DE60036017T3

DE60036017T3 - Verfahren zur thrombolyse durch lokale behandlung mit reversibel inaktiviertem, angesäuertem plasmin

Info

Publication number: DE60036017T3
Application number: DE60036017.2T
Authority: DE
Inventors: Valery Novokhatny; Gary Jesmok; Kyle LANDSKRONER; Kathryn Taylor; Thomas Zimmerman
Original assignee: Grifols Therapeutics LLC
Current assignee: Grifols Therapeutics LLC
Priority date: 1999-11-13
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2017-08-31
Anticipated expiration: 2020-11-14
Also published as: DK1232254T3; EP1232252A4; PT1232252E; BE2013C050I2; DE60040345D1; US20130164273A1; ES2290058T3; US20030012778A1; DK1232252T3; CY2013030I1; JP5025868B2; CA2389487A1; DE60036017T2; WO2001036608A8; EP1232252A1; CY2013030I2; US20020192794A1; US20080311105A1; DE60042214D1; AU3643601A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf ein Verfahren zur Thrombolyse unter Verwendung eines reversibel inaktivierten angesäuerten Plasmins, das im Wesentlichen frei von Plasminogenaktivatoren ist, und die lokale Verabreichung des angesäuerten Plasmins nahe einem oder direkt innerhalb eines Thrombus. Das therapeutische Verfahren ist insbesondere für die Auflösung von Thromben anwendbar, wenn eine Katheter-vermittelte Verabreichung möglich ist.
Hintergrund
Thrombotische Erkrankungen sind ein Hauptgrund für Morbidität und Mortalität in der modernen Welt. Der akute Herzinfarkt und der ischämische Schlaganfall sind die erste und dritte Ursache für Tod und Arbeitsunfähigkeit in westlichen Gesellschaften. Die okklusive Thrombose resultiert in einem Verlust des Blutflusses zu den lebenswichtigen Organen, was lokalen Sauerstoffmangel, Zellnekrose und den Verlust der Organfunktion verursacht. Die schnelle Zerstörung eines Thrombus, die zu einer frühen Rekanalisation führt, bringt bedeutende Vorteile mit sich: Sie verhindert den Zelltod, reduziert die Infarktgröße, erhält die Organfunktion und reduziert die frühe und späte Mortalität. Eine thrombolytische Therapie wird heutzutage weltweit an mehr als 750.000 Patienten pro Jahr verabreicht, während eine Vielzahl dieser Zahl potenziell von einer solchen Behandlung profitieren könnte.
Thrombolytische Mittel, die heutzutage für die Lyse von okklusiven Blutgerinnseln verwendet werden, sind Plasminogenaktivatoren. Mehrere unterschiedliche Plasminogenaktivatoren sind derzeit für die unmittelbare klinische Verwendung verfügbar und mehrere Plasminogenaktivatoren einer neuen Generation sind der Gegenstand klinischer Studien: Der Gewebeplasminogen-Aktivator, tPA, und sein Nachfolger der zweiten Generation TNK-tPA, RETEPLASE^TM (eine Deletionsmutante von tPA), der Einzelkettenurokinase-Typ Plasminogenaktivator (scuPA, oder Pro-Urokinase), Urokinase (UK), Streptokinase (SK) und der anisoylierte Plasminogenstreptokinase-Aktivatorkomplex (APSAC). tPA, scuPA und UK werden in Menschen normalerweise in niedrigen Mengen gefunden. Streptokinase ist ein bakterielles Enzym mit einer starken thrombolytischen Aktivität. APSAC ist ein anisoylierter Streptokinase-Plasminogenkomplex. In allen Fällen sind die Plasminogenaktivatoren in der Lage, das Zymogenplasminogen in das aktive Proteaseplasmin umzuwandeln. Der Vorteil, der durch tPA und scuPA (und in einem geringeren Maße APSAC) dargebracht wird, ist, dass deren Aktivierung des Plasminogens fibrinspezifisch ist; die Bindung an Fibrin ist eine Voraussetzung dafür, dass ihre vollständige proteolytische Aktivität verwirklicht wird (Haber et al., 1989). Urokinase und Streptokinase können Plasminogen in der Abwesenheit von Fibrin aktivieren. Eine solche Variation in der Affinität für Fibrin hat wichtige Konsequenzen hinsichtlich des Ausmasses, mit dem systemische Blutungen in Tiermodellen auftreten; diese Unterschiede sind jedoch noch nicht klinisch ausgewertet worden.
Plasminogenaktivatoren üben ihr thrombolytisches Potential üblicherweise durch die Aktivierung von zirkulierendem Zymogenplasminogen in Plasmin aus. Plasmin, das grundsätzliche fibrinolytische Enzym in Säugetieren, ist eine Serinprotease mit Trypsin-ähnlicher Spezifität, die von dem inaktiven Zymogenvorläufer-Plasminogen abgeleitet ist, welches im Plasma zirkuliert. Plasminogen selbst ist ein 791 Aminosäurepolypeptid, das einen Glutamatrest am N-Terminus hat. Plasminogenaktivatoren, wie der Gewebeplasminogenaktivator (tPA) oder Urokinase, spalten das Einzelketten-Plasminogenmolekül an der Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶² Peptidbindung, um aktives Plasmin zu produzieren. Die zwei resultierenden Polypeptidketten des Plasmins werden durch zwei Zwischenketten-Disulfidbrücken zusammengehalten. Die leichte Kette von 25 kDA trägt das katalytische Zentrum und ist zu Trypsin und anderen Serinproteasen homolog. Die schwere Kette (60 kDA) besteht aus fünf Tripel-Loop-Kringle-Strukturen mit hochgradig ähnlichen Aminosäuresequenzen. Einige dieser Kringles enthalten sogenannte Lysinbindestellen, die für die Wechselwirkung von Plasminogen und Plasmin mit Fibrin, α₂-Antiplasmin oder anderen Proteinen verantwortlich sind.
Das innewohnende Problem bei der therapeutischen Verwendung von existierenden Plasminogenaktivatoren, wie tPA, UK und SK, sind mit deren Verwendung assoziierte Blutungskomplikationen, einschließlich z. B. gastrointestinaler Blutung bei bis zu 20% der Patienten. Die intercraniale Blutung, die klinisch die gravierendste ist, ist ein häufiger und tödlicher Nebeneffekt der derzeitigen thrombolytischen Therapie und tritt bei ungefähr 1% der Patienten auf. Der Mechanismus der Blutung ist multifaktoriell und es wird davon ausgegangen, dass dieser auf der Bloßstellung einer Gefäßverletzung durch Lyse eines schützenden hämostatischen Pfropfens und dem anschließenden Verlust der vasculären Integrität beruht. Dieses wird mit der systemischen Aktivierung des fibrinolytischen Systems und dem diese begleitenden Schwund von Gerinnungsfaktoren kombiniert. Der Focus der jüngsten Forschung lag auf der Herstellung modifizierter Plasminogenaktivatoren, die eine verbesserte Fibrinspezifität zeigen; hiervon wurde erwartet, die Menge der Blutungskomplikationen zu reduzieren. In einigen Fällen neigen diese neuen Aktivatoren dazu, die Zirkulationsspiegel solcher Gerinnungsfaktoren, wie Fibrinogen, Faktoren VIII und V, Plasminogen und α₂-Antiplasmin, zu erhalten. Sie zielen spezifisch auf und binden an die Fibrinmoleküle, die in einem Thrombus anwesend sind, und werden nur auf Plasminogen einwirken, wenn sie so gebunden sind. Dieses führt zu dem Ergebnis, dass Plasminogen nur in der Nachbarschaft der Thrombose zum aktiven Proteaseplasmin gespalten wird, und dass das Level an nicht-spezifischer systemischer Spaltung von Fibrin reduziert wird. Die Anzahl von Blutungskomplikationen bei diesen neuen Plasminogenaktivatoren bleibt jedoch signifikant.
Der klinische Erfolg thrombolytischer Wirkstoffe, wie Gewebeplasminogenaktivator (tPA), Streptokinase und Urokinase bei der Reduzierung des Ausmaßes eines thrombotischen Verschlusses eines Blutgefäßes ist bekannt. Plasminogenaktivatoren sind daher bei der Handhabung von akutem Herzinfarkt und einigen anderen thrombotischen Zuständen die Behandlung der Wahl geworden. Nichtsdestotrotz verbleiben verschiedene Erkrankungen, einschließlich Herzinfarkt, okklusiver Schlaganfall, tiefe Venenthrombose und periphere arterielle Erkrankung ein ernstes klinisches Problem und die bekannten derzeitig verwendeten Plasminogenaktivatoren leiden an zahlreichen Einschränkungen, die deren allgemeine Nützlichkeit bei der Beseitigung eines Thrombus beeinträchtigen. Beim Herzinfarkt wird der vasculäre Fluss bei ungefähr 50% der Patienten innerhalb von 90 Minuten wiederhergestellt, während ein akuter coronarer Wiederverschluss bei grob 10% der Patienten auftritt. Die coronare Rekanalisation benötig im Durchschnitt 45 Minuten oder mehr. Die verbleibende Mortalität, die sich in erster Linie aus intracerebraler Blutung ergibt, beträgt immer noch wenigstens 50% der Sterblichkeitsrate in der Abwesenheit einer Thrombolysebehandlung.
Der größte Teil der Forschung auf dem Gebiet der Thrombolytica hat sich auf die Verbesserung der Wirksamkeit und der Fibrinspezifität von existierenden Plasminogenaktivatoren, sowie das Finden neuer fokussiert. Viele dieser Bemühungen haben sich darauf konzentriert, die Plasminogenaktivatoren zum Fibrin zu lenken, welches das Gerüst eines Thrombus bildet, und die Pharmacokinetik der Aktivatoren zu verbessern, wenn diese in den Blutstrom verabreicht werden. Dieses würde deren Verabreichung als Bolusdosen anstatt einer kontinuierlichen Verabreichung erlauben, was die Exposition des Patienten gegenüber dem aktiven Mittel und dem begleitenden Risiko einer unerwünschten systemischen Blutung verlängert.
Basierend auf den Ergebnissen von Phase II klinischen Studien mit gerichteten Plasminogenaktivatoren, wie TNK-tPA, Plasminogenaktivator des Vampirfledermausspeichels, ist die erwartete Verbesserung der Sicherheitsprofile von neuen Plasminogenaktivatoren infolge einer thrombolytischen Therapie jedoch nicht klinisch realisiert worden. Der Prozentsatz von mäßigen und starken Blutungsvorfällen, einschließlich intercranialer Blutung und Schlaganfall, waren mit dem originalen, unmodifizierten tPA vergleichbar. Die verstopften Arterien wurden nicht früher geöffnet und die Rate von Wiederverschlüssen verblieb unverändert. Es hatte den Anschein, dass der einzige Vorteil, den diese Aktivatoren haben, die verlängerte Plasma-Halbwertszeit und die Möglichkeit der Bolusverabreichung ist.
Ein anderes Problem bei Plasminogenaktivatoren ist, dass diese eine begrenzte Wirksamkeit bei der Behandlung von langen Blutgerinnseln haben, die bei peripheren arteriellen Verschlüssen (PAO) gefunden werden. Diese Thromben sind typischerweise gealtert und können zu einer signifikanten Größe heranwachsen. Die durchschnittliche Größe von peripheren Thromben, die sowohl in den nativen Arterien als auch Transplantaten gefunden wird, ist 31 ± 11 cm. Gealterte und eingezogene Thromben weisen kein Plasminogen auf, was daher die Empfänglichkeit von alten Thromben gegenüber Plasminogenaktivator-induzierter Thrombolyse einschränkt. Es ist durchaus gewöhnlich, dass ein Patient mit PAO für 24 Stunden oder mehr mit Urokinase behandelt wird und sogar nach dieser ausgedehnten Zeitdauer nicht die komplette Durchgängigkeit des Blutgefäßes aufweist. Bei der Verabreichung von existierenden thrombolytischen Mitteln über einen Katheter direkt in das Innere eines Thrombus, wo erniedrigte Levels des Plasminogensubstrats vorherrschen, ist das Problem größer.
Ein grundlegend anderer Ansatz, um die Probleme zu vermeiden, die mit der systemischen Verabreichung eines Plasminogenaktivators verbunden sind, um ausreichendes Plasmin an der Stelle des Thrombus zu erzeugen, ist es, Plasmin selbst direkt an den Patienten zu verabreichen. Dies ist so, da Plasmin letztendlich das Enzym ist, welches die Thrombolyse, die durch Plasminogenaktivatoren iniiziiert wird, vermittelt. Die direkte Verabreichung von aktivem Plasmin direkt in zurückgezogene Thromben würde das innewohnende Plasminogendefizit dieser Thromben umgehen und eine vorhersagbare, schnelle und effektive Thrombolyse bereitstellen, die unabhängig vom Plasminogengehalt ist.
Reich et al. offenbaren in U.S. Patent Nr. 5,288,489 eine fibrinolytische Behandlung, die die parenterale Verabreichung von Plasmin in den Körper eines Patienten einschließt. Die Konzentration und Behandlungszeit waren ausreichend, um es dem aktiven Plasmin zu erlauben, an der Stelle eines intravasculären Thrombus eine Konzentration zu erreichen, die ausreichend ist, den Thrombus aufzulösen, oder die Levels des zirkulierenden Fibrinogens zu erniedrigen. Reich et al. setzen jedoch die Erzeugung des Plasmins aus Plasminogen direkt vor dessen Einbringen in den Körper voraus.
Im Gegensatz dazu offenbart Jenson in U.S. Patent Nr. 3,950,513 eine Herstellung von Schweineplasmin, von der behauptet wird, dass sie bei niedrigem pH stabilisiert sei. Die Plasminlösung wird für die thrombolytische Therapie vor der systemischen Verabreichung an Menschen neutralisiert.
Yago et al. offenbaren in U.S. Patent Nr. 5,879,923 Plasminzusammensetzungen, die als ein diagnostisches Reagens nützlich sind. Die Zusammensetzungen von Yago et al. bestehen aus niedrigen Konzentrationen von Plasmin bei einem neutralen pH und einer zusätzlichen Komponente, die 1) ein Oligopeptid umfassend zumindest zwei Aminosäuren, oder 2) zumindest zwei Aminosäuren, oder 3) eine einzelne Aminosäure und ein mehrwertiger Alkohol sein kann.
Plasmin repräsentiert eine zweite mechanistische Klasse von thrombolytischen Mitteln, die sich von der Klasse der Plasminaktivatoren unterscheiden. Obwohl Plasmin als ein potentielles thrombolytisches Mittel erforscht worden war, haben zahlreiche technische Schwierigkeiten die wirkungsvolle klinische Verwendung dieses fibrinolytischen Enzyms verhindert. Diese Schwierigkeiten schlossen die Herausforderung ein, reines Plasmin herzustellen, welches frei von allen funktionellen Spuren des Plasminogenaktivators ist, welcher verwendet wurde, um Plasmin aus dem inaktiven Vorläuferplasminogen zu erzeugen. Die thrombolytische Aktivität dieser frühen Plasminpräparationen wurde schlussendlich der Gegenwart von kontaminierenden Plasminogenaktivatoren anstelle der von Plasmin selbst zugeschrieben. Die kontaminierenden Plasminogenaktivatoren lösten jedoch auch systemische Blutungen an anderen Stellen als dem angezielten Thrombus aus. Ein weiterer Nachteil von Streptokinase, die für die Plasminpräparation verwendet wurde, ist, dass deren Vorhandensein in einer Plasminpräparation häufig nachteilige Immunantworten einschließlich Fieber und anaphylaktischem Schock verursacht.
Die wichtigste Einschränkung für die klinische Verwendung von Plasmin ist, dass es als eine Serinprotease mit weiter Spezifität hochanfällig für Autodegradation und Aktivitätsverlust bei physiologischem pH ist. Dieses führt zu massiven Herausforderungen bei der Produktion von stabilen Plasminformulierungen hoher Qualität, die geeignet sind, für ausgedehnte Zeiträume vor der Verwendung gelagert zu werden, und bei der sicheren und wirkungsvollen Verabreichung von Plasmin an menschliche Patienten, die an verschließenden Thromben leiden.
Was daher benötigt wird, ist ein Verfahren zur Verabreichung einer stabilen Form von aktivem Plasmin, das im Wesentlichen frei ist von Plasminogenaktivatoren und das bei In-Berührung-Kommen mit einem angezielten vasculären thrombotischen Verschluss aktiv ist.
Was ebenfalls benötigt wird, ist ein Verfahren zur Lyse von Thromben, welches direkt eine aktivierbare Form von aktivem Plasmin über einen Katheter in das Innere des Thrombus liefert.
Was weiterhin benötigt wird, ist ein Verfahren zur Thrombolyse, in welchem ein verabreichtes thrombolytisches Mittel auf die thrombotische Stelle beschränkt ist, und welches eine reduzierte systemische und besonders intracraniale Blutung aufweist.
