DE2742529A1

DE2742529A1 - Plasminogen-aktivatorkomplex, verfahren zu seiner herstellung und ihn enthaltendes arzneimittel

Info

Publication number: DE2742529A1
Application number: DE19772742529
Authority: DE
Inventors: Kenneth C Robbins; Louis Summaria
Original assignee: REESE RES FOUND
Current assignee: REESE RES FOUND
Priority date: 1976-09-24
Filing date: 1977-09-21
Publication date: 1978-03-30
Also published as: FR2365583B1; JPS5352606A; US4082612A; SE8301794D0; GB1533205A; SE8301795L; DE2742529C2; CH637992A5; SE7710653L; DK421577A; SE454047B; SE8301795D0; NL7710451A; CH637991A5; FR2365583A1; SE442304B; CA1094449A; SE454048B

Description

PATENTANWÄLTE R. SPLANEMANN dr. B. REITZNER J.RICHTER F. WERDERMANN

DIPL.-ING. DIPL.-CHEM. DIPL.-ING. DIPIoIfJG/ O C O G

MÖNCHEN

HAMBURG

Michael Reese Research Foundation

530 East 31 st Stieet Chicago, 111. 60616 USA

eoooMünchen 2 21. September 1977 Tal 13

Telefon (089) 22 6207/2262 Telegramme: Inventius München

Unsere Akte:

Ihr Zeichen:

4233-1-10.069

Plasminogen-Aktivatorkomplex, Verfahren zu seiner Herstellung und ihn enthaltendes Arzneimittel

809813/0879

Konten: Deutscht Bonk AC. Manchen, KoMo-Nr. 20/14009 - Postscheck: München 60040-807

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine funktionell aktive Fraktion von Plasmin, Komplexe dieser funktionell aktiven Fraktion mit Materialien, wie Streptokinase, welche die Plasminfraktion aktivieren unter Bildung einer Substanz, die Fibrin enthaltende Blutgerinnsel auflöst; sie betrifft insbesondere einen Plasminfraktionskomplex, der eine vorteilhafte fibrinolytische Aktivität aufweist, selbst nachdem seine aus dem Blut stammenden Komponenten zur Inaktivierung von Virenverunreinigungen wärmebehandelt worden sind.

Es ist bekannt, daß unter der Einwirkung einer als Fibrin bekannten Plasmakomponente Blutgerinnsel entstehen. Es ist auch bekannt, daß Materialien, welche die Neigung haben, Fibrin zu lösen (fibrinolytische Materialien) wirksam sind in bezug auf die Verminderung oder Eliminierung von Blutgerinnseln in dem Kreislaufsystem, wo ein großer Schaden entstehen kann durch Kreislaufblockierungen, die durch nicht aufgelöste Blutgerinnsel hervorgerufen werden können·

Bas menschliche Blut enthält Plasminogen, bei dem es sich nicht um ein Enzym, sondern um einen Enzymvorläufer handelt. Bestimmte Aktivatoren wandeln das Plasminogen in Plasmin um, das in der Lage ist, Fibrin zu lösen und Blutgerinnsel aufzubrechen. Plasmin ist ein proteolytisches Enzym mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum und es hat die Fähigkeit, Protein aufzulösen, auch sich selbst aufzulösen. Plasmin und viele seiner Komplexe sind deshalb bei der Lagerung in gelöster Form ohne Zugabe von stabilisierenden Materialien, wie Leupeptin, instabil. Die proteolytische Aktivität von Plasmin und seinen Komplexen kann zu nachteiligen Sekundäreffekten führen, wenn solche Materialien in den Blutstrom eingeführt werden, da durch die proteolytische Aktivität

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Serumproteine zerstört werden können, wie z.B. Gerinnungsund Komplementkomponenten.

Bei der Streptokinase, die von Streptococcus-Kulturen stammt, handelt es sich um einen Aktivator, der in der Lage ist, Humanplasminogen in Humanplasmin umzuwandeln. Er ist auch in der Lage, Katzen-Plasminogen in Katzen-Plasmin umzuwandeln, er ist jedoch verhältnismäßig inaktiv in bezug auf die Umwandlung von anderen Säugetier-Plasminogenen.

Wenn Streptokinase Humanplasminogen zugesetzt wird, besteht ihre erste Wirkung darin, sich mit einem Teil des Plasminogens in stöchiometrischen Mengen zu verbinden unter Bildung eines Komplexes. Der Streptokinase-Plasminogen-Komplex dient dann als Katalysator für die Umwandlung des restlichen Plasminogens in Plasmin. Streptokinase verbindet sich auch stöchiometrisch mit Plasmin unter Bildung eines Komplexes, der einen Katalysator für die Umwandlung von Plasminogen darstellt.

Streptokinase ist, wie oben angegeben, verhältnismäßig inaktiv in bezug auf die Umwandlung von anderen Säugetier-Plasminogenen als Human- und Katzenplasminogenen und wandelt deshalb Rinder-Piasminogen nicht in Rinder-Plasmin um. Andererseits sind der Streptokinase-Humanplasminogen-Komplex htv> der Streptokinase-Humanplasmin-Komplex aktiv bei der Umwandlung von Rinder-Plasminogen in Rinder-Plasmin.

