DE3400413C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 11 angegebene Verfahren zum Pasteurisieren einer Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden Zusammensetzung, pasteu­ risierte Zusammensetzungen, die ein Konzentrat von Koagu­ lationsfaktoren II, VII, IX und X enthalten nach den Ansprüchen 12 bis 15 und nach Anspruch 16 ein pharmazeutisches Mittel enthalten und diese zusammensetzt. Weitere Ziele der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, in welcher alle Teile und Prozent­ sätze auf das Gewicht bezogen sind, sofern nicht anders angegeben.

Aus humanen Blutplasma können zahlreiche brauchbare Blutfraktionen und Blutproteine durch Fraktionieren nach bekannten Techniken erhalten werden, z. B. der Alkoholfraktionierungsmethode von Cohn, beschrieben in US-PS 23 90 074 (1945) und in Journal of the American Chemical Society, Band 68, Seite 459 (1947) und der Rivanol®-Ammoniumsulfatmethode.

Die vorerwähnten Methoden sowie auch andere Variationen und Verfahren, werden in "The Plasma Proteins", 2. Ausgabe, Band III, Seiten 548 bis 550, Academic Press, New York (1977) zusam­ mengefaßt. Diese Blutfraktionen enthalten biologisch aktive Proteine, die gewisse therapeutische Qualitäten aufweisen. Beispielsweise ist ein Konzentrat der Fak­ toren II, VII, IX und X für die Behandlung von an Hämophile leidenden Personen geeignet. Man schätzt bis zu 100 000 Fälle an angeborener Hämophilie in den Vereinigten Staaten von Amerika. Von diesen sind annä­ hernd 20 000 Fälle von Hämophilie B, bei denen im Blut solcher Patienten entweder die Plasmathromboplastin­ komponente vollständig fehlt oder ein erheblicher Man­ gel an der Plasmathromboplastinkomponente vorliegt. Diese Krankheit tritt deshalb in verschiedenen Schwere­ graden auf und erfordert eine wöchentliche bis zu 1 bis 2mal jährliche Therapie. Im Falle des vollstän­ digen Fehlens ist eine Austauschtherapie einmal wöchent­ lich erforderlich, während in solchen Fällen, bei de­ nen nur ein Teilmangel vorliegt, eine Therapie nur er­ forderlich wird, wenn Blutungsepisoden eintreten, die in einigen Fällen nur einmal jährlich auftreten. Die Blutungsepisoden bei den angeborenen Teilmangelfällen werden im allgemeinen durch eine vorübergehend erworbene Empfindlichkeit und nicht allein durch eine Verlet­ zung verursacht. Durch intravenöse Injektionen einer ausreichend großen Menge an Frischplasma oder einer äquivalenten Menge an Frischblut, kann man die Defekte bei einer unter dem Mangel leidenden Person zeitweilig korrigieren. Die positive Wirkung hält oft für 2 bis 3 Wochen an, obwohl die Koagulationsdefekte, gemessen durch in vitro Versuche in dem Blut des Patienten, nur für 2 oder 3 Tage eine Besserung zeigen. Eine solche Therapie mit Frischplasma oder Frischblut ist zwar wirk­ sam, weist jedoch erhebliche Nachteile auf:

• 1) man benötigt schnell zur Verfügung stehende große Mengen an Frischplasma;
• 2) während der Verabreichung des Plasma ist ein Krankenhausaufenthalt erforderlich;
• 3) zahlreiche Patienten werden gegen wiederholte Blut- oder Plasmainfusionen empfindlich und es können schließlich lebensgefährliche Transfusionsreaktionen auftreten;
• 4) im besten Fall kann das Plasma nur zum Teil den Mangel beheben;
• 5) eine Langzeitbehandlung oder ein chirurgi­ scher Eingriff sind nicht möglich, weil die großen Mengen an benötigtem Blut oder Plasma akute und gefähr­ liche Ödeme hervorrufen.

Wegen der obigen Gründe sind Konzentrate der Koagula­ tionsfaktoren II, VII, IX und X (Faktor-IX-Konzentrate) für die Verabreichung an Hämophilie B-Patienten ent­ wickelt worden (z. B. die Konzentrate der Faktoren II, VII, IX und X gemäß US-PS 37 17 708).

Ein Problem, das sich den Anwendern von Faktor-IX- Konzentraten stellt, ist die Wärmeinstabilität der darin enthaltenen therapeutisch aktiven Proteine. In vielen Fällen stellt man einen erheblichen und in einigen Fällen einen vollständigen Aktivitätsverlust fest, wenn man diese Konzentrate oberhalb der physio­ logisch verträglichen Temperaturen, d. h. oberhalb etwa 40 bis 45°C, erwärmt. Infolgedessen erfordern diese Stoffe eine besondere Vorsicht während der Zube­ reitung und Lagerung, um eine solche Desaktivierung zu minimieren.