Diese und andere Ziele und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den folgenden Ansprüchen vollständig offenkundig werden, oder können durch die Ausführung der Erfindung erlernt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, dass die thrombolytische Therapie durch die Verabreichung von reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin direkt in oder nahe eines Thrombus verbessert werden kann. Aufgereinigtes Plasmin ist wegen der Autodegradation bei physiologischem pH instabil und daher war Plasmin nicht ohne Weiteres für die therapeutische Verabreichung verfügbar. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer fibrinolytischen Zusammensetzung an einen Menschen oder ein Tier mit vasculärem thrombotischem Verschluss zur Verfügung, umfassend die Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer pharmazeutische akzeptablen reversibel inaktivierten angesäuerten fibrinolytischen Zusammensetzung, die im Wesentlichen von Plasminogenaktivator frei ist. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer reversibel inaktivierten angesäuerten fibrinolytischen Zusammensetzung zur Verfügung, die Plasmin und einen pharmazeutischen annehmbaren angesäuerten Träger umfasst, worin der pharmazeutisch annehmbare Träger eine niedrige Pufferkapazität hat.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer reversibel inaktiviertem angesäuerten fibrinolytischen Zusammensetzung zur Verfügung, worin die fibrinolytische Zusammensetzung Plasmin und einen pharmazeutisch annehmbaren angesäuerten Träger umfasst, worin der pharmazeutisch annehmbare angesäuerte Träger Wasser und eine pharmazeutisch annehmbare Säure umfasst, die aus den Säureformen von Carbonsäuren, Aminosäuren oder anderen Verbindungen ausgewählt ist, die eine niedrige Pufferkapazität haben, und worin der angesäuerte Träger einen pH von weniger als ungefähr 4,0 hat.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis eines reversiblen inaktivierten angesäuerten Plasmins und eines pharmazeutisch annehmbaren angesäuerten Trägers zur Verfügung, weiterhin umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Stabilisator wie z. B., aber nicht limitiert auf, einen Zucker oder einen mehrwertigen Alkohol.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die fibrinolytische Zusammensetzung eine reversibel inaktivierte angesäuerte Serinprotease, die im Wesentlichen frei ist von ihrem jeweiligen Aktivator, einen Puffer mit geringer Pufferkapazität und optional ein Stabilisierungsmittel. Solche Serinproteasen schließen Trypsin, Chymotrypsin, pankreatische Elastase II, Cathepsin G, Prostata-spezifisches Antigen, Leukocyten-Elastase, Chymase, Tryptase, Acrosin, humanes Gewebe-Kallikrein und Plasmin ein. Plasmin schließt Glu-Plasmin, Lys-Plasmin, Derivate und modifizierte oder trunktierte Varianten davon ein, einschließlich, jedoch nicht limitiert auf Midi-Plasmin, Mini-Plasmin oder Mikro-Plasmin.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen saure Bedingungen und Stabilisatoren, die das Plasmin für die Lagerung stabilisieren. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Plasmin wird durch die Aktivierung von Plasminogen erhalten und wird in einer angesäuerten Lösung isoliert und gelagert, die einen pH von weniger als ungefähr 4 hat, um eine stabile Formulierung des Plasmins bereitzustellen. Die fibrinolytische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann lyophilisiert werden und ist im Wesentlichen frei von Plasminogenaktivator. Die niedrige Pufferkapazität der Plasminzusammensetzung erlaubt die schnelle Titration auf einen physiologischen pH, wenn diese an einen Thrombus oder an ein Serum verabreicht wird. Das angesäuerte Plasmin wird schnell neutralisiert und aktiviert, wenn es für die thrombolytische Therapie in einer Lösung mit geringer Pufferkapazität direkt an die Stelle des Gerinnsels verabreicht wird.
Zusätzliche Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden bei der Durchsicht der detaillierten Beschreibung, die unten dargelegt ist, offenkundiger, wenn diese in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen gesehen wird, die wie folgend kurz beschrieben werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 veranschaulicht die pH-Abhängigkeit der Plasminaktivität, wie mit dem chromogenen Substrat S2251 gemessen.
2 veranschaulicht die Plasminstabilität in angesäuertem Wasser (pH 3,7), wie mittels eines caseinolytischen Assays gemessen.
3 veranschaulicht ein Diagramm des pHs versus Prozent schwerer Kette, relativ zum Gesamtprotein in jeder Spur von SDS-Gelen.
4 veranschaulicht die Wirksamkeit von Plasmin oder tPA plus Plasminogen bei der Thrombolyse.
5 veranschaulicht die thrombolytische Wirksamkeit von aktivem Plasmin.
6 veranschaulicht den Effekt von Plasma-Inhibitoren auf die Plasmin-induzierte Thrombolyse.
7 vergleicht die lokale Verabreichung von tPA oder Lys-Plasmin auf die Wiederherstellung des Blutflusses und den FVIII- und Fibrinogenverbrauch nach 60 Minuten.
8 vergleicht die lokale Verabreichung von tPA oder Lys-Plasmin auf die Wiederherstellung des Blutflusses nach 90 Minuten und den FVIII- und Fibrinogenverbrauch nach 60 Minuten.
9 veranschaulicht den Effekt der lokalen Verabreichung von tPA versus Plasmin auf Nagelhaut-Blutungszeiten.
10 veranschaulicht die Lyse zurückgezogener Blutgerinnsel mit einer äquimolaren Menge an reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin oder Mini-Plasmin.
11 vergleicht die lokale Verabreichung von tPA und Plasmin auf die Thrombuslyse und den Faktor VIII- und Fibrinogenverbrauch nach 60 Minuten.
12 vergleicht die lokale Verabreichung von tPA und Plasmin auf die Thrombuslyse nach 90 Minuten und den Faktor VIII- und Fibrinogenverbrauch nach 60 Minuten.
13 veranschaulicht die Risiko-/Nutzen-Auswertung von Plasmin versus tPA.
14 veranschaulicht den fortschreitenden Zerfall einer Plasminzusammensetzung bei einem pH von 2,2, 2,5 oder 3,7.
15 veranschaulicht die Spaltungsstellen, die in Plasmin bei pH 2,2 und 3,8 erzeugt werden.
16 veranschaulicht die Stabilität eines reversibel inaktivierten angesäuerten Plasmins bei 37°C bei einem pH von 3,7 mit Kohlenhydratstabilisatoren.
17 veranschaulicht die Stabilität eines reversibel inaktivierten angesäuerten Plasmins bei 37°C bei einem pH von 3,7 mit Glucosamin, Niacinamid, Thiamin oder Citrullin als Stabilisierungsmittel.
18 veranschaulicht die Titration von Plasminlösungen mit verschiedenen Puffern geringer Pufferkapazität mit humanem Serum.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eine volle und ausführbare Offenbarung der vorliegenden Erfindung einschließlich der besten Art, die den Erfindern bekannt ist, diese Erfindung auszuführen, wird noch genauer im restlichen Teil der Beschreibung dargelegt, einschließlich der Bezugnahme auf die Beispiele. Diese Beschreibung wurde zum Zwecke der Veranschaulichung der allgemeinen Prinzipien der Erfindung erstellt und sollte nicht im einschränkenden Sinn aufgefasst werden.
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit dem Bedarf für ein Verfahren für die Thrombolyse, welches die Verwendung einer fibrinolytischen Zusammensetzung erlaubt, die ein reversibel inaktiviertes angesäuertes Plasmin umfasst und die ortsgebundene Verabreichung des Plasmins an einen thrombotischen Verschluss. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer fibrinolytischen Zusammensetzung an einen Menschen oder ein Tier mit einem thrombotischen Verschluss nach Anspruch 1 bereit, umfassend die parenterale Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer pharmazeutisch annehmbaren reversibel inaktivierten angesäuerten fibrinolytischen Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei ist von Plasminogenaktivator, an den Menschen oder das Tier, es der verabreichten fibrinolytischen Zusammensetzung erlauben zu lassen, mit dem thrombotischen Verschluss zu interagieren, Überwachung des Grads des vasculären Flusses des Menschen oder des Tiers und Wiederholung dieser Schritte, bis ein zuvor ausgewählter Grad an vasculärem Fluss erreicht ist. Das erfindungsgemäße Verfahren nach Anspruch 1 gewährleistet weiterhin die Verwendung einer fibrinolytischen Zusammensetzung, die ein reversibel inaktiviertes angesäuertes Plasmin in einem Puffer mit niedriger Pufferkapazität umfasst, das im Wesentlichen frei ist von Plasminogenaktivator. Das Verfahren gewährleistet ebenfalls die direkte intravasculäre Verabreichung der fibrinolytischen Zusammensetzung über einen Katheter in oder in die direkte Nachbarschaft des Thrombus, wobei die systemische Degradierung des Fibrins minimiert wird, während die maximale Plasminaktivität gegen den Thrombus bewahrt wird.
Mit der steigenden Verwendung von arteriellen und venösen Kathetern in den Kliniken, bietet die lokale Verabreichung von reversibel inaktiviertem angesäuerten Plasmin in die enge Nachbarschaft zu einem, oder sogar in einen Thrombus, eine attraktive therapeutische Möglichkeit für die Thrombolyse an. Als aktive Serinprotease ist Plasmin im Gegensatz zu Plasminogenaktivatoren, die die Gegenwart des Zymogenplasminogens in der Nähe des Thrombus erfordern, ein den Thrombus direkt auflösendes Mittel. Die lokale Katheter-dirigierte thrombolytische Therapie mit aktivem Plasmin kann reguliert werden, um eine örtlich begrenzte Thrombolyse zu erzielen, und Plasmin hat das Potenzial, ein sichereres thrombolytisches Mittel zu sein, da die benötigte niedrigere Dosierung für die lokale Verabreichung die Blutungskomplikationen signifikant reduzieren kann, die häufig mit einer hochdosierten thrombolytischen Therapie, die durch Plasminogenaktivatoren induziert wird, einhergehen. Jegliches Auslaufen von Plasmin von der direkten Nachbarschaft der Thrombusstelle wird schnell durch zirkulierendes α₂-Antiplasmin neutralisiert werden.
Es gibt verschiedene technische Herausforderungen, die mit der Aufreinigung und Lagerung von Plasmin, als auch mit dessen therapeutischer Verwendung und Verabreichung verbunden sind. Plasmin ist eine aktive Serinprotease und unterliegt dem Selbstverdau und der Inaktivierung bei physiologischem pH. Unglücklicherweise ist die Plasmindegradierung ebenfalls in dem pH-Bereich am ausgeprägtesten, der für die in vivo Thrombolyse benötigt wird.
Die in die vorliegende Erfindung eingebundene fibrinolytische Zusammensetzung schließt die Aufrechterhaltung von Plasmin während der Aufreinigung in einem sauren Puffer sowie dessen Formulierung in einem angesäuerten Träger mit einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer mit geringer Pufferkapazität ein, wodurch eine fibrinolytiosche Zusammensetzung bereitgestellt wird, die reversibel inaktiviertes angesäuertes Plasmin enthält, die im Wesentlichen frei von Plasminogenaktivator ist. Es wird als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegend erachtet, dass die fibrinolytische Zusammensetzung eine lyophilisierte Zusammensetzung sein kann, die durch Zugabe eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers wie, aber nicht beschränkt auf, Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder jeglichem anderen Lösungsmittel, das die Verabreichung der Zusammensetzung an einen Menschen oder ein Tier erlaubt, rekonstituiert werden kann. Ihre Wirksamkeit bei der Wiederherstellung vasculärer Durchgängigkeit wurde in in vitro Assays und in einem in vivo Kaninchen-Jugularvenen-Thrombolyse-Modell demonstriert.
Der Begriff „reversibel inaktiviert”, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine enzymatische Aktivität, die unter einer bestimmten Reihe von Bedingungen im Wesentlichen frei von Aktivität ist, aber zu einer aktiven Form zurückkehrt, wenn sie in eine andere Reihe von Bedingungen überführt wird.
Der Begriff „pharmazeutisch annehmbarer Träger”, wie hier verwendet, bezieht sich auf jeglichen Träger, der von einem menschlichen oder tierischen Empfänger toleriert wird, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Wasser, Salzlösungen, physiologische Kochsalzlösung oder jegliche/jegliches andere Flüssigkeit oder Gel, in welcher/welchem ein fibrinolytischer Wirkstoff wie Plasmin gelöst oder suspendiert werden kann. Der „pharmazeutisch annehmbare Träger” kann jegliche pharmazeutisch annehmbare Verbindung einschließen, die zu einer Plasminlösung führt, die einen pH unter ungefähr 4,0 hat und die eine niedrige oder keine Pufferkapazität hat.
Der Begriff „Puffer mit niedriger Pufferkapazität”, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Menge an Säure oder Base, die ein Puffer neutralisieren kann, bevor der pH beginnt, sich um einen nennenswerten Grad zu verändern. Wie hier verwendet, wird der pH eines Puffers mit niedriger Pufferkapazität signifikant durch die Zugabe einer geringen Menge einer Säure oder einer Base relativ zu dem Volumen der Pufferlösung der niedrigen Pufferkapazität eingestellt. Dieser Begriff soll Lösungen einschließen, die mittels starker Säuren angesäuert wurden, einschließlich, jedoch nicht limitiert auf Salzsäure, Salpetersäure, oder Schwefelsäure, und die keine Pufferkapazität haben.
Der Begriff „physiologischer pH”, wie hier verwendet, bezieht sich auf einen pH zwischen ungefährt pH 6,5 und 7,5, typischer zwischen pH 7,1 bis 7,5.
Der Begriff „Thrombus”, wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Thrombus in einem Blutgefäß oder einer Vorrichtung, die Blut kontaktiert (z. B. Kathetervorrichtungen oder Shunts). Ein Thrombus kann Fibrin umfassen und kann weiterhin, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Blutplättchen, Erythrocyten, Lymphocyten, Lipide, Bestandteile des Serums oder jegliche Kombination davon umfassen. Ein „Thrombus” kann, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, ein ringförmiger Thrombus, ein Ball-Thrombus, ein hyaliner Thrombus, ein muraler Thrombus, ein geschichteter Thrombus oder ein weißer Thrombus sein.
Der Begriff „thrombotischer Verschluss”, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine teilweise oder totale Blockade eines Gefäßes aufgrund der Bildung eines thrombotischen Blutgerinnsels, wobei der Thrombus zumindest Fibrin umfasst. Das verschlossene Blutgefäß kann, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, eine Vene, Arterie, kleine Vene, Arteriole, Kapillare, eine Strombahn oder das Herz sein und kann sich innerhalb jeglichem vascularisierten Organ oder Gewebe des menschlichen oder tierischen Körpers befinden. Der thrombotische Verschluss kann ebenfalls der eines Katheters oder anderen Implantats sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, pro sthetische Gefäße und Transplantate synthetischer, menschlicher oder tierischer Herkunft, die wirksam durch einen Verschluss blockiert sind, der Fibrin umfasst.
Der Begriff „Kathetervorrichtung”, wie hier verwendet, bezieht sich auf jeglichen Katheter oder jegliche röhrenförmige Vorrichtung, die in den Körper eindringen kann, und schließt, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, einen Arterienkatheter, einen Einschwemmkatheter, einen Zentralkatheter, einen zentralen Venenkatheter, einen intravenösen Katheter, Ballonkathetervorrichtungen, einen peripher inserierten Zentralkatheter, einen Pulmonalarterienkatheter, oder einen getunnelten zentralvenösen Katheter und arteriovenöse Shunts ein.
