CN111840529B

CN111840529B - 一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗vkvq的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法

Info

Publication number: CN111840529B
Application number: CN202010749550.9A
Authority: CN
Inventors: 戚南山; 孙铭飞; 廖申权; 吕敏娜; 吴彩艳; 李娟�; 林栩慧; 胡俊菁; 蔡海明; 肖文婉; 于林增; 张健騑
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN111840529A

Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备方法，制备方法包括：步骤一，VKVQ编码基因的克隆，根据鸡球虫基因序列设计上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4,进行PCR扩增、电泳得到一条约1200bp的片段，将该产物连接转化后得到序列全长为1245bp的VKVQ,其序列为SEQ ID NO:1以及后续相关步骤。该方法制备的疫苗通过免疫柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ真核表达质粒和原核表达蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

Description

一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，更具体的说，涉及一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法。

背景技术

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)是一类专性细胞内寄生的顶复门原虫，可引起严重危害集约化养鸡业生产的鸡球虫病。在无预防措施或预防失败(如因抗药性问题致药物无效)的情况下，鸡发病率可达30％-100％，致死率可高达80％。全球每年因鸡球虫病引起的经济损失超过30亿美元以上。目前对鸡球虫病的防控仍主要是执行“在饲料中添加各种抗球虫药进行药物防控”和“活卵囊疫苗进行疫苗防控”的技术方法。但鸡球虫广泛而严重的抗药性，以及活卵囊疫苗存在的潜在散毒风险使鸡球虫病的防控面临严峻挑战，新的抗球虫药物及疫苗研制成为亟待解决的问题。然而，人们至今对球虫与宿主细胞的详细互作机制尚无系统认识，造成新型抗球虫药物及分子疫苗的研制面临巨大困难。

顶膜抗原(Apical Membrane Antigen，AMA)是一种在顶复门原虫中高度保守的微线分泌蛋白，可以和棒状体分泌的颈部蛋白共同形成“运动结合体(Moving Junction)”，共同完成虫体与宿主细胞的粘附作用，是协助虫体进入宿主细胞的关键物质。在Bromley等的蛋白组学研究中发现，柔嫩艾美耳球虫不只一种顶膜抗原，并且出现在不同的发育阶段，所以分析可能这些蛋白分别在不同的入侵阶段发挥着类似的作用。本课题组在对广东株柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA的克隆时，获得了多个类似顶膜抗原的基因，分别对其功能进行研究，发现其中一种蛋白(这里命名为VKVQ，下述部分沿用)可以有效预防鸡体感染鸡球虫病。而迄今为止，尚无任何其他关于该蛋白对艾美耳球虫免疫保护性的研究。

发明内容

本发明的目的是提供了一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法，该方法制备的疫苗通过免疫柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ真核表达质粒和原核表达蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备方法，制备方法包括：

步骤一，VKVQ编码基因的克隆，根据鸡球虫基因序列设计上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4,进行PCR扩增、电泳得到一条约1200bp的片段，将该产物连接转化后得到序列全长为1245bp的VKVQ,其序列为SEQ ID NO:1；

步骤二，VKVQ真核质粒的制备，针对目的基因设计引物序列，上游引物SEQ ID NO:5和下游引物SEQ ID NO:6，通过PCR扩增、电泳得到PCR产物，回收目的片段并进行酶切反应，通过表达载体的处理以及酶切载体与酶切片段的连接构建VKVQ重组真核表达质粒，再通过连接产物转化、菌落PCR法鉴定转化克隆以及通过阳性克隆测序验证，最后通过质粒小提试剂盒进行质粒小提以及进行VKVQ真核质粒的表达验证；

步骤三，VKVQ蛋白的制备，针对目的基因设计上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8，通过基因扩增，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，然后进行表达载体的处理以及酶切载体与酶切片段的连接构建VKVQ重组原核表达质粒，再通过连接产物转化、菌落PCR法鉴定转化克隆，最后采用质粒小提试剂盒进行质粒小提以及进行VKVQ在表达菌中的诱导表达。

本申请还公开了一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ在抗鸡球虫病中的应用方法，应用方法包括：

步骤一，VKVQ重组蛋白的乳化，取权利要求1步骤三中纯化后所得的VKVQ重组蛋白与弗氏佐剂(FCA)按照1：1的比例混匀，用7号针头注射器反复抽吸至滴于水上5min内不扩散为止；

步骤二，将权利要求1步骤二中的VKVQ真核质粒在鸡体的腿部肌肉注射或将步骤一中的的VKVQ重组蛋白在鸡体的皮下进行注射，分别进行免疫应用。

与已有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明中通过本方法制备的疫苗通过免疫柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ真核表达质粒和原核表达蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

附图说明

图1是柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗Et-VKVQ真核表达质粒在DF-1细胞中表达的WB分析(图中，M.蛋白质分子质量标准；1.DF-1细胞总蛋白；2.pCDA3.1-Et-VKVQ转染至DF-1细胞中的表达产物；3.原核表达阳性对照)；

图2是柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗Et-VKVQ表达产物SDS-PAGE电泳分析图(图中，M.蛋白质分子质量标准；1.未诱导菌液；2.37℃诱导后菌液；3-4.纯化后重组表达蛋白)；

图3是柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗Et-VKVQ表达产物的WB图(图中，M.蛋白质分子质量标准；1-2.pET30a-Et-VKVQ重组纯化蛋白)。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明，以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。及《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋主编，第2版,北京，中国协和医科大学出版社,1999.)。

一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备方法，包括：

1.Et-VKVQ编码基因的克隆：

1.1引物设计

根据鸡球虫注释基因序列ETH_00017730用Premier Primer 5.0软件设计，ThermoFisher Scientific Inc.合成：

上游引物Et-VKVQ-F:5’GTCAAAGTTCAGCAGCAGCAGCAGC 3’(SEQ ID NO:3)；

下游引物Et-VKVQ-R:5’CGGGAGGGCCTCCTCCGCCAAAGAA 3’(SEQ ID NO:4)。

1.2广东株E.tenella卵囊

由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物学研究室保存；

1.3 E.tenella卵囊总RNA的提取

方法参照北京美基生物科技公司HiPure Total RNA Plus Micro Kit试剂盒说明书。

1.4 RT-PCR扩增Et-VKVQ编码基因序列

以上述步骤抽提的E.tenella卵囊的总RNA作为模板，用Takara公司的PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA；以cDNA为模板，Et-VKVQ-F，Et-VKVQ-R为引物，TaKaRa LA TaqTM酶进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，72℃延伸10min，35个循环。产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增获得一条约1200bp的片段(见图1)。将PCR产物纯化回收后按试剂盒说明书连接至pMD18-T载体(Takara公司)，再将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，得到E.coli DH5α(pMD18-T-Et-VKVQ)。阳性菌送上海英骏生物技术有限公司测序，Et-VKVQ序列全长为1245bp，如SEQ ID NO:1所示。

2.Et-VKVQ真核质粒的制备：

2.1引物设计

针对目的基因上下游设计引物序列：

上游引物Et-VKVQ-EuF:5’CTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCGTCAAAGTTCAGCAGCAGCAGCAGC 3’(SEQ ID NO:5)；

下游引物Et-VKVQ-EuR:5’GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACGGGAGGGCCTCCTCCGCCAAAGAA3’(SEQ ID NO:6)。

2.2基因扩增

PCR反应体系及扩增条件以pMD18-T-Et-VKVQ质粒为模板，使用PrimeSTAR高保真酶扩增基因目的片段，具体反应体系与条件如下(表1)：

表1 Et-VKVQ的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：94℃预变性5min→94℃变性30sec→60℃退火30sec→72℃延伸2min→72℃延伸10min→4℃；共30个循环；

电泳：将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测仪下观察结果。产物大小约为1200bp，与预期产物大小一致。

PCR产物回收：用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并进行酶切反应(表2)

表2 Et-VKVQ酶切反应体系(单位：μL)

37℃孵育3h后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段。

2.3表达载体的处理：

取5μL(1μg/μL)的pCDNA3.1质粒，用BamHI和XbaI双酶切，建立如下(表3)酶切反应，酶切质粒：

表3质粒的酶切反应体系(单位：μL)

37℃孵育3h后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的质粒；

2.4酶切载体与酶切片段的连接：

酶切后的Et-VKVQ与pCDNA3.1按表4组成建立连接反应(表4)，构建pCDNA3.1-Et-VKVQ重组真核表达质粒；

表4酶切载体与片段的连接反应体系(单位：μL)

2.5连接产物转化E.coli DH5α：

(1)冰浴中将10μL连接产物加入至100μL E.coli DH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。

(2)将离心管放入预加温至42℃水浴中，静置90s。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

(4)每管加800μL SOC培养基，于37℃缓慢振摇培养温育45min。

(5)将培养物涂布于LB琼脂平板(含100μg/mL Amp)，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，37℃过夜培养(约12～16h)。

2.6菌落PCR法鉴定转化克隆：

挑取一些菌落分别接种于10ml LB培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养后，取培养物建立如下(表5)PCR反应筛选阳性克隆；

表5鉴定转化克隆的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：同上，取PCR反应产物10μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，选取阳性菌落摇菌，测序。

2.7阳性克隆测序验证：

将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证，测序完成后，软件比对测序结果，测序引物见下表(表6)：

表6测序引物

测序引物名称	测序引物序列(5′-3′)
		pCDNA3.1F	CTAGAGAACCCACTGCTTAC
pCDNA3.1R	TAGAAGGCACAGTCGAGG

2.8质粒小提：

经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提，具体步骤见质粒小提试剂盒说明书。

2.9 Et-VKVQ真核质粒表达验证：

细胞转染：(1)转染前一天，消化DF-1细胞并计数，按1.0x106cells/孔的细胞量接种至6孔板，使细胞在24h后的汇合度在70％-90％之间，每孔2ml完全培养基培养；(2)转染当天，细胞换成无双抗完全培养基，37℃、5％CO2培养箱孵育；(3)转染前准备：a.用250μL无血清DMEM稀释质粒DNA，轻轻混匀；b.混匀lipofectamin试剂，取适量的lipofectamin试剂用250μL无血清DMEM稀释，轻轻混匀，室温放置5分钟；c.将前两步所稀释的DNA和lipofectamin试剂混合，轻轻混匀，室温下静置20-30分钟；(4)在每孔细胞中加入第3步骤的混合液；(5)转染4-6h后，可更换完全培养基；(6)细胞于5％CO2培养箱中37℃温育48-72h后，进行转染后的检测。

进行Western blot验证，再进行样本制备：(1)去除细胞培养基，用PBS轻轻冲洗细胞，用刮刀将细胞从培养皿中刮下来，转移到1.5ml EP管中，1000rpm离心5min，用PBS洗3次，1000rpm离心5min，弃上清；(2)每管分别加入100μL裂解液，冰上裂解10min；(3)12000rpm 4℃离心10min，将上清转移到新的1.5ml EP管中。

蛋白质定量，取5(1μL)、10(2μL)、15(3μL)、20(4μL)、25(5μL)、30(6μL)、35(7μL)μg的BSA(5ug/μL)制作标准曲线，样品取2μL，三复管测定，最后取平均值。每支管加入1mLBradford进行染色，涡旋振荡20s，使其充分混匀后即可测定吸光值，测定时两个样品之间的操作间隔也应该是20s左右。打入液体时要均匀，避免产生气泡。

SDS-PAGE凝胶电泳，根据定量结果，每个样本取20ug，加ddH2O补足至18μL，再加入6μL 4×Loading buffer，100℃煮5min，12000rpm 4℃离心3min，上样，开始电泳。恒压130V/胶电泳，直到溴酚蓝跑出胶底部，积层胶浓度4％，分离胶10％。

电泳转膜：(1)准备NC膜，切膜的时候戴手套。(2)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回以擀几遍以擀走里面的气泡。在海绵垫上垫两层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀走其中的气泡。(3)将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片→2层滤纸→样品胶→NC膜→2层滤纸(注意：排除气泡)→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。(4)转膜时间1小时30分钟，恒流：300mA。

封闭，5％脱脂奶粉溶于1×TBST中，室温封闭1h。

孵育抗体：(1)将一抗(兔抗Et-VKVQ多抗，编号KHD2016165，上海生工)用1×TBST稀释到适合浓度，4度孵一抗过夜。(2)孵一抗过夜后，用TBST在摇床上洗膜三次，每次5min。(3)将二抗(羊抗兔，编号A0277，购自碧云天)用1×TBST稀释到适合浓度，与膜室温孵育2h后，用1×TBST在摇床上洗膜三次，每次5min。

化学发光，显影，定影：(1)先用滤纸吸干膜上液体(2)将A和B两种发光试剂在EP管中等体积混合，将发光试剂涂于玻璃板上，将膜正面朝下，用枪弄平，计时2min。(3)在NC膜上将配好的ECL化学发光液均匀点好，10～30s后用化学发光凝胶成像系统进行曝光。结果见图1。

3.Et-VKVQ蛋白的制备

3.1引物设计

针对目的基因上下游设计引物序列：

上游引物Et-VKVQ-PaF:5’GGCGGATCCGTCAAAGTTCAGCAGCA GCAGCAGC 3’(SEQ IDNO:7)；

下游引物Et-VKVQ-PaR:5’GGCAAGCTTCGGGAGGGCCTCCTCCGCC AAAGAA 3’(SEQ IDNO:8)。

3.2基因扩增

(1)PCR反应体系及扩增条件：以pMD18-T-Et-VKVQ质粒为模板，使用PrimeSTAR高保真酶扩增基因目的片段，具体反应体系与条件如下(表7)：

表7 Et-VKVQ的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：

94℃预变性5min→94℃变性30sec→60℃退火30sec→72℃延伸2min→72℃延伸10min→4℃；共30个循环。

(2)电泳：将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测仪下观察结果。产物大小约为1200bp，与预期的产物大小一致。

(3)PCR产物回收：用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并进行酶切反应(表8)：

表8 Et-VKVQ酶切反应体系(单位：μL)

3.3表达载体的处理

取5μL(1μg/μL)的pET30a质粒，用BamHI和Hind III双酶切，建立如下(表9)酶切反应，酶切质粒：

表9质粒的酶切反应体系(单位：μL)

3.4酶切载体与酶切片段的连接

酶切后的Et-VKVQ与pET30a按表10组成建立连接反应(表10)，构建pET30a-Et-VKVQ重组原核表达质粒；

表10酶切载体与片段的连接反应体系(单位：μL)

3.5连接产物转化E.coli DH5α

(2)将离心管放入预加温至42℃水浴中，静置90s。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

(4)每管加800μL SOC培养基，于37℃缓慢振摇培养温育45min。

(5)将培养物涂布于LB琼脂平板(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，37℃过夜培养(约12～16h)。

3.6菌落PCR法鉴定转化克隆

挑取一些菌落分别接种于10ml LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，37℃振荡过夜培养后，取培养物建立如下(表11)PCR反应筛选阳性克隆：

表11鉴定转化克隆的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：同上。

取PCR反应产物10μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，选取阳性菌落摇菌，测序。

3.7质粒小提

3.8 pET30a-Et-VKVQ在表达菌中的诱导表达

表达载体转化及诱导表达，将构建好的pET30a-Et-VKVQ质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。

从转化的平板中挑选单克隆，接种到4L的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向培养液中加入终浓度0.1mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。

SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果，取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图2。

蛋白纯化，包涵体采用20mM PBS(pH7.2)，150mM NaCl含1％Triton X-100，2mMEDTA，2mM DTT洗涤后，以20mM PB(pH7.2)，150mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。结果见图2。

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane 5-11，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液1×PBS(pH 7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，2mM EDTA，0.4ML-Arginine中复性，复性后Et-VKVQ蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，10％Glycerol溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

3.9重组蛋白的免疫印迹(Western blot)分析

将重组Et-VKVQ蛋白采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源his单克隆抗体(Sigma公司)，二抗为羊抗鼠IgG-HRP(Sigma公司)。结果见图3。

4 Et-VKVQ的免疫保护性试验

4.1材料

球虫卵囊：柔嫩艾美耳球虫广东株孢子化卵囊，由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物学研究室保存，使用前在无球虫雏鸡体内复壮。

雏鸡：岭南黄雏鸡，由广东省农业科学院动物科学研究所提供，饲养于已消毒的专用动物房内；鸡笼和所用器皿均严格消毒，自由采食和饮用纯净水；实验前观察雏鸡有无临床症状及连续3天检查粪便有无球虫卵囊，备用。

饲料：由广东省农业科学院动物科学研究所定制育雏料，不含任何抗球虫药物。

4.2试验方法

分组：180只1日龄试验雏鸡逐只称重后，剔除瘦弱或体重过大雏鸡，选择个体体重差异在10g以内的健康鸡，随机分成6组，每组30只。

处理：

Et-VKVQ重组蛋白的乳化：取3.9纯化后所得的Et-VKVQ重组蛋白与弗氏佐剂(FCA)按照1∶1的比例混匀；用7号针头注射器反复抽吸至滴于水上5min内不扩散为止。

试验鸡于1、7、14日龄分别用pCDNA3.1-Et-VKVQ真核质粒(腿部肌肉注射)或pET30a-Et-VKVQ重组蛋白(皮下注射)进行免疫，另设非免疫感染组及非免疫非感染组作为对照。21日龄分别经口感染5×104个新鲜的E.tenella孢子化卵囊。每天观察并记录鸡群的精神状况、采食量、粪便情况等；对死亡雏鸡称重，剖检，若为柔嫩艾美耳球虫感染引起死亡则病变记分为+4分；所有雏鸡于感染后第7天逐只称重，剖检，进行盲肠病变记分。具体的试验分组详见表12：

表12试验分组设计

抗球虫指数评定标准：

相对增重率：试验开始及结束时分别称鸡只体重，计算平均增重和相对增重率。相对增重率＝(各组增重率/非免疫非感染组增重率)×100％。

存活率：记录各组死亡鸡数，剖检确定死因，算出存活率。存活率＝(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100％。

病变值：感染后第7天宰杀鸡，参照Johnson和Reid(1970)设计的病变记分法，进行每只鸡的肠道病变记分，并将病变记分换算成病变值；

病变记分：(两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准)：

0分，无肉眼病变；

1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常；

2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常；

3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少；

4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，因球虫病死亡鸡只也记4分。

病变值(0～40)＝各试验组的平均病变记分(0～4)×10。

卵囊值：用麦克马斯特计数法进行粪便卵囊计数，求出每组克粪便卵囊数(OPG)，计算卵囊数，根据表13换算得出卵囊值。

表13卵囊数与卵囊值的换算关系

抗球虫指数(ACI)：ACI＝(相对增重率+存活率)×100-(病变值+卵囊值)计算而得。

免疫效果判定标准：ACI＞180属高效；160＜ACI＜180属中效；120＜ACI＜160属低效；ACI＜120对球虫无效。

4.3试验结果

临床症状观察：

非免疫感染对照组试验鸡感染孢子化卵囊后逐渐出现采食减少、精神差等反应。感染后第4天，pCDNA3.1组、pET30a组及非免疫感染对照组均有血粪排出，饮水量减少，第5天和第6天更为严重，剖检见盲肠病变，有不同程度出血或血凝块，其他脏器未观察到病变；质粒+重组蛋白免疫组、重组蛋白+质粒免疫组及非免疫非感染对照组均无血粪，采食，饮水正常。

试验结果表明，pCDNA3.1组、pET30a组的抗球虫指数均低于120，均呈现出无效的抗球虫效果；质粒+重组蛋白免疫抗球虫指数为188.68，重组蛋白+质粒免疫组抗球虫指数为189.86，具有高等效力的抗球虫效果。结果详见表14。

表14 Et-VKVQ的免疫保护效果评价

本申请中的氨基酸与核苷酸序列如下：

SEQ ID NO：1(Et-VKVQ核苷酸序列)

GTCAAAGTTCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAAGCAGCCCTTCCCCCTTGCAGAGAGCGCCTGCAGAGAGCTTTTCCGCGATGGATCAAACAGCAGCAGCAGCGCTAGAGATGCTGCAGCTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGAGCAGCAGGAAGCTGAAAAGTTGAATTCAAACAACTTCCTGGCCACTGCATCGCCACATGCTGTCTCTACACTGCAAACAGAAAGTCAAAATCCTTGGCTGTCGGGAGCTCTGAAGACATTCATAAGCAAGTTCAATATCCCGGTTGTTCACGGTTCTGGGGTGTACGTGGACCTCGGGAAAACGAGTTCCGGATACCGCCAGCCGGGAGGACTCTGTCCAGTTTTTGGGAAATATATTAAAATTGAAAAGCAAAATTCAAATTACAAAACTTTTCTCGAAGACTTTCCAGTTTCGGGATCTTCCGAAAGGCCTTTGCCCGGAGGATTCAACTTGGCGTATGTCACCAGCAGCGGACGCGCCTTTTCTCCGGTTGCCGATTCTTTCCTCGTGGATGCTTTTGGCTTGACGGGGCCATCGGACCCGATATCTCGCTGCGCGAAGTACAGCTACTTGATGGAGCCCCGGAAGCCAGGAACAAATGGCACTTTTGATTACAAGTTGCCTTTTGTTTACGACGCAGCAGCAAAAAGCTGCTTCGTGCTGCACGTCAGCATGCAGAAGCTCACTGGCAGCAGATATTGCTCCTCGAACGGGACCCCCGCTGGCCTCTTTTGGCCCTGCTTCCGCCCCGCCAAAAGCGCCTCAGCTTCGACCCATCTTGTCTATGGCTCTGGGCAAATGGGCGCAGACCCAGAGGCTTGGAAAAAGAAGTGCCCCTCGAGAGCCGTGAAGGACGCGGTGTTCGGACAGTGGGGGGTGGGGGGCTGCACGGCGTTGGCGGCGAACTCTTCGGGTGTACGTACACTGCAAGTTGCATACAAAAGCAAATGTTGGGAAACTCTTTTTGACTTCTCTGCTTCTGACGAAGCTGTTGCTTCCAACCCCGACAACTGGGACTCCATTTGGCCTACGCTCGACAGCAGCGCCTCCGTCTCAGCGGGAGTTGGGCAAAACTACGCCAACTTCTTCCCCAGCAGCTCCGGGCCAGGGGGGACTTGTGTTATTTTTGCTGCTGTACCCTCTTGCTTCCTGAGGGCCCCCGGGCACACAGCCTACACCTCAGTGGGTTCTTTGGCGGAGGAGGCCCTCCCG

SEQ ID NO:2(Et-VKVQ氨基酸序列)

VKVQQQQQQQQSSPSPLQRAPAESFSAMDQTAAAALEMLQLQQQQQQQQQEQQEAEKLNSNNFLATASPHAVSTLQTESQNPWLSGALKTFISKFNIPVVHGSGVYVDLGKTSSGYRQPGGLCPVFGKYIKIEKQNSNYKTFLEDFPVSGSSERPLPGGFNLAYVTSSGRAFSPVADSFLVDAFGLTGPSDPISRCAKYSYLMEPRKPGTNGTFDYKLPFVYDAAAKSCFVLHVSMQKLTGSRYCSSNGTPAGLFWPCFRPAKSASASTHLVYGSGQMGADPEAWKKKCPSRAVKDAVFGQWGVGGCTALAANSSGVRTLQVAYKSKCWETLFDFSASDEAVASNPDNWDSIWPTLDSSASVSAGVGQNYANFFPSSSGPGGTCVIFAAVPSCFLRAPGHTAYTSVGSLAEEALP

SEQ ID NO:3(Et-VKVQ-F)

GTCAAAGTTCAGCAGCAGCAGCAGC

SEQ ID NO:4(Et-VKVQ-R)

CGGGAGGGCCTCCTCCGCCAAAGAA

SEQ ID NO:5(Et-VKVQ-EuF)

CTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCGTCAAAGTTCAGCAGCAGCAGCAGC

SEQ ID NO:6(Et-VKVQ-EuR)

GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACGGGAGGGCCTCCTCCGCCAAAGAA

SEQ ID NO:7(Et-VKVQ-PaF)

GGCGGATCCGTCAAAGTTCAGCAGCAGCAGCAGC

SEQ ID NO:8(Et-VKVQ-PaR)

GGCAAGCTTCGGGAGGGCCTCCTCCGCCAAAGAA

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法

<130> 20200730

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1245

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 1

gtcaaagttc agcagcagca gcagcagcag caaagcagcc cttccccctt gcagagagcg 60

cctgcagaga gcttttccgc gatggatcaa acagcagcag cagcgctaga gatgctgcag 120

ctgcagcagc agcagcagca gcagcagcag gagcagcagg aagctgaaaa gttgaattca 180

aacaacttcc tggccactgc atcgccacat gctgtctcta cactgcaaac agaaagtcaa 240

aatccttggc tgtcgggagc tctgaagaca ttcataagca agttcaatat cccggttgtt 300

cacggttctg gggtgtacgt ggacctcggg aaaacgagtt ccggataccg ccagccggga 360

ggactctgtc cagtttttgg gaaatatatt aaaattgaaa agcaaaattc aaattacaaa 420

acttttctcg aagactttcc agtttcggga tcttccgaaa ggcctttgcc cggaggattc 480

aacttggcgt atgtcaccag cagcggacgc gccttttctc cggttgccga ttctttcctc 540

gtggatgctt ttggcttgac ggggccatcg gacccgatat ctcgctgcgc gaagtacagc 600

tacttgatgg agccccggaa gccaggaaca aatggcactt ttgattacaa gttgcctttt 660

gtttacgacg cagcagcaaa aagctgcttc gtgctgcacg tcagcatgca gaagctcact 720

ggcagcagat attgctcctc gaacgggacc cccgctggcc tcttttggcc ctgcttccgc 780

cccgccaaaa gcgcctcagc ttcgacccat cttgtctatg gctctgggca aatgggcgca 840

gacccagagg cttggaaaaa gaagtgcccc tcgagagccg tgaaggacgc ggtgttcgga 900

cagtgggggg tggggggctg cacggcgttg gcggcgaact cttcgggtgt acgtacactg 960

caagttgcat acaaaagcaa atgttgggaa actctttttg acttctctgc ttctgacgaa 1020

gctgttgctt ccaaccccga caactgggac tccatttggc ctacgctcga cagcagcgcc 1080

tccgtctcag cgggagttgg gcaaaactac gccaacttct tccccagcag ctccgggcca 1140

ggggggactt gtgttatttt tgctgctgta ccctcttgct tcctgagggc ccccgggcac 1200

acagcctaca cctcagtggg ttctttggcg gaggaggccc tcccg 1245

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 2

Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Ser Pro Ser Pro

1 5 10 15

Leu Gln Arg Ala Pro Ala Glu Ser Phe Ser Ala Met Asp Gln Thr Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Leu Glu Met Leu Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

35 40 45

Gln Gln Glu Gln Gln Glu Ala Glu Lys Leu Asn Ser Asn Asn Phe Leu

50 55 60

Ala Thr Ala Ser Pro His Ala Val Ser Thr Leu Gln Thr Glu Ser Gln

65 70 75 80

Asn Pro Trp Leu Ser Gly Ala Leu Lys Thr Phe Ile Ser Lys Phe Asn

85 90 95

Ile Pro Val Val His Gly Ser Gly Val Tyr Val Asp Leu Gly Lys Thr

100 105 110

Ser Ser Gly Tyr Arg Gln Pro Gly Gly Leu Cys Pro Val Phe Gly Lys

115 120 125

Tyr Ile Lys Ile Glu Lys Gln Asn Ser Asn Tyr Lys Thr Phe Leu Glu

130 135 140

Asp Phe Pro Val Ser Gly Ser Ser Glu Arg Pro Leu Pro Gly Gly Phe

145 150 155 160

Asn Leu Ala Tyr Val Thr Ser Ser Gly Arg Ala Phe Ser Pro Val Ala

165 170 175

Asp Ser Phe Leu Val Asp Ala Phe Gly Leu Thr Gly Pro Ser Asp Pro

180 185 190

Ile Ser Arg Cys Ala Lys Tyr Ser Tyr Leu Met Glu Pro Arg Lys Pro

195 200 205

Gly Thr Asn Gly Thr Phe Asp Tyr Lys Leu Pro Phe Val Tyr Asp Ala

210 215 220

Ala Ala Lys Ser Cys Phe Val Leu His Val Ser Met Gln Lys Leu Thr

225 230 235 240

Gly Ser Arg Tyr Cys Ser Ser Asn Gly Thr Pro Ala Gly Leu Phe Trp

245 250 255

Pro Cys Phe Arg Pro Ala Lys Ser Ala Ser Ala Ser Thr His Leu Val

260 265 270

Tyr Gly Ser Gly Gln Met Gly Ala Asp Pro Glu Ala Trp Lys Lys Lys

275 280 285

Cys Pro Ser Arg Ala Val Lys Asp Ala Val Phe Gly Gln Trp Gly Val

290 295 300

Gly Gly Cys Thr Ala Leu Ala Ala Asn Ser Ser Gly Val Arg Thr Leu

305 310 315 320

Gln Val Ala Tyr Lys Ser Lys Cys Trp Glu Thr Leu Phe Asp Phe Ser

325 330 335

Ala Ser Asp Glu Ala Val Ala Ser Asn Pro Asp Asn Trp Asp Ser Ile

340 345 350

Trp Pro Thr Leu Asp Ser Ser Ala Ser Val Ser Ala Gly Val Gly Gln

355 360 365

Asn Tyr Ala Asn Phe Phe Pro Ser Ser Ser Gly Pro Gly Gly Thr Cys

370 375 380

Val Ile Phe Ala Ala Val Pro Ser Cys Phe Leu Arg Ala Pro Gly His

385 390 395 400

Thr Ala Tyr Thr Ser Val Gly Ser Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro

405 410 415

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 3

gtcaaagttc agcagcagca gcagc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 4

cgggagggcc tcctccgcca aagaa 25

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 5

cttggtaccg agctcggatc cgccaccgtc aaagttcagc agcagcagca gc 52

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 6

ggtttaaacg ggccctctag acgggagggc ctcctccgcc aaagaa 46

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 7

ggcggatccg tcaaagttca gcagcagcag cagc 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 8

ggcaagcttc gggagggcct cctccgccaa agaa 34

Claims

1.一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备方法，其特征在于：制备方法包括：

VKVQ编码基因的克隆，根据鸡球虫基因序列设计上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQID NO:4,进行PCR扩增、电泳得到一条1200bp的片段，将该产物连接转化后得到序列全长为1245bp的VKVQ,其序列为SEQ ID NO:1；

VKVQ真核质粒的制备，针对目的基因设计引物序列，上游引物SEQ ID NO:5和下游引物SEQ ID NO:6，通过PCR扩增、电泳得到PCR产物，回收目的片段并进行酶切反应，通过表达载体的处理以及酶切载体与酶切片段的连接构建VKVQ重组真核表达质粒，再通过连接产物转化、菌落PCR法鉴定转化克隆以及通过阳性克隆测序验证，最后通过质粒小提试剂盒进行质粒小提以及进行VKVQ真核质粒的表达验证；

VKVQ蛋白的制备，针对目的基因设计上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8，通过基因扩增，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，然后进行表达载体的处理以及酶切载体与酶切片段的连接构建VKVQ重组原核表达质粒，再通过连接产物转化、菌落PCR法鉴定转化克隆，最后采用质粒小提试剂盒进行质粒小提以及进行VKVQ在表达菌中的诱导表达；

VKVQ重组蛋白的乳化，取纯化后所得的VKVQ重组蛋白与弗氏佐剂（FCA）按照1：1的比例混匀，用7号针头注射器反复抽吸至滴于水上5min内不扩散为止，即得到柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ。