktion hemmen bzw. verhindern und dadurch ihre Aktivität während der Reduktions- und Trennungsstufen schützen.

Es wurde auch gefunden, dass Streptokinase das aktive Serinprotease-Zentrum schützt und dass ein Streptokinase-Plasminogen-Komplex oder ein Streptokinase-Plasmin-Komplex einer Reduktion und Trennung unterworfen werden können, ohne dass ein reversibler aktiver Serinpro-teasezentrums-Inhibitor vorhanden ist, unter Bildung eines Streptokinase-leichte (B) Kettenfraktion-Komplexes, der eine fibrinolytische Aktivität aufweist.

Es wurde ferner gefunden, dass eine aktive leichte (B) Kettenfraktion hergestellt werden kann aus einem Plasminogen-Ausgangsmaterial, das 10 Stunden lang bei 60°C wärmebehandelt worden ist, und dass die so hergestellte Fraktion mit Streptokinase verbunden (kombiniert) werden kann unter Bildung eines fibrinolytisch aktiven Komplexes, der eine wesentlich geringere antigene oder pyrogene Reaktion hervorrufen kann, wenn er in den Blutstrom eines Patienten injiziert wird, als der Komplex aus Streptokinase und einem wärmebehandelten Plasminogen, das nicht fraktioniert worden ist. Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst gemäss einem bevorzugten Aspekt die lOstündige anfängliche Wärmebehandlung von Human-Plasminogen bei 60°C,

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um irgendwelche darin enthaltenen Virenverunreinigungen , zu inaktivieren. Das wärmebehandelte Plasminogen wird dann zu Plasmin aktiviert und mit einem aktiven Serinpro-tease-Zentrumsinhibitor, wie Leupeptin (Acetyl-L-leucin-L-leucin-L-argininal) in einer solchen Menge gemischt, dass der grösste Teil der oder die gesamte Piasminaktivität gehemmt (inhibiert) werden. Die Plasmin-Leupeptin-Mischung wird dann mit einem Reduktionsmittel, wie 2-Mercaptoäthanol oder Dithioerythrit, reduziert, um die Disulfidbindungen in den Plasminmolekülen zu spalten unter Bildung der schweren (A) Plasmin-Kettenfraktionen und der leichten (B) Kettenfraktionen. Das Produkt wird dann mit einem Alkylie-rungsmittel, wie Natriumjodacetat, alkyliert, um die gespaltenen Enden der Disulfidbindungen (Sulfhydrylgruppen) an der Rekombination zu hindern; und das alkylierte Produkt wird auf eine chromatographische Affinitäts-Kolonne aufgegeben, in welcher die schwere (A) Kettenfraktion adsorbiert und die leichte (B) Kettenfraktion eluiert wird, die ohne Adsorption die Kolonne passiert. Die leichte (B) Kettenfraktion wird mit Ammoniumsulfat ausgefällt, zentrifugiert und dann in einem Puffermedium wieder aufgelöst. Wenn die Kettenfraktion ausgefällt wird, bleibt der grösste Teil des Leupeptins (Acetyl-L-leucin-L-leucin-L-argininal) in der flüssigen Phase zurück. Die geringe Menge Leupeptin (Acetyl-L-leucin-L-leucin-L-argininal), die bei der ausgefällten und wieder aufgelösten leichten (B) Kettenfraktion verbleibt, unterstützt ihre Konservierung, wenn sie in flüssiger Phase gelagert wird, sie beeinträchtigt jedoch nicht ihre Aktivität, da sie bis zu einer vernachlässigbar geringen Konzentration verdünnt wird, wenn der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase (wie nachfolgend beschrieben) in den Blutstrom eines Patienten eingeführt wird.

