CN108690123A - 短肽在制备免疫调节药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及短肽miPEP155在制备免疫调节药物中的应用。所述短肽来自于微小RNA155的host gene，称为miPEP155。所述的miPEP155多肽能抑制Th17细胞的分化，具有免疫调节功能，可用于预防或治疗自身免疫性疾病。

Description

短肽在制备免疫调节药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地说，本发明涉及短肽miPEP155在制备免疫调节药物中的应用。

背景技术

Th17细胞(T helper cell17，Th17)是一种新发现的能够分泌白介素17(interleukin 17，IL-17)的T细胞亚群，Th17是由TH0细胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的辅助性T细胞，RORγ是其重要的转录因子。Th17细胞能够分泌产生IL-17A、IL-17F、IL-6以及肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factora，TNF-a)等，这些细胞因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞，从而有效地介导了组织的炎症反应，因此Th17在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。

已有研究表明，Th17与银屑病、自身免疫性脑炎、哮喘、类风湿性关节炎等自身免疫疾病密切相关。此外，其也与结肠炎、脑肿瘤，糖尿病病等疾病密切相关。因此，Th17对于自身免疫性疾病的发生和发展都具有重要意义，对其进行深入研究将有助于了解自身免疫性疾病的发病机制，对疾病预后判断、进一步的治疗有着深远的意义。

银屑病是一种慢性炎症性疾病，其诱因主要包括：感染、免疫、遗传、精神及环境等因素。银屑病主要病理学变化包括：角质形成细胞角化不全或角化过度，真皮大量炎症细胞浸润，血管异常增生，常伴有糖尿病、冠心病、高血压、抑郁、代谢综合征等系统性疾病。银屑病在中国的发病人群以25-45岁的青壮年为多，近年来儿童银屑病发病率也逐渐增加，银屑病不易治愈且容易复发的特性不仅严重危害患者的身心健康，并且严重影响患者的生活质量。目前临床上治疗银屑病的方法，包括药物治疗、物理治疗、免疫生物学治疗和中医中药治疗等。中国每年用于进口治疗银屑病的药物，尤其是科技含量高、靶向性强的小分子生物类药物的花销庞大，但是，大部分基于抗体等生物制剂药物的银屑病治疗方法都易造成一定程度的毒副作用，并且机体可能对药物产生耐药性，有些银屑病患者在使用一些分子抗体药物停药后出现复发及反弹。因此，开发中国自主知识产权的靶向性强、远期疗效好、安全性高、价格低廉的新一代治疗银屑病的新药势在必行。

多肽类(peptide)药物习惯上常指多肽类激素。一般将50或50以下氨基酸残基组成的化合物列入多肽。现已知生物体内含有和分泌很多种激素和活性多肽，仅脑中就存在近40种，而人们还在不断地发现、分离、纯化新的活性多肽物质。多肽随着长度的增加，其稳定性及体内的半衰期都相应变差或者缩短。生理情况的多肽也不一定全部序列都是发挥功能所必须的。通过探索其发挥功能的最短功能域，我们可以增加多肽药物的稳定性及半衰期，降低合成成本，减少生物毒性。多肽在生物体内的浓度很低，但生理活性很强，在调节生理功能时起着非常重要的作用。多肽类药物具有毒性低，特异性高，分子量小等自身独特的优势，且可以通过体外合成及生物学合成大量获得。

因此，针对自身免疫性疾病的多肽类药物具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的意义在于本发明提供了一种新型的由miRNA host gene编码的短肽，其可在炎症环境中特异性靶向Th17，抑制Th17的分化，降低银屑病人外周血及IMQ诱导的类银屑病模型鼠皮损区IL-17A的mRNA及蛋白表达水平，并且能够降低Th17的转录因子C/EBPβ的mRNA及蛋白表达水平，小鼠活体实验能够有效减轻IMQ诱导的小鼠类银屑病模型，能够通过人工合成或生物学合成大量获得，可应用于制备免疫调节药物。

在本发明的第一方面，提供一种短肽，该短肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一个优选例中，所述的短肽由微小RNA155(miRNA-155)host gene编码。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的短肽；较佳地，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:1中第181～231位或第181～234位所示的核苷酸序列，或它们的简并序列。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体(包括病毒载体或非病毒载体)，其含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组细胞，其含有所述的表达载体或其基因组中包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的短肽或编码其的多核苷酸，或所述的表达载体或所述的重组细胞在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用；较佳地，所述的自身免疫性疾病是Th17过度分化、Th17细胞过度增殖、IL-17A过度表达、C/EBPβ过度表达为特征的自身免疫性疾病；较佳地，所述的自身免疫性疾病是自身免疫性炎症性疾病；更佳地，所述自身免疫性炎症性疾病包括(但不限于)：银屑病，白癜风，皮炎，实验性自身免疫性脑炎(EAE)，哮喘，类风湿性关节炎(RA)，阿瑟氏反应。

在一个优选例中，所述的短肽或编码其的多核苷酸，或所述的表达载体或所述的重组细胞在制备免疫调节药物中的应用，所述的免疫调节包括：抑制Th17过度分化、抑制Th17细胞过度增殖、抑制IL-17A过度表达，和/或抑制C/EBPβ过度表达。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的短肽的方法，所述方法包括：培养所述的重组细胞，从而重组表达所述的短肽；或所述方法包括：通过体外人工合成的方法或生物学合成方法制备所述的短肽。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫调节的药物组合物，所述的药物组合物包括：所述的短肽或编码其的多核苷酸，或所述的表达载体或所述的重组细胞；以及药学上或生理学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于银屑病治疗的药盒，所述药盒中包括：

所述的短肽或编码其的多核苷酸；或

所述的表达载体；或

所述的重组细胞；或

所述的药物组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、质谱分析确定miPEP155氨基酸正确性，质谱检测的分子量为1879.3。

图1B、HPLC的纯度分析，其纯度为95.1％。

图2、外源合成的miPEP155-Histag可以在细胞中表达。

A、将miPEP155的编码序列及6*Histag构建到质粒pcDNA3.1(+)的BamHI/XhoI限制性位点中。从而，获得的重质粒在表达后能够形成miPEP155与histag的融合蛋白，经测序鉴定重组质粒重组序列正确。

B、将miPEP155-Histag融合蛋白转染293T细胞，24h后固定细胞，免疫荧光染色检测到miPEP155-Histag融合蛋白主要表达在细胞的胞浆及胞膜。

图3、外源合成的miPEP155可以抑制Th17的分化。

不同浓度的miPEP155(0.1μΜ，1μΜ，10μΜ)加入到T细胞诱导的Th17分化体系中，流式细胞术检测，发现外源合成的miPEP155可以抑制体外诱导的Th17的分化。

图4A～C、外源合成的miPEP155可以减少类银屑病模型鼠皮肤中及脾脏Th17的数量。尾静脉注射miPEP155(100μg/只)治疗IMQ诱导的类银屑病模型鼠，7天后，处死小鼠，取耳部皮肤及脾脏进行固定，免疫组化染色检测到miPEP155治疗组小鼠耳部皮肤及脾脏中Th17的数量减少。

图5、外源合成的miPEP155能够降低IMQ诱导的类银屑病模型鼠皮损区IL-17AmRNA、蛋白及C/EBPβ蛋白的表达水平。

A、外源合成的miPEP155能够降低IMQ诱导的类银屑病模型鼠皮损区IL-17A mRNA及蛋白的表达水平。

B、外源合成的miPEP155能够降低IMQ诱导的类银屑病模型鼠皮损区IL-17A蛋白的表达水平。

C、外源合成的miPEP155能够降低IMQ诱导的类银屑病模型鼠皮损区C/EBPβ的蛋白表达水平

图6、外源合成的miPEP155能够有效减轻IMQ诱导的小鼠类银屑病体征。

A、外源合成的miPEP155能够明显减轻模型鼠的类银屑病的发病。

B、外源合成的miPEP155能够有效抑制IMQ诱导的类银屑病模型鼠表皮中角质形成细胞的增殖。

图7、外源合成的miPEP155能够降低THP-1细胞及银屑病人外周血单核细胞IL-17AmRNA的表达水平。

A、外源合成的miPEP155能够降低THP-1细胞中IL-17A mRNA表达水平。

B，外源合成的miPEP155能够降低银屑病人外周血单核细胞IL-17A mRNA表达水平。

具体实施方式

本发明人研究发现，微小RNA155的host gene的部分核苷酸序列能够编码产生一短肽，将之称为微小RNA155 host gene编码的多肽(miPEP155)。所述的miPEP155多肽能抑制Th17细胞的分化，具有免疫调节功能，可用于预防或治疗自身免疫性疾病，如银屑病。

如本文所用，所述的“微小RNA155 host gene编码多肽”、“miRNA-155前体编码多肽”、“miPEP155多肽”可以互换使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

如本文所用，“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。

miPEP155短肽

本发明人发现微小RNA155的host gene的部分核苷酸序列能够编码产生一段短肽，命名为miPEP155。

本发明的miPEP155多肽可以是重组多肽、合成多肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。化学合成的方法对于本领域技术人员而言是熟悉的，例如固相多肽合成方法。

本发明的miPEP155多肽的序列为：MEMALMVAQTRKGKSVV(SEQ ID NO:2)。

本发明还包括miPEP155多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的miPEP155多肽相同的生物学功能或活性的多肽。miPEP155多肽的片段、衍生物或类似物可以是：

(i)有一个或多个(如1-5个、1-3个或1-2个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或

(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或

(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或

(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，miPEP155多肽可以指具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽。该术语还包括具有与miPEP155多肽相同功能的、在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括miPEP155多肽的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加多肽的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的多肽。例如，在所述截短体中，对于部分氨基酸进行修饰形成的新的、保留原有功能的多肽。

本发明公开的miPEP155合成简易、成本低、不具免疫排斥性、能够在炎症环境中特异性抑制Th17细胞大的分化、疗效好、治疗后疾病不易复发并且副作用小，治疗效果极为显著。

本发明还提供了编码本发明miPEP155多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或miPEP155肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞(重组细胞)，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

miPEP155多肽的应用

本发明还提供了所述的miPEP155多肽、其编码核酸、含有其编码核酸的质粒或重组细胞用于制备自身免疫性疾病药物，或用于制备抑制Th17过度分化、Th17细胞过度增殖、IL-17A过度表达、C/EBPβ过度表达的药物的应用。所述的自身免疫性疾病是Th17过度分化、Th17细胞过度增殖、IL-17A过度表达、C/EBPβ过度表达为特征的自身免疫性疾病。较佳地，所述的自身免疫性疾病是自身免疫性炎症性疾病。

本发明还提供了所述的短肽或编码其的多核苷酸、表达载体或重组细胞在制备免疫调节药物中的应用。所述的免疫调节包括：抑制Th17过度分化、抑制Th17细胞过度增殖、抑制IL-17A过度表达，和/或抑制C/EBPβ过度表达。

在本发明的具体实施例中，确定了miPEP155能够在细胞中表达，miPEP155能够抑制Th17分化。并且，miPEP155能够减少IMQ诱导的类银屑病模型鼠皮肤及脾脏中Th17细胞的数量，减少耳部皮肤角质形成细胞的增殖，并有效降低IL-17A及C/EBPβ的蛋白及mRNA的表达水平，从而有效地减轻IMQ诱导的小鼠类银屑病动物模型的发病。在THP-1细胞及银屑病人外周血的检测中发现，外源给予miPEP155能够有效降低IL-17A及C/EBPβmRNA的表达水平。上述的研究结果表明，miPEP155多肽可应用于抑制Th17的分化，可用于制备对于自身免疫性疾病有效的免疫调节药物。

例如，所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和银屑病等。此外，对其它一些与Th17免疫调节功能失调相关的疾病或症状也具有潜在的预防或治疗作用。目前，已知与Th17的免疫调节功能失调相关的疾病或症状选自：肿瘤或病毒感染，炎症反应、类风湿关节炎、器官移植、系统性红斑狼疮、银屑病、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎、传染性疾病等。

例如，所述肿瘤包括：前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤、肠癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、直肠腺癌或黑色素瘤，等。

例如，所述炎症反应包括：过敏性炎症、毛囊炎、扁桃体炎、肺炎、肝炎、肾炎、痤疮、哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠道疾病、盆腔炎、再灌注损伤、类风湿关节炎、移植排斥反应、血管炎或间质性膀胱炎，等。

例如，所述传染性疾病包括：鼠疫、霍乱、传染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、手足口病、登革热、炭疽、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿破伤风、猩红热、布鲁氏菌病、淋病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、麻风病、流行性和地方性斑疹伤寒、黑热病、包虫病、丝虫病，除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病、真菌感染，等。

药物组合物及药盒

本发明还提供一种用于免疫调节的药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞；以及药学上或生理学上可接受的载体。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括：本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞；或所述的药物组合物。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

本发明的优点在于miPEP155能够特异性靶向Th17细胞；分子量小，容易进入细胞发挥作用；短肽通过原核表达进行生物学合成，易于大量制备，稳定性好，相对于现有的对于治疗银屑病有效的抗体价格更低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、miPEP155序列分析和体外合成

1、miPEP155序列分析

miR-155 host gene的序列如下：

上述序列中，斜体下划线部分为miPEP155预测序列。翻译为氨基酸的序列为：MEMALMVAQTRKGKSVV(SEQ ID NO:2)。

2、miPEP155的体外合成

使用常规的固相多肽合成方法，按照SEQ ID NO:2氨基酸序列合成多肽，质谱分析确定氨基酸正确如图1A(miPEP155)。纯度为95.1％，如图1B。使用前溶于ddH₂O待用。

实施例2、miPEP155在细胞中的表达

将miPEP155的编码序列构建到质粒pcDNA3.1(+)的BamHI/XhoI限制性位点中。从而，获得的重组质粒在表达后能够形成miPEP155与his-tag的融合蛋白，经测序鉴定重组质粒重组序列正确，如图2A。

将前述获得的重组质粒转染到人肾上皮细胞系(293T)中，以转入空质粒pcDNA3.1(+)的人肾上皮细胞系(293T)为对照。空白组只转染pcDNA3.1(+)质粒，miPEP155组转染miPEP-histag质粒。免疫荧光显微镜观察miPEP-histag蛋白的表达。结果如图2B，miPEP-histag蛋白主要表达在293T细胞的包膜及胞浆。

实施例3、miPEP155抑制Th17细胞分化

实施例1中固相多肽合成方法得到的miPEP155，测定其对Th17细胞分化的影响。

获取小鼠的脾脏细胞，利用免疫磁珠分离小鼠CD4+T细胞，在37℃条件下培养于1640培养基中，在培养基中加入anti-CD3(5μg/ml)、anti-CD28(2μg/ml)、TFG-β(10ng/ml)、IL-23(20ng/ml)、anti-IL-4(5μg/ml)、anti-IFN-γ(10μg/ml)培养3天以得到Th17。

在37℃条件下、1640培养基中培养Th17，分为若干个培养组，分别加入0μM，0.1μM，1μM和10μM浓度的miPEP155，流式细胞术观察miPEP155对Th17分化的影响。

结果如图3，miPEP155可以明显地抑制体外诱导的Th17的分化。

实施例4、miPEP155能够减轻IMQ诱导的小鼠类银屑病模型鼠皮损区的Th17细胞的数量

将SPF级别小鼠随机分为IMQ组及IMQ+miPEP155组，IMQ涂抹小鼠耳部皮肤内外侧，25mg/只，共计涂抹一周，建立IMQ诱导的小鼠类银屑病模型，并于IMQ给药后第2天进行生理盐水及miPEP155(溶解于ddH₂O，再用生理盐水稀释，浓度为：100ug/200ul)尾静脉给药，剂量为100μg/只鼠，每天一次，从诱导当天开始每天定时测量耳部皮肤厚度并称量小鼠体重。IMQ诱导7天时处理小鼠，取耳部皮肤及脾脏检测Th17细胞数量。

结果如图4A～C，miPEP155能够明显减少皮损区及脾脏Th17细胞的数量。

实施例5、外源合成的miPEP155能够降低IMQ诱导的类银屑病模型鼠IL-17A mRNA、蛋白及C/EBPβ蛋白的表达水平

1、外源性给予miPEP155对于银屑病模型IL-17A表达的影响

按照实施例4的步骤制备IMQ诱导的小鼠类银屑病模型及miPEP治疗模型鼠，获取部分耳部皮肤，加入Trizol提取RNA，逆转录及qPCR检测IMQ诱导的小鼠类银屑病模型皮损区IL-17A mRNA的表达水平。

结果如图5A，可见外源性给予miPEP155能够明显降低银屑病小鼠皮损区IL-17AmRNA的表达水平。

2.外源给予miPEP155对于银屑病模型IL-17蛋白表达的影响

按照实施例4的步骤制备IMQ诱导的小鼠类银屑病模型及miPEP治疗模型鼠，获取部分耳部皮肤，用组织匀浆机将皮肤打成粉末，加入Total protein extractionbuffer与蛋白酶磷酸酶抑制剂的混合物(Total protein extractionbuffer：蛋白酶磷酸酶抑制剂＝1：100)，冰上20min，每5min震荡混匀一次，充分裂解蛋白。按照mouse IL-17A试剂盒检测IL-17A蛋白的表达。

结果如图5B，外源给予miPEP155能够显著降低IMQ诱导的类银屑病模型鼠皮损区IL-17蛋白的表达水平。

3.外源给予miPEP155对于银屑病模型C/EBPβ蛋白表达水平的影响

按照实施例4步骤制备IMQ诱导的小鼠类银屑病模型，获取部分耳部皮肤，加入Total protein extractionbuffer与蛋白酶磷酸酶抑制剂的混合物(Total proteinextractionbuffer：蛋白酶磷酸酶抑制剂＝1：100)，冰上20min，每5min震荡混匀一次，充分裂解蛋白。将蛋白与蛋白上样buffer按照1：4的比例混匀，100℃煮沸5分钟，进行WesternBlot检测。

结果如图5C，外源给予miPEP155能够降低类银屑病模型鼠皮损区C/EBPβ蛋白的表达水平。

实施例6、外源合成的miPEP155能够有效减轻IMQ诱导的小鼠类银屑病体征

1、合成的miPEP155对于银屑病表型的影响

按照实施例4步骤制备IMQ诱导的小鼠类银屑病模型及miPEP治疗模型鼠，获取部分耳部皮肤，4％多聚甲醛固定24h,常规脱水，包埋，将组织块切成厚度为5μm的组织切片，H&E染色，显微镜下观察IMQ诱导的类银屑病模型鼠耳部皮肤的病理情况。

结果如图6A，外源合成的miPEP155能够明显减轻模型鼠的类银屑病表型，具体表现为：与对照组相比，miPEP155能够明显使小鼠的表皮变薄，鳞屑减少，炎细胞浸润减少。

2、外源合成的miPEP155对于银屑病模型的角质形成细胞的影响

外源合成的miPEP155能够有效抑制IMQ诱导的类银屑病模型鼠表皮中角质形成细胞的增殖。按照实施例4步骤制备IMQ诱导的小鼠类银屑病模型及miPEP治疗模型鼠，获取部分耳部皮肤，4％多聚甲醛固定24h，常规脱水，包埋，将组织块切成厚度为5μm的组织切片，免疫组织化学染色，显微镜下观察IMQ诱导的类银屑病模型鼠耳部皮肤中Ki-67(作为细胞增殖活性的标志)的表达情况。

结果如图6B，与对照组相比，miPEP155组的模型鼠，皮肤中Ki-67阳性细胞数明显减少。

实施例7、外源给予miPEP155能够有效降低银屑病人外周血单核细胞IL-17A及C/EBPβ的mRNA的表达

培养THP-1细胞，10％的高糖DMEM培养至对数生长期，以5×10⁴个/孔铺48孔板。同时加入0nM，0.1μM，1μM和10μM浓度的miPEP155共同孵育24h，培养终体积为250μl。24小时时收取细胞，3000rpm离心20分钟，弃上清后用1ml PBS重悬细胞，再次离心，加入Trizol获取RNA，逆转录及qPCR检测THP-1细胞中IL-17A及C/EBPβmRNA的表达水平、

结果如图7A，外源给予miPEP155能够有效降低THP-1细胞中IL-17A及C/EBPβ的mRNA的表达。

获取银屑病人的外周血，贴壁4h去除单核细胞，原代培养液培养，设立NC组及miPEP155给药组，刺激24小时收取细胞，3000rpm离心20分钟，弃上清后用1ml PBS重悬细胞，再次离心，加入Trizol获取RNA，逆转录及qPCR检测银屑病人外周血中IL-17A及C/EBPβmRNA的表达水平。

结果如图7B，外源性给予miPEP155能够明显降低银屑病人外周血单核细胞IL-17A及C/EBPβmRNA的表达水平。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院

<120> 短肽在制备免疫调节药物中的应用

<130> 183359

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gccgagcccg ggcccagcgc cgcctgcagc ctcgggaagg gagcggatag cggagccccg 60

agccgcccgc agagcaagcg cggggaacca aggagacgct cctggcactg cagataactt 120

gtctgcattt caagaacaac ctaccagaga ccttacctgt caccttggct ctcccaccca 180

atggagatgg ctctaatggt ggcacaaacc aggaagggga aatctgtggt ttaaattctt 240

tatgcctcat cctctgagtg ctgaaggctt gctgtaggct gtatgctgtt aatgctaatc 300

gtgatagggg tttttgcctc caactgactc ctacatatta gcattaacag tgtatgatgc 360

ctgttactag cattcacatg gaacaaattg ctgccgtggg aggatgacaa agaagcatga 420

gtcaccctgc tggataaact tagacttcag gctttatcat ttttcaatct gttaatcata 480

atctggtcac tgggatgttc aaccttaaac taagttttga aagtaaggtt atttaaaaga 540

tttatcagta gtatcctaaa tgcaaacatt ttcatttaaa tgtcaagccc atgtttgttt 600

ttatcattaa cagaaaatat attcatgtca ttcttaattg caggttttgg cttgttcatt 660

ataatgttca taaacacctt tgattcaact gttagaaatg tgggctaaac acaaatttct 720

ataatatttt tgtagttaaa aattagaagg actactaacc tccagttata tcatggattg 780

tctggcaacg ttttttaaaa gatttagaaa ctggtacttt cccccaggta acgattttct 840

gttcaggcaa cttcagttta aaattaatac ttttatttga ctcttaaagg gaaactgaaa 900

ggctatgaag ctgaattttt ttaatgaaat atttttaaca gttagcaggg taaataacat 960

ctgacagcta atgagatatt ttttccatac aagataaaaa gatttaatca aaaaatttca 1020

tatttgaaat gaagtcccaa atctaggttc aagttcaata gcttagccac ataatacggt 1080

tgtgcgagca gagaatctac ctttccactt ctaagcctgt ttcttcctcc atatggggat 1140

aatactttac aaggttgttg tgaggcttag atgagataga gaattattcc ataagataat 1200

caagtgctac attaatgtta tagttagatt aatccaagaa ctagtcaccc tactttatta 1260

gagaagagaa aagctaatga tttgatttgc agaatattta aggtttggat ttctatgcag 1320

tttttctaaa taaccatcac ttacaaatat gtaaccaaac gtaattgtta gtatatttaa 1380

tgtaaacttg ttttaacaac tcttctcaac attttgtcca ggttattcac tgtaaccaaa 1440

taaatctcat gagtctttag ttgatttaaa ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Glu Met Ala Leu Met Val Ala Gln Thr Arg Lys Gly Lys Ser Val

1 5 10 15

Val

Claims (10)

1.一种短肽，其特征在于，该短肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的短肽，其特征在于，所述的短肽由微小RNA155host gene编码。

3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的短肽；较佳地，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:1中第181～231位或第181～234位所示的核苷酸序列，或它们的简并序列。

4.一种表达载体，其含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种重组细胞，其含有权利要求4所述的表达载体或其基因组中包含权利要求3所述的多核苷酸。

6.权利要求1所述的短肽或编码其的多核苷酸，或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的重组细胞在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用；较佳地，所述的自身免疫性疾病是Th17过度分化、Th17细胞过度增殖、IL-17A过度表达、C/EBPβ过度表达为特征的自身免疫性疾病；较佳地，所述的自身免疫性疾病是自身免疫性炎症性疾病；更佳地，所述自身免疫性炎症性疾病包括：银屑病，白癜风，皮炎，实验性自身免疫性脑炎，哮喘，类风湿性关节炎，阿瑟氏反应。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的短肽或编码其的多核苷酸，或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的重组细胞在制备免疫调节药物中的应用，所述的免疫调节包括：抑制Th17过度分化、抑制Th17细胞过度增殖、抑制IL-17A过度表达，和/或抑制C/EBPβ过度表达。

8.一种制备权利要求1所述的短肽的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求5所述的重组细胞，从而重组表达权利要求1所述的短肽；或所述方法包括：通过体外人工合成的方法或生物学合成方法制备权利要求1所述的短肽。

9.一种用于免疫调节的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：权利要求1所述的短肽或编码其的多核苷酸，或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的重组细胞；以及药学上或生理学上可接受的载体。

10.一种用于银屑病治疗的药盒，其特征在于，所述药盒中包括：

权利要求1所述的短肽或编码其的多核苷酸；或

权利要求4所述的表达载体；或

权利要求5所述的重组细胞；或

权利要求9所述的药物组合物。