Die Wärmeinstabilität der vorerwähnten Proteine macht sie unpasteurisierbar. Aus Plasma isolierte, thera­ peutisch aktive Proteine können Viren enthalten, z. B. Hepatitis-Viren, die in dem Ausgangsmaterial für die Proteinfraktion, nämlich dem Spenderblut, vorliegen. Es besteht daher die Gefahr einer Hepatitisansteckung bei den Personen, die unpasteurisierte Fraktionen von Blutplasmafraktionen erhalten, weil man die Anwesen­ heit des Virus mit den bekannten Verfahren nicht mit Sicherheit nachweisen kann. In zahlreichen Situationen muß vom Arzt entschieden werden, ob das Infektionsri­ siko für den Patienten durch den Schaden, der dem Patienten entstünde, wenn er keine therapeutische Be­ handlung mit der Plasmafraktion erhält, wieder wett­ gemacht wird.

Einige therapeutisch aktive Proteine aus Plasma sind erfolgreich pasteurisiert worden. So ist es bekannt, daß man Albumin durch Erhitzen auf 60°C oder 64°C während 10 Stunden (Gellis et al, J. Clin. Invest., Bd. 27, Seiten 239 bis 244 (1948)) in Gegenwart von gewissen Stabilisatoren, wie Acetyltryptophan und Natriumcaprylat, pasteurisieren kann. Personen, die dieses pasteurisierte Material erhielten, wurden nicht mit Hepatitis angesteckt und dies ist ein An­ zeichen dafür, daß die Hepatitis-Viren inaktiviert wurden, während die Albuminaktivität unter den vor­ erwähnten Erwärmungsbedingungen beibehalten wurde. Eine Plasmaproteinfraktion (Human) wurde auch schon während der Pasteurisierung nach der oben erwähnten Methode stabilisiert.

Ein Verfahren zum Pasteurisieren von Plasminogen wird von Baumgarten et al in US-PS 32 27 626 beschrieben. Eine wäßrige Zubereitung, enthaltend 0,25 bis 20 mg/ml Plasminogen und weiterhin 0,1 bis 0,5 Mol Lysin mit einem pH von 5,3 bis 7,5, wurde während 10 Stunden bei 60°C erwärmt. Wie in der Patentschrift festgestellt wird, wurden die Hepatitis-Viren zerstört und die Ge­ fahr einer Hepatitisübertragung wurde unter Beibehal­ tung der Plasminogenaktivität behoben. Versuche, Plasminogen unter den vorerwähnten Bedingungen in Abwe­ senheit von Lysin zu pasteurisieren, ergaben eine voll­ ständige Zerstörung der Plasminogenaktivität. Interes­ sant ist dabei die Feststellung, daß Plasminogen mit N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat während der Pasteurisierung nicht stabilisiert werden kann, noch daß man Albumin und Plasmaproteinfraktion (human) in Gegenwart von Lysin pasteurisieren kann.

Singher hat ein Verfahren zur Behandlung von Plasminogen beschrieben, unter Erhalt eines Materials, das nicht mit Hepatitis-Viren kontaminiert ist (US-PS 28 97 123). In der patentierten Pasteurisierungstechnik werden wäßrige Lösungen von Plasminogen während etwa 10 Stunden auf etwa 60°C erwärmt. Die Aktivität des Plas­ minogens wird beibehalten, wenn die Lösungen einen pH im Bereich von nicht weniger als 3 oder mehr als 6,5 und eine Ionenstärke von mehr als 0,2 aufweisen.

Eine weitere Methode zur Entfernung von Hepatitis- Viren aus biologischem Material wird in US-PS 41 68 300 beschrieben. Das zu behandelnde Material wird mit einer Zubereitung in Berührung gebracht, die Agarosegel oder perlförmiges Polyacrylamid, gekuppelt mit einer Auswahl an hydrophoben Liganden, sein kann. Plasma und Albumin wurden zur Entfernung von Hepatitis-Viren der obigen Reinigungsmethode unterworfen.

Wäßrige Lösungen von Enzymthrombin wurden stabili­ siert (Seegers, Arch. Biochem., 1944, Bd. 3, Seiten 363 bis 367), indem man in Gegenwart von Sättigungs­ mengen von gewissen Glykosiden auf 50°C erwärmte. Die stabilisierten Lösungen wurden bei der obigen Tempera­ tur während 48 Stunden oder mehr unter einem minimalen Aktivitätsverlust erwärmt. Andererseits hat Seegers auch offenbart, daß Glykoside und Polyole nur eine minimale Wirkung haben, Enzymprothrombin zu stabili­ sieren. Die reversible Denaturierung von Lysozym und Ribonuklease wurde von Gerlsma et al, Int. J. Peptide Proteine Res., Bd. 4, Seiten 377 bis 383 (1972) unter­ sucht. Die Autoren fanden, daß gewisse mehrwertige Alkohole die Temperaturen, bei denen die Enzyme dena­ turisiert wurden, etwas erhöhten. Schließlich stell­ ten Simpson et al in J. Am. Chem. Soc., Bd. 75, Nr. 21, Seiten 5139 bis 5152 (1953) und Donovan in J. Sci. Fd. Agric., Bd. 28, Seiten 571 bis 578 (1977) fest, daß die Denaturisierungstemperatur von Ovalbumin (ein Eiweißprotein) etwas erhöht wurde in Gegenwart von Saccharose in einer wäßrigen Lösung des Proteins. Donovan hat jedoch betont, daß die Denaturisierungs­ temperatur von Ovalbumin und S-Ovalbumin 84,5°C bzw. 92,5°C beträgt. Weiterhin haben Ovalbumin und S-Oval­ bumin ebenso wie die vorerwähnten Enzyme keine thera­ peutische Aktivität bei der Behandlung von Krankhei­ ten beim Menschen, während Blutplasmaproteine therapeu­ tisch aktiv sind. Wie unten dargelegt wird, desakti­ vieren proteolytische Enzyme Blutplasmaproteine.

