DE4416166C2

DE4416166C2 - Stabiles Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen

Info

Publication number: DE4416166C2
Application number: DE4416166A
Authority: DE
Inventors: Johann Eibl; Hans Peter Schwarz; Juergen Siekmann; Peter Turecek
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 1997-11-20
Anticipated expiration: 2014-05-07
Also published as: DE4416166A1; JPH07304658A; EP0680764A2; CA2148746A1; EP0680764A3; US5698677A; ATA76995A; NO951761D0; NO951761L; FI952169A0; FI952169L; JP3051650B2; FI952169A7

Description

Die Erfindung betrifft ein stabiles virussicheres Präparat, welches ein gerinnungsaktives Protein enthält, wobei das Präparat einem Verfahren zur Virusinaktivierung unterworfen worden ist.

Das Präparat ist zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen geeignet. Ebenso sind auch gerinnungs aktive Proteine bzw. Polypeptide mit antigener Determinante möglich. Ein immunologisch wirksames Protein hat vor allem als Impfstoff eine Bedeutung. Daneben werden als Protein auch diverse Enzyme bzw. Enzyminhibitoren verstanden, sowie andere pharmakologisch wirksame Proteine.

Gerinnungsstörungen von Blut treten auf, wenn beispielsweise die Gerinnungszeit durch das Fehlen einer Gerinnungskomponente vom Normalwert abweicht. Die Störungen können sowohl angeboren als auch durch Krankheitszustände erworben sein.

Hämophilie A ist eine der am häufigsten auftretenden angeborenen Gerinnungsstörungen. Patienten mit Hämophilie A neigen aufgrund eines Mangels an Faktor VIII zu häufigen Blutungen, die mit Faktor VIII-Konzentraten behandelt werden können. Bei etwa 15% der Patienten kommt es aber zum Auftreten von Faktor VIII neutralisierenden Antikörpern, sogenannte Inhibitoren, wodurch eine Therapie mit Faktor VIII-Konzentraten kaum mehr möglich ist.

Zur Behandlung von Hämophilie A Inhibitor Patienten haben sich komplexe Gemische von Gerinnungsfaktoren bewährt. Der aktivierte Prothrombinkomplex FEIBA® weist eine "factor eight inhibitor bypassing activity" auf.

Anstelle von Faktor VIII-Konzentraten wurde auch versucht, Hämophilie A mit einer Mischung aus Gerinnungsfaktor Xa und Phospholipiden zu behandeln. In der US 4 610 880 ist die Behandlung von hämophilen Hunden mit einer Mischung von Faktor Xa und Phospholipidvesikeln beschrieben. Diese Mischung war nicht stabil, weshalb eine Faktor Xa-haltige Lösung und eine Suspension aus Phospholipidvesikeln unmittelbar vor Verwendung frisch vermischt werden mußten. Es wird betont, daß das Mischungsverhältnis so gewählt werden muß, daß zwar die Hämostase erreicht wird, aber Thrombosen nicht hervorgerufen werden.

Es ist bekannt, daß Phospholipidvesikel in Kombination mit Faktor Xa die Thrombosegefahr erhöhen. In Blood 59, 401-407 (1982) ist anhand eines in vivo Stasis-Modells mit Kaninchen die erhöhte Thrombogenität von Faktor Xa beschrieben, wenn dieser gemeinsam mit synthetischen Phospholipiden (Phosphatidylcholin-Phosphatidylserin Lipidvesikel, PCPS-Vesikel) getestet wurde. Die Thrombosegefahr nach Verabreichung von Prothrombinkomplexkonzentraten wird ebenfalls der Kombination von gerinnungsaktiven Phospholipiden und aktivierten Gerinnungsfaktoren zugeschrieben.

Aus der US 4 348 384 ist bekannt, die Gerinnungsfaktoren Faktor VIII oder Faktor IX in Liposomen zu inkorporieren. Damit wird ein oral oder intestinal verabreichbares Präparat zur Behandlung von Hämophilie A oder B zur Verfügung gestellt. Die Liposomen haben hier eine Größe von 1 µm und schützen den Faktor VIII oder Faktor IX vor einer vorzeitigen Verdauung. Die Verabreichung dieser Präparate birgt keine Thrombosegefahr, weil sie nicht intravenös erfolgt.

Die Instabilität von aktivierten Gerinnungsfaktoren bei der Lagerung ist bekannt. Aus Thrombosis Research 22, 213-220 (1981) ist ein Verfahren bekannt, welches den Erhalt einer möglichst stabilen beta-Faktor Xa-Präparation erlaubt. Nach diesem Verfahren wird beta-Faktor Xa in 50% Glyzerin bei pH 7,2 in 0,03 mol/l Imidazolpuffer gekühlt gelagert. Jedoch tritt auch bei diesem Verfahren selbst bei 4°C eine weitere Umwandlung zu inaktiven Fragmenten auf. In ähnlicher Weise wird auch in J. Biol. Chem. 248, 7729-7741 (1973) die Instabilität von Faktor Xa in an sich stabilisierenden Glyzerin-Wasser-Gemischen beschrieben.

Zur Inaktivierung der zu injizierenden Präparate und potentiell vorhandenen Viren werden verschiedene Sterilisationsverfahren verwendet.

Im Medline Abstract mit der Nummer 94229366 werden Schwierigkeiten bei der Virusinaktivierung von Präparaten, die Gerinnungsfaktoren enthalten, genannt. Aus diesem Kurzreferat geht hervor, daß ein Bedarf an stabilen, virussicheren Präparaten besteht.

Zum Thema Liposomen wurde von Riaz et al. offenbart, daß hohe Temperaturen Liposomen beträchtlich beeinträchtigen können und es zu nicht umkehrbaren Störungen der Membranen führen kann ("Pharmaceutical dosage forms: disperse Systems" Kapitel 16, Nr. 2, 1988, Verleger: Liebermann et al.).

Die Erfindung stellt sich zur Aufgabe, ein stabiles Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, enthaltend ein gerinnungsaktives Protein, zur Verfügung zu stellen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein stabiles Präparat bereitzustellen, das ein Protein enthält und einer Behandlung zur Inaktivierung potentiell vorhandener Viren unterworfen worden ist.

Die vorstehend genannten Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch ein stabiles virussicheres Präparat, enthaltend ein gerinnungsaktives Protein, das in bzw. an Lipid-Vesikel gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat zur Inaktivierung von potentiell vorhandenen Viren behandelt worden ist. Es hat sich gezeigt, daß durch die Assoziation eines aktivierten Gerinnungsfaktors, wie Faktor Xa an ein Phospholipid in vesikulärer Form, also durch die Bindung in und an einem Lipidvesikel, die Stabilität eines aktivierten Gerinnungsfaktors in unerwarteter Weise erhöht wird. Damit wird nicht nur eine außerordentlich gute Lagerstabilität in Lösung oder gefrorener bzw. lyophilisierter Form erreicht. Es kann sogar gezeigt werden, daß ein aktivierter Gerinnungsfaktor vor physikalischer Inaktivierung, wie z. B. bei Lyophilisierung oder bei einer Behandlung zur Virusinaktivierung, geschützt wird. Auch wird die in vivo-Aktivität des aktivierten Gerinnungsfaktors erfindungsgemäß erhalten, was ebenso ein Maß für die Stabilität des erfindungsgemäßen Präparates ist.

Durch die unerwartet hohe Stabilität der erfindungsgemäßen Präparate ist es möglich, ein Protein, beispielsweise einen Blutfaktor der intrinsischen bzw. extrinsischen Gerinnung und/oder einen Cofaktor und/oder einen Inhibitor der Blutgerinnung und/oder ein gerinnungsaktives Lipoprotein, wie z. B. Lp(a), oder ein Antigen, insbesondere ein virales Antigen, in der in oder an Lipidvesikel gebundenen Form einer Behandlung zur Virusinaktivierung, vorzugsweise einer chemischen und/oder physikalischen Behandlung und insbesondere einer Hitzebehandlung, zu unterwerfen. Dabei bleibt die biologische Aktivität bzw. Antigenität weitgehend erhalten.

Ein erfindungsgemäßes Präparat gilt also dann als stabil, wenn durch Maßnahmen, wie der Lyophilisierung und Rekonstitution in Abwesenheit üblicher Stabilisatoren in ungepufferter Lösung, die Aktivität des Proteins noch zu mehr als 40%, vorzugsweise mehr als 50% erhalten bleibt, bzw. wenn durch die Lagerung einer wässerigen Lösung des Präparates in Abwesenheit üblicher Stabilisatoren bei 22°C nach 20 Stunden mehr als 40% der Aktivität des Proteins erhalten bleibt, vorzugsweise mehr als 50%, am meisten bevorzugt mehr als 60%.

Der Ausdruck "gerinnungsaktives Protein" umfaßt erfindungsgemäß einen aktivierten oder nicht aktivierten Blutfaktor der intrinsischen bzw. extrinsischen Gerinnung, einen Cofaktor der Blutgerinnung, einen Inhibitor der Blutgerinnung und ein gerinnungsaktives Lipoprotein, wie z. B. Lp(a), sowie Kombinationen davon.

Der Vorteil eines Antigens in einem erfindungsgemäßen Präparat liegt vor allem darin, daß gleichzeitig mit einer erhöhten Stabilität des Präparates die Lipidkomponente eine Adjuvanswirkung aufweist. Dadurch eignet sich das erfindungsgemäße Präparat insbesondere als Impfstoff. Das Antigen ist beispielsweise ein Protein bzw. Polypeptid, das rekombinant hergestellt ist. In Abhängigkeit von der Art der Zellkultur kann dabei eine Kontamination mit infektiösen Agenzien erfolgen. Durch das erfindungsgemäße Präparat, welches als sicher gegenüber einer Übertragung infektiöser Agenzien gilt, wird jedoch eine Infektion effektiv vermieden.

Bedingt durch die außerordentlich hohe Stabilität, die auch in vivo nach Infusion des erfindungsgemäßen Präparates bewiesen wurde, eignet sich das Präparat hervorragend zur Behandlung von Patienten, insbesondere zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen.

Aufgrund seiner Struktur, die durch eine Protein- und eine Lipidkomponente charakterisiert ist, eignet sich erfindungsgemäß ein Komplex aus einer thrombozytären gerinnungsaktiven Substanz, also beispielsweise ein Blutgerinnungsfaktor, der natürlicherweise in Thrombozyten vorkommt, alleine oder in Kombination mit weiteren gerinnungsaktiven Substanzen und einem Lipidvesikel als Thrombozytenersatz und damit zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, die mit einem Mangel an aktivierten Thrombozyten in Zusammenhang gebracht werden. Einerseits imitiert der erfindungsgemäße Komplex die Form eines Blutplättchens, andererseits können funktionelle Ähnlichkeiten festgestellt werden, wie z. B. Aggregationsfähigkeit in einer Proteinlösung oder in Gegenwart von Calciumionen oder die Adsorption an Strukturprotein vom Kollagentyp. Das erfindungsgemäße Präparat kann daher Thrombozytenfunktionen erfüllen.

Ein in vitro Test zur Bestimmung der Gerinnungszeit von Hämophilie-A-Inhibitor-Plasma dient zur Beurteilung der Effektivität des erfindungsgemäßen Präparates zur Behandlung von Hämophilie-A-Inhibitor-Patienten. Ein wirksames Präparat verkürzt die Gerinnungszeit auf mindestens 50% und vorzugsweise auf mindestens die Gerinnungszeit von Normalplasma.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß durch die Assoziation von Gerinnungsfaktor Xa und Phospholipidvesikeln die Herstellung eines Präparates mit guter Lagerstabilität und einer hohen Halbwertszeit in einem Faktor VIII-Inhibitorplasma möglich ist. Das erfindungsgemäße Präparat wird vorzugsweise in lyophilisierter Form gelagert. Das lyophilisierte Präparat kann zu einer Lösung rekonstituiert werden, die den Komplex in vesikulärer Struktur enthält. Ein Zusatz von Kohlenhydraten, wie Mono- oder Disaccharide, etwa in einer Menge von 3-20% (w/w), ist vorteilhaft. Die Stabilität des erfindungsgemäßen Komplexes ist in Gegenwart von geringen Mengen an Calciumionen noch erhöht. Es hat sich weiters gezeigt, daß der Komplex aus Gerinnungsfaktoren und Lipidvesikeln im pharmazeutischen Präparationen zur Behandlung von Gerinnungsstörungen nicht thrombogen ist.

Das erfindungsgemäße Präparat enthält vorzugsweise als aktive Komponente ein Vitamin K-abhängiges Protein, beispielsweise einen Faktor ausgewählt aus der Gruppe der Faktoren IIa, VIIa, IXa und Xa, vorzugsweise Xa beta. Weiters können zusätzliche Proteine enthalten sein, wie z. B. die Faktoren II, VII, IX, X, Protein C, aktiviertes Protein C, Protein S und Protein Z. Es hat sich herausgestellt, daß die Kombination von Faktor Xa mit mindestens einem der genannten Proteine besonders effektiv ist. Ein zusätzlicher Gehalt an Faktor VIII, aktiviertem Faktor VIII, und/oder vWF, Faktor V und/oder aktivierter Faktor V ist vorteilhaft. Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Präparates enthält einen Komplex aus einem aktivierten Blutgerinnungsfaktor und Lipidvesikel und zusätzlich Gewebefaktor oder Fragmente vom Gewebefaktor.

Die im Komplex enthaltenden Proteine sind vorzugsweise human und aus einer Plasmafraktion isoliert oder rekombinanten Ursprungs. Aufgrund einer potentiellen Infektiosität ist eine Behandlung zur Inaktivierung infektiöser Agentien, wie z. B. Viren oder Prionen, angebracht. Es empfiehlt sich, eine Hitzebehandlung der Substanzen oder des Komplexes aus den Proteinen und Lipidvesikel vorzunehmen. Die Behandlung kann beispielsweise gemäß der EP 0 159 311 erfolgen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Komplex aus einem hochgereinigten Faktor Xa (mindestens 100 E/mg Protein), der durch eine Behandlung zur Virusinaktivierung frei von infektiösen Agenzien ist, mit Phospholipidvesikel zur Verfügung gestellt.

Das Präparat ist aufgrund seiner Stabilität ohne weiteres, d. h. ohne Zusatz der üblicherweise verwendeten Stabilisatoren, wie Kohlenhydrate (Saccharose) oder Proteaseinhibitoren (Aprotinin) als Flüssigpräparat zur Verfügung zu stellen.