Es ist bekannt, daß Plasmin durch Spaltung der Plasminmoleküle an ihren Disulfid-Bindungen zwischen den Ketten (einer oder zwei Disulfidbindungen pro Molekül) in eine schwere (A) Kettenfraktion und eine leichte (B) Kettenfraktion aufgespalten werden kann, und es ist bekannt, daß die schwere (A) Kettenfraktion und die leichte (B)

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Kettenfraktion voneinander getrennt werden können. Hickli undOtavasky geben in "Eur. J. Biochem.", ^2, 441-44? (1975)» an, daß die Fraktionen durch Adsorption der schweren (A) Kettenfraktion an einem L-Ijysin-substituierten Polyacrylamid-Adsorbens "pd Eluieren der leichten (B) Kettenfraktion voneinander getrennt werden können. Die Autoren machen keine Angabe über irgendwelche Eigenschaften der eluierten leichten (B) Kottenfraktion, durchgeführte Tests haben jedoch gezeigt, daß die bei diesem Verfahren gebildete leichte (B) Kettenfrakticr, wenn sie mit Streptokinase in einen Komplex überführt wird, einen Komplex bildet, der in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin praktisch inaktiv ist. Die schwere (A) Kettenfraktion kann keinen Streptokinasekomplex bilden·

Aus Sicherheitsgründen können therapeutische Materialien, die von menschlichem Blut abgeleitet sind, die Plasminogen und Plasmin umfassen, nicht in den Blutstrom eines Patienten injiziert werden, weil durch eine solche Injektion Virenverunreinigungen, wie z.B. der Hepatitis-Virus, in den Blutstrom des Patienten übertragen werden können. Die Food and Drug Administration der USA schreibt vor, daß jedes Material, das aus menschlichem Blut gewonnen worden ist, 10 Stunden lang auf 60°C erhitzt werden muß, um eventuelle Hepatitis-Viren zu inaktivieren, bevor von ihr das Material oder irgendein Derivat davon für den Verkauf als Arzneimittel, das in den Blutstrom injiziert werden soll, freigegeben wird.

Wenn man einen Streptokinase-Plasmin-Komplex der vorstehend beschriebenen Wärmebehandlung unterwirft, ändert sich sein Charakter und er wird in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin inaktiv· Wenn man Plasminogen der vorstehend beschriebenen Wärmebehandlung unterzieht, bevor man es in Plasmin umwandelt und bevor man es mit

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Streptokinase in einen Komplex überführt, ändert sich ebenfalls der Charakter des dabei erhaltenen Komplexes. Obgleich sein Streptokxnasekomplex noch die Aktivität in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin aufweist, wird seine Proteinkomponente durch die Wärmebehandlung so denaturiert, daß Antigen- und Pyrogen-Heaktionen auftreten können, wenn der Komplex in den Blutstrom eines Patienten injiziert wird. Aus diesen Gründen wurden Streptokinase-Plasmin-Komplexe bisher nicht als übliche therapeutische Behandlung zum Auflösen von Blutgerinnseln bei menschlichen Patienten verwendet.

Erfindungsgemäß wird eine leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum hergestellt. Es wurde gefunden, daß das katalytische Serinprotease-Zentrum in dem Piasminmolekül sich auf der Seite der leichten (B) Kette desselben befindet, daß jedoch durch die Verfahren, die bisher zur Aufspaltung des Piasminmoleküls und zur anschließenden Trennung der leichten (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion angewendet wurden, das katalytische Serinprotease-Zentrum an der leichten (B) Kettenfraktion inaktiviert wird, so daß die leichte (B) Kettenfraktion ebenso inaktiv wird wie die schwere (a) Kettenfraktion (die kein derartiges katalytisches Zentrum aufweist).

Es wurde ferner gefunden, daß bekannte reversible aktive Serinprotease-Zentrumsinhibitoren, wie Leupeptin, die Desaktivierung oder Vergiftung des katalytischen Serinprotease-Zentrums in der leichten (B) Kettenfraktion hemmen bzw. verhindern und dadurch ihre Aktivität während der Reduktions- und Trennungsstufen schützen.

Es wurde auch gefunden, daß Streptokinase das aktive Serinprotease-Zentrum schützt und daß ein Streptokinase-Plasmi-

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nogen-Komplex oder ein Streptokinase-Plasmin-Komplex einer Reduktion und Trennung unterworfen werden können, ohne daß ein reversibler aktiver Serinproteasezentrums-Inhibitor vorhanden ist, unter Bildung eines Streptokinaseleichte (B) Kettenfraktion-Komplexes, der eine fibrinolytische Aktivität aufweist.

Es wurde ferner gefunden, daß eine aktive leichte (B)-Kettenfraktion hergestellt werden kann aus einem Plasminogen-Ausgangsmaterial, das 10 Stunden lang bei 60 C wärmebehandelt worden ist, und daß die so hergestellte Fraktion mit Streptokinase verbunden (kombiniert) werden kann unter Bildung eines fibrinolytisch aktiven Komplexes, der eine wesentlich geringere antigene oder pyrogene Reaktion hervorrufen kann, wenn er in den Blutstrom eines Patienten injiziert wird, als der Komplex aus Streptokinase und einem wärmebehandelten Plasminogen, das nicht fraktioniert worden ist. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt gemäß einem bevorzugten Aspekt die 10-stündige anfängliche Wärmebehandlung von Human-Plasminogen bei 60⁰C, um irgendwelche darin enthaltenen Virenverunreinigungen zu inaktivieren. Das wärmebehandelte Plasminogen wird dann zu Plasmin aktiviert und mit einem aktiven Serinprotease-Zentrumsinhibitor, wie Leupeptin (Acetyl-L-leucin-L-leucin-L-argininal)in einer solchen Menge gemischt, daß der größte Teil der oder die gesamte Piasminaktivität gehemmt (inhibiert) werden. Die Plasmin-Leupeptin-Mischung wird dann mit einem Reduktionsmittel, wie 2-Mercaptoäthanol oder Dithioerythrit, reduziert, um die Disulfidbindungen in den Piasminmolekülen zu spalten unter Bildung der schweren (A)-Plasmin-Kettenfraktionen und der leichten (B)-Kettenfraktionen. Das Produkt wird dann mit einem Alkylierungsmittel, wie Natriumjodacetat, alkyliert, um die gespaltenen Enden der Disulfidbindungen (Sulfhydryl-

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gruppen) an der Rekombination zu hindern; und das alkylierte Produkt wird auf eine chromatographische Affinitäts-Kolonne aufgegeben, in welcher die schwere (A) Kettenfraktion adsorbiert und die leichte (B) Kettenfraktion eluiert wird, die ohne Adsorption die Kolonne passiert. Die leichte (B') Kettenfraktion wird mit Ammoniumsulfat ausgefällt, zentrifugiert »nfl dann in einem Puffermedium wieder aufgelöst. Wenn die Kettenfraktion ausgefällt" wird, bleibt der größte Teil des Leupeptins in der flüssigen Phase zurück. Die geringe Menge Leupeptin, die bei der ausgefällten und wieder aufgelösten leichten (B) Kettenfraktion verbleibt, unterstützt ihre Konservierung, wenn sie in flüssiger Phase gelagert wird, sie beeinträchtigt jedoch nicht ihre Aktivität, da sie bis zu einer vernachlässigbar geringen Konzentration verdünnt wird, wenn der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase (wie nachfolgend beschrieben) in den Blutstrom eines Patienten eingeführt wird.

Die leichte (B) Kettenfraktion wird komplex an Streptokinase gebunden, entweder in roher oder in gereinigter Form, indem man die Materialien in äquimolaren Mengenanteilen miteinander mischt und dann die Mischung kurze Zeit inkubiert. Ein äquimolarer Komplex aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase kann auch hergestellt werden aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex durch Reduzieren des Komplexes zur Aufspaltung der Disulfidbindungen in den Piasminmolekülen des Komplexes unter Bildung von schweren (A) Plasmin-Kettenfraktionen und leichten (B) Plasmin-Kettenfraktionen, die an die Streptokinase gebunden sind, und anschließende Alkylierung und Aufgeben des dabei erhaltenen Produktes auf eine chromatographische Kolonne, in welcher die schwere (A) Plasmin-Kettenfraktion adsorbiert wird und aus der der Komplex aus der leichten

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(B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase eluiert wird, der ohne Adsorption die Kolonne durchläuft. Im letzteren Falle ist die Verwendung von Leupeptin oder anderer reversibler Serinprotease-Aktivitätszentrum-Inhibitoren nicht erforderlich, da die Streptokinase die gleiche Punktion erfüllt und den Aktivitätsverlust in der leichten (B) Kettenfraktion während der Reduktion der Piasminstruktur und während der Trennstufen verhindert·

Die wie vorstehend angegeben hergestellte leichte (B) Plasmin-Kettenfraktxon weist eine viel geringere proteolytische Aktivität auf als das Plasmin, aus dem sie abgeleitet ist, die im allgemeinen weniger als etwa 5 %» bezogen auf die Molmenge, und weniger als etwa 15 %» bezogen auf das Gewicht, beträgt. In der Regel hat die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktxon eine proteolytische Aktivität, gemessen auf einem Caseinsubstrat, von etwa 2 bis etwa 3 CTA-Einheiten/mg Protein oder von etwa 0,05 bis etwa 0,08 CITA-Einheiten/n UoI Protein. Bei den CTA-Einheiten handelt es sich tua Standard-Aktivitätseinheiten, die von dem Committee on Thrombolytic Agents (National Heart and Lung Institute) und von der World Health Organization angewendet werden und in Johnson et al., "Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica", Band 21, Seiten 259-272 (1969), beschrieben sind.

Der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktxon und Streptokinase, der, wie vorstehend angegeben, aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden ist, hat eine viel geringere proteolytische Aktivität als der Plasmin-Streptokinase-Komplex, aus dem er abgeleitet ist, die im allgemeinen weniger als etwa 20 %, bezogen auf das Molverhältnis, und weniger als etwa 35 #, bezogen auf das Gewicht, beträgt. In der Regel hat der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, der aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden

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.L

ist, eine proteölytische Aktivität, gemessen auf einem Caseinsubstrat, von etwa 2 bis etwa 3»5 CTA-Einheiten/ng Protein oder von etwa 0,14 bis etwa 0,25 CTA-Einheiten/n Mol Protein. Der aus Streptokinase und einer leichten (B) Kettenfraktion, wie vorstehend angegeben, hergestellte Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hat eine proteolytische Aktivität, die etwa in der gleichen Größenordnung liegt wie diejenige des aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellten Komplexes.

Der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, der wie vorstehend angegeben aus dem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden ist, hat in der Regel eine Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivität, die etwa 1,6 bis etwa 1,8 mal so groß ist, bezogen auf das Gewicht, wie diejenige des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. Die Rinder-Piasminogen-Aktivität des Komplexes aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase, bezogen auf das Molverhältnis, ist etwa 0,8 bis etwa 1,° mal so groß wie diejenige des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. In der Regel betragen die Werte für die Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivität der Komplexe aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, die aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden sind, gemessen auf einem Caseinsubstrat, etwa 3 bis etwa 4 CTA-Einheiten/ug Protein oder etwa 200 bis etwa 360 CTA-Einheiten/n Mol Protein.

Die Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivität des aus Streptokinase und einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion wie vorstehend angegeben hergestellten Komplexes aus der leichten

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(B) Plasmin-Kettenfraktion «wfl Streptokinase beträgt etwa 0,70 bis etwa 0,75 der Aktivität des aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase.

Die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des aus dem wie vorstehend angegeben Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase beträgt

im allgemeinen etwa das 1,8- bis etwa 2,2-fache der Aktivität, bezogen auf das Gewicht, des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. Die Humanplasminogen-Akt ivat or aktivität des aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellten Komplexes beträgt, bezogen auf das Molverhältnis, etwa das 1,0- bis etwa 1,2-fache der Aktivität des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. Typische Werte für die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, gemessen auf einem Caseinsubstrat, betragen etwa 8 bis etwa 12 CTA-Einheiten/ng Protein oder etwa 550 bis etwa 800 COJA-Einheiten/n Hol Protein. Sie Humanplasminogen-Aktivatoraktivitätswerte für aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellte Komplexe aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase betragen etwa das 0,9- bis etwa 1,0-fache der Werte des aus - einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase. Die wesentlich höhere Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, bezogen auf das Gewicht, im Vergleich zu der Aktivität des Plasmin-Streptokinase-Komplexes ermöglicht die Anwendung von niedrigeren intravenösen Dosen des Komplexes

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aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase zur Erzielung einer gewünschten fibrinolytischen Wirkung im Vergleich zu dem Plasmin-Streptokinase-Komplex.

In vitro-Tests haben außerdem gezeigt, daß der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase wesentlich wirksamer ist als der Plasmin-Streptokinase-Komplex in bezug auf die Verminderung oder Auflösung von Blutgerinnseln selbst bei Dosen, die im Hinblick auf die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität miteinander vergleichbar sind. Ohne an irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß diese verbesserte Wirksamkeit auf die geringere Molekülgröße des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase im Vergleich zu dem Plasmin-Streptokinase-Komplex und demzufolge auf das bessere Eindringvermögen der kleineren Moleküle in und die bessere Wirkung auf das Innere einer Blutgerinnselstruktur zurückzuführen ist.

Wenn es erwünscht ist, sicherzustellen, daß in der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion gemäß einem Aspekt der Erfindung oder in dem Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung keine Virenverunreinigungen enthalten sind, wird das Plasminogen-Ausgangsmaterial vor der Umwandlung in Plasmin oder vor der Komplexbildung mit Streptokinase wärmebehandelt, um irgendwelche Virenverunreinigungen zu inaktivieren. Eine Standard-Wärmebehandlung, die von der Food and Drug Administration, wie oben erläutert, gefordert wird, besteht darin, das Plasminogen mindestens 10 Stunden lang bei einer Temperatur von mindestens 60⁰C zu halten. Es wurde gefunden, daß die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion gemäß einem Aspekt der Erfindung und der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase gemäß einem anderen Aspekt

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der Erfindung ihre jeweiligen Aktivitäten auch dann im wesentlichen vollständig behalten, wenn die jeweiligen Produkte aus wärmebehandeltem Plasminogen als Ausgangsmaterial hergestellt werden.

Wenn ein Plasmin-Streptokinase-Komplex aus einem wärmebehandelten Plasminogen-Ausgangsmaterial hergestellt wird, behält er ebenfalls im wesentlichen seine gesamte Aktivität. Unter der Einwirkung der Wärme auf das Plasminogenmolekül verändert sich jedoch seine Struktur oder es wird denaturiert in einer Reihe von Zentren und das verhältnismäßig große Piasminmolekül, das davon abgeleitet ist, wird ebenfalls im wesentlichen denaturiert, wodurch es selbst und seine Komplexe antigen und pyrogen gemacht werden, wenn es in den Blutstrom eines Patienten eingeführt wird.

Wenn das aus wärmetehandeItem Plasminogen hergestellte Plasmin reduziert und in eine schwere (A) Kettenfraktion und in eine leichte (B) Kettenfraktion aufgespalten wird, wird die schwere (A) Kettenfraktion verworfen, wobei viele der denaturierten Zentren, die sich in der schweren (A) Kettenfraktion befinden, ebenfalls verworfen werden, so daß eine native leichte (B) Kettenfraktion zurückbleibt, die wesentlich weniger antigen und weniger pyrogen sein kann als das gesamte denaturierte Plasmin. In entsprechender Weise können Komplexe mit einer solchen leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion, wie z.B. Streptokinase-Komplexe, wesentlich weniger antigen und weniger pyrogen sein als ähnliche Komplexe aus dem gesamten denaturierten Plasmin.

Es hat sich als nicht notwendig erwiesen, stark gereinigte Streptokinase zu verwenden, da auch rohe Streptokinasefraktionen zur Herstellung der Komplexe verwendet werden können.

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Die Kupplungsreaktion der Streptokinase mit der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion oder mit dem Gesamtplasmin dient dazu, die Streptokinase von den in ihrer rohen Form damit verbundenen Verunreinigungen zu trennen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Hersjtel.lung der ,leichten £Bj) Kettenfrakti£n_

150 mg Leupeptin wurden zu 10 ml Humanplasmin (25 bis 30 CTA-Einheiten/mg Protein), gelöst ii einem wäßrigen Puffermedium aus 25 % Glycerin, 0,04 Mol/l tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan (nachfolgend abgekürzt mit "Tris"X 0,02 Mol/l Lysin und 0,08 Mol Liter Natriumchlorid bei pH 9 und bei einer Konzentration von 5 mg/ml Protein zugegeben. Das Plasmin war aus wärmebehandeltem Humanplasminogen, wie nachfolgend angegeben, hergestellt worden. Während der Zugabe des Leupeptins wurde die Piasminlösung in einem Eisbad von O⁰C gehalten und die Endkonzentration des Leupeptins in der Lösung betrug 0,04 Mol/l.

Zu dieser Plasmin-Leupeptin-Mischung wurden 0,072 ml konzentriertes 2-Mercaptoäthanol (Endkonzentration 0,1 M) zugegeben und die Plasmin-Leupeptin-Mischung wurde 20 Minuten lang reduziert, während sie in einem Wasserbad von 20⁰C gehalten wurde. Das reduzierte Plasmin wurde dann in ein Eisbad von O⁰C gebracht und es wurden 0,29 ml

4 M Natriumjodacetat zugegeben, um die beim Aufbrechen der Disulfidbindungen in den Plasminmolekülen während der Reduktionsreaktion gebildeten Sulfhydrylgruppen zu alkylieren. Die Alkylierungsreaktion wurde 30 Minuten lang

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bei O⁰C ablaufen gelassen. Das reduzierte und alkylierte Plasmin wurde dann über eine L-Lysin-substituierte Sepharose—Kolonne (1 ζ 20 cm) laufen gelassen, äquilibriert und bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 2°C mit einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer eluiert. Sie Elution wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/Stunde durchgeführt und Volumenfraktionen von 3 ml wurden getrennt gesammelt. Die leichte (B) Kettenfraktion passierte die Kolonne ohne Adsorption und sie wurde durch Extinktionsmessungen bei 280 nm nachgewiesen. Wenn der Extinktionswert auf 0 zurückkehrte, wurden die die leichte (B) Kettenfraktion enthaltenden Fraktionen miteinander vereinigt und zur Ausfällung der leichten (B) Kettenfraktion wurden 5,1 g/10 ml Ammoniumsulfat bei 0% zugegeben, wobei das nicht-ausgefällte Leupeptin in der flüssigen Phase zurückblieb· Die miteinander vereinigten, Ammoniumsulfat enthaltenden Fraktionen wurden über Nacht bei 4-⁰C stehen gelassen, um eine vollständige Ausfällung der leichten (B) Kettenfraktion zu gewährleisten, und der Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren bei 6000 UpM für einen Zeitraum von 1 Stunde bei 2°C entfernt.

Der Niederschlag aus der leichten (B) Kettenfraktion

1 ?6 wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml (E^_c£ « 16) in einem wäßrigen Puffermedium gelöst ähnlich demjenigen, wie es anfänglich zum Auflösen des Plasmins verwendet worden war. Die leichte (B) Kettenfraktion wurde bei 1-stündigem Zentrifugieren bei 2°C mit 3000 UpH klar und sie wurde bei -20⁰C aufbewahrt·

In der Regel hatte die so erhaltene leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsubstrat von 0,07 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder von 2,6 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von 2,03 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder 27,2 CTA-Einheiten/mg Protein für das Plasmin,

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Z4

aus dem die leichte (B) Kettenfraktion stammte.

In der Begel kann die auf diese Weise erhaltene leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion 0,09 Mol tritiiertes Diisopropylphosphorfluoridat pro Mol Protein einarbeiten im Vergleich zu dem Ausgangs-Plasmin, das 0,95 Mol pro Mol Protein einarbeiten kann.

Beispiel 2

Herstellung eines Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase aus der leichten Kejbtenfrakt ic_n

Ein äquimolarer Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase wurde hergestellt durch Zugabe von 0,5 ml Streptokinase (32 mg/ml) zu 0,9 ml der in Beispiel 1 hergestellten leichten (B) Kettenfraktion. Der äquimolare Komplex wurde 10 Minuten lang bei inkubiert und dann bei -20°C aufbewahrt. In der Begel hatte der so hergestellte äquimolare Komplex eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsubstrat von 0,16 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder von 2,3 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von 1,52 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder von 11,6 CTA-Einheiten/mg Protein des aus dem Ausgangsplasmin hergestellten äquimolaren Streptokinasekomplexes.

Typische Rinder-Plasminogen-Aktivatoraktivitätswerte für den äquimolaren Komplex des Beispiels 2 auf einem Caseinsubstrat waren 2,6 CTA-EinheitenAig Protein oder 175 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 2,1 CTA-Einheiten/ug Protein oder 264 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit

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Il

dem Ausgangsplasmin. Typische Werte für die Humanplasminogen-Akbivatoraktivität des äquimolaren Komplexes des Beispiels 2 auf einem Caseinsubstrat waren 9»3 CTA-Einheiten/ug Protein oder 636 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 4,9 CTA-EinheitenAig Protein oder 622 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

Der äquimolare Komplex des Beispiels 2 kann in der Regel 0,50 Mol tritiiertes Diisopropylphosphorfluoridat pro Mol Protein einarbeiten im Vergleich zu einem Wert von 0,90 Mol pro Mol Protein für einen äquimolaren Komplex aus Streptokinase und dem Ausgangsplasmin.

Beispiel 3

Herstellung eines Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase aus dem Plasmin-Streptokinase-KomjDlex

Wärmebehandeltes Humanplasminogen (25 bis 30 CTA-Einheiten/mg Protein) wurde in einem wäßrigen Puffermedium gelöst, das 0,05 Mol: pro Liter Tris, 0,02 Mol pro Liter Lysin und 0,1 Mol pro Liter Natriumchlorid enthielt und einen pH-Wert von 9 aufwies, bis zu einer Konzentration von 22 mg/ml Protein. Zu 3 ml der oben genannten Plasminogenlösung wurden in einem Wasserbad von O⁰C 1 ml Streptokinase (100 000 Einheiten/mg Protein) in einer Konzentration von 32 mg/ml Protein in einem 0,067 M Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7»4 zugegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang in einem Wasserbad von 25°C inkubiert, um den Komplex sich in einem Plasmin-Streptokinase-Komplex umwandeln zu lassen. Der Komplex wurde dann in einem Eisbad von O⁰C gekühlt und durch Zugabe

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von 8 ml der in Beispiel 1 beschriebenen 25 #igen Glycerin-Pufferlösung auf 12 ml verdünnt.

Zu 12 ml des Plasaiin-Streptokinasekomplexes, der oben hergestellt worden war, wurden 0,07 al konzentriertes 2-Mercaptoäthanol bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben. Der Komplex wurde 20 Minuten lang in einem Wasserbad von 20⁰C reduziert, dann auf O⁰C abgekühlt und alkyliert durch Zugabe von 0,35 ml 4 M Natrium-οdacetat. Nach 30-minütigem Stehenlassen bei O⁰C wurde der reduzierte und alkylierte Streptokinase-Komplex über eine L-Iysin-substituierte Sepharose-Kolonne (1 χ 20 cm) auf die in Beispiel 1 für das reduzierte und alkylierte Plasmin beschriebene Weise laufen gelassen. Der Komplex aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase passierte ohne Adsorption die Kolonne und er wurde nachgewiesen, gesammelt, ausgefällt, zentrifugiert, gelöst und geklärt wie die leichte (B) Kettenfraktion in Beispiel

In der Begel hatte der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase in Beispiel 3 eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsubstrat von 0,21 Casein-Einheiten/n Mol Protein oder von 2,9 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von 1,52 CTA-Einheiten/n Mol Protein oder 11,6 CTA-Einheiten/mg Protein für den äquimolaren Komplex aus Streptokinase und dem Ausgangsplasmin. Die typischen Einder-Plasminogenaktivatoraktivitätswerte für den Komplex des Beispiels 3 auf einem Caseinsubstrat betrugen 3,6 CTA-Einheiten/ug Protein oder 237 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 2,1 CTA-Einheiten/ug Protein oder 264 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin. Typische Werte für die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des Komplexes des Beispiels 3 auf einem Caseinsubstrat waren

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10,0 CTA-EinheitenAig Protein oder 685 CTA-Einheiten/n MoI Protein im Vergleich zu 4,9 CTA-Einheiten/ug Protein oder 622 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

In der Regel kann der Komplex des Beispiels 3 0,70 Mol tritiiertes Diisopropylphosphorfluoridat pro Mol Protein aufnemen im Vergleich zu einem Wert von 0,90 Mol pro Mol Protein für einen äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

Beispiel 4

Wärmebehandlung von Plasminogen

In Beispiel 1 wurde das Ausgangsplasmin als "aus einem wärmebehandelten Humanplasminogen hergestellt" bezeichnet und in Beispiel 3 wurde das Ausgangsplasminogen als "wärmebehandelt" bezeichnet.

In (jedem Falle wurde Humanplasminogen bei einer Konzentration von 20 mg/ml in einem 0,05 M Tris-0,02 M Lysin-0,1 M NaCl-Puffer bei einem pH-Wert von 9,0 mit 1 η HCl bei O⁰C auf pH 3,0 eingestellt, dann bei einem pH-Wert von 3,0 gegen einen 0,15 M Glycin-0,001 M HCl-PuXfer gründlich dialysiert· Nach der Dialyse wurde die Proteinlösung mit dem 0,15 M Glycin-0,001 M HCl-Puffer bis auf eine Endkonzentration von 1 mg Protein pro ml verdünnt und in einem mit einem Stopfen verschlossenen Kolben 10 Stunden lang in einem Wasserbad von 60°C erhitzt. Das Plasminogen wurde dann in einem Eisbad abgekühlt und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat (3»1 g/10 ml Lösung) ausgefällt. Das wärmebehandelte Plasminogen wurde durch 1-stündiges Zentrifugieren bei 6000 UpM abgetrennt und der Niederschlag wurde aufgelöst zur Er-

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zielung einer Konzentration von 10 mg/ml in dem 0,05 M Tris-0,02 M Iorsin-0,10 M NaCl-Puffer bei einem pH-Wert von 9»0. Das wärmebehandelte Plasminogenkonzentrat wurde durch 1-stündiges Zentrifugieren bei 3000 UpM geklärt und das unlösliche Protein wurde entfernt und verworfen. Das Plasminogen wurde unter Verwendung einer chromato^ graphischen L-I<ysin-substituierten Sepharose-Affinitats-Kolonne weiter gereinigt und nach dem Eluieren mit ξ, Aminocapronsäure wurde es unter Anwendung der Ammoniumsulfat-Ausfällungsmethode abgetrennt. Nach der Wärmebehandlung wurden etwa 74- % des Ausgangsproteins und etwa 73 % der anfänglichen proteolytischen Aktivität zurückgewonnen, wobei fast keine Änderung der spezifischen Aktivität des Plasmxnogens auftrat.

Es braucht nicht erwähnt zu werden, daß die vorstehend beschriebenen Beispiele auch in einer für den Fachmann ohne weiteres ersichtlichen Weise abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird. So können beispielsweise anstelle von Iieupeptin andere reversible Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitoren, wie Benzamidin und seine Derivate, verwendet werden. Der Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitor wird vorzugsweise in einer Konzentration verwendet, die ausreicht, um eine etwa 90 %ige Plasmin-Inhibierung (-Hemmung) zu erzielen. Bei Verwendung von Benzamidin als Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitor sind die proteolytischen Aktivitäten der leichten (B) Kettenfraktion und ihres Streptokinase-Komplexes nicht so niedrig wie diejenigen der unter Verwendung eines Leupeptin-Inhibitors hergestellten Produkte, sie sind jedoch niedriger als diejenigen des Komplexes aus Streptokinase und dem vollständigen Plasmin. Die Plasminogenaktivat or aktivität ist auch höher für die unter Verwendung

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von Benzamidin als Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitor hergestellten Produkte um bis zu etwa 8 CTA-Einheiten/ng Protein oder 600 CTA-Einheiten/n Mol für die Rinder-Plasminogenaktivatoraktivität oder bis zu etwa 25 CTA-Einheiten/ng Protein oder I5OO CTA-Einheiten/n Mol für die Humanplasminogenaktivatoraktivität.

Anstelle von 2-Mercaptoäthanol können auch andere Reduktionsmittel, wie Dithioerythrit oder Dithiothreit, verwendet werden, um die Disulfidbrücken in den Plasmin-r molekülen aufzuspalten. Als Alkylierungsmittel kann Natriumjodacetat verwendet werden, wie in den Beispielen 1 und 3 angegeben, es kann aber auch Jodacetamid oder irgendeinaanderes Alkylierungsmittel verwendet werden, von dem bekannt ist, daß es eine Schutzgruppe für eine freie Sulfhydrylgruppe liefert.

Das Plasminogen-Ausgangsmaterial braucht nicht rein zu sein. Es können auch rohe Präparate, die Plasmafraktionen enthalten oder sogar vollständiges Plasma enthalten, verwendet werden, da während der weiteren Verarbeitung des Materials eine Reinigung erfolgt« Anstelle von L-Lysin-substituierter Sepharose können in der chromatographischen Affinitätskolonne auch andere selektive Adsorbentien, wie z.B. L-Lysin-substituiertes Polyacrylamid oder L-Lysin-substituierte Agarose sowie durch L-Arginin oder D-Lysin substituierte Sepharose, Polyacrylamid oder Agarose verwendet werden. Die chromatographische Trennung kann gewünschtenfalls auch unter Anwendung eines diskontinuierlichen Verfahrens anstatt in einer Kolonne durchgeführt werden.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme

auf den äquimolaren Komplex aus der leichten (B) Plasmin kettenfraktion und Streptokinase näher erläutert, es ist

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jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion auch brauchbare Komplexe bildet mit allen anderen Substanzen, die äquimolare Komplexe mit Humanplasminogen bilden, unter Erzeugung eines Aktivators, wie z.B. Staphylokinase. Solche Komplexe werden auf die vorstehend für die Komplexe mit Strepokinase beschriebene Weise hergestellt und sie sind ebenso wertvoll wegen ihrer fibrinolytischen Aktivität.

Die erfindungsgemäßen äquimolaren Komplexe werden, wenn sie wegen ihrer fibrinoIytischen Wirkung an einen Patienten verabreicht werden, am besten intravenös verabreicht. Sie können&llmählich (portionsweise) über einen längeren Zeitraum in einer in einer physiologischen Glukose-Kochsalz-Lösung verdünnten Form verabreicht werden oder sie können in einer konzentrierteren Form, gelöst in einer physiologischen Glukose-Kochsalz-Lösung,verabreicht werden, entweder allein oder in Mischung mit anderen Materialien, wie z.B. Humanalbumin. Die Dosen können in Abhängigkeit von dem Zustand des Patienten variieren und sie liegen im allgemeinen innerhalb des Bereiches von 0,01 bis 1,0 mg/kg Körpergewicht/Tag.

Die Komplexe können in flüssiger Form in Ampullen in Form einer Lösung in einer physiologischen Glukose-Kochsalzlösung oder in einer Albumin enthaltenden Kochsalzlösung abgepackt sein. Sie können auch in trockener Form als Pulver in Mischung mit Humanalbumin, hergestellt durch Lyophilisieren einer Lösung des Komplexes mit Albumin, abgepackt sein.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf kei-

neswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

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Claims

Patentansprüche

1. Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin, g e k e η η · zeichnet durch ein aktives Serinprotease-Zentrum.

2. Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie abgeleitet ist von einem Stammplasmin mit einer proteolytischen Aktivität und daß sie eine geringere proteolytische Aktivität als das Stammplasmin, bezogen auf eine äquimolare Basis, aufweist.

3. Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Stammplasmin um Humanplasmin handelt.

4-. Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Human-Stamraplasmin aus Plasminogen hergestellt worden ist, das zur Inaktivierung von Virenverunreiniguhgen wärmebehandelt wurde.

5. Im wesentlichen äquimolarer Komplex aus Streptokinase und einer leichten (B) Kettenfraktion von Plasmin, gekennzeichnet durch ein aktives Serinproteasezentrum.

6. Komplex nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin von einem Stammplasmin mit einer proteolytischen Aktivität abgeleitet ist und daß der Komplex eine geringere proteolytische Aktivität als der äquimolare Komplex aus Streptokinase und dem Stammplasmin, bezogen auf eine äquimolare Basis, aufweist.

7· Komplex nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktipn von Humanplasmin abgeleitet ist.

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8. Komplex nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Humanplasmin hergestellt worden ist aus Plasminogen, das zur Inaktivierung von Virenverunreinigungen wärmebehandelt wurde.

9. Komplex nach den Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um das Reaktionsprodukt von Streptokinase mit einer leichten (B) Kettenfraktion von Plasmin handelt.

10. Komplex nach den Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine Fraktion eines Reduktionsproduktes eines äquimolaren Komplexes aus Streptokinase und Plasminogen oder Plasmin handelt.

11. Komplex nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Rinder-Plasminogenaktivatoraktivität, gemessen auf einem Kaseinsubstrat, von etwa 100 bis etwa 600 CTA-Einheiten/n Mol Protein aufweist.

12. Verfahren zur Herstellung einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinproteasezentrum, dadurch gekennzeichnet, daß man Plasmin mit einem reversiblen aktiven Serinproteasezentrums-Inhibitor mischt, an den Disulfidbindungen zwischen den Ketten die Plasminmoleküle in der Mischung reduziert unter Bildung eines Gemisches, das schwere (A) und leichte (B) Kettenfraktionen enthält, und anschließend die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch aus der schweren (A) und der leichten (B) Kettenfraktion vor der Trennung alkyliert.

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14. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkylierung mit einem Alkylierungsmittel aus der Gruppe Natriumjodacetat und Jodacetamid durchführt.

15· Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 14-, dadurch gekennzeichnet, daß man als Plasmin Humanplasmin verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß man Humanplasmin verwendet, das aus Plasminogen hergestellt worden ist, das zur Inaktivierung von Virenverunreinigungen wärmebehandelt wurde.

17· Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Serinprotease-Inhibitor um einen Vertreter aus der Gruppe Leupeptin und Benzamidin handelt.

18· Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung durch chromatographische Affinitäts-Adsorption durchgeführt wird.

19· Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographisehe Affinitäts-Adsorption an einem durch L-Lysin substituierten Adsorptionsmaterial durchgeführt wird und daß die leichte (B) Kettenfraktion nicht adsorbiert wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als chromatographisches Affinitäts-Adsorptionsmaterial einen Vertreter aus der Gruppe L-Lysin-substituierte Sepharose, L-Lysin-substituiertes Polyacrylamid und L-Lysin-substituierte Agarose, L-Arginin-substituierte Sepharose, L-Arginin-substituiertes Polyacrylamid, L-Arginin-substituierte Agarose, D-Lysin-substituierte Sepharose, D-Lysin-substituiertes Polyacrylamid und D-Lysin-substituierte Agarose verwendet.

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21. Verfahren zur Herstellung einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum, dadurch gekennzeichnet, daß man Humanplasmin, das aus Plasminogen hergestellt worden ist, das mindestens 10 Stunden lang bei mindestens 60⁰C wärmebehandelt wurde, mit Leupeptin mischt, das Reaktionsprodukt mit 2-Mercaptoäthanol reduziert unter Bildung einer Mischung aus schweren (A) und leichten (B) Kettenfraktionen, diese Mischung mit Natriumjodacetat alkyliert und anschließend durch Eluieren aus einer L-Lysin-substituierten Sepharose-Kolonne die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt und die leichte (B) Kettenfraktion in der nicht-adsorbierten Fraktion gewinnt.

22. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Streptokinase und einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum, dadurch gekennzeichnet, daß man die leichte (B) Kettenfraktion, die nach dem Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 21 hergestellt worden ist, mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge Streptokinase umsetzt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 1,0 Mol der leichten (B) Kettenfraktion mit etwa 0,9 Mol Streptokinase umsetzt.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung aus der schweren (A) Kettenfraktion und der leichten (B) Kettenfraktion vor der Trennung alkyliert.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkylierung mit einem Alkylierungsmittel aus der Gruppe Natriumjodacetat und Jodacetamid durchführt.

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26. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Streptokinase und einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum, dadurch gekennzeichnet, daß man Humanplasmin, das aus Plasminogen hergestellt worden ist, das mindestens 10 Stunden lang bei mindestens 60°C wärmebehandelt wurde, mit Leupeptin mischt, das Reaktionsprodukt mit 2-Mercaptoäthanol reduziert unter Bildung einer Mischung aus schweren (A) und leichten (B) Kettenfraktionen, die Mischung mit Natriumjodacetat alkyliert, die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion durch Eluieren aus einer L-Lysin-substituierten Sepharose-Kolonne trennt und die leichte (B) Kettenfraktion in der nicht-adsorbierten Fraktion gewinnt und anschließend die gewonnene leichte (B) Kettenfraktion mit Streptokinase umsetzt in einem Molverhältnis von etwa 1,0 Mol der leichten (B) Kettenfraktion auf etwa 0,9 Mol Streptokinase.

27. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Streptokinase und einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion mit einem aktiven Serinprotease-Zentrum, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substanz aus der Gruppe Humanplasminogen, das mindestens 10 Stunden lang bei mindestens 60°C wärmebehandelt worden ist, und Plasmin, das aus Humanplasminogen hergestellt worden ist, das mindestens 10 Stunden lang bei mindestens 60°C wärmebehandelt wurde, mit einer etwa äquimolaren Menge Streptokinase umsetzt unter Bildung eines Streptokinasekomplexes damit, das Reaktionsprodukt an den Disulfid-Bindungen zwischen den Ketten der Plasminmoleküle reduziert unter Bildung eines schweren (A) Kettenfraktion- und eines leichten (B) Kettenfraktion-Streptokinase-Komplexes und anschließend den leichten (B) Kettenfraktion-Streptokinase-Komplex von dem der schweren (A) Kettenfraktion trennt.

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28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung aus dem schweren (A) Kettenfraktion-' und dem leichten (B) Kettenfraktion-Streptokinase-Komplex vor der Trennung alkyliert.

29· Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkylierung mit einem Alkylierungsmittel aus der Gruppe Natriumjodacetat und Jodacetamid durchführt.

30. Verfahren nach den Ansprüchen 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung durch Chromatographisehe Affinitäte~Adsorption durchführt.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die chromatographische Affinitäts-Adsorptioh an einem L-Lysin-substituierten Adsorptionsmaterial durchführt und daß der leichte (B) Kettenfraktion-Streptokinase-Komplex nicht adsorbiert wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als chromatographisches Affinitäts-Adsorptionsmaterial einen Vertreter aus der Gruppe L-Lysin-substituierteSepharose, L-I<ysin-substituiertes Polyacrylamid und L-Ijysin-substituierte Agarose, L-Arginin-substituierte Sepharose, L-Arginin-substituiertes Polyacrylamid, I»- Arginin-substituierte Agarose, D-Lysin-substituierte Sepharose, D-Lysin-substituiertes Polyacrylamid und D-I^ysin-substituierte Agarose verwendet.

33. Arzneimittel für die intravenöse Behandlung eines Blutgerinnsels in dem Kreislaufsystem eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß es eine physiologische Kochsalzlösung des äquimolaren leichten (B) Ketienfraktion-Streptokinase-Komplexes nach den Ansprüchen 5 bis 11 enthält oder daraus besteht.

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