Singher zählt in dem vorerwähnten US-Patent einige Methoden zur Zerstörung von Hepatitis-Viren auf. Die am wenigsten wirksame Methode betrifft die Verwendung von entweder Stickstofflost oder β-Propiolakton. Eine Hochenergiebestrahlung in geeigneten Dosen ist wirk­ sam, zerstört jedoch bei der Anwendung auf humane Blutprodukte die biologische Aktivität. Wärme wird ebenfalls als wirksam gegen Hepatitis-Viren erkannt, wobei die bevorzugte Behandlung darin besteht, daß man das Material während 10 Stunden auf 60°C erwärmt. Höhere Temperaturen oberhalb 70°C für kürzere Zeit­ räume oder niedrigere Temperaturen während längerer Zeiträume sind ebenfalls mit erfolgreichen Ergebnissen versucht worden. Dabei ist es jedoch wichtig festzu­ stellen, daß höhere Temperaturen wegen der Denatu­ rierungsgefahr der Proteine unerwünscht sind. Ebenso sind niedrige Temperaturen während längerer Zeiträume zu vermeiden, weil eine Reihe von proteolytischen Enzymen unter diesen Bedingungen aktiviert werden und diese aktivierten Enzyme einen Proteinabbau verur­ sachen. Auch die Anwendung von Temperaturen unterhalb 60°C zum Pasteurisieren hat nicht gleichbleibend zu einem Material, das keine infektiösen Viren enthält, geführt.

Wie vorerwähnt, haben Gellis et al erkannt, daß ein Erhitzen auf 60°C bis 64°C während 10 Stunden er­ folgreich die Hepatitis-Viren in Albumin zerstören. Gellis et al haben experimentell nachgewiesen, daß Albumin, das unter den vorerwähnten Bedingungen er­ wärmt wurde, keine Hepatitis überträgt, selbst wenn vor dem Pasteurisieren Hepatitis-Viren vorhanden waren. Der Autor hat jedoch festgestellt, daß Hepatitis- Viren ein 1stündiges Erhitzen auf 56°C überlebten, eine Temperatur, die üblicherweise zum Inaktivieren von Viren angewendet wird. Obwohl ein 1stündiges Er­ hitzen auf Temperaturen von etwa 56°C die meisten Viren deaktiviert, wird der Hepatitis-Virus nicht inaktiviert und Materialien, die Hepatitis-Viren ent­ halten und die während 1 Stunde auf 56°C erwärmt wur­ den, verursachen eine Hepatitis-Infektion bei Personen, die diese Materialien erhalten.

In dem japanischen Patent 51-134878 (1976) wird die Stabilisierung von Faktor XIII gegen Wärmeinaktivie­ rung (60°C während 10 Stunden) unter Verwendung von 10 bis 20% (w/v) eines Stabilisators, wie einer neutralen Aminosäure, einem Monosaccharid oder einem Zuckeralkohol gelehrt. Weiterhin wird in US-PS 42 97 344 eine Methode zum Wärmestabilisieren von Koagulationsfaktoren II, VIII, XIII, Antithrombin III und Plasminogen in Gegenwart von 1 bis 3 molaren Mengen von gewissen Aminosäuren und 20 bis 60% (w/w) Kohlehydraten offenbart. Haptoglobin wurde in Gegen­ wart eines Stabilisators, wie einer Aminosäure, einem Mono- oder Disaccharid oder einem Zuckeralkohol pa­ steurisiert.

In der DE-OS 30 43 857 wird ein Verfahren zur Herstel­ lung einer hepatitisfreien Zubereitung von Koagula­ tionsfaktoren II und/oder VII offenbart. Das Verfah­ ren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Zuberei­ tung des Faktors II und/oder VII mit einer Aminosäure und/oder einem Saccharid oder einem Zuckeralkohol und einem Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraessig­ säure oder Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylenether)- tetraacetat vermischt und die Mischung zur Inaktivie­ rung von Hepatitis-Viren erwärmt.

Antithrombin-Zusammensetzungen wurden mit Zitrationen vermischt, um das Antithrombin gegen Wärme zu stabili­ sieren (Holleman et al, Thromb. Haemostatis, 38, 201 (1977)).

Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode zur Verfügung, um die vorerwähnten Probleme zu lösen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Zusammensetzun­ gen, die ein Konzentrat der Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X enthalten, während der Pasteurisierung unter Erwärmen auf eine Temperatur von etwa 60 bis 100°C wärmestabilisiert, indem man sie mit wärme­ stabilisierenden oder pasteurisierungsstabilisierenden Mengen eines Polyols und einer Quelle für Citrationen vermischt. Als Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfah­ rens stehen pasteurisierte Zusammensetzungen, enthal­ tend ein Konzentrat der Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X, wie sie bisher nicht erhältlich waren, zur Verfügung, indem man eine Mischung einer unpasteuri­ sierten Proteinzusammensetzung, eines Polyols und einer Quelle für Zitrationen, suspendiert oder solubilisiert, gewöhnlich in einem wäßrigen Medium, bei einer Tem­ peratur und während einer ausreichenden Zeit, um die Proteinzusammensetzung zu pasteurisieren, erwärmt. Im Anschluß an die Pasteurisierungs- oder Wärmebehand­ lung werden im gewünschten Maße das Polyol und die Zitrationen ganz oder zum Teil aus der Proteinzusammen­ setzung nach üblichen Methoden entfernt und die pa­ steurisierte Proteinzusammensetzung wird dann in übli­ cher Weise für die vorgesehene therapeutische Anwendung verarbeitet.

Der Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verfügbarkeit von wärmestabilen und pasteuri­ sierten Zusammensetzungen, enthaltend ein Konzentrat von Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X, die bisher unbekannt und nicht erhältlich waren. Da die thera­ peutisch aktiven Proteinzusammensetzungen gemäß der Erfindung mit einem minimalen Aktivitätsverlust unter Bedingungen erwärmt werden können, die zur Inaktivie­ rung von Hepatitis-Viren bekannt sind, kann man diese wertvollen Stoffe Patienten verabreichen, welche die vollen therapeutischen Vorteile unter einem wesentlich verminderten Risiko, durch Hepatitis-Viren infiziert zu werden, erhalten.

Wie schon erwähnt, schließen die erfindungsgemäßen Produkte pasteurisierte oder wärmebehandelte Zusammen­ setzungen aus einem Konzentrat von Koagulationsfakto­ ren II, VII, IX und X ein, die einer Pasteurisierung oder Erwärmung bei Temperaturen von etwa 60 bis 100°C, vorzugsweise etwa 60 bis 75°C, unterworfen wurden, nachdem man sie mit wärmestabilisierenden oder pasteu­ risierungsstabilisierenden Mengen eines Polyols und einer Quelle für Citrationen vermischt hat, wobei die pasteurisierten Zusammensetzungen Polyole und Citrat­ ionen enthalten oder davon frei sind.

Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfah­ ren ist eine unpasteurisierte Zusammensetzung aus einem Konzentrat von Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X, wobei die Zusammensetzung heptatitsinfektiös sein kann, d. h. infektiöse Mengen an Hepatitis-Viren enthal­ ten kann. Man kann Konzentrate von Faktoren II, VII, IX und X (Faktor IX-Konzentrat-Prothrombin-Komplex) aus Blutplasma auf verschiedene Weisen erhalten. Beispielsweise kann man die Methode gemäß US-PS 37 17 708 oder irgendeine andere Methode des hier beschriebenen Standes der Technik anwenden. Beim Verfahren gemäß US-PS 37 17 708 wird Cohn-Supernatant I, Methode 6, aus unmodifiziertem citriertem Humanplasma auf ein Ionenaustauschharz, auf dem Koagulationsfak­ toren II, VII, IX und X adsorbiert sind, aufgebracht. Die vorerwähnten Faktoren werden dann selektiv von dem Ionenaustauschharz eluiert. Ein Beispiel für eine andere Methode zur Herstellung eines Faktor XI-Konzen­ trates ist das Verfahren, welches in US-PS 42 72 523 beschrieben wird. Im allgemeinen besteht bei Faktor IX-Konzentration aus humanem Blutplasma die Gefahr für eine Hepatitisinfektion.

Die Faktor IX-Zusammensetzung enthält im allgemeinen etwa 1 bis 20 Gew.-% der Koagulationsfaktoren, ge­ wöhnlich mindestens etwa 5 Gew.-%. Die Koagulations­ aktivitäten sind im allgemeinen normalerweise in den Zusammensetzungen in dem folgenden Verhältnis vorhan­ den: Faktor II : Faktor IX von etwa 0 bis 10, vor­ zugsweise etwa 0,1 bis 2,0, Faktor VII : Faktor IX von etwa 0 bis 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 2,0 und Faktor X : Faktor IX von etwa 0 bis 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 2,0.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu pasteu­ risierende Proteinzusammensetzung in einem wäßrigen Medium mit einer Menge an Polyol und einer Quelle für Citrationen, die ausreicht, um die Proteinzusammen­ setzung während der nachfolgenden Pasteurisierung zu stabilisieren, suspendiert oder gelöst. Die Konzentra­ tion an Polyol und Citrationen, die erforderlich ist, um die Proteinzusammensetzung in Übereinstimmung mit der Erfindung zu stabilisieren, hängt von der Kon­ zentration an therapeutisch aktivem Protein in der Proteinzusammensetzung und von der Art des Polyols ab. Im allgemeinen soll die wärmestabilisierende Menge oder pasteurisierungsstabilisierende Menge des Polyols im Bereich von etwa 1 bis 1000 Teilen, vorzugsweise 5 bis 100 Teilen an Polyol pro Teil Gesamtprotein in der Proteinzusammensetzung liegen. Im allgemeinen wird etwa 1 Teil der Proteinzusammensetzung mit etwa 1 bis 500 Teilen, vorzugsweise 4 bis 200 Teilen eines wäßrigen Mediums, enthaltend etwa 20%, vorzugsweise wenigstens etwa 30%, bis zur Sättigungskonzentration (vorzugsweise bei der Pasteurisierungstemperatur), eines Polyols auf einer Gewicht-zu-Volumen-Basis, vermischt. Das therapeutisch aktive Protein wird dann als sta­ bilisiert angesehen, wenn es einen wesentlichen Teil, d. h. wenigstens 40% seiner therapeutischen Aktivi­ tät während der Pasteurisierung beibehält. Vorzugs­ weise sollen 50% oder mehr der therapeutischen Akti­ vität des Faktor IX-Konzentrats während der Pasteuri­ sierung beibehalten werden. Infolgedessen soll die Menge des zugegebenen Polyols groß genug sein, um die vorerwähnte Menge der therapeutischen Aktivität bei­ zubehalten.

Die Menge an Citrationen beträgt im allgemeinen 0,1 bis 1,0 Mol pro Liter der Lösung und vorzugsweise etwa 0,3 bis 0,5 Mol pro Liter.

Nachdem man die Proteinzusammensetzung mit dem Polyol und den Citrationen vermischt hat, wird die Mischung in einer für die Pasteurisierung ausreichenden Zeit und Temperatur erwärmt. Auf diese Weise wird die Mischung beim Erwärmen unter Bedingungen pasteurisiert, von denen bekannt ist, daß Hepatitis-Viren inaktiviert werden. Eine wirksame Pasteurisierung zur Inaktivierung von Hepatitis-Viren und zur Vermeidung des Risikos einer Hepatitisinfektion erzielt man, wenn man die unpasteurisierte Proteinzusammensetzung auf eine Temperatur von etwa 60 bis 100°C, vorzugs­ weise etwa 60 bis 75°C während etwa 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise 6 bis 10 Stunden, im allgemeinen während etwa 10 Stunden auf 60 bis 65°C, erwärmt.

Die Pasteurisierung wird unter physiologisch annehm­ baren pH-Bedingungen durchgeführt. Das heißt, daß der pH der Mischung im allgemeinen im Bereich von etwa 5,5 bis 8,0 und vorzugsweise etwa 6,0 bis 7,5 liegen soll. Im allgemeinen sind physiologische Bedingungen, soweit möglich, während der Pasteurisierung erwünscht, um eine möglichst geringe Störung der therapeutisch aktiven Proteinzusammensetzung sicherzustellen.

Die Menge eines bestimmten Polyols und an Citrationen, die erforderlich sind, um eine bestimmte Proteinzusam­ mensetzung während der Pasteurisierung zu stabili­ sieren, und die Bedingungen, die erforderlich sind, um die Zusammensetzung zu pasteurisieren, kann ein Fach­ mann durch Vorversuche an Hand der hier erteilten Lehre leicht bestimmen.

Im Anschluß an die Pasteurisierung kann man die Mischung aus Polyol, Citrationen und Proteinzusammen­ setzung zur Entfernung des ganzen oder eines Teils des Polyols und der Citrationen behandeln. Um dies zu erzielen, kann man übliche Methoden anwenden. Man kann beispielsweise die Mischung unter Verwendung von geeigneten semipermeablen Membranen dialysieren oder diafiltrieren. Dem Fachmann bieten sich weitere Methoden zur Entfernung des Polyols und der Citrat­ ionen an.

Die pasteurisierte Mischung kann in bekannter Weise zur Entfernung des Wassers behandelt werden. Beispiels­ weise kann man die Mischung gefriertrocknen oder ultra­ filtrieren und dann gefriertrocknen. Weiterhin kann man die Mischung in üblicher Weise vor der Entfernung des Wassers steril filtrieren.

Die erfindungsgemäßen pasteurisierten Proteinzusam­ mensetzungen können zu pharmazeutischen Zubereitungen für die therapeutische Anwendung formuliert werden. Zur Herstellung von intravenösen Verabreichungen wird die Proteinzusammensetzung gewöhnlich in Wasser, ent­ haltend physiologische Substanzen, wie Natriumchlorid, Glyzin und dergleichen und die auf einen pH, der mit den physiologischen Bedingungen verträglich ist, ge­ puffert wurde, gelöst. Im allgemeinen sind Richtlinien für intravenös zu verabreichende Proteinzusammenset­ zungen durch Regierungsverordnungen festgelegt.

Der Ausdruck "Polyol" bedeutet eine Substanz mit mehr als einer Hydroxylgruppe (-OH) und schließt mehr­ wertige Alkohole und Kohlenhydrate, wie Zucker, ein. Vorzugsweise soll das Polyol wassermischbar, beim Infusieren physiologisch annehmbar, physikalisch mit dem Protein verträglich und von niedrigem Mole­ kulargewicht sein, d. h. ein Molekulargewicht von we­ niger als etwa 5000 haben. Höhermolekulargewichtige Polyole, z. B. Polysaccharide, wie Dextrin, Stärke, Glykogen, Zellulose, Pentosane, Pektin, Hemizellulose und dergleichen, werden bei der vorliegenden Methode nicht bevorzugt, weil sie im allgemeinen wasserunmisch­ bar sind und nur schwer aus den Proteinzusammenset­ zungen nach Beendigung der Pasteurisierung entfernt werden können.

Typische Beispiele für bei den Verfahren verwendbare Zucker sind Mono-, Di- und Trisaccharide, wie Arabinose, Glukose, Galaktose, Fruktose, Ribose, Mannose, Rhamnose, Saccharose, Maltose, Raffinose, Melezitose und der­ gleichen. Beispiele für mehrwertige Alkohole oder re­ duzierte Zucker schließen Erythrit, Ribit, Sylit, Sorbit, Mannit etc. ein.

Ebenso sind in die Erfindung Mischungen von Polyolen sowie Substanzen, die in Gegenwart von Wasser oder Wärme Polyole ergeben, wie Hydrate, Actonide und dergleichen, eingeschlossen.

Als Quelle für Citrationen kann man Natriumcitrat, Kaliumcitrat und dergleichen verwenden.

Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Pasteuri­ sierung ist es vorteilhaft, wenn die Ionenstärke der Pasteurisierungsmischung physiologisch verträg­ lich ist, d. h. etwa 0,05 bis 0,2 beträgt. Hierzu kann man ein Salz, wie Natriumchlorid oder dergleichen, aus der Pasteurisierungsmischung zufügen oder ent­ fernen, um die gewünschte Ionenstärke zu erreichen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zusammen mit anderen Methoden zum Inaktivieren von Hepatitis- Viren angewendet werden, z. B. indem man Proteinzu­ sammensetzungen in Gegenwart von anderen Stabilisa­ toren, wie Aminosäuren, pasteurisiert oder indem man Proteinzusammensetzungen in Gegenwart von Substan­ zen, von denen bekannt ist, daß sie Hepatitis-Viren töten, erwärmt.

Als Aminosäure kann man Lysin, Arginin, Leucin, Iso­ leucin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Trypto­ phan, Valin, Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin­ säure, Glyzin, Histidin, Prolin, Serin, Tyrosin und dergleichen verwenden. Substanzen, welche die vorerwähn­ ten Aminosäuren ergeben, z. B. Aminosäuresalze und dergleichen, können ebenfalls verwendet werden. Da­ bei ist darauf hinzuweisen, daß Aminosäuren in Ab­ wesenheit eines Polyols keine wirksamen pasteuri­ sierungsstabilisierenden Mittel für Faktor IX-Konzen­ trate sind.

Wie vorerwähnt, kann man die pasteurisierten erfin­ dungsgemäßen, Faktor IX-Konzentrate enthaltenden Zusammensetzungen zu pharmazeutischen Zubereitungen, die für therapeutische Anwendungen verwendet werden, verarbeiten. Der Begriff "pharmazeutische Zubereitung" wird hier jedoch in einem breiten Sinn verstanden und schließt Zubereitungen, die Proteinzusammensetzungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren pasteuri­ siert wurden und die nicht nur für therapeutische Zwecke, sondern auch als Reagenzien in bekannter Weise verwendet werden, ein, sowie solche Zubereitungen, die für Gewebekulturen verwendet werden, bei denen Orga­ nismen, wie Viren, für die Herstellung von Impfstoffen, Interferon und dergleichen auf Plasma oder Plasma­ fraktionen, z. B. Cohn Effluent II + III, Cohn Fraktion IV, Con Fraktion V und dergleichen gezüchtet werden.

Für alle der obigen Anwendungen ist es vorteilhaft, daß die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten Proteinzusammensetzungen frei von infektiöser Hepatitis sind. Die für therapeutische Verwendungen bestimmten pharmazeutischen Zubereitungen sollen eine therapeu­ tische Menge der pasteurisierten Proteinzusammenset­ zung enthalten, d. h. eine Menge die ausreicht für eine vorbeugende oder heilende Behandlung. Wird die phar­ mazeutische Zusammensetzung als Reagenz verwendet, dann soll sie Reagenzmengen der pasteurisierten Pro­ teinzusammensetzung enthalten. Wendet man sie für Gewebekulturen oder ein Kulturmedium an, dann sollen die pasteurisierten Proteinzusammensetzungen eine Menge der Proteinzusammensetzung enthalten, die aus­ reicht, um das gewünschte Wachstum zu erzielen. Es ist selbstverständlich, daß die in erfindungsgemäßer Weise pasteurisierten Proteinzusammensetzungen keine infektiösen Mengen an Viren und anderen Organismen, die unter den Pasteurisierungsbedingungen inaktiviert werden, enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden beschreiben­ den Beispielen weiter erläutert.

Beispiele Assaymethoden Faktor II und VII

Faktor II und Faktor VII wurden nach der Methode von Owren, beschrieben in Scand. J. Clin. and Lab. Investigation, Bd. 1, Seite 81 (1949) untersucht.

Faktor X und Xa

Faktor X und Faktor Xa wurden nach der Methode von Bachmen et al, beschrieben in Thromb. Diath. Haemorrh., Bd. 2, Seite 24 (1958) untersucht.

Thrombin

Das angewendete Assayverfahren wird von Fenton II et al, in Thrombosis Res., Bd. 4, Seiten 809 bis 817 (1974) beschrieben.

Faktor IX und VIII

Es wurden Modifizierungen der von Langdell et al (partielle Thromboplastinzeit- Technik), J. Lab. Clin. Med., Bd. 41, Seiten 637 bis 647 (1953) und von Proctor et al (Kaolingerringszeit- Methode), Amer. J. Clin. Path., Bd. 36, Seite 212 (1961) angewendet. Plättchenfaktor 3 wurde mittels einer Cephalinsuspension zur Verfügung gestellt. Maximale Oberflächenkontaktaktivierung wurde mittels Celite®- Pulver erzielt. Alle anderen Gerinnungsfaktoren (außer Faktor IX und Faktor VIII) wurden aus einem Substrat erhalten, welches Plasma von einem Pa­ tienten mit einem erheblichen Mangel an Faktor IX oder Faktor VIII, vermischt mit bariumsulfatabsorbier­ ten Rinderplasma, enthielt. Eine quantitative Bestim­ mung einer unbekannten Probe wird durchgeführt, in­ dem man deren Gerinnungszeit im Versuch mit einer sol­ chen verglich, die durch Verdünnung eines normalen Standards erhalten worden war.

Das genaue Assayverfahren ist das gleiche, sowohl für Faktor IX als auch für Faktor VIII, mit der Ausnahme, daß der Aktivator im Faktor IX-Assay ein Platelin®- Plus-Aktivator ist, an Stelle des automatisierten APTT- Reagenz.

Nicht-aktivierte partielle Thromboplastinzeit (NAPTT)

Eine 0,1 ml-Probe von NAPTT-Substratplasma (auf Eis gelagert), eine 0,1 ml-Probe von partiellem Thrombo­ plastin ohne Aktivator (auf Eis gelagert) und 0,1 ml der zu untersuchenden Probe (in verschiedenen Verdün­ nungen) wurden in ein 10 × 75 mm-Polystyrol-Reagenzglas gegeben, sorgfältig durch Schütteln vermischt und in ein 37°C Wasserbad unter gleichzeitigem Start einer Stoppuhr gegeben. Nach genau 1 Minute wurden 0,1 ml 0,025 M CaCl₂ von 37°C unter gleichzeitigem Starten des Zeitnehmers zugeführt und der Inhalt des Reagenz­ glases wurde durch sorgfältiges Schütteln vermischt. Anschließend wurde das Reagenzglas 30 Sekunden bis 1 Minute, je nach der Art der Probe, ungeschüttelt gehalten. Es wurde dann von Zeit zu Zeit schräg ge­ stellt, bis die Gelierung begann oder bis eine Gerin­ nung festzustellen war, wobei man darauf achtete, das Aussetzen gegenüber Raumtemperatur, die unterhalb 37°C lag, zu minimieren. Die Zeit bis zum Auftreten der ersten Gerinnungsbildung wurde aufgezeichnet. Eine Opazität und Gelierung lief dem Auftreten einer ein­ deutigen Gerinnung voraus.

Wurde die Probe durch einen Trispuffer ersetzt, so erhielt man die NAPTT-Zeit für den Nullversuch. Be­ trug die Nullversuchszeit mehr als 300 Sekunden, so wurde das Assay fortgeführt. Jedes Substratplasma, das eine Nullversuchszeit von weniger als 300 Sekunden ergab, war für diesen Versuch ungeeignet.

Durch Messen der NAPTT-Zeiten in einem großen Ver­ dünnungsbereich und Auftragen der Zeiten in Sekunden auf der Ordinate und der Konzentrationen auf der Abs­ zisse wurde eine geradlinige Beziehung erhalten. Bei den meisten Prothrombin-Komplex(Faktor IX)Konzentraten wurde eine Inhibierungswirkung bei niedrigen Verdün­ nungen festgestellt. Deshalb wurde eine geradlinige Beziehung bei 1 : 100 oder größeren Verdünnungen fest­ gestellt. Unter Verwendung eines geeigneten Standards, wie Faktor IX-1 (FN-1) vom Bureau of Biologics und indem man 100 Einheiten/ml für diesen Standard einsetzte, war es möglich, eine Standardkurve aufzu­ stellen. Von dieser Standardkurve wurden die NAPTT- Zeiten für eine gegebene Probe abgelesen und als Ein­ heiten ausgedrückt. Längere NAPTT-Zeiten (in der Nähe der Nullversuchszeit), ausgedrückt als niedrige NAPTT-Einheiten/ml, zeigen eine verminderte Thrombo­ genizität an.

Beispiel 1

Effluent I (3000 l) wurde mit 30 kg DEAE-Sephadex-Gel in Berührung gebracht und während etwa 1 Stunde bei 1 bis 3°C vermischt. Die Mischung wurde filtriert, wo­ bei man 30 kg Gel erhielt. 2 kg davon wurden nach­ einander mit 10 l 0,2 M Ammoniumbikarbonat, 10 l 0,3 M Ammoniumbikarbonat und 6 l 0,2 M Natriumchlorid­ puffer gewaschen. Dann wurde mit 4 l 0,55 M Natrium­ chlorid eluiert unter Erhalt einer Proteinlösung mit A₂₈₀ = 10,12.

Die Ionenstärke des Eluats wurde durch Zugabe von 3 Teilen Wasser für Injektionszwecke um das 4fache vermindert. Die Lösung wurde auf ein A₂₈₀ von 12 ultrafiltriert und nach Zugabe von Citrat in einer Menge von 0,5 M wurde der pH auf 6,5 eingestellt und Saccharose in einer Menge von 1,2 g/ml zugegeben. Die Mischung wurde während 6 oder 10 Stunden auf 60°C erwärmt und nach dem Abkühlen mit einem gleichen Volumen 0,09 M NaCl und 0,01 M Natriumcitrat bei pH 7,4 und 5°C vereint. Diese Mischung wurde gegen mindestens 3 Volumina 0,09 M NaCl, 0,01 M Natriumcitrat, pH 7,4-Puffer, diafiltriert. Dann wurde die Lösung auf eine Endstärke von annähernd 25 bis 30 Einheiten an Faktor IX pro ml ultrafiltriert und der pH wurde auf 6,9 ± 0,5 eingestellt.

Tabelle 1

Beispiel 2

Effluent I (1500 l) wurde mit 15 kg DEAE-Sephadex-Gel in Berührung gebracht und während 1 Stunde bei 1 bis 3°C vermischt. Die Mischung wurde filtriert, wobei man 50 kg eines Gels erhielt, das hintereinander mit 50 l 0,2 M Ammoniumbikarbonat, und 50 l 0,3 M Ammoniumbi­ karbonat gewaschen wurde. Der Faktor IX-Komplex wurde mit 0,75 M Ammoniumbikarbonat eluiert, bis der A₂₈₀ des Eluats allmählich auf 3,5 abfiel. Ammoniumbikarbo­ nat in dem Eluat wurde durch Diafiltration gegen NLT 5 Volumina von 0,09 M NaCl, 0,01 M Na-Citrat, pH 7,4, entfernt. Zu der Lösung (A₂₈₀ = 13) wurde Natrium­ citrat bis zu einer Menge von 0,5 M, pH eingestellt auf 6,5, und Saccharose bis zu einer Menge von 1,2 g/ml gegeben. Die Lösung wurde dann weiter wie in Beispiel 1 verarbeitet und die Ergebnisse werden nachfolgend gezeigt.

Tabelle 2

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde bis zur Stufe der Pasteurisierung bei 60°C während 10 Stunden wieder­ holt. Nach dem Pasteurisieren wurde die Lösung mit 2 Teilen Wasser für Injektionszwecke verdünnt und der pH wurde auf 7,1 eingestellt. Die Mischung wurde auf eine zuvor mit 0,14 M NaCl und 0,005 M Phosphatpuffer, pH 7,1, ins Gleichgewicht gebrachte DEAE-Sepharosesäule aufgebracht. Der adsorbierte Faktor IX-Komplex wurde mit einem NaCl-Gradienten, 0,14 M bis 0,44 M, eluiert. Die Faktor IX-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben. Die spezifischen Aktivitäten der Fak­ toren II, VII, IX und X betrugen 2,5, <0,1, 1,3 bzw. 2,5.

Claims (16)

1. Verfahren zum Pasteurisieren einer Koagulations­ faktoren II, VII, IX und X enthaltenden Zusammen­ setzung durch Erhitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zusammensetzung mit einem Polyol und einer Quelle für Citrationen vermischt, um das Protein während der Pasteurisierung zu stabilisieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 1000 Teile an Polyol, bezogen auf 1 Teil Gesamtprotein, zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß man 0,1 bis 1,0 Mol an Citrationen pro Liter der Zusammensetzung zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Zusammensetzung mit einer wäßrigen Lösung vermischt, in welcher 20% bis zur Sättigungs­ konzentration des Polyols enthalten sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeich­ net, daß das Polyol ein Kohlehydrat oder ein Zucker­ alkohol ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Zusammensetzung etwa 1 bis 10 Stun­ den auf eine Temperatur von etwa 60 bis 100°C erwärmt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeich­ net, daß man nach der Pasteurisierung das Polyol und die Citrationen aus der Mischung entfernt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polyol und die Citrationen entfernt, indem man die Mischung einer Diafiltration unterwirft.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polyol und die Citrationen entfernt, indem man die Mischung einer Dialyse oder einer Ionenaus­ tauschchromatografie unterwirft.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man weiterhin eine Sterilfiltration vornimmt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeich­ net, daß man in einem weiteren Schritt das Wasser aus der Zusammensetzung entfernt.

12. Pasteurisierte Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, ent­ haltend Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X.

13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Koagulationsfaktoren etwa 1 bis 20 Gew.-% der Zusammensetzung ausmachen.

14. Gefriergetrocknete Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 12 und 13.

15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen frei von infektiöser Hepatitis ist.

16. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine Zusammenset­ zung gemäß Anspruch 12 bis 15.