Die leichte (B) Kettenfraktion wird komplex an Streptokinase gebunden, entweder in roher oder in gereinigter Form, indem man die Materialien in äquimolaren Mengenanteilen miteinander mischt und dann die Mischung kurze Zeit inkubiert. Ein äquimolarer Komplex aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase kann auch hergestellt werden aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex durch Reduzieren des Komplexes zur Aufspaltung der Disulfidbindungen in den Plasminmolekülen des Komplexes unter Bildung von schweren (A) Plasmin-Kettenfraktionen und leichten (B) Plasmin-Kettenfraktionen, die an die Streptokinase gebunden sind, und anschliessende Alkylierung und Aufgeben des dabei erhaltenen Produktes auf eine chromatographische Kolonne, in welcher die schwere (A) Plasmin-Kettenfraktion adsorbiert wird und aus der der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase eluiert wird, der ohne Adsorption die Kolonne durchläuft. Im letzteren Falle ist normalerweise die Verwendung von Leupeptin oder anderer reversibler Serinprotease-Aktivitätszentrum-Inhibitoren nicht erforderlich, da die Streptokinase die gleiche Funktion erfüllt und den Aktivitätsverlust in der leichten (B) Kettenfraktion während der Reduktion der Plas-minstruktur und während der Trennstufen verhindert.

Die wie vorstehend angegeben hergestellte leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion weist eine viel geringere proteolytische Aktivität auf als das Plasmin, aus dem sie abgeleitet ist, die im allgemeinen weniger als etwa 5%, bezogen auf die Molmenge, und weniger als etwa 15%, bezogen auf das Gewicht, beträgt. In der Regel hat die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion eine proteolytische Aktivität, gemessen auf einem Caseinsubstrat, von etwa 2 bis etwa 3 CTA-Ein-heiten/mg Protein oder von etwa 0,05 bis etwa 0,08 CTA-Einheiten/n Mol Protein. Bei den CTA-Einheiten handelt es sich um Standard-Aktivitätseinheiten, die von dem Com-mittee on Thrombolytic Agents (National Heart and Lung

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Institute) und von der World Health Organization angewendet werden und in Johnson et al., «Thrombosis et Dia-thesis Haemorrhagica», Band 21, Seiten 259-272 (1969), beschrieben sind.

Der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, der, wie vorstehend angegeben, aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden ist, hat eine viel geringere proteolytische Aktivität als der Plasmin-Streptokinase-Komplex, aus dem er abgeleitet ist, die im allgemeinen weniger als etwa 20%, bezogen auf das Molverhältnis, und weniger als etwa 35%, bezogen auf das Gewicht, beträgt. In der Regel hat der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, der aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden ist, eine proteolytische Aktivität, gemessen auf einem Caseinsubstrat, von etwa 2 bis etwa 3,5 CTA-Einheiten/mg Protein oder von etwa 0,14 bis etwa 0,25 CTA-Einheiten/n Mol Protein. Der aus Streptokinase und einer leichten (B) Kettenfraktion, wie vorstehend angegeben, hergestellte Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hat eine proteolytische Aktivität, die etwa in der gleichen Grössenord-nung liegt wie diejenige des aus einem Plasmin-Streptoki-nase-Komplex hergestellten Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellten Komplexes.

Der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, der wie vorstehend angegeben aus dem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden ist, hat in der Regel eine Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivität, die etwa 1,6 bis etwa l,8mal so gross ist, bezogen auf das Gewicht, wie diejenige des Plasmin-Streptokinase-Kom-plexes, aus dem er hergestellt ist. Die Rinder-Plasminogen-Aktivität des Komplexes aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase, bezogen auf das Molverhältnis, ist etwa 0,8 bis etwa 1,0mal so gross wie diejenige des Plasmin-Strep-tokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. In der Regel betragen die Werte für die Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivität der Komplexe aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, die aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden sind, gemessen auf einem Caseinsubstrat, etwa 3 bis etwa 4 CTA-Einheiten/jig Protein oder etwa 200 bis etwa 360 CTA-Einheiten/n Mol Protein.

Die Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivität des aus Streptokinase und einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion wie vorstehend angegeben hergestellten Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase beträgt etwa 0,70 bis etwa 0,75 der Aktivität des aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase.

Die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des aus dem wie vorstehend angegeben Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase beträgt im allgemeinen etwa das 1,8- bis etwa 2,2fache der Aktivität, bezogen auf das Gewicht des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. Die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellten Komplexes beträgt, bezogen auf das Molverhältnis, etwa das 1,0- bis etwa 1,2fache der Aktivität des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. Typische Werte für die Humanplasminogen-Aktiva-toraktivität des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, gemessen auf einem Caseinsubstrat, betragen etwa 8 bis etwa 12 CTA-Einheiten/ug Protein oder etwa 550 bis etwa 800 CTA-Einheiten/n Mol Protein. Die Humanplasminogen-Aktivatoraktivitätswerte für aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellte Komplexe aus der leichten (B) Plasmin-Ket-tenfraktion und Streptokinase betragen etwa das 0,9- bis etwa l,0fache der Werte des aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase. Die wesentlich höhere Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, bezogen auf das Gewicht, im Vergleich zu der Aktivität des Plasmin-Streptokinase-Komplexes ermöglicht die Anwendung von niedrigeren intravenösen Dosen des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase zur Erzielung einer gewünschten fibrinolyti-schen Wirkung im Vergleich zu dem Plasmin-Streptokinase-Komplex.

In vitro-Tests haben ausserdem gezeigt, dass der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase wesentlich wirksamer ist als der Plasmin-Streptokinase-Komplex in bezug auf die Verminderung oder Auflösung von Blutgerinnseln selbst bei Dosen, die im Hinblick auf die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität miteinander vergleichbar sind. Ohne an irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass diese verbesserte Wirksamkeit auf die geringere Molekülgrösse des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase im Vergleich zu dem Plasmin-Streptokinase-Komplex und dem zufolge auf das bessere Eindringvermögen der kleineren Moleküle in und die bessere Wirkung auf das Innere einer Blutgerinnselstruktur zurückzuführen ist.

Wenn es erwünscht ist, sicherzustellen, dass in der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion gemäss einem Aspekt der Erfindung oder in dem Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Ket-tenfraktion und Streptokinase gemäss einem anderen Aspekt der Erfindung keine Virenverunreinigungen enthalten sind, kann das Plasminogen-Ausgangsmaterial vor der Umwandlung in Plasmin oder vor der Komplexbildung mit Streptokinase wärmebehandelt werden, um irgendwelche Virenverunreinigungen zu inaktivieren. Eine Standard-Wärmebehand-lung, die von der Food and Drug Administration, wie oben erläutert, gefordert wird, besteht darin, das Plasminogen mindestens 10 Stunden lang bei einer Temperatur von mindestens 60°C zu halten. Es wurde gefunden, dass die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion gemäss einem Aspekt der Erfindung und der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase gemäss einem anderen Aspekt der Erfindung ihre jeweiligen Aktivitäten auch dann im wesentlichen vollständig behalten, wenn die jeweiligen Produkte aus wärmebehandeltem Plasminogen als Ausgangsmaterial hergestellt werden.

Wenn ein Plasmin-Streptokinase-Komplex aus einem wärmebehandelten Plasminogen-Ausgangsmaterial hergestellt wird, behält er ebenfalls im wesentlichen seine gesamte Aktivität. Unter der Einwirkung der Wärme auf das Plasmino-genmolekül verändert sich jedoch seine Struktur oder es wird denaturiert in einer Reihe von Zentren und das verhältnismässig grosse Piasminmolekül, das davon abgeleitet ist, wird ebenfalls im wesentlichen denaturiert, wodurch es selbst und seine Komplexe antigen und pyrogen gemacht werden, wenn es in den Blutstrom eines Patienten eingeführt wird.

Wenn das aus wärmebehandeltem Plasminogen hergestellte Plasmin reduziert und in eine schwere (A) Kettenfraktion und in eine leichte (B) Kettenfraktion aufgespalten wird, wird die schwere (A) Kettenfraktion verworfen, wobei viele der denaturierten Zentren, die sich in der schweren (A) Kettenfraktion befinden, ebenfalls verworfen werden, so dass eine native leichte (B) Kettenfraktion zurückbleibt, die wesentlich weniger antigen und weniger pyrogen sein kann als das gesamte denaturierte Plasmin. In entsprechender Weise können Komplexe mit einer solchen leichten (B)

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Plasmin-Kettenfraktion, wie z.B. Streptokinase-Komplexe, wesentlich weniger antigen und weniger pyrogen sein als ähnliche Komplexe aus dem gesamten denaturierten Plasmin.

Es hat sich als nicht notwendig erwiesen, stark gereinigte Streptokinase zu verwenden, da auch rohe Streptokinase-fraktionen zur Herstellung der Komplexe verwendet werden können.

Die Kupplungsreaktion der Streptokinase mit der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion oder mit dem Gesamtplasmin dient dazu, die Streptokinase von den in ihrer rohen Form damit verbundenen Verunreinigungen zu trennen.

Die Erfindung wird duch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Herstellung der leichten (B) Kettenfraktion

150 mg Leupeptin (Acetyl-L-leucin-L-leucin-L-argininal • V2H2SO4 • H2O) wurden zu 10 ml Humanplasmin (25 bis 30 CTA-Einheiten/mg Protein), gelöst in einem wässrigen Puffermedium aus 25% Glycerin, 0,04 Mol/1 tris-(Hydroxy-methyl)aminomethan (nachfolgend abgekürzt mit «Tris»), 0,02 Mol/1 Lysin und 0,08 Mol Liter Natriumchlorid bei pH

9 und bei einer Konzentraton von 5 mg/ml Protein zugegeben. Das Plasmin war aus wärmebehandeltem Humanplasminogen, wie nachfolgend angegeben, hergestellt worden. Während der Zugabe des Leupeptins wurde die Plasminlö-sung in einem Eisbad von 0°C gehalten und die Endkonzentration des Leupeptins in der Lösung betrug 0,04 Mol/1.

Zu dieser Plasmin-Leupeptin-Mischung wurden 0,072 ml konzentriertes 2-Mercaptoäthanol (Endkonzentration 0,1 M) zugegeben und die Plasmin-Leupeptin-Mischung wurde 20 Minuten lang reduziert, während sie in einem Wasserbad von 20°C gehalten wurde. Das reduzierte Plasmin wurde dann in ein Eisbad von 0°C gebracht und es wurden 0,29 ml 4 M Natriumjodacetat zugegeben, um die beim Aufbrechen der Disulfidbindungen in den Plasminmolekülen während der Reduktionsreaktion gebildeten Sulfhydrylgruppen zu alky-lieren. Die Alkylierungsreaktion wurde 30 Minuten lang bei 0°C ablaufen gelassen. Das reduzierte und alkylierte Plasmin wurde dann über eine L-Lysin-substituierte Sepharose-Kolonne (1 x20 cm) laufen gelassen, äquilibriert und bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 2°C mit einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer eluiert. Die Elution wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/Stunde durchgeführt und Volumenfraktionen von 3 ml wurden getrennt gesammelt. Die leichte (B) Kettenfraktion passierte die Kolonne ohne Adsorption und sie wurde durch Extinktionsmessungen bei 280 nm nachgewiesen. Wenn der Extinktionswert auf 0 zurückkehrte, wurden die die leichte (B) Kettenfraktion enthaltenden Fraktionen miteinander vereinigt und zur Ausfällung der leichten (B) Kettenfraktion wurden 3,1 g/10 ml Ammoniumsulfat bei 0°C zugegeben, wobei das nicht-ausge-fällte Leupeptin in der flüssigen Phase zurückblieb. Die miteinander vereinigten, Ammoniumsulfat enthaltenden Fraktionen wurden über Nacht bei 4°C stehen gelassen, um eine vollständige Ausfällung der leichten (B) Kettenfraktion zu gewährleisten, und der Niederschlag wurde anschliessend durch Zentrifugieren bei 6000 UpM für einen Zeitraum von 1 Stunde bei 2°C entfernt. Der Niederschlag aus der leichten (B) Kettenfraktion wurde in einer Konzentration von

10 mg/ml (E|Jm = 16) in einem wässrigen Puffermedium gelöst ähnlich demjenigen, wie es anfänglich zum Auflösen des Plasmins verwendet worden war. Die leichte (B) Kettenfraktion wurde bei 1 stündigem Zentrifugieren bei 2°C mit 3000 UpM klar und sie wurde bei —20°C aufbewahrt.

In der Regel hatte die so erhaltene leichte (B) Plasmin-Ket-tenfraktion eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsubstrat von 0,07 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder von 2,6 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von 2,03 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder 27,2 CTA-Einheiten/mg Protein für das Plasmin, aus dem die leichte (B) Kettenfraktion stammte.

In der Regel kann die auf diese Weise erhaltene leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion 0,09 Mol tritiiertes Diisopropylphos-phorfluoridat pro Mol Protein einarbeiten im Vergleich zu dem Ausgangs-Plasmin, das 0,95 Mol pro Mol Protein einarbeiten kann.

Beispiel 2

Herstellung eines Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase aus der leichten (B) Kettenfraktion

Ein äquimolarer Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase wurde hergestellt durch Zugabe von 0,5 ml Streptokinase (32 mg/ml) zu 0,9 ml der im Beispiel hergestellten leichten (B) Kettenfraktion. Der äqui-molare Komplex wurde 10 Minuten lang bei 25°C inkubiert und dann bei -20°C aufbewahrt. In der Regel hatte der so hergestellte äquimolare Komplex eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsubstrat von 0,16 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder von 2,3 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von 1,52 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder von 11,6 CTA-Einheiten/mg Protein des aus dem Ausgangsplasmin hergestellten äquimolaren Streptokinasekomplexes.

Typische Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivitätswerte für den äquimolaren Komplex des Beispiels 2 auf einem Caseinsubstrat waren 2,6 CTA-Einheiten/ug Protein oder 175 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 2,1 CTA-Einheiten/ug Protein oder 264 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin. Typische Werte für die Humanplas-minogen-Aktivatoraktivität des äquimolaren Komplexes des Beispiels 2 auf einem Caseinsubstrat waren 9,3 CTA-Ein-heiten/ug Protein oder 636 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 4,9 CTA-Einheiten/}ig Protein oder 622 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

Der äquimolare Komplex des Beispiels 2 kann in der Regel 0,50 Mol tritiiertes Diisopropylphosphorfluoridat pro Mol Protein einarbeiten im Vergleich zu einem Wert von 0,90 Mol pro Mol Protein für einen äquimolaren Komplex aus Streptokinase und dem Ausgangsplasmin.

Beispiel 3

Herstellung eines Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase aus dem Plasmin-Streptokinase-Komplex

Wärmebehandeltes Humanplasminogen (25 bis 30 CTA-Einheiten/mg Protein) wurde in einem wässrigen Puffermedium gelöst, das 0,05 Mol pro Liter Tris, 0,02 Mol pro Liter Lysin und 0,1 Mol pro Liter Natriumchlorid enthielt und einen pH-Wert von 9 aufwies, bis zu einer Konzentration von 22 mg/ml Protein. Zu 3 ml der oben genannten Plasminogen-lösung wurden in einem Wasserbad von 0°C 1 ml Streptokinase (100 000 Einheiten/mg Protein) in einer Konzentration von 32 mg/ml Protein in einem 0,067 M Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4 zugegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang in einem Wasserbad von 25°C inkubiert, um den Komplex sich in einem Plasmin-Streptokinase-Komplex umwandeln zu lassen. Der Komplex wurde dann in einem Eisbad von 0°C gekühlt und durch Zugabe von 8 ml der in Beispiel 1 beschriebenen 25%igen Glycerin-Pufferlö-sung auf 12 ml verdünnt.