Der Begriff „pharmazeutisch annehmbarer angesäuerter Träger”, wie hier verwendet, bezieht sich auf jeglichen pharmazeutisch annehmbaren Träger, der auf einen pH von unter ungefähr 4,0 angesäuert wurde. Der „pharmazeutisch annehmbare angesäuerte Träger” kann einen Puffer ohne oder mit geringer Pufferkapazität umfassen, wie eine Carbonsäure wie, jedoch nicht beschränkt auf, Ameisen-, Essig-, Propion-, Butter-, Zitronen-, Bernstein-, Milch- oder Äpfelsäuren, die durch die Zugabe einer anorganischen Säure auf einen pH von unter ungefähr 4,0 angesäuert wurden; oder zumindest eine Aminosäure wie, jedoch nicht beschränkt auf, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Threonin oder Glutamin, oder zumindest eine anorganische Säure wie, jedoch nicht beschränkt auf, Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure oder jegliche Kombination davon. Als vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst wird auch der Säurerest des pharmazeutischen Trägers angesehen, der zumindest ein physiologisch tolerierter Puffer, ein Oligopeptid, ein anorganisches oder organisches Ion oder jegliche Kombination davon ist, der im pharmazeutischen akzeptablen Träger einen pH unterhalb eines Wertes von ungefähr 4,0 beibehält.
Der Begriff „Kohlenhydrat”, wie hier verwendet, bezieht sich auf jegliches pharmazeutisch annehmbares Saccharid oder Disaccharid wie, jedoch nicht beschränkt auf, Glucose, Fructose, Maltose oder Mannose, Zuckeralkohole einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Sorbitol und Mannitol und Polysaccharide wie, jedoch nicht beschränkt auf, Dextrine, Dextrane, Glycogen, Stärken und Cellulosen, oder jegliche Kombination oder Derivative davon, die pharmazeutisch annehmbar für Mensch oder Tier sind.
Der Begriff „Stabiliserungsmittel”, wie hier verwendet, bezieht sich auf zumindest eine Verbindung wie, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Glycerin, Ascorbat, Niacinamid, Glucosamin, Thiamin oder anorganisches Salz, wie, jedoch nicht beschränkt auf, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid oder Manganchlorid oder jegliche Kombination davon, die die Stabilität einer Präparation von Plasmin erhöhen.
Der Begriff „reversibel inaktiviertes angesäuertes Plasmin”, wie hier verwendet, bezieht sich auf jegliche katalytisch aktive Form von Plasmin, die unter physiologischen Bedingungen zur proteolytischen Spaltung von Fibrin fähig ist, jedoch reversibel inaktiviert ist, wenn sie einem pH zwischen ungefähr pH 2,5 bis ungefähr 4,0 ausgesetzt wird. Der Begriff „inaktiviert”, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine gesamte oder wesentliche Erniedrigung der enzymatischen Aktivität, verglichen mit der Aktivität bei physiologischem pH. Der Begriff „aktives Plasmin”, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Plasmin unter Bedingungen, bei denen das Plasmin in der Lage ist, Fibrin proteolytisch zu spalten. Der Begriff „Plasmin” schließt Glu-Plasmin, Lys-Plasmin, Derivate, modifizierte oder trunktierte Varianten davon ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Der Begriff „trunktierte Variante” schließt das Midi-Plasmin, das Mini-Plasmin oder das Mikro-Plasmin, wie in U.S. Patent Nr. 4,774,087 offenbart, ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „anti-coagulant”, wie hier verwendet, bezieht sich auf jegliche Verbindung, die in der Lage ist, die Bildung eines Thrombus zu verhindern, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Hiruidin, Heparin, Thrombin-Inhibitoren, Thrombozyten-Inhibitoren, Thrombozytenaggregations-Inhibitoren und jegliche Derivative oder Kombinationen davon.
Der Begriff „Serinprotease”, wie hier verwendet, bezieht sich auf jegliche Serinprotease, die zur proteolytischen Spaltung von Fibrin fähig ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Plasmin, Trypsin, Chymotrypsin, pankreatische Elastase II, Cathepsin G, Prostata-spezifisches Antigen, Leucocytenelastase, Chymase, Tryptase, Acrosin und humanes Gewebe-Kallikrein.
Eine Einschränkung der derzeitigen thrombolytischen Therapie mit Plasminogenaktivatoren ist die Verfügbarkeit von Plasminogen umgebend einen oder innerhalb eines Thrombus. Die lokale Verabreichung eines fibrinolytischen Mittels an einen Thrombus erlaubt es nun Plasmin selbst, ein wirkungsvolles therapeutisches Mittel zu sein, welches direkt an einen Thrombus verabreicht wird. Im Gegensatz zu verschiedenen Plasminogenaktivatoren, die derzeitig als Thrombolytica Verwendung finden, kann die direkte lokalisierte thrombolytische Therapie mit Plasmin auf jeglichen Grad verstärkt werden, der benötigt wird, um eine Lyse von Blutgerinnseln zu erzielen. Dies rührt daher, dass Plasmin direkt auf das Fibrinpolymer wirkt. Weiterhin erlaubt Plasmin, wenn es direkt in oder benachbart an einen Thrombus verabreicht wird, dass eine geringere wirksame Dosis mit einer begleitenden Erniedrigung der systemischen Blutung, die typischerweise mit der konventionellen thrombolytischen Therapie in Verbindung gebracht wird, verabreicht wird. Überschüssiges Plasmin kann weiterhin schnell durch zirkulierendes α₂-Antiplasmin inaktiviert werden.
Das hoch aufgereinigte aktive Plasmin der vorliegenden Erfindung wurde deshalb aus Plasminogen hergestellt, welches aus der Cohn-Fraktion II + III aufgereinigt worden war. Die Reinheit des Plasmins war größer als 95 und die spezifische Aktivität lag im Bereich von 18–23 CU/mg. Die Plasminpräparationen waren im Wesentlichen frei von Urokinase oder jeglichem anderen Plasminaktivator, der für die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin verwendet worden war. Die vorliegende Erfindung erwägt weiterhin, dass Plasmin, das im Wesentlichen frei von Plasminogenaktivatoren ist, aus jeglicher Quelle hergestellt werden kann, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Säugetierserum, ein rekombinantes Plasminogen oder ein trunktiertes Plasminogen wie, jedoch nicht beschränkt auf, das Mini-Plasminogen oder das Mikro-Plasminogen wie von Wu et al. in U.S. Patent Nr. 4,774,087 offenbart.
Das Plasmin der vorliegenden Erfindung wurde mittels Bindung an eine Benzamidin-Sepharose-Chromatographiesäule aufgereinigt, um die Plasminogenaktivatoren im Wesentlichen zu entfernen, und das eluierte Plasmin wurde in einem angesäuerten pharmazeutisch annehmbaren Träger mit einem Puffer geringer Pufferkapazität gesammelt und gelagert. Ein niedriger pH im Bereich von ungefähr 2,5 bis ungefähr 4,0 stabilisiert das Plasmin sogar dann signifikant, wenn es bei Raumtemperatur oder höher aufbewahrt wird. Ohne sich an irgendeine Theorie zu binden, wird davon ausgegangen, dass das Plasmin bei diesem niedrigen pH-Wert keine Serinproteaseaktivität mehr aufweist, die anderweitig zur Autodegradation des Plasmins führen würde, wie es auftreten würde, falls das Plasmin bei einem physiologischen pH von ungefähr 7,0–7,5 gelagert werden sollte.
Wenn das reversibel inaktivierte angesäuerte Plasmin in Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung direkt in einen Thrombus oder nahe desselben verabreicht wird, begegnet das reversibel inaktivierte angesäuerte Plasmin im Puffer mit der niedrigen oder nicht vorhandenen Pufferkapazität der Pufferkapazität des Serums beim physiologischen pH von ungefähr 7,4. Die niedrige Pufferkapazität des pharmazeutisch annehmbaren Trägers wird neutralisiert, worauf das Plasmin in seinen aktiven Zustand zurückkehrt und proteolytisch das Fibrin des Thrombus verdaut.
Durch die anfängliche Anwendung eines Verfahrens zur Herstellung von Plasmin, die das Plasmin proteolytisch inaktiv macht, bis es in oder direkt neben einen Thrombus verabreicht wird und welches ebenfalls im Wesentlichen frei von jeglichem Plasminogenaktivator ist, wird die Wahrscheinlichkeit der Herbeiführung von ungewünschter systemischer Blutung vermindert. Überschüssig verabreichtes Plasmin wird schnell durch zirkulierende Serum-Inhibitoren wie α₂-Antiplasmin inaktiviert und die relativ stabilen Plasminogenaktivatoren, die anderweitig zirkulieren, um eine distale Fibrinolyse zu induzieren, sind im Wesentlichen abwesend.
Angesäuertes Plasmin kann einfach in pharmazeutisch annehmbaren Trägern gelagert werden, die eine niedrige oder keine Pufferkapazität haben, wie, jedoch nicht beschränkt auf, wässriges 5 mM Glycin. Jegliches pharmazeutisch annehmbares Ion kann für sich oder in Kombination verwendet werden, wenn der pH im Bereich von ungefähr 2,5–4,0 liegt. Typischerweise wurde reversibel inaktiviertes angesäuertes Plasmin bei einem pH von 3,1–3,5 aufrecht erhalten. Die pharmazeutisch annehmbaren sauren Ionen, die in den Träger eingeführt wurden, um einen niedrigen pH beizubehalten, können aus Oligopeptiden, zumindest einer Aminosäure oder organischen oder anorganischen Säuren oder Kombinationen davon ausgewählt sein. Die Stabilisierung kann weiterhin durch die Einbeziehung von zumindest einer pharmazeutisch annehmbaren Verbindung verstärkt werden, die ein Kohlenhydrat sein kann, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
Die Verabreichung der Plasminzusammensetzung kann mittels jeglichen Verfahrens durchgeführt werden, das das Plasmin als einen Bolus oder eine andauernde Infusion direkt in einen Thrombus oder an eine Stelle verabreicht, die nur eine geringe Entfernung vom Thrombus entfernt ist, worauf es schnell auf den Thrombus treffen kann. Durch die Verringerung dieser Entfernung zum Thrombus oder durch direkte Verabreichung in die Blutgerinnsel wird die Aussetzung des Plasmins an Plasmin-Inhibitoren im Serum, die sich zwischen der/dem Verabreichungsnadel oder -Katheter und dem Thrombus befinden, reduziert. Die vorliegende Erfindung erwägt, dass das reversibel inaktivierte angesäuerte Plasmin mittels eines Katheters an den Thrombus verabreicht werden kann. Die vorliegende Erfindung erwägt weiterhin, dass eine kanülierte Nadel wie, jedoch nicht beschränkt auf, die Nadel einer Spritze verwendet werden kann, um das reversibel inaktivierte angesäuerte Plasmin in einen Thrombus zu injizieren. Die lokale Verabreichung einer Flüssigkeit an eine spezifische Stelle im Menschen oder Tier auf irgendeine dem Fachmann bekannte Weise liegt jedoch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die Verabeichung an einen vasculären oder coronären Thrombus mittels eines Katheters erlaubt weiterhin eine präzise Platzierung des Plasmins, vor allen Dingen innerhalb des Thrombus. Während die vorliegende Erfindung Verfahren zur lokalisierten Verabreichung eines reversibel inaktivierten angesäuerten Plasmins in einem Puffer mit geringer Pufferkapazität an einen Thrombus bereitstellt, liegt die Verabreichung der reversibel inaktivierten angesäuerten Plasminzusammensetzung davon an einen Fibrinverschluss eines in einen Menschen oder in ein Tier implantierten Katheters innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Unter Verwendung eines in vitro ¹²⁵I-Fibrin-markierten Thrombolyse-Assays wurde gezeigt, dass Plasmin in der Lage war, Thromben in einer Dosis-abhängigen Weise aufzulösen. Die Fibrinolyse wurde durch die Entfernung von entweder α₂-Antiplasmin oder α₂-Mikroglobulin in dem den Thrombus umgebendenden Plasma, sowie durch die Entfernung aller Inhibitoren (d. h. in PBS) verstärkt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Thrombolyse durch Plasmin unter einer sehr strengen Regulation durch die endogenen Plasmin-Inhibitoren steht und die Basis für eine sicherere thrombolytische Therapie bereitstellt.
Die in vivo Wirksamkeit reversibel inaktivierten angesäuerten Plasmins (1–3 mg/kg) in einem Puffer mit geringer Pufferkapazität, das direkt über einen Katheter lokal an einen Thrombus verabreicht wurde, wurde mit der von tPA (0,5 und 1,0 mg/kg) im Kaninchen-Jugularvenen-Thrombosemodell verglichen. Die Thrombolyserate wurde überwacht. Zusätzlich wurden der Verbrauch von Faktor VIII und Fibrinogen sowie die Blutungszeit der Nagelhaut (CBT) als Indikatoren des systemischen lytischen Zustands gemessen. Im Vergleich zu 0,5 mg/kg an tPA lieferte Plasmin eine vergleichbare oder signifikant bessere Thrombolyse mit einem vergleichbaren Verbrauch an Faktor VIII und Fibrinogen und ähnlicher CBT bei einer 1 mg/kg Dosis. Bei 3 mg/kg gab es einen signifikant erhöhten Verbrauch und CBT. Beim Vergleich mit 1 mg/kg von tPA erreichten sowohl Plasmin als auch tPA sehr ähnliche Thrombolyseraten, mit einem signifikant geringeren Verbrauch an Fibrinogen bei 3 mg/kg Plasmin.
Daher kann reversibel inaktiviertes angesäuertes Plasmin wirkungsvoll und sicher gelagert werden und ohne Neutralisation vor der Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier als ein thrombolytisches Mittel während der Katheter-unterstützten lokalen Thrombolyse verwendet werden. Plasmin hat, verglichen mit tPA, eine vergleichbare, wenn nicht überlegene fibrinolytische Aktivität und das Sicherheitsprofil in diesem Tiermodell für lokale thrombolytische Verabreichung erscheint zumindest ähnlich.
Es wird als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet, dass das reversibel inaktivierte angesäuerte fibrinolytische Enzym ohne darauf beschränkt zu sein Plasmin, Derivate von Plasmin, wie trunktierte Formen davon, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Mini-Plasmin und Mikro-Plasmin sein kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis eines Präparats einer flüssigen fibrinolytischen Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei von Plasminogenaktivatoren ist, in die direkte Nachbarschaft von oder direkt in einen thrombotischen Verschluss eines Blutgefäßes oder einer verschlossenen Kathetervorrichtung bereit. Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer flüssigen reversibel inaktivierten angesäuerten Plasminzusammensetzung an einen vasculären thrombotischen Verschluss bereit, worin das Plasmin vor der Verabreichung bei einem pH von ungefähr 4,0 stabilisiert werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis eines flüssigen reversibel inaktivierten angesäuerten Plasmins in einem Puffer mit geringer Pufferkapazität direkt in einen vasculären thrombotischen Verschluss oder Thrombus bereit, woraufhin die Plasminzusammensetzung wieder einen physiologischen pH annimmt, der es dem Plasmin erlaubt, Fibrin proteolytisch zu spalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1 der Erfindung umfasst die Schritte der Identifizierung eines Menschen oder Tiers mit einem thrombotischen Verschluss, der Verabreichung einer therapeutischen Dosis einer pharmazeutisch annehmbar reversibel inaktivierten angesäuerten fibrinolytischen Zusammensetzung in einem Puffer mit geringer Pufferkapazität an den Menschen oder das Tier, dem Erlauben, dass die verabreichte fibrinolytische Zusammensetzung mit dem vasculären Verschluss interagiert, dem Überwachen des Grads des vasculären Flusses des Menschen oder Tiers; und der Wiederholung der Schritte der Verabreichung der fibrinolytischen Zusammensetzung, bis ein zuvor bestimmter Grad an vasculärem Fluss erreicht ist.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die reversibel inaktivierte angesäuerte fibrinolytische Zusammensetzung Plasmin und einen pharmazeutisch annehmbaren angesäuerten Träger mit einem Puffer einer geringen Pufferkapazität.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der pharmazeutisch annehmbare angesäuerte Träger Wasser und zumindest eine pharmazeutisch annehmbare Säure, worin die Säure eine organische Säure ist, die eine Carbonsäure, ein Oligopeptid, eine Aminosäure oder eine anorganische Säure sein kann, ohne darauf beschränkt zu sein, und eine geringe oder keine Pufferkapazität hat und worin der angesäuerte Träger einen pH von weniger als ungefähr 4,0 hat.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst der pharmazeutisch annehmbare angesäuerte Träger Wasser und eine pharmazeutisch annehmbare Säure, die ausgewählt ist aus den Säureformen Format, Acetat, Citrat, Glycin, Isoleucin, Serin, Threonin, Glutamin und Alanin, worin der angesäuerte Träger einen pH von weniger als ungefähr 4,0 hat.
