ES2290058T5 - Método de trombólisis por medio del suministro local de plasmina acidulada inactivada en forma reversible - Google Patents

Método de trombólisis por medio del suministro local de plasmina acidulada inactivada en forma reversible Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Metodo de trombolisis por medio del suministro local de plasmina acidulada inactivada en forma reversible.
Campo de la invencion
La presente invencion se relaciona generalmente con un metodo de trombolisis utilizando plasmina acidulada inactivada en forma reversible que esta sustancialmente libre de activadores de plasminogenos y su suministro local de la plasmina acidulada proximal a, o directamente dentro de, un trombo. El metodo terapeutico es particularmente aplicable a la disolucion de trombos donde quiera que sea factible la colocacion de un cateter dirigido.
Antecedentes
La enfermedad trombotica es una causa principal de morbidez y de mortalidad en el mundo moderno. El infarto agudo al miocardio y el ataque isquemico fulminante son la primera y la tercera causas de muerte e invalidez en las sociedades occidentales. La trombosis oclusiva resulta en perdida de flujo sangulneo a los organos vitales produciendo una privacion local de oxlgeno, necrosis celular y perdida de la funcion del organo. Existen beneficios principales para la rapida destruction de un trombo, resultando en una recanalizacion temprana: previene la muerte celular, reduce el tamano del infarto, preserva la funcion del organo y reduce la mortalidad temprana y tardla. La terapia trombolltica se administra ahora a mas de 750.000 pacientes por ano en todo el mundo, aunque muchas veces ese numero podrla potencialmente beneficiarse de tal tratamiento.
Los agentes trombollticos utilizados hoy en dla en la lisis de coagulos de sangre oclusivos son activadores del plasminogeno. Varios activadores diferentes de plasminogeno se encuentran actualmente disponibles para uso cllnico inmediato y varios activadores nuevos del plasminogeno de nueva generation son objeto de estudios cllnicos: el activador del plasminogeno tisular, tPA, y su sucesor de segunda generacion TNK-tPA, RETEPLASE™ (un mutante de supresion de tPA), un activador del plasminogeno del tipo uroquinasa de cadena sencilla (scuPA, o prouroquinasa), uroquinasa (UK), estreptoquinasa (SK), y el complejo activador de la estreptoquinasa del plasminogeno anisoilado (APSAC). tPA, scuPA, y UK se encuentran normalmente en bajos niveles en los humanos. La estreptoquinasa es una enzima bacteriana con una potente actividad trombolltica. APSAC es un complejo estreptoquinasa-plasminogeno anisoilado. En todos los casos los activadores del plasminogeno son capaces de convertir el plasminogeno zimogeno a la plasmina proteasa activa. La ventaja ofrecida por tPA y scuPA (y, en menor grado, APSAC) es que su activation de plasminogeno es especlfica para la fibrina; el enlazamiento a la fibrina es un prerrequisito para que su actividad proteolltica se realice en forma completa (Haber y colaboradores, 1989). La uroquinasa y la estreptoquinasa pueden activar al plasminogeno en ausencia de fibrina. Tal variation en la afinidad por la fibrina tiene consecuencias importantes por lo que respecta al grado al cual ocurre el sangrado sistemico en modelos animales; estas diferencias, sin embargo, no han sido evaluadas cllnicamente.
Los activadores del plasminogeno ejercen universalmente su potencial trombolltico por medio de la activacion de la circulation del plasminogeno zimogeno en la plasmina. La plasmina, el principio de la enzima fibrinolltica en mamlferos es una proteasa serina con especificidad como la de la tripsina que se deriva del plasminogeno zimogeno precursor inactivo que circula en plasma. El plasminogeno por si mismo es un polipeptido de 791 aminoacidos que tiene un residuo de glutamato N-terminal. Los activadores del plasminogeno tal como el activador del plasminogeno tisular (tPA) o la uroquinasa escindiran la molecula de plasminogeno de cadena sencilla, para producir plasmina activa, en el enlace del peptido Arg561- Val562. Las dos cadenas de polipeptido resultantes de la plasmina se mantienen juntas por medio de dos puentes disulfuro entre cadenas. La cadena liviana de 25 kDa transporta al centro catalltico y es homologa a la tripsina y a otras serina proteasas. La cadena pesada (60 kDa) consiste de cinco estructuras kringle de triple bucle con secuencias de aminoacidos muy similares. Algunos de estos kringles contienen a los as! llamados sitios de enlazamiento de lisina que son responsables por la interaction del plasminogeno y de la plasmina con la fibrina, a2-antiplasmina u otras protelnas.
El problema inherente con el uso terapeutico de los activadores existentes del plasminogeno tales como tPA, UK y SK son las complicaciones de sangrado asociadas con su uso, incluida, por ejemplo, la hemorragia intestinal hasta en un 20% de los pacientes. La hemorragia intracraneal, que es cllnicamente la mas seria, es un efecto secundario frecuente y letal de la terapia trombolltica actual, y se presenta aproximadamente en el 1% de los pacientes. El mecanismo para el sangrado es multifactorial y se cree que es debido al desenmascaramiento de una lesion vascular por lisis de un obturador hemostatico protector y la consecuente perdida de la integridad vascular. Esto se combina con la activacion sistemica del sistema fibrinolltico y su depauperation concomitante de los factores de coagulation. El enfoque de las investigaciones mas recientes ha estado en la generacion de los activadores modificados del plasminogeno que exhiben una especificidad mejorada por la fibrina; se esperaba reducir la cantidad de complicaciones por el sangrado. En algunos casos, estos nuevos activadores tienden a preservar los niveles en circulacion de tales factores de coagulacion tales como el fibrinogeno, los Factores VIII y V, el plasminogeno, y la a2-antiplasmina. Ellos dirigen y se enlazan especlficamente a las moleculas de fibrina que residen en un trombo, y actuaran unicamente sobre el plasminogeno cuando esta enlazado asl. Esto trae como resultado que el plasminogeno sea escindido por la plasmina de la proteasa activa unicamente en la vecindad de la trombosis y se
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reduce el nivel de escision sistemica no especlfica de la fibrina. Sin embargo, el numero de complicaciones por el sangrado con estos nuevos activadores del plasminogeno sigue siendo significativo.
El exito cllnico para drogas trombollticas tales como el activador del plasminogeno tisular (tPA) , la estreptoquinasa y la uroquinasa se establece por medio de la reduccion del grado de una oclusion trombotica de un vaso vascular. Los activadores del plasminogeno han llegado a ser por lo tanto un tratamiento de escogencia en el manejo del infarto agudo del miocardio y de algunas otras condiciones tromboticas. Sin embargo, varios desordenes, incluido el infarto del miocardio, el ataque oclusivo fulminante, la trombosis venosa profunda y la enfermedad arterial periferica, permanecen como un serio problema cllnico y los activadores conocidos del plasminogeno actualmente utilizados sufren de severas limitaciones que impactan su utilidad total en la eliminacion de un trombo. En el infarto del miocardio, el flujo vascular se restablece dentro de 90 minutos en aproximadamente 50% de los pacientes, mientras que en una reoclusion coronaria aguda ocurre aproximadamente en 10% de los pacientes. La recanalizacion coronaria requiere en promedio de 45 minutos o mas. La mortalidad residual, principalmente debida a hemorragia intracerebral, es aun al menos 50% del nivel de mortalidad en ausencia de tratamiento para la trombolisis.
La mayorla de las investigaciones en el area de los trombollticos se ha enfocado en mejorar la eficacia y la especificidad de la fibrina de los activadores existentes del plasminogeno as! como en el hallazgo de nuevos. Mucho de este esfuerzo se ha concentrado en dirigir a los activadores del plasminogeno hacia la fibrina que forma el armazon de un trombo y en mejorar las farmacocineticas de los activadores cuando se los administra dentro del torrente sangulneo. Esto permitirla su administracion como dosis en bolos en vez de como un suministro continuo que prolonga la exposicion del paciente al agente activo, y al riesgo acompanante de una hemorragia sistemica indeseable.
Con base en los resultados de la Fase II de los ensayos cllnicos con los activadores del plasminogeno fijados como objetivo tales como TNK-tPA, el activador del plasminogeno de la saliva del murcielago vampiro, sin embargo, la mejora anticipada en los perfiles de seguridad de los nuevos activadores del plasminogeno no ha sido verificada cllnicamente despues de la terapia trombolltica. El porcentaje de episodios de sangrado moderado y mas grande, incluidos la hemorragia intracraneal y el ataque fulminante, fueron comparables con el tPA original no modificado. Las arterias ocluidas no fueron abiertas mas temprano, y la velocidad de las nuevas oclusiones se mantuvo inalterada. Parece que el unico beneficio que estos activadores tienen es la prolongada vida media en el plasma y la posibilidad de administracion en bolo.
Otro problema con los activadores del plasminogeno es que ellos tienen una limitada eficacia en el tratamiento de los coagulos grandes encontrados en las oclusiones arteriales perifericas (PAO). Estos trombos son tlpicamente viejos y pueden crecer hasta un tamano significativo. El tamano promedio de los trombos perifericos encontrados tanto en las arterias nativas como en los injertos es de 31 ± 11 cm. Los trombos envejecidos y encogidos son deficientes en plasminogeno, lo cual limita por lo tanto la susceptibilidad de los trombos viejos a la trombolisis
inducida por el activador del plasminogeno. Es muy comun para un paciente con PAO ser tratado durante 24 horas o
mas con uroquinasa y aun despues de este perlodo prolongado no tener la completa permeabilidad del vaso. El problema es mayor con el suministro de los agentes trombollticos existentes a traves de un cateter directamente en el interior del trombo donde existen niveles reducidos del sustrato del plasminogeno.
Una aproximacion fundamentalmente diferente para evitar los problemas asociados con la administracion sistemica de un activador plasminogeno para generar plasmina suficiente en el sitio del trombo, es administrar la plasmina misma directamente al paciente. Esto es debido a que la plasmina es finalmente la enzima que media la trombolisis iniciada por los activadores del plasminogeno. El suministro directo de plasmina activa directamente dentro de los trombos encogidos estrecharla la deficiencia inherente del plasminogeno de estos trombos y provee una trombolisis predecible, rapida y efectiva con independencia del contenido de plasminogeno.
Reich y colaboradores en la patente estadounidense No. 5.288.489, divulga un tratamiento fibrinolltico que incluye la administracion parenteral de plasmina dentro del organismo de un paciente. La concentracion y el tiempo del
tratamiento fueron suficientes para permitir que la plasmina activa alcanzara una concentracion en el sitio de un
trombo intravascular que es suficiente para lisar al trombo o para reducir los niveles circulantes de fibrinogeno. Reich y colaboradores, sin embargo, requieren de la generacion de la plasmina a partir del plasminogeno inmediatamente antes de su introduccion dentro del organismo.
En contraste, Jenson en la patente estadounidense No. 3.950.513 divulga una preparacion de un plasmina de porcino que se mantiene estable a un pH bajo. La solucion de plasmina se neutraliza antes de la administracion sistemica a humanos para terapia trombolltica.
Yago y colaboradores en la patente estadounidense No. 5.879.923 divulga composiciones de plasmina utiles como reactivos de diagnostico. Las composiciones de Yago y colaboradores consisten de bajas concentraciones de plasmina a un pH neutro y un componente adicional que puede ser 1) un oligopeptido que contiene al menos dos aminoacidos, o 2) al menos dos aminoacidos, o 3) un aminoacido sencillo y un alcohol polihldrico.
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La plasmina representa una segunda clase de mecanismo de agentes trombollticos, distinta de la clase de los activadores del plasminogeno. Aunque la plasmina ha sido investigada como un agente trombolltico potencial, numerosas dificultades tecnicas han evitado el uso cllnico efectivo de esta enzima fibrinolltica. Estas dificultades incluyen el reto de preparar plasmina pura que este libre de todas las trazas funcionales del activador del plasminogeno utilizado para generar plasmina a partir del precursor inactivo, plasminogeno. La actividad trombolltica de estas preparaciones tempranas de plasmina fue atribuida eventualmente a la presencia de activadores contaminantes del plasminogeno en vez de a la plasmina por si misma. Los activadores contaminantes del plasminogeno, sin embargo, tambien dispararon el sangrado sistemico en sitios diferentes al del trombo fijado como objetivo. Una desventaja adicional de la estreptoquinasa utilizada para las preparaciones de plasmina es que su presencia en una preparacion de plasmina a menudo causa respuestas inmunologicas adversas incluidas fiebre y choque anafilactico.
La limitacion mas importante para el uso cllnico de plasmina es que, como una proteasa serina con amplia especificidad, es muy propensa a la autodegradacion y a la perdida de actividad a pH fisiologico. Esto causa severos retos a la produccion de una formulacion estable de plasmina de gran calidad adecuada para perlodos prolongados de almacenamiento antes de ser usada, y para una administracion efectiva y segura de plasmina a pacientes humanos que sufren de trombos oclusivos.
Lo que se necesita, por lo tanto, es un metodo para administrar una forma estable de plasmina activa que este sustancialmente libre de activadores del plasminogeno y que sea activa cuando encuentre una oclusion trombotica vascular objetivo.
Lo que tambien se necesita es un metodo de lisis de trombos que suministre directamente una forma activable de plasmina activa a traves de un cateter en el interior del trombo.
Lo que se necesita ademas es un metodo de trombolisis en el cual un agente trombolltico administrado se restrinja al sitio trombotico y que exhiba una hemorragia sistemica y especlficamente intracraneal.
Estos y otros objetivos y ventajas de la invencion se haran completamente claros a partir de la descripcion y de las reivindicaciones que vienen a continuacion o se pueden aprender por medio de la practica de la invencion.
Resumen de la invencion
Esta invencion se relaciona con el descubrimiento de que se puede mejorar la terapia trombolltica por medio de la administracion de plasmina acidulada inactivada en forma reversible directamente dentro, o proximo a, un trombo. La plasmina purificada es inestable a un pH fisiologico debido a la autodegradacion y, por lo tanto, la plasmina no ha estado facilmente disponible para administracion terapeutica. La presente invencion provee un metodo segun la reivindicacion 1 para administrar una dosis terapeutica de una composicion fibrinolltica a un humano o animal que tenga una oclusion vascular trombotica, que comprende la administracion de una dosis terapeutica de una composicion fibrinolltica acidulada e inactivada en forma reversible, farmaceutica aceptable y sustancialmente libre del activador del plasminogeno. La presente invencion provee ademas un metodo segun la reivindicacion 1 de administrar una dosis terapeutica de una composicion fibrinolltica acidulada e inactivada en forma reversible que comprende plasmina y un excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable, en donde el excipiente farmaceuticamente aceptable tiene una baja capacidad de amortiguacion.
La presente invencion tambien provee un metodo segun la reivindicacion 1 para administrar una dosis terapeutica de una composicion fibrinolltica acidulada e inactivada en forma reversible, en donde la composicion fibrinolltica contiene plasmina y un excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable, en donde el excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable contiene agua y un acido farmaceuticamente aceptable seleccionado de las formas acidas de acidos carboxllicos, aminoacidos u otros compuestos que tienen una baja capacidad amortiguadora y el excipiente acidulado tiene un pH aproximadamente menor a 4,0.
La presente invencion provee un metodo segun la reivindicacion 1 para administrar una dosis terapeutica de una plasmina acidulada inactivada en forma reversible y un excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable, que comprende ademas un estabilizador farmaceuticamente aceptable tal como, pero sin limitarse a, un azucar o un alcohol polihldrico.
En un aspecto de la presente invencion, la composicion fibrinolltica comprende una serina proteasa acidulada inactivada en forma reversible sustancialmente libre de su activador respectivo, un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion, y opcionalmente, un agente estabilizante. Tales serina proteasas incluyen tripsina, quimotripsina, elastasa pancreatica II, catepsina G, antlgeno especlfico para la prostata, leucocito elastasa, quimasa, triptasa, acrosina, kalikreina tisular, y plasmina. La plasmina incluye Glu-plasmina, Lys-plasmina, derivados y variantes modificadas o truncadas de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, midiplasmina, miniplasmina, o microplasmina.
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Los metodos de la presente invencion comprenden condiciones acidas y estabilizantes que vuelven a la plasmina estable para almacenamiento. La plasmina utilizada en la presente invencion se obtiene por medio de la activacion del plasminogeno, y que la alsla y almacena en una solucion acidulada que tienen un pH aproximadamente menor a 4 para proveer una formulacion estable de plasmina. La composition fibrinolltica de la presente invencion se puede liofilizar y esta sustancialmente libre del activador del plasminogeno. La baja capacidad de amortiguacion de la composicion de plasmina permite una titulacion rapida a un pH fisiologico cuando se la administra aun trombo o al suero. La plasmina acidulada es rapidamente neutralizada y activada cuando se la administra en una solucion con baja capacidad de amortiguacion directamente al sitio del coagulo a la terapia trombolltica.
Los objetivos adicionales, caracterlsticas, y ventajas de invencion seran mas claros por revision de la description detallada expuesta mas abajo cuando se la toma en conjunto con las figuras de los dibujos acompanantes, que se describen brevemente a continuation.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 ilustra la dependencia con el pH de la actividad de la plasmina segun lo medido con el sustrato cromogenico S2251.
La Figura 2 ilustra la estabilidad de la plasmina en agua acidulada (pH 3,7) segun lo medido por medio de un ensayo caseinolltico.
La Figura 3 ilustra un grafico de pH versus el porcentaje de cadena pesada con relation a la protelna total en cada senda de los geles SDS.
La Figura 4 ilustra la este llegado de plasmina o del tPA mas el plasminogeno en la trombolisis.
La Figura 5 ilustra la potencia trombolltica de la plasmina activa.
La Figura 6 ilustra el efecto de los inhibidores de la plasmina sobre la trombolisis inducida por plasmina.
La Figura 7 compara la administration local del tPA o de la Lys-plasmina sobre la restauracion del flujo sangulneo, y el consumo de FVIII y de fibrinogeno, a los 60 minutos.
La Figura 8 compara la administracion local del tPA o de la Lys-plasmina sobre la restauracion del flujo sangulneo a los 90 minutos, y el consumo de FVIII y de fibrinogeno a los 60 minutos.
La Figura 9 ilustra el efecto de la administracion local de tPA versus plasmina sobre los tiempos de sangrado de la cutlcula.
La Figura 10 ilustra la lisis de los coagulos sangulneos encogidos con una cantidad equimolar de plasmina o de miniplasmina acidulada inactivada en forma reversible.
La Figura 11 compara la administracion local de tPA y de plasmina sobre la lisis del trombo, y el consumo de FVIII y de fibrinogeno a los 60 minutos.
La Figura 12 compara la administracion local de tPA y de plasmina sobre la lisis del trombo a los 90 minutos, y el consumo de FVIII y de fibrinogeno a los 60 minutos.
La Figura 13 ilustra la evaluation del riesgo/beneficio de la plasmina versus tPA.
La Figura 14 ilustra la degradation progresiva de una composicion de plasmina a un pH de 2,2, 3,5 o 3,7.
La Figura 15 ilustra los sitios de escision generados en la plasmina a un pH 2,2 y de 3,8.
La Figura 16 ilustra la estabilidad a 37°C de una plasmina acidulada inactivada en forma reversible a un pH de 3,7, con estabilizadores de carbohidrato.
La Figura 17 ilustra la estabilidad a 37°C de una plasmina acidulada inactivada en forma reversible a un pH de 3,7, con glucosamina, niacinamida, tiamina o citrulina como agente estabilizante.
La Figura 18 ilustra la titulacion, con suero humano, de soluciones de plasmina que tienen diferentes amortiguadores con baja capacidad amortiguadora.
Descripcion detallada de la invencion
Una divulgation completa y habilitante de la presente invencion, incluida la mejor forma conocida por los inventores
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para llevar a cabo la intencion, es expuesta en mas particularmente en el resto de la especificacion, incluida la referenda a los Ejemplos. Esta descripcion se hace para los propositos de ilustrar los principios generales de la invention y no debe ser tomada en un sentido limitante.
La presente invencion se dirige a la necesidad por un metodo de trombolisis que permita el uso de una composition fibrinolltica que comprende plasmina acidulada inactivada en forma reversible y el suministro localizado de la plasmina a una oclusion trombotica. La invencion provee un metodo para administrar una dosis terapeutica de una composicion fibrinolltica a un humano o animal que tengan una oclusion trombotica, segun la reivindicacion 1 que comprende administrar en forma parenteral al humano o al animal una dosis terapeutica de una composicion fibrinolltica acidulada inactivada en forma reversible y farmaceuticamente aceptable, sustancialmente libre de activador del plasminogeno, permitiendole a la composicion fibrinolltica administrada interactuar con la oclusion trombotica, monitoreando el nivel de flujo vascular del humano o del animal, y repitiendo estas etapas hasta lograr un nivel preseleccionado de flujo vascular. El metodo segun la reivindicacion 1 de la invencion provee ademas el uso de una composicion fibrinolltica que contiene una plasmina acidulada inactivada en forma reversible, sustancialmente libre del activador del plasminogeno en un amortiguador de baja capacidad de amortiguacion. El metodo segun la reivindicacion 1 tambien provee el suministro directo a traves de un cateter intravascular de la composicion fibrinolltica dentro o en la vecindad inmediata del trombo, minimizando as! la degradation sistemica de la fibrina mientras se retiene la actividad maxima de la plasmina contra el trombo.
Con el uso mas intensivo de cateteres arteriales y venosos en las cllnicas, el suministro local de plasmina acidulada inactivada en forma reversible en la proximidad, o en forma efectiva dentro de un trombo, ofrece una oportunidad terapeutica atractiva para la trombolisis. Siendo una serina proteasa activa, la plasmina es un agente directo para la disolucion de un trombo, en contraste con los activadores del plasminogeno que requieren de la presencia del plasminogeno zimogeno en la vecindad del trombo. Se puede regular la terapia local trombolltica dirigida a traves de un cateter con plasmina activa, para lograr una trombolisis total localizada, y la plasmina tienen el potencial para ser un agente trombolltico seguro debido a que la dosis menor requerida para la suministro local puede reducir significativamente las complicaciones del sangrado frecuentemente asociadas con una terapia trombolltica con una dosis alta inducida por los activadores del plasminogeno. Cualquier vertimiento de plasmina en la vecindad inmediata del sitio del trombo sera rapidamente neutralizado por la a2-antiplasmina circulante.
Existen varios desaflos tecnicos asociados con la purification de la plasmina, y el almacenamiento, as! como con su uso y suministro terapeutico. La plasmina es una serina proteasa activa y esta sometida a autodigestion y a inactivation a pH fisiologico. De la degradacion de la plasmina, infortunadamente, es tambien lo mas evidente en el rango de pH requerido para la trombolisis in vivo.
La composicion fibrinolltica, como la incorporada en la presente invencion, incluye el mantenimiento de la plasmina en un amortiguador acido durante la purificacion, as! como su formulation en un excipiente acidulado que tiene un amortiguador farmaceuticamente aceptable con baja capacidad de amortiguacion, proveyendo as! una composicion fibrinolltica que contiene plasmina acidulada inactivada en forma reversible sustancialmente libre del activador del plasminogeno. Esta contemplada dentro del alcance de la presente invencion por ser la composicion fibrinolltica una composicion liofilizada que puede ser reconstituida por medio de la adicion de un excipiente farmaceuticamente aceptable tal como, pero sin limitarse a, agua, solution fisiologica salina o cualquier otro solvente que permita la administration de la composicion a un humano o a un animal. Su eficacia en restablecer la permeabilidad vascular se demostro en los ensayos in vitro y en un modelo in vivo de trombolisis en la vena yugular de un conejo.
El termino "inactivado en forma reversible" como se lo utiliza aqul, se refiere a una actividad enzimatica que esta sustancialmente libre de actividad bajo un conjunto especlfico de condiciones pero que se revertiran a una forma activa cuando se cambia a otro conjunto de condiciones.
El termino "excipiente farmaceuticamente aceptable" como se lo utiliza aqul, se refiere a cualquier excipiente que sea fisiologicamente tolerado por un receptor humano o animal, que incluye, pero sin limitarse a, agua, soluciones salinas, soluciones fisiologicas salinas, o cualquier otro llquido o gel en el cual se pueda disolver o suspender un agente fibrinolltico tal como plasmina. El "excipiente farmaceuticamente aceptable" puede incluir a cualquier compuesto farmaceuticamente aceptable que producira una solucion de plasmina que tenga un pH aproximadamente por debajo de 4,0 y que tenga una capacidad de amortiguacion baja o de cero.
El termino "amortiguador con baja capacidad de amortiguacion" como se lo utiliza aqul, se refiere a la cantidad de acido o de base que un amortiguador puede neutralizar antes de que el pH comience a cambiar en un grado apreciable. Como se lo utiliza aqul, un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion ajustara significativamente el pH por la adicion de un pequeno volumen de un acido o de una base, con relation al volumen de la solucion amortiguadora con baja capacidad de amortiguacion. Este termino tambien incluye soluciones aciduladas por acidos fuertes que incluyen, pero no se limitan a, acido clorhldrico, acido nltrico o acido sulfurico, y que no tienen capacidad de amortiguacion.
El termino "pH fisiologico" como se lo utiliza aqul, se refiere a un pH aproximadamente entre 6,5 y 7,5, mas tlpicamente entre el pH de 7,1 a 7,5.
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El termino "trombo" como se lo utiliza aqul, se refiere a un trombo en un vaso sangulneo o a un dispositivo en contacto con la sangre (por ejemplo dispositivos tipo cateter o de desvlo). Un trombo puede contener fibrina y puede contener ademas, pero sin limitarse a, plaquetas, eritrocitos, linfocitos, llpidos, constituyentes del suero o cualquier combinacion de los mismos. Un "trombo" puede ser, pero no se limita a, un trombo anular, un trombo en forma de bola, un trombo hialino, un trombo adosado a una pared, un trombo estratificado o trombos blancos.
El termino "oclusion trombotica" como se lo utiliza aqul, se refiere a un bloqueo total o parcial de un vaso debido a la formacion de un coagulo trombotico, en donde el trombo contiene al menos fibrina. El vaso vascular ocluido puede ser, pero no se limita a, una vena, arteria, venula, arteriola, capilar, lecho vascular o el corazon y puede estar dentro de cualquier organo vascularizado o tejido del cuerpo de un humano o de un animal. La oclusion trombotica puede ser tambien de un cateter o de otro implante, incluyendo, pero sin limitarse a, vasos prosteticos e injertos de origen humano, animal o sintetico, efectivamente bloqueados por una oclusion que contiene fibrina.
El termino "dispositivo tipo cateter" como se lo utiliza aqul, se refiere a cualquier cateter o dispositivo de tipo tubular que puede entrar al organismo, e incluye, pero no se limita a, un cateter arterial, un cateter cardlaco, un cateter central, un cateter venoso central, un cateter intravenoso, dispositivos tipo cateter en forma de balon insertados en forma periferica en un cateter central, en un cateter arterial pulmonar o en un cateter venoso central en forma de tunel y derivaciones arterio-venosas.
El termino "excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable" como se lo utiliza aqul, se refiere a cualquier excipiente farmaceuticamente aceptable que haya sido acidulado hasta un pH aproximadamente por debajo de 4,0. El "excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable" puede contener un amortiguador con capacidad de amortiguacion baja o de cero tal como un acido carboxllico como por ejemplo, pero sin limitarse a, acido formico, acido acetico, acido propionico, acido butlrico, acido cltrico, acido succlnico, acido lactico o acido malico acidulados hasta un pH aproximadamente por debajo de 4,0 por medio de la adicion de un acido inorganico; o al menos un aminoacido tal como pero sin limitarse a, glicina, alanina, valina, isoleucina, treonina o glutamina, o al menos una acido inorganico tal como, pero sin limitarse a, acido sulfurico, acido clorhldrico, acido nltrico o acido fosforico o cualquier combinacion de los mismos. Se contempla que esten dentro del alcance de la presente invencion para que la fraccion acida del excipiente farmaceutico sea al menos un amortiguador fisiologicamente tolerado, oligopeptido, ion organico o inorganico o cualquier combinacion de los mismos que mantendran un pH en el excipiente farmaceuticamente aceptable por debajo de un valor aproximadamente de 4,0.
El termino "carbohidrato" como se lo utiliza aqul, se refiere a cualquier sacarido o disacarido farmaceuticamente aceptable tal como, pero sin limitarse a, glucosa, fructuosa, maltosa o manosa, alcoholes dulces incluyen, pero no se limitan a, sorbitol y manitol, y polisacaridos tales como, pero sin limitarse a, dextrinas, dextranos, glicogeno, almidones y celulosas, o cualquier combinacion o derivado de los mismos que sean farmaceuticamente aceptables para un humano o un animal.
El termino "agente de estabilizacion" como se lo utiliza aqul, se refiere al menos a un compuesto tal como, pero sin limitarse a, glicerol, ascorbato, niacinamida, glucosamina, tiamina o sal inorganica tal como, pero sin limitarse a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio o cloruro de manganeso o cualquier combinacion de los mismos que incrementara la estabilidad de una preparacion de plasmina.
El termino "plasmina acidulada inactivada en forma reversible" como se lo utiliza aqul, se refiere a cualquier forma catallticamente activa de plasmina capaz de escindir proteollticamente a la fibrina cuando se encuentra bajo condiciones fisiologicas, pero inactivadas en forma reversible cuando se encuentran en un pH aproximadamente entre un pH de 2,5 hasta aproximadamente 4,0. El termino "inactivado" como se lo utiliza aqul, se refiere a una reduccion total o sustancial en actividad enzimatica comparada con la actividad a un pH fisiologico. El termino "plasmina activa" como se lo utiliza aqul, se refiere a una plasmina bajo condiciones donde la plasmina es capaz de escindir proteollticamente a la fibrina. El termino "plasmina" incluye, pero no se limita a, Glu-plasmina, Lys-plasmina, derivados, variantes modificadas o truncadas de las mismas. El termino "variantes truncadas" incluye, pero no se limita a, la midiplasmina, miniplasmina o microplasmina como se divulga en la patente estadounidense No. 4.774.087.
El termino "anticoagulante" como se lo utiliza aqul, se refiere a cualquier compuesto capaz de inhibir la formacion de un trombo incluyendo, pero sin limitarse a, hiruidina, heparina, inhibidores de trombina, inhibidores plaquetarios, inhibidores de agregacion plaquetaria y cualquiera de los derivados o combinaciones de los mismos.
El termino "serina proteasa" como se lo utiliza aqul, se refiere a cualquier serina proteasa capaz de escindir proteollticamente a la fibrina incluyendo, pero sin limitarse a, plasmina, tripsina, quimotripsina, elastasa pancreatica II, catepsina G, antlgeno especlfico para la prostata, elastasa leucocito elastasa, quimasa, triptasa, acrosina y kalikreina tisular humana.
Una limitacion de la terapia trombolltica actual con activadores del plasminogeno es la disponibilidad de plasminogeno que rodea o esta dentro de un trombo. El suministro local de un agente fibrinolltico a un trombo
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permite ahora que la plasmina por si misma sea un potente agente terapeutico directamente administrado a un trombo. En contraste con diferentes activadores del plasminogeno que son actualmente utilizados como trombollticos, la terapia trombolltica directa localizada con plasmina se puede intensificar hasta cualquier nivel que se requiera para lograr la lisis del coagulo. Esto es debido a que la plasmina actua directamente sobre el pollmero de fibrina. Tambien, la plasmina, cuando se la suministra directamente en, o en forma adyacente a un trombo, permite que se administre una dosis efectiva menor con la reduction concomitante en la hemorragia sistemica tlpicamente asociada con la terapia convencional trombolltica. El exceso de plasmina tambien puede ser rapidamente inactivado por medio de la a2-antiplasmina circulante.
La plasmina activa altamente purificada de la presente invention fue preparada por lo tanto a partir del plasminogeno que habla sido purificado a partir de la Fraction II + III de Cohn. La pureza de la plasmina fue superior al 95% y la actividad especlfica estaba en el rango de 18-23 CU/mg. Las preparaciones de plasmina estaban sustancialmente libres de uroquinasa, o de cualquier otro activador del plasminogeno, que haya sido utilizado para la conversion de plasminogeno en plasmina. La presente invencion tambien contempla que la plasmina sustancialmente libre del activador del plasminogeno se pueda preparar a partir de cualquier fuente que incluya, pero no se limite a, suero de mamlfero, un plasminogeno recombinante o un plasminogeno truncado tal como, pero que no se limite a, el miniplasminogeno o el microplasminogeno divulgados por Wu y colaboradores en la patente estadounidense No. 4.774.087.
La plasmina de la presente invencion fue purificada hasta remover sustancialmente a los activadores del plasminogeno por medio del enlazamiento a una columna cromatografica de Sefarosa con benzamidina y la plasmina eluida fue recolectada y almacenada en un excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable que tiene un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion. Un pH bajo el rango de aproximadamente 2,5 hasta aproximadamente 4,0 estabilizo significativamente a la plasmina, aun cuando se mantuvo a temperatura ambiente o superior. Mientras no este limitado por ninguna teorla, se cree que a este valor tan bajo de pH, la plasmina ya no tiene la actividad de la serina proteasa que de otra forma conducirla a la autodegradacion de la plasmina, como se observarla cuando la plasmina es almacenada a un pH fisiologico aproximadamente 7,0-7,5.
Cuando se administra plasmina acidulada inactivada en forma reversible, de acuerdo a los metodos de la presente invencion, directamente dentro de un trombo o en forma proxima al mismo, la plasmina acidulada inactivada en forma reversible en el amortiguador con baja o ninguna capacidad de amortiguacion encuentra al suero, encuentra la capacidad de amortiguacion del suero en el pH fisiologico de aproximadamente 7,4. Se neutraliza la baja capacidad de amortiguacion del excipiente farmaceuticamente aceptable, con lo cual la plasmina se revierte hasta su estado activado y digiere proteollticamente la fibrina del trombo.
Empleando inicialmente un metodo de preparation de plasmina que suministre plasmina proteollticamente inactiva hasta administrarla dentro, o en forma inmediatamente adyacente a un trombo, y que este tambien sustancialmente libre de cualquier activador del plasminogeno, se disminuye la probabilidad de inducir una hemorragia sistemica indeseable. La plasmina administrada en exceso es rapidamente inactivada por los inhibidores que circulan en el suero tales como la a2-antiplasmina, y los activadores relativamente estables del plasminogeno que de otra manera circularlan para inducir fibrinolisis distal, estan practicamente ausentes.
La plasmina acidulada se puede almacenar facilmente en excipientes farmaceuticamente estables que tienen una capacidad de amortiguacion baja o nula tal como, pero sin limitarse a, glicina acuosa 5 mM. Se puede utilizar cualquier ion farmaceuticamente aceptable, ya sea solo o en combination, si un pH esta en el rango aproximadamente de 2,5-4,0. Tlpicamente, la plasmina acidulada inactivada en forma reversible ha sido mantenida a un pH de 3,1-3,5. Los iones acidos farmaceuticamente aceptables incorporados en el excipiente para mantener un pH bajo se pueden seleccionar entre oligopeptidos, al menos un aminoacido, o acidos organicos o inorganicos o una combinacion de los mismos. La estabilizacion se puede mejorar ademas por medio de la inclusion de al menos un compuesto farmaceuticamente aceptable que puede ser, pero sin limitarse a, un carbohidrato.
La administration de la composition de plasmina se pueda hacer por cualquier metodo que suministrara la plasmina como un bolo o como una infusion prolongada directamente dentro de un trombo, o en un sitio a una distancia corta proxima al trombo, con lo cual puede encontrar rapidamente al trombo. Minimizando esta distancia hasta el trombo o administrandola directamente dentro de los coagulos, se reduce la exposition de la plasmina a los inhibidores de plasmina en el suero que esta situado entre la aguja o el cateter suministrados y el trombo. La presente invencion contempla que la plasmina acidulada inactivada en forma reversible puede ser suministrada al trombo por medio de un cateter. La presente invencion contempla ademas que se pueda utilizar una aguja con canula, tal como, pero sin limitarse a, una aguja de jeringa, para inyectar la plasmina acidulada inactivada en forma reversible dentro de un trombo. Esto esta, sin embargo, dentro del alcance de la presente invencion por cualquier medio conocido por alguien capacitado en el arte, para administrar localmente un fluido en una ubicacion especlfica en un humano o animal. El suministro de un cateter a un trombo vascular o coronario permite ademas precision en la colocation de la plasmina, especlficamente dentro del trombo. Aun cuando la presente invencion provee metodos de suministro localizado de una plasmina acidulada inactivada en forma reversible en un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion a un trombo, esta dentro del alcance de la presente invencion para el suministro de una composicion
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de plasmina acidificada inactivada en forma reversible de la misma a una oclusion de fibrina de un cateter implantado en un humano o en un animal.
Utilizando un ensayo in vitro de trombolisis de fibrina marcada con 125I, se observo que la plasmina era capaz de disolver trombos en forma dependiente de la dosis. Se reforzo la fibrinolisis por medio de la supresion ya sea de la a2-antiplasmina o de la a2-microglobulina en el plasma que rodea al trombo, as! como por medio de la supresion de todos los inhibidores (esto es, en PBS). Estos resultados muestran que la trombolisis por plasmina esta bajo una regulacion muy estricta por parte de los inhibidores endogenos de la plasmina, y provee las bases para una terapia trombolltica mas segura.
Se comparo la eficacia in vivo de la plasmina acidulada inactiva en forma reversible (1-3 mg/kg) en un amortiguador con baja capacidad amortiguacion directamente administrada en forma local a un trombo a traves de un cateter con aquella del tPA (0,5 y 1,0 mg/kg) en el modelo de trombosis en la vena yugular de conejo. Se monitoreo la velocidad de la trombolisis. Ademas, el consumo del Factor VIII y de fibrinogeno, as! como el tiempo de sangrado de la cutlcula (CBT), se midieron como indicadores del estado sistemico lltico. En comparacion con 0,5 mg/kg del tPA, la plasmina proveyo una trombolisis comparable o significativamente mejor, con un consumo comparable del Factor VIII y de fibrinogeno y un CBT similar con una dosis de 1 mg/kg. Hubo un consumo significativamente mayor y de CBT con una dosis de plasmina de 3 mg/kg. Cuando se compara con 1 mg/kg del tPA, tanto la plasmina como el tPA proveyeron velocidades de trombolisis muy similares con un consumo menos significativo de fibrinogeno con una dosis de plasmina de 3 mg/kg.
De este modo, se puede almacenar en forma efectiva y segura la plasmina acidulada inactivada en forma reversible y utilizarla como un agente trombolltico durante la trombolisis local asistida por un cateter sin neutralizacion antes de la administracion a un humano o a un animal. La plasmina tiene una actividad fibrinolltica comparable, si no superior, comparada con la del tPA, y el perfil de seguridad parece al menos similar en este modelo animal de suministro trombolltico local.
Se contempla dentro del alcance de la presente invencion que la enzima fibrinolltica acidulada inactiva a en forma reversible puede ser, pero no se limita a, plasmina, derivados de plasmina tales como las formas truncadas de la misma que incluyen, pero no se limitan a, miniplasmina y microplasmina.
La presente invencion provee un metodo para administrar una dosis terapeutica de una preparacion de una composicion fibrinolltica fluida sustancialmente libre de activadores del plasminogeno en la vecindad inmediata de, o directamente dentro, de una oclusion trombotica de un vaso vascular o de un dispositivo ocluido tipo cateter. La invencion provee ademas un metodo para suministrar una dosis terapeutica de una composicion fluida de plasmina acidulada inactivada en forma reversible a una oclusion trombotica en donde la plasmina se puede estabilizar antes de administrarla a un pH aproximadamente de 4,0. La presente invencion provee ademas un metodo para suministrar una dosis terapeutica de una composicion fluida de plasmina acidulada inactivada en forma reversible en un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion directamente dentro de una oclusion vascular trombotica, o de un trombo, con lo cual la composicion de plasmina se revierte hasta un pH fisiologico que permitiera plasmina escindir proteollticamente a la fibrina.
El metodo segun la reivindicacion 1 de la invencion comprende las etapas de identificar a un humano o a un animal que tienen una oclusion trombotica, administrandole al humano o al animal una dosis terapeutica de una composicion fibrinolltica acidificada inactivada en forma reversible en un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion, permitiendo que la composicion fibrinolltica administrada interactue con la oclusion vascular, monitoreando el nivel de flujo vascular del humano o del animal; y repitiendo las etapas de administrar la composicion fibrinolltica hasta lograr un nivel preseleccionado de flujo vascular.
En otra modalidad de la presente invencion, la composicion fibrinolltica acidulada inactivada en forma reversible contiene plasmina y un excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable que tiene un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion.
En aun otra modalidad de la presente invencion, el excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable contiene agua y al menos un acido farmaceuticamente aceptable, en donde el acido es un acido organico, que puede ser, pero no se limita a, un acido carboxllico, un oligopeptido, un aminoacido, o un acido inorganico y que tiene una capacidad de amortiguacion baja o nula, y el excipiente acidulado tiene un pH aproximadamente menor a 4,0.
En aun otra modalidad, el excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable contiene agua y un acido farmaceuticamente aceptable seleccionado de las formas acidas de formato, acetato, citrato, glicina, isoleucina, serina, treonina, glutamina, y alanina, en donde el excipiente acidulado tiene un pH aproximadamente menor a 4,0.
En una modalidad adicional, el acido farmaceuticamente aceptable es la forma acida de acetato o citrato.
En aun otra modalidad, el acido farmaceuticamente aceptable es la forma acida de acetato.
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En una modalidad del metodo de la presente invencion, la composicion fibrinolltica acidulada inactivada en forma reversible tiene un pH aproximadamente entre 2,5 y aproximadamente 4,0. En otra modalidad del metodo de la presente invencion, la composicion fibrinolltica tiene un pH aproximadamente de 3,7.
En otras modalidades del metodo de la presente invencion, la plasmina esta en el rango de concentration de aproximadamente entre 0,01 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml. En una modalidad del metodo de la presente invencion, la plasmina esta en el rango de concentracion aproximadamente entre 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml.
En modalidades adicionales del metodo que la presente invencion, el ion acido esta en el rango de concentracion aproximadamente entre 1 mM y aproximadamente 500 mM. En una modalidad del metodo de la presente invencion, el ion acido esta en el rango de concentracion aproximadamente entre 1 mM y 50 mM.
Las modalidades para practicar el metodo de la presente invencion comprenden ademas un estabilizador de plasmina fisiologicamente aceptable, en donde el carbohidrato se selecciona de glucosa, maltosa, manitol, sorbitol, sacarosa, lactosa o trehalosa, en donde el azucar tiene una concentracion en el rango aproximadamente de 0,2% p/v hasta aproximadamente 20% p/v. En una modalidad, el azucar es glucosa y la concentracion de la misma es aproximadamente del 20%.
Las modalidades del metodo de la presente invencion comprenden ademas la dosis terapeutica de la plasmina acidulada inactivada en forma reversible en el rango aproximadamente entre 0,01 mg de plasmina/kg de peso corporal y 10 mg de plasmina/kg de peso corporal.
En el metodo de la presente invencion, la composicion fibrinolltica acidulada inactivada en forma reversible se administra intravascularmente o dentro del trombo. En una modalidad del metodo de la presente invencion, se administra la plasmina acidulada inactivada en forma reversible en un amortiguador con baja capacidad de amortiguar el pH directamente dentro, o en forma proxima a un trombo por medio de un dispositivo intravascular tipo cateter. En aun otra modalidad del metodo de la presente invencion, el cateter intravascular esta dirigido a una oclusion vascular.
Los ejemplos siguientes se presentan para describir las modalidades preferidas y los usos de la presente invencion, y no se deben interpretar como limitantes de la misma.
Se apreciara por parte de aquellos capacitados en el arte que las tecnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la practica de la invencion, y por lo tanto se puede considerar que constituyen formas preferidas para practicarlas.
Ejemplo 1: Fuentes de protefnas investiaadas
El plasminogeno se purifico a partir de una pasta de la Fraction II + III de Cohn por medio de cromatografla de afinidad sobre Sefarosa con Lys como lo describen Deutsch & Mertz (1970). Por lo tanto, se resuspendieron 200 g de la pasta en 2 litros de una solution 0,15 M de amortiguador de citrato de sodio, pH 7,8. Se incubo la suspension durante la noche a 37°C, se centrifugo a 14.000 rpm, se filtro a traves de fibra de vidrio y se mezclo con 500 ml de Sefarosa 4B con Lys (Pharmacia). El enlazamiento del plasminogeno se hizo a temperatura ambiente durante 2 horas. Se transfirio luego la columna de Sefarosa con Lys sobre un filtro de vidrio de 2 litros, y se lavo varias veces con citrato de sodio 0,15 M que contenla NaCl 0,3 M hasta que la absorbancia a 280 nm cayo por debajo de 0,05. Se eluyo el plasminogeno enlazado con tres porciones de 200 ml de acido e-aminocaproico 0,2 M. Se precipito el plasminogeno eluido con 0,4 g de sulfato de amonio solido/ml de solucion de plasminogeno. El precipitado de plasminogeno crudo (80-85% de pureza) se almaceno a 4°C.
Se purifico adicionalmente la uroquinasa de bajo peso molecular (uroquinasa LMW) (Abbokinase-Abbott Laboratories, Chicago III) por medio de cromatografla de afinidad sobre Sefarosa con benzamidina. La uroquinasa se acoplo luego a la Sefarosa 4B activada con CNBr por medio de la mezcla de 1,3 mg de uroquinasa LMW en amortiguador de acetato 50 mM, pH 4,5, y diluyendo con 5 ml del amortiguador de acoplamiento, bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,0.
Esta solucion se combino inmediatamente con 5 ml de Sefarosa activada con CNBr previamente hinchada y lavada en HCl 0,1 M. El acoplamiento ocurrio durante 4 horas sobre hielo con agitation. El exceso del grupo activado con CNBr fue bloqueado con Tris 0,1 M, pH 8,0. Cada lote de Sefarosa con uroquinasa fue utilizado 5 veces v almacenado en glicerol al 50% en agua a 4°C entre los ciclos. El activador del plasminogeno tisular (ACTIVASE™) era de Genentech. El fibrinogeno libre de plasminogeno y la a-trombina (3793 U/ml) eran de Enzyme Research, Inc. La a2-antiplasmina se obtuvo de Athens Research Technologies. La plasmina comercialmente disponible era de Haemotologic Technologies, Inc. El sustrato S2251 de plasmina cromogenica era de Chromogenix. El fibrinogeno humano marcado con 125I (150-250 pCi/mg) era de Amersham Pharmacia Biotech. La electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS se realizo sobre un aparato Phast System de Pharmacia utilizando geles con un gradiente elaborado previamente de 8-25% y tiras de amortiguador con SDS.
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Ejemplo 2: Purificacion de plasmina activa
(i) Activacion del plasminogeno hasta plasmina utilizando Sefarosa con uroquinasa
El plasminogeno se escindio hasta plasmina produciendo plasmina sin contamination de la preparation final por medio del uso de un activador inmovilizado del plasminogeno. La uroquinasa escinde directamente al plasminogeno. La activacion del plasminogeno por la uroquinasa no depende de la presencia de fibrina como en el caso del tPA, y la uroquinasa es una protelna humana. Estos factores, y su costo relativamente bajo, hacen de la uroquinasa el activador preferido, aunque esto no impide el uso del tPA, la estreptoquinasa o cualquier otro medio de escision que produce una plasmina activa capaz de degradar fibrina. El precipitado de sulfato de amonio de plasminogeno crudo fue centrifugado a 14.000 rpm y resuspendido en un volumen mlnimo utilizando Tris 40 mM, que contenla lisina 10 mM, NaCl 80 mM a pH 9,0 para lograr la concentration de final de protelna de 10-15 mg/ml. Se dializo la solution de plasminogeno durante la noche contra el mismo amortiguador para remover el sulfato de amonio. La solucion dializada de plasminogeno (10-20 ml) fue diluida con un volumen igual del glicerol al 100% y combinada con 5 ml de Sefarosa con uroquinasa. El uso de glicerol al 50% reduce la autodegradacion de la plasmina formada durante la activacion. La plasmina es estable en glicerol al 50% y se puede almacenar en esta solucion a -20°C durante un largo perlodo de tiempo.
La activacion del plasminogeno ocurre a temperatura ambiente entre 2 y 24 horas dependiendo de la frescura de la Sefarosa con uroquinasa. Con un lote fresco de Sefarosa con uroquinasa, la activacion se podrla completar en 2 horas. Sin embargo, se deteriora y se hace menos eficiente despues de varios ciclos, necesitandose del uso de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras para monitorear el progreso de la activacion del plasminogeno. Despues de completarse la activacion, se filtro la solucion de plasmina de la Sefarosa con uroquinasa con un filtro de vidrio, y se aplico directamente a la Sefarosa con benzamidina.
(ii) Captura de la plasmina sobre Sefarosa con benzamidina
Ya que la plasmina es una serina proteasa con especificidad como de tripsina, la Sefarosa con benzamidina es un absorbente de afinidad que permite la captura de la plasmina activa. Se aplico una solucion de plasminogeno en glicerol al 50% en la columna de Sefarosa con benzamidina de 50 ml equilibrada con Tris 0,05 M, pH 8,0, que contenla NaCl 0,5 M con una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se corrio la columna a razon de 3 ml/min a 3-7°C. La portion frontal del pico no enlazado contenla impurezas de alto peso molecular. El resto del pico no enlazado esta representado por el plasminogeno residual no activado y por los productos inactivos de autodegradacion de plasmina.
(iii) Elucion de la plasmina enlazada con amortiguador de bajo pH
Para proteger a la plasmina de la inactivation en condiciones de pH neutro, se seleccionaron condiciones acidas de elucion. Se eluyo la plasmina enlazada a Sefarosa con benzamidina con amortiguador de glicina 0,2 M, pH 3,0 que contenla NaCl 0,5 M. El pico enlazado fue dividido tlpicamente en tres porciones, dos picos frontales, B1 y B2, y el grueso del material eluido como B3.
Los analisis sobre gel no reductor mostraron que las tres porciones contenlan plasmina de alta pureza (>95%). El analisis del gel, sin embargo, junto con las cadenas pesada y liviana de la plasmina, revelo algunas bandas de bajo peso molecular en un rango de 10-15 kDa como resultado de la degradation parcial por escision interna de la plasmina.
La porcion frontal del pico B1 contenla tlpicamente la mayor parte de las impurezas de bajo peso molecular. Las porciones B2 y B3 se degradaron menos. La porcion frontal del pico enlazado tenia muy poco de la actividad de la plasmina y fue usualmente descartada. La perdida de actividad en este material puede ser debida a autodegradacion durante la cromatografia, debido a que no existe glicerol presente en el material eluido, y el pH de la porcion frontal es intermedia entre el pH de los amortiguadores de equilibrio y de elucion, tlpicamente en un rango de pH 6-6,5. La plasmina eluida, sustancialmente libre de activadores de plasminogeno, fue recolectada en tubos que contenian amortiguador de glicina 2 M, pH 3,0 (10% del volumen recolectado).
(iv) Formulation del material eluido en agua acidulada (pH 3,7)
La plasmina eluida fue dializada contra agua que habia sido acidulada hasta aproximadamente pH 3,7 con acido acetico glacial, o contra agua que contenia NaCl 0,15 M tambien acidulada aproximadamente hasta pH 3,7 con acido acetico glacial.
Cualquier acido que provea un excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable que tenga un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion y que tenga un pH aproximadamente entre 2,5 y aproximadamente 4,0 puede ser utilizado. Por ejemplo, tambien esta contemplado dentro del alcance de esta invention el uso de otros acidos y aminoacidos tales como, pero sin limitarse a, acidos inorganicos, acidos carboxilicos, acidos alifaticos y aminoacidos
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incluyendo, pero sin limitarse a, acido formico, acido acetico, acido citrico, acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido benzoico, serina, treonina, valina, glicina, glutamina, isoleucina, b-alanina y derivados de los mismos, ya sea solos o cualquier combinacion de los mismos, que mantendran el pH en el excipiente farmaceuticamente aceptable aproximadamente entre 2,5 y aproximadamente 4,0.
La plasmina es extremadamente estable en agua acidulada y puede ser efectivamente utilizada en esta forma para estudios in vivo e in vitro. La actividad especlfica de la plasmina fue medida utilizando un ensayo caseinolltico adaptado como lo describen Robbins & Summaria (1970). Se anadieron un ml de solucion de caselna al 4% en agua acidulada y un volumen apropiado de amortiguador fosfato de sodio 67 mM, pH 7,4 a un tubo de ensayo de policarbonato. Se agitaron las soluciones en un vortice y se incubaron a 37°C durante 10 minutos. Se anadieron las muestras de plasmina o de amortiguador (blanco) a cada tubo en intervalos de 15 segundos, se mezclaron bien y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Se detuvo la reaccion con la adicion de 3 ml de acido tricloroacetico al 15% y se permitio la formacion del precipitado durante 15 minutos. Se centrifugaron los tubos a 3200 rpm durante 20 minutos. Se trasfirieron los sobrenadantes a cubetas y se determino la A280 de cada muestra. Se determino la actividad caseinolltica especlfica de cada muestra por medio de la siguiente formula:
3,27 x [A2jo (Muestra de Plasmina) - A2*o (Blanco)]
______________________________________________ = unidades caseinolfticas
ug de Plasmina en el Ensayo (CU/mg de proteina)
La concentration de plasmina se determino espectrofotometricamente utilizando el coeficiente de extincion de 1,7 para una solucion al 0,1%.
Ejemplo 3: Estabilidad de la plasmina dependiente del pH
La plasmina exhibe una dependencia del pH en forma de campana de su actividad catalltica. Como se observa en la Figura 1, la plasmina tiene una actividad enzimatica maxima a un pH entre 7,5-8,0, y su actividad decirse rapidamente ya sea con valores de pH mas alcalinos o mas acidos. La plasmina es mas inactiva, y tambien reversible, por debajo de pH 4,0, debido a la protonacion de la histidina en el centro catalltico, como lo muestran Robbins & Summaria, (1976) y Castellino & Powell (1981).
La plasmina es muy inestable a un pH fisiologico. Tanto la cadena pesada como las cadenas livianas de plasmina se degradan dramaticamente en horas a temperatura ambiente y a 4°C. La plasmina fue formulada a 1 mg/ml en fosfato de sodio 0,04 M, pH 7,4, e incubada a 22°C o a 4°C durante 6 horas. Durante la incubation, se analizo la integridad de la plasmina cada dos horas por medio de analisis SDS-PAGE en condiciones de reduction. Tanto la cadena pesada como la cadena liviana se degradaron rapidamente en horas a 22°C y a 4°C como se observa en la Tabla 1.
Tabla 1. La rapida degradation de la plasmina en solucion de pH neutro a 22°C y a 4°C
% de cadena pesada intacta % de cadena liviana intacta
Plasmina
Amortiguador PH Temp. Inicial 2 h 4 h 6 h Inicial 2 h 4 h 6 h
1 mg/ml
P04 0,04 M 7,4 22°C 100% 27% 27% 29% 100% 29% 26% 28%
1 mg/ml
P04 0,04 M 7,4 4°C 100% 32% 27% 25% 100% 33% 25% 22%
(La cadena pesada y la cadena liviana intactas de plasmina fueron normalizadas en un punto inicial de tiempo como 100%)
La plasmina en una concentracion de 1 mg/ml fue incubada a 37°C durante 14 dlas bajo diferentes condiciones acidas. Los cambios en la cadena pesada y en la cadena liviana de plasmina fueron analizados por medio de SDS-PAGE en condiciones de reduccion. La plasmina fue formulada en una concentracion de 1 mg/ml en fosfato de sodio 0,04 M, pH 7,4 y fue tambien incubada a 4°C durante seis horas. Durante la incubacion, se midio la actividad de la muestra de plasmina cada dos horas por medio del ensayo cromogenico de potencia. Se midio cuantitativamente la potencia de la plasmina utilizando el analizador MLA 1600C (Pleasantville, NY). La plasmina hidrolizo al sustrato cromogenico S-2403 (clorhidrato de D-piroglutamil-L-Fenilalanil-L-Lisina-p-Nitroanilina, o abreviado como pyro-Glu-Phe-Lys-pNA) para formar al peptido y al grupo cromoforico p-nitroanilina (pNA). Se midio la velocidad de formacion del color cineticamente a 405 nm. La cantidad de sustrato hidrolizado era proporcional a la actividad de la plasmina en la muestra. Se genero una curva estandar de la regresion lineal de la velocidad de formacion del color (OD/min) versus la potencia de un estandar de plasmido. La ecuacion lineal junto con la velocidad observada para una muestra desconocida fue utilizada para calcular la potencia de las desconocidas. La potencia de la plasmina fue reportada en unidades de mg/ml.
La integridad de la plasmina disminuyo significativamente por incubacion a un pH fisiologico, como se observa en la Tabla 2.
Tabla 2. La disminucion rapida de la actividad de la plasmina en una solucion de pH neutro a 4°C
Potencia Cromogenica
Plasmina
Amortiguador pH Inicial 2 h 4 h 6 h
1 mg/ml
P04, 0,04 M 7,4 100% 43,3% 32,6% 26,4%
(* La actividad de la solucidn de plasmina se normalizo en un punto inicial de tiempo como 100%)
En esta solucion de pH neutro, la actividad de la plasmina disminuyo mas del 70% despues de 6 horas a 4°C.
10 La plasmina formulada en agua acidulada a pH 3,7 es estable. Puede ser mantenida en esta forma durante meses a temperaturas reducidas sin ninguna perdida de actividad o la aparicion de productos de degradation de naturaleza proteolltica o acida. La Figura 2 y los datos de la Tabla 3 muestran la estabilidad de la plasmina a 4°C y a temperatura ambiente.
Tabla 3. Estabilidad de 1 mg/ml de plasmina en las siguientes condiciones acidas a 37°C
Formulacidn
Plasmina (mg/ml) Condicidn Acida pH % de cadena pesada intacta despues de 14 dias a 37°C % de cadena liviana intacta despuds de 14 dias a 37°C
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HAC/NaAc 5 mM 2,5 19% 62%
2
1 HAC/NaAc 5 mM 3,0 41% 92%
3
1 HAC/NaAc 5 mM 3,4 48% 92%
4
1 HAC/NaAc 5 mM 3,4 49% 96%
5
1 HAC/NaAc 5 mM 3,4 50% 96%
6
1 HAC/NaAc 5 mM 3,7 13% 123%
7
1 HACYNaAc 5 mM 4,0 9,3% 107%
8
1 Acido citrico/ Citrate de Na 5 mM 2,27 9,3% 64%
9
1 Acido citrico/ Citrato deNa 5 mM 3,1 33% 68%
10
1 Acido citrico/ Citrato de Na 5 mM 3,56 46% 88%
11
1 Acido citrico/ Citrato de Na 5 mM 4,0 7,4% 104%
12
I Glicina 5 mM 2,2 7,3% 104%
13
1 Glicina 5 mM 3,1 36% 70%
14
1 Glicina 5 mM 3,5 49% 85%
15
1 Glicina 5 mM 3,8 12% 85%
16
1 Glicina 5 mM 4,1 6% 81%
17
1 Serina 5 mM 3,4 56% 100%
18
1 Treonina 5 mM 3,4 54% 100%
19
1 Valina 5 mM 3,4 52% 96%
20
1 Isoleucina 5 mM 3,4 51% 100%
21
1 P-alanina 5 mM 3,7 33% 90%
22
1 Acido benzoico 2 mM 3,5 42% 93%
23
1 Acido lactico 2 mM 3,5 45% 91%
24
1 Acido m^Iico 2 mM 3,5 50% 90%
25
1 Acido tartdrico 2 mM 3,5 28% 87%
(La cadena pesada y la cadena liviana intactas en cada formulacidn antes de incubacibn se normalizaron como 100%; HAc/NaAc = dcido acetico/acetato de sodio)
5 A 4°C, la plasmina es estable al menos durante 9 meses. Aun a temperatura ambiente, la plasmina acidulada inactivada en forma reversible es estable al menos durante dos meses. La estabilidad a largo plazo a temperatura ambiente es importante ya que harla a esta formulacion compatible con reglmenes largos de administracion trombolltica. Por ejemplo, la administracion durante 36 horas de trombollticos tales como el activador del plasminogeno tisular o la uroquinasa es comun en el tratamiento de oclusiones arteriales perifericas. En la Figura 3 10 se muestra una grafica d pH versus el porcentaje de cadena pesada con relacion a la protelna total en cada senda de los geles SDS. Los resultados demuestran una optima estabilidad de pH de aproximadamente 3,1-3,5, con independencia del tipo amortiguador, o de la concentracion del amortiguador.
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La habilidad de la plasmina acidulada inactivada en forma reversible para convertirse en completamente activa por transferencia a un pH fisiologico se evidencia por su actividad en el ensayo caseinolltico y tambien en los ensayos de trombolisis de fibrina marcada con 125I. Ambos ensayos se realizaron a pH 7,4, y hubo una completa recuperacion de la actividad de la plasmina durante el cambio de pH y pasando a traves del punto isoelectrico (pH 5-5,5). La plasmina se formula en un solvente con baja capacidad de amortiguacion y, cuando se la anade a una solucion amortiguada tal como plasma, rapidamente adopta el pH neutro o fisiologico en forma instantanea y la precipitacion que usualmente acompana al paso lento a traves del punto isoelectrico, no se presenta.
Ejemplo 4: La plasmina tiene la misma potencia fibrinolitica intrinseca que una mezcla de plasminoaeno/activador del plasminogeno
La plasmina tiene la misma potencia fibrinolitica intrinseca que una mezcla de plasminogeno/activador del plasminogeno. La potencia fibrinolitica de la plasmina se comparo con aquella de una mezcla de Lys-plasminogeno y tPA. Estos experimentos se realizaron en un sistema definido que consiste de un trombo de fibrina marcado en forma radiactiva con 125I sumergido en PBS.
La Figura 4 muestra que, en un ambiente amortiguado, la trombosis lograda con la plasmina es casi identica a la de la mezcla Lys-plasminogeno mas tPA (curvas a y b, respectivamente). Al mismo tiempo, no se observo trombolisis solamente con tPA (curva c) o en ausencia de cualquiera de las proteinas (curva d). Los datos obtenidos unicamente con tPA muestran que su actividad depende de su sustrato, del plasminogeno, para ser un trombolitico efectivo.
Estos datos indican que, en ausencia de inhibidores y de otros factores de la proteina presente en el plasma, no existe diferencia en la habilidad para lisar los trombos de fibrina entre la plasmina purificada y la combinacion de tPA y Lys-plasminogeno activado con tPA. Con el proposito de evaluar la potencia trombolitica de la plasmina activa, se llevo a cabo el ensayo de trombolisis de fibrina marcada con 125I con trombos de plasma en un ambiente de plasma.
Ejemplo 5: Papel de los inhibidores de plasmina en la reaulacion de la actividad de la plasmina
Ensayo de trombolisis de fibrina marcada con 125I. Las propiedades fibrinoliticas de la plasmina se determinaron en un sistema in vitro que consiste de un trombo del plasma marcado en forma radiactiva sumergido en plasma humano tratado con citrato como lo describen Lijnen y colaboradores (1986). El plasma utilizado en todos experimentos fue un plasma donante sencillo descongelado a 37°C, dividido en alicuotas, y vuelto a congelar y a almacenar a -80°C. La solucion patron de fibrinogeno marcada con 125I se preparo rehidratando los contenidos del vial (aproximadamente 110 pCi/vial) con 1,0 ml de citrato de sodio 0,15 M y se almaceno a 4°C.
Se anadieron 10 pl de fibrinogeno marcado con 125I a un tubo de ensayo de policarbonato que contenia 250 pl de plasma a 37°C y se mezclo brevemente. Se anadieron al plasma 25 pl de a-trombina, diluida con CaCl2 0,1 M hasta una concentracion final de 10-20 pM. A los trombos marcados en forma radiactiva se les permitio envejecer durante cinco minutos a 37°C y luego se los lavo con PBS. Se transfirieron los trombos a tubos de ensayo que contenian 2, 25 ml de plasma o de amortiguador, un trombo por tubo.
Se midio una muestra con reactividad de linea base para cada trombo. Se anadio plasmina a cada tubo despues de la adicion de cada trombo. Se retornaron los trombos a 37°C durante el transcurso de todo el experimento. Se tomaron muestras adicionales en momentos especificos para medir la radioactividad liberada. Se calculo el grado de trombolisis a partir de la relacion entre la cantidad de radioactividad liberada por el trombo dentro del plasma y la cantidad total de radioactividad soluble en el tubo de reaccion. Se grafico la liberacion de los productos marcados de degradation de la fibrina, expresada en porcentaje, versus el tiempo.
Ademas del medio ambiente el plasma, algunos experimentos de trombolisis se llevaron a cabo en el ambiente de un amortiguador o con plasma que carecia de actividad de a2-antiplasmina o de a2-macroglobulina. El plasma sin a2-antiplasmina se obtuvo pasando el plasma normal a traves de una columna de Sefarosa Kringles 1-3 como lo describe Wiman (1980). El plasma inactivado con a2-macroglobulina se obtuvo por medio de tratamiento del plasma normal con metilamina 0,1 M Barrett y colaboradores (1979) durante 2 horas a 37°C con dialisis posterior contra PBS a 4°C.
Utilizando el ensayo de trombolisis anteriormente descrito, se observo que la plasmina era capaz de disolver a los trombos del plasma en una forma dependiente de la dosis como se observa en las Figuras 5 y 6. Se anadieron cantidades crecientes de plasmina a los trombos del plasma con fibrina marcada con 125I y el grado de trombolisis se evaluo por medio de la medicion de la liberacion de radiactividad: (a) 0,15 mg/ml de plasmina en el tubo de reaccion, (b) 0,30 mg/ml; (c) 0,45 mg/ml; (d) 0,60 mg/ml; (e) control sin adicion de plasmina. Los datos de la Figura 6 de muestran que la plasmina es activa tambien en un ambiente de plasma y es capaz de disolver trombos en plasma. Este fenomeno depende de la dosis. Al mismo tiempo, a diferencia de la mezcla con Lys-plasminogeno y tPA, la trombolisis por medio de la plasmina sola no progresa hasta la termination en una ambiente de plasma; la trombolisis tiende a cesar despues de 2 horas. Mientras que no se desea estar limitado por ninguna teoria, este
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fenomeno se puede explicar por medio de la presencia de diferentes inhibidores de proteasa en un ambiente de plasma y, especialmente por medio de la inhibicion rapida de plasmina no enlazada al trombo por medio de la a2-antiplasmina.
Para evaluar el papel de los inhibidores de plasma en la lisis de trombos catalizada por plasmina, se llevaron a cabo una serie de experimentos de trombolisis con plasma normal y con muestras de plasma que carecen de a2-antiplasmina, de a2-macroglobulina o de todos los inhibidores, o de PBS.
Como se observa en la Figura 6, se mejoro la fibrinolisis inducida por plasmina por medio de la supresion o bien de la de a2-antiplasmina o de la a2-macroglobulina en el plasma que rodea a los trombos, y aun mas por la supresion de todos los inhibidores. Estos resultados confirman que la trombolisis por plasmina esta bajo control fisiologico muy estricto por medio de los inhibidores endogenos de plasmina en plasma, proveyendo as! una base para una terapia trombolltica mas segura.
En contraste con la trombolisis inducida por el activador del plasminogeno, la trombolisis con plasmina se puede controlar por medio de estos inhibidores. La trombolisis inducida por el activador de plasminogeno utiliza la fuente interna de plasminogeno presente en plasma a que, desde el punto de vista practico, es ilimitado en un organismo humano. Por otro lado, la trombolisis inducida por plasmina depende completamente de la fuente externa de plasmina. La cesacion en la administracion de plasmina al paciente de resultar en una interrupcion rapida de la trombolisis y provee una base para terapia trombolltica mas segura.
Ejemplo 6: Comparacion de la plasmina acidulada inactivada en forma reversible y tPA en un modelo in vitro de Oclusion Arterial Periferica (PAO)
Los coagulos encogidos y envejecidos son deficientes en plasminogeno, el sustrato requerido por todos los activadores del plasminogeno para una lisis efectiva del coagulo. Robbie y colaboradores, Thrombosis and Haemostasis, 1996, 75 (1), 127-33. Los coagulos envejecidos son significativamente menos susceptibles a la lisis por medio de los activadores del plasminogeno.
Los coagulos envejecidos difieren de los coagulos que causan infarto de miocardio o ataque fulminante tanto mecanicamente como en su composicion de protelnas. Ellos se encuentran tlpicamente en las arterias perifericas y pueden crecer hasta un tamano significativo. El tamano promedio del coagulo periferico encontrado en las arterias activas es de 14,8 ± 11 cm como se describe en Ouriel y colaboradores. Los trombollticos actuales representados exclusivamente por los activadores del plasminogeno son casi inefectivos en la lisis de estos tipos de coagulos. Tlpicamente, un paciente con PAO es tratado por mas de 24 horas con uroquinasa y aun despues de este tiempo tan prolongado, no se logra la completa permeabilidad del vaso. La situation se puede exacerbar cuando se suministran los trombollticos a traves de un cateter en el interior del coagulo, evitando ademas el acceso del sustrato de plasminogeno requerido por su eficacia.
Otra aproximacion a la lisis de los coagulos encogidos es el suministro directo de plasmina activa a traves de un cateter, en el interior del coagulo. El suministro de plasmina acidulada inactivada en forma reversible directamente dentro de los coagulos encogidos estrecha la deficiencia inherente del plasminogeno de aquellos coagulos y provee una trombolisis predecible del coagulo, rapida y efectiva independientemente del contenido del plasminogeno. Ademas, la presencia abundante del inhibidor natural de plasmina, a2-antiplasmina, en plasma sirve para inactivar instantaneamente cualquier plasmina que se escape de la vecindad del coagulo, evitando as! la fibrinolisis distal y los consecuentes episodios de sagrado.
Para comparar la eficacia de la plasmina y del tPA en la lisis de coagulos largos encogidos, hemos desarrollado un modelo in vitro que imita los parametros de los coagulos formados en pacientes con PAO.
Modelo PAO In Vitro. Se recolecto sangre humana fresca entera en tubos de vidrio de 30 x 0, 95 cm y se le permitio coagular espontaneamente sin aditivos. Se incubaron los tubos durante 20 horas a 37°C para permitir un encogimiento completo. Los coagulos encogidos se separaron del suero utilizando tamices para analisis USA Standard D16 con malla 14 y se determinaron sus pesos. Se transfirieron los coagulos de sangre a tubos de vidrio de diametro mas pequeno que se pareclan a los coagulos de tamano promedio en las arterias de la pierna (0, 6 x 12 cm). Se inserto un cateter "pulse-spray" de puerto en multiples costados (tamano frances con la punta rociadora de 11 cm, Cook, Inc.) dentro del coagulo y se suministro una composicion trombolltica de plasmina acidulada activada en forma reversible de acuerdo con la presente invention, (o tPA) con una concentration de 1 mg/ml en incrementos de 1 ml separados con intervalos de 1 hora. El numero de inyecciones corresponde a la dosis del trombolltico. Se midio el grado de lisis del coagulo por medio del peso de un coagulo residual y se lo expreso como un porcentaje de la reduction del peso del coagulo. Este modelo es llamado un modelo PAO. Imita las dimensiones de los trombos encontrados en los pacientes con PAO, aunque se utilizo sangre venosa para la formation del coagulo. Tanto tPA como la composicion de plasmina acidulada inactivada en forma reversible de acuerdo con la presente invencion fueron analizados en este modelo y los resultados son presentados mas adelante.
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La plasmina es tan efectiva como el tPA para la lisis de los coagulos frescos, a diferencia de cuando tPA y la plasmina son utilizados para la lisis de coagulos encogidos envejecidos durante 20 horas para permitir el entrecruzamiento completo por medio del Factor XIII. El tPA es incapaz de lisar tales coagulos. La reduccion en el peso del coagulo obtenida con coagulos tratados con tPA es similar a la del control, aun cuando la dosis es aumentada hasta 5 mg por coagulo.
Por otro lado, la plasmina es efectiva con los coagulos completamente encogidos y entrecruzados. Existe una dependencia con la dosis del efecto lltico de la plasmina y despues de cinco inyecciones (o 5 mg de plasmina en total) los coagulos estan casi completamente lisados. En una serie similar de experimentos, se observo la misma inhabilidad para disolver los trombos humanos encogidos y entrecruzados con uroquinasa. La plasmina suministrada localmente es por lo tanto un agente trombolltico mas efectivo que tPA y que otros activadores del plasminogeno.
Estos datos in vitro muestran que tPA requiere de la presencia de su sustrato, plasminogeno, en el coagulo para iniciar y mantener la lisis del mismo. Por lo tanto, mientras que la plasmina es tan efectiva como el tPA para lisar coagulos frescos o ricos en plasminogeno, la plasmina es mas efectiva que el tPA, y que otros activadores del plasminogeno, para lisar los coagulos largos encogidos pobres en plasminogeno. Ademas, los datos presentados en este ejemplo demuestran que la plasmina es efectiva en su forma acidulada inactivada en forma reversible cuando es inyectada directamente dentro del coagulo.
Los coagulos en los tubos de vidrio son tambien un modelo en donde se forma un trombo o tapon de fibrina en los cateteres colocados en un humano o en un animal y se ocluye el cateter.
Ejemplo 7: Modelo de trombosis en la vena yugular de coneio
Se determino la eficacia y seguridad in vivo de la plasmina activa administrada localmente por medio de un modelo de trombosis en la vena yugular de conejo de Collen y colaboradores (1983). El modelo, en resumen era el siguiente: Los conejos (2-3 kg) son sedados con ketamina/xilazina y se les coloco un cateter venoso 22G en la vena de la oreja para la administration de una solution diluida de pentobarbital (5-10 mg/kg/h). Se les rasuro el cuello y se les coloco un cateter arterial en la arteria carotida para mediciones de la presion y el muestreo de sangre. Se les realizo una traqueotomla para colocarles un tubo traqueal para facilitar la respiration. Se aislo cuidadosamente la vena yugular practicando una diseccion sin filo e incluyendo la vena facial. Se coloco un cateter 24G en la vena facial y se aseguro la vena yugular tanto en forma distal como proximal a la vena facial aislada. El segmento aislado de la vena fue lavado varias veces con solucion salina y se le dreno completamente la sangre. El segmento aislado fue lavado varias veces con una solucion de trombina (500 U/ml). Despues del ultimo lavado, se retiraron 0,5 ml de muestra de sangre arterial del cateter arterial y se nos mezclo rapidamente con 50 ml de fibrinogeno marcado con 125I (aproximadamente 1 pCi) . Se hizo rapidamente infusion de la mezcla dentro del segmento aislado de la vena a traves de la vena facial hasta que se distendio completamente el segmento de vena. Se mezclo el trombo masajeando la vena con pinzas y se coloco una pieza de Envoltura Saran sobre la vena yugular expuesta para evitar que se secara. Se administro heparina (100 IU/kg) para evitar la deposition de fibrinogeno frlo sobre el trombo. Se le permitio al trombo envejecer durante 30 minutos y se removieron los sujetadores.
Se monitoreo la estabilidad del trombo durante un periodo de equilibrio de 30 minutos. Se monitoreo la disolucion del trombo marcado (% de lisis) continuamente con una sonda contador gama G1LE colocada directamente sobre el trombo.
Ejemplo 8: Restauracion del fluio venoso
Para proveer una lectura fisiologica de la disolucion del trombo, se utilizo la restauracion del flujo sangulneo como otro indicador de trombolisis en una serie separada de experimentos. En esos experimentos, se coloco una sonda de flujo de tamano apropiado en forma distal al trombo oclusivo (no marcado en forma radiactiva), conectada a un Flujometro Transonico y se tomaron cada minuto las mediciones de flujo de sangre venosa.
La llnea a base del flujo sangulneo antes de la formation del trombo era de 12-18 ml/min y los datos se representan como el % de llnea base. El porcentaje de restauracion de flujo de sangre venosa y el consumo de Factor VIII y de fibrinogeno se observan a los 60 minutos en la Figura 7, y a los 90 minutos en la Figura 8. Con dosis de 0, 5 mg/kg y 1,0 mg/kg, tPA indujo una restauracion de llnea base de 16 ± 4% y de 21 ± 10% del flujo sangulneo a los 60 minutos, respectivamente. La plasmina en una concentration de 1,0 mg/kg y 2,0 mg/kg indujo una restauracion de llnea base de 20 ± 1% y de 33 ± 1% del flujo sangulneo, respectivamente. A los 90 minutos, la infusion de tPA resulto en una restauracion del flujo sangulneo de 18 ± 3% y de 26 ± 11%, respectivamente y la plasmina habla resultado en una restauracion del flujo de 25 ± 5% y de 34 ± 6%, respectivamente.
Ejemplo 9: Tiempos de sangrado de la cuticula (CBT)
Los tiempos de sangrado de la cuticula a los 60 minutos son mostrados en la Figura 9. El tratamiento con solucion salina resulta en tiempos de sangrado de 13 ± 1% minuto. El tPA en dosis de 0,5 mg/kg y de 1,0 mg/kg resulto en tiempos de sangrado de 13 ± 2 minutos y de 25 ± 4 minutos, respectivamente, mientras que la plasmina, en dosis de
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1,0 mg/kg y de 2,0 mg/kg resulto en tiempos de sangrado de 17 ± 3 y de 19 ± 1 minutos, respectivamente. El tPA muestra un CBT prolongado comparado con cuando se utiliza la plasmina acidulada inactivada en forma reversible, demostrando que la fibrinolisis sistemica por la activacion del tPA del plasminogeno endogeno es mas extensa que si se administra plasmina y se inhibe rapidamente por factores del suero.
Ejemplo 10: Modelo de hemorragia fibrinolitica de coneio
La mayor seguridad de la plasmina, con relacion al activador del plasminogeno tPA, se demostro en un modelo establecido de conejo de sangrado fibrinolltico que representa una indicacion valida de hemorragia fibrinolitica, como lo describen Marder y colaboradores, (1992).
Las dosis trobollticamente equivalentes (volumenes de 10 ml) de plasmina y de tPA se compararon en un modelo de puncion en la oreja por sus efectos relativos sobre la ocurrencia y duracion de un nuevo sangrado, y sobre parametros seleccionados de coagulacion en plasma y fibrinollticos. Se hizo infusion de dos dosis diferentes de plasmina (2,0 o 4,0 mg/kg) o de tPA (1,0 o 2,0 mg/kg) durante perlodos de 60 minutos en conejos a traves de un cateter insertado dentro de la vena yugular externa. Las punciones en la oreja (aproximadamente seis por oreja) con una cuchilla de escalpelo antes, durante y despues de la infusion de cada agente fibrinolltico, fueron observadas tanto por el tiempo de sangrado como por el nuevo sangrado. Los tiempos del sangrado primario fueron realizados 30 minutos antes, 10 minutos antes, 0, 10, 30, 60, 70, 90, 120 y 180 minutos con relacion al inicio de cada infusion. Las muestras de sangre tratadas con citrato (5 ml) fueron obtenidas antes, durante, y hasta dos horas despues de infusion de cada agente fibrinolltico; estas muestra de sangre fueron analizadas por fibrinogeno, Factor VIII, y a2-antiplasmina. Cada grupo experimental consistio de cinco conejos.
Los tiempos de sangrado primario tienden a ser mas largos para los grupos con tPA en cada momento despues de la iniciacion de la infusion hasta el punto de 90 minutos (Tabla 4).
Tabla 4. Tiempos de sangrado primario
Grupo Experimental
Tiempo Medio de Sangrado por Grupo (Minutos) a Diferentes Tiempos (Minutos) con Relacidn al Inicio de la Infusidn
-30 -10 0 10 30 60 70 90 120 180
tPA (1,0 mg/kg)
2,2 1,7 1,4 3,3 2,8 2,5 1,6 1,6 1.2 2,4
tPA (2,0 mg/kg)
1,7 1,9 1,6 1,6 2,7* 3,9 3,0* 2,3 1,7 1,0
Plasmina (2,0 mg/kg)
1,6 1,7 1,8 2,0 1,9 2,5 1,8 2,2 2,0 1,7
Plasmina (4,0 mg/kg)
1,5 1,5 1,4 2,3 1,1* 2,8 1,4* 0,9 1,4 1,5
^Estadisticamente superior que los valores medios correspondientes observados con los grupos indicados de plasmina (p<0,05)
Este efecto fue estadisticamente significativo (p<0, 05) en la comparacion de los grupos de dosis alta de tPA y de plasmina al minuto 30 y al minuto 70 de los tiempos experimentales.
La Tabla 5 muestra la ocurrencia observada de nuevo sangrado en cada uno de los cuatro grupos experimentales. Tabla 5. Ocurrencia de Nuevo Sangrado en Cada Grupo Experimental
Grupo Experimental
Numero de Animales que Exhiben Nuevo Sangrado
tPA (1,0 mg/kg)
5 de 5
tPA (2,0 mg/kg)
4 de 5
Plasmina (2,0 mg/kg)
0 de 5
Plasmina (4,0 mg/kg)
0 de 5
Grupos combinados con tPA (n=10)
9 de 10
Plasmina combinada
0 de 10
Los resultados distinguen la actividad hemorragica del activador del plasminogeno, tPA, de aquella de la plasmina. Ninguno de los animales tratados con plasmina exhibio nuevo sangrado, a diferencia de los nueve de diez animales tratados con tPA.
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La Tabla 6A resume los tiempos medio de nuevo sangrado en los sitios activos y en todos los sitios de nuevo sangrado para el grupo con dosificacion de 1,0 mg/kg de tPA. La Tabla 6B resume los datos correspondientes para el grupo con dosificacion de 2,0 mg/kg.
Tabla 6A. Tiempos Medios de Nuevo Sangrado en Conejos que Recibieron tPA a Razon de 1, 0 mg/kg
Tiempo Kelativo para lnicio de la Infusion (Minutos)
-30 -10 0 10 30 60 70 90 120 180
Porcentaje de sitios que sangraron nuevamente
60 60 80 100 80 20 20 0 0 0
Tiempo medio de nuevo sangrado (minutos) de sitios activos
2,0 4,0 31,3 20,7 9,0 1,5 1,0
Tiempo medio de nuevo sangrado (minutos) de todos los sitios
1,2 2,4 25,0 20,7 7,2 0,3 0,2
Tabla 6B. Tiempos Medios de Nuevo Sangrado en Conejos que Recibieron tPA a Razon de 2, 0 mg/kg
Tiempo Relativo para Inicio de la Infusidn (Minutos)
-30 -10 0 10 30 60 70 90 120 180
Porcentaje de sitios que sangraron nuevamente
40 80 60 80 60 40 0 0 0 0
Tiempo medio de nuevo sangrado (minutos) de sitios activos
32 23 44,7 68,4 48,7 2,5
Tiempo medio de nuevo sangrado (minutos) de todos los sitios
12,8 18,4 26,8 54,7 7,2 29,2
El nuevo sangrado en los sitios activos mostro una distincion entre los dos grupos de dosis para tPA, con una duracion mayor de nuevo sangrado con las dosis de 2,0 mg/kg con relacion a la dosis de 1,0 mg/kg de tPA. Los resultados de las mediciones de qulmica sangulnea se resumen en las Tablas 7-9.
La Tabla 7 presenta los niveles de fibrinogeno medidas en los tiempos experimentales. Los niveles medios de fibrinogeno despues de la infusion de tPA cayeron mas rapidamente y hasta un punto mas bajo que despues de las infusiones de plasmina.
Tabla 7. Niveles Medios de Fibrinogeno (mg/dl) en Grupos Experimentales en Diferentes Tiempos (Minutos) con
Relacion al Inicio de la Infusion en el Minuto 60
Tiempo Relativo para Inicio de la Infusion (Minutos)
Grupo Experimental
-30 0 10 60 70 90 120 180
LPA (1,0 mg/kg)
221 205 202 93 145 126 194 205
tPA (2,0 mg/kg)
260 233 151 118 196 190 214 160
Plasmina (2,0 mg/kg)
208 231 214 149 167 134 183 145
Plasmina (4,0 mg/kg)
297 293 256 222 146 184 159 140
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Los valores medios para el Factor VIII (Tabla 8) fueron mayores a la mayorla de los tiempos experimentales para los animales que recibieron infusion de tPA con relacion a los animales que recibieron infusion de plasmina, con significancia estadlstica siendo alcanzada en el tiempo experimental al minuto 60 por cada grupo de tPA versus cada grupo de plasmina.
Tabla 8. Niveles Medios del Factor VIII (porcentaje inicial) en Grupos Experimentales en Diferentes Tiempos (Minutos) con Relacion al Inicio de la Infusion en el Minuto 60
Tiempo Relativo para Inicio de la Infusidn (Minutos)
Grupo Experimental
-30 0 10 60 70 90 120 180
tPA (1,0 mg/kg)
(100) 87 84 23* 58 77 57 64
tPA (2,0 mg/kg)
(100) 85 56 29* 41 36 46 44
Plasmina (2,0 mg/kg)
(100) 108 87 77 62 56 72 78
Plasmina (4,0 mg/kg)
(100) 85 65 58 58 61 47 50
‘Estadisticamente inferior que los valores medios correspondientes de cualquiera de los grupos de plasmina a los 60 minutos (p<0,05).
La recuperacion del Factor VIII en animales que recibieron tPA fue aproximadamente de la misma concentracion (50-60% de los valores iniciales) que con los animales que recibieron plasmina. La comparacion de las dos dosis de tPA mostro una disminucion mas rapida en el Factor VIII con la dosis mayor y un incremento que repercute mas dramaticamente en el Factor VIII con la dosis menor.
Los valores medios para la a2- antiplasmina que se muestran en la Tabla 9 fueron menores que la mayorla de los tiempos experimentales para los animales que recibieron la infusion de tPA con relacion a los animales que recibieron la infusion de plasmina.
Tabla 9. Niveles Medios de la a2- antitripsina (porcentaje inicial) en Grupos Experimentales en Diferentes Tiempos (Minutos) con Relacion al Inicio de la Infusion en el Minuto 60
Tiempo Relativo para Inicio de la Infusidn (Minutos)
Grupo Experimental
-30 0 10 60 70 90 120 180
tPA (1,0 mg/kg)
(100) 100 39* 4* 34 37 51 43
tPA (2,0 mg/kg)
(100) 81 12* 0* 9** 15** 15 27
Plasmina (2,0 mg/kg)
(100) 104 93 55 55 56 45 79
Plasmina (4,0 mg/kg)
(100) 102 89 45 20 49 24 24
*Estadisticamente inferior que los valores medios coirespondientes de cualquiera de los grupos de plasmina de estos tiempos experimentales (p<0,05),
** Estadisticamente inferior que los valores medios para los grupos de plasmina de dosis menor a estos tiempos experimentales (p<0,05).
La significancia estadlstica se alcanzo al minuto 10 y al minuto 60 de los tiempos experimentales entre cada uno de los grupos con tPA y cualquiera de los grupos con plasmina y al minuto 70 y al minuto 90 de los tiempos experimentales entre los grupos con dosis alta de tPA y los grupos correspondientes con baja dosis de plasmina.
Ejemplo 11: Fibrinolisis por medio de miniplasmina
La miniplasmina es una version truncada de la plasmina que carece del primero de cuatro dominios kringle. Puede ser producida a partir de miniplasminogeno que es generado por medio de proteolisis limitada del plasminogeno con elastasa. La miniplasmina sera mas efectiva para la lisis de un coagulo que la plasmina de tamano completo ya que: (a) la miniplasmina es mas pequena que la plasmina (38 kDa vs 84 kDa) y se difundira mas facilmente dentro del coagulo; y (b) la miniplasmina carece del sito de enlazamiento para la a2- antiplasmina del kringle 1, y por lo tanto sera resistente a la inhibicion por la a2- antiplasmina entrecruzada con el coagulo. La a2- antiplasmina es a menudo responsable por la resistencia de los coagulos envejecidos para la terapia trombolitica. Se purifico el miniplasminogeno como lo describen Sottrup-Jensen y colaboradores (1975). La conversion del miniplasminogeno
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en miniplasmina, su purificacion y formulacion se logro utilizando exactamente un protocolo como el descrito para la plasmina del Ejemplo 2.
La potencia trombolltica de la miniplasmina fue comparada con aquella de la plasmina en concentraciones equimolares utilizando el modelo PAO in vitro descrito en el Ejemplo 6. Los coagulos se envejecieron durante 20 horas y se suministraron dos dosis de plasmina de 1 ml (1 mg/ml) o de miniplasmina (0,45 mg/ml) al coagulo a traves de un cateter. Entre inyecciones, los coagulos fueron incubados a 37°C durante 1 hora. Se midio el grado de trombolisis por medio de la reduccion del peso del coagulo. Los coagulos que recibieron la infusion son solucion salina fueron utilizados como control. Dimensiones del coagulo -0,6 x 12 cm.
Como se muestra en la Figura 10, la miniplasmina causa una lisis mayor del coagulo que la plasmina cuando se la utiliza en las cantidades equimolares. La reduccion del peso del coagulo despues de dos inyecciones de 1 ml de miniplasmina con una concentracion de 0,45 mg/ml fue de 44,3 ± 4,4%, mientras que dos inyecciones de 1 ml de plasmina con una concentracion de 1 mg/ml resultaron en una reduccion en peso del coagulo de 36 ± 1,7%. La miniplasmina puede ser aun un agente trombolltico mas efectivo que la plasmina cuando se suministra a traves del cateter directamente a, o dentro del coagulo.
Ejemplo 12: Eficacia de la administracion localizada de plasmina a traves de un cateter
La eficacia de la plasmina in vivo (1-2 mg/kg) administrada localmente a traves de un cateter fue comparada con aquella del tPA (0,5 y 1,0 mg/kg) en el modelo de trombosis de la vena yugular de conejo. Se utilizaron dos aproximaciones para evaluar la trombosis: 1) mediciones en tiempo real del porcentaje de lisis con un trombo marcado en forma radioactiva; y 2) restauracion de la llnea base del flujo sangulneo a traves de la aplicacion de una sonda de flujo y de un medidor de flujo. Se monitoreo la velocidad de la trombolisis y se la cuantifico durante 90 minutos, como se describe en el Ejemplo 6. Concomitantemente, el consumo del Factor VIII y de fibrinogeno, as! como el tiempo de sangrado de la cutlcula (CBT) , fueron medidos como indicadores del estado sistemico lltico. Para estos estudios de administracion local, se introdujo un cateter (PE 50) a traves de la vena marginal de la oreja, hasta 1 cm dentro del trombo obstructor. Se utilizaron dos dosis de tPA: 0,5 y 1,0 mg/kg y dos dosis de plasmina: 1,0 mg/kg y 2,0 mg/kg. Estas dosis estaban contenidas en un volumen total de 10, 0 ml con los cuales se hizo una infusion durante 30 minutos. El porcentaje de lisis a los 60 y 90 minutos con el trombo marcado en forma radioactiva fue medido y, en otra serie separada de experimentos con trombos no marcados, el porcentaje de restauracion de flujo fue medido en momentos similares. Las muestras de sangre arterial (4 ml) obtenidas a los 0 minutos y a los 60 minutos fueron utilizadas para la determinacion de los niveles de fibrinogeno y del Factor VIII. Los niveles del Factor VIII y las concentraciones de fibrinogeno fueron determinados utilizando un Reloj para Medicion de la Coagulacion MLA Electra 800 y el Juego para Ensayo del Fibrinogeno. Los niveles de Factor VIII fueron determinados por medio del ensayo COATEST VIII C4 utilizando el Factor VII humano para generar una curva estandar. Los tiempos de sangrado de la cutlcula a los 0 minutos y a los 60 minutos fueron determinados pellizcando con una pinza la una del conejo, en el apice, con un cortaunas para perro. La sangre fue untada ligeramente, sin tocar la una, con un papel filtro cada dos minutos hasta que se formo un trombo y el papel filtro no absorbio mas sangre. Los resultados se presentan como la Media ± SEM, y para evaluar las diferencias significativas entre los grupos se utilizo un ANOVA de un solo sentido seguido por un procedimiento de Bonferroni para analisis por comparacion multiple. P<0,05 fue considerado significativo.
Se hizo infusion de plasmina o de tPA (volumen total 10 ml) durante 30 minutos a traves de un cateter colocado proximo 1 cm del trombo. Un volumen igual de solucion salina sirvio como control. Las dosis de plasmina de 1,0-2,0 mg/kg fueron comparadas con una dosis de 0,5 mg/kg de tPA. Se utilizo un ANOVA de un solo sentido seguido por el metodo de Dunn para un analisis de comparacion multiple para evaluacion estadlstica, (*p<0, 05 comparado con tPA con una concentracion de 0,5 mg/kg, o # vs tPA o una concentracion de 1, 0 mg/kg).
Cuando se compara con tPA (0,5-1,0 mg/kg), la infusion de plasmina (1,0-2,0 mg/kg) indujo localmente una trombolisis comparable o significativamente mejor, con un consumo similar o menor del Factor VIII y de fibrinogeno y CBT. La evaluacion de riesgo/beneficio del tratamiento con plasmina revelo que una dosis doble de plasmina (con base en el peso) indujo efectos similares de sangrado a los de tPA. Por lo tanto, se puede utilizar plasmina en forma efectiva y segura como agente trombolltico durante la trombolisis local asistida por cateter. La plasmina tiene una actividad lltica comparable o superior cuando se la compara con tPA, y el perfil de seguridad parece similar en este modelo animal para el suministro trombolltico local.
El grado de trombolisis se calculo a partir de la relacion entre la cantidad de radiactividad liberada por el trombo en el plasma y la cantidad total de radiactividad en el tubo de reaccion. La liberacion de los productos de degradation de la fibrina marcada, expresada en porcentaje, fue graficada versus tiempo.
El porcentaje de lisis de los trombos marcados en forma radioactiva y el consumo del Factor VIII y de fibrinogeno se muestran con perlodos de incubation de 60 minutos (Figura 11) y de 90 minutos (Figura 12). Con una concentracion de 0,5 mg/kg y de 1,0 mg/kg, tPA indujo 16 ± 2% y 21 ± 2% de lisis, respectivamente, la plasmina con una concentracion de 1,0 mg/kg y de 2,0 mg/kg indujo 26 ± 3% y 33 ± 4% de lisis, respectivamente. A los 90 minutos, la
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infusion de tPA habla resultado en 21 ± 2% y 26 ± 2% de lisis, respectivamente, comparado con la plasmina que indujo una lisis de 31 ± 4% y 36 ± 2%, respectivamente.
Ejemplo 13: Evaluacion del riesao/beneficio del tratamiento con plasmina vs el tratamiento con tPA
Se hizo una extensa evaluacion farmacologica comparativa (riesgo/beneficio) de la plasmina en el modelo de trombolisis en conejo. La eficacia de la plasmina fue comparada con aquella del tPA. Se utilizaron el porcentaje de lisis y de restauracion del flujo sangulneo como Indices de eficacia. Estos analisis se llevaron a cabo en experimentos separados. Los respectivos efectos secundarios inducidos por estos agentes trombollticos fueron comparados por medio de la medicion del consumo del Factor VIII y de fibrinogeno y evaluando los tiempos de sangrado. Esto permitio una determinacion de un perfil aproximado de riesgo/beneficio.
Para determinar el perfil de riesgo, se calculo la dosis de ED50 para tPA, utilizando el consumo del Factor VIII como marcador sustituto para la induction del estado lltico y del sangrado. El consumo del Factor VIII fue directamente relacionado con el efecto secundario del sangrado surtiendo de nuevo Factor VIII (Kogenatee) y retornando a la hemostasis normal. Se examinaron las dosis de tPA en el rango de 0,1 mg/kg hasta 3,0 mg/kg con un N de al menos 10 animales/dosis. 1,0 mg/kg es considerada una dosis cllnica para tPA. El ED50 calculado para tPA fue de 1,8 mg/kg. Un calculo similar para la administration local de plasmina produjo un ED50 de 3,6 mg/kg. Por lo tanto, una dosis doble de plasmina (con base en el peso) indujo efectos secundarios similares de sangrado que el tPA. Se evaluo la eficacia (% de lisis y de flujo sangulneo) con dosis de tPA y de plasmina con perfiles equivalentes de riesgo, esto es, consumo de protelnas de coagulation y sangrado, como se muestra en la Figura 13. Con todas las dosis equivalentes de riesgo analizadas, tPA (0,5 - 3,0 mg/kg) y plasmina (1,0 - 3,0 mg/kg) , la plasmina indujo tasas de lisis por lo menos similares o significativamente mejores y de restauracion del flujo sangulneo en comparacion con tPA. Los datos farmacologicos, por lo tanto, son suficientes para recomendar que la plasmina sea considerada para el tratamiento lltico de trombos accesibles por medio de la colocation de un cateter.
Ejemplo 14: Peptidos de la dearadacion de las muestras de plasmina caracterizados por la secuenciacion N-terminal
Los peptidos de la degradation de las muestras de plasmina se caracterizaron por medio de la secuenciacion N-terminal de la siguiente manera. Se formularon composiciones de plasmina con valores de pH bajos: un pH menor a 2,5 y un pH de 3,5 y de 3,8 que contenla acido acetico 2 mM. Las muestras de plasmina se analizaron utilizando SDS-PAGE con geles Bis-Tris NuPage al 4-12%, como se observa en la Figura14. Se transfirieron las bandas de protelna a una membrana de PVDF, se las coloreo con Azul de Coomassie R-250 (Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA) y se cortaron las bandas utilizando un escalpelo.
El analisis de la secuencia N-terminal fue realizado directamente a partir de la membrana utilizando un Secuenciador de Protelna Hewlett Packard 241 (Hewlett Packard, Inc., Glen Allen, VA.). Se corrieron diez ciclos para cada banda para que pudiera ser identificado el fragmento correspondiente de plasmina. Se determinaron los pesos moleculares de cada banda por medio de un analisis de densitometrla utilizando el marcador Mark 12 disponible con Invitrogen, Inc. (San Diego, CA).
Tres polipeptidos generados por incubation de plasmina a pH 3,8 comenzaron en las posiciones (numeration con relation a Lys-plasmina) treonina (T105) , glicina (G190) y acido glutamico (E623). A partir de la secuencia conocida de aminoacidos de la plasmina, se determino que los primeros dos polipeptidos eran de cadena pesada y el tercero de cadena liviana. Como se observa en la Figura 15, el aminoacido que precede al aminoacido N-terminal era o bien arginina o bien lisina (K104, R189, y K622). Se sabe comunmente que la plasmina escinde protelnas sobre el lado del carboxllico de la lisina y de la arginina. Estos resultados demostraron que las composiciones de plasmina a pH 3,8 eran susceptibles a la autodegradacion.
Tres polipeptidos generados por incubacion de plasmina a pH 2,2 comenzaron con prolina en los N-terminales. A partir de la secuencia conocida de aminoacidos de la plasmina, se determino que estos polipeptidos eran de cadena pesada, comenzando en las posiciones P63, P155 y P347, como se observa en la Figura 15. El aminoacido que precede a cada prolina era un acido aspartico (D62, D154, y D346). Es comunmente sabido que los enlaces del peptido aspartilo-prolilo (D-P) son labiles al acido. Estos resultados demostraron que las composiciones de plasmina a un pH de 2,2 eran susceptibles a hidrolisis acida de los enlaces del peptido.
Ejemplo 15: Azucares en una formulacion de bajo pH que estabilizan a la plasmina
La plasmina fue formulada en uno de los siguientes acidos con al menos uno de los siguientes azucares, a pH 2,5 a 4,0. El grupo de acidos inclula 1 mM a 500 mM de acido acetico, acido cltrico, serina, treonina, isoleucina, valina, glutamina, b-alanina, u otros acidos, preferiblemente en el rango de 1 mM a 50 mM. El grupo de los azucares inclula 0,2% a 20% de maltosa, manitol, sorbitol, sacarosa, lactosa, glucosa y trehalosa. La formulacion de plasmina sin ningun excipiente fue incluida como control. Todas las muestras fueron incubadas a 37°C durante 7dlas. El cambio en la integridad de la plasmina fue analizado corriendo un SDS-PAGE reductor.
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Los resultados mostrados en la Figura 16 demuestran que los azucares tienen un efecto estabilizante sobre la plasmina a un pH de 3,5 y que mejoran los beneficios de almacenar la plasmina acidulada inactivada en forma reversible a un pH bajo.
Ejemplo 16: Estabilizacion de la composicion de plasmina acidulada inactivada en forma reversible con aaentes de estabilizacion que no son carbohidratos
Las composiciones aciduladas inactivadas en forma reversible fueron formuladas en una concentracion de 1 mg/ml en acido acetico 5 mM, pH 3,7, de acuerdo a la presente invencion, con 0,1 M de glucosamina, niacinamida, citrulina o tiamina anadidas como estabilizadores que no son de carbohidrato. Una formulacion de plasmina acidulada inactivada en forma reversible sin ningun agente de estabilizacion como excipiente fue incluida como control. Todas las muestras fueron incubadas a 37°C durante 7dlas de febrero y se analizo el cambio en la integridad de la plasmina utilizando SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras. Con referencia ahora a la Figura 17, todos los agentes de estabilizacion analizados que no son azucares mejoraron la estabilidad de la composicion de plasmina acidulada inactivada en forma reversible a 37°C durante los 7 dlas del perlodo de analisis.
Las composiciones de plasmina con aciduladas inactivadas en forma reversible fueron formuladas tambien en una concentracion de 1 mg/ml en acido acetico 2 mM, pH 3, 4, de acuerdo a la presente invencion, con cloruro de sodio 150 mM como agente de estabilizacion. La misma formulacion, pero sin cloruro de sodio, fue preparada tambien e incubada como control. Las muestras fueron incubadas a 4°C durante 28 dlas. El cambio en la integridad de la plasmina fue analizado utilizando SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras, como se describe en el Ejemplo 3 mas arriba. Los valores fueron normalizados con relacion a los controles el dla 0 y se les asigno un valor de 100%. En la Tabla 5, los resultados demuestran que la plasmina almacenada a 4°C es mas estable en la formulacion de pH bajo que contiene cloruro de sodio.
Tabla 5. Estabilidad de la composicion de plasmina acidulada inactivada en forma reversible (NaAc 2 mM, pH 3, 4)
con o sin cloruro de sodio 150 mM, almacenada a 4°C
Concentracion de Cloruro de Sodio (mM)
Plasmina (mg/ml) % de la cadena pesada intacta despu£s de 28 dias % de la cadena liviana intacta despues de 28 dias % de actividad despu^s de 28 dias
0
1 90 93 81
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1 101 95 97
Ejemplo 17: El plasma puede neutralizar proporcionalmente arandes volumenes de solucion salina acidulada
Con el proposito de estimar el volumen de las composiciones de plasmina aciduladas inactivadas en forma reversible de la presente invencion que puede ser neutralizado por un mililitro de suero a pH fisiologico, se llevaron a cabo una serie de experimentos de titulacion. Se estima que un volumen de 1 ml de suero representa el volumen en fase llquida de un coagulo encogido promedio encontrado en la arteria de un paciente con pAo. Se titulo el suero (1 ml) con una solucion acidulada (pH 3,7) de amortiguador con baja capacidad de amortiguacion tlpica de aquella en la cual es formulada la plasmina acidulada inactivada en forma reversible de acuerdo a la presente invencion. 1 ml de suero es capaz de neutralizar aproximadamente 150 ml de solucion salina acidulada. El ultimo volumen excedera el volumen probable de plasmina acidulada inactivada en forma reversible requerida para el tratamiento de oclusiones arteriales perifericas.
Por lo tanto, la formulacion de la plasmina acidulada inactivada en forma reversible en un amortiguador con baja capacidad de amortiguacion provee las bases para una composicion farmaceutica estable y efectiva. Tales composiciones permitirlan la administracion de plasmina acidulada inactivada en forma reversible, a temperatura ambiente durante el tiempo requerido por el tratamiento sin que la plasmina pierda potencia significativamente durante el suministro de la preparacion al paciente.
Ejemplo 18: La tripsina estabilizada a pH bajo puede ser reactivada por medio de la transferencia a un ambiente con un pH mas alto
Se disolvio tripsina (16,4 mg, Sigma Chemical Co. Catalogo No. T-1426) en 2,28 ml de Tris 50 mM/NaCl 0,5 M (pH 8,0). Se cargo la solucion de tripsina sobre una columna de 1 ml de Sefarosa con Benzamidina (Pharmacia Codigo No. 17-0568-01) que habla sido previamente equilibrada con Tris 50 mM/NaCl 0,5 M (pH 8,0). Se lavo esta columna volumen 4 ml de este ultimo amortiguador, resultando en una disminucion en la absorbancia del eluato (280 nm) a menos de 0,03. Se eluyo la tripsina de esta columna en un estado inactivado con volumenes de 0,5 ml de glicina 200 mM/NaCl 0,5 M (pH 3,0); la tercera a la quinta fracciones de 0,5 ml que eluyeron de esta columna contenlan los
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valores pico de absorbancia (280 nm) y fueron reunidas. Se determino que la absorbancia (280 nm) de este eluato reunido de tripsina era de 9,22; con base en el coeficiente de extincion para la tripsina (E280 para una solucion al 1% = 17,09) y el peso molecular de la tripsina (24.000), se calculo que la concentracion total de la protelna tripsina en este eluato reunido de la columna era de 225 pM.
La concentracion de los sitios activos de tripsina en este eluato reunido de tripsina de la columna fue determinado por medio del metodo descrito por Case & Shaw, Biochem. Biophys. Res. Commun. 29, 508 (1967) utilizando p-nitrofenilguanidinobenzoato como titulante del sitio activo. Este ensayo fue llevado a cabo a un pH de 8, 3, por medio de la dilucion de un pequeno volumen (100 pl) del eluato reunido de la tripsina de la columna en una mezcla de ensayo que tambien contenla 700 pl de borato de sodio 50 mM (pH 8,3), 200 pl de fosfato de sodio 10 mM/glicina al 1% (pH 7,0) mas 10 pl de p-nitrofenilguanidinobenzoato (disuelto en dimetil formamida); se determino que el pH final de esta composicion de la mezcla era de 8,3. La cantidad dependiente de tripsina del p-nitrofenol formado en este ensayo fue monitoreado a 410 nm. Con base en el coeficiente de extincion para el p-nitrofenol a 410 nm y un pH de 8,3 (16.595 M-1), 100 pl de este eluato reunido de la tripsina de la columna presentes en el ensayo de 1,01 ml correspondieron a una concentracion de sitios activos de tripsina de 22,95 pM presentes en la cubeta. Por lo tanto, la solucion patron original del eluato reunido de la tripsina de la columna contenla 231 pM de sitios activos de tripsina. Este ultimo valor es identico, dentro del error experimental, a la concentracion de la protelna tripsina total presente (225 pM). Estos resultados demuestran que la tripsina se puede ajustar a un pH bajo y luego transferirla a un ambiente de pH mas alto con reactivacion de su sitio activo.
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Patentes estadounidenses Nos:
5.288.489
3.950.513
5.879.923

Claims (28)

  1. 5
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    REIVINDICACIONES
    1. El uso de una plasmina acidulada inactivada en forma reversible que esta sustancialmente libre de un activador de plasminogeno, un excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable que tiene, o que ha sido acidulado hasta, un pH por debajo de 4,0, y opcionalmente, un estabilizador, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una oclusion trombotica en un humano o animal mediante la administracio de la dosis terapeutica dentro de, o en forma proxima a dicha oclusion trombotica sin neutralizacion antes de la administracion.
  2. 2. El uso de la Reivindicacion 1, en donde la oclusion trombotica es una oclusion vascular seleccionada de una trombosis coronaria, una trombosis venosa profunda, una trombosis periferica, una trombosis embolica, una trombosis en la vena hepatica, una trombosis marasmica, una trombosis en el seno, una trombosis venosa, una trombosis arterial, una derivacion arterio-venosa ocluida, hubo un dispositivo tipo cateter ocluido.
  3. 3. El uso de la Reivindicacion 1 o 2, en donde el medicamento esta liofilizado.
  4. 4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la plasmina es Glu-plasmina, Lys-plasmina, miniplasmina, microplasmina, o una variante truncada de las mismas.
  5. 5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el medicamento comprende ademas un agente anti-trombotico.
  6. 6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el excipiente acidulado farmaceuticamente aceptable es un acido organico seleccionado de un acido carboxllico, un oligopeptido, un aminoacido, o un acido inorganico.
  7. 7. El uso de la reivindicacion 6, en donde el acido farmaceuticamente aceptable se selecciona de acido formico, acido acetico, acido cltrico, glicina, isoleucina, serina, treonina, glutamina, acido aspartico, valina y alanina.
  8. 8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en donde el acido esta en el rango de concentraciones entre 1 mM y 500 mM.
  9. 9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en donde el acido esta en el rango de concentraciones entre 1 mM y 50 mM.

  10. 10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el medicamento tiene un pH entre 2, 5 y 4, 0.

  11. 11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el medicamento tiene un pH entre 3, 0 y 4, 0.

  12. 12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el medicamento tiene un pH entre 3, 1 y 3, 5.
  13. 13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la plasmina de mamlfero esta en el rango de
    concentraciones entre 0, 01 mg/ml y 50 mg/ml.
  14. 14. El uso de la Reivindicacion 7, en donde la plasmina de mamlfero esta en el rango de concentraciones entre 0, 1 mg/ml y 10 mg/ml.
  15. 15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el medicamento comprende ademas un agente estabilizante.
  16. 16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el agente de estabilizacion es un carbohidrato farmaceuticamente aceptable seleccionado de glucosa, maltosa, manitol, sorbitol, sacarosa, lactosa o trehalosa.
  17. 17. El uso de la Reivindicacion 16, en donde el carbohidrato tiene una concentracion en el rango de 0, 2% p/v y 20% p/v.
  18. 18. El uso de la Reivindicacion 16 o 17, en donde el carbohidrato es glucosa y la concentracion del mismo es del 20%.
  19. 19. El uso de la Reivindicacion 16, en donde el agente de estabilizacion tiene una concentracion en el rango de 0, 01 M a 0, 1 M.
  20. 20. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el agente de estabilizacion se selecciona de glucosamina, niacinamida y tiamina.
  21. 21. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la dosis terapeutica de la plasmina acidulada inactivada en forma reversible esta en el rango entre 0, 1 mg de plasmina/kg de peso corporal y 10, 0 mg de plasmina/kg de peso corporal.
    10
    15
    20
  22. 22. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la dosis terapeutica de la plasmina acidulada
    inactivada en forma reversible esta en el rango entre 0, 2 mg de plasmina/kg de peso corporal y 4, 0 mg de
    plasmina/kg de peso corporal.
  23. 23. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la dosis terapeutica de la plasmina acidulada
    inactivada en forma reversible esta en el rango entre 1, 0 mg de plasmina/kg de peso corporal y 2, 0 mg de
    plasmina/kg de peso corporal.
  24. 24. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde el medicamento puede ser administrado por medio de un dispositivo tipo cateter.
  25. 25. El uso de la reivindicacion 24, en donde el dispositivo tipo cateter es un cateter intravascular.
  26. 26. El uso de la Reivindicacion 25, en donde el cateter intravascular puede ser dirigido a una oclusion vascular.
  27. 27. El uso de la Reivindicacion 25 o 26, en donde el cateter intravascular puede suministrar el medicamento en forma proxima a, o dentro, de una oclusion trombotica.
  28. 28. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el cateter intravascular es capaz de entrar a la oclusion trombotica y el cateter puede suministrar el medicamento directamente dentro de la oclusion trombotica.
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