DE3751218T2 - Verfahren und therapeutische Zubereitungen für die Behandlung von Gerinnungsstörungen. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Blutungs- bzw. Gerinnungsstörungen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Gewebefaktorprotein, um bei bestimmten klinischen Symptomen und insbesondere in Tieren, denen bestimmte Koagulationsproteine fehlen, Hämostaste zu bewirken. Mangel an Faktor VIII und Faktor IX sind zwei Beispiele.
• Das Bluten ist eines der schwerwiegendsten und deutlichsten Erscheinungsbilder der Krankheit. Es kann lokal oder generalisiert (diffus) auftreten. Das Bluten, das mit einer lokalen Läsion in Zusammenhang steht, kann einem normalen oder gestörten hämostatischen Mechanismus überlagert sein. Die normale Hämostase umfaßt Mechanismen, die unmittelbar nach einer Verletzung zum Tragen kommen, und jene, die über längere Zeiträume wirken. Die primäre Hämostase besteht hauptsächlich aus zwei Komponenten: Gefäßverengung und Plättchenpropfenbildung. Der Aufrechterhaltungsmechanismus besteht aus dem Fibringerinnsel, das durch das Koagulationssystem gebildet wird. Die Plättchenpropfenbildung ist besonders wichtig bei kapillarer Hämostase, während die Gefäßverengung und Fibrinklumpenbildung bei der Hämostase größerer Gefäße wichtiger ist. Im Mikrokreislauf besteht die Hämostase aus der Gefäßverengung und der Plättchenpropfenbildung. Die Plättchenpropfenbildung kann in verschiedene Stufen eingeteilt werden: das Anhaften der Plättchen an den durch die Verletzung freigelegten subendothelialen Oberflächen; die Plättchenaktivierungs- Freisetzungsreaktion; die Plättchenaggregation, die zur Sequesterbildung zusätzlicher Plättchen an dieser Stelle führt, und das Binden von Fibrinogen und der Koagulationsproteine an die Plättchenoberfläche, wobei dies die Thrombinbildung umfaßt; sowie die Fusion, die die Koaleszenz von Fibrin und der verschmolzenen Plättchen zur Bildung eines stabilen hämostatischen Propfens ist.
• Die Blutkoagulation erfüllt zwei Funktionen: die Bildung von Thrombin, das die Plättchenaggregation induziert und die Bildung von Fibrin, das den Plättchenpropfen stabil macht. Einige diskrete Proenzyme und Procofaktoren, die man als "Koagulationsfaktoren" bezeichnet, sind am Koagulationsprozeß beteiligt. Der Prozeß besteht aus mehreren Stufen und endet mit der Fibrinbildung. Fibrinogen wird durch Einwirkung von Thrombin zu Fibrin umgewandelt. Thrombin enteht durch das proteolytische Spalten eines Proenzyms, nämlich Prothrombin. Diese Proteolyse wird durch den aktivierten Faktor X bewirkt (als Faktor Xa bezeichnet), der an die Oberfläche aktivierter Plättchen bindet und in Gegenwart von Va und ionischem Kalzium Prothrombin spaltet.
• Die Aktivierung von Faktor X kann auf einem von zwei getrennten Wegen erfolgen, auf extrinsischem oder intrinsischem Wege (Fig.1). Die intrinsische Kaskade besteht aus einer Reihe von Reaktionen, worin ein Proteinvorläufer zur Bildung von aktiver Protease gespalten wird. Bei jedem Schritt katalysiert die neu gebildete Protease die Aktivierung der Vorläuferprotease im anschließenden Schritt der Kaskade. Ein Mangel an irgendeinem Protein auf diesem Weg blockiert den Aktivierungsprozeß in diesem Schritt, wodurch die Klumpenbildung verhindert wird und typischerweise eine Blutungsneigung entsteht. Ein Mangel an Faktor VIII oder Faktor IX beispielsweise verursacht die schweren Blutungssyndrome Hämophilie A bzw. B. Auf dem extrinsischen Weg der Blutkoagulation wird Gewebefaktor, den man auch als Gewebe- Thromboplastin bezeichnet, aus beschädigten Zellen freigesetzt und aktiviert Faktor X in Gegenwart von Faktor VII und Kalzium. Obwohl die Aktivierung von Faktor X ursprünglich als die einzige durch Gewebefaktor und Faktor VII katalysierte Reaktion galt, ist heute bekannt, daß eine Verstärkungsschleife zwischen Faktor X, Faktor VII und Faktor IX besteht (Osterud, B., und S.I. Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5260- 5264, 1977; Zur, M. et al., Blood 52:198, 1978). Jede der Serinproteasen in diesem Schema kann durch Proteolyse die anderen beiden in die aktivierte Form umwandeln, wodurch das Signal in diesem Stadium des Koagulationsprozesses verstärkt wird (Fig.2). Man ist heute der Ansicht, daß der extrinsische Weg der physiologische Hauptweg der normalen Blutkoagulation ist (Haemostasis 13: 150-155, 1983). Da Gewebefaktor normalerweise nicht im Blut vorhanden ist, zeigt das System keine kontinuierliche Klumpenbildung; der Koagulationsauslöser wäre demnach die Freisetzung von Gewebefaktor aus beschädigtem Gewebe.
• Gewebefaktor ist ein integrales Membranglykoprotein, das wie bereits erwähnt die Blutkoagulation über den extrinsischen Weg auslösen kann. Bach, R. et al., J. Biol. Chem. 256 (16), 8324-8331 (1981). Der Gewebefaktor besteht aus einer Proteinkomponente (früher als Gewebefaktor-Apoprotein-III bezeichnet) und einem Phospholipid. Osterud, B. und Rapaport, S.I., PNAS 74, 5260-5264 (1977). Der Komplex wurde auf den Membranen von Monozyten und verschiedenen Zellen der Blutgefäßwand festgestellt. Osterud, B., Scand. J. Haematol. 32, 337-345 (1984). Gewebefaktor aus verschiedenen Organen und Spezien besitzt laut Berichten eine relative Molekülmasse von 42.000 bis 53.000. Humangewebe-Thromoplastin besteht laut Beschreibungen aus einem Gewebefaktorprotein, das in einem optimalen Verhältnis von Gewebefaktorprotein : Phospholipid von etwa 1 : 80 in eine Phospholipid-Doppelschicht eingesetzt ist. Lyberg, T. und Prydz, H., Nouv. Rev. Fr. Hematol. 25 (5), 291-293 (1983). Die Reinigung von Gewebefaktor aus verschiedenen Geweben wurde berichtet, z.B. aus: menschlichem Gehirn (Guha, A. et al., PNAS 83, 299-302 [1986] und Broze, G.H. et al., J. Biol. Chem. 260[20], 10917-10920 [1985]); Rinderhirn (Bach, R. et al., J. Bio. Chem. 256: 8324-8331 [1981]; Humanplazenta (Bom, V.J.J. et al., Thrombosis Res. 43: 275-286 [1986]); Schafshirn (Carlsen, E. et al., Thromb. Haemostas. 48[3], 315-319 [1982]); und aus der Lunge (Glas, P. und Astrup, T., Am. J. Physiol. 219, 1140-1146 [1970]. Es wurde gezeigt, daß Rinder- und Humangeweb-Thromboplastin eine idente Größe und Funktion aufweisen. Siehe beispielsweise Broze, G.H. et al., J. Bio. Chem. 260(20), 10917-10920 (1985). Es wird allgemein anerkannt, daß es zwar Unterschiede in der Struktur von Gewebefaktorprotein zwischen Spezien gibt, daß aber keine funktionalen Unterschiede bestehen, die durch in vitro-Koagulationsassays gemessen werden. Guha et al., oben. Weiters wies der aus verschiedenen Geweben eines Tiers, z.B. Hundehirn, Lunge, Arterien und Venen, isolierte Gewebefaktor in einigen Punkten, z.B. dem Extinktionskoeffizienten, dem Stickstoff- und Phosphorgehalt und dem optimalen Phospholipid-Lipid-Verhältnis, Ähnlichkeiten auf, er wies jedoch bezüglich der Molekülgröße, des Aminosäuregehalts, der Reaktivität mit Antikörpern und der Plasma- Halbwertszeit Unterschiede auf. Gonmori, H. und Takeda, Y., J. Physiol. 229(3), 618- 626 (1975). Alle Gewebefaktoren aus den verschiedenen Hundeorganen zeigten in der Gegenwart von Lipid Klumpungsaktivität. Ebda. Es wird weithin angenommen, daß, um biologische Aktivität zu zeigen, der Gewebefaktor mit Phospholipiden assoziiert werden muß. Pitlick, F.A., und Nemerson, Y., Biochemistry 9, 5105-5III(1970) und Bach, R. et al., oben auf S. 8324. Es wurde gezeigt, daß die Entfernung der Phospholipidkomponente des Gewebefaktors, z.B. durch Verwendung einer Phospholipase, zu einem Verlust der biologischen Aktivität führt. Nemerson, Y.,J. C. 47, 72-80 (1968). Die Relipidation kann die Gewebefaktor-Aktivität in vitro wiederherstellen. Pitlick, F.A. und Nemerson, Y. Biochemistry 9, 5105-5113 (1970) und Freyssinet, J.M. et al., Thrombosis and Haemostasis 55, 112-118 [1986].
• Man nahme lange an, daß die Infusion von Gewebefaktor die normale Hämostase beeinträchtigt. 1834 belegte der französische Physiologe de Blainville erstmals, daß der Gewebefaktor direkt zur Blutkoagulation beitrug. de Blainville, H. Gazette Medicale de Paris, Series 2, 524 (1834). de Blainville beobachtete auch, daß die intravenöse Infusion einer Gehirngewebe-Suspension zum sofortigen Tod führt, der seinen Beobachten zufolge mit einem hyperkoagulativen Zustand in Zusammenhang stand, der zur Entstehung weit verteilter Blutklumpen führte, wie man in der Autopsie feststellte. Man ist sich heute einig, daß die intravenöse Infusion von Gewebe-Thromboplastin die intravaskuläre Koagulation bewirkt und bei verschiedenen Tieren zum Tod führen kann (Hunde: Lewis, J. und Szeto I.F., J. Lab. Clin. Med. 60, 261-273 (1962); Hasen: Fedder, G. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 27, 365-376 (1972); Ratten: Giercksky, K.E. et al., Scand. J. Haematol. 17, 305-311 (1976); und Schafe: Carlsen, E. et al., Thromb. Haemostas. 48, 315-319 [1982]).
• Zusätzlich zur intravaskulären Koagulation eines hyperkoagulativen Zustands aufgrund der exogenen Verabreichung von Gewebefaktor wurde angenommen, daß die intravaskuläre Freisetzung von Gewebe-Thromboplastin die disseminierte intravaskuläre Koagulation (DIC) einleiten könnte. Prentice, C.R., Clin. Haematol. 14(2), 413-442 (1985). DIC kann in verschiedenen Zuständen entstehen, z.B. bei Schock, Blutvergiftung, Herzstilstand, schweren Verletzungen, Bissen durch Giftschlangen, akuter Lebererkrankung, großen Operationen, Verbrennungen, septischem Abortus, Hitzschlag, disseminierter Malignität, Bauchspeicheldrüsen- und Eierstockkrebs, promyelocyter Leukämie, Myokardinfarkt, Neoplasmen, systemischem Lupus Erythematosus, Nierenerkrankungen und Eklampsie. Die derzeitige Behandlung von DIC umfaßt die Transfusion von Blut und frisch gefrorenem Plasma, die Infusion von Heparin und die Entfernung gebildeter Klumpen. Die obigen klinischen Syndrome lassen vermuten, daß die endogene Freisetzung von Gewebefaktor zu schweren klinischen Komplikationen führen kann. Andoh, K. et al., Thromb. Res. 43, 275-286 (1986). Es wurde versucht, die thrombotische Wirkung von Gewebe-Thromboplastin mit dem Enzym Thromboplastinase zu überwinden. Gollub, S. et al., Thromb. Diath. Haemorh. 7, 470-479 (1962). Thromboplastinase ist eine Phospholipase und würde vermutlich den Phospholipid-Abschnitt des Gewebefaktors spalten. Ebda.
• Angeborene Koagulationsstörungen sind typischerweise an ein einzelnes Koagulationsprotein gebunden. Die Hämophilie ist eine Blutungsstörung aufgrund eines vererbten Mangels eines Koagulationsfaktors, z.B. der proagulanten Aktivität von Faktor VIII. Die Therapie der Blutungszustände beruht auf der Transfusion von Material, das das fehlende Koagulationsprotein enthält, z.B. die Infusion von Faktor VIII-proagulanter Aktivität, die den spezifischen Mangel bei Hämophilie A vorübergehend korrigiert.
• Die Von Willebrand'sche Krankheit ist eine weitere Blutungsstörung, die durch eine verlängerte Blutungszeit sowie durch eine Abnormität im oder einen Mangel an Willebrand-Protein gekennzeichnet ist. Die Behandlung erfolgt durch Infusion von normalem Plasma oder durch eine Zusammensetzung, die reich an von Willebrand- Protein ist. Angeborene Defizienzen jedes der anderen Koagulationsfaktoren treten auf und können mit Blutungsneigung in Zusammenhang stehen. Derzeitige Therapien für diese Defizienzen sind die folgenden: ein Mangel an Faktor IX wird mittels Faktor IXhältigen Konzentraten behandelt; bei einem Mangel an Faktor XI werden Plasmainfusionen vorgenommen; bei einem Mangel an Faktor XIII werden Plasmainfusionen vorgenommen.
• Erworbene Koagulationsstörungen entstehen als Folge eines Krankheitsverlaufs in Personen ohne Bluter-Krankengeschichten. Inhibitoren für Blutkoagulationsfaktoren können bei mehrfach transfundierten Personen auftreten. Erworbene Koagulationsfaktor- Mangelerscheinungen mit unbekannter Ursache führen auch zu hämostatischen Problemen. DIC zeigt einen gravierenden Zusammenbruch des hämostatischen Mechanismus an.
• Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der neuen und unerwarteten Beobachtung, daß die Infusion von Gewebefaktorprotein in Hasen mit einem Mangel an Koagulationsfkatoren nicht nur die hämostatische Defizienz korrigierte, sondern auch keine disseminierte intravaskuläre Koagulation oder andere negative Nebenwirkungen nach sich zog. Gewebefaktorprotein ist der Proteinabschnitt des Gewebefaktors, dem das natürlich vorkommmende Phospholipid fehlt, das man früher als Gewebefaktor- Apoprotein III bezeichnete und das als inaktiv galt. Es wurde erstmals festgestellt, daß Gewebefaktorprotein die Hämmorhagiediathese, d.h. die Blutungsneigung, die in Zusammenhang mit der Faktor VIII-Defizienz steht, in vivo korrigiert. Weiters würde man erwarten, daß die Infusion von Gewebefaktorprotein angesichts der Arbeiten, die den Gewebefaktor dahingehend beschreiben, daß er ein absolutes Bedürfnis nach Phospholipid aufweist, ineffektiv ist. Die Wirksamkeit und mangelnde Toxizität, die man beobachten konnte, steht im Gegensatz zu den Ergebnissen, die man aufgrund der Arbeiten von de Blainville und den nachfolgenden Forschern im Laufe der letzten 152 Jahre erwarten konnte.
• Es wäre daher wünschenswert, eine koagulationsinduzierende therpeutische Zusammensetzung für verschiedene chronische Blutungsstörungen bereitzustellen, die durch eine angeborene oder erworbene Blutungsneigung gekennzeichnet sind. Beispiele solcher chronischer Blutungsstörungen sind Defizienzen der Faktoren VIII, IX oder XI. Beispiele erworbener Störungen sind: erworbene Inhibitoren für Blutkoagulationsfaktoren, z.B. Faktor VIII, von Willebrand-Faktor, Faktoren IX, V, X, XII und XIII; hämostatische Störung als Folge von Lebererkrankung, bei der eine verringerte Synthese von Koagulationsfaktoren und DIC festzustellen ist; Blutungsneigung in Zusammenhang mit akuter und chronischer Nierenerkrankung, die Koagulationsfaktor- Defizienzen und DIC einschließt; Hämostase nach Trauma oder Operation; Patienten mit disseminierter Malignität, die sich in DIC mit Zunahmen der Faktoren VIII, des von Willebrand-Faktors und von Fibrinogen äußert; und Hämostase während kardiopul monärer Chirurgie und massiver Bluttransfusion.
• Ein weiteres Ziel besteht darin, eine koagulationsinduzierende therapeutische Zusammensetzung für akute Blutungsprobleme bei normalen Patienten und jenen mit chronischen Blutungsstörungen bereitzustellen.
• Ein weiteres Ziel besteht darin, ein gerinnungshemmendes Therapeutikum bereitzustellen, das ein Antagonist zu Gewebefaktorprotein ist, um die thrombotischen Wirkungen der endogenen Freisetzung von Gewebe-Thromboplastin zu neutralisieren, die zu einem hyperkoagulativen Zustand führen kann. Ein solches Antikoagulans, d.h. ein Antagonist zu Gewebefaktorprotein, würde die hyperkoagulativen Wirkungen von endogen freigesetztem Gewebethromboplastin durch Inkaktivierung von Gewebefaktorprotein neutralisieren. Ein solcher Gewebefaktorprotein-Antagon ist kann ein Antikörper oder ein anderes Protein sein, das die Proteinkomponente spezifisch inaktiviert.
• Die vorliegende Erfindung wurde durch die neue Erfahrung dargelegt, daß die Verabreichung von Gewebefaktorprotein, d.h. Gewebe-Thromboplastin oder Gewebefaktor, dem das Phospholipid fehlt, das normalerweise mit dem natürlich vorkommenden Protein assoziiert ist, an Tiere mit einem hämostatischen Mangel diese Defizienz korrigiert. Bis zu den unerwarteten Beobachtungen der vorliegenden Erfindung betrachtete man das Gewebefaktorprotein in Abwesenheit der Phospholipidkomponente als inaktiv. Die Nicht-Toxizität von Gewebefaktorprotein stellte sich erstmals bei intravenöser Verabreichung heraus. Demzufolge betrifft ein Aspekt der Erfindung die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend Gewebefaktorprotein als Koagulans bei Patienten mit Blutungsstörungen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Behandlungsverfahren chronischer Blutungsstörungen. In einem weiteren Aspekt betrifft sie die Behandlung akuter Blutungsvorfälle bei Patienten mit chornischen Blutungsstörungen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Antikoagulans zur Neutralisierung der Gerinnungswirkung von endogen freigesetztem Gewebe-Thromboplastin durch Inaktivierung von Gewebefaktorprotein.
Es sind Zeichnungen beigelegt, worin:
• Fig.1 ein Diagramm ist, das die Aktivierung der Blutkoagulation über dem intrinsischen Weg zeigt;
• Fig.2 ein Diagramm ist, das die Verstärkung des Koagulationssignals beim extrinsischen Weg zeigt;
• Fig.3 die kütikulären Blutungszeiten (CBT) von Tieren darstellt, die Gewebefaktorprotein erhalten. Pfeile kennzeichnen die Dosierung von Gewebefaktorprotein in U/kg. Pre bezieht sich auf CBT vor allen Injektionen.
• Hierin bezieht sich der Ausdruck "Gewebefaktorprotein" auf ein Protein, das verschiedene Blutungsstörungen korrigieren kann, insbesondere jene, die mit einem Mangel an Koagulationsfaktoren in Zusammenhang stehen. Gewebefaktorprotein unterscheidet sich insoferne von Gewebefaktor oder Gewebe-Thromboplastin, als ihm der natürlich vorkommende Lipidabschnitt des Moleküls fehlt. Die Infusion von Gewebefaktorprotein führt zu keiner dissem in ierten intravaskulären Koagulation. Gewebefaktorprotein umfaßt auch Gewebefaktorprotein, das mit Phospholipid assoziiert ist, welches Lipid sich vom natürlich vorkommenden und mit Gewebethromboplastin assoziierten Lipid unterscheidet und eine koagulationsinduzierende Fähigkeit ohne die begleitende Toxizität aufweist, die man beim lipidierten Protein beobachtet. Die Infusion von Gewebefaktorprotein führt gemäß der Definition hierin zu keiner disseminierten intravaskulären Koagulation. Die Fähigkeit von Gewebefaktorprotein, verschiedene Blutungsstörungen zu korrigieren, wird problemos unter Verwendung unterschiedlicher in vivo-Blutungsmodelle bestimmt, z.B. Einleitung der Blutgerinnung in hämophilen Hunden mittels Bestimmung der kutikulären Blutungszeit (Giles,A.R. et al., Blood 69: 727-730 [1982]).
• Der hierin verwendete Ausdruck "Gewebefaktorprotein-Antagonisten bezieht sich auf Substanzen, die auf zweierlei Art wirken können. Erstens binden sich Gewebefaktorprotein-Antagonisten mit ausreichender Affinität und Spezifität an Gewebefaktorprotein, um Gewebefaktorprotein solcherart zu neutralisieren, daß es sich nicht an Faktor VII oder VIIa binden kann oder in Komplex mit Faktor VII oder VIIa keine Proteolyse der Faktoren IX oder X bewirken kann. Alternativ dazu inaktivieren Gewebefaktorprotein-Antagon isten das Gewebefaktorprotein oder seinen Gewebefaktor/Faktor VIIa-Komplex durch Spalten, z.B. einer spezifischen Protease. Antagonisten eignen sich entweder alleine oder gemeinsam zur Therapie verschiedener Blutgerinnungsstörungen, die sich durch hierin beschriebene geänderte Plasmafibrinogen-Werte äußern, z.B. DIC, die bei schweren Entzündungen und Blutvergiftungen, nach Operationen oder Verletzungen auftritt, anstelle von oder in Kombination mit anderen Antikoagulantien wie Heparin.
• Ein Beispiel eines Antagonisten, der Gewebefaktor neutralisiert, ist ein neutralisierender Antikörper zu Gewebefaktorprotein. Gewebefaktorprotein-neutralisierende Antikörper werden problemlos in Tieren wie Hasen oder Mäuse durch Immunisierung mit Gewebefaktorprotein in Freund'schem Adjuvans und allenfalls anschließenden Auffrischungsimpfungen gebildet. Immunisierte Mäuse eignen sich besonders zum Bereitstellen von B-Zellen zur Herstellung von Hybridomas, die ihrerseits zur Herstellung großer Mengen an billigen monoklonalen Anti-Gewebefaktorprotein- Antikörpern kultiviert werden. Solche monoklonalen Gewebefaktorprotein-Antikörper wurden durch Carson, S.D. et al., Blood 66(1) 152-156 (1985) hergestellt.
• Gewebefaktor wird aus beschädigten Zellen freigesetzt und aktiviert die Faktoren IX und X in Gegenwart von Faktor VII oder VIla und Kalzium (siehe Fig.2). Für die Aktivierung von Faktor X auf extrinsischem Koagulationswege ist Gewebefaktor absolut erforderlich. Silverberg, S.A. et al., J. Bio. Chem. 252, 8481-8488 (1977). Bis zur Entdeckung im Rahmen der vorliegenden Erfindung dachte man, daß die Lipidkomponente von Gewebefaktor für eine optimale Gewebefaktoraktivität bei der Katalyse von Faktor X oder Faktor IX durch Faktor VII oder VIIa essentiell sei. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Behandlung verschiedener akuter und chronischer Blutungsstörungen durch Umgehung dieser Mangelerscheinungen mittels Verabreichung von Gewebefaktorprotein. Genauer gesagt eignet sich die vorliegende Erfindung für jene Blutungsstörungen, die bei Tieren entstehen, die einen Mangel verschiedener Gerinnungsfaktoren aufweisen.
• Gewebe-Thromboplastin oder Gewebefaktor besteht aus einer Glykoproteinkomponente (zuvor als Gewebefaktor-Apoprotein III bezeichnet), die zu offensichtlicher Homogenität gereinigt wurde (Bjorklid, E. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 969-976 [1973]), und einer Phospohipidfraktion. Zahlreiche Berichte beschrieben die Reinigung von Gewebefaktor aus verschiedenen Gewebearten wie Gehirn, Lunge und Plazenta. Schafe, Kühe, Hasen, Hunde und Menschen dienten als Gewebefaktorquelle. der erste Schritt der chemischen Reinigung bestand darin, Gewebefaktor von seinem nativen Lipid mittels z.B. Extrahieren mit organischen Lösungsmitteln abzutrennen. Beispiele solcher organischer Lösungsmittel sind Pyridin, Heptan-Butanol-Mischung oder Ethanol. Gewebefaktorprotein wurde durch chemische Mittel gereinigt. Beispiele solcher chemischer Mittel sind: Behandlung mit Detergenzien, z.B. Deoxycholat oder Triton x-100; Gelfiltration und präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat; an eine Sepharose-Säule gebundenes Concanavalin A; und Affinitätssäulen unter Verwendung von Antikörpern zum Gewebefaktorprotein oder selektive Adsorption an Faktor VII. In den Bereich von Gewebefaktorproteinen fällt auch das Gewebefaktorprotein aus rekombinanten oder synthetischen Quellen. Es sind auch Dimere von Gewebefaktorprotein und Gewebefaktorprotein-Varianten mit Aminosäuresubstitutionen und/oder löschungen und/oder -hinzufügungen, organische und anorganische Salze und kovalent modifzierte Derivate von Gewebefaktorprotein enthalten. Gewebefaktorprotein, das durch rekombinante Mittel hergestellt wird, kann eine natürlich vorkommende pro-Form sowie eine Präpro-Form von Gewebefaktorprotein umfassen.
• Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können Gewebefaktorprotein oder Gewebefaktorprotein-Antagonisten zu einem injizierbaren Präparat formuliert werden. Parenterale Formulierungen eignen sich zur Verwendung in der Erfindung, vorzugsweise zur intravenösen Verabreichung. Diese Formulierungen enthalten therapeutisch wirksame Mengen an Gewebefaktorprotein, sie sind entweder sterile flüssige Lösungen, flüssige Suspensionen oder lyophilisierte Versionen und enthalten wahlweise Stabilisatoren oder Exzipienten. Typischerweise werden lyophilisierte Zusammensetzungen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, z.B. sterilem Wasser zur Injektion, steriler Salzlösung u.dgl. rekonstituiert, wo die biologische Aktivität ausreicht, eine hämostatische Koagulation herbeizuführen, wie dies in einer Infusionsuntersuchung mit Hasen beobachtet wurde.
• Alternativ dazu kann zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung Gewebefaktorprotein zu einem Präparat für die Absorption durch den Magen-Darm- Trakt formuliert werden. Ein solches Präparat eignet sich zur Verwendung in der Erfindung für die orale Verabreichung. Solche oralen Präparate enthalten therapeutisch wirksame Mengen von Gewebefaktorprotein, ein lipophiles Vehikel und ein Mittel zur Verbesserung der Absorption durch den Magen-Darm-Trakt. Geeignete lipophile Vehikel sind Mineralöl, Triglyzeride, veresterte Glykole, Polyglkyole mit hydrophoben Alkyl-Seitenketten und Sterole. Beispiele von Absorptionsverstärkern sind Hydroxyaryloder Hydroxyaralkylsäuren und ihre Salze, Ester oder Amide. Andere Verbindungen mit ähnlichen Eigenschaften sind Salicylsäure-Derivate, Amine von 1,3- Dicarbonylverbindungen und Enaminosäuren, und ihre Salze, Amine und Ester.
• Gewebefaktorprotein kann intravaskulär mittels Injektion oder durch orale Verabreichung in einer Dosierung verabreicht werden, die zur Korrektur einer Blutungsstörung ausreicht, z.B. bei einer Ersetzungstherapie angesichts eines Faktor VIII- Mangels. Gewebefaktorprotein kann in einer Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, einen akuten Blutungsvorfall bei einem Koagulationsfaktormangel zu korrigieren.
• Die therapeutische Dosierung von Gewebefaktorprotein liegt in einem Bereich von etwa 10 U/kg bis 300 U/kg. Eine bevorzugte therapeutische Dosierung von Gewebefaktorprotein liegt im Bereich von etwa 50 U/kg bis 250 U/kg. Eine am meisten bevorzugte therapeutische Dosierung von Gewebefaktorprotein liegt im Bereich von etwa 75 U/kg bis 200 U/kg. In Abwesenheit einer internationalen Norm der Gewebefaktoraktivität legten die Autoren eine Gewebefaktornorm fest. Eine Einheit der Gewebefaktoraktivität ist jene Menge von Gewebefaktorprotein in 10 ul Gewebe- Thromboplastin (im Handel erhältlich von Sigma, St. Louis, MO), die durch den chromogenen Assay gemessen wird. Eine Beschreibung des chromogenen Assays folgt weiter unten. Die Dosis hängt von der relativen Aktivität der jeweiligen Spezies des Gewebefaktorproteins ab, z.B. vom Human-Gewebefaktorprotein im Vergleich zum Rinder-Gewebefaktorprotein. Die relativen Aktivitäten können unter Verwendung des chromogenen Assays bestimmt werden. Wenn beispielsweise ein Human- Gewebefaktorprotein in einem in vivo-hämophilen Hundemodell um die Hälfte weniger aktiv ist als das Rinder-Gewebefaktorprotein, würde sich der therapeutische Dosierungsbereich unter Verwendung des Human-Gewebefaktorproteins um einen Faktor zwei ausweiten.
• Die Dosierung hängt von verschiedenen therapeutischen Variablen ab, z.B. von der zu behandelnden Tierspezies, dem Verabreichungsweg, den Eigenschaften des verwendeten Gewebefaktorproteins wie etwa von seiner Aktivität und biologischen Halbwertszeit, der Konzentration des Gewebefaktorproteins in der Formulierung, dem Plasmavolumen des Patienten, seinem klinischen Zustand, z.B. insbesondere von der jeweiligen Blutungsstörung, und von anderen Parametern, die ein herkömmlich ausgebildeter Arzt berücksichtigen würde.
• Der Gewebefaktorprotein-Antagonist kann intravaskulär durch Injektion in einer Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, ein Blutungsstörung, z.B. DIC, zu korrigieren. Antagonisten können in einer Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um eine solche Blutungsstörung zu korrigieren. Die Dosierung hängt von verschiedenen dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten therapeutischen Variablen ab.
• Gewebefaktorprotein wird auch günstigerweise zu einem topischen Präparat zur lokalen Therapie kleiner Blutungen an zugänglichen Stellen in Verbindung mit kalter Anwendung und leichtem Druck formuliert. Ein solches Präparat zur lokalen Therapie enthält eine therapeutisch wirksame Konzentration von Gewebefaktorprotein in einem dermatologischen Vehikel. Diese zu verabreichende Menge Gewebefaktorprotein und die Gewebefaktorprotein-Konzentration in der topischen Formulierung hängt vom ausgewählten Vehikel, dem klinischen Zustand, der Spezies des verwendeten Gewebefaktorproteins und der Stabilität des Gewebefaktorproteins in der Formulierung ab.
• Das Gewebefaktorprotein oder der Gewebefaktorprotein-Antagon ist der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise als sterile Lösung formuliert und verabreicht, obwohl es im erfindungsgemäßen Schutzbereich liegt, lyophilisierte Gewebefaktorpräparate zu verwenden. Sterile Lösungen werden durch Sterilfiltration von Gewebefaktorprotein der durch andere auf dem Gebiet an sich bekannte Verfahren gebildet. Die Lösungen werden dann lyophilisiert oder in pharmazeutische Dosierungsbehälter gefüllt. Der pH- Wert der Lösung sollte im Bereich von 3,0 bis 9,5, vorzugsweise von 5,0 bis 7,5 liegen. Das Gewebefaktorprotein sollte sich in einer Lösung mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Puffer wie Phosphat, tris(Hydroxymethyl)aminomethan MCI oder -citrat u.dgl. befinden. Pufferkonzentrationen sollten im Bereich von 1 bis 100 mm liegen. Die Lösung des Gewebefaktorproteins kann auch ein Salz enthalten, z.B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid in einer Konzentration von 50 bis 750 mM.
• Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten wahlweise eine wirksame Menge eines allenfalls erforderlichen Stabilisierungsmittels wie etwa ein Albumin, ein Globulin, ein Gelatin, Mono- oder Polysaccharid, Aminosäure oder Zucker. Man kann eine Stabilisierungsmenge eines Petergens hinzufügen, z.B. nichtionische Detergenzien (PRG oder Blockcopolymere), Natriumdesoxycholat, Triton X-100 oder Natriumdodecylsulfat (SDS).
• Ein Gewebefaktorprotein oder Gewebefaktorprotein-Antagon ist wird vorzugsweise in einen Behälter mit einer sterilen Öffnung gefüllt, z.B. in eine intravenöse Lösungstasche oder ein Fläschchen mit einem durch eine subkutane Injektionsnadel durchstechbaren Verschluß.
• Die systemische Verabreichung von Gewebefaktorprotein kann täglich oder mehrmals wöchentlich im Falle der Ersatztherapie für eine Koagulationsfaktordefizienz erfolgen. Die Verabreichung erfolgt typischerweise durch intravenöse Injektion. Die Verabreichung kann auch intranasal oder durch andere nonparenterale Wege erfolgen. Gewebefaktorprotein kann auch mittels Mikrokügelchen, Liposomen oder andere in bestimmten Geweben wie Blut angeordnete Mikroteilchen-Zufuhrsysteme verabreicht werden.
Beispiel 1 Allgemeine Materialien und Verfahren
• Reife Ringerhirne stammten von Pel-Freeze, Rogers, Ar., und wurden bei -20ºC gelagert.Triton X- 100 und α-D-Methylglucosid stammten von Calbiochem, San Diego, CA. Concanavalin A-Sepharoseharz (in Tabelle 1 als Con A Sepharose bezeichnet) stammte von Pharmacia und Ultrogel AcA 44 von LKB, Gaithersburg, MD. Alle Chemikalien und Reagenzien für präparative und analytische Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) stammten von den Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA. Faktor IXa/Faktor X-Reagens und S2222/12581 stammten von den Helena Laboratories (Kabi Coatest kit, Helena Laboratories, Beaumont, CA., Katalognummer 5293). YM 10-Ultrafiltrationsmembranen stammten von Amicon. Faktor VII wurde aus Rinderplasma gereinigt. (Broze, G. und Majerus, P., J. Biol. Chem. 255(4): 1241-1247 [1980]). Normales zitriertes Plasma und jenes mit einem Faktor VIII-Mangel stammten von George King Biomedicals, Overland Park, Kansas. Roh-Phosphatidylcholin (Lezithin-Granulat aus Sojabohnen) stammte von Sigma, St. Louis, MO. Alle anderen Chemikalien wiesen zumindest Reagenzqualität auf.
Aceton-Delipidation von Rinderhirnen
• Zwei reife Rinderhirne wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und mit destilliertem Wasser von geronnenem Blut abgewaschen. Das Gewebe wurde dann unter Verwendung eines Ultra-Turrex-Gewebehomogenisierapparats in eiskaltes Aceton bis zu einem Volumen von 10 ml Aceton pro g Nettogewicht Rinderhirn homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 4ºC 30 min lang extrahiert und dann durch Whatman Nr. 1- Filterpapier auf einem evakuierten Kolben gefiltert. Die Gewebeaufschlämmung wurde erneut im ursprünglichen Volumen des eiskalten Acetons suspendiert, extrahiert und sechsmal gefiltert. Der endgültige Filterkuchen wurde unter einem Stickstoffstrahl getrocknet und bei -20ºC gelagert.
Triton X-100 Soubilisierung von Gewebefaktor
• Aceton-Gehirnpulver (145 g) wurden in 0,05 M Tris/0,1 M NaCl, pH-Wert 7,5, (TBS) zu einem Endvolumen von 20 ml Puffer/g Aceton-Gehirnpulver homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 4ºC 1 Stunde lang extrahiert und anschließend bei 10.000 x g 1 Stunde lang bei 4ºC zentrifugiert. Das Überstand wurde verworfen und das Pellet erneut in 3 Liter TBS/0,1% Triton X-100 suspendiert. Das Material wurde wie oben extrahiert und zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde dann in 3 Liter TBS/2% Triton X-100 homogenisiert, um Gewebefaktor zu solubilisieren. Das Homogenat wurde 16 Stunden lang bei 4ºC extrahiert und dann wie oben zentrifugiert.
Concanavalin A-Sepharose-Affinitätssäule
• Dem Überstand aus der 2% Triton X-100-Extraktion wurde CaCl&sub2; und MgCl&sub2; bis zu einer Menge von 1 mM hinzugefügt, und der Überstand wurde mit 100 ml Concanavalin-A-Sepharoseharz 16 Stunden lang bei 4ºC chargenweise adsorbiert. Nach der Adsorption wurde das Sepharoseharz in eine 3 x 20 cm Säule gefüllt und mit 500 ml TBS 0,05% Triton X-100 bei einer Flußrate von 2 ml/min gewaschen. Das dekadische Absorptionsvermögen wurde bei 280 nm überwacht. Wenn kein weiteres Protein aus der Säule gewaschen wurde, wurde die Sepharose mit einem Puffer umfassend 100 mg/ml α-D-Methylglucosid in TBS/0,05% Triton X-100 isokratisch eluiert. 10 ml- Fraktionen wurden bei einer Flußrate von 2 ml/min gesammelt. Fraktionen wurden relipidiert und hinsichtlich Gewebefaktoraktivität geprüft. Gewebefaktorprotein wurde in etwa 4 Säulenvolumina Eluens eluiert. Das Eluat wurde in einer Amicon- Konzentrationszelle unter Verwendung eier YM10-Ultrafiltrationsmembran konzentriert.
Gelpermeationschromatographie
• 10 ml konzentriertes Concanavalin-A Sepharose-Eluat wurden gegen TBS 0,1% Triton X- 100, pH-Wert 7,4, 1I Volumen mit 4maligem Pufferwechsel dialysiert. Nach der 8- stündigen Dialyse wurde das Material auf eine 120 x 1,5 cm Säule von AcA 44 Ultrogel aufgebracht, die mit TBS 0,1% Triton X-100 prääquilibriert war. Die Säule wurde bei einer Flußrate von 6 ml/h isokratisch entwickelt. 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen wurden relipidiert und auf Gewebefaktoraktivität geprüft. Peakfraktionen wurden zu einem Endvolumen von 20 ml gepoolt. Dieses Material wurde vor der Verwendung bei -20ºC gelagert.
Reinigung von Gewebefaktorprotein
• Gewebefaktorprotein wurde aus Rindergehirn durch eine Kombination von Aceton- Delipidation, Triton X-100-Extraktion, Lectin-Affinitätschromatographie und Gelpermeationschromatographie teilweise gereinigt. Das hochgereinigte Gewebefaktorprotein wurde aus Gehirnpulvern 12.000-fach gereinigt (Tabelle 1). Ein sensitiver chromogener Assay auf Gewebefaktorprotein diente dazu, die Reinigungsschritte zu überwachen. Nach der Detergensextraktion von Aceton- Gehirnpulvern konnte nur dann Gewebefaktorprotein-Aktivität im Assay festgestellt werden, wenn Gewebefaktorprotein relipidiert wurde. Das Material, das in Hasen infundiert wurde, wies vor der Relipidation weder im einstufigen Koagulationsassay noch im nachstehend beschriebenen zweistufigen chromogenen Assay eine Cofaktoraktivität auf (Tabelle 2). Dies bestätigte die bekannte Phospholipid- Abhängigkeit von Gewebefaktor. Siehe Nemerson, Y., oben. Humanplazenta- Gewebefaktor wurde mittels bekannter Verfahren isoliert, siehe z.B. Guha, A. et al., oben. Humanplazenta-Gewebefaktorprotein wurde mit Rinder-Gewebefaktorprotein verglichen. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, benötigen sowohl Humanplazenta- Gewebefaktor als auch Rinder-Gewebefaktor zur Aktivität in einem in vitro chromogenen Assay Lipide. Wie bereits erwähnt, weisen der Humanplazenta- und Rinder-Gewebefaktor eine ähnliche Struktur auf. Somit könnte man erwarten, daß der Humanplazenta-Gewebefaktor beim Infundieren in Hasen ähnlich wirkt.
Assay auf Gewebefaktorprotein 1. Chromogener Gewebefaktorassay
• Alle durch ein nichtionisches Detergens aus Rindergehirn extrahierten Proben wurden vor dem Assay erneut lipidiert. Wie bereits erwähnt, ist für den Gewebefaktor Phospholipid absolut erforderlich, damit er in in vitro Assaysystemen eine Aktivität aufweisen kann (Pitlick und Nemeson, oben). Lecithin-Granulat wurde in Tris 0,05 M 0,1 M NaCl, pH-Wert 7,4 (TBS) umfassend 0,25% Natriumdesoxycholat zu einer Konzentration von 1 mg/ml homogenisiert.
• Diese Lösung (PC/DOC) diente dazu, den Gewebefaktor wie folgt erneut zu lipidieren. Gewebefaktorprotein wurde in TBS enthaltend 0,1% Rinder-Serumalbumin (TBSA) verdünnt. 50 ul wurden in ein 12 x 75 mm Polystyrol-Teströhrchen gefüllt und 50 ul PC/DOC-Lösung hinzugefügt. 350 ul TBSA wurde dann gemeinsam mit 25 ul 100 mM CdCl&sub2; hinzugefügt. Diese Relipidationsmischung wurde dann 30 min lang bei 37ºC inkubiert.
• Für den chromogenen Assay wurden relipidierte Gewebefaktorprotein-Proben in TBSA verdünnt. 10 µl wurden in ein Teströhrchen mit 50 µl des Faktor IXa/Faktor X-Reagens und 2 µl einer Lösung von gereinigtem Faktor VII, 30 Einheiten/ml gefüllt. Die Teströhrchen wurden auf 37ºC erwärmt und 100 µl 25 mM CaCl&sub2; hinzugefügt. Proben wurden 5 min lang bei 37ºC vor der Zugabe von 50 µl chromogenem Substrat S2222 umfassend den synthetischen Thrombininhibitor 12581 inkubiert. Die Reaktion wurde 10 min lang fortgesetzt und durch die Zugabe von 100 µl 50% Eisessigsäurelösung abgebrochen. Das dekad. Absorptionsvermögen wurde bei 405 nm festgestellt. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von Hasengehirn-Thromboplastin (erhältlich bei Sigma, St. Louis, MO Katalognummer T0263) erstellt, wobei diesem Reagens willkürlich 100 Gewebefaktoreinheiten/ml zugewiesen wurden. Verdünnungen wurden von 1:10 bis 1:1000 angefertigt. Die dekadische Absorptionsfähigkeit wurde auf der Abszisse von halblogarithmischem Millimeterpapier und die Verdünnung des Standards auf der Ordinate aufgetragen.
2. Einstufiger Assay auf Gewebefaktoraktivität
• 100 µl Hämophilenplasma wurde zu 10 µl relipidiertem oder lipidfreiem Gewebefaktor oder TBSA als Kontrolle in einem silikonisierten Glasrohr hinzugefügt, um nichtspezifische Aktivierung durch die Kontaktphase der Koagulation zu verhindern. Die Reaktanden wurden auf 37ºC erwärmt und 100 µl 25 mM CaCl&sub2; hinzugefügt; anschließend wurde die Klumpenbildungszeit gestoppt. Hvatum, Y. und Prydz, H., Thromb. Diath. Haemorrh. 21, 217-222 (1969).
Beispiel 2 Wirksamkeit und Toxizitätsmangel von Gewebefaktorprotein in einem Hasenmodell
• Arterielle und venöse Kanülen wurden in die Ohren von zwei weißen 1,8 kg schweren New Zealand Hasen gesteckt. 0,8 ml arterielles Blut wude jedem Tier abgenommen und mit 0,2 ml 0,13 M Trinatriumcitrat antikoaguliert. Beide Tiere wurden dann mit 600 ul Protein-A gereinigtem, Human-Antihuman-Faktor VIII-Antikörper, 1700 Bethesda U/ml, durch die venöse Kanüle infundiert. 30 min nach der Infusion wurden arterielle Kanülen mit 1 ml Salzlösung ausgespült; 1 ml Blut wurde entnommen und verworfen. 0,8 ml Blut wurde dann für den Assay antikoaguliert, wie dies oben beschrieben ist. 300 ul TBS/0,1 % Triton X-100 wurden dann dem ersten Hasen als Kontrolle infundiert, während der zwite Hase 300 µl Gewebefaktorprotein erhielt. Bei der Relipidation würde dies einer Dosis von 233 Gewebefaktoreinheiten pro Kilogramm (U/kg) entsprechen. 60 min nach der Infusion des Antikörpers wurde beiden Hasen Blut für den Assay entnommen, und die arteriellen Kanülen wurden entfernt. Blut wurde gesammelt und der Fluß und die Dauer des Blutflusses aufgezeichnet.
• Hasenfaktor VIII zeigt in in vitro-Assaysystemen mit Human-Antihuman-Faktor VIII- Antikörpern eine Kreuzreaktion. Diese Antikörper dienten dann dazu, Hasen zu antikoagulieren, wodurch die Faktor VIII-Umgehungsfähigkeit des Gewebefaktorproteins in vivo aufgezeigt wurde. 30 min nach der Infusion von Antifaktor VIII-Antikörpern wurde durch den chromogenen Faktor VIII-Assay (Tabelle 3) kein Faktor VIII im Plasma festgestellt. Der Kontrollhase erhielt 30 min vor der Entfernung der arteriellen Venenkanüle eine Pufferinfusion (300 ul) umfassend 0,1% Triton X-100. Dies führte zu einer intensiven Blutung, die nach 11 min aufhörte (Tabelle 3). Das Tier, das das Gewebefaktorprotein erhielt (Versuch Nr.2, in Tabelle 3) blutete nach der gleichen Behandlung nur gering, wobei dieser Fluß nach 38 sek aufhörte; dies zeigte, daß das Gewebefaktorprotein die Faktor VIII-Aktivität in vivo umgeht. Bei den das Gewebefaktorprotein erhaltenden Tieren konnte man keine Klumpenbildung feststellen, wie dies in der Literatur beschrieben und oben angeführt wird.
• Die Toxizität des Gewebefaktorprotein-Präparats wurde an 6 Hasen untersucht, die mit 250 Einheiten Gewebefaktorprotein pro kg infundiert wurden. Nach 3 Tagen beobachtete man keine negativen Auswirkungen (Tabelle 4). Man beachte, daß dies die in Tabelle 3 verwendete Dosis ist, worin der Blutungsfehler korrigiert wurde. Zwei der Hasen wurden dann mit einer zweiten Dosis von 250 U/kg infundiert, einer erhielt das Doppelte dieser Dosis, und ein Hase erhielt die fünffache Menge dieser Dosis. Diese Tiere sowie die zwei, die keine zweite Injektion erhielten, wurden zwei zusätzliche Tage lang beobachtet. Alle Tiere schienen nach insgesamt 120-stündiger Beobachtung normal. Dies zeigte, daß das Material gut verträglich und nichttoxisch ist. Man kann demnach erwarten, daß ähnliche Präparate für Human-Gewebefaktorprotein beim Infundieren in Patienten gut verträglich sind (Tabelle 4) und Blutungsstörungen korrigieren können (Tabelle 3).
Beispiel 3 Wirksamkeit und Toxizitätsmangel von Gewebefaktorprotein in einem Hundehämophilie-Modell
• Gewebefaktorprotein wird unter Verwendung des Verfahrens nach Giles, A.R. et al., Blood 60, 727-730 (1982) hämophilen Hunden infundiert.
• Ein Mangel an Gewebefaktorprotein-Toxizität wurde in einem normalen Hund zuerst bei einer Bolusinjektion von 50 Gewebefaktorprotein U/kg und 250 Gewebefaktorprotein U/kg-Dosen festgestellt. Eine kutikuläre Blutungszeit (CBT) wurde vor der Infusion und 30 min nach jeder Injektion vorgenommen (Giles, oben). Blut wurde entnommen und für Koagulationsassays zu verschiedenen Zeitpunkten während des Versuchs antikoaguliert (Fig.3). Zum Aufzeigen der in vivo Faktor VIII- Umgehungsaktivität von Gewebefaktorprotein erfolgten Versuche mit hämophilen Hunden. Fastengelassene Tiere wurden anästhesiert und vor jeder Injektion eine CBT vorgenommen. Gewebefaktorprotein wurde dann durch Bolusinjektion verabreicht, und CBTS wurden zu verschiedenen Zeitpunkten bis 90 min nach der Infusion vorgenommen. Mehrere Dosen von Gewebefaktorprotein wurden verabreicht. Blutproben wurden während jedes Versuchs abgenommen und auf Faktor V, Prothrombin und Teil-Thromboplastinzeiten untersucht. CBTs von mehr als 12 min wurden als stark abnormal angesehen. Diese Nägel wurden zur Vermeidung von übermäßigem Blutverlust kauterisiert.
• Ein anästhesierter normaler Hund erhielt Gewebefaktorprotein-Dosen, die bei der Relipidation im chromogenen Assay 50 und 250 U/kg Gewebefaktorprotein entsprechen. Die CBT erfolgte in diesem Tier etwa 3 min vor jeder Infusion (Fig.3). Faktor V-Werte waren 30 min nach jeder Infusion normal (Tabelle 6). Die Prothrombinund Teil-Thromboplastinzeiten waren am Ende des Versuchs unverändert, und auch die CBTS bewegten sich im normalen Bereich. Die Infusion von Gewebefaktorprotein war demnach bei normalen Hunden gut verträglich; man konnte keinen Hinweis auf disseminierte intravaskuläre Koagulation feststellen.
• Ein hämophiler Hund mit einer für Hämophile A typischen verlängerten CBT erhielt 50 U/kg Gewebefaktorprotein. Die CBT war 30 min nach dieser Infusion normalisiert (Fig.3). Diese Korrektur stand nicht im Zusammenhang mit einer Änderung der Faktor V- Werte, und auch die Prothrombinzeit war nicht verlängert (Tabelle 6). Die prokoagulierende Wirkung wurde 90 min nach der Infusion nicht aufrechterhalten, da die CBT-Wirkung zu diesem Zeitpunkt wieder abnormal war. Eine Dosisreaktionsbeziehung wurde durch Infusion von 250 Gewebefaktorprotein U/kg festgelegt. Bei dieser Dosis war die CBT des hämophilen Hunds bei 30 und 90 min normalisiert (Fig.3). Diese erhöhte Dosis stand jedoch mit einer Abnahme bei den Faktor V-Werten und einer geringfügigen Verlängerung der Prothrombinzeit in Zusammenhang (Tabelle 6). Daher wurden die Versuche mit einer Dosis von 100 Gewebefaktorprotein U/kg wiederholt, um die maximale Wirksamkeitsdauer zu erzielen und gleichzeitig sicherzustellen, daß andere Koagulationsfaktorwerte nicht beeinflußt wurden. Somit erhielt ein hämophiler Hund 100 Gewebefaktorprotein U/kg und eine CBT bei 12, 30 und 45 min. Interessanterweise war die CBT bei 15 min noch immer abnormal (Fig.3), und die Stase trat erst 30 min nach der Infusion ein. Dies ist eine Beobachtung, die mit den Ergebnissen übereinstimmt, die man mit herkömmlichen Hundefaktor VIII-Präparaten bei Nichtinhibitor-hämophilen Hunden erzielte. Bei dieser Dosis war die CBT bei 45 min normal. Blutproben wurden abgenommen und auf Hinweise von konsumptiver Koagulopathie analysiert (Tabelle 6). Faktor V-Werte, Prothrombinzeiten, Thrombin-Klumpungszeiten und Plättchenwerte blieben durch die Behandlung unverändert. Somit konnte man die Wirksamkeit von Gewebefaktorprotein in vivo bei einer Dosis aufzeigen, die keine disseminierte intravaskuläre Koagulation bewirkt. Die Umgehungsaktivität wurde mittels einer Dosis von 100 Gewebefaktorprotein U/kg und CBTs bei 30 und 45 min in einem dritten hämophilen Hund bestätigt. Während die Wirksamkeit zu beiden Zeitpunkten aufgezeigt wurde, trat bei 45 min ein gewisses Maß an erneuter Blutung ein.
Beispiel 4 Funktionale Homologie zwischen Rinder- und H uman-Gewebefaktorproteinen
• Die funktionale Homologie zwischen Rinder- und Human-Gewebefaktorproteinen wurde mittels des chromogenen Gewebefaktorassays aufgezeigt. Rinder- Gewebefaktorprotein wurde wie oben gereinigt. Human-Gewebefaktorprotein wurde aus Plazenten unter Verwendung des Verfahrens von Freyssinet et al., Thrombosis and Haemostasis 55(1): 112-118 (1986) einschließlich Affinitätschromatographie auf Concanavalin-A-Sepharose teilweise gereinigt. Das aus dieser Säule eluierte Material wurde dann auf einer Aca 44-Ultrogel Säule einer Gelfiltrationschromatographie unterzogen, wie dies oben für Rinderprotein beschrieben wird.
• Rinder- und Humanfaktorproteine (in Tabelle 5 als BTFP bzw. HTFP bezeichnet) wurden im bereits beschriebenen chromogenen Gewebefaktor-Standardassay geprüft. Proben, die vor dem Assay relipidiert worden waren, wiesen eine starke Gewebefaktorcofaktor-Aktivität auf (in Tabelle 5 als BTFP + P1 bzw. HTFP + P1 bezeichnet). Proben, die nicht relipidiert worden waren, wiesen im Assay keine Cofaktoraktivität auf (BTFP - P1 und HTFP - P1).
• Die Proteinkonzentrationen in diesen Proben waren bei Rinder-Gewebefaktorprotein 0,59 mg/ml und bei Human-Faktorprotein 13,55 mg/ml. Die Differenz bei der Proteinkonzentration war die Folge eines Unterschieds des Reinigungsgrads. Diese Ergebnisse beweisen die funktionale Homologie zwischen den Gewebefaktorproteinen aus Human- und Rinderquellen. Tabelle 1 Reingung von Rindergehirn-Gewebefactor Probe Protein Gewebefactoraktivität Gesamt Reinigung Acerton-Hirnpulver Überstand der TBS-Waschung 0.1% Triton-überstand 2% Triton-Extract Con A Sepharose-überstand Con A Sepharose-Eluat Con A Eluat nach Konzentration Ultrogel AcA 44 Pool Tabelle 2 Charakterisierung von teilweise gereinigtem Gewebefaktorprotein Probe Chromogener Assay Gerinnungszeit TBS/0,1% Triton-Puffer Gewebefaktorprotein Relipidiertes TFP Tabelle 3 Ergebnisse der in vitro Gewebefaktorprotein-Blutungskorrektur Nr. Hase Infusion FaktorVIII U/ml Blutungszeit 1. Kontrolle 2. Test * 233 U/kg der Gewebefaktoraktivität nach der Relipidation, gemessen durch den chromogenen Assay. Tabelle 4 Überleben nach Infusion von Gewebefaktorprotein Nr. Gew.(kg) Zeit 0 Infusion von TFP*/Insgesamt U U/kg 72 Stunden Infusion von TFP*/Insgesamt U U/kg 120 Stunden Überleben (+/-) * Einheiten wurden nach der Relipidation von Gewebefaktorprotein-Proben durch einen chromogenen Assay bestimmt. Tabelle 5 Funktionale Homologie zwischen Rinder- und Humangewebefaktor Probe Assayverdünnung dekad. Absorptionsvermögen Gewebefaktoraktivität Tabelle 6 Blutparameter in normalen und hämophilen Hunden nach der Bolusinjektion von Gewebefaktorprotein Hund Dosis Gewebefaktorprotein Probenzeit nach Infusion Faktor V Plättchen Koagulationsassay-Ergebnisse nach Bolusinjektion von Gewebefaktorprotein in normalen und hämophilen Hunden. N= normaler Hund H1 und H2 = hämophile Hunde ND = nicht bestimmt