Daneben kann das Präparat jedoch auch in flüssig tiefgefrorener Form oder in lyophilisierter Form gelagert werden, wobei beim Wasserentzug ein Polysaccharid-Gehalt vorteilhaft ist.

Als Lipid-Vesikel können erfindungsgemäß Phospholipide in vesikulärer Form verwendet werden. Die Phospholipide können synthetischen oder natürlichen Ursprungs sein. Dabei ist eine standardisierte Mischung von chemisch reinen Phospholipiden vorteilhaft.

Die Lipid-Vesikel lassen sich auf verschiedene Art und Weise wie durch Sonifizierung von Phospholipid-Dispersionen (Barenholz et al., Biochemistry 16, 2806-2810, 1977), der Reversed-Phase-Evaporation Technik (F. Szoka et D. Paphadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4194-4198, 1978), der Ethanol-Injektions-Methode (S. Batzri et E.D. Korn, Biochim. Biophys. Acta 298, 1015-1019, 1973) oder auch der Entfernung von Detergenzien aus gemischten Micellen durch Dialyseverfahren (O. Zumbuehl et H.G. Weder, Biochim. Biophys. Acta 640, 252-262, 1981) darstellen. Darüber hinaus kann auch das Extrusionsverfahren nach Olson et al. (Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979) verwendet werden. Eine Dispersion multilamellarer Vesikel wird durch Hydratisierung eines Lipid-Filmes, der sich vorzugsweise durch Evaporation von Lösungen der Lipide in organischen Lösungsmitteln mit Hilfe eines Rotationsverdampfers gewinnen läßt, hergestellt. Diese Dispersion wird anschließend wiederholt durch zwei übereinander gelegte Polycarbonat-Filter mit Stickstoff-Druck gepreßt.

Bei diesem Verfahren sollte bei einer Temperatur gearbeitet werden, bei der sich die Phospholipide im flüssig kristallinen Zustand befinden (mindestens 5°C, vorzugsweise mindestens 10°C, über der Phasenübergangstemperatur T_M). Gegebenenfalls ist vor der Extrusion ein mehrmaliger Einfrier/Auftau-Zyklus einzuführen (M.J. Hope et al., Biochim. Biophys. Acta, 812, 55-65, 1985). Darüber hinaus hat sich eine Ausführungsform als besonders vorteilhaft erwiesen. Hier wird die Dispersion multilamellarer Vesikel, hergestellt wie oben skizziert, lyophilisiert und mit Wasser wieder rekonstituiert. Dadurch läßt sich die anschließende Extrusion besonders leicht und auch mit sehr hohen Lipidkonzentrationen (z.Bsp. 100 mg Lipid/ml) einfach durchführen.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Komplexes läßt sich der beschriebene Lyophilisationsschritt nach Mischung der Vesikel-Dispersion mit dem Protein, hier vorzugsweise Gerinnungsfaktor Xa, durchführen. Nach Rekonstitution kann der erfindungsgemäße Komplex weiters extrudiert werden. Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung des erfindungsgemäßen Komplexes ist die Mischung der Komponenten in Gegenwart eines Tensides und die anschließende Entfernung des Tensides, beispielsweise durch Dialyse. Besonders vorteilhaft ist auch eine direkte Hydratisierung des Lipid-Filmes mit einer Lösung des Proteins, wobei gegebenenfalls vorher lyophilisiert und wieder rekonstituiert werden kann, wodurch die Extrusion erleichtert wird. Gegebenenfalls kann in letzterer Variante auf den zusätzlichen Lyophilisationsschritt verzichtet werden. Denkbar ist auch eine direkte Mischung der fertigen Vesikel mit dem Protein, vorzugsweise in Anwesenheit von geladenen Teilchen oder unter Bedingungen, die die Inkorporation des Proteins in und an die Lipid-Vesikel erlauben (Konzentration, Auswahl von Proteinen mit hydrophoben Eigenschaften, etc.).

Für den Extrusionsprozeß können besonders Filter mit einem Durchmesser von ca. 30 bis 1000 nm zur Anwendung kommen. Die typische Größe der Lipidvesikel (bestimmt durch die Methode der dynamischen Lichtstreuung) liegt in der Größenordnung von 30 bis 900 nm, bevorzugt 100 bis 500 nm.

Die Stabilität des hergestellten Komplexes ist verbessert, wenn geladene Teilchen, beispielsweise Calciumionen, vorzugsweise 1-10 mmol/l vorhanden sind. Aufgrund der Bindung der Gerinnungsproteine in und an die Lipid-Vesikel ist eine Reinigung und Isolierung des Komplexes per se möglich. Dieses kann durch Gelfiltration oder Ultrazentrifugation erfolgen.

Zu den geeigneten Phospholipiden zählen die Glycerophospholipide Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Phosphatidylglycerol, Diphosphatidylglycerol (Cardiolipin) und auch Phosphatidylethanolamin, die eine negative Ladung ausbilden können und vorzugsweise allein oder auch kombiniert in einer Mischung mit neutralen Phospholipiden wie Phosphatidylcholin und Sphingomyelin verwendet werden, wobei die Bindung durch Zusatz von Calciumionen begünstigt ist. Als anionische Komponente ist auch die Verwendung anderer Lipide wie zum Beispiel Sulfatide, oder auch Dicetylphosphat, Phosphatidylmethanol, Phosphatidyl-β- Lactate und Ölsäure möglich. Denkbar ist aber auch die ausschließliche Verwendung neutraler Phospholipide wie Phosphatidylcholin oder Sphingomyelin. Verwendbar sind jedoch auch durch chemische Modifizierung erhaltene Substanzen wie die Lipidderivate des Polyethylenglykols oder Substanzen aus den Klassen der Lysophospholipide oder der Glykolipide. Denkbar ist auch der Einsatz von Lipiden, die eine positive Ladung ausbilden können wie beispielsweise Stearylamin, Dimethyl dioctadecylammoniumbromid (DDAB) oder auch kationische Lipide vom Typ der 1,2-Diacyl-3-Trimethylammonium-Propane (TAP) oder der 1,2-Diacyl-3-Dimethylammonium-Propane (DAP).

Eine bevorzugte Ausführungsform beinhaltet die Verwendung von Lipiden mit antiviraler Wirkung, beispielsweise Alkylphospholipide (vgl. EP 0506704 B1).

Zur Stabilisierung können die Phospholipid-Vesikel bis zu 80 Mol% Cholesterin als zusätzliche Komponente enthalten. Es ist zu betonen, daß alle aufgeführten Lipide auch als alleinige Komponente, gegebenenfalls auch unter Zusatz von Cholesterin, verwendet werden können.

Die Lipid-Vesikel können sich zur Ausbildung der Komplexe im Gelzustand oder im flüssig-kristallinen Zustand befinden, jedoch ist die Verwendung von Systemen im flüssig-kristallinen Zustand günstiger. In einer Variante der Erfindung werden Lipid-Vesikel bestehend aus 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und 1-Palmitoyl-2- Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoserin verwendet (z.Bsp. in einem Verhältnis von PC/PS = 80/20 (w/w), s. 1), die bei Raumtemperatur flüssig-kristallin sind. Die Verwendung von Phospholipiden mit ungesättigten Seitenketten kann aber zu einer reduzierten Stabilität aufgrund von Oxidation führen. Für die chemische Stabilität der Vesikel ist daher die Verwendung von Lipiden mit Fettsäureresten wie die der Myristinsäure, Palmitinsäure (siehe 2 und 3) oder Stearinsäure vorzuziehen, die sich jedoch normalerweise im Gelzustand befinden. Die Verwendung dieser Lipide hat sich jedoch in Mischungen mit Cholesterin als besonders vorteilhaft erwiesen.