Zu 12 ml des Plasmin-Streptokinasekomplexes, der oben s

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hergestellt worden war, wurden 0,07 ml konzentriertes 2-Mercaptoäthanol bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben. Der Komplex wurde 20 Minuten lang in einem Wasserbad von 20°C reduziert, dann auf 0°C abgekühlt und alkyliert durch Zugabe von 0,35 ml 4 M Natriumjodacetat. Nach 30minütigem Stehenlassen bei 0°C wurde der reduzierte und alkylierte Streptokinase-Komplex über eine L-Lysin-substituierte Sepharose-Kolonne (1 x20 cm) auf die in Beispiel 1 für das reduzierte und alkylierte Plasmin beschriebene Weise laufen gelassen. Der Komplex aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase passierte ohne Adsorption die Kolonne und er wurde nachgewiesen, gesammelt, ausgefällt, zentrifugiert, gelöst und geklärt wie die leichte (B) Kettenfraktion in Beispiel 1.

In der Regel hatte der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase in Beispiel 3 eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsubstrat von 0,21 Casein-Einheiten/n Mol Protein oder von 2,9 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von 1,52 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder 11,6 CTA-Einheiten/mg Protein für den äquimolaren Komplex aus Streptokinase und dem Ausgangsplasmin. Die typsichen Rinder-Plasminogenaktivatoraktivitätswerte für den Komplex des Beispiels 3 auf einem Caseinsubstrat betrugen 3,6 CTA-Einheiten/jig Protein oder 237 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 2,1 CTA-Einheiten/|ag Protein oder 264 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin. Typische Werte für die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des Komplexes des Beispiels 3 auf einem Caseinsubstrat waren 10,0 CTA-Einheiten/ug Protein oder 685 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 4,9 CTA-Einheiten/jig Protein oder 622 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

In der Regel kann der Komplex des Beispiels 3 0,70 Mol tritiiertes Diisopropylphosphorfluoridat pro Mol Protein aufnehmen im Vergleich zu einem Wert von 0,90 Mol pro Mol Protein für einen äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

Beispiel 4

Wärmebehandlung von Plasminogen

In Beispiel 1 wurde das Ausgangsplasmin als «aus einem wärmebehandelten Humanplasminogen hergestellt» bezeichnet und in Beispiel 3 wurde das Ausgangsplasmi-nogen als «wärmebehandelt» bezeichnet.

In jedem Falle wurde Humanplasminogen bei einer Konzentration von 20 mg/ml in einem 0,05 M Tris-0,02 M Lysin-0,1 M NaCl-Puffer bei einem pH-Wert von 9,0 mit 1 n HCl bei 0°C auf pH 3,0 eingestellt, dann bei einem pH-Wert von 3,0 gegen einen 0,15 M Glycin-0,001 M HCl-Puffer gründlich dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Proteinlösung mit dem 0,15 M Glycin-0,001 M HCl-Puffer bis auf eine Endkonzentration von 1 mg Protein pro ml verdünnt und in einem mit einem Stopfen verschlossenen Kolben 10 Stunden lang in einem Wasserbad von 60°C erhitzt. Das Plasminogen wurde dann in einem Eisbad abgekühlt und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat (3,1 g/10 ml Lösung) ausgefällt. Das wärmebehandelte Plasminogen wurde durch 1 stündiges Zentrifugieren bei 6000 UpM abgetrennt und der Niederschlag wurde aufgelöst zur Erzielung einer Konzentration von 10 mg/ml in dem 0,05 M Tris-0,02 M Lysin-0,10 M NaCl-Puffer bei einem pH-Wert von 9,0. Das wärmebehandelte Plasminogenkonzentrat wurde durch 1 stündiges Zentrifugieren bei 3000 UpM geklärt und das unlösliche Protein wurde entfernt und verworfen. Das Plasminogen wurde unter Verwendung einer chromatographischen L-Lysin-substitu-

ierten Sepharose-Affinitäts-Kolonne weiter gereinigt und nach dem Eluieren mit e-Aminocapronsäure wurde es unter Anwendung der Ammoniumsulfat-Ausfällungsmethode abgetrennt. Nach der Wärmebehandlung wurden etwa 74% des Ausgangsproteins und etwa 73% der anfänglichen proteolytischen Aktivität zurückgewonnen, wobei fast keine Änderung der spezifischen Aktivität des Plasminogens auftrat.

Es braucht nicht erwähnt zu werden, dass die vorstehend beschriebenen Beispiele auch in einer für den Fachmann ohne weiteres ersichtlichen Weise abgeändert und modifiziert werden können, ohne dass dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird. So können beispielsweise anstelle von Leupeptin (Acetyl-L-leucin-L-leucin-L-argi-ninal) andere reversible Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitoren, wie Benzamidin und seine Derivate, verwendet werden. Der Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitor wird vorzugsweise in einer Konzentration verwendet, die ausreicht, um eine etwa 90%ige Plasmin-Inhibierung ("Hemmung) zu erzielen. Bei Verwendung von Benzamidin als Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitor sind die proteolytischen Aktivitäten der leichten (B) Kettenfraktion und ihres Streptokinase-Komplexes nicht so niedrig wie diejenigen der unter Verwendung eines Leupeptin-Inhibitors hergestellten Produkte, sie sind jedoch niedriger als diejenigen des Komplexes aus Streptokinase und dem vollständigen Plasmin. Die Plasminogenaktivatoraktivität ist auch höher für die unter Verwendung von Benzamidin als Serinprotease-Aktivitäts-zentren-Inhibitor hergestellten Produkte um bis zu etwa 8 CTA-Einheiten/(ig Protein oder 600 CTA-Einheiten/n Mol für die Rinder-Plasminogenaktivatoraktivität oder bis zu etwa 25 CTA-Einheiten/|j,g Protein oder 1500 CTA-Einheiten/ n Mol für die Humanplasminogenaktivatoraktivität.

Anstelle von 2-Mercaptoäthanol können auch andere Reduktionsmittel, wie Dithioerythrit oder Dithiothreit, verwendet werden, um die Disulfidbrücken in den Plasminmolekülen aufzuspalten. Als Alkylierungsmittel kann Natriumjodacetat verwendet werden, wie in den Beispielen 1 und 3 angegeben, es kann aber auch Jodacetamid oder irgendein anderes Alkylierungsmittel verwendet werden, von dem bekannt ist, dass es eine Schutzgruppe für eine freie Sulfhy-drylgruppe liefert.

Das Plasminogen-Ausgangsmaterial braucht nicht rein zu sein. Es können auch rohe Präparate, die Plasmafraktionen enthalten oder sogar vollständiges Plasma enthalten, verwendet werden, da während der weiteren Verarbeitung des Materials eine Reinigung erfolgt. Anstelle von L-Lysin-sub-stituierter Sepharose können in der chromatographischen Affinitätskolonne auch andere selektive Adsorbentien, wie z.B. L-Lysin-substituiertes Polyacrylamid oder L-Lysin-sub-stituierte Agarose sowie durch L-Arginin oder D-Lysin substituierte Sepharose, Polyacrylamid oder Agarose verwendet werden. Die chromatographische Trennung kann gewünsch-tenfalls auch unter Anwendung eines diskontinuierlichen Verfahrens anstatt in einer Kolonne durchgeführt werden.

Die äquimolaren Komplexe werden, wenn sie wegen ihrer fibrinolytischen Wirkung an einen Patienten verabreicht werden, am besten intravenös verabreicht. Sie können allmählich (portionsweise) über einen längeren Zeitraum in einer in einer physiologischen Glukose-Kochsalz-Lösung verdünnten Form verabreicht werden oder sie können in einer konzentrierteren Form, gelöst in einer physiologischen Glukose-Kochsalz-Lösung, verabreicht werden, entweder allein oder in Mischung mit anderen Materialien, wie z.B. Humanalbumin. Die Dosen können in Abhängigkeit von dem Zustand des Patienten variieren und sie liegen im allgemeinen innerhalb des Bereiches von 0,01 bis 1,0 mg/kg Körpergewicht/Tag.

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Die Komplexe können in flüssiger Form in Ampullen in Form einer Lösung in einer physiologischen Glukose-Kochsalzlösung oder in einer Albumin enthaltenden Kochsalzlösung abgepackt sein. Sie können auch in trockener Form als Pulver in Mischung mit Humanalbumin, hergestellt durch Lyophilisieren einer Lösung des Komplexes mit Albumin, abgepackt sein.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, dass sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern dass diese in vielfacher s Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne dass dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

B

Claims

637991 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinproteasezentrum, dadurch gekennzeichnet, dass man Plasmin mit einem reversiblen aktiven Serinproteasezentrums-Inhibitor mischt, an den Disulfidbindungen zwischen den Ketten die Piasminmoleküle in der Mischung reduziert unter Bildung eines Gemisches, das schwere (A) und leichte (B) Kettenfraktionen enthält, und anschliessend die leichte (B) Kettenfraktion von der* schweren (A) Kettenfraktion trennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gemisch aus der schweren (A) und der leichten (B) Kettenfraktion vor der Trennung alkyliert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serin-protease-Zentrum, dadurch gekennzeichnet, dass man Humanplasmin, das aus Plasminogen hergestellt worden ist, das mindestens 10 Stunden lang bei mindestens 60°C wärmebehandelt wurde, mit Acetyl-L-Leucin-L-Leucin-L-argininal mischt, das Reaktionsprodukt mit 2-Mercaptoäthanol reduziert unter Bildung einer Mischung aus schweren (A) und leichten (B) Kettenfraktionen, diese Mischung mit Natrium-jodacetat alkyliert und anschliessend durch Eluieren aus einer L-Lysin-substituierten Sepharose-Kolonne die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt und die leichte (B) Kettenfraktion in der nicht-adsor-bierten Fraktion gewinnt.

4. Verwendung der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion, die nach dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 hergestellt worden ist, zur Herstellungeines Komplexes aus Streptokinase und einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum, dadurch gekennzeichnet, dass man die leichte (B) Kettenfraktion mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge Streptokinase umsetzt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Humanplasmin, das aus Plasminogen hergestellt worden ist, das mindestens 10 Stunden lang bei mindestens 60°C wärmebehandelt wurde, mit Acetyl-L-Leucin-L-Leucin-L-argininal mischt, das Reaktionsprodukt mit 2-Mercaptoäthanol reduziert unter Bildung einer Mischung aus schweren (A) und leichten (B) Kettenfraktionen, die Mischung mit Natriumjodacetat alkyliert, die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion durch Eluieren aus einer L-Lysin-substituierten Sepharose-Kolonne trennt und die leichte (B) Kettenfraktion in der nicht-adsorbierten Fraktion gewinnt und anschliessend die gewonnene leichte (B) Kettenfraktion mit Streptokinase umsetzt in einem Molverhältnis von 1,0 Mol der leichten (B) Kettenfraktion auf 0,9 Mol Streptokinase.