Claims (19)

1. Gewebefaktorprotein, dem Phospholipid fehlt, zur pharmazeutischen Verwendung.

2. Verwendung von Gewebefaktorprotein, dem Phospholipid fehlt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Blutungsstörungen, die durch eine Neigung zur Blutung gekennzeichnet sind.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin die Blutungsstörung mit einem Mangel an einem Koagulationsfaktor assoziiert ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Koagulationsfaktormangel ein Mangel an FaktorVIII ist.

5. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Koagulationsfaktormangel ein Mangel an Faktor IX ist.

6. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Koagulationsfaktormangel ein Mangel an Faktor XIII ist.

7. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Koagulationsfaktormangel ein Mangel an Faktor XI ist.

8. Verwendung nach Anspruch 2, worin die Blutungsstörung eine erworbene Koagulationsstörung ist.

9. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 2 - 8, worin das Medikament zur intravenösen Verabreichung hergestellt wird.

10. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 2 - 8, worin das Medikament zur oralen Verabreichung hergestellt wird.

11. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 2 - 10, worin das Medikament eine therapeutisch wirksame Dosis im Bereich von etwa 50 E/kg bis 250 E/kg umfaßt.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin die therapeutisch wirksame Dosis im Bereich von etwa 75 E/kg bis 200 E/kg liegt.

13. Gewebefaktorprotein-Antagonist zur pharmazeutischen Verwendung.

14. Verwendung von Gewebefaktorprotein-Antagon ist zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tieres mit einer hyperkoagulativen Blutungsstörung.

15. Therapeutische Dosierungsform zur Verabreichung an ein Tier mit einer Blutungsstörung, die durch eine Neigung zur Blutung gekennzeichnet ist, umfassend Gewebefaktorprotein, dem Phospholipid fehlt, und ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel.

16. Dosierungsform nach Anspruch 15, die steril ist.

17. Dosierungsform nach Anspruch 15, die zu Blut isotonisch ist.

18. Dosierungsform nach Anspruch 15, worin das Vehikel eine lipophile Formulierung mit verzögerter Freisetzung ist.

19. Therapeutische Dosierungsform zur Verabreichung an ein Tier mit einer Blutungsstörung, die durch einen hyperkoagulativen Zustand gekennzeichnet ist, umfassend einen Gewebefaktorprotein-Antagonisten und ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel.