CN106084062A

CN106084062A - 桥连的双特异性融合蛋白

Info

Publication number: CN106084062A
Application number: CN201610144347.2A
Authority: CN
Inventors: 房健民; 姜静; 李伟伟
Original assignee: RONGCHANG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd YANTAI
Current assignee: RONGCHANG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd YANTAI
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2016-03-14
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2036-03-14
Also published as: CN106084062B

Abstract

本发明涉及桥连的双特异性融合蛋白，具体地，本发明涉及改良的拮抗血管新生诱导因子的融合蛋白及其用途，更具体地，本发明涉及VEGF受体和FGF受体的融合蛋白及其在治疗与血管新生相关的疾病中的用途。

Description

桥连的双特异性融合蛋白

技术领域

背景技术

血管新生(Angiogenesis)是导致恶性肿瘤生长和转移的基本要素之一[1]。血管新生过程受多种因子的调节，有些因子促进血管新生，有些因子抑制血管新生，目前已经知道相当数目的血管新生刺激因子，例如血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、Tie-1等，这些因子能刺激血管内皮细胞的分裂、分化和血管的形态发生。其中，VEGF是目前所知对血管新生最特异、最有效的生长因子[2，3]。

在肿瘤组织内的缺氧环境中，肿瘤细胞分泌大量的VEGF，诱导血管内皮细胞的分裂和迁移，最终建立肿瘤血管网络。众多动物试验证明，抑制VEGF能阻止血管新生，进而抑制肿瘤的生长。正因为此，VEGF及其受体是抗血管新生药物最重要的靶标，目前在临床试验中取得显著疗效的抗血管新生药物有贝伐单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)，它能够直接阻断VEGF，抑制肿瘤血管的新生，于2004年被美国FDA批准上市作为结直肠癌的一线用药，是第一个被批准上市的通过抑制血管新生发挥抗癌作用的新药。

除了Avastin，还有若干个抗VEGF信号的药物已获得批准上市。Regeneron研发的针对VEGF的融合蛋白Aflibercept(或称VEGF-Trap)于2011年被FDA批准上市用于治疗年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，又于2012年被批准用于治疗结直肠癌。成都康弘研发的针对VEGF的融合蛋白KH902于2013年11月被CFDA批准上市。

抗VEGF药物在肿瘤的临床治疗上取得了重大的进展，但是，临床试验也显示抗VEGF治疗也存在相当大的局限。导致抗VEGF治疗失败或产生抗性的的根本原因可能在于肿瘤血管新生是受到多种因子控制的，尽管VEGF在血管新生中起到重要作用，但它不是唯一的血管新生刺激因子。

成纤维细胞生长因子(FGF)是结合肝素的生长因子家族，在哺乳动物中其具有22个家族成员(FGF 1-14，16-23)。FGF在多种生物学功能上具有重要作用，例如细胞增殖、分化、迁移、血管新生和肿瘤发生。其通过结合并活化细胞表面FGF受体(FGFR)发挥其多种生物学功能。(参见，例如Eswarakumar et al.Cytokine Growth Factor Rev.16：139-149，2005)。成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)是与成纤维细胞生长因子家族成员相结合的受体。成纤维细胞生长因子受体中的一部分参与疾病过程。

关于两个结合结构域在Fc的两端的报道，中国专利申请CN101490085A公开了一种具有效应功能的单链多价结合蛋白，其中第一结合结构域与第二结合结构域均源自免疫球蛋白，第一结合结构域与第二结合结构域分别在Fc的两端。除此之外，中国专利申请CN104159926A公开了一种包含补体抑制结构域、VEGF抑制结构域的融合蛋白，补体抑制结构域、VEGF抑制结构域可以在Fc的两端，也可以在Fc的一端。

鉴于VEGF和FGF(尤其是FGF-2)在肿瘤血管新生中的重要作用，我们认为双重拮抗VEGF和FGF(尤其是FGF-2)的大分子蛋白药物将能够更好地抑制肿瘤血管的新生，在临床上得到更好的治疗效果。中国专利ZL201110131029.X公开了一种VEGFR和FGFR的双靶标融合蛋白，将VEGFR和FGFR的血管新生抑制单元融合在一起，形成了抑制双重靶标进而抑制血管新生的融合蛋白，获得了特别好的效果。

尽管现有技术在本领域已经取得了上述进展，但是仍然需要稳定性更高、亲和力更强的血管新生抑制剂。本发明人出人意料地发现，将血管新生抑制单元(例如VEGFR和FGFR的结构域)放在融合蛋白的两端，可减少相互之间的影响，提高稳定性并且增强亲和力，进一步改进血管新生抑制效果。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了一种双特异性融合蛋白，其从N端到C端依次包含：特异性结合血管新生因子的第一靶向结合域、中间桥连结构域和特异性结合血管新生因子的第二靶向结合域，其中：所述第一靶向结合域包含：一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免疫球蛋白样结构域；所述中间桥连结构域为免疫球蛋白Fc区；和所述第二靶向结合域包含：一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免疫球蛋白样结构域。

在一些实施方案中，所述一个或更多个VEGF受体的免疫球蛋白样结构域独立地选自：VEGFR1或VEGFR2的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第二免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第四免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第五免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第六免疫球蛋白样结构域或其一部分、和VEGFR1或VEGFR2第七免疫球蛋白样结构域或其一部分。

在另一些实施方案中，所述一个或更多个FGF受体的免疫球蛋白样结构域独立地选自：FGFR1第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域或其一部分和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域或其一部分。

在又一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1 Fc区。

在一些具体实施方案中，所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)：VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)：FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域；或者

所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)：FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)：VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域。

在一些具体实施方案中，所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)或由其组成：VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)或由其组成：源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域；或者

所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)或由其组成：源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)或由其组成：VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域。

特别地，本发明的融合蛋白中所述的源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分之氨基酸序列对应于SEQ ID NO：3中起点为选自第119至151位的氨基酸至终点为第162位氨基酸的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO：3第134至162位、145至162位、148至162位、149至162位或151至162位所示的氨基酸序列，更优选为SEQ ID NO：3第148至162位所示的氨基酸序列。

在另一些具体实施方案中，所述VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ IDNO：1第151至214位相对应的氨基酸序列；所述VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQID NO：2第224至320位相对应的氨基酸序列；所述FGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：3第163至247位相对应的氨基酸序列；和所述FGFR1第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：3第270至359位相对应的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白具有抑制血管新生的活性。

在另一些实施方案中，相比于Fc区在融合蛋白之C端的融合蛋白，本发明的融合蛋白表现出提高的稳定性和/或提高的活性。例如，相比于Fc区在融合蛋白之C端的融合蛋白，本发明的融合蛋白表现出稳定性提高至少10％、20％、30％、40％、或50％和/或活性提高至少10％、20％、30％、40％、或50％。

在一些特定的实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由其组成：

(1)SEQ ID NO：6、8、10和12中任一项所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO：7、9、11和13中任一项所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(2)与SEQ ID NO：6、8、10和12中任一项所示氨基酸序列有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性；或者

(3)由与SEQ ID NO：7、9、11和13中任一项所示核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性。

在另一个方面，本发明提供了编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子。

在另一个方面，本发明提供了包含本发明核酸分子的载体。

在又一个方面，本发明提供了用本发明的载体转染的细胞，优选CHO细胞。

在又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白，以及可药用载体。

在又一个方面，本发明提供了根据本发明的融合蛋白或药物组合物在制备用于在哺乳动物中抑制血管新生的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供了根据本发明的融合蛋白或药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的药物中的用途，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。

在又一个方面，本发明提供了根据本发明的融合蛋白或药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的药物中，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。

在又一个方面，本发明提供了治疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的根据本发明的融合蛋白或药物组合物。优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。

本发明涉及一种双靶标融合蛋白，其包含三个结构域，第一靶向结合域、中间桥连结构域、第二靶向结合域。

在一些实施方案中，所述第一靶向结构域为衍生自VEGFR胞外区的部分或衍生自FGFR胞外区的部分，第二靶向结合域为衍生自FGFR胞外区的部分或衍生自VEGFR胞外区的部分。

特别地，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包括VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3的胞外区部分。

特别地，所述衍生自FGFR胞外区的部分包括FGFR1和/或FGFR2和/或FGFR3和/或FGFR4的胞外区部分。

在又一些实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含选自下列的一项或多项或者由其组成：VEGFR的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第二免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第四免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第五免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第六免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第七免疫球蛋白样结构域或其一部分。

在又一些实施方案中，所述衍生自FGFR胞外区的部分包含选自下列的一项或多项或者由其组成：FGFR的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二免疫球蛋白样结构域或其一部分、FGFR第三免疫球蛋白样结构域或其一部分。特别地，本发明的融合蛋白所包含的结构域和/或区段等之间可以直接连接和/或通过接头连接，在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白包含所述源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分，优选地，所述源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分不包括酸性盒(acidic box，AB)。

具体地，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包括VEGFR1和/或VEGFR2的第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR1和/或VEGFR2的第三免疫球蛋白样结构域。更具体地，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包括VEGFR1的第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2的第三免疫球蛋白样结构域。

在一个实施方案中，本发明所述的VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQID NO：1第151至214位相对应的氨基酸序列，本发明所述的VEGFR1第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：1第230至327位相对应的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述的VEGFR2第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQID NO：2第141至207位相对应的氨基酸序列，本发明所述的VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：2第224至320位相对应的氨基酸序列。

在一些具体实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区部分还包括VEGFR1的第一免疫球蛋白样结构域。优选地，所述VEGFR1的第一免疫球蛋白样结构域具有与SEQ ID NO：1第32到123位相对应的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO：1第32到123位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述衍生自FGFR胞外区部分包括FGFR1第二Ig样结构域或其一部分、第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、以及源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中所述的源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分之氨基酸序列对应于SEQ ID NO：3中起点为选自第119至151位的氨基酸至终点为第162位氨基酸的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO：3第134至162位、145至162位、148至162位、149至162位或151至162位所示的氨基酸序列，更优选为SEQ ID NO：3第148至162位所示的氨基酸序列。

在另一些实施方案中，所述的FGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有与SEQ ID NO：3第163至247位相对应的氨基酸序列，所述的FGFR1第三免疫球蛋白样结构域具有与SEQ IDNO：3第270至359位相对应的氨基酸序列。

更具体地，衍生自FGFR胞外区部分还包括FGFR1的第一Ig样结构域或一部分。其中所述FGFR1的第一免疫球蛋白样结构域具有与SEQ ID NO：3第40至118位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：3第40至118位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少为80％、90％、93％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。

在又一个实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分为图3 VR M1-M5所示的氨基酸序列，或者与图3VR M1-M5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在又一个实施方案中，所述衍生自FGFR胞外区的部分为图4 FR M1-M10所示的氨基酸序列，或者与图4FR M1-M10所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

中间桥连结构域

在本发明的一些实施方案中，所述中间桥连结构域包括免疫球蛋白结构域、亮氨酸拉链(Leucine zipper)等。特别地，所述免疫球蛋白结构域为免疫球蛋白Fc结构域，优选人IgG Fc区，更优选地是人IgG 1的Fc区，再优选地其具有：与SEQ ID NO：4相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：5相对应的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：5的核苷酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

接头

在一些实施方案中，所述第一靶向结合域、所述第二靶向结合域直接或通过接头融合到所述中间桥连结构域的N端或C端。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的融合蛋白从N端到C端可包含：第一靶向结合域-接头-中间桥连结构域-第二靶向结合域，第一靶向结合域--中间桥连结构域-接头-第二靶向结合域，第一靶向结合域-接头-中间桥连结构域-接头-第二靶向结合域，或者第一靶向结合域--中间桥连结构域-第二靶向结合域。

在一些实施方案中，所述接头为短肽接头，例如可选自：GS、PPP、SGGGGSE、DKTHTS、(GGGGS)n(其中n为1-19)、AAAGSGGASAS、AAAGS、GXaaGGGSGASAS(其中Xaa为任意氨基酸)、AAAGSGXaaSGASAS(其中Xaa为任意氨基酸)、ASGGGGSGGGGA、GGGGSGGGGA、ASGA、和GGGGGG。优选地，所述接头可选自：ASGGGGSGGGGA、(GGGGS)n(其中n为1-19，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或其任意区间)、GGGGSGGGGA、ASGA和GGGGGG。

本发明人出人意料地发现，仅仅通过调整靶向结合域与中间桥连结构域(例如Fc区)的顺序，就出人意料地使得本发明的融合蛋白在稳定性和结合亲和力方面得到了显著的改善。具体地，本发明的融合蛋白在37℃放置15天后，纯度下降不超过1.5％，与对照下降了约12％相比，稳定性有意料不到的改善。

附图说明：

图1 ELISA法测融合蛋白与FGF-2的结合能力。

图2融合蛋白的VEGF端细胞活性测定结果。

图3所示为VEGFR胞外区M1-M5的氨基酸序列。“......”表示与M1所示序列一致，“-”表示不含该序列。

图4所示为FGFR胞外区M1-M10的氨基酸序列。“......”表示与M1所示序列一致，“-”表示不含该序列。

图5所示为SDS-PAGE法测S1融合蛋白的稳定性。

具体实施方式

定义：

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。特别地，本文所使用术语的含义还可参见中国专利申请201110131029.X。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

本文使用的术语“Fc”、“Fc区”、“Fc片段”或“免疫球蛋白Fc区”等表示免疫球蛋白的可结晶片段，在本发明中，所述Fc区优选人IgG1的Fc区。

本文使用的术语“可溶性”蛋白是指在生物学相关的温度、pH水平和渗透压下可溶于水溶液的蛋白。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白是可溶性蛋白。本文使用的“可溶性融合蛋白”表示该融合蛋白不包含跨膜区和胞内区。

如本文所用，术语“分离的”是指以下物质和/或实体，(1)与起初产生时(在天然环境中和/或在试验设置中)和其相关联的至少一些组分相分离和/或(2)通过人工生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本100％或100％的其初始相关联的其他组分相分离。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白是分离的融合蛋白。

术语“部分”和“片段”可互换的指代多肽、核酸或其它分子构建物的一部分。

本文使用的术语“Ig样结构域”或者“免疫球蛋白样结构域”可互换使用，其表示本发明的蛋白中与免疫球蛋白结构类似的结构域。所述Ig样结构域可见于多种蛋白质家族，参与多种生物学功能，包括细胞-细胞识别、细胞表面受体、免疫功能等等。

本文使用的术语“FGFR”表示成纤维细胞生长因子受体，其可以是FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4。优选地，本发明中的FGFR是FGFR1，更优选人FGFR1。例如“FGFR1”表示成纤维细胞生长因子受体1。

本文使用的术语“FGFR Ig样结构域中间功能性序列区”或“FGFR Ig样结构域中间功能性序列”或“IFS”表示FGFR蛋白中第一Ig样结构域和第二Ig样结构域之间的序列。优选地，IFS序列具有对应于SEQ ID NO：3第119至162位的氨基酸序列。本发明人出乎意料地发现，所述中间功能性序列区对于Ig样结构域的功能具有显著的影响。在一些实施方案中，本发明提供了FGFR融合蛋白，其包含多种不同长度的源自所述中间功能性序列区的部分，特别优选地源自所述中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。更优选地，所述源自IFS的部分具有与SEQ ID NO：3第134至162位、145至162位、148至162位、149至162位或151至162位对应的氨基酸序列。所述FGFR蛋白优选FGFR1(SEQ ID NO：3)，特别是人FGFR1蛋白。

本文使用的术语“酸性盒(acidic box)”表示在上述IFS中由8个酸性氨基酸组成的区段，即序列为EDDDDDDD的区段。具体地，其为FGFR1(SEQ ID NO：3)的127到133位序列。

本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

本文使用的术语“一致性”、“百分比一致性”、“同源性”或“同一性”指两个氨基酸序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可以通过比对两个序列来确定百分比一致性，百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基(即氨基酸或核苷酸)的数量。可使用本领域的标准算法(例如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482；Needleman和Wunsch，1970，J.MoI.Biol.48：443；Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：2444)或者通过这些算法的计算机化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，WI)进行序列比对和比较，所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院(BethesdaMD)可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各个程序(例如BLASTN，在美国国家生物技术信息中心的因特网站点上可用)的缺省参数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为1的GCG来确定两个序列的百分比同一性，使得每个氨基酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序(2.0版)，其是GCG(Aceelrys，San Diego，CA)序列比对软件包的一部分。

下面给出hFGFR1的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，可参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH15035.1

MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVE SDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPVAPYWTSPEKMEKK RSPHRPILQAGLPANKTVALGS LEER

FGFR1的氨基酸序列可参见SEQ ID NO：3。

本文使用的术语“VEGFR”表示血管内皮细胞生长因子受体，其可以是VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3。优选地，本发明中的VEGFR是VEGFR1和/或VEGFR2，优选人的VEGFR。例如“VEGFR1”表示血管内皮细胞生长因子受体1。

下面给出hVEGFR1的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，各结构域之间为天然连接序列。hVEGFR1的具体序列可参见http://www.uniprot.org/uniprot/P17948：

SKLKD IYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTE LYKTNYLTHRQTNTI IYDKAFI LIVNVK DV IRDQEA VQGTSDKSNLE

VEGFR1的氨基酸序列可参见SEQ ID NO：1。

下面给出hVEGFR2的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，各结构域之间为天然连接序列。hVEGFR2的具体序列可参见http://www.uniprot.org/uniprot/P35968

ASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKA ASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITE SYQSIMYIVVVVGYRI FVRVHEK LVVYVP RG VLERVA IEGAQEKTNLE

VEGFR2的氨基酸序列可参见SEQ ID NO：2。

本文使用的术语融合蛋白或部分或结构域“与SEQ ID NO：N对应的氨基酸序列”表示，所述融合蛋白或部分或结构域具有基本上如SEQ ID NO：N所示的氨基酸序列，优选地其中含有不超过1、2、3、4、5、10或20个氨基酸替换、添加或缺失，又优选地所述融合蛋白或部分或结构域具有与SEQ ID NO：N所示氨基酸序列至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％的同一性，更优选地，所述融合蛋白或部分或结构域具有SEQ ID NO：N所示氨基酸序列。

本发明的所述的“接头”可以是本文公开的任意融合蛋白的成分的接头。在一些实施方案中，该接头用在第一靶向结合域和桥连结构域之间或第二靶向结合域和桥连结构域之间。在一些实施方案中，融合多肽包含至少一个接头，但不超过两个接头，例如，融合多肽可以从N端到C端按以下顺序排列：1)第一靶向结合域-接头-桥连结构域-第二靶向结合域；2)第一靶向结合域-接头-桥连结构域-接头-第二靶向结合域；3)第一靶向结合域-桥连结构域-接头-第二靶向结合域。

在所述方法的一些实施方案中，可一起(同时)或在不同时间(依次地)施用一种或多种VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。另外，所述融合蛋白可与另一类治疗癌症或抑制血管新生的药物一起施用。

在一些实施方案中，本公开的主题方法可单独使用。或者，可将所述主题方法与其它用于治疗或预防增殖性疾病(例如肿瘤)的常规抗癌治疗法组合使用。例如，这些方法可用于预防癌症、预防癌症复发和手术后转移，以及作为其它癌症治疗的辅助手段。本公开表明，可通过使用目标多肽治疗剂来增强常规癌症治疗(例如，化疗、放疗、光疗、免疫疗法和手术)的有效性。

施用

本发明中的融合蛋白可以单独施用，但优选地作为药物组合物施用，其通常包括根据施用的计划方式所选的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体。融合蛋白可以通过任何适合的方式适用于需要治疗的患者。精确的计量将取决于多个因素，包括该融合蛋白精确的性质。

一些合适的使用方式包括(但不限于)口服、直肠、鼻部、局部(包括口腔和舌下)、皮下、阴道或胃肠外的(包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内和硬脑膜外)施用。

对于静脉注射和在病痛位置的注射，活性成分将为一种胃肠外接受的水溶液形式，其不含热源并具有合适的pH值、等张性和稳定性。

本领域中相关技术人员可使用适当的溶剂或制剂配制融合蛋白，例如：等张赋形剂如氯化钠注射液、林格氏注射液，乳酸林格氏注射液。根据要求，可以加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或口服液等形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

以上所提到的技术和方案的例子以及其它一些根据本发明所使用的技术和方案可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.(ed)，1980.中找到。

实施例1 双靶标融合蛋白重组表达质粒的构建

1.制备VEGFR和FGFR的DNA片段

VEGF受体和FGF受体cDNA片段通过合成而获得(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，序列见SEQ ID NO：14，SEQ IN NO：16。合成的cDNA片段是直接合成至PUC57-载体上(所述载体可购自南京金斯瑞生物科技有限公司)。

2.制备长接头Fc的DNA片段

合成Fc-cDNA序列，所合成的Fc前后均带有接头(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，其合成至载体HX1上(所述载体可购自南京金斯瑞生物科技有限公司)，从而得到带有长接头的Fc DNA片段，在本文中也被称为Fc long。具体地，前后接头分别为：ASGGGGSGGGGA和GGGGSGGGGA。Fc的cDNA序列参见SEQ ID NO：5。

3.制备短接头Fc的DNA片段

以Fc long为模板，设置不同的引物进行PCR扩增可获得带有不同接头的Fc片段，从而构建出带有不同接头的中间桥连结构域。

以合成的Fc long为模板，使用下表1中所示引物(如SEQ ID NO：18和19所示)进行PCR扩增，从而得到短接头Fc的DNA序列，即-ASGA-Fc-ASGA-片段，其在本文中也被称为Fcshort。

表1

引物名称	引物
		Fc-short-Primer-5：	AATTGCTAGCGGAGCTGACAAAACTCAC
Fc-short-Primer-3：	TAATGGGCCCCAGAGGCTTTACCCGGAGACAGGGAG

PCR扩增的条件为：98℃预变性5min，98℃变性15s，然后于72℃退火1min，72℃延伸5min，共进行32个循环。扩增完成后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化回收PCR扩增片段。用NheI/NaeI同时酶切PCR产物和HX1表达载体，置37℃进行酶切反应1小时以上，使用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司)回收目的片段。将回收的目的片段使用连接酶(New England BioLabs)于室温连接1小时，将连接产物通过热激转化的方法转入大肠杆菌感受态细胞中。挑菌进行DNA测序验证，证实得到了上述片段。

4.引入第一靶向结合域

将第3步获得的质粒与第1步合成的PUC57-FGFR或者PUC57-FltKdr(即，VEGFR)同时用NheI和BSPQI进行酶切。酶切体系为质粒1μg/μl 40μl，10Xcutsmart 5μl，NheI-HF 1.5μl，加水至50μl，置37℃进行酶切反应1小时以上，再加1.5μl的BSPQI反应1小时以上。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，并用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司)回收目的片段。将回收的目的片段使用连接酶(New England BioLabs)于室温连接1小时，将连接产物通过热击转化的方法转入大肠杆菌感受态中。挑菌进行DNA测序验证，证实得到了Fc分别与FGFR或者VEGFR相连的片段。

5.引入第二靶向结合域

以PUC57-FGFR，PUC57-FltKdr为模板，使用下表中所示引物(如SEQ ID NO：20、21、22和23所示)，进行PCR扩增，PCR引物中引入了酶切位点，PspoMI和NaeI。

表2

FltKdr-Primer-5：	AATTCGGCCGGAAGACCCTTCGTGGAG
		FltKdr-Primer-3：	TAATGCCGGCTTATCACTTCTCGTGCACTCTCACG
FGFR-Primer-5：	AATTGGGCCCCTGTGGCTCCATACTGG
		FGFR-Primer-3：	TAATGCCGGCTTATCAAGCCTCCAACACGGTCAG

PCR反应条件与第3步相同。PCR反应完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，并用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司)回收目的片段。

使用内切酶PspoMI和NaeI同时酶切PCR反应产物和上一步获得的质粒，于室温反应1h，跑胶纯化，并用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司)回收目的片段。将回收的目的片段使用连接酶(New England BioLabs)于室温连接1小时，将连接产物通过热击转化的方法转入大肠杆菌感受态中。挑菌进行DNA测序验证，证实得到了Fc的两端分别与FGFR或者VEGFR相连的片段。

根据以上方法分别构建得到融合蛋白S1，S2，S3，S4，其所对应的氨基酸序列和核苷酸序列见下表3a，其结构如表3b所示。

表3a 融合蛋白对应的序列

表3b 融合蛋白的结构

融合蛋白名称	结构
		S1	VEGFR-Fc long-FGFR
S2	VEGFR-Fc short-FGFR
		S3	FGFR-Fc long-VEGFR
S4	FGFR-Fc short-VEGFR

实施例2 融合蛋白的瞬时表达

用MAX质粒提纯试剂盒(QIAGEN)提纯相应融合蛋白质粒DNA，用紫外分光光度计确定质粒DNA的浓度，将重组质粒1μg和6μL脂质体(FuGENE 6 Transfection Reagent，Roche公司)于100μL新鲜IMDM培养液(GIBCO公司)中混匀，静置15分钟后加入按细胞密度3×10⁵/mL接种于6孔板过夜培养的CHO细胞(ATCC)中，细胞完全培养液含88％IMDM、10％的FBS、1％HT和1％谷氨酰胺(均为GIBCO公司产品)，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时后收集上清，用人IgG ELISA蛋白定量试剂盒(BETHYL公司)确定CHO分泌表达融合蛋白的相对含量。

实施例3 融合蛋白的结合亲和力测定

使用ELISA法检测以上构建的融合蛋白与VEGF和FGF-2的结合能力。用20ng/孔的VEGF或50ng/孔FGF-2包板，100μl/孔，2-8℃过夜。洗板机洗板3次。3％BSA-PBST溶液封闭，37度2h。洗板机洗板3次。加样：用PBST溶液稀释标线从10000ng/ml(VEGF包板时)或50000ng/ml(FGF包板时)起梯度稀释9个点，100μl/孔，37度1h。洗板机洗板3次。用PBST溶液稀释二抗(Goat anti-human IgG-Fc-HRP)5000倍，。加入TMB显色液显色，室温避光显色5min。用2M H₂SO₄终止试验，450nm酶标仪读取光密度吸收值。其中，以VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白构建体作为对照，即中国专利CN102219859B中的#28构建体。

本发明的融合蛋白与VEGF的结合能力见下表5。结果显示，本发明的融合蛋白与VEGF的结合能力均显著好于对照。

表5 与VEGF的结合能力

本发明融合蛋白与FGF-2的结合能力见下表6及图1。由结果可知，本发明的融合蛋白S1、S3与FGF-2的结合能力均好于对照(#28构建体)。

表6 与FGF-2的结合能力

实施例4 融合蛋白的细胞活性试验

人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)分裂试验检验融合蛋白抑制血管内皮细胞的分裂能力。

使用HUVEC完全培养基(购自上海澳赛尔斯生物技术有限公司)于37℃，5％CO2培养箱中培养HUVEC细胞(购自上海澳赛尔斯生物技术有限公司)至细胞对数生长期。用胰酶消化计数HUVEC细胞，将HUVEC细胞悬液分别用含VEGF 40ng/mL稀释至70000个/mL。将稀释好的细胞悬液以每孔100μL加入到96孔板中(每孔细胞数为7000个)。37℃、CO2培养箱孵育过夜。

按下表7中的药物浓度进行稀释，以100μL/孔的量加入到96孔板中，每个浓度3个复孔，设置空白对照(加等量培养基)。置于37℃二氧化碳恒温培养箱中培养72h。药物作用72h后，加入含CCK-810％的无血清1640培养基(DOJINDO公司)100μL/孔。37℃、CO2培养箱孵育1h，使用酶标仪测450nm处OD值。根据吸光度的差异确定融合蛋白抑制VEGF或FGF-2诱导的血管内皮细胞分裂的能力。

表7 VEGF端测活药物加样浓度梯度

结果见图2，S3VEGF端的细胞活性要明显高于对照。

实施例5融合蛋白的稳定性试验

a)HPLC法检测

将制备好的样品放置在37℃中进行加速稳定性试验，分别加速0天、1天、3天、7天、15天，加速样品取出后置于-80℃保存待检。然后用HPLC(安捷伦1200液相色谱仪)检测融合蛋白的纯度，色谱柱为TSK-G3000。

具体操作步骤如下：1)流动相配制20mM磷酸钠溶液，0.3M NaCl，pH6.8，0.45μm微孔过滤膜滤过，待用。2)样品准备样品稀释至1mg/mL，上样量25μL；3)色谱条件见表8，按峰面积归一化法进行计算，结果见下表9。

表8 HPLC色谱条件

表9 HPLC法测得的样品纯度

由表9可知，对照样品37℃放置15天后，纯度下降非常明显。不论是下降幅度还是最终纯度，本发明的融合蛋白均显著优于对照。具体地，对照的纯度下降了12.3％(95％-82.7％＝12.3％)，而本发明制备的样品S1-S4在37℃放置15天后，纯度下降非常轻微，仅为约0.5％-1.5％。由此可知，本发明制备的样品稳定性得到了极大的改善。

b)SDS-PAGE法检测

将制备好的S1样品与对照样品同时放在-80℃、4℃、25℃、37℃中进行加速，14天后取出，SDS-PAGE法检测。检测结果见图5。

由图5可知，S1样品明显比对照样品稳定，降解条带少，特别是在25℃、37℃放置14天后，对照样品降解非常明显，而S1样品仍非常稳定，几乎无降解。由此可知，本发明制备的S1样品稳定性得到了极大的改善。

本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。

参考文献

[1]Hanahan D，Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell，2000，100(1)：57-70.

[2]Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and itsreceptors.Nat Med.2003，9：669-76.

[3]Ferrara N.Vascular endothelial growth factor as a target foranticancer therapy.Oncologist.2004，1：2-10.

Claims

1.双特异性融合蛋白，其从N端到C端依次包含：特异性结合血管新生因子的第一靶向结合域、中间桥连结构域和特异性结合血管新生因子的第二靶向结合域，其中

所述第一靶向结合域包含：一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免疫球蛋白样结构域；

所述中间桥连结构域为免疫球蛋白Fc区；和

所述第二靶向结合域包含：一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免疫球蛋白样结构域。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述一个或更多个VEGF受体的免疫球蛋白样结构域独立地选自：VEGFR1或VEGFR2的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第二免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第四免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第五免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第六免疫球蛋白样结构域或其一部分、和VEGFR1或VEGFR2第七免疫球蛋白样结构域或其一部分。

3.权利要求1的融合蛋白，其中所述一个或更多个FGF受体的免疫球蛋白样结构域独立地选自：FGFR1第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域或其一部分和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域或其一部分。

4.权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1 Fc区。

5.权利要求1-4中任一项的融合蛋白，其中

所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)：VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)：FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域；

或者

6.权利要求5的融合蛋白，其中：

所述VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：1第151至214位相对应的氨基酸序列，

所述VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：2第224至320位相对应的氨基酸序列，

所述FGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：3第163至247位相对应的氨基酸序列，和

所述FGFR1第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO：3第270至359位相对应的氨基酸序列。

7.前述任一项权利要求的融合蛋白，所述蛋白具有抑制血管新生的活性。

8.前述任一项权利要求的融合蛋白，所述蛋白包含或由其组成：

9.编码前述任一项权利要求的融合蛋白的分离的核酸分子。

10.包含权利要求9的核酸分子的载体。

11.用权利要求10的载体转染的细胞，优选CHO细胞。

12.一种药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项的融合蛋白，以及可药用载体。

13.权利要求1-8中任一项的融合蛋白或权利要求12的药物组合物在制备用于在哺乳动物中抑制血管新生的药物中的用途。

14.权利要求1-8中任一项的融合蛋白或权利要求12的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的药物中的用途，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。