AT408612B - Verwendung von mindestens 2 gerinnungsfaktoren zur herstellung eines pharmazeutischen präparats - Google Patents
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Description
AT 408 612 B
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens 2 Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase oder Pro-Prothrombinase und frei von Phospholipiden sind, zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats nach Patent Nr. 407 116 zur Behandlung nicht-hämophiler Patienten.
Die Prothrombinase ist ein Enzym-Substratkomplex, der sich an einer Phospholipidoberfläche bildet und die Aktivierung von Prothrombin ermöglicht. Die Prothrombinase besteht definitionsgemäß aus dem Faktor II (Prothrombin), dem aktivierten Faktor X (Faktor Xa), den Kofaktor V bzw. Va, Phospholipiden und Calciumionen. Diese Faktoren liegen in vivo als transienter Komplex zur Aktivierung des Prothrombins und Bildung des Thrombins vor.
Eine entsprechende Pro-Prothrombinase ist als Komplex von Faktoren definiert, die zumindest teilweise modifiziert bzw. aktiviert zur Bildung einer Prothrombinase vorliegen. Die Pro-Prothrombinase ist daher als Vorstufe der Prothrombinase und als Komplex zu verstehen, bei welchem eine oder mehrere Komponenten in ihren Vorstufen, als Zymogene oder als Proformen vorliegen und der aufgrund von Affinitäten der Komponenten zueinander gebildet wird.
Gemäß dem Stammpatent wird vorgesehen, die mit der bisher bekannten Therapie von Haemophilie A-Patienten mit einer Faktor Vlll-Hemmkörperhaemophilie verbundenen Probleme zu vermeiden und ein Therapieprinzip für die Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, insbesondere für die Behandlung von Faktor Vlll-Hemmkörperhaemophilie, zur Verfügung zu stellen, welches u.a. eine einfache Anwendung, einen effektiven Wirkungseintritt, eine verlängerte Halbwertszeit sowie eine Vermeidung von thrombogenen Nebenwirkungen ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gemäß dem Stammpatent mit einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen enthaltend mindestens zwei Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase oder Pro-Prothrombinase sind, als aktive Komponenten, insbesondere mit einer Präparation enthaltend gereinigtes Prothrombin und gereinigten Faktor Xa als aktive Komponenten, gelöst, wobei vorzugsweise einer der Faktoren aktiviert ist. Die Komponenten sind vorzugsweise zumindest so weit gereinigt, daß sie von endogenen, d.h. aus dem Ausgangsmaterial stammenden, Phospholipiden, aber auch insbesondere von Phospholipidvesikeln, befreit sind.
Damit wird einerseits eine vorzeitige Thrombinbildung unterbunden und die Stabilität der pharmazeutischen Präparation gewährleistet und andererseits das Risiko von thromboembolischen Nebenwirkungen minimiert.
Ein Gemisch bzw. Komplex aus mindestens zwei Bestandteilen der Prothrombinase wird als "partielle Prothrombinase" verstanden.
Neben den Bestandteilen der Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase sind vorteilhafterweise weitere Faktoren der Blutgerinnung und Fibrinolyse enthalten, um eine attenuierte Wirkung, insbesondere eine Verstärkung, Abschwächung, Beschleunigung oder Verzögerung der Hämostase, zu erzielen. Dementsprechend können Aktivatoren oder Proaktivatoren der Blutgerinnung, darunter Faktoren der intrinsischen oder extrinsischen Blutgerinnung, als Zymogen oder als aktivierte Faktoren, sowie deren Agonisten oder Antagonisten bzw. Inhibitoren weiters enthalten sein. Daneben sind auch die entsprechenden Kombinationen als Präparate möglich, die separat zur Anwendung kommen. Dazu zählt die Kombination mit einem Fibrinogenpräparat, die vor allem für die lokale Applikation geeignet ist.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform des Stammpatents besteht die pharmazeutische Präparation jedoch im wesentlichen aus der "partiellen Prothrombinase", wobei vorzugsweise die Bestandteile der Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase als Komplex gebunden vorliegen. Dieser Komplex kann in einfacher Weise gereinigt und behandelt werden, insbesondere zur Inaktivierung von molekularen oder viralen Pathogenen chemisch und/oder physikalisch behandelt werden.
Die Faktoren der pharmazeutischen Präparation sind in einer Form enthalten, die die Aktivierung mindestens eines Faktors ermöglicht bzw. in der mindestens ein Faktor bereits aktiviert ist. Als Faktoren sind in der pharmazeutischen Präparation vorzugsweise jene enthalten, die aus der Gruppe bestehend aus den Faktoren II, V, Va, X und Xa ausgewählt sind.
Als Präparation einer partiellen Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase werden im Stammpatent vorzugsweise Kombinationen der Faktoren II und V bzw. Va sowie X und V bzw. Va zur Verfügung gestellt. Dabei ist besonders bevorzugt, daß die Präparation im wesentlichen aus 2
AT 408 612 B diesen Kombinationen besteht. Gleichermaßen ist auch eine Pro-Prothrombinase bestehend aus den Faktoren II und X, gegebenenfalls in Kombination mit Faktor V bzw. Va, eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung des Stammpatents.
Dabei können native Faktoren, etwa aus Plasma oder einer Plasmafraktion gewonnene Proteine bzw. deren Äquivalente, die beispielsweise von rekombinanten Nukleinsäuren kodiert werden, eingesetzt werden. Des weiteren eignen sich aber auch entsprechende Derivate, welche die modifizierten Proteine oder Fragmente umfassen, solange sie aktivierbar sind bzw. die entsprechende Aktivität aufweisen, um die Generierung von Thrombin zu modulieren.
Die Präparation hat den Vorteil, daß sie trotz der hohen Stabilität in vitro auch in vivo solange stabil ist, bis sich dessen Wirksamkeit durch die Aktivierung von Prothrombin und die Entwicklung von Thrombin am Ort der Wunde bzw. Blutung zeigt. Durch den Kontakt mit den Blutungsmarkern, insbesondere phospholipidhältigen Oberflächen wird in situ Thrombin generiert und die Hämostase gefördert. Aufgrund der lokalen Wirksamkeit werden systemische Nebenwirkungen, wie z.B. throm-boembolische Komplikationen, vermieden.
Um eine kontrollierte Beeinflussung der Hämostase zu bewirken, ist es bevorzugt, hochgereinigte Faktoren einzusetzen, die von störenden Verunreinigungen, insbesondere von einer Thrombinaktivität, befreit sind. Dafür eignen sich im wesentlichen Faktoren, die durch chromatographische Reinigungsverfahren, wie der lonenaustauschchromatographie, Hydrophoben Chromatographie, Affinitätschromatographie und/oder Molekularausschlußchromatographie gereinigt sind. Damit können jeweils spezifische Aktivitäten von mindestens 50% der theoretischen Reinheit, insbesondere mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 90% bis zur theoretischen Reinheit für den Einzelfaktor erreicht werden. Dementsprechend ist es auch bevorzugt, Faktoren zu verwenden, die im wesentlichen frei von Denaturierungsprodukten sind und daher als gereinigte aktive Faktoren, Enzyme bzw. aktivierbare Zymogene vorliegen.
Es ist weiters auch bevorzugt eine Behandlung zur Inaktivierung von infektiösen Krankheitserregern vorzunehmen, beispielsweise durch eine Behandlung mit Chemikalien und/oder eine physikalische Behandlung, wie die der Hitzebehandlung, Bestrahlung bzw. der Filtration, insbesondere der Nanofiltration. Gemäß einer bevorzugten Variante sind die Faktoren der pharmazeutischen Präparation des Stammpatents mit Detergentien behandelt, was einerseits zur Inaktivierung von Viren führt und andererseits möglicherweise vorhandene Phospholipide solubilisiert.
Phospholipide können in Präparationen von Blutgerinnungsfaktoren beispielsweise aus Plasma oder aus einer Plasmafraktion bzw. aus einer Zellkultur enthalten sein. Die spezielle Behandlung der Faktoren zur Abtrennung der natürlicherweise vorhandenen Phospholipide umfaßt einerseits die Solubilisierung dieser und andererseits die Abtrennung der Phospholipide durch die erwähnten Reinigungsverfahren.
Obwohl das Präparat in Kombination mit exogenen Phospholipiden eingesetzt werden kann, sind gemäß einer weiteren bevorzugten Variante der Präparate des Stammpatents diese frei an zugesetzten Phospholipiden und enthalten weniger als 0,01 mg Phospholipide/E Prothrombin, was aufgrund der möglichen thrombogenen Wirkung von Phospholipiden zu einer weiteren erheblichen Verringerung des Thrombogenizitätsrisikos führt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Präparate frei von nachweisbarem Phospholipid.
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform des Stammpatents enthält die Präparation weiters Magnesiumionen. Diese Ionen wirken kompetitiv zu Calciumionen und können die Calciumionen in der Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase verdrängen. Damit wird eine vorzeitige Thrombinbildung in einer Lösung der Präparation unterbunden und damit diese soweit stabilisiert, daß sie in einer Lösung auch nach Stunden stabil bleibt.
Es hat sich herausgestellt, daß die pharmazeutische Präparation sogar als stabile Infusionslösung zur Verfügung gestellt werden kann, vor allem wenn gewährleistet ist, daß sie keine freien Calciumionen enthält. Zur Komplexierung der Calciumionen eignet sich auch ein Gehalt an einem pharmazeutisch akzeptablen Chelatbildner, beispielsweise EDTA, und verwandte Strukturen, wie Citrat.
Ein Komplex, bestehend aus mindestens zwei Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase oder Pro-Prothrombinase sind, insbesondere in hochgereinigter Form, hat als "partieller Prothrombinase-Komplex" grundlegende Bedeutung. Die Aktivität eines Präparates auf Basis dieses Komplexes kann durch den Zusatz von Calciumionen, wie Calciumchlorid, um ein Viel- 3
AT 408 612 B faches beschleunigt werden.
Das Präparat gemäß dem Stammpatent weist eine FEIBA-vergleichbare biologische Wirksamkeit in Tiermodellen auf und ist in der Lage, die Gerinnungszeit eines Faktor Vlll-Inhibitorplasmas deutlich zu verringern. Es kann die verlängerte Blutungszeit und Blutungsneigung von Faktor VIII-Inhibitorkaninchen und von von Willebrand-Faktor-Inhibitorkaninchen gänzlich normalisieren. Durch das Bereitstellen von gereinigten Blutgerinnungsfaktoren, z.B. von gereinigtem Prothrombin und gereinigtem Faktor Xa, ist die Toxizität des Präparates im Vergleich zu FEIBA deutlich reduziert. So erweist sich beispielsweise die effektive Kombination von Faktor Xa und Prothrombin im Wess-ler-Thrombose-Modell (J.Appl.Phys. 14 (1959), 943-946) als negativ, d.h., es können für diese Kombination auch bei sehr hohen Dosen keine thrombogenen Effekte im Wessler-Modell nachgewiesen werden.
Bei diesem Thrombogenitätsmodell werden Kaninchen mit Pentobarbital narkotisiert, dann unter zusätzlicher Lokalanästhesie die Vena jugularis freipräpariert und mit losen Ligaturen im Abstand von 2 cm versehen. Schließlich wird die zu testende Substanz, in die der Vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene innerhalb von 15 injiziert. Nach weiteren 25 werden die Ligaturen zugezogen und 10 min gewartet bis das abgebundene Venenstück entnommen und in einer mit Citratpuffer gefüllten Petrischale aufgeschnitten und bewertet werden kann. Die Bewertungskriterien, modifiziert nach Wessier, sind: keine Thrombenbildung = 0, wenige kleine Thromben = 0,5 -1, wenige mittelgroße und viele kleine Thromben = 2, viele mittelgroße Thromben = 3, wenige große Thromben = 3,5, ein zusammenhängender Thrombus = 4.
Die Komponenten des pharmazeutischen Präparates sind vorzugsweise bis zu einer derartigen Reinheit aufgereinigt, daß es sogar bei einer Dosis von mindestens 150 E Prothrombin/kg frei an thromboembolischen Nebenwirkungen, ausgedrückt durch einen Score im Wessler-Thrombose-modell von höchstens 3, vorzugsweise höchstens 2, insbesondere weniger als 2 Punkten, ist. Prothrombin ist im erfindungsgemäßen Kombinationspräparat, vorzugsweise in einer spezifischen Aktivität von mindestens 5 E/mg Protein, noch bevorzugter mindestens 6, insbesondere mindestens 7, entsprechend 50, 60 oder 70 % der theoretischen Reinheit, enthalten. Die eingesetzte Faktor X- bzw. Xa-Präparation sollte vorzugsweise eine spezifische Aktivität von mindestens 100 E/mg Protein aufweisen, wobei Faktor Xa vorzugsweise vorwiegend als Faktor Xaß enthalten ist. Faktor V bzw. Va wird als Cofaktor in einem etwa äquimolaren Verhältnis zum Gerinnungsfaktor der partiellen Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase eingesetzt. Das Verhältnis beträgt vorzugsweise (0,01-2):1 (mol/mol), am meisten bevorzugt (0,5-2):1.
Das eingesetzte Präparat sollte möglichst frei an Thrombin sein, wobei die Freiheit an Thrombin durch geeignete, vorzugsweise chromogene Tests, nachgewiesen werden kann (z.B. mit dem chromogenen Substrat TH-1 der IMMUNO AG.).
Es zeigte sich, daß, wenn die Gerinnungsfaktoren, wie z.B. Prothrombin und Faktor Xa, im Präparat gemäß dem Stammpatent als Komplex vorliegen, das Präparat eine erhöhte Stabilität gegenüber herkömmlichen Präparaten aufweist und der Komplex darüberhinaus noch einer weiteren Behandlung zur Reinigung und/oder Inaktivierung von Viren unterzogen werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Präparates umfaßt dieses weiters Antithrombin III in stabilisierenden Mengen, gegebenenfalls gemeinsam mit Heparin, wobei jedoch auch bei einem solchen Präparat die Freiheit an thromboembolischen Nebenwirkungen gemäß dem Wessler-Test in Abwesenheit bzw. auch nach Demaskierung des Heparins, d.h. Neutralisation und/oder Abtrennung des Heparins, nachgewiesen werden kann, in dem Sinne, daß der Wert von 3 Punkten nicht erreicht wird.
Das Kombinationspräparat gemäß dem Stammpatent enthält bevorzugterweise weniger als 0,1 E Faktor VIII:C oder Faktor VIII:Ag/E Prothrombin bzw. weniger als 0,1 E Faktor IX/E Prothrombin bzw. weniger als 0,1 E Faktor X/E Prothrombin. Dadurch kann die unerwünschte Bildung von bzw. Reaktion mit Antikörpern gegen diese Proteine effizienter hintangehalten und das Risiko von Nebenwirkungen verringert werden.
Es hat sich nun überraschenderweise herausgestellt, daß mit der Präparation des Stammpatents auch bei nicht-hämophilen Patienten akute Blutungen, eine gesteigerte Blutungsneigung bzw. ein erhöhtes Blutungsrisiko effektiv behandelt werden können. Die Präparation des Stammpatent ist neben den bereits im Stammpatent genannten Indikationen der verschiedenen Formen der Hämophilie, d.h. Hämophilie A und B sowie Inhibitorhämophilie, auch bei nicht-hämophilen Patien- 4
AT 408 612 B ten anwendbar. Zu den nicht-hämophilen Patienten zählen auch jene, die Blutgerinnungsstörungen aufgrund von Inhibitoren gegen Blutfaktoren aufweisen, welche nicht Faktor VIII oder Faktor IX sind. Weiters können Patienten behandelt werden, die eine gestörte Thrombingeneration zeigen, welche durch das Fehlen oder einen funktionellen Defekt eines oder mehrerer Faktoren der extrin-sischen oder intrinsischen Gerinnung oder bei Bildung von Antikörpern gegen einen oder mehreren dieser Faktoren oder durch Fehlen des zellulären Rezeptors für einen oder mehreren dieser Faktoren verursacht ist. Nach Gabe einer Präparation gemäß dem Stammpatent kommt es in vivo gegebenenfalls zu einer gerinnungsfördemden Wirkung, wodurch eine Behandlung, nämlich prophylaktische bzw. therapeutische Verabreichung möglich wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung von mindestens 2 Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase sind, zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation gemäß Patent Nr. 407 116 zur Behandlung von akuten Blutungen, einer gesteigerten Blutungsneigung bzw. einem erhöhten Blutungsrisiko bei nicht-hämophilen Patienten.
Im speziellen können Zustände aufgrund eines gestörten Aggregationsverhaltens von Blutplättchen oder Thrombopathien, z.B. Storage-Pool Defekte, oder bedingt durch Mangel- oder Dysfunktion von plättchenassoziierten Proteinen, aber auch Blutungszustände bedingt durch Plättchenmangel (Thrombozytopänie) behandelt werden. Eine Nebenwirkung einer Antikoagulantien-Therapie liegt in der Heparin-induzierten Thrombozytopänie, die ebenfalls eine Indikation für die erfindungsgemäße Präparation darstellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher die Verwendung von mindestens 2 Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase sind, zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von Blutungen aufgrund einer Thrombozytopänie, insbesondere zur Behandlung einer Heparin-induzierten Thrombozytopänie.
In diesem Zusammenhang ist es von Vorteil, daß die nach der erfindungsgemäßen Verwendung hergestellte pharmazeutische Präparation unter Umständen eine primäre hämostatische Aktivität aufweist. Die hergestellte pharmazeutische Präparation kann durch die Kombination mit Proteinen mit primärer hämostatische Aktivität verstärkt werden. Dafür eignet sich vor allem ein von Willebrand Faktor-Protein bzw. eine Fraktion des von Willebrand Faktors mit einer definierten Kollagenbindungsaktivität.
Eine weitere Indikation zur Behandlung von Patienten mit Blutgerinnungsstörungen liegt in der Verhinderung bzw. Behandlung von Blutungen, die im Zusammenhang mit der von Willebrand's Disease auftreten. Diese Krankheit mit und ohne der Prävalenz von Gerinnungsfaktorinhibitoren bringt eine erhöhte Blutungsneigung oder ein Blutungsrisiko mit sich und führt in vielen Fällen zur schwer kontrollierbaren Blutungen. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Präparation ist es möglich, eine derartige Blutung rasch zum Stillstand zu bringen.
Somit wird erfindungsgemäß ein Set zur Behandlung von Patienten mit Blutgerinnungsstörungen zur Verfügung gestellt, welches die folgenden Komponenten umfaßt: a) eine pharmazeutische Präparation enthaltend mindestens 2 Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase und frei von Phospholipiden sind, und b) ein Protein mit primärer hämostatischer Aktivität, insbesondere vWF.
Schwer kontrollierbare Blutungen können fallweise als Nebenwirkung einer Therapie mit synthetischen, halbsynthetischen und biologischen Gerinnungsinhibitoren bzw. Antikoagulantien oder Thrombozytenfunktionshemmern auftreten. Diese Substanzen greifen unmittelbar bzw. mittelbar in das Gerinnungssystem ein und können den natürlichen Gerinnungsvorgang in unerwünschter Weise stören. Es besteht daher Bedarf für Antagonisten für diese Substanzen. Im Stand der Technik ist die Verwendung eines Prothrombinkomplexes oder einer FEIBA-Präparation zur Behandlung von Blutungen, die durch eine Antikoagulantien-Therapie verursacht sind, bekannt. Siehe dazu Irani M S et al., The American Journal of Cardiology, Vol. 75, Feb. 15, 1995, p 422; Fareed J et al., Haemostasis 1991, Vol. 21 (suppl. 1) p 64-72; und Fareed J et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 1991, Vol. 17, No. 2, p 137.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die genannten Gerinnungsfaktoren zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation gemäß dem Stammpatent zur Behandlung von Blutungen im Rahmen einer Antikoagulantien-Therapie, insbesondere zur 5
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Herstellung einer pharmazeutischen Präparation als Antidot für einen Gerinnungsinhibitor bzw. für ein Antikoagulans oder für einen Thrombozytenfunktionshemmer verwendet. Wesentlich ist dabei, daß ein mit der Gegenwart von Phospholipiden verbundenes Thromboserisiko vermieden wird. Gerade bei Patienten, die mit Antikoagulantien therapiert werden, besteht ein erhöhtes Thromboserisiko. Erfindungsgemäß kann jedoch auf die Verwendung der Phospholipide verzichtet werden, wodurch überraschenderweise die Antidotwirkung noch spezifischer wird.
Die erfindungsgemäße Verwendung betrifft vor allem die Antagonisierung eines Gerinnungsinhibitors bzw. Antikoagulans, welche den Faktor Xa oder Thrombin mittelbar oder unmittelbar inhibieren. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine Substanz antagonisiert, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus APAP ((2S)-2-[4-[[(3S)-1-Acetimidyl-3-pyrrolidinyl]oxy]phenyl]-3-(7-amidino-2-naphthyl)-propionsäurehydrochlorid-pentahydrat), Benzamidinderivat, Hirudin, Heparin, Heparinanaloga, insbesondere Pentasaccharide, AT Ill-Heparinkomplex, AT III, Antistasin, "Tick-Anticoagulant Peptide", inaktive Gerinnungsfaktoren, insbesondere "active site" inhibierte Gerinnungsfaktoren, TFPI, kompetitive Liganden für Thrombozytenmembranoberflächenrezeptoren, insbesondere Antikörper gegen GP llb/llla, und deren gentechnisch oder synthetisch hergesteilten Analoga, insbesondere Peptide, sowie orale Antikoagulantien. Zu den inaktiven Gerinnungsfaktoren zählen vor allem derivatisierte, mutierte, fragmentierte, chemisch oder physikalisch inaktivierte bzw. inhibierte Faktoren der intrinsischen bzw. extrinsischen Blutgerinnung, welche in kompetitiver Weise mit dem nativen Faktor in Wechselwirkung treten können.
Die Antagonisierung eines Thrombozytenfunktionshemmers ist vor allem im Fall von Ticlopidin oder Acetylsalicylsäure indiziert.
Akute Blutungen sind vor allem im Bereich des Gehirns sehr kritisch. Deshalb besteht der Bedarf der Verhinderung bzw. Behandlung von intracraniellen Blutungen, z.B. intraventrikuläre Hä-morrhagie (IVH). Ein erhöhtes Risiko für intracranielle Blutungen besteht vor allem bei Patienten mit einer Schädigung der Blutgefäße bzw. bei gestörter Thrombingenerierung. Die erfindungsgemäße Präparation ist auch speziell für diese Indikation geeignet, wobei vor allem die verbesserte Behandlung von Frühgeburten ermöglicht wird.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung zu den genannten Indikationen werden jeweils die entsprechenden Sets zur Verfügung gestellt, welche als eine Komponente die erfindungsgemäße pharmazeutische Präparation enthält. Weiters können Substanzen, die den hämo-statischen Effekt verstärken, wie z.B. ein Protein mit primärer hämostatischer Aktivität, insbesondere vWF enthalten sein. Daneben enthält ein Set zur Antikoagulantien-Therapie natürlich das entsprechende Antikoagulans, und die erfindungsgemäße pharmazeutische Präparation als Antidot.
Die Dosierung der Präparate orientiert sich an der Dosierung der äquivalenten Komponenten in FEIBA. Die Factor Eight Inhibitor Bypassing-Aktivität (FEIBA) wird definiert als jene Aktivität einer derartigen Präparation, die die Gerinnungszeit eines Faktor Vlll-Inhibitorplasmas in einem Gerinnungstest, wie er in AT 350726 beschrieben wird, auf 50 % des Leerwertes reduziert. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Präparate im Vergleich zu FEIBA liegen bedingt durch die hohe Reinheit der Komponenten in einer reduzierten Belastung des Patienten mit Plasmaproteinen. Insbesondere ist durch das Fehlen von Faktor VIILAg die anaphylaktische Nebenwirkung ausgeschlossen. Es ist daher möglich, die Präparate in einer Dosis zu verabreichen, welche beispielsweise mindestens 50 E Prothrombin/kg Körpergewicht umfaßt, wobei diese Dosis auf Grund der Nebenwirkungsfreiheit erstmalig bei dieser Art von Präparaten sogar in einer Bolusinjektion verabreicht werden kann, womit die ansonsten langwierige Verabreichung derart hoher Dosen vermieden werden kann. Üblicherweise werden die Präparate in einer Dosis von beispielsweise 50 bis 150 E Prothrombin/kg Körpergewicht verabreicht, wobei die maximalen Dosen jedoch auch weit über den 150 E/kg Körpergewicht liegen können (z.B. bis 300 bzw. bis 500), ohne daß es zu thromboembolischen Nebenwirkungen kommen kann.
Gegenstand der Anmeldung sind auch Darreichungsformen der pharmazeutischen Präparate, welche eine Dosis von mindestens 50 E Prothrombin/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen 50 und 500 E/kg Körpergewicht, umfassen.
Diese Darreichungsformen können bereits zur direkten Verabreichung vorgesehene Ampullen, Spritzen, oder ähnliche direkt oder indirekt applizierbare Formen sein. Dazu zählen Behälter geeignet zur Infusion, intramuskulären bzw. subkutanen Anwendung oder Sets, bestehend aus Behälter 6
AT 408 612 B mit den Wirkstoffen als Lyophilisat und einem Behälter mit einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung, geeignet zur Rekonstitution des Lyophilisats. Üblicherweise enthält die pharmazeutisch akzeptable Lösung bzw. das pharmazeutische Präparat Salze, Konservierungsstoffe, Puffer und dgl. in einer wässerigen Lösung (siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Aufl., Easton: Mack Publishing Co., S, 1405-1412 und 1461-1487 (1975) und The National Formulary XIV., 14. Aufl., Washington: American Pharmaceutical Association (1975)). Beispielhaft für nicht-wässerige Lösungen sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wässerige Träger sind beispielsweise Wasser, gegebenenfalls mit Alkohol gemischt, Salzlösungen (NaCI), Ringer's Dextrose, etc.. Als Konservierungsstoffe können antimikrobielle Substanzen, Antioxidantien, Chelatbildner oder Inertgase verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Präparate eignen sich auch zur lokalen Behandlung, wobei Applikationsformen gewählt werden, die am Ort einer Blutung wirksam werden. Dazu zählen Feststoffe oder Flüssigkeiten, vorzugsweise in Form eines Puders, Pflasters bzw. Wundauflage, Salben, Suppositorien, Kapseln, insbesondere magensaftresistente Kapseln, aber auch Tropfen oder Sprays.
Die eingesetzten Gerinnungsfaktoren können sowohl plasmatischen Ursprungs als auch durch rekombinante DNA-Technologie hergestellte Proteine sein. Wesentlich ist in beiden Fällen, daß sie in gereinigter Form, insbesondere in einer von endogenen und exogenen Phospholipiden befreiter Form im pharmazeutischen Präparat vorliegen.
Bevorzugterweise werden die pharmazeutischen Präparate in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt, was die bekannten Transport-, Lagerungs- und Applikationsvorteile mit sich bringt. Als Rekonstitutionslösung bietet sich eine pharmazeutisch akzeptable Lösung an, die gegebenenfalls ATIII bzw. Heparin enthält. Durch den hohen Reinheitsgrad der Komponenten der Präparate können diese nach geringer Lösungszeit, vorzugsweise unter 5 min, insbesondere unter 1 min, zu einer optisch klaren Lösung mit beispielsweise mindestens 10 E Prothrombin/ml rekonstituiert werden, wobei sogar Konzentrationen von bis zu 200 E Prothrombin/ml Lösung erreicht werden können. Eine optisch klare Lösung ist dabei definiert durch ein Maximum der Extinktion bei 600 nm von 0,1 (für eine Lösung mit mindestens 5 Gew.% Proteingehalt, bei einer Schichtdicke von 1 cm), bezogen auf die reine (Puffer-) Lösung als Referenz. Alternativ dazu gilt auch eine Lösung mit weniger als 70 Light Scattering Units (LSU), ermittelt durch Messung im Nephelometer bei 340 nm und einer Schichtdicke von 1 cm als klar.
Die erfindungsgemäßen Präparate sind im Gegensatz zu den bisher bekannten Präparaten zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen außerordentlich stabil, d.h., sie können für eine längere Zeitperiode vor der Verabreichung stehen gelassen werden. Beispielsspielsweise sollte FEIBA im verabreichungsfertigen Zustand gemäß der Produktinformation nicht länger als 1 Stunde stehen gelassen werden, wohingegen die vorliegenden Präparate als gebrauchsfertige Lösung auch während eines Zeitraums von 3 Stunden oder länger bei Raumtemperatur keinerlei Thrombogeni-ziät bzw. Gerinnungsaktivierung zeigen, weshalb sie auch als Infusionslösung zur Verfügung gestellt werden können, die auch über einen Zeitraum von mehreren Stunden verabreicht werden kann. Aus den gleichen Gründen ist es auch möglich, die Präparate über einen längeren Zeitraum als Infusionslösung zu verabreichen, wobei es sich gezeigt hat, daß in bezug auf die thrombo-embolischen Nebenwirkungen kein wesentlicher Unterschied zwischen einer Bolusinjektion und einer langsamen Infusion mit den erfindungsgemäßen Präparaten auftritt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die pharmazeutischen Präparate in geeigneten Applikationsvorrichtungen vorgegeben, vorzugsweise als Lyophilisat in Spritzen, welche eine in situ-Rekonstitution mit einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung erlauben. Es empfiehlt sich eine Applikationsvorrichtung, wie in Fig. 1 der Stammanmeldung gezeigt, worin die Lyophilisate von beispielsweise Prothrombin und Faktor Xa vorzugsweise getrennt aufbewahrt werden und bei Bedarf nach einer in situ-Rekonstitution mittels einer Doppel kammerspritze verabreicht werden können.
Die pharmazeutischen Präparate können, insbesondere wenn sie aus plasmatischen Proteinen oder Zellkulturen gewonnen werden, einer oder mehreren Virus-Inaktivierungsbehandlungen bzw. Behandlungen zur Virus-Abreicherung unterzogen werden, beispielsweise einer chemischen oder chemisch-physikalischen Behandlung, einer Hitze- und/oder Detergensbehandlung gemäß der EP 0 159 311, der EP 0 519 901 oder der EP 0 674 531 oder einer physikalischen Behandlung, 7
AT 408 612 B wie die der Nanofiltration.
Die Präparate ermöglichen eine sichere und einfache Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, bei welcher ein effektiver Wirkungseintritt innerhalb kürzester Zeit beobachtet werden kann. Es zeigt sich, daß der effektive Wirkungseintritt bei der Gabe des Komplexes von Faktor il und Faktor Xa schneller erfolgt, als für ein Präparat, welches ausschließlich Faktor II enthält.
Darüberhinaus ermöglichen die lange Halbwertszeit der Präparate und deren Freiheit an thrombogenen Nebenwirkungen bzw. das Ausbleiben einer anaphylaktischen Reaktion, welche zur Verstärkung des Inhibitortiters führt, eine gegenüber bekannten Verfahren erheblich verbesserte Behandlung des Patienten. Der Patient kann durch die hohe Konzentration bzw. Dosis des erfindungsgemäßen Präparates ein Wirkstoffdepot erhalten, was den Bedarf an oftmaligen Behandlungen herabsetzt. Der Patient kann also auch über einen längeren Zeitraum von mehreren Tagen ohne Behandlung bleiben und sich gegebenenfalls auch durch Selbstinjektion, eventuell subkutan, ambulant behandeln.
Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur Herstellung einer gereinigten pharmazeutischen Prothrombin-Präparation, wobei ein Prothrombinkomplexkonzentrat einer chromatographischen Reinigung unterzogen wird und die Fraktion, enthaltend Prothrombin, zu einer pharmazeutischen Präparation verarbeitet wird. Mit diesem Verfahren wird eine Prothrombin-Präparation zur Verfügung gestellt, die die Anforderungen an die Reinheit für die pharmazeutischen Präparate, insbesondere was die mit dem Wessler-Test ermittelte Nebenwirkungsfreiheit anbeiangt, voll erfüllt.
Insbesondere wird dieses Verfahren durch die Kombination der folgenden Schritte vorgenommen: - Bereitstellen eines Prothrombinkomplexpräparates in festem Zustand oder als Prothrombin-hältige Lösung, - Virusinaktivierungsbehandlung, vorzugsweise durch Hitzebehandlung, insbesondere in festem Zustand, - gegebenenfalls Lösen des Prothrombinkomplexpräparates, wobei eine Prothrombin-hältige Lösung erhalten wird, - gegebenenfalls Behandeln der Prothrombin-hältigen Lösung mit einem Erdalkalisalz als festem Träger, wobei Prothrombin adsorbiert und anschließend desorbiert wird, - gegebenenfalls ein- oder mehrmaliges Konzentrieren, vorzugsweise durch Präzipitation oder Ultra-/Diafiltration, und Gelfiltrieren der Prothrombin-hältigen Lösung, - Behandeln der Prothrombin-hältigen Lösung mit einem Anionenaustauscher, wobei Prothrombin adsorbiert und anschließend selektiv desorbiert wird, - Behandeln der Prothrombin-hältigen Lösung mit einem hydrophoben Chromatographiematerial, und - Fertigstellen der Prothrombin-hältigen Lösung zu einem pharmazeutischen Präparat.
Als Erdalkalisalz können dabei vorzugsweise Kalziumphosphat, Bariumsulfat oder Aluminiumhydroxid eingesetzt werden. Als Anionenaustauscher kommen im Prinzip alle Anionenaustauscher in Frage, die eine Affinität zu Prothrombin aufweisen, wie z.B. Anionenaustauscher auf Zellulosebasis mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sephacel®), Anionenaustauscher auf Basis von quervernetztem Dextran mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sephadex®), Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose CL6B®, DEAE-Sepharose Fast Flow®), Anionenaustauscher auf Basis von quervernetztem Dextran mit Diethyl[2-hydroxypro-pyljaminoethyl-Gruppen (QAE-Sephadex®), Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit CH2N+ (CH3)3-Gruppen (Q-Sepharose Fast Flow®, Q-Sepharose High Performance®, Q-Sepharose Big Beads®) (alle Fa. Pharmacia), sphärische Chromatographiegele, hergestellt durch Copolymerisation von N-acryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und einem anionischen Acrylderivat mit Diethylamino-ethyl-Gruppen als funktionellem Anionenaustauscher (DEAE-Tris-Acryl®), nicht kompressible Silica-Dextran-Matrizes, bei welchen poröses Silicagel in einer quervernetzten Detranmatrix eingebettet ist, mit reaktiven Diethylaminoethylanionenaustauschergruppen (DEAE-Spherodex®), Gele aus rigiden Polystyrolpartikeln, deren Poren mit einem Hydrogel gefüllt sind, welches quarternäre Amingruppen mit starker Anionenaustauscherwirkung trägt (Q-Hyper-D®) (alle Fa. Sepracor); rigide macroporöse hydrophile Oberflächen mit N+(C2H5)2 oder N+(CH3)3-Gruppen (Macroprep DEAE®, Macroprep Q® (alle Fa. BioRad); 8
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Anionenaustauscher mit Diethylaminoethyl-Diethyl(2-hydroxypropy0aminoethyl und ΟΗ2Ν+(ΟΗ3)3-Gruppen (DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Toyopearl Super-Q® (alle Fa. Tosohaas), Anionenaustauscherharze bestehend aus porösem Polymethacrylat/Polyacrylat-Gel (Protein PAK DEAE®, Fa. Waters);
Anionenaustauscher auf Basis von Copolymeren bestehend aus Oligoethylenglycol-dimethyl-acrylat, Glycidyl-methacrylat und Pentaerythrit-Dimethylacrylat mit einer hydrophoben Oberfläche (Fractogel EMD-TMAE®, Fractogel EMD-DEAE®, Fractogel EMD-DMAE®), Anionenaustauscher auf Kieselgelbasis mit porösen kugelförmigen druckstabilen Chromatographiepartikel (Licrospher 1000 TMAE®, Licrospher 1000 DEAE® und Licrospher 4000 DMAE®) (alle Fa. MERCK).
Als Gel für die hydrophobe Interaktionschromatographie wird vorzugsweise ein hydrophobes Gel auf Basis von Agarose mit Phenyl-Gruppen (Phenyl-Sepharose High Performance®; (Fa. Pharmacia), aber auch andere Chromatographiegele wie z.B. hydrophobe Gele auf Basis von Agarose mit Butyl-Gruppen (Butyl-Sepharose®), Octyl-Gruppen (Octyl-Sepharose®), Phenyl-Gruppen (Phenyl-Sepharose®, Phenyl-Sepharose Fast Flow High Sub®, Phenyl-Sepharose Fast Flow Low Sub®) (alle Fa. Pharmacia), Copolymere bestehend aus Oligoethylenglycol-dimethylacrylat, Glycidyl-methacrylat und Pentaerythrit-Dimethylacrylat mit einer hydrophilen Oberfläche (Fractogel TSK-Butyl®; Fa. MERCK), Gele auf Basis von Metacrylat (Macroprep-Methyl-HIC-Support®, Macroprep t-Butyl-HIC-Support® (alle Fa. BioRad); TSK-Gel Butyl Toyopearl®, TSK-Gel Phenyl Toyopearl® und TSK-Gel Ether Toyopearl® (alle Fa. Tosohaas)), eingesetzt.
Eine mögliche Ausführungsform dieses Verfahrens ist in Fig. 3 dargestellt.
Die Prothrombin-Präparation, welche mit diesem Verfahren hergestellt werden kann, zeichnet sich nicht nur durch eine äußerst hohe Reinheit, welche nahe der theoretisch möglichen Reinheit von 10 E/mg liegt, sondern auch dadurch, daß es sogar bei einer Dosis von mindestens 150 E Prothrombin/kg frei an thromboembolischen Nebenwirkungen, ausgedrückt durch einen Score im Wessler-Thrombosemodell von höchstens 3 Punkten, vorzugsweise höchstens 2 Punkten, insbesondere weniger als 2 Punkten ist, und darüberhinaus als Lyophilisat mit einer Lösezeit von höchstens 1 min zu einer klaren Lösung mit einer Aktivität von zumindest 10 E Prothrombin/ml bis zu 200 E Prothrombin/ml rekonstituierbar ist. Die biologische Aktivität dieses Prothrombin-Präparates wird verstanden als die enzymatische Aktivität, welche nach Aktivierung des Prothrombins erhalten wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von gereinigten Pro-thrombinase-Faktoren, insbesondere von gereinigtem Prothrombin und gegebenenfalls gereinigtem Faktor Xa zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Etablierung von supranormalen Prothrombin-Konzentrationen im Blut eines Patienten, bzw. zur Etablierung von normalen Prothrombin-Konzentrationen im Blut bei Zuständen mit erniedrigtem Prothrombin-Level.
Es zeigte sich, daß mit den vorliegenden Präparaten solche supranormalen Faktor Il-Levels sogar permanent, d.h. über längere Zeiträume erhalten werden können, was einesteils darauf zurückzuführen ist, daß Prothrombin eine für Blutgerinnungsfaktoren sehr hohe Halbwertszeit als Medikament aufweist und andererseits auch in der Nebenwirkungsfreiheit der erfindungsgemäßen Präparationen besteht, so daß sogar eine subkutane Verabreichung etwa durch Depotverabreichung möglich ist. Die supranormalen Konzentrationen von Prothrombin, die im Blut durch Gabe von gereinigtem Prothrombin und gegebenenfalls gereinigtem Faktor Xa bzw. anderen Prothrom-binase-Faktoren möglich sind, betragen zumindest 150 %, vorzugsweise sogar mindestens 200 %, entsprechend einer Aktivität von mindestens 1,5 E Prothrombin/ml Blut, vorzugsweise mindestens 2,0 bis zu 10 E/ml.
Die erfindungsgemäßen Präparate werden bevorzugt in einer Lösung mit physiologischem pH zur Verfügung gestellt, welche vorzugsweise keine freien Calciumionen enthalten. Es ist aber auch möglich, einen beispielsweise vom Faktor Xa-Aktivitätsoptimum entfernten sauren Puffer im Bereich von pH 4,5-6,5, vorzugsweise 5-6, zu verwenden, mit welchem die Stabilität des Kombinationspräparates nochmals gesteigert werden kann. Es versteht sich, daß sämtliche für Faktor II, V, Va, X und Xa geeigneten pharmazeutischen Zusatzstoffe und Lösungen zur verabreichungsfertigen Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate verwendet werden können.
Herstellung von Faktor X und Faktor II aus einer virusinaktivierten Plasmafraktion mittels lonenaustauschchromatographie. 9
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Eine lyophilisierte Prothrombinkomplexfaktorenpräparation, welche die Faktoren II, IX, X sowie Protein C und Protein S enthielt, wurde nach der Methode von Brummelhuis, H.G.J., Preparation of the Prothrombincomplex. In: Methode of Plasma Protein Fractionation, Curling, J.M. ed., 117-128, Academic Press, New York, (1980), hergestellt und zur Virusinaktivierung nach EP 159 311 hitzebehandelt. Entsprechend wurde das Lyophilisat (1000 E Faktor X/g, 1200 E Faktor ll/g) in destilliertem Wasser gelöst, sodaß dieses 50 000 E Faktor X/l enthielt, und auf pH 7,0 eingestellt. Nach Zusatz von 12 % (v/v) Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, 1:5 verdünnt und die Prothrombinkomplexproteinfraktion an Calciumphosphat [Ca3(P04)2] in einer Konzentration von 30 g Ca3(P04)2 pro 1 Prothrombinkomplexlösung durch einstündiges Rühren bei Raumtemperatur adsorbiert. Anschließend wurde die feste Phase durch Zentrifugation, 20 Minuten bei 5000 rpm, abgetrennt und der Niederschlag zweimal mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, enthaltend 10 % Ammoniumsulfat, durch Resuspension und erneute Zentrifugation gewaschen. Eine dritte Waschung wurde mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, enthaltend 150 mM NaCI in analoger Weise durchgeführt. Die Elution der Prothrombinkomplexfraktion erfolgte mit 1 M Natriumphosphatlösung, pH 7,0, wobei 25 ml dieser Lösung pro g Calciumphosphat 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend der verbleibende Niederschlag durch Zentrifugation wie oben abgetrennt wurde. Der Überstand wurde anschließend einer Ammoniumsulfatfällung mit 366 g Ammoniumsulfat pro I 15 h bei 4°C unter Rühren unterzogen. Das Präzipitat, enthaltend die Prothrombinkomplexfraktion, wurde wie oben abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in einem 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCI, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, aufgenommen und auf einer Säule, gefüllt mit quervernetztem Dextran (Sephadex® G-25), bei 4°C mit einem linearen Fluß von 1 cm/min gegen 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCI und 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, umgepuffert, um das Ammoniumsulfat abzutrennen. Dabei wurde im Eluatstrom die UV-Absorption bei 280 nm und die elektrische Leitfähigkeit gemessen. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und anschließend einer lonenaustauschchroma-tographie über einen Anionenaustauscher auf Basis von Agarose mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose FF®, Fa. Pharmacia) unterzogen. Die Fraktionen wurden auf einer Säule (Innendurchmesser: Gelbetthöhe =1 : 1,3) mit einem Gelvolumen von 8,2 I, 0,55 g Protein/I Gel, bei einem linearen Fluß von 0,36 cm/min aufgetragen. Die Chromatographie erfolgte bei 22°C. Vor Auftrag der Proteine war die Säule mit einem 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCI, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, äquilibriert worden. Die Elution der Proteinfraktionen erfolgte in mehreren Stufen mit einem Puffer 1 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 245 mM NaCI, pH 6,0), Puffer 2 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 270 mM NaCI, pH 6,0) und einem Puffer 3 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 400 mM NaCI, pH 6,0). Die Elution mit Puffer 1 wurde mit 2,4 Säulenvolumen durchgeführt, dabei wurde Inertprotein abgetrennt. Die Elution wurde mit 5,6 Säulenvolumen mit Puffer 2 durchgeführt, wobei hier Fraktionen gesammelt wurden, die auf Gehalt von Faktor N, Faktor X, Protein C und Faktor IX analysiert wurden. Die Faktor X enthaltenden Fraktionen, die frei von Faktor II, IX und Protein C wurden vereinigt. Durch Elution mit Puffer 3 (1,9 Säulenvolumen) wurde Faktor II desorbiert, wobei wieder Fraktionen gesammelt und auf den Gehalt an Faktor X, Faktor IX und Faktor II untersucht wurde. Die Faktor II enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt. Sowohl der Faktor II, als auch der Faktor X enthaltende Pool konnten gegebenenfalls durch Zusatz von 1 M KSCN und Inkubation bei 22°C für mehrere Stunden einer zusätzlichen Behandlung zur Inaktivierung pathogener Verunreinigungen unterworfen werden.
Reinigung von Faktor II mittels hydrophober Interaktionschromatographie
Der wie obenstehend gewonnene Faktor Il-Pool wurde durch Zugabe von Natriumchlorid auf 1,8 M NaCI eingestellt und der pH-Wert auf pH 7,0 korrigiert. Diese Lösung wurde anschließend durch hydrophobe Interaktion an ein hydrophobes Gel auf Basis von Agarose mit Phenyl-Gruppen (Phenylsepharose High Performance®, Fa. Pharmacia) adsorbiert, wobei 3 g Protein/I Gel gebunden wurden. In einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser: Gelbetthöhe = 1 : 1,9 wurde bei einem linearen Fluß von 0,25 cm/min die Proteinfraktion adsorbiert und anschließend durch Waschen mit einem Puffer (25 mM Tris-HCI, 3 M NaCI, pH 7,4) vom Inertprotein befreit. Durch 10
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Gradientenelution mit 11,5 Säulenvolumina von 3 M - 0,9 M NaCI unter gleichzeitiger Sammlung von Fraktionen wurde Faktor II von der Säule eluiert, wobei jene Fraktionen gepoolt wurden, die Faktor Il-Aktivität enthielten, aber frei von Faktor X und Faktor IX waren. Die gesammelten Faktor Il-Fraktionen wurden anschließend durch Ultra-/Diafiltration über eine Ultrafiltrationsmembran mit einem cut-off von 30 kD zehnfach aufkonzentriert und gegen einen Puffer enthaltend 4 g Trinatri-umcitratdihydrat/l, 8 g NaCI/Ι, pH 7,0, umgepuffert. Eine so hergestellte Faktor Il-Präparation wies eine spezifische Aktivität von 6,9 E/mg Protein auf. Die Bestimmung der Faktor Il-Aktivität erfolgte mit der 1-Stufen-Methode, basierend auf der Thromboplastinzeit, unter Verwendung eines Faktor Il-Mangelplasmas gegen den Internationalen Faktor Il-Standard unter Verwendung der Reagenskombination von IMMUNO, Wien. Andere Gerinnungsfaktoren waren in Gerinnungsanalysen in Spuren oder gar nicht mehr nachweisbar (Faktor VII < 0,00002 E/E Faktor II, Faktor IX 0,0002 E/E Faktor II, Faktor X 0,004 E/E Faktor II, Protein C 0,003 E/E Faktor II und Faktor VIII < 0,0002 E/E Faktor II).
Reinigung von Faktor II mittels hydrophober Interaktionschromatographie und Hydroxyl- apatitchromatographie
Als alternatives Herstellungsverfahren für einen hochgereinigten Faktor II wurde auch ein Verfahren verwendet, bei dem aus einem lyophilisierten Prothrombinkomplexfaktorenpräparat (siehe oben) durch hydrophobe Chromatographie zuerst Faktor IX abgetrennt, anschließend Faktor II isoliert und dieser dann durch Chromatographie an Hydroxylapatit hochgereinigt wurde.
Die Prothrombinkompiexfaktorenpräparation wurde wie oben gelöst und mit Detergens 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde durch lonenaustauschchromatographie auf einem Anionenaustauscher auf Basis von Agarose mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose FF®, Fa. Pharmacia) wie vorstehend beschrieben, eine Faktor II, IX und X-hältige Fraktion isoliert. Aus dieser wurde anschließend durch Interaktion mit einem hydrophoben Chromatographiematerial mit Butyl-Gruppen (Butyl-Toyopearl®, Fa. Toso Haas) die Faktor IX-enthaltende Fraktion entfernt. Der Adsorptionsüberstand wurde anschließend an ein hydrophobes Gel auf Basis von Agarose mit Phenyl-Gruppen (Phehyl-Sepharose High Performance®, Fa. Pharmacia) durch eine weitere hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt, wobei ca. 4 g Protein/I Gel adsorbiert werden konnten. In einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser: Gelbetthöhe = 1 : 1,9 wurde bei einem linearen Fluß von 0,25 cm/min die Proteinfraktion adsorbiert, anschließend durch Waschen mit 20 mM Tris-HCI, 3 M NaCI, pH 7,4, das Inertprotein entfernt und schließlich durch stufenweise Elution die Faktor II enthaltende Fraktion isoliert, die bei fallender Leitfähigkeit bei 1,9 M NaCI vom Gel desorbierte. Die Faktor II enthaltende Fraktion wurde anschließend direkt an eine Hydroxylapitit-Oberfläche Ceramik-Hydroxylapatit®, Fa. Biorad, adsorbiert. Dies erfolgte auf einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser: Gelbetthöhe = 1 : 4,8. Die Elution erfolgte bei einem linearen Fluß von 3 cm/min. Durch Elution mit einem Salzgradienten konnte Faktor II von der Säule desorbiert werden. Die Faktor II enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und über Ultra-/Diafiltration über Polysulfonmembranen mit einem cut-off von 30 kD aufkonzentriert bis die Faktor Il-Konzentration 50 - 100 E/ml betrug. Eine so hergestellt Faktor Il-Präparation wies eine spezifische Aktivität von mindestens 7 E/mg Protein auf. Andere Gerinnungsfaktoren, insbesondere Faktor IX und Faktor VIII, waren nur mehr in Spuren oder gar nicht mehr, wie im Präparat aus Beispiel 2, nachweisbar. Durch Wahl eines geeigneten Diafiltrationspuffers wurde die Faktor Il-Präparation in einem pharmazeutisch verträglichen Puffer (z.B. 4 g Trinatriumcitratdihydrat/I, 8 g NaCI/Ι, pH 7,0) übergeführt.
Gewinnung von Faktor Xa
Die wie vorstehend beschrieben hergestellte Faktor X-Fraktion wurde anschließend wie in DE 43 25 872 beschrieben zu Faktor Xab weiterverarbeitet, wobei die so gewonnene hochgereinigte Faktor Xa-Präparation in Gegenwart von 1 g/100 ml Humanalbumin lyophilisiert wurde. Ein solches Präparat war frei von anderen Gerinnungsfaktoren; der enthaltene Faktor Xa wies eine spezifische Aktivität von 120 E/mg Protein vor Zugabe zum Albumin auf. 11
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Gefriertrocknung von Faktor II
Die beschriebene, hochgereinigten Faktor II enthaltende Präparation wurde ohne Zusatz von Stabilisatoren gefriergetrocknet, wobei nach Lyophilisierung mehr als 80 % der Ausgangsaktivität erhalten blieben.
Colyophilisierung von Faktor il und Faktor Xa
Eine wie oben beschrieben hergestellte Faktor Il-Präparation wurde in einer Konzentration von 100 E/ml zu 20 ml in ein 50 ml-Fläschchen abgefüllt und bei -80°C schockgefroren. Anschließend wurde eine Lösung eines hochgereinigten Faktor Xa, der gemäß DE 43 25 872 hergestellt worden war und eine Konzentration von 500 E/ml aufwies, in einer Menge von 30 μΙ auf die gefrorene Faktor Il-Lösung dosiert. Durch das sofortige Einfrieren des geringen Volumens wurde eine Mischung von Faktor II- und Faktor Xa-Phase verhindert. Anschließend wurde gefriergetrocknet. Zur Bereitung der Infusionslösung wurde das Lyophilisat mit 20 ml A.dest. rekonstituiert, gemischt und sofort zur Verabreichung vorbereitet.
Pharmazeutische Formulierung von Faktor II, Faktor Xa und Antithrombin III und/oder
Antithrombin Ill-Heparinkomplex
Der hochgereinigte Faktor II in Kombination mit Faktor Xa und Antithrombin III oder Antithrombin Ill-Heparinkomplex wurden in einem Puffer, enthaltend 4 g Trinatriumcitratdihydrat/I und 8 g NaCI/l, pH 7,0, auf die Anwendungskonzentration verdünnt. Diese Lösungen konnten gefriergetrocknet werden, wobei eine Aktivität von zumindest 80 % der jeweiligen Komponenten erhalten blieb.
Nachweis der partiellen Prothrombinase
Die Bildung eines Komplexes aus Faktor II und Faktor Xa zur "partiellen Prothrombinase" wurde durch das in Beispiel 8 des Stammpatents beschriebene Experiment nachgewiesen.
Formulierung des Präparates im Zweikammerspritzensystem
Zur Vereinfachung der Anwendung des Mehrkomponentensystemen, wie z.B. Mischungen von Faktor II und Faktor Xa oder Faktor II, Faktor Xa und Antithrombin III, kann als Applikationsvorrichtung ein doppelter Doppelkammerspritzenkörper, wie er in AT 382 783 beschrieben ist, verwendet werden. Bei der klinischen Anwendung von lyophilisierten Mehrkomponentensystemen müßten diese sonst jeweils rekonstituiert werden und in einem definierten Verhältnis miteinander gemischt werden, bevor sie dem Patienten verabreicht werden können. Die Verfüllung der entsprechenden Lyophilisate in einem Doppelkammerspritzensystem ermöglicht eine exakte Dosierung auf eine vorherbestimmbare Aktivität des Präparates. Unter Verwendung eines solchen Systemes wird die wirksame Mischung in situ bei der Injektion hergestellt. In einer Ausführungsform liegen in den beiden Doppelkammerspritzenkörpern jeweils Lyophilisate der Wirkstoffe, Faktor II und Faktor Xa, vor, die durch Zugabe des Lösungsmittels, A.dest., aufgrund der leichten Löslichkeit der hochgereinigten Proteine sofort in Lösung treten und unmittelbar durch Weiterdrücken der Spritzenkolben nach Mischung im Mischkopf dem Patienten infundiert werden (siehe Fig. 1 des Stammpatents).
Aufgrund der hohen Stabilität des Faktor II in Lösung, eignet sich diese auch als Lösungsmittel für den Faktor Xa in der Darreichungsform einer Doppelkammerspritze. Eine Lösung von hochgereinigtem Faktor II, z.B. hergestellt gemäß Beispiel 2 des Stammpatents, in einem physiologisch verträglichen Citratpuffer (4 g Trinatriumcitratdihydrat/I, 8 g NaCI/l, pH 7,0) in einer Konzentration von 100 E Faktor ll/ml wird mit Antithrombin III, Immuno Wien, versetzt (1 mE Antithrombin lll/E Faktor II). In einer Doppelkammerspritze wird diese Lösung als Lösungsmittel für das gefriergetrocknete Pulver eines hochgereinigten Faktor Xa verwendet.
Stabilität des hochgereinigten Faktor II 12
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Faktor II wurde wie zuvor beschrieben gereinigt und als Lösung in einer Konzentration von 60 E/ml in einem Puffer, enthaltend 4 g/l Trinatriumcitratdihydrat, 8 g/l NaCI, pH 7,0, bei 5°C, bei 22°C, bei 37°C und bei 50°C gelagert. Bei den Lagerungstemperaturen 5°C und 22°C wurden Proben jeweils alle 24 h gezogen, bei der Lagerung bei 37°C und bei 50°C erfolgten die Probenentnahmen über 24 h zum Zeitpunkt 1 h, 2 h, 4 h, 8 h und 24 h. In den Proben wurde jeweils Faktor Il-Aktivität bestimmt.
Bei 5°C konnten auch noch 86 Tage nach Lagerungsbeginn mehr als 80 % der Ausgangsaktivität festgestellt werden. Bei 22°C wurde über 14 Tage mehr als 80 % der Ausgangsaktivität gefunden; bei 37°C konnten 24 h nach Lagerungsbeginn 95 % der Ausgangsaktivität wiedergefunden werden. Sogar bei 50°C wurden 8 h nach Beginn der Lagerung noch 94 % der ursprünglichen Aktivität gefunden.
Autoaktivierung und Stabilität der Präparate des Stammpatents
Präparate gemäß Beispiel 5 (Faktor II) und Beispiel 6 (Faktor Il/Xa-Komplex) des Stammpatents wurden im Vergleich zu zwei handelsüblichen Prothrombinkomplexkonzentraten in einem in vitro-Test auf ihre prothrombotischen Eigenschaften insbesondere des extrinsischen Gerinnungssystems untersucht. Vor Einsatz im Test wurde das im Prothrombinkomplexkonzentrat vorhandene Heparin entsprechend der Konzentration mit Protaminsulfat neutralisiert, um thrombo-gene Bestandteile, die durch das Heparin maskiert würden, darzustellen.
Der Analysenansatz bestand aus 250 μΙ Thrombotest® (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen), einem Präparat enthaltend Thromboplastin aus Rinderhirn und adsorbiertem Rinderplasma, welches 3 min bei 37°C vorinkubiert wurde. Anschließend wurden 50 μΙ einer Probe zugesetzt und die Gerinnungszeit mit einem Kugelkoagulometer (KC4, Amelung) bestimmt. Rinderthromboplasti-ne gelten als besonders sensitiv für aktivierte Gerinnungsfaktoren. Entsprechend kann das Testsystem eine Aussage über die in vitro-Thrombogenität der untersuchten Präparate geben. In diesem Testansatz wurde humanes Normalplasma als Kontrolle unverdünnt eingesetzt. Dieses zeigt eine Gerinnungszeit von 74 sek. Die beiden untersuchten erfindungsgemäßen Präparate zeigten unverdünnt eingesetzt Gerinnungszeiten von mehr als 100 sek, wobei die Konzentration einer möglichen Anwendungskonzentration von 30 E Faktor ll/ml entsprach. Ein handelsübliches Prothrombinkomplexkonzentrat, ebenfalls gelöst in der Anwendungskonzentration und verdünnt auf 30 E/ml, mußte mit Puffer 1 : 32 weiterverdünnt werden, um auf die Gerinnungszeit des Normalplasmas (74 s) zu kommen. Ein anderes handelsübliches, aktiviertes Prothrombinkomplexkonzentrat mußte sogar 1 : 216 mit Puffer verdünnt werden, um auf die Gerinnungszeit eines Normalplasmas von 74 s zu kommen. Anschließend wurden die erfindungsgemäßen Präparate bis zu 4 h bei Raumtemperatur gelöst gelagert und ein mal pro Stunde Proben gezogen und neuerlich die Gerinnungszeit mit Thrombotesr bestimmt. Dabei kam es zu keiner Veränderung, d.h. auch nach 4 h zeigten die unverdünnt eingesetzten Proben immer noch Gerinnungszeiten über 100 s. Aus diesen Versuchen war zu ersehen, daß die Präparate des Stammpatents gegenüber handelsüblichen Prothrombinkomplexkonzentraten ein deutlich geringeres Thrombogenitätspotential aufweisen. Lösungsverhalten des Präparates des Stammpatents
Eine hochgereinigten Faktor II enthaltende Präparation wurde, wie zuvor beschrieben, hergestellt und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat war so eingestellt, daß die Volumsaktivität nach Rekonstitution mit destilliertem Wasser 50 E/ml war. Dies war eine typische Anwendungskonzentration. Aufgrund der hohen Reinheit des Präparates konnten jedoch auch Volumskonzentrationen von 100 und mehr Einheiten Faktor II pro ml erzielt werden. Die Lösezeit des Präparates, definiert als jene Zeit die von der Zugabe des Lösungsmittels (destilliertes Wasser) bis zum vollständigen Auflösen des Pulvers, wurde bestimmt. Im Vergleich dazu wurden die Lyophilisate zweier handelsüblicher Präparate, nämlich Prothrombinkomplex und aktivierter Prothrombinkomplex, nach Angabe des Herstellers jeweils in der Anwendungskonzentration durch Zugabe von destilliertem Wasser rekonstituiert und ebenso die Lösezeit bestimmt. Die Lösezeit der untersuchten Präparate ist der Tabelle von Beispiel 13 des Stammpatents zu entnehmen. 13
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Nach erfolgter Lösung der jeweiligen Präparate wurde von diesen jeweils ein UV/VIS-Spektrum zwischen 280 und 750 nm gegen einen Citrat-Kochsaizpuffer gemessen (Fig. 5a, b und c des Stammpatents). Der Vergleich der Spektren zeigte, daß das Präparat des Stammpatents im sichtbaren Bereich bis 700 nm eine deutlich niedrigere Lichtabsorption aufwies als die Vergleichspräparate. Das Präparat des Stammpatents zeichnete sich also durch eine hervorragende Löslichkeit aus und war in gelöster Form als klare, ungefärbte Lösung, wie für ein verbessertes pharmazeutisches Präparat charakteristisch, vorliegend.
Thrombogenität des erfindungsgemäßen Präparates
Die Einzelkomponenten und Mischungen derselben des Präparates des Stammpatents wurden auf ihre thrombogene Aktivität unter Verwendung der von Wessler beschriebenen Methode, J.Appl.Phys. 14:943-946 (1959), im stasierenden venösen Blut in Kaninchen getestet.
Kaninchen wurden in Pentobarbital-Narkose versetzt, die Vena jugularis der Tiere wurde freipräpariert und mit losen Ligaturen im Abstand von 1 - 2 cm versehen. Die zu testenden Substanzen wurden den Tieren in die der freipräparierten Vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene injiziert. Die Injektion erfolgte innerhalb von 15 sek. Nach einer Wartezeit von 10-15 sek wurde das Venenstück abgeklemmt. Nach weiteren 10 min wurde das abgeklemmte Venenstück entnommen und in einem Citratpuffer in einer Petrischale aufgeschnitten und die erhaltenen Thromben mittels einer Skalierung zwischen 0 und 4 bewertet (siehe Tabelle von Beispiel 16 des Stammpatents).
Die Substanzen wurden an jeweils sechs Tieren untersucht, die je 75 E Faktor ll/kg, 0,55 E Faktor Xa/kg und 75 mE Antithrombin lll/kg entweder alleine oder in Kombination erhielten. Die zweite Tabelle von Beispiel 16 des Stammpatents gibt den Mittelwert des Wessler-Scores von jeweils sechs untersuchten Tiere wieder. Als Kontrolle wurde reiner Citratpuffer, der auch als Verdünnungspuffer verwendet wurde, herangezogen.
Es zeigte sich, daß keine der eingesetzten Komponenten, weder alleine noch in Kombinationen, eine thrombogene Aktivität im Kaninchen aufwies.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. BEISPIEL 1
Wirkung von partieller Prothrombinase in Ratten mit Plättchendefekt
Als Thrombozytopathie-Modell werden Haubenratten, die von T.B. Tschopp und M.B. Zucker (Hereditary Defect in Platelet Function in Rats, Blood 1972; 40: 217-226) beschrieben wurden, verwendet. Dieser Rattenstamm, der von S.L. Raymond und W.J. Dodds (Characterization of the Fawn-Hooded Rats as a Model for Hemostatic Studies, Thrombos Diathes haemorrh. 1975; 33: 361-369) weiter charakerisiert wurde, zeichnet sich durch abnorm gesteigerte Blutungszeit und reduzierte Plättchenaggregation aus, während Prothrombinzeit, partielle Thromboplastinzeit, Plasma Faktor VIII- und Fibrinogenspiegel sowie Plättchenzahl im gleichen Bereich wie in der gesunden Ratte liegen. Die in der Haubenratte auftretende Thrombopathie ist mit einer reduzierten Thrombininduzierten ATP- und ADP-Freisetzung sowie mit einer reduzierten Serotoninfreisetzung verbunden, und wird daher als "Storage-Pool Defizienz" charakterisiert, die "Storage-Pool Defi-zienz" beim Menschen wiederspiegeln.
Die Haubenratten werden mit Ketamin-Xylazin (100 mg/kg + 5 mg/kg) i.m. narkotisiert. In eine Jugularvene wird ein Katheter eingebunden, über welchen die zu testenden Substanzen infundiert werden. Anschließend wird die Blutungszeit bestimmt, wobei hierzu Simplate R-Einmalschnäpper (Organon, Technica) verwendet werden. Im Abstand von ca. 1,5 cm von der Schwanzwurzel werden dorsal und danach ventral je ein Längsschnitt angebracht und jeweils die Blutungszeit gemessen. Der Mittelwert aus den beiden Einzelmessungen gilt als Blutungszeit. Danach erfolgt die Applikation der Testsubstanz (Puffer, Faktor II gemäß Beispiel 2, Faktor Xa gemäß Beispiel 4 und partielle Prothrombinase gemäß Beispiel 6); 30 Minuten später wird die Blutungszeit neuerlich bestimmt. Zur Kontrolle werden gesunde Sprague-Dawley Ratten (Charles River) verwendet.
Die Untersuchung erfolgt in Gruppen von je 10 Tieren, wobei der Komplex der partiellen Prothrombinase in 2 Dosen, 75 E/kg Körpergewicht (KG) Prothrombin und 0,55 E/kg KG Faktor Xa 14
AT 408 612 B sowie 150 E/kg KG Prothrombin und 1,1 E/kg KG Faktor Xa, verabreicht wird. Als Kontrolle dazu werden die Einzelkomponenten und Puffer gegeben. Die in den einzelnen Versuchsgruppen gemessenen mittleren Blutungszeiten sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben. Gesunde Ratten weisen unter den gleichen Versuchsbedingungen eine Blutungszeit von 168 ± 5 Sekunden auf, während Ratten mit einer Thrombopathie eine verlängerte Blutungszeit von 335 ±10 Sekunden haben. Durch Gabe der partiellen Prothrombinase kann diese abnorm gesteigerte Blutungszeit auf ca. 270 Sekunden reduziert werden.
Tabelle 1
Blutungszeit (s) Mittelwert aus 10 Tieren 0 Faktor II (E/kg) 75 150 0 335 ± 10 296 ± 13ns 307 ± 11ns FXa 0,55 n.b. 273±13* n.b. (E/kg) 1,1 320 ± 13ns n.b. 268 ± 11***
Statistische Auswertung:
Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben. Die Gruppenmittelwerte wurden mittels Student T-Test verglichen. n.b. nicht bestimmt ns Unterschied zur Kontrollgruppe (0 E/kg Fll und 0 E/kg FXa) nicht signifikant * Unterschied zur Kontrollgruppe (0 E/kg Fll und 0 E/kg FXa) signifikant mit p > 95 % *** Unterschied zur Kontrollgruppe (0 E/kg Fll und 0 E/kg FXa) signifikant mit p > 99,9 % BEISPIEL 2
Wirkung von partieller Prothrombinase im von Willebrand Faktor-defizienten Hund
Ein Hund mit angeborener von Willebrand Faktor-Defizienz mit einem nicht meßbaren von Willebrand Faktor-Aktivitäts- und Antigenplasmaspiegel und einer um 50 % verminderten Faktor VIII-Plasmakonzentration wird mit einer partiellen Prothrombinase in einer Dosis von 100 E/kg KG behandelt. Dazu wird der Hund narkotisiert und anschließend die partielle Prothrombinase hergestellt gemäß Beispiel 6 als Bolus intravenös verabreicht. Unmittelbar vor Verabreichung der Testsubstanz sowie 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 24 h und 48 h nach Infusion werden Blutproben genommen, aus diesen Plasma hergestellt und die Prothrombin-, Thrombin- und Faktor Vlll-Kon-zentration in den Plasmaproben bestimmt.
Vor Verabreichung der partiellen Prothrombinase sowie 3 und 24 h nach der Injektion wird die Nagelhautblutungscharakteristk bestimmt. Dazu wird nach der Methode von A.R. Giies, S. Tiniin und R. Greenwood, A Canine Model of Hemophilic (Factor VlllrC Deficiency) Bleeding, Biood 1982; 60, in abgewandelter Form vorgegangen. Das Fell um die Kralle wird rasiert, um zu verhindern, daß bei der späteren Blutung austretendes Blut vom Fell absorbiert wird. Die Nagelhaut wird mittels einer Krallenzange verletzt. Unmittelbar danach werden Filter (Pipetman P5000-Schutzfilter, Gilson) unter der Wunde so etabliert, daß das Blut direkt auf den Filter tropfen kann, ohne von diesem durch Kapillarwirkung aufgesogen zu werden, um zu verhindern, daß ein sich formierendes Blutgerinnsel verletzt wird. Die Filtereinheiten werden alle 2 Minuten gewechselt und das austretende Blut in Fraktionen gesammelt. Die Blutsammlung wird 30 min fortgesetzt. Danach wird, sofern die Blutung nicht zum Stillstand gekommen ist, die Wunde verödet. Verschiedene Krallen können bei ein und demselben Tier verwendet werden. 15
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Die Qualifizierung der Blutungscharakteristik erfolgt durch Extraktion des in Fraktionen auf den Filtern gesammelten Blutes mit jeweils 5 ml 0,04 % Ammoniumhydroxid-Lösung über 5 Stunden. Dabei lysieren die Erythrozyten, die mit dem Blut im Filter gesammelt wurden. Durch eine 10-minütige Ultraschallbehandlung (Sonorex RK 100, Bandelin electronic, Berlin) wird das Hae-moglobin extrahiert und quantitativ photometrisch bei 416 nm gegen eine Eichkurve bestimmt. Eine Eichkurve kann ermittelt werden, indem Hundeblutvolumina zwischen 10 μΙ und 1 ml auf die Filter pipettiert werden, diese wie oben beschrieben extrahiert werden und das Haemoglobin photometrisch bei 416 nm bestimmt wird. Entsprechend lassen sich lineare Eichkurven erstellen, die eine direkte Umrechnung der Haemoglobinkonzentration auf die Blutmenge pro Filter ermöglichen. Die Blutungscharakteristik des Nagelschnittes wird ermittelt, indem graphisch die Blutmenge pro 2-Minuten-Fraktion gegen die Zeit aufgetragen wird. Zur Beurteilung der Blutungscharakteristik wird der kumulierte Blutverlust ermittelt, indem die einzelnen Blutfraktionen additiv gegen die Zeit in die Graphik eingetragen werden. Als für die Blutung relevantes Kriterium wird die Steigung der kumulierten Blutung zwischen 10 und 20 Minuten herangezogen. Dieser Wert ist unabhängig von der initialen Blutmenge, die durch schlecht standardisierbare Krallenschnittechniken variieren kann. Die Steigung dieser Blutungscharakteristik im 10-20 min Beobachtungsintervall dient als Maß für die Intensität der Blutung und wird in ml Blut/min angegeben. Eine Steigung gleich Null, entsprechend 0 ml/min, bedeutet, daß die Blutung zum Stillstand gekommen ist; eine Steigung größer als Null mit einem Korrelationskoeffizienten von > 0,8 bedeutet, daß eine konstante Blutung vorliegt. Normale Hunde, die unter diesen Bedingungen getestet wurden zeigen im Beobachtungszeitraum keine Blutung mehr, d.h. die Blutung ist bereits zuvor zum Stillstand gekommen (Blutungsintensität: 0,0 ml/min).
Die Blutungsintensität betrug vor Verabreichung der partiellen Prothrombinase 1,05 ml/min und war nach 3 h auf 0,35 ml/min und auch nach 24 h weiterhin auf 0,47 ml/min reduziert.
Der Faktor Vlll-Plasmaspiegel blieb über die gesamte Beobachtungszeit konstant, von Willebrand Faktor-Antigen blieb unter der Nachweisgrenze, Prothrombin war vor Substanzgabe bei 0,7 E/ml und stieg nach Injektion der partiellen Prothrombinase auf 2,4 E/ml an und wurde mit einer Halbwertszeit von ca. 24 h aus der Zirkulation eliminiert. 1 h nach Verabreichung der Testsubstanz konnte eine signifikante Thrombingenerierung mit einem chromogenen Substrat für Thrombin, Th1 (Immuno), bestimmt werden. Die Injektion von partieller Prothrombinase wurde ohne Nebenwirkungen vom Hund vertragen. BEISPIEL 3
Wirkung von partieller Prothrombinase und von Willebrand Faktor im von Willebrand
Faktor-defizienten Hund
Analog zu Beispiel 2 wurde der Hund mit einer partiellen Prothrombinase in einer Dosierung von 100 E/kg KG und einem gereinigten von Willebrand Faktor in einer Dosierung von 60 RCoF E/kg KG behandelt. Durch Gabe dieser Kombination kam es im von Willebrand Faktor-defizienten Hund nach 24 h zu einer vollständigen Normalisierung des abnorm gesteigerten Blutungsverhaltens, wobei die Plasmaparameter wie in Beispiel 2 bezüglich Prothrombin und Thrombin vergleichbar waren. Darüber hinaus kam es zu einem endogenen Faktor Vlll-Anstieg auf ca. 200 % des Ausgangswertes der über einen Zeitraum von mehr als 48 h konstant blieb und anschließend über einen Zeitraum von ca. 120 h zum Ausgangswert zurückkehrte. Von Willebrand Faktor wurde mit einer Halbwertszeit von 20 h eliminiert. Aus der Literatur (L. Drouet, J. Roussi, M. Bonneau, G.A. Pignaud, P.L. Turecek, F. Dorner, U. Schlokat, F.G. Falkner, B. Fischer, A. Mitterer und H.P. Schwarz, The effect of recombinant human von Willebrand Factor in pigs with severe von Willebrand Disease. Blood 1995; 86: 612a-AbsNo2435. (abs)) war bekannt, daß die Gabe von von Willebrand Faktor alleine lediglich zu einer partiellen Normalisierung des Blutungsverhaltens führt. BEISPIEL 4
Wirkung der partieller Prothrombinase als Antagonist von Peptidanticoagulantien
Eine partielle Prothrombinase in einer Zusammensetzung von 57 E Faktor II und 1.2 E Faktor Xa wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mM NaCI, pH 7,4, gelöst und 15 min bei 16
Claims (13)
- AT 408 612 B Raumtemperatur zur Bildung des Komplexes inkubiert. Anschließend wurde ein Aliquot von 50 μΙ entnommen und mit 50 μΙ eines Tris-Imidazolpuffers, pH 8,4, für 90 s bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde mit 100 μΙ einer Lösung des chromogenen Substrates, Methoxycarbonyl-D-cyclo-hexylalanyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanili d-hydroacetat, versetzt, so daß die Konzentration des chromogenen Substrates 1 mmol/l betrug. Anschließend wurde die Kinetik der Spaltung des chromogenen Substrates photometrisch bei 405 nm über 3 min bei 37°C bestimmt. Das chromogene Substrat, welches sowohl von Thrombin als auch von Faktor Xa hydrolysiert wird, wies bei Inkubation mit partieller Prothrombinase eine AOD/min von 0,084 auf. Als Vergleich wurde Faktor Xa in derselben Konzentration jedoch ohne Prothrombin in diesem Test eingesetzt und es zeigte sich eine Umsatzrate des chromogenen Substrates von 0,064 AOD/min. Zur partiellen Prothrombinase wurde rekombinantes Hirudin (Rhein-Biotech) in einer Konzentration von 0,0025 E/ml zugesetzt und ebenso die Umsatzrate des chromogenen Substrates untersucht. Es zeigte sich, daß nach Abzug des Substratumsatzes des reinen Faktor Xa (0,064 AOD/min) kein weiterer Substratumsatz mehr gemessen werden konnte, was auf eine vollständige Neutralisierung des Hirudin zurückzuführen war. Neben dem effektiven und spezifischen Thrombininhibitor, Hirudin, wurde dann auch der selektive Faktor Xa-Inhibitor, rekombinantes Tick-Anticoagulant Peptide, ein rekombinantes Äquivalent des Serinproteaseinhibitors aus Ornithodoros moubata, dessen anticoagulatorische in vivo-Wirk-samkeit von G.P. Vlasuk, D. Ramjit, T. Fujita et al. in Comparison of the In Vivo Anticoagulant Properties of Standard Heparin and the Highly Selective Factor Xa Inhibitors Antistasin and Tick Anticoagulant Peptide (TAP) in a Rabbit Model of Venous Thrombosis. Thrombos Haemostas 1991; 65: 25W-262 beschrieben wurde, in einer Konzentration von 50 pg/ml zugesetzt. Bereits 30 min nach Zusatz des rekombinanten Tick-Anticoagulant Peptides konnte mit dem chromogenen Substrat keine Enzymaktivität mehr gemessen werden. Der Versuch zeigt, daß partielle Prothrombinase ein effizienter Antagonist der Peptidanticoagulantien, Hirudin und Tick-Anticoagulant Peptide ist. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verwendung von mindestens zwei Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase sind, zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation gemäß Patent Nr. 407 116 zur Behandlung von akuten Blutungen, einer gesteigerten Blutungsneigung bzw. einem erhöhten Blutungsrisiko bei nicht-hämophilen Patienten.
- 2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von Blutungen aufgrund einer Thrombopathie.
- 3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung einer Heparin-induzierten Thrombozytopänie.
- 4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, mit der Maßgabe, daß die pharmazeutische Präparation eine primäre hämostatische Aktivität aufweist.
- 5. Pharmazeutische Präparation zur Behandlung von Patienten mit Blutgerinnungsstörungen, enthaltend mindestens zwei Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase und frei von Phospholipiden sind, sowie ein Protein mit primärer hämostatischer Aktivität, insbesondere vWF.
- 6. Set zur Behandlung von Patienten mit Blutgerinnungsstörungen gekennzeichnet durch die Komponenten: a) eine pharmazeutische Präparation enthaltend mindestens zwei Gerinnungsfaktoren, die Bestandteile einer Prothrombinase bzw. Pro-Prothrombinase und frei von Phospholipiden sind, und b) ein Protein mit primärer hämostatischer Aktivität, insbesondere vWF.
- 7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von Blutungen im Rahmen einer Antikoagulantien-Therapie.
- 8. Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation als Antidot für einen Gerinnungsinhibitor bzw. für ein Antikoagulans oder für einen Thrombozytenfunktionshemmer. 17 AT 408 612 B
- 9. Verwendung nach Anspruch 8, mit der Maßgabe, daß der Gerinnungsinhibitor bzw. das Antikoagulans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus APAP, Benzamidinderivat, Hirudin, Heparin, Heparinanaloga, insbesondere Pentasaccharide, AT III (Antithrombin III)-Heparinkomplex, AT III, Antistasin, "Tick-Anticoagulant Peptide" (Antikoagulans aus Zecken) inaktive Gerinnungsfaktoren, insbesondere “active site" inhibierte Gerinnungsfaktoren (Gerinnungsfaktoren, die durch Manipulation am aktiven Zentrum inhibiert sind), TFPI (tissue factor pathway inhibitor), kompetitive Liganden für Thrombozytenmembranoberflächenrezeptoren, insbesondere Antikörper gegen GP llb/llla (Glykoprotein llb/llla), und deren gentechnisch oder synthetisch hergestellten Analoga, insbesondere Peptide, sowie orale Antikoagulantien.
- 10. Verwendung nach Anspruch 8, mit der Maßgabe, daß der Thrombozytenfunktionshemmer Ticlopidin oder Acetylsalicylsäure ist.
- 11. Set zur Antikoagulantien-Therapie von Patienten, gekennzeichnet durch die Komponenten: a) einen Gerinnungsinhibitor bzw. ein Antikoagulans oder einen Thrombozytenfunktionshemmer, und b) eine pharmazeutische Präparation gemäß Patent Nr. 407 116
- 12. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von intracraniellen Blutungen, insbesondere bei gestörter Thrombingenerierung.
- 13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Behandlung von Frühgeborenen. KEINE ZEICHNUNG 18
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EP0549964A2 (de) * | 1991-12-24 | 1993-07-07 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung eines virusinaktivierten Prothrombin-komplex-Konzentrats (PPSB) |
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