Die topische Applikation eines Komplexes aus gerinnungsaktivem Protein und Phospholipid-Vesikel stellt ein weiteres Anwendungsgebiet dar. So ist die topische Anwendung von Thrombin seit langem bekannt (Tidrick et al. 1943, Surgery 14, 191-196). Zum anderen kommt dem topischen Gebrauch von Liposomen eine zunehmende Bedeutung zu (Weiner, N. et al. 1994, J. of Drug Targeting 2, 405-410), wobei durchaus auch Systeme multilamellarer Vesikel, die normalerweise einen Durchmesser von mehr als 1000 nm bis zu 100 µm aufweisen, zur Anwendung kommen können. Durch eine liposomale Formulierung des Thrombins wird das Eindringen des aktivierten Gerinnungsfaktors in die Haut erleichtert. Denkbar ist eine Applikation in Lösung, Suspension, in Form einer Salbe oder als Wundauflage. Das Präparat kann zur Inaktivierung von Viren, beispielsweise gemäß der EP 159 311 behandelt werden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele noch näher erläutert.

Es wird nun die Herstellung von Phospolipid-Vesikeln beschrieben.

1. Herstellung von multilamellaren Vesikeln
In einem 100 ml-Kolben wurden 40,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholin und 10,0 mg 1-Palmitoyl-2-Oleoyl- sn-Glycero-3-Phosphoserin in 5 ml Chloroform gelöst und mit Hilfe eines Rotationsverdampfers unter reduziertem Druck und einer Temperatur von 30°C eingeengt. Nach vollständiger Entfernung des Lösungsmittels wurde noch über 30 min bei 30 mbar im Vakuum gehalten und über einen Zeitraum von sechs Stunden im Hochvakuum bei 0,1 mbar nachgetrocknet. Der Phospholipidfilm wurde anschließend durch Zugabe von 5 ml Puffer (20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, pH 7,4) und leichtem Schütteln über eine Stunde bei Raumtemperatur hydratisiert.

2. Nach Ausbildung einer Dispersion multilamellarer Vesikel gemäß 1 wurde diese 10 mal mit N₂-Druck durch zwei übereinandergelegte 100 nm Polycarbonatfilter extrudiert (10 ml-Thermobarrel-Extruder). Die Bestimmung der Partikelgröße der so hergestellten Vesikel mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung ergab einen mittleren Durchmesser von ca. 100 nm.

3. Aus 35,0 mg 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und 15,0 mg 1,2-Dimyristoyl- sn-Glycero-3-Phosphoserin in 5 ml Chloroform/Methanol-Gemisch (2 : 1, v/v) wurde wie in 1 beschrieben ein Phospholipidfilm hergestellt. Nach Zugabe von 5 ml Puffer (20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, pH 7,4) wurde der Film bei 50°C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers hydratisiert und bei 50°C wie unter 2 beschrieben extrudiert.

4. Aus einer Mischung von 35,0 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero- 3-Phosphocholin und 15,0 mg 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoserin wurden wie in 3 beschrieben Phospholipid-Ve sikel hergestellt. Die Hydratation des Filmes und die Extrusion erfolgte ebenfalls bei 50°C.

5. Aus einer Mischung von 40,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin und 10,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero- 3-Phosphoglycerin oder 17,5 mg Cardiolipin aus Rinderherz wurden wie unter 1 und 2 beschrieben Phospholipid-Vesikel hergestellt.

6. Aus einer Mischung von 40,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin und 10,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphat wurden wie unter 1 und 2 beschrieben Phospholipid-Vesikel hergestellt.

7. Aus einer Mischung von 35,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin, 10,0 mg 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3- Phosphoserin und 5 mg Phosphatidylinosit aus Sojabohnen wurden wie unter 1 und 2 beschrieben Phospholipid-Vesikel hergestellt.

8. Den unter 1 bis 7 beschriebenen Mischungen von Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidsäure bzw. Phosphatidylinosit wurden 5 bis 80 Mol% Cholesterin zugesetzt und wie unter den jeweiligen Punkten beschrieben extrudiert.

9. Nach Hydratisierung des Phospholipidfilmes wurden die Dispersionen aus 1-8 schockgefroren (flüssiges N₂) und bei 37°C (2, 5-8), bzw. 50°C (3 und 4) aufgetaut. Dieser Vorgang wurde vier mal wiederholt. Die so hergestellten multilamellaren Vesikel wurden, wie in den jeweiligen Punkten beschrieben, extrudiert. Die daraus resultierende Vesikelpräparation wies einen mittleren Durchmesser von 100 nm auf.

10. Wie in 1-9 beschrieben, wurden multilamellare Vesikel durch Hydratation von Phospholipid- Filmen hergestellt. Die so gewonnenen Dispersionen wurden bei -80°C eingefroren und lyophilisiert. Nach Rekonstitution der Lyophilisate mit dem entsprechenden Volumen H₂O wurde wie unter den jeweiligen Punkten beschrieben extrudiert.

11. Die Herstellung von Phospholipid-Vesikel nach 1-10 wurde in 150 mmol/l NaCl-Lösung statt mit Tris-Puffer durchgeführt. Die Größenbestimmung der Vesikel mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung ergab nahezu idente Größenverteilungen im Vergleich zu Vesikel, die mit gepufferter Lösung hergestellt wurden.

12. In einem 50 ml-Rundkolben wurde eine Mischung aus 8,0 mg Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin, 2,0 mg Phosphatidylinosit aus Sojabohnen und 10,0 mg Natriumcholat gegeben und in 10 ml einer Chloroform/Methanol-Mischung (1 : 1, v/v) gelöst. Dann wurde am Rotationsverdampfer bei einer Badtemperatur von 20°C unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingeengt, in 10 ml absolutem Methanol aufgenommen und wieder eingeengt. Der so hergestellte Film wurde unter Schütteln mit 2 ml Puffer (20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, pH 7,4) aufgenommen. Zur Herstellung der Vesikel wurde die klare Lösung anschließend 24 h gegen den gleichen Puffer bei 4°C dialysiert. Die Bestimmung der Partikelgröße mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung ergab einen mittleren Durchmesser von ca. 70 nm.

13. Lyophilisierung von Phospholipid-Vesikel in Gegenwart von Saccharose
Den entsprechend unter 1-12 hergestellten Vesikel wurde Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 3-20% (w/v) zugesetzt. Anschließend wurde bei -80°C eingefroren und lyophilisiert. Nach Rekonstitution des Lyophilisates ergab die Bestimmung der Größe mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung einen mittleren Durchmesser von ca. 100 nm. Die elektronenmikroskopische Untersuchung dieser Lösung ergab nach Visualisierung mit der Negative-Staining Methode eine Größenverteilung von ca. 80 bis 130 nm.

14. Herstellung eines Komplexes aus Faktor Xa und Phospholipid vesikel
Colyophilisierung
Faktor Xa wurde folgendermaßen hergestellt:
Eine Lösung des Prothrombinkomplexpräparates (entsprechend 50 000 E Faktor X/l), hergestellt nach der Methode von Brummelhuis (Methods of Plasma Protein Fractionation, J.M.Curling (Hrsg.), S. 117 ff, Acad. Press., 1980) und hitzebehandelt nach dem Verfahren der EP 0 159 311, wurde in Gegenwart von 12% (v/v) Tween®80 eine Stunde bei pH 7,0 und Raumtemperatur behandelt. Anschließend wurde verdünnt, mit Trinatrium-Citrat-Dihydrat (7,0 g/l) versetzt und durch Zusatz von 400 ml 1 mol/l Bariumchloridlösung die Proteine des Prothrombinkomplexes bei pH 7,0 ausgefällt. Das Präzipitat wurde gewaschen und in einer 25%igen (w/v) Ammoniumsulfatlösung, enthaltend 50 mmol/l Benzamidin-HCl resuspendiert. Die ungelösten Bestandteile wurden abgetrennt und die Lösung mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht, um die Proteine wieder zu fällen. Der Niederschlag wurde in Puffer gelöst und chromatographisch über Sephadex®-G25 gegen 25 mmol/l Trinatrium-Citrat-Puffer, enthaltend 100 mmol/l NaCl und 1 mmol/l Benzamidin-HCl, pH 6,0, umgepuffert.

Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden mittels einer DEAE-Sepharose®-Fast-Flow-Säule weiter gereinigt. Durch Erhöhung der Natriumchloridkonzentration im Citratpuffer (25 mmol/l, pH 6,0) wurde Faktor X getrennt von den anderen Prothrombinkomplexproteinen eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde gegen 20 mmol/l Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mmol/l Natriumchlorid und 2 mmol/l Calciumchlorid (pH 7,4) umgepuffert. Anschließend wurde mit 0,14 mg RVV (Russel′s viper venom, eine Protease aus Vipera russellii) (pro 100 E FX versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der generierte Faktor Xa wurde dann chromatographisch mit einer Benzamidin-Sepharose®-Säule gereinigt und durch Ammoniumsulfatfällung ankonzentriert und anschließend zur Entfernung der Salze über Sephadex®- G25 chromatographiert. Die hergestellte Faktor Xa-Präparation wies eine spezifische Aktivität von mindestens 100 E Faktor Xa/mg Protein auf.

Zur Herstellung des Komplexes wurde zur Faktor Xa-Fraktion eine nach 1-12 hergestellte Vesikelpräparation mit oder ohne 2,5 mmol/l Calciumchlorid gemischt. Diese Lösung wurde lyophilisiert.

Nach Rekonstitution wurde die Wirksamkeit des Präparates im FEIBA-Test (Testbeschreibung siehe AT 350 726) getestet. Im Vergleich dazu wurde die FEIB-Aktivität des nicht komplexierten Faktor Xa bestimmt. Vor der Lyophilisierung betrug in beiden Fällen die FEIB-Aktivität 1700 E/ml. Nach der Lyophilisierung und Rekonstitution wurden im Fall des Faktor Xa/PCPS-Komplexes 1650 E/ml wiedergefunden. Der Verlust an FEIB-Aktivität war im Fall von nicht komplexiertem Faktor Xa viel größer. Es wurden lediglich 1220 E/ml wiedergefunden.

15. Extrusion eines Colyophilisates
Ein gemäß 14 hergestelltes Colyophilisat bestehend aus 1000 E Faktor Xa sowie 50,0 mg einer gemäß 6 hergestellten Phospholipidpräparation aus 40,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und 10,0 mg 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphat wurde mit Wasser im Originalvolumen aufgenommen und bei einer Temperatur von 20°C zweimal durch zwei übereinandergelegte 400 nm Polycarbonatfilter extrudiert (10 ml-Thermobarrel-Extruder). Die Bestimmung der Partikelgröße mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (Malvern Zetasizer 4) ergab einen mittleren Durchmesser von ca. 450 nm.

16. Coextrusion
Wie unter 1 beschrieben wurde aus einer Phospholipidmischung ein Film hergestellt. Dieser wurde mit einer Faktor Xa-haltigen Lösung aus 14 mit oder ohne 2,5 mmol/l Calciumchlorid hydratisiert. Nach Hydratisierung des Filmes wurde wie in 2, 9 und 10 verfahren und extrudiert. Dadurch wurde Faktor Xa mit Phospholipid-Vesikel komplexiert. Dem so hergestellten Komplex konnte Saccharose in einer Konzentration von 3 - 20% (w/v) zugesetzt werden, um anschließend zu lyophilisieren.

Herstellung eines Komplexes aus aktiviertem Protein C, Faktor Xa und Phospholipid vesikel Beispiel 1

Aus einer Phospholipidmischung wurde wie unter 1 beschrieben ein Film hergestellt. Dieser wurde mit der Faktor Xa-haltigen Fraktion aus 14, sowie mit aktiviertem Protein C in einem 20 mmol/l Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mmol/l NaCl und 5 mmol/l CaCl₂, pH 7,4 hydratisiert. Die Mischung, enthaltend 10 E FXa/ml, 10 E APC/ml und 10 mg Phospholipid/ml, wurde lyophilisiert.

Reinigung des Komplexes aus Faktor Xa und PCPS-Vesikel Beispiel 2

Eine Präparation, enthaltend Faktor Xa und PCPS-Vesikel, wurde nach der in 14 oder 16 beschriebenen Methode hergestellt, wobei der Faktor Xa-Phospholipidpräparation Saccharose in einer Endkonzentration von 5% (w/v) zugesetzt worden war. Das Lyophilisat wurde in Wasser so gelöst, daß die fertige Lösung 2,4 E Faktor Xa/ml und 1 mg/ml PCPS-Vesikel enthielt. Eine mit Superose®6 HR 10/30 gepackte Säule wurde mit einem Puffer (20 mmol/l Tris-HCl, enthaltend 150 mmol/l NaCl, 0,1% Albumin, 0,01% Tween 20, 1 mmol/l CaCl₂, pH 7,4) äquilibriert. 500 µl der PCPS-Vesikel und Faktor Xa enthaltenden Präparation wurden mit einer Flußrate von 0,4 ml/Minute über die Säule chromatographiert.

Im Eluatstrom wurde die UV-Absorption bei 254 nm gemessen. Die Fraktion des Ausschlußvolumens, enthaltend einen Komplex von PCPS-Vesikel und Faktor Xa wurde gesammelt.

Beispiel 3

Ein nach 14 hergestelltes Lyophilisat wurde mit Wasser rekonstituiert, so daß die fertige Lösung 5 E Faktor Xa und 5 mg PCPS pro ml enthielt. 0,5 ml dieser Lösung wurden mit 1 ml einer 30%-igen (w/v) Ficoll 400-Lö sung in 150 mmol/l Natriumchloridlösung) versetzt. Diese Mischung wurde in ein Ultrazentrifugationsröhrchen gebracht und mit 3 ml 10%-iger Ficoll-Lösung überschichtet. Schließlich wurde mit 150 mmol/l NaCl-Lösung überschichtet und anschließend im Ausschwingrotor für 30 min bei 100 000 g und Raumtemperatur zentrifugiert.

Die den gereinigten Faktor Xa/PCPS-Komplex enthaltende Schicht mit geringerer Dichte als die wässerige Lösung konnte als Überstand abgetrennt werden.

Beispiel 4

Ein Komplex bestehend aus aktiviertem Protein C, Faktor Xa und Phospholipid-Vesikel wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt. Der lyophilisierte Komplex wurde mit Wasser rekonstituiert und durch Ultrafiltration über Filtereinheiten, Ausschlußgrenze 100 000 Dalton (Polysulfon-Membranen) durch Zentrifugation 30 min bei 4000 U/min auf ein Drittel des Ausgangsvolumens eingeengt. Das so gewonnene Retentat enthielt den gereinigten Komplex aus aktiviertem Protein C, Faktor Xa und Phospholipid-Vesikel.

Stabilität des Komplexes aus Protein und Phospholipid vesikel Beispiel 5 Stabilität eines Faktor Xa/PCPS-Vesikelkomplexes bei der Lyophilisierung

PCPS-Vesikel wurden wie in 1 und 2 beschrieben hergestellt. Diese wurden anschließend mit Faktor Xa, der wie in 14 beschrieben hergestellt wurde, versetzt, so daß die Präparation 0,5 mg Phospholipidvesikel pro ml und 47 E Faktor Xa in einer wäßrigen Lösung von 150 mmol/l NaCl und 5 mmol/l CaCl₂ enthielt. Der Komplex wurde lyophilisiert. Als Vergleich dazu wurde Faktor Xa in derselben Konzentration allerdings ohne PCPS-Vesikel lyophilisiert. Anschließend wurde die Faktor Xa-Aktivität gemäß DE 43 25 871 C1 in den lyophilisierten Präparationen nach Rekonstitution mit destilliertem Wasser im Ausgangsvolumen bestimmt und mit dem Faktor Xa-Gehalt vor der Lyophilisierung verglichen (s. Tabelle).

Die Tabelle zeigt den stabilisierenden Einfluß von vesikulärem Phospholipid auf Faktor Xa in der Copräparation.

Beispiel 6 Stabilität eines Faktor Xa/PCPS-Vesikelkomplexes in Lösung

Ein Komplex aus PCPS-Vesikel und Faktor Xa wurde wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt und lyophilisiert. Nach dem Rekonstituieren wurde die Lösung bei 22°C über 20 h gelagert. Anschließend wurde die Aktivität von Faktor Xa bestimmt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Stabilität von Faktor Xa im PCPS-Vesikelkomplex im Vergleich zu nicht komplexiertem Faktor Xa.

Beispiel 7 Stabilität eines Protein C/Faktor Xa/PCPS-Vesikelkomplexes bei der Lyophilisierung

Ein Komplex, bestehend aus Protein C, Faktor Xa und PCPS-Vesikel, wurde analog zu Beispiel 1 hergestellt und lyophilisiert. Die Präparation enthielt 0,5 mg Phospholipid-Vesikel/ml, 10 E Protein C/ml und 47 E Faktor Xa/ml in einer wäßrigen Lösung von 150 mmol/l NaCl. Als Vergleich dazu wurden Protein C und Faktor Xa in denselben Konzentrationen allerdings ohne PCPS-Vesikel lyophilisiert. Anschließend wurde die Faktor Xa-Aktivität, wie in Beispiel 5, und die Protein C-Aktivität in einem chromogenen Test in den lyophilisierten Präparationen nach Rekonstitution mit destilliertem Wasser im Ausgangsvolumen bestimmt und mit dem jeweiligen Gehalt an Faktor Xa und Protein C vor der Lyophilisierung verglichen (s. Tabelle).

Die Tabelle zeigt den stabilisierenden Einfluß von Phospholipid-Vesikel auf Protein C und Faktor Xa im Komplex.

Beispiel 8 Stabilität eines Protein C/FXa/PCPS-Vesikelkomplexes in Lösung

Ein Komplex aus Protein C, Faktor Xa und PCPS-Vesikel wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt und lyophilisiert. Nach dem Rekonstituieren wurde die Lösung bei 22°C über 20 h gelagert. Anschließend wurden die Aktivitäten von Protein C und Faktor Xa bestimmt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhöhte Stabilität von Protein C und Faktor Xa im PCPS-Vesikelkomplex im Vergleich zu den nicht-komplexierten Faktoren.

In vitro Charakterisierung der Protein/Phospholipid-Komplexe Beispiel 9

Zur Testung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Präparation wurde das folgende Testsystem verwendet.

100 µl FVIII-Inhibitorplasma (45 Bethesda Einheiten/ml) wurden in einem Coagulometerröhrchen mit 100 µl 20 mmol/l Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mmol/l NaCl, pH 7,4 (TBS), gemischt und mit weiteren 100 µl einer 0,025 mol/l Calciumchloridlösung recalcifiziert. Unmittelbar nach Zusatz der zu analysierenden Probe (100 µl) wurde die Gerinnungszeit des Gemisches in einem Häkchencoagulometer nach Schnitger/Gross bei 37°C bestimmt.

Wenn im dargestellten Testansatz als Probe reiner TBS-Puffer eingesetzt wurde, betrug die Gerinnungszeit 820 s. Im Vergleich dazu betrug die Gerinnungszeit von Normalplasma in diesem Testsystem etwa 350 s.

Eine Präparation, hergestellt nach 16, wurde in einer Konzentration von 0,88 mE Faktor Xa und 0,3 µg Phospholipid/ml getestet. Als Zusatz wurden entweder 0,1 E FEIBA, hergestellt nach dem Verfahren der AT 368 883 B oder 0,1 E rekombinanter Faktor VIIa getestet. Ebenso wurde eine Mischung der FEIBA-Präparation (0,01; 0,1; 1,0 E/ml) oder von Faktor X (0,01; 0,1; 1,0 E/ml), hergestellt nach dem Verfahren aus 14, mit 0,3 µg/ml Phospholipid-Vesikel, hergestellt nach dem Verfahren aus 1 und 2, getestet. Der Einfluß der getesteten Substanzen auf die Gerinnungszeit ist in der folgenden Tabelle angegeben.

Biologische in vitro-Aktivität verschiedener Phospholipid- Vesikeltypen Beispiel 10

Phospholipid-Vesikel bestehend aus Mischungen verschiedener Phospholipidtypen in unterschiedlicher Zusammensetzung wurden wie in den Beispielen beschrieben hergestellt, und zu Copräparationen mit FXa verarbeitet. Der daraus resultierende FXa-Phospholipid-Vesikel-Komplex wurde, wie in Beispiel 9 beschrieben, auf den gerinnungsverkürzenden Effekt von FVIII-Inhibitorplasma untersucht. Die Resultate (Gerinnungszeiten) sind nachfolgender Tabelle zu entnehmen:

Legende: DOPC = 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin
POPS = 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3- Phosphoserin
CHOL = Cholesterin
CLP = Diphosphatidylglycerin (Cardiolipin)
PI = Phosphatidylinosit
DMPC = 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin
DMPS = 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3- Phosphoserin
DPPC = 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin
DOPG = 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphoglycerin
DOPA = 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphorsäure

Beispiel 11

Die Wirksamkeit eines nach 14 hergestellten Komplexes mit 20 mE Faktor Xa und 4,96 µg PCPS/ml, und verschiedenen Verdünnungen davon, in Faktor VIII-Inhibitor Plasma wurde sofort nach dem Zusammenmischen und nach einer Stunde Inkubation bei 37°C im folgenden Gerinnungstest bestimmt:
200 µl Probe wurden in einem Coagulometerröhrchen mit 100 µl 20 mmol/l Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mmol/l NaCl, pH 7,4 (TBS), gemischt und mit weiteren 100 µl einer 0,025 mol/l Calciumchloridlösung recalcifiziert. Unmittelbar nach Zusatz dieser Lösung wurde die Gerinnungszeit des Gemisches in einem Häkchencoagulometer nach Schnitger/Gross bei 37°C bestimmt.

Wenn im dargestellten Testansatz als Probe eine 1+1 Mischung von FVIII-Inhibitorplasma (45 Bethesda Einheiten/ml) und TBS-Puffer eingesetzt wurde, betrug die Gerinnungszeit mehr als 500 s.

Als Vergleich wurde reiner Faktor Xa, hergestellt nach dem Verfahren aus 14, getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.

Gerinnungszeit von Faktor Xa/PCPS und Faktor Xa vor und nach Inkubation mit Faktor VIII-Inhibitor Plasma.

Der erfindungsgemäße Komplex von Faktor Xa/PCPS weist eine höhere Stabilität auf als nicht-komplexierter Faktor Xa. Faktor Xa/PCPS führt auch in niedrigen Konzentrationen zu einer Verkürzung der Gerinnungszeit nach einstündiger Inkubation in Faktor VIII-Inhibitor Plasma, während nicht- komplexierter Faktor Xa seine gerinnungszeitverkürzende Aktivität bereits verloren hat.

In vivo Charakterisierung der Protein/Phospholipidkomplexe Beispiel 12 Test auf Thrombogenität

Eine FEIBA-Präparation, hergestellt nach dem Verfahren der AT 368 883, wurde als Komplex mit PCPS-Vesikel und in nicht-komplexierter Form im Wessler-Stase-Modell auf seine Thrombogenität getestet. Die PCPS-Vesikel wurden nach dem Verfahren aus 1 und 2 hergestellt, wobei durch eine entsprechende Filterwahl Vesikel der mittleren Größe von 100 nm bzw. 50 nm gewonnen wurden. Zum Einsatz kamen 4 E FEIBA und 60 µg PCPS pro kg Kaninchen. Die Thrombogenität der FEIBA-Präparation wurde durch die Komplexbildung mit PCPS-Vesikel nicht erhöht. In allen Fällen wurde im Stase- Modell keine Thrombenbildung registriert (Score = 0-1)

Beispiel 13 Test der Wirkung auf die Blutungszeit

Die in vivo-Aktivität des Faktor Xa/Phospholipidvesikelkomplexes wurde an Kaninchen untersucht, deren FVIII-abhängige Gerinnung durch Gabe eines hochtitrigen, humanen Faktor VIII-Inhibitorplasmas für die Versuchsdauer reduziert war, um so die Gerinnungssituation eines Haemophilie A-Inhibitorpatienten zu simulieren.

Ca. 2 kg schwere, weiße Neuseelandkaninchen wurden narkotisiert. Nach Eintritt der Narkose wurde die Vena femoralis rechts präpariert und ein permanenter venöser Zugang geschaffen. Durch diesen wurden 0,5 ml/kg Körpergewicht (KG) eines humanen Faktor VIII-Inhibitorplasmas (1500 Bethesda E/ml) über 10 Minuten infundiert. 90 min nach Abschluß der Infusion wurde die Krallenblutungszeit bestimmt. Dazu wurde mittels eines Dog Nail Trimmers eine Kralle nach der Methode von Giles, A.R. et al., Blood 60: 727-730 (1982) geschnitten und so eine arterielle Nagelblutung zugefügt. Das austretende Blut wurde in 2-Minuten-Intervallen mittels Pipetman P5000 Schutzfiltern quantitativ über 30 min jeweils so aufgefangen, daß kein Kontakt zwischen Wunde und Filterpapier bestand. Die blutgetränkten Filterpapiere wurden anschließend mit 5 ml 0,04%iger Ammoniaklösung 5 h bei Raumtemperatur und anschließend 10 min im Ultraschallbad extrahiert. Die so gewonnenen Lösungen wurden 1 : 10 mit 0,04%iger Ammoniaklösung verdünnt und anschließend bei 416 nm spektrophotometrisch gemessen (Leerwertblutung).

Anschließend wurden 30 ml einer Lösung enthaltend Faktor Xa/PCPS-Vesikelkomplex mit einer Infusionsgeschwindigkeit von 1 ml/min kontinuierlich infundiert, so daß eine Dosierung von 0,0079 mg PCPS-Vesikel/kg KG und 0,93 E FXa/kg KG erzielt wurde.

30 min nach Ende der Substanzinfusion wurde erneut ein Krallenschnitt durchgeführt und der Blutungsverlauf ebenso bestimmt. Nach Beendigung der Meßintervalle (30 min) wurden die Wunden zur Stillung der Blutung verödet. Das Experiment wurde an je 6 Kaninchen durchgeführt. Als Kontrolle wurde Faktor Xa in einer Dosierung von 0,93 E FXa/kg KG in gleicher Weise infundiert und die Blutungscharakteristik bestimmt.

Das Ergebnis ist der Abbildung zu entnehmen.

Abb.: Blutungsverlauf von Faktor VIII-Inhibitor-Kaninchen nach Gabe von Faktor Xa/PCPS-Vesikelkomplex und Faktor Xa.

Es zeigt sich, daß der Komplex aus Faktor Xa und PCPS-Vesikel zu einer deutlichen Reduktion der Blutung des Faktor VIII-Inhibitorkaninchens führt, während Faktor Xa alleine keinen entsprechenden Effekt aufweist.

Hitzebehandlung der Protein/Phospholipid-Vesikelkomplexe Beispiel 14 Hitzebehandlung eines Komplexes aus Faktor Xa und PCPS-Vesikel

Ein gemäß 14 oder 16 hergestelltes Lyophilisat aus Faktor Xa und PCPS wurde nach dem Verfahren der EP 159 311 10 h bei 60°C und 1 h bei 80°C behandelt. Die Faktor Xa-Aktivität der rekonstituierten Lösung betrug mehr als 90% der Aktivität vor der Hitzebehandlung. Mit Hilfe der Methode der dynamischen Lichtstreuung konnte der Erhalt der vesikulären Struktur nachgewiesen werden.

Beispiel 15 Hitzebehandlung eines Komplexes aus FEIBA und PCPS-Vesikel

Ein Komplex aus Phospholipid-Vesikel und FEIBA wurde analog 14 hergestellt und lyophilisiert. Nach Rekonstitution enthielt das Lyophilisat 30 E FEIBA/ml und 3,4 mg PCPS/ml in einem Puffer aus 4 g Na₃Citrat · 2H₂O/l und 8 g NaCl/l, pH 7,0. Ein dieser Zusammensetzung entsprechendes Lyophilisat wurde nach dem Verfahren der EP 159 311 10 h bei 60°C und 1 h bei 80°C behandelt. Die FEIBA-Aktivität in der rekonstituierten Lösung nach Hitzebehandlung betrug mehr als 90% der Aktivität vor der Hitzebehandlung. Mit Hilfe der Methode der dynamischen Lichtstreuung (Malvern Zetasizer 4) konnte der Erhalt der vesikulären Struktur nachgewiesen werden.

Beispiel 16 Thrombin/Phospholipid-Vesikel zur topischen Anwendung

Zur Herstellung eines Thrombin/Phospholipid-Vesikel Komplexes für die topische Anwendung wurden in einen 100-ml Rundkolben 250 mg einer Phospholipid-Mischung bestehend aus 50 Mol% 1,2- Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 20 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoglycerol sowie 30 Mol% Cholesterin in 10 ml Chloroform/Methanol- Mischung (2 : 1/v : v) gelöst. Daraus wurde mit Hilfe eines Rotationsverdampfers durch Verdampfen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck und einer Temperatur von T = 37°C ein Phospholipid-Film hergestellt, der anschließend mit 10 ml TBS-Puffer (20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, pH 7,4) bei 50°C hydratisiert wurde. Diese Lösung wurde bei -80°C eingefroren und lyophilisiert. Nach Rekonstitution des Lyophilisates mit 10 ml H₂O wurde 10 mal durch zwei übereinandergelegte Polycarbonat- Filter (Porendurchmesser 100 nm) bei einer Temperatur von 50°C extrudiert (50 ml-Thermobarrel-Extruder). Die Bestimmung der Größe der so hergestellten Vesikel mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (Zetasizer 4) ergab einen Durchmesser von 100 nm. Die Vesikel wurden mit TBS-Puffer auf eine Konzentration von 5 mg/ml verdünnt, daraus eine 1 : 1-Mischung (v : v) mit einer Lösung von bovinem Thrombin (Pentex®) in TBS-Puffer (1000 E Thrombin/ml) hergestellt, bei -80°C eingefroren und lyophilisiert. Nach der Lyophilisation und Rekonstitution mit dem entsprechenden Volumen H₂O wurden für die Vesikel mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung eine Größe von 3100 nm bestimmt. Anschließend wurde zwei mal durch zwei übereinandergelegte 400 nm-Filter extrudiert. Nach der Extrusion konnte für die Vesikel eine Größe von 260 nm bestimmt werden (Malvern Zetasizer 4). Zur Abtrennung von freiem Thrombin wurde bei 35 000 g zentrifugiert, der Überstand abgetrennt und der Niederschlag mit TBS-Puffer resuspendiert. Die Zentrifugation wurde noch zweimal wiederholt.

Der so hergestellte Thrombin/Phospholipid-Vesikel Komplex wurde mit Hilfe eines chromogenen Substrattests (Substrat Th-1) sowie mit Hilfe der Methode der Thrombinzeit in einem Normalplasma (Jürgens, J. 1952, Dtsch. Arch. klin. Med. 200, 67) charakterisiert. So konnte für den frisch hergestellten Komplex eine Thrombinaktivität von 1,0 IE/ml (chromogenes Substrat) bestimmt werden. Der Einsatz dieser Probe in ein Testsystem zur Bestimmung der Thrombinzeit in einem Normalplasma führte zu keiner beschleunigten Clotbildung im Vergleich zu einer Pufferkontrolle. Nach Zerstörung der Vesikelstruktur durch Detergenzbehandlung (Probe mit 5% Triton-X 100 über 20 min bei 37°C inkubieren) wurde die Gesamtmenge des gebundenen Thrombins bestimmt. So konnten im chromogenen Substrattest 35 IE Thrombin/ml, mit Hilfe der Thrombinzeit 30 IE/ml nachgewiesen werden.

Die Thrombin-Vesikel Präparation wurde mit Saccharose bis zu einer Konzentration von 5% (w/v) versetzt, bei -80°C eingefroren und lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wurde gemäß dem Verfahren der EP 159 311 über 10 Stunden bei 60°C und 1 Stunde bei 80°C behandelt. Der Gesamtmenge des Thrombins der rekonstituierten Lösung betrug mehr als 90% der Aktivität vor der Hitzebehandlung. Mit Hilfe der Methode der dynamischen Lichtstreuung konnte der Erhalt der vesikulären Struktur nachgewiesen werden.

Claims

1. Stabiles virussicheres Präparat, enthaltend ein gerinnungsaktives Protein, das in bzw. an Lipid-Vesikel gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat zur Inaktivierung von potentiell vorhandenen Viren behandelt worden ist.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat durch physikalische Maßnahmen behandelt ist.

3. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat durch chemische und physikalische Maßnahmen behandelt ist.

4. Präparat nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat hitzebehandelt ist.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß ein Blutfaktor der intrinsischen oder extrinsischen Gerinnung enthalten ist.

6. Präparat nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß ein Blutgerinnungsfaktor oder Co-Faktor in aktivierter Form enthalten ist.

7. Präparat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem aktivierten Gerinnungsfaktor um ein Vitamin K-abhängiges Protein handelt.

8. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der aktivierte Gerinnungsfaktor aus der Gruppe der Faktoren IIa, VIIa, IXa und Xa ausgewählt ist.

9. Präparat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Faktor Xabeta enthalten ist.

10. Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Protein aus der Gruppe Faktor II, VII, IX, X, Protein C, aktiviertes Protein C, Protein S und Protein Z enthalten ist.

11. Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Gewebefaktor oder ein Fragment von einem Gewebefaktor enthalten ist.

12. Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Faktor VIII, aktivierter Faktor VIII und/oder von Willebrand-Faktor enthalten ist.

13. Präparat nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Faktor V und/oder aktivierter Faktor V enthalten ist.

14. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein um ein Enzym und/oder Inhibitor der Blutgerinnung enthalten ist.

15. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein um ein gerinnungsaktives Lipoprotein enthalten ist.

16. Präparat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Lipoprotein um Lipoprotein (a) handelt.

17. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein um ein Antigen der Blutgerinnung handelt.

18. Präparat nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat als intravenöses Präparat formuliert ist.

19. Präparat nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipid-Vesikel eine nach der Methode der dynamischen Lichtstreuung bestimmte Größe im Bereich von 30 bis 900 nm, bevorzugt 100 bis 500 nm, aufweisen.

20. Präparat nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es keine üblichen Stabilisatoren, wie Kohlenhydrate oder Proteaseinhibitoren, enthält.

21. Präparat nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in flüssig-gefrorener oder lyophilisierter Form vorliegt.

22. Präparat nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Abwesenheit üblicher Stabilisatoren in wäßriger Lösung bei 22°C nach 20 h mehr als 50% der ursprünglichen Aktivität erhalten sind.

23. Verfahren zur Herstellung eines Präparates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß ein Lyophilisationsschritt nach Mischung einer Vesikel-Dispersion mit dem Protein durchgeführt wird und daß das Verfahren eine Stufe umfaßt, in der das in bzw. an Lipid-Vesikel gebundene Protein einer Behandlung zur Virusinaktivierung unterworfen wird.

24. Verfahren zur Herstellung eines Präparates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine direkte Hydratisierung eines Lipid-Filmes mit einer Lösung des Proteins erfolgt und daß das Verfahren eine Stufe umfaßt, in der das in bzw. an Lipid-Vesikel gebundene Protein einer Behandlung zur Virusinaktivierung unterworfen wird.

25. Verfahren zur Herstellung eines Präparates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß fertige Vesikel direkt mit dem Protein gemischt werden, um eine Inkorporation des Proteins in und an die Lipid-Vesikel zu erlauben, und daß das Verfahren eine Stufe umfaßt, in der das in bzw. an Lipid-Vesikel gebundene Protein einer Behandlung zur Virusinaktivierung unterworfen wird.