CN110960672B - 一种提高牦牛免疫能力的aif-1蛋白注射液 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫领域，具体涉及一种提高牦牛免疫能力的AIF‑1蛋白注射液。具体技术方案为：一种AIF‑1蛋白注射液，组分包括：1～3mg/mL的牦牛纯化AIF‑1蛋白、10～30mM的低聚果糖、30～100mM的海藻糖、5～10mM的氨基酸组合物，溶剂为使AIF‑1蛋白注射液维持pH＝7～8的缓冲液，所述氨基酸组合物的组分包括：按质量比，异亮氨酸：苏氨酸：缬氨酸：半胱氨酸＝(0.5～1)：(0.7～1.2)：(1～3)：(1～3)。本发明首次证实牦牛体内表达的AIF‑1蛋白确实具有提高牦牛免疫能力的作用，并基于该蛋白提供了一种可提高牦牛生长性能及免疫能力的注射液，可有效帮助降低牦牛常见疾病的发生，提高幼年牦牛的存活率，帮助患病牦牛快速恢复健康。

Description

一种提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液

技术领域

本发明属于免疫领域，具体涉及一种提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液。

背景技术

同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1，以下简称AIF-1)是一种受干扰素γ诱导的钙离子结合蛋白，由免疫细胞产生。AIF-1最早从经历异源心脏移植的人和大鼠巨噬细胞中克隆得到的，其可以参与调节巨噬细胞的活化及功能，是巨噬细胞和活化的T淋巴细胞产生的细胞因子。目前发现，AIF-1包含能够结合钙离子的手型结构域，可以调节胞内钙离子浓度；其可能为一种前体多肽酶，经剪切后发挥生物活性；其包含有PDZ结构域结合基序、酪氨酸激酶磷酸化位点以及多肽激素翻译后修饰区等结构。

现有研究表明，AIF-1是一种多种功能的炎症因子，主要参与介导多种炎症反应、移植排斥、细胞凋亡、自生性和非炎性的损伤等过程，并可调节I型/II型免疫反应平衡，因此AIF-1在生物体内有着非常重要的作用。目前研究发现，除参与器官移植过程外，AIF-1还参与了动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖、类风湿性关节炎、实验性结肠炎、微生物感染、以及恶性肿瘤等疾病的发生。在炎性因子的刺激下，体内的巨噬细胞等免疫细胞被激活，活化后的巨噬细胞会分泌多种细胞因子参与炎症反应，从而发挥其在炎症通路中的重要作用。AIF-1在巨噬细激活作用过程中调整免疫反应的基因，在解聚素的存活和促炎症反应过程中起着重要作用。

AIF-1目前在鱼、毛冠鹿、小鼠等动物上有一定研究，但在高原哺乳动物中研究较少。牦牛生活于高寒地区，是青藏高原动物中最具代表性的物种之一，对其基因资源及抗病机制的研究具有重要的应用和科研价值。王利等目前仅对牦牛的AIF-1基因序列进行了克隆和分析，但尚未探讨其具体功能。同时，虽已有研究证明AIF-1蛋白与免疫能力有一定关联，但其在具体应用上尚且处于空白状态。

因此，研究牦牛的AIF-1蛋白的具体作用，并相应提供一种利用AIF-1蛋白制备的可提高牦牛免疫能力的注射液，不仅具有重要的应用价值，也可以为进一步研究AIF-1蛋白在牦牛抗疾病机制中的作用提供参考资料。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液。

为实现上述发明目的，采取的技术方案为：一种提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液，包括1～3mg/mL的牦牛纯化AIF-1蛋白。

优选的，还包括低聚果糖、海藻糖和氨基酸组合物。

优选的，所述低聚果糖用量为10～30mM。

优选的，所述海藻糖用量为30～100mM。

优选的，按摩尔量，所述低聚果糖：海藻糖＝1:3。

优选的，所述氨基酸组合物用量为5～10mM。

优选的，所述氨基酸组合物的组分包括：异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、半胱氨酸。

优选的，所述氨基酸组合物的组分包括：按质量比，异亮氨酸：苏氨酸：缬氨酸：半胱氨酸＝(0.5～1)：(0.7～1.2)：(1～3)：(1～3)。

优选的，所述AIF-1蛋白注射液由AIF-1蛋白冻干粉与缓冲液共同组成。

相应的，所述AIF-1蛋白注射液的使用方法，以AIF-1蛋白质质量/牦牛体重计，所述AIF-1蛋白注射液的用量为0.001～0.003g/kg。

本发明具有以下有益效果：本发明首次证实牦牛体内表达的AIF-1蛋白确实具有提高牦牛免疫能力的作用，并基于该蛋白提供了一种提高牦牛生长性能和免疫能力的注射液，可有效帮助降低牦牛常见疾病的发生，提高幼年牦牛的存活率，帮助患病牦牛快速恢复健康。

附图说明

图1为AIF-1基因在麦洼牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中的表达情况示意图；

图2为重组质粒pET-32a(+)-AIF-1双酶切鉴定示意图；

图3为蛋白表达菌株诱导后进行SDS-PAGE检测示意图；

图4为AIF-1蛋白纯化后进行SDS-PAGE检测示意图；

图5为纯化的AIF-1蛋白进行Western-blot鉴定示意图；

图6不同浓度的AIF-1蛋白对各炎症因子表达量影响示意图。

具体实施方式

本发明获得了牦牛体内表达的纯化AIF-1蛋白，并利用所述AIF-1蛋白制备了可有效提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液。

所述AIF-1蛋白注射液的组分包括：1～3mg/mL的牦牛纯化AIF-1蛋白、10～30mM的低聚果糖、30～100mM的海藻糖、5～10mM的氨基酸组合物，溶剂为使AIF-1蛋白注射液维持pH＝7～8的缓冲液，所述缓冲液无细胞毒性，适宜于牦牛静脉注射，例如为生理盐水、葡萄糖-磷酸盐缓冲液等。所述氨基酸组合物的组分包括：按质量比，异亮氨酸：苏氨酸：缬氨酸：半胱氨酸＝(0.5～1)：(0.7～1.2)：(1～3)：(1～3)。

所述AIF-1蛋白注射液可以为制备好的注射液(液体)，直接使用；也可以由蛋白冻干粉与缓冲液共同组成，使用时利用缓冲液将蛋白冻干粉溶解、稀释、充分混匀后，现配现用。优选采用蛋白冻干粉与缓冲液组合的形式，便于运输和保存。

下面结合具体实施例展示本发明的技术方案。

实施例一：获取并纯化牦牛体内的AIF-1蛋白

1、试验动物及主要试剂

(1)随机选取三头四川阿坝州红原健康2.5～3岁麦洼牦牛，各牦牛间差异不显著。将牦牛屠宰后，使用无菌工具采取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织样品，于DEPC水(即焦碳酸二乙酯处理后，且不含焦碳酸二乙酯的水)中除去各组织样品的血渍，于液氮中进行保存。

(2)本试验所需昆明小鼠购自成都某实验动物服务部。

(3)1.1×T3 Super PCR购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT Reagent Kit、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ酶、pMDTM19-T VectorCloning Kit、BL21(DE3)感受态细胞，均购于宝生物工程(大连)有限公司。抗His标签鼠单克隆抗体和His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。DMEM培养基、KpnI、EcoRI、HRP标记的山羊抗小鼠IgG、ECL发光试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

(4)pET-32a(+)由本实验室提供。根据本实验室已获得的牦牛AIF-1基因序列，设计q-PCR引物；参考李凤格(分枝杆菌LpqT蛋白可抑制巨噬细胞炎性因子的表达及凋亡以促进细菌在体内生存)设计巨噬细胞M1型基因iNOS、TNF-α、IL-1β及M2型基因IL-6的引物以进行q-PCR检测，详见表1。

表1本发明涉及的引物序列表

2、提取RNA、合成cDNA，检测AIF-1基因组织表达谱

按照RNAios Plus说明书分别对牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏5种组织进行RNA提取，通过电泳及紫外分光光度计检测RNA提取质量及完整性。依照PrimeScriptTM RTReagent Kit反转录试剂盒制备模板cDNA，置于-20℃保存备用。

采取q-PCR方法检测AIF-1基因在麦洼牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏5种组织中的表达情况。其中，10μL体系：上下游引物均为0.8μL，cDNA模板1μL，TB GreenTM Premix ExTaqTMII 5.2mL，灭菌双蒸水2.2μL。反应程序：预变性(95℃，3min)，变性(95℃，10s)，退火(温度梯度50～55℃，10s)，延伸(72℃，30s)，39个循环。采用2^--△△Ct法分析试验结果，SPSS24.0单因素方差分析其显著性。

结果如图1所示，图1中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。结果表明，AIF-1基因在牦牛脾脏中的表达量最高，其次为肝脏、心脏、肾脏、肺脏。在脾脏和肝脏中该基因的转录水平均极显著高于其他组织(P＜0.01)。

3、原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

用KpnI和EcoRI对pET-32a(+)载体质粒和目的片段进行双酶切，连接转化到大肠杆菌DH5α当中，挑选阳性克隆子，对阳性克隆子提取质粒，用EcoRI酶和MluI酶对质粒进行酶切验证，并送生工生物工程(上海)有限公司测序鉴定。测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)，挑取单菌落培养之后进行菌种保存。菌种活化后加入终浓度为1.0mM的IPTG，37℃诱导6h，采用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果如图2所示。图2中，M表示DNA相对分子质量标准；1表示重组质粒酶切验证结果；2表示重组质粒。综合测序结果表明：重组表达载体构建成功。

使用IPTG对重组蛋白进行诱导表达后，收集菌体后10000g，4℃离心20min，收集沉淀，用PBS磷酸缓冲液对菌体进行重悬后，37℃反复冻融3次。随后10000g、4℃离心20min，收集上清。按照康为世纪的His标签蛋白纯化试剂盒说明书对AIF-1蛋白进行纯化并复性，用2mLEP管收集纯化的蛋白，SDS-PAGE进行检测，证明AIF-1蛋白可溶。将检测成功的AIF-1蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定。

结果如图3所示。图3中，M表示蛋白相对分子质量标准；1表示未诱导菌体沉淀；2表示mM IPTG诱导菌体沉淀。结果显示：AIF-1重组蛋白诱导成功。AIF-1基因表达13.47kDa的蛋白质，表达载体能诱导出约16kDa，诱导表达的菌体沉淀被诱导出29.47kDa大小的蛋白质。

将成功诱导的AIF-1蛋白纯化后进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示，图4中，M表示蛋白相对分子质量标准；1～3分别表示纯化后收集的第1～3管蛋白。第1管的浓度最高，目的条带最粗。纯化的蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定，根据标准品制备标准曲线，获得公式为C(蛋白浓度)＝823.3×Abs(吸光度)-68.89，R²＝0.9937。管1、2、3的AIF-1蛋白浓度分别为859.42μg/mL、550.89μg/mL、490.46μg/mL。

4、AIF-1蛋白的Western-blot鉴定

将纯化的AIF-1蛋白进行Western-blot鉴定，结果如图5所示。图5中的1～3分别表示纯化后收集的第1～3管蛋白。结果显示，纯化的蛋白能被组氨酸标签抗体识别并结合，ECL发光试剂进行显色后于免染蛋白印迹系统进行分析，可见明显的蛋白印迹条带，表明该蛋白的确为AIF-1重组蛋白。

至此，发明人成功获得牦牛体内纯化的AIF-1蛋白。

实施例二：牦牛AIF-1蛋白对小鼠巨噬细胞的影响

使用实施例一获得的、不同浓度的AIF-1蛋白分别对小鼠巨噬细胞进行处理24h后，检测巨噬细胞相关炎性细胞因子的mRNA表达水平。

具体方法如下：

1、细胞培养。从小鼠腹腔分离获得纯化的小鼠巨噬细胞，将纯化的巨噬细胞用DMEM培养基制成细胞悬液，计数并调节细胞密度。以2×10⁵～4×10⁵个/cm²的密度接种巨噬细胞于6孔培养板内，加入血清含量为10％的的DMEM培养液后置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次DMEM培养液，获得处理后的巨噬细胞，备用。

2、设置三个实验组，各组在步骤1的巨噬细胞培养24h后分别加入1.0μg/mL、10.0μg/mL和100μg/mL的AIF-1蛋白，共三个浓度梯度，分别作为试验组1、2、3。同时设置不加AIF-1蛋白、加入等量DMEM培养基，其余条件相同的组别，作为对照组。各组分别设置3个平行。在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养条件下处理24h后收集细胞。用枪头刮取细胞后，将细胞重悬离心，取细胞沉淀按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。

选定巨噬细胞M1型基因iNOS、TNF-α、IL-1β及M2型基因IL-6设计引物(具体引物参见表1)，测定巨噬细胞在不同浓度的AIF-1处理下，其相关炎性细胞因子的表达情况，结果如图6所示。结果显示，1.0μg/mL的AIF-1蛋白能够促进IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的表达，且均极显著高于对照组(P＜0.01)；10.0μg/mL的AIF-1蛋白能够促进IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的表达，IL-6、TNF-α、iNOS的表达水平极显著高于对照组(P＜0.01)；100μg/mL的AIF-1蛋白能够促进IL-6、TNF-α、iNOS的表达，TNF-α的表达水平显著高于对照组(P＜0.05)，iNOS的表达水平极显著高于对照组(P＜0.01)。IL-1β的表达水平在1.0μg/mL的AIF-1蛋白处理下极显著增加(P＜0.01)；IL-6的表达水平在1.0μg/mL、10.0μg/mL的AIF-1蛋白处理下均极显著增加(P＜0.01)；TNF-α的表达水平在1.0μg/mL、10.0μg/mL的AIF-1蛋白处理下极显著增加(P＜0.01)，在100μg/mL的AIF-1蛋白处理下显著增加(P＜0.05)；iNOS的表达水平在1.0μg/mL、10.0μg/mL、100μg/mL的AIF-1蛋白处理下均极显著增加(P＜0.01)。

上述试验证明，适宜浓度的牦牛AIF-1蛋白可以明显提升炎症因子的表达量，可能能够在提高机体免疫能力上与其它炎症因子共同发挥作用，有望作为免疫添加剂增强牦牛机体免疫能力，治疗与免疫功能下降相关的疾病及免疫缺陷病。

实施例三：牦牛AIF-1蛋白注射液的制备及效果展示

1、制备25组AIF-1蛋白冻干粉，各组组分如表2所示。表2中“/”表示未使用对应试剂；表2中各氨基酸的比值指质量比；表2中出现文字及对应数字，指未使用表头对应试剂，而是使用表格中的试剂(例如，“蔗糖，100”指未使用海藻糖，而是使用100mM的蔗糖)。对应的缓冲液均选用葡萄糖-磷酸盐缓冲液。

表2各组AIF-1蛋白冻干粉组分对照表

2、各组AIF-1蛋白冻干粉的制备方法为：在无菌环境下，将上述各组AIF-1蛋白冻干粉的组分加入超纯水中，充分搅拌混匀后，置于冻干机内，在100mTorr下，降温至0℃，保温0.5h；随后以0.5℃/min的速率降温至-30℃，保温1.5h；再以0.5℃/min的速率升至-25℃，保温10min；再以0.5℃/min的速率升至-20℃，保温20h；再以0.1℃/min的速率升至20℃，保温5h，完成冻干。只将AIF-1蛋白直接加入超纯水中，AIF-1蛋白浓度为3mg/ml，在相同条件下完成冻干，作为对照组。

3、将上述各组的AIF-1蛋白冻干粉密封，保存在室温、干燥环境中，分别于保存1个月、6个月、12个月后使用超纯水复溶，检测各组复溶后的AIF-1蛋白冻干粉中完整蛋白质的百分比(冻干前的完整蛋白质百分比为100％)。完整蛋白质的百分比为非变性蛋白质的峰面积与包括凝聚物的总峰面积的比值，用HPLC测定。结果如表3所示。

表3各组AIF-1蛋白冻干粉保存情况

4、从表2可以看出，组9、10、组12～14、组16～18、组20、21、23的AIF-1蛋白质冻干粉保存效果不佳，保存12个月后完整蛋白质百分比低于90％。为节约饲养成本，不对上述11组AIF-1蛋白质冻干粉进行动物试验。选择2～2.5岁的健康公牦牛30头，分为15组，每组设置2个平行，各牦牛初始体重为160±20kg。各牦牛在正式试验前，都进行驱虫处理。其中14组分别在月初注射各组使用AIF-1蛋白冻干粉复配的AIF-1蛋白注射液(使用葡萄糖-磷酸盐缓冲液复配)，用量以AIF-1蛋白的量计算，为0.001g/kg，在试验开始时注射1次，随后不再注射，作为处理组。剩下1组在相同时间注射等量的葡萄糖-磷酸盐缓冲液，作为对照组。

各牦牛饲喂条件相同，半舍饲，精饲料与干草混合饲喂。精料选用成都施普诺生物技术有限公司，先饲喂当日精料，每日投喂2次精饲料，精饲料饲喂总量为：2.5kg/头/天。随后自由采食干草，自由饮水。共计饲喂4个月。观察各组牦牛中途是否染病(偶有食欲不振等不计为染病，以出现明显症状且2天内无法自愈，需要药物介入作为染病标准)，如有，统计染病数量，按每头牛次进行统计，例如，同一头牛在试验期间出现3次染病，记为3牛次。统计各组死亡数量。试验结束时对各组牦牛进行称重，计算平均重量(终体重)。结果如表4所示。为便于对比，表4中各组别与表2、3中所用蛋白质冻干粉和分组一一对应。

表4各组犊牛生长情况

Claims (3)

1.一种提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液，其特征在于：包括1～3mg/mL的牦牛纯化AIF-1蛋白、10～30mM的低聚果糖、30～90mM的海藻糖和6～10mM的氨基酸组合物；所述氨基酸组合物的组分包括：按质量比，异亮氨酸：苏氨酸：缬氨酸：半胱氨酸=（0.5～1）：（0.7～1.2）：（1～3）：（1～3）。

2.根据权利要求1所述的提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液，其特征在于：按摩尔量，所述低聚果糖：海藻糖=1:3。

3.根据权利要求1或2所述的提高牦牛免疫能力的AIF-1蛋白注射液，其特征在于：所述AIF-1蛋白注射液还包括pH=7～8的缓冲液。

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