In einer weiteren Ausführungsform ist die pharmazeutisch annehmbare Säure die Säureform von Acetat oder Citrat.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die pharmazeutisch annehmbare Säure die Säureform von Acetat.
In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hat die reversibel inaktivierte angesäuerte fibrinolytische Zusammensetzung einen pH zwischen ungefähr 2,5 und ungefähr 4,0. In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hat die fibrinolytische Zusammensetzung einen pH von ungefähr 3,7.
In anderen Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt das Plasmin in einem Konzentrationsbereich von zwischen ungefähr 0,01 mg/ml bis ungefähr 50 mg/ml. In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt das Plasmin im Konzentrationsbereich von zwischen ungefähr 0,1 mg/ml bis ungefähr 10 mg/ml.
In weiteren Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt das saure Ion im Konzentrationsbereich von zwischen ungefähr 1 mM bis ungefähr 500 mM. In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt das saure Ion im Konzentrationsbereich von zwischen ungefähr 1 mM und 50 mM.
Die Ausführungsformen zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin einen physiologisch annehmbaren Plasminstabilisator, worin das Kohlenhydrat ausgewählt aus Glucose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Saccharose, Lactose oder Trehalose, wobei der Zucker eine Konzentration im Bereich von ungefähr 0,2% G/V bis ungefähr 20% G/V hat. In einer Ausführungsform ist der Zucker Glucose und die Konzentration davon ist ungefähr 20%.
Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin die therapeutische Dosis des reversibel inaktivierten angesäuerten Plasmins im Bereich von zwischen ungefähr 0,01 mg Plasmin/kg Körpergewicht und 10 mg Plasmin/kg Körpergewicht.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die reversibel inaktivierte angesäuerte fibrinolytische Zusammensetzung intravasculär oder in den Thrombus verabreicht. In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird das reversibel inaktivierte angesäuerte Plasmin in einem Puffer mit niedriger pH-gepufferter Kapazität über eine intravasculäre Kathetervorrichtung direkt in oder nahe an einen Thrombus verabreicht. In noch einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird der intravasculäre Katheter auf einen vasculären Verschluss gerichtet.
Die folgenden Beispiele werden aufgeführt, um die bevorzugten Ausführungsformen und Nutzen der vorliegenden Erfindung zu beschreiben, sie sollten jedoch nicht ausgelegt werden, diese zu beschränken.
Der Fachmann sollte erkennen, dass die Techniken, die in den folgenden Beispielen offenbart werden, Techniken repräsentieren, die von den Erfindern als für die Ausführung der Erfindung gut funktionierend erkannt wurden und daher als bevorzugte Ausführungsarten darstellend angesehen werden können.
Beispiel 1: Quellen der untersuchten Proteine
Plasminogen wurde mittels Affinitätschromatographie auf Lys-Sepharose, wie durch Deutsch & Mertz (1970) beschrieben, aus Cohn-Fraktion II + III Paste aufgereinigt. Dementsprechend wurden 200 g der Paste in 2 l 0,15 M Natriumcitratpuffer, pH 7,8, resuspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei 37°C inkubiert, bei 14.000 U/min zentrifugiert, durch Fiberglas filtriert und mit 500 ml Lys-Sepharose 4B (Pharmacia) vermischt. Die Bindung von Plasminogen fand bei Raumtemperatur für 2 Stunden statt. Die Lys-Sepharose wurde dann auf einen 2-Liter Glasfilter transferiert und mehrere Male mit 0,15 M Natriumcitrat enthaltend 0,3 M Natriumchlorid gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm unter 0,05 fiel. Gebundenes Plasminogen wurde mit drei 200-ml Portionen von 0,2 M ε-Aminocapronsäure eluiert. Das eluierte Plasminogen wurde mit 0,4 g festem Ammoniumsulfat/ml der Plasminogenlösung ausgefällt. Das Präzipitat des kruden (80–85% reinen) Plasminogens wurde bei 4°C gelagert.
Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht (LMW-Urokinase) (Abbokinase-Abbott Laboratories, Chicago Ill.) wurde weiterhin mittels Affinitätschromatographie auf Benzamidin-Sepharose aufgereinigt. Die Urokinase wurde dann durch Vermischen von 1,3 mg von LMW-Urokinase in 50 mM Acetatpuffer, pH 4,5, und Verdünnung mit 5 ml des Kopplungspuffers, 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,0, an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt.
Die Lösung wurde sofort mit 5 ml CNBr-aktivierter Sepharose kombiniert, die zuvor in 0,1 M HCl gequollen und gewaschen worden war. Die Kopplung fand für 4 Stunden auf Eis unter Schütteln statt. Der Überschuss der CNBr-aktiven Gruppe wurde mit 0,1 M Tris, pH 8,0, blockiert. Jeder Ansatz von Urokinase-Sepharose wurde 5 Mal verwendet und zwischen den Zyklen in 50 Glycerin in Wasser bei 4°C gelagert. Der Gewebe-Plasminogenaktivator (AKTIVASE^TM) stammte von Genentech. Das Plasminogen-freie Fibrinogen und α-Thrombin (3.793 U/ml) stammten von Enzyme Research, Inc. α₂-Antiplasmin wurde von Athens Research Technologies bezogen. Kommerziell erhältliches Plasmin stammte von Haemotologic Technologies, Inc. Das chromogene Plasminsubstrat S2251 stammte von Chromogenix. ¹²⁵I-markiertes humanes Fibrinogen (150–250 μCi/mg) stammte von Amersham Pharmacia Biotech. Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde mittels der Pharmacia Phast System Vorrichtung unter Verwendung vorgefertigter 8–25% Gradientengele und SDS-Pufferstreifen durchgeführt.
Beispiel 2: Aufreinigung von aktivem Plasmin
(i) Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin unter Verwendung von Urokinase-Sepharose
Plasminogen wurde unter Verwendung eines immobilisierten Plasminogenaktivators zu Plasmin gespalten, was Plasmin ohne Kontamination der Endpräparation ergab. Urokinase spaltet Plasminogen direkt. Die Plasminogenaktivierung durch Urokinase hängt nicht, wie im Fall von tPA, von der Gegenwart von Fibrin ab, und Urokinase ist ein humanes Protein. Diese Faktoren und seine relativ geringen Kosten machen Urokinase zum bevorzugten Aktivator, obwohl dies die Verwendung von tPA, Streptokinase oder jeglicher anderen Spaltungsmittel, die ein aktives Plasmin ergeben, das zur Fibrindegradierung fähig ist, nicht ausschließen. Das Ammoniumsulfatpräzipitat des kruden Plasminogens wurde bei 14.000 rpm zentrifugiert und in einem minimalen Volumen unter Verwendung von 40 mM Tris, enthaltend 10 mM Lysin, 80 mM NaCl bei pH 9,0 resuspendiert, um die Endproteinkonzentration von 10–15 mg/ml zu erreichen. Die Plasminogenlösung wurde über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Die dialysierte Plasminogenlösung (10–20 ml) wurde mit einem gleichen Volumen von 100% Glycerin verdünnt und mit 5 ml der Urokinase-Sepharose kombiniert. Die Verwendung von 50% Glycerin verringert die Autodegradation des während der Aktivierung gebildeten Plasmins. Plasmin ist in 50% Glycerin stabil und kann in dieser Lösung bei –20°C für einen ausgedehnten Zeitraum gelagert werden.
Die Plasminogenaktivierung fand abhängig von der Frische der Urokinase-Sepharose zwischen 2 Stunden und 24 Stunden bei Raumtemperatur für statt. Bei einem frischen Ansatz von Urokinase-Sepharose konnte die Aktivierung innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen werden. Jedoch verschlechtert es sich und wird nach einigen Zyklen weniger wirkungsvoll, was die Verwendung von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen nötig macht, um das Fortschreiten der Plasminogenaktivierung zu überwachen. Nach Abschluss der Aktivierung wurde die Plasminlösung mit einem Glasfilter von der Urokinase-Sepharose gefiltert und sofort auf die Benzamidin-Sepharose gegeben.
(ii) Fangen von Plasmin auf Benzamidin-Sepharose
Da Plasmin eine Serinprotease mit Trypsin-ähnlicher Spezifität ist, ist Benzamidin ein Affinitätsabsorptionsmittel, das das Fangen des aktiven Plasmins erlaubte. Eine Plasminogenlösung in 50 Glycerin wurde mit einer Flussrate von 3 ml/min. auf die 50 ml Benzamidin-Sepharosesäule gegeben, die mit 0,05 M Tris, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 3 ml/min. bei 3–7°C gefahren. Der vordere Teil des nicht gebundenen Peaks enthielt Unreinheiten mit hochmolekularem Gewicht. Der Rest des nicht gebundenen Peaks wird von übrig gebliebenem, nicht aktiviertem Plasminogen und durch inaktive Autodegradierungsprodukte von Plasmin ausgemacht.
(iii) Elution des gebundenen Plasmins mit einem Puffer mit niedrigem pH
Um das Plasmin vor der Inaktivierung bei neutralen pH-Bedingungen zu schützen, wurden saure Elutionsbedingungen ausgewählt. Das an Benzamidin-Sepharose gebundene Plasmin wurde mit 0,2 M Glycinpuffer, pH 3,0, enthaltend 0,5 M NaCl, eluiert. Der gebundene Peak wurde typischerweise in drei Pools unterteilt, zwei vordere Peaks, B1 und B2, und der Großteil des eluierten Materials als B3.
Nicht reduzierende Gelanalyse zeigte, dass alle drei Pools hochreines (> 95%) Plasmin enthielten. Die Gelanalyse deckte jedoch zusätzlich zu den schweren und leichten Plasminketten einige Banden mit niedermolekularem Gewicht im Bereich von 10–15 kDa als ein Resultat der teilweisen internen Spaltungsdegradierung des Plasmins auf.
Der vordere Teil des B1-Peaks enthielt typischerweise das meiste der Unreinheiten mit niedrigem Molekulargewicht. Die B2- und B3-Pools waren weniger degradiert. Der vordere Teil des gebundenen Peaks wies sehr wenig Plasminaktivität auf und wurde üblicherweise verworfen. Der Verlust der Aktivität in diesem Material kann auf Autodegradation während der Chromatographie zurückzuführen sein, da im eluierten Material kein Glycerin vorhanden ist und der pH des vorderen Teils in der Mitte zwischen dem pH der Äquilibrierungs- und Elutionspuffer liegt, typischerweise in einem Bereich von pH 6–6,5. Das eluierte, im Wesentlichen von Plasminogenaktivatoren freie Plasmin, wurde in Röhrchen gesammelt, die 2 M Glycinpuffer, pH 3,0, enthielten (10% des gesammelten Volumens).
(iv) Formulierung des eluierten Materials in angesäuertem Wasser (pH 3,7)
Das eluierte Plasmin wurde gegen Wasser dialysiert, das mit Eisessig auf einen pH von ungefähr 3,7 angesäuert worden war, oder gegen Wasser dialysiert, das 0,15 M NaCl enthielt und ebenfalls mit Eisessig auf einen pH von ungefähr 3,7 angesäuert worden war.
Jegliche Säure, die einen pharmazeutisch annehmbaren angesäuerten Träger mit einem Puffer mit geringer Pufferkapazität und einem pH zwischen ungefähr 2,5 bis ungefähr 4,0 bereitstellt, kann verwendet werden. z. B. wird auch die Verwendung von anderen Säuren und Aminosäuren wie, jedoch nicht beschränkt auf, anorganischen Säuren, Carbonsäuren, aliphatischen Säuren und Aminosäuren einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Benzoesäure, Serin, Threonin, Valin, Glycin, Glutamin, Isoleucin, β-Alanin und Derivaten davon, entweder einzeln oder in jeglicher Kombination davon, die den pH im pharmazeutisch annehmbaren Träger bei ungefähr 2,5 bis ungefähr 4,0 aufrecht erhalten, als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung betrachtet.
Plasmin ist in angesäuertem Wasser extrem stabil und kann wirkungsvoll in dieser Form für in vitro- und in vivo-Studien verwendet werden. Die Plasmin-spezifische Aktivität wurde unter Verwendung eines angepassten caseinolytischen Assays, wie durch Robbins & Summaria (1970) beschrieben, gemessen. Ein ml 4% Caseinlösung in angesäuertem Wasser und ein angemessenes Volumen von 67 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7, wurden in eine Test-Polycarbonatröhre gegeben. Die Lösungen wurden gevortext und bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Plasminproben oder Puffer (Leerprobe) wurden in 15-Sekunden-Intervallen zu jedem Röhrchen hinzugegeben, gründlich gemischt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Hinzugabe von 3 ml 15% Trichloressigsäure gestoppt und es wurde dem Präzipitat für 15 Minuten erlaubt, sich zu bilden. Die Röhrchen wurden bei 3.200 U/min für 20 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden in Küvetten transferiert und die A₂₈₀ jeder Probe wurde bestimmt. Die spezifische caseinolytische Aktivität jeder Probe wurde mittels der folgenden Formel bestimmt:
Die Plasminkonzentration wurde spektrophotometrisch unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von 1,7 für 0,1% Lösung bestimmt.
Beispiel 3: pH-abhängige Stabilität von Plasmin
Plasmin zeigt eine glockenförmige pH-Abhängigkeit seiner katalytischen Aktivität. Wie in 1 gezeigt, hat Plasmin eine maximale enzymatische Aktivität bei pH 7,5 bis 8,0, und seine Aktivität nimmt schnell zu sowohl basischeren als auch saureren pH-Werten hin ab. Plasmin ist, wie durch Robbins & Summaria (1976) und Castellino & Powell (1981) gezeigt, wegen der Protonierung von Histidin im katalytischen Zentrum am inaktivsten, und zwar reversibel unterhalb eines pH von 4,0.
Plasmin ist bei physiologischem pH sehr unstabil. Sowohl die schweren als auch die leichten Ketten von Plasmin degradierten innerhalb von Stunden bei Raumtemperatur und 4°C dramatisch. Plasmin wurde bei 1 mg/ml in 0,04 M Natriumphosphat, pH 7,4, formuliert und bei 22°C oder 4°C für 6 Stunden inkubiert. Während der Inkubation wurde die Plasminintegrität alle zwei Stunden mittels reduzierender SDS-PAGE-Analyse analysiert. Sowohl die schwere Kette als auch die leichte Kette degradierten bei 22°C und 4°C schnell innerhalb von Stunden, wie in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Die schnelle Degradierung von Plasmin in neutralen pH-Lösungen bei 22°C und 4°C.
(Die intakte schwere Kette und leichte Kette vom Plasmin zum anfänglichen Zeitpunkt wurden als 100% normalisiert.)
1 mg/ml Plasmin wurde für 14 Tage unter verschiedenen sauren Bedingungen bei 37°C inkubiert. Die Veränderungen der schweren Kette und leichten Kette von Plasmin wurden mittels reduzierender SDS-PAGE analysiert. Plasmin wurde mit 1 mg/ml in 0,04 M Natriumphosphat, pH 7,4, formuliert und wurde ebenfalls für 6 Stunden bei 4°C inkubiert. Während der Inkubation wurde die Aktivität der Plasminprobe alle zwei Stunden mittels eines chromogenen Wirksamkeits-Assays gemessen. Die Wirksamkeit von Plasmin wurde unter Verwendung des MLA 1600C-Analyzers (Pleasantville, N. Y.) quantitativ gemessen. Plasmin hydrolysierte das chromogene Substrat S-2403 (D-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-lysin-p-nitroanilinhydrochlorid, oder abgekürzt als pyro-Glu-Phe-Lys-pNA) um ein Peptid und die chromophore Gruppe p-Nitroanilin (pNA) zu bilden. Die Rate der Farbbildung wurde kinetisch bei 450 nm gemessen. Die Menge an hydrolysiertem Substrat war proportional zu der Plasminaktivität in der Probe. Eine Standardkurve wurde aus der linearen Regression der Farbbildungsrate (OD/min.) gegen die Wirksamkeit eines Plasminstandards erzeugt. Die lineare Gleichung wurde zusammen mit der beobachteten Rate für eine unbekannte Probe verwendet, um die Wirksamkeit von Unbekannten zu berechnen. Die Wirksamkeit von Plasmin wurde in Einheiten von mg/ml angegeben.
Die Plasminintegrität wurde, wie in Tabelle 2 gezeigt, signifikant durch Inkubation bei einem physiologischen pH erniedrigt. Tabelle 2. Die schnelle Erniedrigung der Plasminaktivität in neutraler pH-Lösung bei 4°C.

Chromogene Wirksamkeit

Plasmin Puffer pH Anfängl. 2 h 4 h 6 h

1 mg/l PO₄, 0,04 M 7,4 100% 43,3% 32,6% 26,4%

(* Die Aktivität der Plasminlösung zum anfänglichen Zeitpunkt wurde als 100% normalisiert)
In dieser neutralen pH-Lösung erniedrigte sich die Plasminaktivität nach 6 Stunden bei 4°C um mehr als 70%.

In angesäuertem Wasser bei pH 3,7 formuliertes Plasmin ist stabil. Es kann in dieser Form für Monate bei reduzierten Temperaturen gehalten werden, ohne jeglichen Verlust an Aktivität oder dem Auftreten von Degradierungsprodukten mit proteolytischer oder saurer Natur. 2 und die Daten aus Tabelle 3 zeigen die Stabilität von Plasmin bei 4°C und bei Raumtemperatur. Tabelle 3. Stabilität von 1 mg/ml Plasmin unter den folgenden sauren Bedingungen bei 37°C.

Formulierung	Plasmin (mg/ml)	Saure Bedingung	pH	% intakte schwere Kette nach 14 Tagen bei 37°C	% intakte leichte Kette nach 14 Tagen bei 37°C
1	1	5 mM HAC/NaAc	2,5	19%	62%
2	1	5 mM HAC/NaAc	3,0	41%	92%
3	1	5 mM HAC/NaAc	3,4	48%	92%
4	1	5 mM HAC/NaAc	3,4	49%	96%
5	1	5 mM HAC/NaAc	3,4	50%	96%
6	1	5 mM HAC/NaAc	3,7	13%	123%
7	1	5 mM HAC/NaAc	4,0	9,3%	107%
8	1	5 mM Zitronensäure/Na-Citrat	2,27	9,3%	64%
9	1	5 mM Zitronensäure/Na-Citrat	3,1	33%	68%
10	1	5 mM Zitronensäure/Na-Citrat	3,56	46%	88%
11	1	5 mM Zitronensäure/Na-Citrat	4,0	7,4%	104%
12	1	5 mM Glycin	2,2	7,3%	104%
13	1	5 mM Glycin	3,1	36%	70%
14	1	5 mM Glycin	3,5	49%	85%
15	1	5 mM Glycin	3,8	12%	85%
16	1	5 mM Glycin	4,1	6%	81%
17	1	5 mM Serin	3,4	56%	100%
18	1	5 mM Threonin	3,4	54%	100%
19	1	5 mM Valin	3,4	52%	96%
20	1	5 mM Isoleucin	3,4	51%	100%
21	1	5 mM β-Alanin	3,7	33%	90%
22	1	2 mM Benzoesäure	3,5	42%	93%
23	1	2 mM Milchsäure	3,5	45%	92%
24	1	2 mM Apfelsäure	3,5	50%	90%
25	1	2 mM Weinsäure	3,5	28%	87%

(Die intakte schwere Kette und leichte Kette in jeder Formulierung vor der Inkubation wurden als 100% normalisiert; Hac/NaAc = Essigsäure/Natriumacetat)

Bei 4°C ist Plasmin zumindest neun Monate stabil. Sogar bei Raumtemperatur ist reversibel inaktiviertes angesäuertes Plasmin zumindest für zwei Monate stabil. Die Langzeitstabilität bei Raumtemperatur ist wichtig, da es diese Formulierung mit langen Kuren thrombolytischer Verabreichung kompatibel machen würde. Z. B. ist eine 36-stündige Verabreichung von Thrombolytica, wie Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase, bei der Behandlung von peripheren arteriellen Verschlüssen gebräuchlich. In 3 wird ein Diagramm des pH gegen den Prozentsatz an schwerer Kette relativ zum Gesamtprotein in jeder Spur des SDS-Gels gezeigt. Die Ergebnisse demonstrieren unabhängig von der Art des Puffers oder der Pufferkonzentration ein pH-Stabilitätsoptimum von ungefähr 3,1–3,5.
Die Fähigkeit von reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin, nach Transfer in einen physiologischen pH vollkommen aktiv zu werden, wird durch seine Aktivität im caseinolytischen Assay und ebenfalls in den ¹²⁵I-Fibrin-markierten Thrombolyse-Assays bewiesen. Beide dieser Assays werden bei pH 7,4 durchgeführt und eine vollständige Wiederherstellung der Plasminaktivität während der pH-Änderung und dem Durchtritt durch den isoelektrischen Punkt (pH 5–5,5) fand statt. Das Plasmin wird in einem Lösungsmittel mit geringer Pufferkapazität formuliert und nimmt, wenn es zu einer gepufferten Lösung wie Plasma hinzugefügt wird, augenblicklich den neutralen oder physiologischen pH an, und das Ausfällen, welches gewöhnlich das langsame Durchtreten durch den isoelektrischen Punkt begleitet, tritt nicht auf.
Beispiel 4: Plasmin hat dieselbe intrinsische fibrinolytische Wirksamkeit wie eine Plasminogen-/Plasminogenaktivator-Mischung
Plasmin hat dieselbe intrinsische fibrinolytische Wirksamkeit wie eine Plasminogen-/Plasminogenaktivator-Mischung. Die fibrinolytische Wirksamkeit von Plasmin wurde mit der von einer Lys-Plasminogen und tPA-Mischung verglichen. Diese Experimente wurden in einem definierten System durchgeführt, bestehend aus einem ¹²⁵I-markierten Fibrinthrombus, der in PBS eingetaucht war. 4 zeigt, dass in einer gepufferten Umgebung die mit Plasmin erreichte Thrombolyse fast identisch zu der Lys-Plasminogen plus tPA-Mischung ist (Kurven a beziehungsweise b). Gleichzeitig wurde mit tPA allein (Kurve c) oder in der Abwesenheit von jeglichem Protein (Kurve d) keine Thrombolyse beobachtet. Die mit tPA allein erhaltenen Daten zeigen, dass dessen Aktivität, ein wirkungsvolles Thrombolyticum zu sein, von seinem Substrat Plasminogen abhängig ist.
Diese Daten deuten darauf hin, dass in der Abwesenheit von Inhibitoren und anderen Proteinfaktoren, die im Plasma vorhanden sind, zwischen aufgereinigtem Plasmin und der Kombination von tPA und Lys-Plasminogen, das mit tPA aktiviert ist, kein Unterschied in der Fähigkeit besteht, Fibrinthromben zu lysieren. Um die thrombolytische Wirksamkeit von aktivem Plasmin zu beurteilen, wurde der ¹²⁵I-Fibrin-markierte Thrombolyse-Assay mit Plasmathromben in einer Plasmaumgebung durchgeführt.
Beispiel 5: Die Rolle von Plasmin-Inhibitoren bei der Regulation der Plasminaktivität
¹²⁵I-Fibrin-markierter Thrombolyse-Assay. Die fibrinolytischen Eigenschaften von Plasmin wurden in einem in vitro-System bestimmt, das aus einem radioaktivmarkierten Plasmathrombus bestand, der, wie von Lijnen et al. (1986) beschrieben, in humanes, mit Nitrat versetztes Plasma eingetaucht war. Das in allen Experimenten verwendete Plasma war Plasma eines einzelnen Spenders, das bei 37°C aufgetaut, aliquotiert, wieder eingefroren und bei –80°C gelagert wurde. Die Stammlösung des ¹²⁵I-markierten Fibrinogens wurde mittels Rehydrierung der Bestandteile der Ampulle (ungefähr 110 μCi/Ampulle) mit 1,0 ml von 0,15 M Natriumcitrat hergestellt und bei 4°C gelagert.
Zehn μl des ¹²⁵I-Fibrinogens wurden zu einer Polycarbonat-Teströhre gegeben, die 250 μl Plasma bei 37°C enthielt und kurz gemischt. 25 μl von mit 0,1 M CaCl₂ auf eine Endkonzentration von 10–20 μM gebrachtem α-Thrombin wurden zum Plasma hinzugefügt. Es wurde den radiomarkierten Thromben erlaubt, für 5 Minuten bei 37°C zu altern und diese wurden dann mit PBS gewaschen. Die Thromben wurden, ein Thrombus pro Röhrchen, in Teströhrchen überführt, die 2,25 ml Plasma oder Puffer enthielten.
Eine Grundlinien-Radioaktivitätsprobe wurde für jeden Thrombus gemessen. Plasmin wurde nach der Zugabe von jedem Thrombus zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Die Thromben wurden für die Dauer des Experiments auf 37°C zurückgebracht. Weitere Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten für die Messung der freigesetzten Radioaktivität genommen. Das Ausmaß der Thrombolyse wurde aus dem Verhältnis zwischen der Menge der aus dem Thrombus in das Plasma freigesetzten Radioaktivität zu der Gesamtmenge der löslichen Radioaktivität im Teströhrchen berechnet. Die Freisetzung von markierten Fibrin-Degradierungsprodukten wurde, in Prozent angegeben, gegen die Zeit aufgetragen.
Zusätzlich zum Plasmamilieu wurden einige Thrombolyseexperimente in einer Pufferumgebung oder mit Plasma, das keine α₂-Antiplasmin- oder α₂-Macroglobulin-Aktivität enthielt, durchgeführt. α₂-Antiplasmin-verarmtes Plasma wurde mittels Passieren von normalem Plasma durch eine Kringles 1-3-Sepharosesäule, wie durch Wiman (1980) beschrieben, erhalten. α₂-Macroglobulin-inaktiviertes Plasma wurde durch Behandlung von normalem Plasma mit 0,1 M Methylamin (Barrett et al. (1979)) für 2 Stunden bei 37°C mit einer nachfolgenden Dialyse gegen PBS bei 4°C erhalten.
Unter Verwendung des oben beschriebenen Thrombolyse-Assays wurde gezeigt, dass Plasmin, wie in 5 und 6 gezeigt, in der Lage ist, Plasmathromben in einer Dosis-abhängigen Weise aufzulösen. Zunehmende Mengen an Plasmin wurden zu ¹²⁵I-Fibrin-markierten Plasmathromben hinzugegeben und der Grad der Thrombolyse wurde durch Messung der Freisetzung von Radioaktivität bestimmt: (a) 0,15 mg/ml Plasmin im Reaktionsgefäß, (b) 0,30 mg/ml; (c) 0,45 mg/ml; (d) 0,60 mg/ml; (e) Kontrolle ohne zugegebenes Plasmin. Die Daten in 6 zeigen, dass Plasmin ebenfalls in einer Plasmaumgebung aktiv ist und in der Lage ist, Plasmathromben aufzulösen. Dieses Phänomen ist dosisabhängig. Gleichzeitig, und im Gegensatz zu der Lys-Plasminogen- und tPA-Mischung, schreitet die Thrombolyse durch Plasmin allein in einer Plasmaumgebung nicht bis zur Vervollständigung fort; die Thrombolyse tendiert dazu, nach 2 Stunden aufzuhören. Obwohl dies nicht an irgendeine Therorie gebunden werden soll, kann dieses Phänomen mit der Gegenwart verschiedener Protease-Inhibitoren in der Plasmaumgebung und besonders mit der schnellen Inhibition von nicht Thrombus-gebundenem Plasmin durch α₂-Antiplasmin erklärt werden.
Um die Rolle von Plasmin-Inhibitoren bei der Plasmin-katalysierten Lyse von Thromben zu untersuchen, wurde eine Reihe von Thrombolyseexperimenten mit normalem Plasma und Plasmaproben, die kein α₂-Antiplasmin, α₂-Macroglobulin oder keinen der Inhibitoren oder PBS enthielten, durchgeführt.
Wie in 6 zu sehen, wurde die Plasmin-induzierte Fibrinolyse durch die Deletion von entweder α₂-Antiplasmin oder α₂-Macroglobulin in dem den Thrombus umgebenden Plasma verstärkt, und sogar noch mehr durch die Deletion aller Inhibitoren. Diese Resultate bestätigen, dass die Thrombolyse durch Plasmin sich unter einer sehr strengen physiologischen Kontrolle durch die endogengen Plasma-Plasmin-Inhibitoren befindet, und damit eine Basis für die sicherere thrombolytische Therapie bereitstellt.
Im Gegensatz zu der Plasminogenaktivator-induzierten Thrombolyse, kann die Thrombolyse durch Plasmin mittels dieser Inhibitoren kontrolliert werden. Die Plasminogenaktivator-induzierte Thrombolyse macht sich die interne Quelle des im Plasma vorhandenen Plasminogens zunutze, das von einem praktischen Standpunkt aus betrachtet im menschlichen Körper unbegrenzt ist. Auf der anderen Seite hängt die Plasmin-induzierte Thrombolyse vollständig von der externen Plasminquelle ab. Die Beendigung der Plasminverabreichung an den Patienten sollte in einer schnellen Beendigung der Thrombolyse resultieren und stellt eine Basis für die sicherere thrombolytische Therapie zur Verfügung.
Beispiel 6: Vergleich von reversibel inaktiviertem angesäuerten Plasmin und tPA in einem in vitro-Modell des peripheren arteriellen Verschlusses (PAO)
Gealterte, zurückgezogene Gerinnsel besitzen unzureichend Plasminogen, das Substrat, das von allen Plasminogenaktivatoren für die effektive Lyse von Gerinnseln benötigt wird. Robbie et al. Thrombosis and Haemostasis, 1996, 75 (1), 127–33. Gealterte Gerinnsel sind signifikant weniger empfänglich für die Lyse durch Plasminogenaktivatoren.
Gealterte Gerinnsel unterscheiden sich sowohl mechanisch als auch in ihrer Proteinzusammensetzung von Gerinnseln, die Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen. Sie werden typischerweise in den peripheren Arterien gefunden und können zu einer signifikanten Größe heranwachsen. Die durchschnittliche Größe eines peripheren Gerinnsels, das in den nativen Arterien gefunden wird, ist, wie in Ouriel et al. beschrieben, 14,8 ± 11 cm. Derzeitige Thrombolytica, die exklusiv durch Plasminogenaktivatoren repräsentiert werden, sind fast wirkungslos für die Lyse dieser Art von Gerinnsel. Typischerweise wird ein Patient mittels PAO für mehr als 24 Stunden mit Urokinase behandelt und sogar nach dieser ausgedehnten Zeit wird die komplette Durchgängigkeit des Gefäßes nicht erreicht. Die Situation kann verschlimmert werden, wenn die Thrombolytica mittels eines Katheters in das Innere des Gerinnsels verabreicht werden, was den Eintritt des Plasminogensubstrats, das für deren Wirksamkeit benötigt wird, weiter verhindert.
Ein anderer Ansatz für die Lyse zurückgezogener Gerinnsel ist die direkte Verabreichung aktiven Plasmins in das Innere des Gerinnsels über einen Katheter. Die Verabreichung von reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin direkt in zurückgezogene Gerinnsel umgeht die inhärente Plasminogendefizienz dieser Gerinnsel und erlaubt eine vorhersagbare, schnelle und effektive Thrombolyse des Gerinnsels, unabhängig vom Plasminogengehalt. Zudem dient die reichlich vorhandene Gegenwart des natürlichen Plasmininhibitors α₂-Antiplasmin im Plasma dazu, sofort jegliches Plasmin zu inaktivieren, das aus der Nachbarschaft des Gerinnsels austritt, wodurch die distale Fibrinolyse und folgende Blutungsvorfälle verhindert werden.
Um die Wirksamkeit von Plasmin und tPA hinsichtlich der Lyse von langen zurückgezogenen Gerinnseln zu vergleichen, haben wir ein in vitro-Modell entwickelt, das die Parameter der im Patienten mit PAO gebildeten Gerinnsel nachahmt.
In Vitro PAO-Modell. Frisches Human-Gesamtblut wurde in Glasröhrchen von 30 × 0,95 cm gesammelt und die spontane Gerinnselbildung ohne Additive wurde zugelassen. Die Röhrchen wurden für 20 Stunden bei 37°C inkubiert, um ein vollständiges Zurückziehen zuzulassen. Zurückgezogene Gerinnsel wurden unter Verwendung von USA-Standard-Testsieben D16 mit 14er-Siebgewebe vom Serum getrennt und deren Gewichte wurden bestimmt. Die Blutgerinnsel wurden in Glasröhrchen mit kleinerem Durchmesser transferiert, die den Gerinnseln mit durchschnittlicher Größe in Beinarterien (0,6 × 12 cm) glichen. Ein Puls-Spray-Katheter mit Öffnungen auf mehreren Seiten (französische Größe 5 mit der 11 cm Sprühspitze, Cook, Inc.) wurde in das Gerinnsel eingeführt und eine thrombolytische reversibel inaktivierte angesäuerte Plasminzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder tPA bei 1 mg/ml wurden in Inkrementen von 1 ml, die durch 1-stündige Zeitintervalle getrennt waren, verabreicht. Die Anzahl der Injektionen korrespondiert zu der Dosis des Thrombolyticums. Das Ausmaß der Lyse des Gerinnsels wurde über das Gewicht des verbleibenden Gerinnsels gemessen und als Prozentsatz der Abnahme des Gewichts des Gerinnsels angegeben. Dieses Modell wird PAO-Modell genannt. Es imitiert die Abmessungen der Thromben, die in PAO-Patienten gefunden werden, obwohl venöses Blut für die Gerinnselbildung verwendet wurde. Sowohl tPA als auch die reversibel inaktivierte angesäuerte Plasminzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wurden in diesem Modell getestet und die Ergebnisse werden unten dargelegt.
Plasmin ist bei der Lyse von frischen Gerinnseln genauso wirksam wie tPA, im Unterschied zu der Verwendung von tPA und Plasmin für die Lyse von zurückgezogenen Gerinnseln, die für 20 Stunden gealtert sind, um eine vollständige Kreuzvernetzung durch Faktor XIII zu erlauben. tPA ist nicht in der Lage, solche Gerinnsel zu lysieren. Die Erniedrigung des Gerinnselgewichts, die bei tPA-behandelten Gerinnseln erhalten wurde, ist sogar dann der Kontrolle ähnlich, wenn die Dosis auf 5 mg pro Gerinnsel erhöht wird.
Dagegen ist Plasmin in Bezug auf voll zurückgezogene und kreuzvernetzte Gerinnsel wirksam. Es gibt eine Dosisabhängigkeit des lytischen Effekts von Plasmin und nach 5 Injektionen (oder insgesamt 5 mg Plasmin) sind die Gerinnsel fast vollständig lysiert. In einer ähnlichen Reihe von Experimenten wurde die gleiche Unfähigkeit, zurückgezogene und kreuzvernetzte humane Thromben aufzulösen, mit Urokinase beobachtet. Daher ist lokal verabreichtes Plasmin ein wirkungsvolleres thrombolytisches Mittel als tPA und andere Plasminogenaktivatoren.
Diese in vitro-Daten zeigen, dass tPA die Gegenwart seines Substrats, Plasminogen, im Gerinnsel benötigt, um die Lyse des Gerinnsels zu initiieren und aufrechtzuerhalten. Daher ist, während Plasmin für die Lyse frischer oder Plasminogen-reicher Gerinnsel so wirkungsvoll wie tPA ist, Plasmin effektiver als tPA und andere Plasminogenaktivatoren für die Lyse von langen zurückgezogenen Plasminogen-armen Gerinnseln. Außerdem demonstrieren die Daten, die in diesem Beispiel dargelegt werden, dass Plasmin in seiner reversibel inaktivierten angesäuerten Form wirkungsvoll ist, wenn es direkt in das Innere des Gerinnsels injiziert wird.
Die Gerinnsel in den Glasröhrchen sind außerdem ein Modell für einen Thrombus oder einen Fibrin-Verschluss, der sich in einem Katheter bildet, der in einem Menschen oder einem Tier platziert ist, und der Katheter verschlossen ist.
Beispiel 7: Kaninchen-Jugularvenen-Thrombosemodell
Die in vivo-Wirksamkeit und Sicherheit von lokal verabreichtem aktivem Plasmin wurde mittels des Kaninchen-Jugularvenen-Thrombosemodells nach Collen et al. (1983) bestimmt. Das Modell wurde, in Kürze, wie folgt durchgeführt: Kaninchen (2–3 kg) wurden mit Ketamin/Xylazin sediert und ein 22G venöser Katheter wurde zur Verabreichung einer verdünnten Lösung von Pentobarbital (5–10 mg/kg/h) in der Ohrvene platziert. Der Hals wurde rasiert und ein arterieller Katheter wurde in der Halsschlagader zur Messung des Blutdrucks und zur Blutprobenentnahme platziert. Ein Luftröhrenschnitt wurde für die Platzierung eines Endotrachealschlauches durchgeführt, um das Atmen zu ermöglichen. Die Jugularvene wurde vorsichtig mittels stumpfer Präparierung bis hoch zu der und einschließlich der Facialvene isoliert. Ein 24G-Katheter wurde in der Facialvene platziert und die Jugularvene wurde sowohl distal als auch proximal zu der isolierten Facialvene abgeklemmt. Das isolierte Venensegment wurde mehrere Male mit Kochsalzlösung gewaschen und vollständig von Blut befreit. Das isolierte Segment wurde mehrere Male mit einer Thrombinlösung (500 U/ml) gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden 0,5 ml einer arteriellen Blutprobe aus dem arteriellen Katheter gezogen und schnell mit 50 μl ¹²⁵I-markiertem Fibrinogen (ungefähr 1 μCi) vermischt. Die Mischung wurde schnell über die Facialvene in das isolierte Venensegment infundiert, bis das Venensegment vollständig aufgebläht war. Der Thrombus wurde durch Massieren der Vene mit einer Pinzette und einem Stück von Saran-Wrap, welches über die exponierte Jugularvene platziert war, um ein Trocknen zu verhindern, gemischt. Heparin (100 IU/kg) wurde verabreicht, um die Ablagerung von kaltem Fibrinogen auf dem Thrombus zu verhindern. Es wurde dem Thrombus erlaubt, für 30 Minuten zu altern und die Klemmen wurden entfernt.
Die Stabilität des Thrombus wird über eine 30-minütige Äquilibrierungsperiode hinweg überwacht. Die Auflösung des markierten Thrombus (% Lyse) wurde kontinuierlich mittels einer GILE-Gammazählersonde, die direkt über dem Thrombus platziert war, überwacht.
Beispiel 8: Wiederherstellung des venösen Flusses
Um eine physiologische Anzeige der Thrombusauflösung bereitzustellen, wurde die Wiederherstellung des Blutflusses als ein weiterer Index der Thrombolyse in einer separaten Reihe von Experimenten verwendet. In diesen Experimenten wurde eine angemessen dimensionierte Fluss-Sonde distal zu dem verschließenden Thrombus (nicht radioaktivmarkiert), platziert, mit einem Transonic-Flussmeter verbunden und jede Minute Messungen des venösen Blutflusses vorgenommen.
Der Grundlinien-Blutfluss vor der Bildung des Thrombus betrug 12–18 ml/min. und die Daten werden als % der Grundlinie dargestellt. Der Prozentsatz der Wiederherstellung des venösen Blutflusses und des Verbrauchs an Faktor VIII und Fibrinogen werden in 7 nach 60 Minuten und in 8 nach 90 Minuten gezeigt. Bei Dosen von 0,5 mg/kg bzw. 1,0 mg/kg induzierte tPA nach 60 Minuten eine 16 ± 4% bzw. 21 ± 10% Wiederherstellung des Grundlinien-Blutflusses. Bei 1,0 mg/kg bzw. 2,0 mg/kg induzierte Plasmin eine 20 ± 1% bzw. 33 ± 1% Wiederherstellung des Grundlinien-Blutflusses. Nach 90 Minuten resultierte die tPA-Infusion in einer 18 ± 3% bzw. 26 ± 11% Wiederherstellung des Blutflusses und Plasmin resultierte in einer 25 ± 5% bzw. 34 ± 6% Wiederherstellung des Flusses.
Beispiel 9: Nagelhaut-Blutungszeiten (CBT)
Die Nagelhaut-Blutungszeiten nach 60 Minuten werden in 9 gezeigt. Eine Behandlung mit Kochsalzlösung resultierte in Blutungszeiten von 13 ± 1 Minuten. tPA resultierte bei Dosen von 0,5 mg/kg bzw. 1,0 mg/kg in Blutungszeiten von 13 ± 2 Minuten bzw. 25 ± 4 Minuten, während Plasmin bei Dosen von 1,0 mg/kg bzw. 2,0 mg/kg in Blutungszeiten von 17 ± 3 bzw. 19 ± 1 Minuten resultierte. tPA zeigt im Vergleich zu der Verwendung von reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin eine verlängerte CBT, was demonstriert, dass die systemische Fibrinolyse durch tPA-Aktivierung von endogenem Plasminogen ausgedehnter ist, als wenn Plasmin verabreicht und schnell durch die Serum-Faktoren inhibiert wird.
Beispiel 10: Fibrinolytisches Blutungsmodell im Kaninchen
Die relativ zum Plasminogenaktivator tPA größere Sicherheit von Plasmin wurde in einem bewährten Modell für fibrinolytische Blutung im Kaninchen demonstriert, das, wie in Marder et al. (1992) beschrieben, einen gültigen Ersatz für die fibrinolytische Blutung darstellt.
Thrombolytisch äquivalente Dosen (10 ml Volumina) von Plasmin und tPA wurden in einem Ohr-Einstichmodell hinsichtlich ihrer relativen Effekte auf das Auftreten und Andauern einer erneuten Blutung und auf ausgewählte Plasma-Koagulations- und fibrinolytische Parameter hin verglichen. Zwei unterschiedliche Dosen an Plasmin (2,0 oder 4,0 mg/kg) oder tPA (1,0 oder 2,0 mg/kg) wurden über Zeitspannen von 60 Minuten über einen Katheter, der in die externe Jugularvene eingeführt worden war, in Kaninchen infundiert. Sowohl die Blutungszeit als auch das erneute Bluten der mit einer Skalpellklinge erzeugten Ohreinstiche (ungefähr sechs pro Ohr) wurden vor, während und nach der Infusion jedes finibrinolytischen Mittels beobachtet. Die primären Blutungszeiten wurden bei –30, –10, 0, 10, 30, 60, 70, 90, 120 und 180 Minuten relativ zum Start jeder Infusion durchgeführt. Mit Zitrat versetzte Blutproben (5 ml) wurden vor, während und bis zu zwei Stunden nach der Infusion jedes fibrinolytischen Mittels erhalten; diese Blutproben wurden auf Fibrinogen, Faktor VIII, und α₂-Antiplasmin hin einem Assay unterzogen. Jede experimentelle Gruppe bestand aus fünf Kaninchen.
Die primären Blutungszeiten neigten für die tPA-Gruppen dazu, zu jedem Zeitpunkt nach dem Beginn der Infusion bis zum 90-Minuten-Punkt länger zu sein (Tabelle 4). Tabelle 4. Primäre Blutungszeiten
* Statistisch größer als die korrespondierenden Durchschnittswerte, die bei den angegebenen Plasmingruppen (p < 0,05) beobachtet wurden.
Dieser Effekt war beim Vergleich der hoch dosierten tPA- und Plasmin-Gruppen zu den experimentellen Zeitpunkten von 30 Minuten und 70 Minuten statistisch signifikant (p < 0,05).

Tabelle 5 zeigt das beobachtete Wiederauftreten von erneuten Blutungen in jeder der vier experimentellen Gruppen. Tabelle 5. Wiederauftreten von erneuten Blutungen in jeder experimentellen Gruppe

Experimentelle Gruppe	Anzahl der Tiere, die erneutes Bluten aufwiesen
tPA (1,0 mg/kg)	5 von 5
tPA (2,0 mg/kg)	4 von 5
Plasmin (2,0 mg/kg)	0 von 5
Plasmin (4,0 mg/kg)	0 von 5
tPA, kombinierte Gruppen (n = 10)	9 von 10
Plasmin, kombiniert	0 von 10

Die Ergebnisse unterscheiden die hämorrhagische Aktivität des Plasminogenaktivators tPA von der von Plasmin. Keines der mit Plasmin behandelten Tiere zeigte im Gegensatz zu neun von zehn der mit tPA behandelten Tiere erneute Blutungen.
Tabelle 6A fasst die durchschnittlichen Zeiten der erneuten Blutungen für die Gruppe mit einer tPA-Dosierung von 1,0 mg/kg an den aktiven Stellen und allen Stellen mit erneutem Bluten zusammen. Tabelle 6B fasst die korrespondierenden Daten für die Gruppe mit einer Dosierung von 2,0 mg/kg zusammen. Tabelle 6A. Durchschnittliche Zeiten erneuter Blutungen in Kaninchen, die 1,0 mg/kg tPA erhielten
Tabelle 6B. Durchschnittliche Zeiten erneuter Blutungen bei Kaninchen, die 2,0 mg/kg tPA erhielten
Das erneute Bluten an den aktiven Stellen zeigte einen Unterschied zwischen den zwei Dosierungsgruppen von tPA, mit einer längeren Dauer des erneuten Blutens bei der 2,0 mg/kg Dosis relativ zu der 1,0 mg/kg Dosis von tPA. Die Resultate der Blutchemie-Messungen werden in Tabellen 7–9 zusammengefasst.

Tabelle 7 zeigt die zu den experimentellen Zeitpunkten gemessenen Fibrinogen-Levels. Die durchschnittlichen Fibrinogen-Levels nach tPA-Infusion fielen schneller und auf einen niedrigeren Tiefstpunkt ab, als die nach Plasmin-Infusionen. Tabelle 7. Durchschnittliche Fibrinogen-Levels (mg/dl) der experimentellen Gruppen zu unterschiedlichen Zeiten (Minuten) relativ zum Beginn der 60-minütigen Infusion

	Zeit, relativ zum Beginn der Infusion (Minuten)
Experimentelle Gruppe	–30	0	10	60	70	90	120	180
tPA (1,0 mg/kg)	221	205	202	93	145	126	194	205
tPA (2,0 mg/kg)	260	233	151	118	196	190	214	160
Plasmin (2,0 mg/kg)	208	231	214	149	167	134	183	145
Plasmin (4,0 mg/kg)	297	293	256	222	146	184	159	140

Die durchschnittlichen Werte für Faktor VIII (Tabelle 8) waren für die meisten der experimentellen Zeitpunkte für die tPA-infundierten Tiere relativ zu den Plasmin-infundierten Tieren niedriger, wobei die statistische Signifikanz für jede tPA-Gruppe gegenüber jeder Plasmingruppe zum experimentellen Zeitpunkt von 60 Minuten erreicht wurde. Tabelle 8. Durchschnittliche Faktor VIII-Levels (Prozent vom Anfangswert) der experimentellen Gruppen zu unterschiedlichen Zeiten (Minuten) relativ zum Beginn der 60-minütigen Infusion

	Zeit, relativ zum Beginn der Infusion (Minuten)
Experimentelle Gruppen	–30	0	10	60	70	90	120	180
tPA (1,0 mg/kg)	(100)	87	84	23*	58	77	57	64
tPA (2,0 mg/kg)	(100)	85	56	29*	41	36	46	44
Plasmin (2,0 mg/kg)	(100)	108	87	77	62	56	72	78
Plasmin (4,0 mg/kg)	(100)	85	65	58	58	61	47	50

* Statistisch niedriger als die korrespondierenden Durchschnittswerte für jede der Plasmingruppen bei 60 Minuten (p < 0,05).

Faktor VIII erholte sich bei den Tieren, die tPA erhielten, ungefähr auf dieselbe Konzentration (50–60% der anfänglichen Werte), wie bei den Tieren, die Plasmin erhielten. Der Vergleich der zwei tPA-Dosen zeigt bei der höheren Dose einen schnelleren Rückgang von Faktor VIII und einen dramatischeren Anstieg bei der Erholung von Faktor VIII bei der niedrigeren Dosis.

Wie in Tabelle 9 gezeigt, waren die durchschnittlichen Werte für α₂-Antiplasmin zu den meisten der experimentellen Zeitpunkte für die tPA-infundierten Tiere relativ zu den Plasmin-infundierten Tieren niedriger. Tabelle 9. Durchschnittliche α₂-Antiplasmin-Levels (Prozent vom Ursprungswert) der experimentellen Gruppen zu unterschiedlichen Zeiten (Minuten) relativ zum Beginn der 60-minütigen Infusion

	Zeit, relativ zum Beginn der Infusion (Minuten)
Experimentelle Gruppe	–30	0	10	60	70	90	120	180
tPA (1,0 mg/kg)	(100)	100	39*	4*	34	37	51	43
tPA (2,0 mg/kg)	(100)	81	12*	0*	9**	15**	15	27
Plasmin (2,0 mg/kg)	(100)	104	93	55	55	56	45	79
Plasmin (4,0 mg/kg)	(100)	102	89	45	20	49	24	24

* Statistisch niedriger als die korrespondierenden Durchschnittswerte für jede der Plasmingruppen zu diesen experimentellen Zeitpunkten (p < 0,05).
** Statistisch niedriger als die Durchschnittswerte der Plasmingruppen niedriger Dosierung zu diesen experimentellen Zeitpunkten (p < 0,05).

Die statistische Signifikanz wurde zu den experimentellen Zeitpunkten von 10 Minuten und 60 Minuten zwischen jeder der tPA-Gruppen und jeder der Plasmingruppen erreicht und zu den experimentellen Zeitpunkten von 70 Minuten und 90 Minuten zwischen den tPA-Gruppen hoher Dosierung und den korrespondierenden Plasmingruppen niedriger Dosierung erreicht.
Beispiel 11: Fibrinolyse durch Mini-Plasmin
Mini-Plasmin ist eine trunkierte Version von Plasmin, die die ersten Kringle-Domänen nicht aufweist. Es kann aus Mini-Plasminogen hergestellt werden, welches durch die eingeschränkte Proteolyse von Plasminogen mit Elastase erzeugt wird. Mini-Plasmin wird für die Lyse von Gerinnseln wirkungsvoller als das Plasmin in voller Größe sein, da: (a) Mini-Plasmin kleiner als Plasmin ist (38 kDA vs. 84 kDa) und leichter in das Gerinnsel hineindiffundieren wird; und (b) Mini-Plasmin, die α₂-Antiplasmin-Bindestelle von Kringle 1 nicht enthält, und damit gegenüber der Inhibierung durch mit dem Gerinnsel kreuzvernetztem α₂-Antiplasmin resistent ist. α₂-Antiplasmin ist häufig für die Resistenz gealterter Gerinnsel gegenüber der thrombolytischen Therapie verantwortlich. Mini-Plasminogen wurde, wie in Sottrup-Jensen et al. (1975) beschrieben, aufgereinigt. Die Umwandlung von Mini-Plasminogen in Mini-Plasmin, dessen Aufreinigung und Formulierung wurden unter Verwendung von genau dem Protokoll wie in Beispiel 2 für Plasmin beschrieben bewerkstelligt.
Die thrombolytische Wirksamkeit von Mini-Plasmin wurde bei äquimolaren Konzentrationen unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen in vitro PAO-Modells mit der von Plasmin verglichen. Gerinnsel wurden für 20 Stunden gealtert und zwei 1-ml-Dosen von Plasmin (1 mg/ml) oder Mini-Plasmin (0,45 mg/ml) wurden über einen Katheter an das Gerinnsel verabreicht. Zwischen den Injektionen wurden die Gerinnsel bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Das Ausmaß der Thrombolyse wurde über die Erniedrigung des Gewichts des Gerinnsels gemessen. Gerinnsel, die mit Kochsalzlösung infundiert worden waren, wurden als Kontrolle verwendet. Ausmaße der Gerinnsel –0,6 × 12 cm.
Wie in 10 gezeigt, verursacht Mini-Plasmin eine stärkere Lyse der Gerinnsel als Plasmin, wenn es in äquimolaren Mengen verwendet wird. Die Erniedrigung des Gewichts des Gerinnsels nach zwei 1-ml Injektionen von Mini-Plasmin von 0,45 mg/ml betrug 44,3 ± 4,4%, während zwei 1-ml Injektionen von Plasmin bei 1 mg/ml in einer Reduktion des Gewichts des Gerinnsels von 36 ± 1,7% resultierten. Mini-Plasmin kann sogar ein noch effektiveres thrombolytisches Mittel als Plasmin sein, wenn es mittels des Katheters direkt an oder in das Gerinnsel verabreicht wird.
Beispiel 12: Wirksamkeit der lokalen Verabreichung von Plasmin über Katheter
Die in vivo-Wirksamkeit von Plasmin (1–2 mg/kg), das lokal über einen Katheter verabreicht worden war, wurde mit der von tPA (0,5 und 1,0 mg/kg) im Kaninchen-Jugularvenen-Thrombosemodell verglichen. Zwei Ansätze wurden verwendet, um die Thrombolyse zu bestimmen: 1) Echtzeitmessungen der prozentualen Lyse eines radioaktivmarkierten Thrombus; und 2) Wiederherstellung des Grundlinien-Blutflusses mittels der Anwendung einer Fluss-Sonde und eines Fluss-Meters. Die Rate der Thrombolyse wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, über 90 Minuten überwacht und quantifiziert. Gleichzeitig wurden der Verbrauch an Faktor VIII und Fibrinogen, wie auch die Nagelhaut-Blutungszeit (CBT) als Indikatoren für den systemischen lytischen Status gemessen. Für diese Studien zur lokalen Verabreichung wurde ein Katheter (PE 50) über die marginale Ohrvene auf 1 cm an den verschließenden Thrombus herangebracht. Zwei Dosen von tPA, 0,5 und 1,0 mg/kg, und zwei Dosen von Plasmin, 1,0 mg/kg und 2 mg/kg, wurden verwendet. Diese Dosen waren in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml enthalten, das über 30 Minuten infundiert wurde. Der Prozentsatz der Lyse wurde bei dem radioaktivmarkierten Thrombus bei 60 und 90 Minuten gemessen und der Prozentsatz der Wiederherstellung des Flusses wurde in einer anderen gesonderten Reihe von Experimenten mit unmarkierten Thromben zu ähnlichen Zeitpunkten gemessen. Arterielle Blutproben (4 ml), die bei 0 Minuten und 60 Minuten erhalten worden waren, wurden zur Bestimmung der Fibrinogen und Faktor VIII-Level verwendet. Die Faktor VIII-Level und die Fibrinogenkonzentrationen wurden unter Verwendung eines MLA Electra 800 Coagulations-Timers und des Fibrinogen-Assay-Sets bestimmt. Die Faktor VIII-Level wurden mittels des COATEST VIII C4 Assays unter Verwendung des humanen Faktors VII für die Erzeugung einer Standardkurve bestimmt. Die Nagelhaut-Blutungszeiten zu 0 Minuten und 60 Minuten wurden durch Abschneiden des Nagels des Kaninchens an der Spitze mit einem Hunde-Nagelschneider bestimmt. Das Blut wurde mit einem Filterpapier ohne Berührung des Nagels alle zwei Minuten abgetupft, bis sich ein Thrombus gebildet hatte und das Filterpapier kein Blut mehr wegsog. Die Resultate werden als Durchschnittswert ± SEM dargestellt und zur Auswertung von signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen wurde eine einfache Abweichungsanalyse gefolgt von der Bonferroni-Prozedur für einen Test mit vielen Vergleichen verwendet. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Plasmin oder tPA (Gesamtvolumen 10 ml) wurde über 30 Minuten über einen Katheter infundiert, der 1 cm proximal zum Thrombus platziert war. Ein gleiches Volumen an Kochsalzlösung diente als Kontrolle. Plasmin-Dosierungen von 1,0–2,0 mg/kg wurden mit einer 0,5 mg/kg Dosis von tPA verglichen. Eine einfache Abweichungsanalyse, gefolgt vom Dunn-Verfahren für den Test vieler Vergleiche, wurde für die statistische Auswertung verwendet (* p < 0,05 verglichen mit tPA bei 0,5 mg/kg, oder # vs. tPA bei 1,0 mg/kg).
Im Vergleich mit tPA (0,5–1,0 mg/kg) induzierte lokal infundiertes Plasmin (1,0–2,0 mg/kg) eine vergleichbare oder signifikant bessere Thrombolyse bei einem vergleichbaren oder geringeren Verbrauch an Faktor VIII und Fibrinogen und CBT. Die Risiko-Nutzen-Bewertung der Plasminbehandlung deckte auf, dass die doppelte Menge an Plasmin. (auf Gewichtsbasis) ähnliche Blutungs-Nebeneffekte induzierte wie tPA. Daher kann Plasmin wirkungsvoll und sicher während der Katheter-unterstützten lokalen Thrombolyse als thrombolytisches Mittel verwendet werden. Plasmin hat, wenn es mit tPA verglichen wird, eine vergleichbare oder überlegene lytische Aktivität und das Sicherheitsprofil erschien in diesem Tiermodell der lokalen thrombolytischen Verabreichung ähnlich.
Das Ausmaß der Thrombolyse wurde aus dem Verhältnis zwischen der Menge der vom Thrombus in das Plasma freigesetzten Radioaktivität und der Gesamtmenge der Radioaktivität im Reaktionsgefäß berechnet. Die Freisetzung von markierten Fibrin-Degradationsprodukten wurde, in Prozent ausgedrückt, gegen die Zeit aufgetragen.
Der Prozentsatz der Lyse der radiomarkierten Thromben und der Verbrauch von Faktor VIII und Fibrinogen werden bei Inkubationszeitspannen von 60 Minuten (11) und 90 Minuten (12) gezeigt. Bei 0,5 mg/kg bzw. 1,0 mg/kg induzierte tPA eine Lyse von 16 ± 2% bzw. 21 ± 2%, während Plasmin bei 1,0 mg/kg bzw. 2,0 mg/kg eine Lyse von 26 ± 3% bzw. 33 ± 4% induzierte. Bei 90 Minuten hatte die tPA-Infusion im Vergleich zu Plasmin in einer Lyse von 21 ± 2% bzw. 26 ± 2% resultiert, welches eine Lyse von 31 ± 4% bzw. 36 ± 2% induzierte.
Beispiel 13: Risiko-Nutzen-Beurteilung der Plasminbehandlung gegenüber der tPA-Behandlung
Eine extensive vergleichende pharmakologische Auswertung (Risiko-Nutzen) wurde für Plasmin im Kaninchenmodell der Thrombolyse bestimmt. Die Wirksamkeit von Plasmin wurde mit der von tPA verglichen. Der Prozentsatz der Lyse und die Wiederherstellung des Blutflusses wurden als Indizes für die Wirksamkeit verwendet. Diese Analysen wurden in gesonderten Experimenten durchgeführt. Die jeweiligen, durch diese thrombolytischen Mittel induzierten Nebeneffekte, wurden durch Messung des Verbrauchs von Faktor VIII und Fibrinogen und Bestimmung der Blutungszeiten verglichen. Dieses erlaubte die Bestimmung eines ungefähren Risiko-Nutzen-Profils.
Um das Risikoprofil zu bestimmen, wurde die ED₅₀-Dosis für tPA unter Verwendung des Verbrauchs an Faktor VIII als Ersatzmarker für die Induktion des lytischen Zustands und der Blutung berechnet. Der Verbrauch an Faktor VIII wurde über Auffüllung von Faktor VIII (Kogenatee) und die Rückkehr zu normaler Hämostase direkt mit dem Blutungsnebeneffekt in Verbindung gebracht. tPA-Dosen, die von 0,1 mg/kg bis 3,0 mg/kg reichten, wurden mit einem n von wenigstens 10 Tieren/Dosis untersucht. 1,0 mg/kg wird als klinische Dosis für tPA angesehen. Der berechnete ED- für tPA war 1,8 mg/kg. Eine ähnliche Berechnung für lokal verabreichtes Plasmin ergab einen ED₅₀ von 3,6 mg/kg. Daher induzierte die doppelte Menge an Plasmin (Gewichtsbasis) ähnliche Blutungsnebeneffekte wie tPA. Die Wirksamkeit (% Lyse und Blutfluss) von tPA und Plasmindosen mit äquivalenten Risikoprofilen, d. h. Verbrauch an Koagulationsproteinen und Blutungen, wurden, wie in 13 gezeigt, ausgewertet. Bei allen äquivalenten getesteten Risikodosen, tPA (0,5–3,0 mg/kg) und Plasmin (1,0–3,0 mg/kg), induzierte Plasmin im Vergleich zu tPA zumindest ähnliche oder signifikant bessere Lyseraten und eine bessere Wiederherstellung des Blutflusses. Daher sind die pharmakologischen Daten ausreichend um zu befürworten, dass Plasmin für die lytische Behandlung von Thromben in Betracht gezogen wird, die durch Einbringen eines Katheters erreichbar sind.
Beispiel 14: Mittels N-terminaler Sequenzierung charakterisierte Degradierungs-Peptide von Plasminproben
Die Degradierungs-Peptide von Plasminproben wurden mittels N-terminaler Sequenzierung wie folgt charakterisiert. Plasminzusammensetzungen wurden bei niedrigen pH-Werten formuliert: ein pH von weniger als 2,5 und ein pH von 3,5 und 3,8 enthaltend 2 mM Essigsäure. Die Plasminproben wurden unter Verwendung der SDS-PAGE mit 4–12% Bis-Tris NuPage-Gelen, wie in 14 gezeigt, analysiert. Die Proteinbanden wurden auf eine PVDF-Membran transferiert, mit Coomassie-Blau R-250 (Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA) angefärbt und die Banden unter Verwendung eines Skalpells ausgeschnitten.
Die N-terminale Sequenzanalyse wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard 241 Protein-Sequenzierers (Hewlett Packard, Inc., Glen Allen, VA) direkt von der Membran ausgeführt. Für jede Bande wurden 10 Zyklen durchgeführt, so dass das korrespondierende Plasminfragment identifiziert werden konnte. Die Molekulargewichte wurden für jede Bande mittels der Dichtemessanalyse unter Verwendung des von Invitrogen, Inc. (San Diego, CA) erhältlichen Mark 12-Markers bestimmt.
Drei Polypeptide, die durch die Inkubation von Plasmin bei pH 3,8 erzeugt worden waren, begannen bei Positionen (Nummerierung relativ zu Lys-Plasmin) Threonin (T105), Glycin (G190) und Glutaminsäure (E623). Mittels der bekannten Aminosäuresequenz von Plasmin wurde bestimmt, dass die ersten beiden Polypeptide von der schweren Kette und das dritte von der leichten Kette stammten. Wie in 15 gezeigt, war die der N-terminalen Aminosäure vorausgehende Aminosäure entweder Arginin oder Lysin (K104, R189 und K622). Es ist allgemein bekannt, dass Plasmin Proteine auf der Carboxylseite von Lysin und Arginin spaltet. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass die Plasminzusammensetzungen bei pH 3,8 anfällig für die Autodegradierung waren.
Drei Polypeptide, die durch die Inkubation von Plasmin bei pH 2,2 erzeugt worden waren, begannen mit Prolin an den N-Termini. Mittels der bekannten Aminosäuresequenz von Plasmin wurde bestimmt, dass diese Polypeptide von der schweren Kette stammten, beginnend bei Positionen P63, P155 und P347, wie in 15 gezeigt. Die jedem Prolin vorangehende Aminosäure war eine Asparaginsäure (D62, D154 und D346). Es ist allgemein bekannt, dass Aspartyl-Prolyl-(D-P)-Peptidbindungen säurelabil sind. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Plasminzusammensetzungen bei einem pH von 2,2 für die saure Hydrolyse von Peptidbindungen anfällig waren.
Beispiel 15: Zucker in Formulierungen mit niedrigem pH stabilisieren Plasmin
Plasmin wurde bei einem pH von 2,5 bis 4,0 in einer der folgenden Säuren mit zumindest einem der folgenden Zucker formuliert. Die Säuregruppen schlossen 1 mM bis 500 mM von Essigsäure, Zitronensäure, Serin, Threonin, Isoleucin, Valin, Glutamin, β-Alanin oder anderen Säuren ein, vorzugsweise im Bereich von 1 mM bis 50 mM. Die Zuckergruppen schlossen 0,2 des 20 von Maltose, Mannitol, Sorbitol, Saccharose, Lactose, Glucose und Trehalose ein. Die Plasminformulierung ohne jeglichen Trägerstoff wurde als Kontrolle eingeschlossen. Alle Proben wurden bei 37°C für 7 Tage inkubiert. Die Veränderungen in der Plasmin-Integrität wurden mittels Durchführung einer reduzierenden SDS-PAGE analysiert.
Die in 16 gezeigten Resultate demonstrieren, dass Zucker bei pH 3,5 einen stabilisierenden Effekt auf Plasmin haben und den Nutzen der Lagerung von reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin bei niedrigem pH verbessern.
Beispiel 16: Stabilisierung von reversibel inaktivierten angesäuerten Plasminzusammensetzungen mit nicht-Kohlenhydrat-Stabilisierungsmitteln
Reversibel inaktivierte angesäuerte Zusammensetzungen wurden bei 1 mg/ml in 5 mM Essigsäure, pH 3,7, gemäß der vorliegenden Erfindung mit 0,1 M Glucosamin, Niacinamid, Citrullin oder Thiamin, die als nicht-Kohlenhydrat-Stabilisatoren hinzugegeben wurden, formuliert. Eine reversibel inaktivierte angesäuerte Plasminformulierung ohne jegliches Träger-Stabilisierungsmittel wurde als Kontrolle eingeschlossen. Alle Proben wurden bei 37°C für 7 Tage inkubiert und die Veränderung in der Plasmin-Integrität wurde unter Verwendung der SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Nun auf 17 Bezug nehmend, verbesserten alle der nicht-zuckrigen Stabilisierungsmittel die Stabilität der reversibel inaktivierten angesäuerten Plasminzusammensetzungen bei 37°C über die 7-tägige Testperiode.
Reversibel inaktivierte angesäuerte Plasminzusammensetzungen wurden ebenfalls bei 1 mg/ml in 2 mM Essigsäure, pH 3,4, gemäß der vorliegenden Erfindung mit 150 mM Natriumchlorid als Stabilisierungsmittel formuliert. Die gleiche Formulierung, jedoch ohne Natriumchlorid, wurde ebenfalls hergestellt und als Kontrolle eingeschlossen. Die Proben wurden für 28 Tage bei 4°C inkubiert. Die Veränderung der Plasmin-Integrität wurde unter Verwendung der SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen, wie in Beispiel 3 oben beschrieben, analysiert. Die Werte wurden relativ zu den Kontrollen am Tag 0, denen ein Wert von 100 zugewiesen wurde, normalisiert. Die Ergebnisse aus Tabelle 5 demonstrieren, dass bei 4°C gelagertes Plasmin in den Formulierungen mit niedrigem pH, die Natriumchlorid enthalten, stabiler ist. Tabelle 5. Stabilität der reversibel inaktivierten angesäuerten Plasminzusammensetzung (2 mM NaAc, pH 3,4) mit oder ohne 150 mM Natriumchlorid, gelagert bei 4°C.

Natriumchlorid-Konzentration(mM) Plasmin (mg/ml) % intakter schwerer Kette nach 28 Tagen % intakter leichter Kette nach 28 Tagen % Aktivität nach 28 Tagen

0 1 90 93 81

150 1 101 95 97
Beispiel 17: Plasma kann anteilsmäßig große Volumina von angesäuerter Kochsalzlösung neutralisieren
Um das Volumen der reversibel inaktivierten angesäuerten Plasminzusammensetzung der vorliegenden Erfindung abzuschätzen, das durch 1 ml Serum bei physiologischem pH neutralisiert werden kann, wurde eine Reihe von Titrierungsexperimenten durchgeführt. Es wird davon ausgegangen, dass ein Volumen von 1 ml Serum das Volumen der flüssigen Phase eines durchschnittlichen zurückgezogenen Gerinnsels repräsentiert, das in der Arterie eines PAO-Patienten gefunden wird. Serum (1 ml) wurde mit einer angesäuerten (pH 3,7) Pufferlösung mit niedriger Pufferkapazität titriert, welche typisch für die ist, in der das reversibel inaktivierte angesäuerte Plasmin gemäß der vorliegenden Erfindung formuliert wird. 1 ml Serum ist in der Lage, ungefähr 150 ml angesäuerter Kochsalzlösung zu neutralisieren. Letzteres Volumen überschreitet das wahrscheinliche Volumen an reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin, das für die Behandlung von peripheren arteriellen Verschlüssen benötigt wird.
Daher stellt die Formulierung von reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin in einem Puffer mit niedriger Pufferkapazität die Basis für eine wirkungsvolle und stabile pharmazeutische Zusammensetzung bereit. Solche Zusammensetzungen würden die Verabreichung von reversibel inaktiviertem angesäuertem Plasmin bei Raumtemperatur für die für die Behandlung benötigte Zeit erlauben, ohne dass das Plasmin während der Verabreichung des Präparats an den Patienten signifikant an Wirksamkeit verliert.
Beispiel 18: Bei einem niedrigen pH stabilisiertes Trypsin kann durch den Transfer zu einer Umgebund mit höherem pH reaktiviert werden
Trypsin (16,4 mg, Sigma Chemical Co., Katalog Nr. T-1426) wurde in 2,28 ml von 50 ml Tris/0,5 M NaCl (pH 8,0) gelöst. Die Trypsinlösung wurde auf eine 1 ml Benzamidin-Sepharosesäule (Pharmacia Code Nr. 17-0568-01) geladen, die zuvor mit 50 mM Tris/0,5 M NaCl (pH 8,0) äquilibriert worden war. Diese Säule wurde mit 4 ml dieses letzteren Puffers gewaschen, was zu einer Erniedrigung der Eluatabsorbanz (280 nm) auf weniger als 0,03 führte. Trypsin wurde mit 0,5-ml Volumina von 200 mM Glycin/0,5 M NaCl (pH 3,0) in einem inaktivierten Zustand von dieser Säule eluiert; die dritte bis fünfte 0,5-ml-Fraktionen, die von dieser Säule eluiert wurden, umfassten die Spitzenwerte der Absorbanz (280 nm) und wurden vereinigt. Die Absorbanz (280 nm) dieses vereinigten Trypsineluats wurde mit 9,22 bestimmt; basierend auf dem Extinktions-Koeffizienten für Trypsin (E₂₈₀ für eine 1% Lösung = 17,09) und dem Molekulargewicht von Trypsin (24.000) wurde die Konzentration von Gesamt-Trypsinprotein in diesem vereinigten Säuleneluat mit 225 μM berechnet.
Die Konzentration der Trypsin-aktiven Stellen in diesem vereinigten Trypsin-Säuleneluat wurde mittels des Verfahrens, das durch Case & Shaw, Biochem. Biophys. Res. Commun. 29, 508 (1967) beschrieben wurde, unter Verwendung von p-Nitrophenylguanidinobenzoat als Titrant für die aktive Stelle bestimmt. Dieser Assay wurde bei einem pH von 8,3 durchgeführt, mittels Verdünnens eines kleinen Volumens (100 μl) des vereinigten Trypsin-Säuleneluats in einer Assay-Mischung, die ebenfalls 700 μl 50 mM Natriumborat (pH 8,3), 200 μl 10 mM Natriumphosphat/1% Glycin (pH 7,0) plus 10 μl p-Nitrophenylguanidinobenzoat (gelöst in Dimethylformamid) enthielt; der endgültige pH dieser Mischungszusammensetzung wurde mit 8,3 bestimmt. Die Trypsin-abhängige Menge an p-Nitrophenol, die in diesem Assay gebildet wurde, wurde bei 410 nm überwacht. Basierend auf dem Extinktionskoeffizienten für p-Nitrophenol bei 410 nm und pH 8,3 (16.595 M^–1), korrespondierten 100 μl dieses vereinigten Trypsin-Säuleneluats, die im 1,01-ml Assay enthalten waren, mit einer Konzentration von 22,95 μM an Trypsin-aktiven Stellen, die in der Küvette vorhanden waren. Daher enthielt die anfängliche Stammlösung des vereinigten Trypsin-Säuleneluats 231 μM Trypsin-aktiver Stellen. Dieser letztere Wert ist innerhalb experimenteller Fehler mit der Konzentration an vorhandenem Gesamttrypsinprotein identisch (225 μM). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Trypsin auf einen niedrigen pH eingestellt werden kann und dann unter Reaktivierung seiner aktiven Stelle in eine Umgebung mit höherem pH transferiert werden kann.
Referenzen

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U.S. Patent Nummern:

Claims

Verwendung von einem reversibel inaktiven, angesäuerten Plasmin, das im Wesentlichen frei von einem Plasminogenaktivator ist, von einem pharmazeutisch akzeptablen, angesäuerten Träger, der einen pH von unter 4,0 hat oder auf einen pH von unter 4,0 angesäuert wurde, und optional von einem Stabilisator für die Herstellung von einem Medikament zur Behandlung eines thrombotischen Verschlusses in einem Menschen oder Tier, indem die therapeutische Dosis in oder nahe des thrombotischen Verschlusses zugeführt wird, und zwar ohne Neutralisierung vor der Verabreichung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der thrombotische Verschluss ein vaskulärer Verschluss ist, der aus einer koronaren Thrombose, tiefen Venenthrombose, peripheren Thrombose, embolischen Thrombose, hepatischen Venenthrombose, marantischen Thrombose, Sinusthrombose, Venenthrombose, einer arteriellen Thrombose, einem verschlossenen arteriovenösen Shunt oder einer verschlossenen Kathetervorrichtung ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medikament lyophilisiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Plasmin Glu-Plasmin, Lys-Plasmin, Mini-Plasmin, Mikro-Plasmin oder eine verkürzte Variante davon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament ferner ein anti-thrombotisches Mittel umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der pharmazeutisch akzeptable, angesäuerte Träger eine organische Säure ist, die aus einer Carbonsäure, einem Oligopeptid, einer Aminosäure oder einer anorganischen Säure ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die pharmazeutisch akzeptable Säure aus Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure, Glycin, Isoleucin, Serin, Threonin, Glutamin, Asparaginsäure, Valin und Alanin ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Säure in dem Konzentrationsbereich zwischen 1 mM und 500 mM liegt.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Säure in dem Konzentrationsbereich zwischen 1 mM und 50 mM liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Medikament einen pH zwischen 2,5 und 4,0 hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Medikament einen pH zwischen 3,0 und 4,0 hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Medikament einen pH zwischen 3,1 und 3,5 hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Säugetierplasmin in dem Konzentrationsbereich zwischen 0,01 mg/ml und 50 mg/ml liegt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Säugetierplasmin in dem Konzentrationsbereich zwischen 0,1 mg/ml und 10 mg/ml liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Medikament ferner einen Stabilisator umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Stabilisator ein pharmazeutisch akzeptables Kohlenhydrat ist, das aus Glucose, Maltose, Mannit, Sorbit, Saccharose, Lactose oder Trehalose ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Kohlenhydrat eine Konzentration in dem Bereich von 0,2% w/v bis 20% w/v hat.
Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Kohlenhydrat Glucose ist und seine Konzentration 20% beträgt.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Stabilisator eine Konzentration ein dem Bereich von 0,01 M bis 0,1 M hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Stabilisator aus Glucosamin, Niacinamid und Thiamin ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die therapeutische Dosis des reversibel inaktivierten, angesäuerten Plasmins im Bereich zwischen 0,1 mg Plasmin/kg Körpergewicht und 10,0 mg Plasmin/kg Körpergewicht liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die therapeutische Dosis des reversibel inaktivierten, angesäuerten Plasmins im Bereich zwischen 0,2 mg Plasmin/kg Körpergewicht und 4,0 mg Plasmin/kg Körpergewicht liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die therapeutische Dosis des reversibel inaktivierten, angesäuerten Plasmins im Bereich zwischen 1,0 mg Plasmin/kg Körpergewicht und 2,0 mg Plasmin/kg Körpergewicht liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das Medikament durch eine Kathetervorrichtung verabreicht werden kann.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Kathetervorrichtung ein intravaskulärer Katheter ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei der intravaskuläre Katheter auf einen vaskulären Verschluss gerichtet werden kann.
Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei der intravaskuläre Katheter imstande ist, das Medikament nahe an oder in einen thrombotischen Verschluss zuzuführen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei der intravaskuläre Katheter imstande ist, in den thrombotischen Verschluss einzudringen, und der Katheter das Medikament direkt in den thrombotischen Verschluss zuführt.