CN107802828B - 一种激肽释放酶注射液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种激肽释放酶注射液，所述的注射液中含有：(1)激肽释放酶0.1‑10PNA单位/mL；(2)缓冲液5‑50mM，pH＝6.0‑7.0；(3)渗透压调节剂0.1‑5％，w/v(以注射液制剂的总体积为基准)；(4)蛋白酶保护剂0.001‑10％，w/v(以注射液制剂的总体积为基准)。本发明提供含有激肽释放酶的注射液中不含防腐剂，不会因为防腐剂的使用使蛋白酶的活性降低，并且得到的注射液稳定性依然很高；本发明提供的激肽释放酶注射液的制备方法，所用配方简单，操作简便，成本低，不污染环境，使用特定的蛋白酶保护剂并调节各成分的比例，使制备的注射液稳定性高、杂质少、副作用低，安全性高，适合大批量生产。

Description

一种激肽释放酶注射液

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，更具体地涉及稳定的激肽释放酶注射液。

背景技术

激肽释放酶是一组存在于多数组织和体液中的丝氨酸蛋白酶，是一种肽链内切酶。它特异性的在碳末端切割底物肽，可裂解激肽原释放具有活性的激肽，由激肽发挥扩张毛细血管、松弛血管平滑肌、改善微循环、抗凝、溶血栓、降低血液粘度和血压，以及具有治疗不孕不育症等作用。其英文名为Kallikrein与Kininogenase、Kallidinogenase、Kininogenin所描述的都是同一类成分。目前已经从人和动物体的不同组织、器官或尿液中获得许多Kallikrein类成分，其中将含量最高，发现也最早的命名为Kallikrein-1(激肽释放酶-1)。该成分在人或哺乳动物的胰腺和肾脏中含量最高，其代谢后又通过肾脏，随尿排出体外。因此，从人或动物尿中分离出来的早年所称的尿激肽原酶(或尿激肽释放酶)实际上就是新分类中的激肽释放酶(Kallikrein)。不同来源的激肽释放酶，其分子量差别很大。例如，从人尿中或胰腺中分离出的人激肽释放酶，其分子量为33800。而通过基因方法获得的重组人激肽释放酶的分子量从26000-35000不等，这主要取决于采用的表达方式(E.cli、酵母、昆虫细胞、CHO细胞等)以及表达的方式(细胞内或分泌表达)等不同，蛋白糖基化的修饰方式、修饰程度不同以及纯化方式对糖链影响等引起的差异。例如，E.cli或酵母细胞内表达出的激肽释放酶其分子量约为26000，而CHO细胞表达的激肽释放酶可达到35000左右。本发明中的激肽释放酶可以使天然提取或重组的，可以是尿激肽原酶或胰激肽原酶，优选地是重组激肽释放酶。

目前激肽释放酶制剂主要有两种形式，注射液制剂和冻干粉制剂。这两个形式的制剂各有利弊。

冻干粉制剂脱去了水分，活性成分和辅料以干粉状态存在，其稳定性相对于注射液制剂更高，因此易于保存运输。例如，中国专利申请200910131861中公开了一种用甘露醇、柠檬酸钠与人尿激肽原酶制成注射液，已达到保持主药活性的作用。然而注射液制剂在制备过程中需要加入大量辅料，例如赋形剂、防腐剂保护剂等等。一方面大量辅料可能会成为潜在过敏原，引起各种不良反应。按照WHO国际药物监测合作中心的规定，药物不良反应(Adverse Drug Reactions，ADR)指正常剂量的药物用于预防、诊断、治疗疾病或调节生理机能时出现的有害的和与用药目的无关的反应。目前关于激肽释放酶注射液不良反应的报告主要为：心脑血管系统不良反应(例如皮肤潮红、血压下降、结膜充血、胸闷、伴发心绞痛等)、神经系统不良反应(头痛、出汗、头晕、乏力)、消化系统不良反应(恶心、呕吐、腹泻、上消化道出血)、全身性不良反应(发热等)以及其他不良反应(剧烈咳嗽、皮疹等)。也曾出现过严重的不良反应报告，例如梗死灶内出血，甚至患者死亡。上述药物不良反应可能会引起用药者的身体不适，甚至致使病情恶化，引发新的疾病。另一方面，注射液制剂在使用时需要进行复溶，复溶需要一定的时间，且复溶效果的好坏直接影响了药物的疗效，因此对于一些需要紧急用药的病例而言，注射液针剂稍显不便。

注射液制剂是将活性成分激肽释放酶与少量辅料(例如缓冲液等)溶解于注射用水制成的药物制剂。其优势是一方面不需要复溶即可直接使用，另一方面由于其中没有注射液使用的赋形剂等大量辅料，因此其不良反应报告往往比注射液针剂小。但是目前激肽释放酶注射液以液体形式存在，因此稳定性不如冻干粉制剂，为了提高其稳定性，不得不添加各种保护剂以及防腐剂。例如，中国专利申请200810038422中公开了一种稳定的激肽释放酶-1注射液，该注射液中除含有主药激肽释放酶-1、磷酸盐缓冲液、氯化钠和蛋白酶保护剂，另外还含有一定量的防腐剂，一方面，防腐剂对活性成分激肽释放酶的催化活力有无影响还未可知；另一方面，作为注射药物，存在防腐剂，意味着存在一定程度的致敏风险。

因此，为了解决上述技术问题，需要开发出一种辅料成分少、稳定性高、同时不良反应发生率低的激肽释放酶注射液，才能够满足实际临床应用对便捷、安全和稳定的需求。

发明内容

本发明旨在提供一种辅料成分少、稳定性高、同时不良反应发生率低的激肽释放酶注射液。

本发明的另一个目的是提供上述激肽释放酶注射液的制备方法。

术语：

1、激肽释放酶：根据本领域的常规使用惯例，本发明中使用的术语″激肽释放酶″，可与″激肽释放酶原″或″激肽原酶″互换使用；在以上名称前冠以来源方式(例如重组激肽释放酶或天然提取激肽释放酶)，或来源代谢产物(如胰激肽释放酶或尿激肽释放酶)等，均与本发明中所涉及的激肽释放酶这一术语指代的是同一种成分。它是一种丝氨酸蛋白酶，可作用于激肽原，使之水解释放出激肽，通过激肽发挥扩张毛细血管、松弛血管平滑肌、改善微循环、增加血流量、抗凝、溶血栓、降低血液粘度和血压等作用。根据本领域的国际惯例，激肽释放酶的英文名可以为Kallikrein、Kininogenase、Kallidinogenase或Kininogenin，不过目前多用Kallikrein一词。

2、缓冲液：本发明中使用的术语″缓冲液″指由能起pH缓冲作用的一种化合物或多种化合物的组合物配制的溶液，其配置均采用无菌纯化水。

定义：

1、在本发明中，1PNA单位被定义为：在37℃、pH8.0的条件下，1分钟水解1μmolVal-Leu-Arg-PNA所用的激肽释放酶量为1PNA单位。

2、w/v：本发明中所使用到的″w/v″指重量体积比，具体指某物质的前的百分数或百分数范围为其重量比溶液体积得到的百分数或百分数范围。例如″渗透压调节剂0.9％-5％，w/v；″指渗透压调节剂的重量比溶液体积的百分数范围为0.9％-5％。

一方面，本发明提供了一种激肽释放酶注射液，所述的激肽释放酶注射液中含有：

优选地，所述的激肽释放酶注射液中含有：

进一步优选地，所述的激肽释放酶注射液中含有：

本发明提供的激肽释放酶注射液中，所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液和枸橼酸盐缓冲液中的一种。

所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

所述的枸橼酸盐缓冲液为枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。

本发明提供的激肽释放酶注射液中，所述的渗透压调节剂可以选自氯化钠、甘露醇或葡萄糖中的一种或几种；优选为氯化钠或葡萄糖中的一种或两种。

在本发明提供的激肽释放酶注射液中，氯化钠的用量为0.1-0.9％，w/v；优选为0.2-0.9％，w/v；进一步优选为0.3-0.9％，w/v。

在本发明提供的激肽释放酶注射液中，甘露醇的用量为0.1-2.5％，w/v；优选为1-2.5％，w/v；进一步优选为1.5-2.5％，w/v。

在本发明提供的激肽释放酶注射液中，葡萄糖的用量为0.1-5％，w/v；优选为1-5％，w/v；进一步优选为2-5％，w/v。

在一些优选的实施方案中，上述各种渗透压调节剂在本发明提供的激肽释放酶注射液中的重量比为氯化钠∶甘露醇∶葡萄糖＝10∶2∶50。

本发明提供的激肽释放酶注射液中，所述的蛋白酶保护剂选自甘露醇、右旋糖苷、甘氨酸、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。优选为甘露醇、甘氨酸和海藻糖中的一种或几种。

甘露醇是山梨糖醇的同分异构体，两种醇类物质的二号碳原子上羟基朝向不同，分子式是C6H1406，分子量为182.17。易溶于水，为白色透明的固体，有类似蔗糖的甜味。甘露醇在医药、食品和工业生产领域有广泛用途。例如，甘露醇在医药上是良好的利尿剂，降低颅内压、眼内压及治疗肾药、脱水药、食糖代用品、也用作药片的赋形剂及固体、液体的稀释剂；以甘露醇为起始剂加压而制成的聚甘露醇-氧化丙烯醚广泛应用于塑料行业中；在食品方面，该品在糖及糖醇中的吸水性最小，并具有爽口的甜味，用于麦芽糖、口香糖、年糕等食品的防粘，以及用作一般糕点的防粘粉。

甘氨酸又名氨基乙酸，白色单斜晶系或六方晶系晶体，或白色结晶粉末，无臭，有特殊的甜味，结构简式NH2CH2COOH，分子量为75.07，甘氨酸分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水中可电离，具有很强的亲水性，属于极性氨基酸，溶于极性溶剂，而难溶于非极性溶剂；甘氨酸食品、医药、饲料和工业生产领域都有广泛的应用。例如，甘氨酸可做食品添加剂，营养增补剂等；甘氨酸可用作医药微生物和生物化学氨基酸代谢研究用药，用作头孢菌素的原料，甲砜霉素中间体等；可作为家禽、畜禽特别是宠物等食用的饲料增加氨基酸的添加剂与引诱剂等；在工业生产中可作农药中间体，如做为除草剂草甘磷的主要原料；电镀液添加剂；PH调节剂等。

右旋糖酐右旋糖酐是蔗糖经肠膜状明串珠菌-1226发酵合成的一种高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血浆代用品之一，临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等，低、小分子右旋糖苷，能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，还可以用于各种休克所指的微循环障碍，弥漫性血管内凝血、心绞痛、急性心肌梗塞即其他周围血管疾病等。

蔗糖是一种双糖，分子式：C12H22O11，分子量342.3，晶体白色，具有旋光性，但无变旋。易被酸水解，水解后产生等量的D-葡萄糖和D-果糖。不具还原性。发酵形成的焦糖可以用作酱油的增色剂。蔗糖可作为甜味剂，冷冻点的改良剂、结晶改良剂和膨松剂。蔗糖为原料，加上脂肪酸反应生成蔗糖脂肪酸脂，以无毒、无溴、无刺激，良好的表面活性性能而广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、洗涤剂、纺织及农牧业等行业。

海藻糖海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(a，a)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(a，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。海藻糖在医药、化妆品、食品加工及农业等领域有很好的应用。例如，海藻糖可广泛应用于饮料、巧克力及糖果、烘烤制品和速冻食品等方面；在医药方面，海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂。

在一些具体实施方案中，以注射液的总体积为基准，上述各种蛋白酶保护剂在本发明提供的激肽释放酶注射液中的用量为：甘露醇0.01-10％，w/v；右旋糖酐0.01-10％，w/v；甘氨酸0.01-5％，w/v；蔗糖0.01-5％，w/v；海藻糖0.1-5％，w/v。

在另一些优选的实施方案中，上述各种蛋白酶保护剂在本发明提供的激肽释放酶注射液中的重量比为甘露醇∶右旋糖苷∶甘氨酸∶蔗糖∶海藻糖＝3∶1∶2∶1∶2。

本发明意料不到地发现，当所述的激肽释放酶注射液中加入强化剂后，其稳定性明显提高，但不良反应发生率并没有明显变化。

所述的强化剂选自甲硫氨酸、精氨酸、烟酰胺和维生素B6中的一种或几种；

优选地，上述强化剂选自甲硫氨酸、精氨酸和维生素B6中的一种或几种；

进一步优选地，上述强化剂选自甲硫氨酸和精氨酸中的一种或几种。

甲硫氨酸，是构成人体的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成。因其不能在体内自身生成，所以必须由外部获得。通常被用作营养补充剂、调味剂以及用于护肝、抗抑郁、防毒去毒和心肌保护等。

精氨酸，精氨酸是一种α-氨基酸，pI(氨基酸等电点)＝10.76，亦是20种普遍的自然氨基酸之一。其具有改善男性性功能障碍、改善心血管相关疾病、增加胰岛素分泌以及减少感冒和呼吸道感染的作用，因此通常被用于男性性功能保健品、心脑血管保健品、减少糖尿病相关并发症药物和预防感冒药物的制备。

烟酰胺，又称尼克酰胺，是烟酸的酰胺化合物。其通常在临床上用于防治糙皮并口炎、舌炎，病态窦房结综合征，房室传导阻滞等问题。

维生素B6，又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素。其通常被用作食品添加剂、营养补充剂或药物制剂，用于抢救异烟肼中毒、治疗贫血、治疗白细胞减少症、治疗智力发育迟滞、治疗口腔溃疡、治疗动脉硬化及血栓栓塞性疾病、回乳、治疗帕金森综合征、治疗破伤风、治疗妊娠糖尿病、甾体避孕药引起的精神抑郁症、增强免疫力和抗癌、治疗维生素C引起的草酸盐结石、维生素B6依赖性惊厥、平喘、治疗腕管综合征等。

所述的稳定剂在本发明提供的激肽释放酶注射液中的用量为0.05-1％，w/v(以注射液制剂的总体积为基准)；优选为0.15-0.9％，w/v；更优选为0.2-0.6％，w/v。

因此，作为另一些优选的实施方案，所述的激肽释放酶注射液中含有：

在本发明提供的激肽释放酶注射液中，甲硫氨酸的用量为0.05-1％，w/v；优选为0.15-0.9％，w/v；更优选为0.2-0.6％，w/v。

在本发明提供的激肽释放酶注射液中，精氨酸的用量为0.05-1％，w/v；优选为0.15-0.5％，w/v；更优选为0.2-0.3％，w/v。

在本发明提供的激肽释放酶注射液中，烟酰胺的用量为0.05-1％，w/v；优选为0.1-0.6％，w/v；更优选为0.1-0.3％，w/v。

在本发明提供的激肽释放酶注射液中，维生素B6的用量为0.05-1％，w/v；优选为0.15-0.9％，w/v；更优选为0.2-0.4％，w/v。

在另一些优选的实施方案中，上述各种强化剂的重量配比为甲硫氨酸∶精氨酸∶烟酰胺∶维生素B6＝2∶2∶1∶1。

另一方面，本发明还提供了上述激肽释放酶注射液的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1).辅料溶液配制：按照配方用量称取除了激肽释放酶之外的其他原料，加温度为2～4℃的注射用水，搅拌至溶解，加入医用活性炭吸附处理后，使用0.45μm滤膜过滤脱碳，得到溶液A；

(2).按照配方用量称激肽释放酶，并于配液罐中依次加入步骤(1)得到的溶液A和激肽释放酶，搅拌至完全溶解，得到溶液B；

(3).用盐酸或氢氧化钠溶液调节步骤(2)得到的溶液B的pH值至6-7，得到溶液C；

(4).采用0.22μm滤膜对步骤(3)得到的溶液C过滤除菌后，得到溶液D；

(5).用2～4℃注射用水将步骤(4)得到的溶液D补足体积至所需体积，混匀，得到溶液E；

(6).采用0.22μm滤膜对步骤(5)得到的溶液E过滤除菌后，进行分装灌封，包装，即得。

本发明所述的制备方法步骤(1)中的医用活性炭的添加量为0.5-3g；优选为1-2g；进一步优选为1-1.5g。

本发明所述的制备方法步骤(1)中的医用活性炭的吸附处理时间为5-10分钟；优选为6-9分钟；进一步优选为7-8分钟。

本发明所述的制备方法步骤(1)中的医用活性炭的平均粒径为3-7μm；优选为4-6μm；进一步优选为4-5μm。

与现有技术相比，本发明提供的激肽释放酶注射液的制备方法具有以下优点：

(1)本发明提供的激肽释放酶注射液的制备方法，所用配方简单，操作简便，成本低，不污染环境，使用特定的蛋白酶保护剂并调节各成分的比例，使制备的注射液稳定性高、杂质少、副作用低，安全性高，适合大批量生产；

(2)本发明生产的重组激肽释放酶注射液生物利用度高，使用方便，吸收快，发挥作用迅速。

(3)本发明提供含有激肽释放酶的注射液中不含防腐剂，不会因为防腐剂的使用使蛋白酶的活性降低，并且得到的注射液稳定性依然很高。

具体实施方案

发明人发现在含有激肽释放酶的水溶液中加入一定种类及数量的蛋白酶保护剂和医学上可接受的辅料，无需添加任何防腐剂可以长时间地保持激肽释放酶在水溶液中的活性。

本发明中，″激肽释放酶″可以使用本领域技术人员熟知的方法获得一种优选的方法可以如中国发明专利申请200810038422中实施例1公开的方法，或参考中国专利申请2006100277541及200710038911.3中的相关内容。

本发明提供的含激肽释放酶且不含防腐剂的稳定注射液可以保证的或自组织、体液或代谢中生物提取的人或动物的激肽释放酶在水溶液中保持长期稳定性。

本发明中提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所解释的所有特征可与任意组合物形式并用，说明书中揭示的各个特征，可被任何可提供相同、均等或相似目的的取代性特征取代。因此除有特殊说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非特殊说明，否则所有的百分比和分数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的优选实施方法与材料仅做示范作用。

本发明涉及的激肽释放酶可以通过本领域的常规方式获得，例如通过基因工程获得的重组激肽释放酶，也可以通过商业途径购得。本发明具体实施方式中使用的激肽释放酶为参考上述已公开的专利中的方法制备的重组激肽释放酶。

实施例1重组激肽释放酶注射液1的制备

配方：

其中：甘露醇、甘氨酸的质量比为3∶2；

制备工艺：

(1).辅料溶液配制：按照配方用量称取除了重组激肽释放酶之外的其他原料，加温度为2～4℃的注射用水，搅拌至溶解，加入1g，平均粒径为5μm的医用活性炭吸附处理7min后，使用0.45μm滤膜过滤脱碳，得到溶液A；

(2).按照配方用量称重组激肽释放酶，并于配液罐中依次加入步骤(1)得到的溶液A和激肽释放酶，搅拌至完全溶解，得到溶液B；

(3).用盐酸或氢氧化钠溶液调节步骤(2)得到的溶液B的pH值至6-7，得到溶液C；

(4).采用0.22μm滤膜对步骤(3)得到的溶液C过滤除菌后，得到溶液D；

(5).用2～4℃注射用水将步骤(4)得到的溶液D补足体积至1000ml，混匀，得到溶液E；

(6).采用0.22μm滤膜对步骤(5)得到的溶液E过滤除菌后，进行分装1000瓶，灌封，包装，即得。

根据上述实施例1的配方和制备方法，制备了3瓶激肽释放酶注射液I-III，将其分别置于4℃、24℃和37℃下，进行稳定性和相对活性考察，数据见下表1。

表1激肽释放酶注射液1外观和相对活性

由上表1数据可知：激肽释放酶注射液1在4℃、24℃和37℃条件下放置一年后溶液澄清无任何沉淀或析出，活性相对稳定。

实施例2

激肽释放酶注射液2的制备

配方：

其中：甘露醇、甘氨酸的质量比为3∶2；

制备方法：除原料外，其他步骤与实施例1相同。

该配方选用了pH＝7.0，含0.9％氯化钠和20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，0.8％甘氨酸和1.2％的甘露醇作蛋白质保护剂，0.05％甲硫氨酸作强化剂。对该重组激肽释放酶注射液2进行稳定性及活性考察，数据见下表2。

表2重组激肽释放酶注射液2于4℃、24℃和37℃条件下放置一年稳定性及相对活性

上表数据表明，本发明制备的重组激肽释放酶注射液2中含有少量的甲硫氨酸作为强化剂，将其放置在4℃、24℃和37℃条件下一年其相对活性相对于注射液1有所增加，溶液澄清无任何沉淀或析出。

实施例3

重组激肽释放酶注射液3的制备

配方：

其中：甘露醇、右旋糖酐、蔗糖的质量比为3∶1∶1；

制备方法：与实施例1的不同在于步骤(1)中加入1.2g，平均粒径为4μm的医用活性炭吸附处理6min，其他步骤与操作与实施例1相同。

该配方选用了pH＝6.5，含5％葡萄糖的20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，2.1％甘氨酸、0.7％右旋糖酐和0.7％的蔗糖作蛋白质保护剂，0.08％精氨酸作强化剂。对该重组激肽释放酶注射液3进行稳定性及相对活性考察，数据见下表3。

表3重组激肽释放酶注射液3于4℃、24℃和37℃条件下放置一年稳定性及相对活性

上表数据表明，本发明制备的重组激肽释放酶注射液3中含有少量的精氨酸作为强化剂，将其放置4℃、24℃和37℃条件下半年其活性相对稳定，放置一年时溶液依然澄清无任何沉淀或析出。

实施例4重组激肽释放酶注射液4的制备

配方：

其中：甘露醇、蔗糖的质量比为3∶1；

精氨酸、维生素B6的质量比为2∶1；

制备方法：除原料外，其他步骤与实施例3相同。

该配方选用了pH＝7.0，含：5％葡糖糖和20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，1.5％甘氨酸和0.5％右旋糖酐作蛋白质保护剂，0.06％精氨酸和0.03％的维生素B6作强化剂。

对该重组激肽释放酶注射液4进行稳定性及活性考察。结果表明，该配方制备的重组激肽释放酶注射液4在4℃、24℃和37℃条件下放置一年其溶液澄清无任何沉淀或析出，活性相对稳定。

实施例5-8重组激肽释放酶注射液5-8的制备

按下表4所列配方和实施例1中所述的制备方法得到含有重组激肽释放酶的注射液5-8。

表4重组激肽释放酶的注射液配方

√表示该组配方使用了本辅料

表5所列是含有激肽释放酶的注射液5-8存放在37℃条件下的相对活性结果。

表5激肽释放酶的注射液5-8存放在37℃条件下的相对活性考察

结果表明，选用甲硫氨酸和精氨酸作强化剂，可以提高重组激肽释放酶注射液活性稳定性的长久性，由数据可以看出随着优选比例的甲硫氨酸和精氨酸含量的不断增加，重组激肽释放酶注射液的活性稳定性不断增加，与预期结果相同。即用甘露醇和甘氨酸作蛋白酶保护剂并加优选比例的甲硫氨酸和精氨酸作强化剂可使重组激肽释放酶注射液在37℃条件下放置一年相对活性依然在99％以上，活性持久，稳定性高。

对比例1重组激肽释放酶注射液A的制备

与实施例7的区别在于改变强化剂的比例，即将甲硫氨酸和精氨酸的比例改为5∶1，即加入5g的甲硫氨酸和1g的精氨酸；其他步骤与操作与实施例8相同。

对比例2重组激肽释放酶注射液B的制备

与实施例7的区别在于改变强化剂的比例，即将甲硫氨酸和精氨酸的比例改为1∶6，即加入1g的甲硫氨酸和6g的精氨酸；其他步骤与操作与实施例8相同。

对比例3重组激肽释放酶注射液C的制备

与实施例7的区别在于改变蛋白酶保护剂的比例，即将甘露醇和甘氨酸的比例改为1∶1，即加入10g的甘露醇和10g的甘氨酸；其他步骤与操作与实施例8相同。

对比例4中国专利申请200810038422的实施例12中公开的含有重组激肽释放酶-1的注射液XI。

对上述对比例1-3与实施例8配方制备的重组激肽释放酶注射液在37℃的条件下放置，进行了相对活性考察，数据见下表7。

表737℃条件下，重组激肽释放酶注射液相对活性考察

试验数据显示，根据本发明提供的配方使用本发明优选的蛋白酶保护剂及强化剂，并加入本发明提供的优选渗透压调节剂，分别使用本发明提供的优选比例(实施例7)，制备的重组激肽释放酶注射液相对活性可以保持360天后依然高达100％；而通过改变强化剂或蛋白酶保护剂的比例，通过测定发现180天的时候相对活性以降低到90％左右，360天的时候相对活性已经将到89％以下。

动物试验：

实验动物：SD大鼠，雌雄各半，体重240～300g，30只/组；

给药方式：静脉注射0.1PNA单位/kg体重；

监测项目：心率、血压、体温、结膜出血情况、注射部位情况；

实验组：本发明实施例7制备的注射液，以0.9％氯化钠氯化钠注射液溶解；

对照组1：本发明实施例5制备的注射液，以0.9％氯化钠氯化钠注射液溶解；

对照组2：本发明对比例4制备的注射液，以0.9％氯化钠氯化钠注射液溶解；

空白对照组：0.9％氯化钠氯化钠注射液；

实验结果：统计每组小鼠上述各个监测项目发生的只数，结果如下表：

由试验结果可知，本发明提供的加入优选并在优选比例中强化剂制备的重组激肽释放酶注射液的不良反应发生率较改变强化剂比例(对比例1-2)的注射液有所降低。说明本发明提供的重组激肽释放酶注射液稳定性好，且不良反应发生率低。

Claims (6)

1.一种激肽释放酶注射液，其特征在于：所述的激肽释放酶注射液中含有：

激肽释放酶 0.1-10 PNA单位/mL；

缓冲液 5-50mM，pH=6.0-7.0；

渗透压调节剂 0.1-5%，w/v，以注射液制剂的总体积为基准；

蛋白酶保护剂 0.001-10%，w/v，以注射液制剂的总体积为基准；

所述注射液还包括强化剂；所述的强化剂为甲硫氨酸和精氨酸；所述甲硫氨酸和精氨酸重量配比为1∶1。

2.根据权利要求1中所述的注射液，其特征在于：所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液和枸橼酸盐缓冲液中的一种。

3.根据权利要求1中所述的注射液，其特征在于：所述的渗透压调节剂选自氯化钠、甘露醇或葡萄糖中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的注射液，其特征在于：所述的渗透压调节剂为氯化钠和葡萄糖，其重量比为氯化钠∶葡萄糖＝10∶50。

5.根据权利要求1中所述的注射液，其特征在于：所述的蛋白酶保护剂选自甘露醇、右旋糖苷、甘氨酸、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的注射液，其特征在于：所述的蛋白酶保护剂为甘露醇和甘氨酸，其重量比为甘露醇∶甘氨酸＝3∶2。