KR102304114B1 - Ny-eso에 대한 고친화력 tcr - Google Patents

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Abstract

본 발명은 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합되는 특성을 구비하고; 또한 상기 TCR이 상기 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 결합 친화력은 적어도 야생형 TCR이 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 결합 친화력의 2배인 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 유형의 TCR와 치료제의 융합 분자를 제공한다. 이러한 유형의 TCR은 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 종양 세포를 표적화 제시하기 위해 단독으로 사용될 수 있고, 치료제와 함께 병용될 수도 있다.

Description

NY-ESO에 대한 고친화력 TCR
본 발명은 생물 기술 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 NY-ESO-1 단백질 유래의 폴리펩티드를 식별할 수 있는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 수용체의 제조 및 용도에 관한 것이다.
특이적인 방식으로 항원을 식별할 수 있는 분자에는 2가지 유형만이 존재한다. 하나는 면역 글로블린 또는 항체이고; 다른 하나는 T 세포 수용체(TCR)이며, 이는 α사슬/β사슬 또는 γ사슬/δ사슬에 의해 헤테로다이머(heterodimer) 형식으로 존재하는 세포막 표면의 당단백질이다. 면역 계통의 TCR 총 스팩트럼의 조성은 흉선에서 V(D)J에 의해 재조합된 후, 양성 및 음성의 선택에 의해 생성된다. 말초 환경에서, TCR은 조직 적합성 복합체-펩티드 복합체(pMHC)에 대한 T 세포의 특이적인 식별을 매개하여, 이의 면역 계통의 세포 면역 기능에 있어서 매우 중요하다.
TCR은 주조직 적합성 복합체(MHC)의 특이적인 항원 펩티드에 존재하는 유일한 수용체로서, 이러한 외인성 펩티드 또는 내인성 펩티드는 세포에서 이상이 나타나는 유일한 현상일 수 있다. 면역 체계에서, 항원 특이적인 TCR과 pMHC 복합체의 결합에 의해 T 세포와 항원과 항원 제시 세포(APC)의 직접적인 물리적 접촉을 유발한 후, T 세포 및 APC 양자의 다른 세포막 표면 분자가 상호 작용하여, 일련의 후속적인 세포 신호 전달과 다른 생리적 반응을 일으켜, 상이한 항원 특이적인 T 세포가 이의 표적 세포에 면역 효과를 발휘하도록 하였다.
TCR에 대응되는 MHC I유형과 II유형의 분자 리간드도 면역 글로블린 슈퍼패밀리의 단백질이지만, 항원의 제시에 특이적이고, 상이한 개체가 상이 MHC를 가지므로, 하나의 단백질 항원 내의 상이한 올리고펩티드가 각각의 APC 세포 표면에 제시될 수 있다.인간의 MHC를 통상적으로 HLA 유전자 또는 HLA 복합체라고 한다.
올리고펩티드 SLLMWITQC는 다양한 종양 세포에 의해 발현된 NY-ESO-1 단백질(Chen et al.,(1997)PNAS USA 94 1914-1918)에서 유래된다. 종양 세포의 Ⅰ형 HLA 분자 제시는 SLLMWITQC를 비롯한 NY-ESO-1 유래의 올리고펩티드를 포함한다. 따라서, SLLMWITQC-HLA A2 복합체는 종양 세포 표지를 표적화할 수 있는 TCR을 제공하였다. SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합될 수 있는 TCR은 종양의 치료에 대한 높은 적용 가치를 가지고 있다. 예를 들어, 상기 종양 세포 표지를 표적화할 수 있는 TCR은 상기 TCR을 발현하는 T 세포를 파괴할 수 있도록 세포 독성제 또는 면역 자극제를 표적 세포에 전달하거나, T 세포에 형질 전환하여, 양자 면역 치료로 불리는 치료 과정에서 환자에게 투여될 수 있다. 전자의 목적에 관하여, 이상적인 TCR은 비교적 고친화력을 가진 것으로, 상기 TCR이 표적화된 세포 상에 장기간 존재하게 할 수 있다. 후자의 목적에 관하여, 바람직하게 중등 친화력의 TCR을 사용한다. 따라서, 당업자는 상이한 목적을 만족할 수 있는 종양 세포 표지를 표적화하는 TCR 개발에 전념하고자 한다.
본 발명의 목적은 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 고친화력을 가진 TCR을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유형의 TCR의 제조 방법 및 상기 유형의 TCR의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 있어서, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합되는 활성을 구비한 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다.
다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 T 세포 수용체(TCR)는 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합되는 활성을 구비하고, 또한 상기 T 세포 수용체는 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하며, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 3개의 CDR영역의 기준 서열은 하기와 같으며,
CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDANGKII, 또한 하기의 돌연변이 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고,
Figure 112019064965532-pct00001
및/또는, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하며, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 CDR영역의 기준 서열은 하기
와 같고,
CDR1β: SGHDY
CDR2β: FNNNVP
CDR3β: ASSLGSNEQY, 또한 하기의 돌연변이 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
Figure 112019064965532-pct00002
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRα사슬 CDR 영역의 돌연변이 개수는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개일 수 있다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRβ사슬 CDR 영역의 돌연변이 개수는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개일 수 있다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 본 발명의 T 세포 수용체(TCR)는 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3α은 [3αX1][3αX2]D[3αX3][3αX4][3αX5][3αX6][3αX7][3αX8] 서열을 포함하고, 여기서, [3αX1], [3αX2], [3αX3], [3αX4], [3αX5], [3αX6] , [3αX7], [3αX8]은 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX1]은 A 또는 M이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX2]는 T 또는 Y이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX3]은 A 또는 E 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX4]는 N 또는 F 또는 Y 또는 W이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX5]는 G 또는 A 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX6]은 K 또는 W 또는 R 또는 T 또는 S 또는 M 또는 L이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX7]은 I 또는 W 또는 V 또는 Y 또는 P이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX8]은 I 또는 N 또는 E 또는 D 또는 Q 또는 V 또는 K 또는 G 또는 M 또는 S이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX1]은 A이고, [3αX2]는 T이며, [3αX3]은 A이고, [3αX4]는 N 또는 F 또는 W이며, [3αX5]는 A이고, [3αX6]은 W 또는 R이며, [3αX7]은 W이고, [3αX8]은 I 또는 N 또는 E 또는 D이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3α는ATDANARWN, ATDANARWE, ATDANARWD, ATDAFAWWI 및 ATDAWARWI로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR1α는 [1αX1][1αX2][1αX3][1αX4]N 서열을 포함하고, 여기서, [1αX1], [1αX2], [1αX3], [1αX4], [1αX5]는 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX1]은 T 또는 G이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX2]는 S 또는 W이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX3]은 I 또는 A 또는 V이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX4]는 N 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX1]은 G이고, [1αX2]는 S 또는 W이며, [1αX3]은 I 또는 A 또는 V이고, [1αX4]는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR1α는 GSIQN, GWAQN, GWVQN 및 TSINN로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2α는 IR [2αX1][2αX2][2αX3][2αX4]E 서열을 포함하고, 여기서, [2αX1], [2αX2], [2αX3], [2αX4]는 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX1]은 S 또는 T이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX2]는 N 또는 G이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX3]은 E 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX4]는 R, A 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2α는 IRTGEQE, IRTGQAE 및 IRSNERE로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하며, 여기서 상기 CDR1β는 SGHDY 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2β는 FN[2βX1][2βX2][2βX3][2βX4] 서열을 포함하고, 여기서, [2βX1], [2βX2], [2βX3] 및 [2βX4]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX1]은 N 또는 H이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX2]는 N 또는 G이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX3]은 V 또는 A이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX4]는 P 또는 V이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2β는 FNHGAV 및 FNNNVP로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3β는 AS[3βX1][3βX2]G[3βX3]NEQY 서열을 포함하고, 여기서, [3βX1], [3βX2], [3βX3]는 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3βX1]은 S, Q 또는 M이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3βX2]는 L, R, K, 또는 M이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3βX3]은 S, A, G 또는 P이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3β는 ASQRGSNEQY, ASQKGANEQY, ASQLGSNEQY, ASQLGANEQY, ASQLGGNEQY, ASQLGPNEQY, ASQRGANEQY, ASQMGSNEQY, ASQMGANEQY 및 ASMLGSNEQY로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 TCRα사슬 가변 도메인은 CDR1α: TSINN; CDR2α: IRSNERE; 및 CDR3α: ATDANGKII와 같은 CDR을 동시에 포함하지 않는다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 TCRβ사슬 가변 도메인은 CDR1β: SGHDY; CDR2β: FNNNVP; 및 CDR3β: ASSLGSNEQY와 같은 CDR을 동시에 포함하지 않는다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 돌연변이는 α사슬 및/또는 β사슬 가변 도메인의 하나 또는 복수의 CDR 영역에서 일어난다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 돌연변이는 α사슬의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에서 일어나고, 및/또는 상기 돌연변이는 β 사슬의 CDR2 및/또는 CDR3에서 일어난다.
본 발명의 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 2배이고; 바람직하게, 적어도 5배이며; 더욱 바람직하게, 적어도 10배이다.
다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 50배이고; 바람직하게, 적어도 100배이며; 더욱 바람직하게, 적어도 1000배이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 104배이고; 바람직하게, 적어도 105배이며; 더욱 바람직하게, 적어도 106배이고; 가장 바람직하게, 적어도 107배이다.
구체적으로, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 KD ≤ 20 μM이고;
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 5μM ≤ KD ≤ 10 μM이며; 바람직하게, 0.1 μM ≤ KD ≤ 1 μM이고; 더욱 바람직하게, 1 nM ≤ KD ≤ 100 nM 이며;
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 100 pM ≤ KD ≤ 1000 pM이고; 바람직하게, 10 pM ≤ KD ≤ 100 pM; 더욱 바람직하게, 1 pM ≤ KD ≤ 10 pM이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 하기로부터 선택되는 CDR을 구비한다.
Figure 112019064965532-pct00003
Figure 112019064965532-pct00004
Figure 112019064965532-pct00005
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 가용인것이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 αβ 이형질 이합체 TCR 또는 단일 사슬 TCR이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 본 발명의 TCR은 αβ 이형질 이합체 TCR이고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더욱 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 바람직하게, 적어도 92 %; 더욱 바람직하게, 적어도 94 %; 가장 바람직하게, 적어도 97 %; (예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은, (ⅰ)이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ⅱ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함하고, 여기서, (ⅰ) 및 (ⅱ)은 모두 TCR사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 αβ 이형질 이합체 TCR이고, 상기 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 포함된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 형성되는 시스테인(Cysteine) 잔기는,
TRAV의 46번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손(Exon)1의 60번 아미노산;
TRAV의 47번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산;
TRAV의 46번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산; 또는
TRAV의 47번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 60번 아미노산으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 사이트를 치환하였다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 함유된 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인 및 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 β사슬 불변 도메인을 포함하지만, α사슬 불변 도메인을 포함하지 않고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 β사슬과 이형질 이합체를 형성한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 함유된 TCR은, (ⅰ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ⅱ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함하고, 여기서 (ⅰ) 및 (ⅱ)는 TCR사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 모두 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 αβ 이형질 이합체 TCR이고, 이는, (ⅰ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ⅱ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함하고, 여기서, (ⅰ) 및 (ⅱ)는 TCR사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 모두 포함하며, α사슬 불변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRα와 β사슬의 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 형성되는 시스테인 잔기는,
TRAC*01 엑손1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57;
TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser77;
TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser17;
TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Asp59;
TRAC*01 엑손1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu15;
TRAC*01 엑손1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser54; TRAC*01 엑손1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ala19; 및
TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu20으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 사이트를 치환하였다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 단일 사슬 TCR이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인으로 이루어진 단일 사슬 TCR이고, 상기 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인은 연성 올리고펩티드(oligopeptide) 서열(linker)에 의해 연결된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRα사슬 가변 도메인 및/또는 β사슬 가변 도메인의 소수성 코어(Hydrophobic core)는 돌연변이된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 소수성 코어가 돌연변이된 TCR은 α가변 도메인과 β가변 도메인으로 이루어진 단일 사슬 TCR이고, 상기 α가변 도메인과 β가변 도메인은 연성 올리고펩티드 서열(linker)에 의해 연결된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하고, 본 발명의 TCR의 α사슬 가변 도메인 소수성 코어 아미노산 잔기19A(즉 IMGT에 열거된 α사슬 가변 영역의 19번), 21M(즉 IMGT에 열거된 α사슬 가변 영역의 21번), 79S(즉 IMGT에 열거된 α사슬 가변 영역의 94번) 중의 하나 또는 복수가 돌연변이 되며, 및/또는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인 소수성 코어 아미노산 잔기13T(즉 IMGT에 열거된 β사슬 가변 영역의 13번), 82S(즉 IMGT에 열거된 β사슬 가변 영역의 94번) 중의 하나 또는 복수가 돌연변이된다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하고, 본 발명의 α사슬 가변 도메인 소수성 코어는 아미노산 잔기19V, 21I 및 79V 중의 하나 또는 복수를 포함하며, SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하고, 상기 TCRβ가변 도메인 소수성 코어는 아미노산 잔기13V 및 82V중의 하나 또는 복수를 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 TCRα가변 도메인 소수성 코어의 돌연변이 형식으로 A19V, M21I 및 S79V 중의 하나의 그룹 또는 복수 그룹을 포함하고; 상기 TCRβ가변 도메인 소수성 코어의 돌연변이 형식은 T13V 및 S82V중의 하나의 그룹 또는 복수 그룹을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 본 발명의 TCR은 단일 사슬 TCR이고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더욱 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 바람직하게, 적어도 92 %; 더욱 바람직하게, 적어도 94 %; 가장 바람직하게, 적어도 97 %; (예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9 ~ 37 및 58 ~ 86으로부터 선택되고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 38 ~ 53 및 87 ~ 102로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 하기로부터 선택된다.
Figure 112019064965532-pct00006
Figure 112019064965532-pct00007
Figure 112019064965532-pct00008
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 하기로부터 선택된다.
Figure 112019064965532-pct00009
Figure 112019064965532-pct00010
Figure 112019064965532-pct00011
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 α사슬 및/또는 β 사슬의 C- 또는 N-말단에 접합체가 결합된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR에 결합된 접합체는 검출 가능한 마커, 치료제, PK 변형 부분 또는 임의의 이러한 물질들의 조합이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR에 결합된 치료제는 상기 TCR의 α 또는 β사슬의 C- 또는 N-말단에 결합되는 항-CD3항체이다.
본 발명의 하나의 바람직한 해결수단에서, 상기 T 세포 수용체(TCR)에 있어서, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합되는 활성을 구비하고, TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하며, 상기 TCR은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 α사슬 가변 도메인에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기의 사이트는 27T, 28S, 29I, 30N, 51S, 52N, 53E, 54R, 90A, 91T, 93A, 94N, 95G, 96K, 97I 및 98I 중의 하나 또는 복수를 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:56 또는 1로 표시되는 번호를 사용하고; 및/또는 상기 TCR은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 β사슬 가변 도메인에서 돌연변이되며, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기의 사이트는 51N, 52N, 53V, 54P, 95S, 96L 및 98S 중의 하나 또는 복수를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:57 또는 2로 표시되는 번호를 사용하며;
바람직하게, 돌연변이 후의 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 27G, 28W, 29A 또는 29V, 30Q, 51T, 52G, 53Q, 54Q 또는 54A, 90M, 91Y, 93E 또는 93Q, 94F 또는 94Y 또는 94W, 95A 또는 95Q, 96W 또는 96R 또는 96T 또는 96S 또는 96M 또는 96L, 97W 또는 97V 또는 97Y 또는 97P, 및 98E 또는 98N 또는 98D 또는 98Q 또는 98K 또는 98V 또는 98G 또는 98M 또는 98S로부터 선택되는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하며; 및/또는 돌연변이 후의 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 51H, 52G, 53A, 54V, 95Q 또는 95M, 96R 또는 96K 또는 96M, 및 98A 또는 98G 또는 98P로부터 선택되는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하고, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용한다.
본 발명의 제2 양태에 있어서, 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하고, 그 중의 적어도 하나의 TCR 분자는 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR인 다가 TCR 복합체를 제공하였다.
본 발명의 제3 양태에 있어서, 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR 분자 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 다가 TCR 복합체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하였다.
본 발명의 제4 양태에 있어서, 본 발명의 제3 양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하였다.
본 발명의 제5 양태에 있어서, 본 발명의 제4 양태에 따른 벡터 또는 염색체 내에 통합된 외인성의 본 발명의 제3 양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하였다.
본 발명의 제6 양태에 있어서, 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR을 발현하는 분리된 세포를 제공하였다.
본 발명의 제7 양태에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 세포를 함유하는 약물 조성물을 제공하였다.
본 발명의 제8 양태에 있어서, 치료가 필요한 대상에게 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 세포, 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 약물 조성물을 적정량 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 제공하였다.
본 발명의 제9 양태에 있어서, 종양을 치료하기 위한 약물 제조에서의 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 세포의 용도를 제공하였다.
본 발명의 제10 양태에 있어서, (i) 본 발명의 제5 양태에 따른 숙주 세포를 배양하여, 본 발명의 제1 양태에 따른 T 세포 수용체를 발현하는 단계; (ii) 상기 T 세포 수용체를 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는 본 발명의 제1 양태에 따른 T 세포 수용체를 제조하는 방법을 제공하였다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술적 특징과 이하(예를 들어 실시예)에 구체적으로 기술된 각 기술적 특징이 서로 조합되어 새롭거나 바람직한 기술 수단을 구성할 수 있는 것을 이해하여야 한다. 편폭의 제한으로 일일이 설명하지 않을 것이다.
도 1a 및 도 1b는 각각 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 특이적으로 결합될 수 있는 야생형 TCRα와 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형 TCR의 α가변 도메인의 아미노산 서열과 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형TCR의 α가변 도메인의 DNA 서열과 β사슬 가변 도메인의 DNA 서열이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형TCR의 연결 올리고펩티드(linker)의 아미노산 서열과 뉴클레오티드(Nucleotide) 서열이다.
도 5(1) ~ (29)는 각각 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 고친화력을 가진 단일 사슬 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 6(1) ~ (16)은 각각 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 고친화력을 가진 단일 사슬 TCR의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 7a 및 도 7b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형TCR의 아미노산 서열과 DNA 서열이다.
도 8a 및 도 8b는 각각 본 발명에서 대조 TCRα과 β사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9(1) ~ (29)는 각각 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 고친화력을 가진 이형질 이합체 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 10(1) ~ (16)은 각각 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 고친화력을 가진 이형질 이합체 TCR의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 11a 및 도 11b는 각각 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 특이적으로 결합될 수 있는 야생형 TCRα와 β사슬 아미노산 서열을 나타낸다.
도 12는 대조 TCR 즉 야생형 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체의 결합 곡선이다.
도 13은 본 발명의 고친화력 TCR이 형질감염된 효과 세포의 INF-γ 활성 실험 결과도이다.
도 14는 표적 세포에 대한 본 발명의 고친화력 TCR이 형질감염된 효과 세포의 살상 실험 결과도이다.
도 15a 및 15b는 효과 세포에 대한 융합 단백질의 방향 변경 실험 결과도이다.
도 16은 본 발명의 고친화력 TCR이 형질감염된 효과 세포의 체내 효능 결과도이다.
본 발명은 광범위하고 깊은 연구를 거쳐, SLLMWITQC올리고펩티드(NY-ESO-1 단백질 유래)를 식별하는 고친화성 T 세포 수용체(TCR)를 획득하였고, 상기 SLLMWITQC올리고펩티드는 펩티드-HLA A2 복합체의 형식으로 제시된다. 상기 고친화성 TCR은 이의 α사슬 가변 도메인의 3개의 CDR 영역:
CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDANGKII에서 돌연변이되고; 및/또는 이의 β사슬 가변 도메인의 3개의 CDR 영역:
CDR1β: SGHDY
CDR2β: FNNNVP
CDR3β: ASSLGSNEQY에서 돌연변이되며; 또한, 상기 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 돌연변이 후의 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 적어도 야생형 TCR의 2배이다.
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 상기 구체적인 방법과 실험 조건에 제한되지 않으며, 그러한 방법 및 조건은 변경될 수 있음을 이해하여야 한다. 본문에 사용된 용어는 단지 구체적인 해결수단을 기술하기 위한 목적으로 사용되는 것으로, 이의 의도는 제한적인 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에만 의해 제한된다.
달리 정의되지 않는 한, 본문에 사용된 모든 기술과 과학 용어는 모두 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 실시 또는 테스트에서 본 발명에 따른 것과 흡사하거나 등가적인 임의의 방법과 재료를 사용할 수 있으며, 본문에서 바람직한 방법과 재료를 예로 든다.
용어
T 세포 수용체(T cell receptor,TCR)
국제 면역 유전학 정보 시스템(IMGT)을 사용하여 TCR을 기술할 수 있다. 천연 αβ 이종 이합체 TCR은 α사슬과 β사슬을 갖는다. 광의적으로, 각 사슬은 가변 영역, 접합 영역 및 불변 영역을 포함하고, 통상적으로 β사슬은 가변 영역과 접합 영역 사이에 짧은 가변 영역을 포함하지만, 상기 가변 영역은 종종 접합 영역의 일부로 여겨진다. 독특한 IMGT의 TRAJ와 TRBJ로 TCR의 접합 영역을 결정하고, IMGT의 TRAC와 TRBC로 TCR의 불변 영역을 결정한다.
각 가변 영역은 프레임(frame) 서열에 키메라된(chimeric) CDR1, CDR2 및 CDR3 3개의 CDR(상보 결정 영역)을 포함한다. IMGT 명명법에서, TRAV와 TRBV의 상이한 번호는 각각 상이한 Vα 유형과 Vβ의 유형을 지칭한다. IMGT 시스템에서, α사슬 불변 도메인은 TRAC*01 부호를 가지고, 여기서 “TR”은 T 세포 수용체 유전자를 나타내며; “A”는 α사슬 유전자를 나타내고; C는 불변 영역을 나타내며; “*01”은 대립 유전자1을 나타낸다. β 사슬 불변 도메인은 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 부호를 가지고, 여기서, “TR”은 T 세포 수용체 유전자를 나태내며; “B”는 β 사슬 유전자를 나타내고; C는 불변 영역을 나타내며; “*01”은 대립 유전자1을 나타낸다. α사슬의 불변 영역은 유일하게 결정되는 것이고, β 사슬의 형식에서, 2개의 가능한 불변 영역 유전자 “C1”과 “C2”가 존재한다. 당업자는 개시된 IMGT데이터베이스에 의해 TCRα와 β 사슬의 불변 영역 유전자 서열을 얻을 수 있다.
일반적으로, TCR의 α와 β 사슬에 각각 2개의 "도메인", 즉 가변 도메인과 불변 도메인이 있는 것으로 본다. 가변 도메인은 연결된 가변 영역과 접합 영역으로 구성된다. 따라서, 본원 발명의 명세서와 청구 범위에서, “TCRα사슬 가변 도메인”은 연결된 TRAV와 TRAJ 영역을 지칭하고, 마찬가지로, “TCRβ사슬 가변 도메인”은 연결된 TRBV와 TRBD/TRBJ영역을 지칭한다. TCRα사슬 가변 도메인의 3개의 CDR은 각각 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α이고; TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 CDR은 각각 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β이다. 본 발명의 TCR가변 도메인의 프레임 서열은 마우스 또는 인간화인 것일 수 있고, 바람직하게는 인간화인 것이다. TCR의 불변 도메인은 세포 내 부분, 막 관통 영역과 세포 외 부분을 포함한다. 가용성의 TCR을 얻어, TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 친화력을 측정하기 위해, 바람직하게, 본 발명의 TCR은 막 관통 영역을 포함하지 않는다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 TCR의 아미노산 서열은 TCR의 세포 외 아미노산 서열을 지칭한다.
본 발명에 따른 “야생형 TCR”의 α사슬 아미노산 서열 및 β 사슬 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:103과 SEQ ID NO: 104이고, 도 11a 및 11b에 도시된 바와 같다. 본 발명에 따른 “대조 TCR”의 α사슬 아미노산 서열 및 β 사슬 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:56과 SEQ ID NO: 57이고, 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같다. 본 발명에서, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합될 수 있는 야생형 TCR의 α와 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO: 2이고, 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같다. 본 발명에서, 용어 “본 발명의 폴리펩티드(Peptide)”, “본 발명의 TCR”, “본 발명의 T 세포 수용체”는 상호 교환 사용할 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 T 세포 수용체(TCR)는 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 CDR1α, CDR2α, 및 CDR3α를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3α는 [3αX1][3αX2]D[3αX3][3αX4][3αX5][3αX6][3αX7][3αX8] 서열을 포함하고, 여기서, [3αX1], [3αX2], [3αX3], [3αX4], [3αX5], [3αX6] , [3αX7], [3αX8]은 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX1]은 A 또는 M이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX2]는 T 또는 Y이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX3]은 A 또는 E 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX4]는 N 또는 F 또는 Y 또는 W이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX5]는 G 또는 A 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX6]은 K 또는 W 또는 R 또는 T 또는 S 또는 M 또는 L이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX7]은 I 또는 W 또는 V 또는 Y 또는 P이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX8]은 I 또는 N 또는 E 또는 D 또는 Q 또는 V 또는 K 또는 G 또는 M 또는 S이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3αX1]은 A이고, [3αX2]는 T이며, [3αX3]은 A이고, [3αX4]는 N 또는 F 또는 W이며, [3αX5]는 A이고, [3αX6]은 W 또는 R이며, [3αX7]은 W이고, [3αX8]은 I 또는 N 또는 E 또는 D이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3a은 ATDANARWN, ATDANARWE, ATDANARWD, ATDAFAWWI 및 ATDAWARWI로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR1α은 [1αX1][1αX2][1αX3][1αX4]N, 여기서, [1αX1], [1αX2], [1αX3], [1αX4]로부터 선택되는 서열을 포함하고, [1αX5]는 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX1]은 T 또는 G이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX2]는 S 또는 W이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX3]은 I 또는 A 또는 V이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX4]는 N 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [1αX1]은 G이고, [1αX2]는 S 또는 W이며, [1αX3]은 I 또는 A 또는 V이고, [1αX4]는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR1α은 GSIQN, GWAQN, GWVQN 및 TSINN 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2α는 IR [2αX1][2αX2][2αX3][2αX4]E 서열을 포함하고, 여기서, [2αX1], [2αX2], [2αX3], [2αX4]는 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX1]은 S 또는 T이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX2]는 N 또는 G이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX3]은 E 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2αX4]는 R, A 또는 Q이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2α는 IRTGEQE, IRTGQAE 및 IRSNERE로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하며, 여기서, 상기 CDR1β는 SGHDY 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2β는 FN[2βX1][2βX2][2βX3][2βX4] 서열을 포함하고, 여기서, [2βX1], [2βX2], [2βX3] 및 [2βX4]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX1]은 N 또는 H이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX2]는 N 또는 G이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX3]은 V 또는 A이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [2βX4]는 P 또는 V이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR2β는 FNHGAV 및 FNNNVP로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3β는 AS[3βX1][3βX2]G[3βX3]NEQY 서열을 포함하고, 여기서, [3βX1], [3βX2], [3βX3]은 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3βX1]은 S, Q 또는 M이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3βX2]는 L, R, K, 또는 M이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3βX3]은 S, A, G 또는 P이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 CDR3β는 ASQRGSNEQY, ASQKGANEQY, ASQLGSNEQY, ASQLGANEQY, ASQLGGNEQY, ASQLGPNEQY, ASQRGANEQY, ASQMGSNEQY, ASQMGANEQY 및 ASMLGSNEQY로부터 선택되는 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 TCRα사슬 가변 도메인은, CDR1α: TSINN; CDR2α: IRSNERE; 및 CDR3α: ATDANGKII의 CDR 동시에 포함하지 않는다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 TCRβ사슬 가변 도메인은, CDR1β: SGHDY; CDR2β: FNNNVP; 및 CDR3β: ASSLGSNEQY의 CDR 동시에 포함하지 않는다.
천연 사슬 간 이황화 결합과 인공 사슬 간 이황화 결합
천연 TCR의 막 근위 영역 Cα와 Cβ 사슬 사이에 이황화 결합이 존재하고, 본 발명에서 “천연 사슬 간 이황화 결합”이라고 한다. 본 발명에서, 인공적으로 도입되고 천연 사슬 간 이황화 결합 위치와 상이한 위치를 갖는 사슬 간 공유 이황화 결합을 “인공 사슬 간 이황화 결합”이라고 한다.
설명의 편리를 위하여, 본 발명에서 TRAC*01과 TRBC1*01 또는 TRBC2*01아미노산 서열의 위치 번호를 N단에서 C단으로의 순서에 따라 위치 넘버링하고, 예를 들어 TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N단에서 C단으로의 순서에 따라 60번째 아미노산은 P(프롤린(Proline))이고, 본 발명에서 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Pro60이라 기술하며, 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 60번 아미노산이라고 기술할 수 있으며, 또한 예를 들어 TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N단에서 C단으로의 순서에 따라 61번째 아미노산은 Q(글루타민(Glutamine))이고, 본 발명에서 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Gln61이라 기술하며, 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산이라고 기술할 수도 있으며, 다른 것들도 이로써 유추한다. 본 발명에서, 가변 영역 TRAV와 TRBV의 아미노산 서열의 위치 번호는, IMGT에 열거된 위치에 따라 넘버링된다. 예를 들어, TRAV에의 어느 아미노산이 IMGT에 열거된 위치 번호가 46이면, 본 발명에서 이를 TRAV 46번 아미노산으로 기술하고, 다른 것들은 이로써 유추한다. 본 발명에서, 다른 아미노산의 서열 위치 번호에 관하여 특수한 설명이 있으면, 특수한 설명에 따른다.
종양
용어 “종양”은 병리학적 유형 또는 감염 단계에 관계없이 모든 유형의 종양 세포 생장 또는 발암 과정을 비롯한 전이성 조직 또는 악성 형질 전환 세포, 조직 또는 기관을 의미한다. 종양의 구현예는 비제한적으로, 고형 종양, 연조직 종양 및 전이성 병변을 포함한다. 고형 종양의 구현예로 육종, 편평 세포 암종 및 암과 같은 상이한 기관 계통의 악성 종양을 포함한다. 예를 들어, 감염된 전립선, 폐, 유방, 임파, 장위(예를 들어: 결장) 및 생식 요로(예를 들어: 신장, 상피 세포), 인두를 포함한다. 폐 편평 세포 암종으로 대부분의 결장암, 직장암, 신 세포 암종, 간암, 폐의 비소 세포 암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함한다. 상기 암의 전이성 병변은 마찬가지로 본 발명의 방법과 조성물에 의해 치료 및 예방될 수 있다.
발명의 상세한 설명
주지된 바와 같이, TCR의 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인은 각각 3개의 CDR을 포함하고, 항체의 상보 결정 영역과 유사하다. CDR3은 항원 올리고펩티드와 상호 작용하고, CDR1 및 CDR2는 HLA와 상호 작용한다. 따라서, TCR 분자의 CDR이 이와 항원 올리고펩티드-HLA 복합체의 상호 작용을 결정하였다. 항원 올리고펩티드 SLLMWITQC와 HLA A2 복합체(즉, SLLMWITQC-HLA A2 복합체)를 결합할 수 있는 야생형 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열과 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO: 2이고, 상기 서열은 본 발명자가 처음으로 발견하였다. 이는 하기 CDR 영역을 구비한다.
α사슬 가변 도메인CDR CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDANGKII
및 β사슬 가변 도메인CDR CDR1β: SGHDY
CDR2β: FNNNVP
CDR3β: ASSLGSNEQY
본 발명은 상기 CDR 영역에 대한 돌연변이 선별을 통하여, SLLMWITQC-HLA A2 복합체와의 친화력이 야생형 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 친화력의 적어도 2배인 고친화력 TCR을 얻었다.
본 발명에서 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합되는 활성을 구비한 T 세포 수용체(TCR)를 제공하였다.
상기 T 세포 수용체는 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하며, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 3개의 CDR영역의 기준 서열 하기와 같고,
CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDANGKII, 또한 하기 돌연변이 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
Figure 112019064965532-pct00012
및/또는, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 CDR영역의 기준 서열은 하기와 같으며,
CDR1β: SGHDY
CDR2β: FNNNVP
CDR3β: ASSLGSNEQY, 또한 하기 돌연변이 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
Figure 112019064965532-pct00013
더욱 상세하게, 상기 TCRα사슬 CDR 영역의 돌연변이 개수는 3개 또는 4개 또는 6개 또는 8개 또는 9개 또는 11개 또는 12개이고; 및/또는 상기 TCRβ사슬 CDR 영역의 돌연변이 개수는 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 또는 7개이다.
나아가, 본 발명의 TCR은 αβ 이형질 이합체 TCR이고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더욱 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 바람직하게, 적어도 92 %; 더욱 바람직하게, 적어도 94 %; 가장 바람직하게, 적어도 97 %; (예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
나아가, 본 발명의 TCR은 단일 사슬 TCR이고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더욱 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 바람직하게, 적어도 92 %; 더욱 바람직하게, 적어도 94 %; 가장 바람직하게, 적어도 97 %; (예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 TCR은, (ⅰ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ⅱ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함하고, 여기서, (ⅰ) 및 (ⅱ)는 모두 TCR사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함한다.
본 발명에서, 야생형 TCRα사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 1의 3개의 CDR 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 1의 27 ~ 31번, 49 ~ 55번 및 90 ~ 98번에 위치된다. 이에 따라, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용되고, 27T 는 CDR1α의 1번 T이며, 28S는 CDR1α의 2번 S이고, 29I는 CDR1α의 3번 I이며, 30N은 CDR1α의 4번 N이고, 51S는 CDR2α의 3번 S이며, 52N은 CDR2α의 4번 N이고, 53E는 CDR2α의 5번 E이며, 54R은 CDR2α의 6번 R이고, 90A는 CDR3α의 1번 A이며, 91T는 CDR3α의 2번 T이고, 93A는 CDR3α의 4번 A이며, 94N은 CDR3α의 5번 N이고, 95G는 CDR3α의 6번 G이며, 96K는 CDR3α의 7번 K이고, 97I는 CDR3α의 8번 I이며, 98I는 CDR3α의 9번 I이다.
마찬가지로, 본 발명에서, 야생형 TCRβ사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2의 3개의 CDR 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 2의 27 ~ 31번, 49 ~ 54번 및 93 ~ 102번에 위치된다. 따라서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하고, 51N은 CDR2β의 3번 N이고, 52N은 CDR2β의 4번 N이며, 53V는 CDR2β의 5번 V이고, 54P는 CDR2β의 6번 P이며, 95S는 CDR3β의 3번 S이고, 96L은 CDR3β의 4번 L이며, 98S는 CDR3β의 6번 S이다.
본 발명에서 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합되는 특성의 TCR을 제공하였고, α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인을 포함하며, 상기 TCR이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 α사슬 가변 도메인에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기의 사이트는 27T, 28S, 29I, 30N, 51S, 52N, 53E, 54R, 90A, 91T, 93A, 94N, 95G, 96K, 97I 및 98I 중의 하나 또는 복수를 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하고; 및/또는 상기 TCR은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 β사슬 가변 도메인에서 돌연변이되며, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기의 사이트는 51N, 52N, 53V, 54P, 95S, 96L 및 98S 중의 하나 또는 복수를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하는 것을 특징으로 하며;
바람직하게, 돌연변이 후의 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 27G, 28W, 29A 또는 29V, 30Q, 51T, 52G, 53Q, 54Q 또는 54A, 90M, 91Y, 93E 또는 93Q, 94F 또는 94Y 또는 94W, 95A 또는 95Q, 96W 또는 96R 또는 96T 또는 96S 또는 96M 또는 96L, 97W 또는 97V 또는 97Y 또는 97P, 및 98E 또는 98N 또는 98D 또는 98Q 또는 98K 또는 98V 또는 98G 또는 98M 또는 98S로부터 선택되는 하나의 그룹 또는 복수 그룹의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하며; 및/또는 돌연변이 후의 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 51H, 52G, 53A, 54V, 95Q 또는 95M, 96R 또는 96K 또는 96M, 및 98A 또는 98G 또는 98P로부터 선택되는 하나의 그룹 또는 복수 그룹의 아미노산 잔기를 포함하고, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용한다.
더욱 구체적으로, α사슬 가변 도메인에서 상기 돌연변이의 구체적인 형식으로 T27G, S28W, I29A/V, N30Q, S51T, N52G, E53Q, R54Q/A, A90M, T91Y, A93E/Q, N94F/Y/W, G95A/Q, K96W/R/T/S/M/L, I97W/V/Y/P 및 I98N/E/D/Q/K/V/G/M/S 중의 하나의 그룹 또는 복수 그룹을 포함하고; β사슬 가변 도메인에서 상기 돌연변이의 구체적인 형식으로 N51H, N52G, V53A, P54V, S95Q/M, L96R/K/M 및 S98A/G/P 중의 하나의 그룹 또는 복수 그룹을 포함한다.
당업자에게 공지된 부위 특이적 돌연변이 방법에 따라, 야생형 TCRα사슬 불변 영역 TRAC*01 엑손1의 Thr48 시스테인으로 돌연변이시키고, β사슬 불변 영역TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57을 시스테인으로 돌연변이시켜, 대조 TCR을 얻고, 이의 아미노산 서열은 각각 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같으며, 돌연변이 후의 시스테인 잔기를 굵은 알파벳으로 표시하였다. 상기 시스테인의 치환으로 인해 대조 TCR의 α와 β사슬의 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 형성될 수 있어, 더욱 안정적인 가용성 TCR을 형성하므로, TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기를 더욱 편리하게 평가할 수 있다. TCR 가변 영역의 CDR 영역이 이와 pMHC 복합체 사이의 친화력을 결정하였고, 따라서, 상기 TCR 불변 영역의시스테인 치환은 TCR의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기에 영향을 미치지 않는 것으로 이해될 것이다. 그러므로, 본 발명에서, 측정된 대조 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력은 야생형 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력으로 간주된다. 마찬가지로, 측정된 본 발명의 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력이 적어도 대조 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력의 10배이면, 본 발명의 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력이 적어도 야생형 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력의 10배이다.
임의의 적합한 방법으로 결합 친화력(해리 평형 상수 KD와 반비례)과 결합 반감기(T1/2로 표시)를 측정할 수 있다. TCR의 친화력을 두 배로 하면 KD가 반으로 줄어드는 것을 이해하여야 한다. T1/2는 In2를 해리 속도(Koff)로 나눈 값으로 계산된다. 따라서, T1/2를 두배로 하면 Koff가 반으로 줄어든다. 바람직하게, 동일한 시험 방안으로 주어진 TCR의 결합 친화력 또는 결합 반감기 차수, 예를 들어 3번 또는 그 이상 측정하여 결과의 평균 값을 취하였다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 실시예에서의 표면 플라스 몬 공명(BIAcore) 방법으로 이러한 측정을 진행하였다. 상기 방법으로 측정된 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 대조 TCR의 해리 평형 상수 KD는 4.3E-05 M, 즉 43 μM이고, 본 발명에서 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 야생형 TCR의 해리 평형 상수 KD 또한 43 μM인 것으로 간주된다. TCR의 친화력이 두 배가 되면 KD이 반으로 줄어들기 때문에, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 고친화력 TCR의 해리 평형 상수 KD가 4.3E-06 M, 즉 4.3 μM으로 측정되면, 상기 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 고친화력 TCR 친화력이 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 야생형 TCR의 친화력의 10배인 것을 설명한다. 당업자에게 공지된 KD 값 단위들 사이의 환산 관계는 1 M = 1000 μM, 1μ M = 1000 nM, 1 nM = 1000 pM이다.
본 발명의 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 2배이고; 바람직하게, 적어도 5배이며; 더욱 바람직하게, 적어도 10배이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 50배이고; 바람직하게, 적어도 100배이며; 더욱 바람직하게, 적어도 500배이고; 가장 바람직하게, 적어도 1000배이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 104배이고; 바람직하게, 적어도 105배이며; 더욱 바람직하게, 적어도 106배이고; 가장 바람직하게, 적어도 107배이다.
구체적으로, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 KD ≤ 20 μM이고;
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 5 μM ≤ KD ≤ 10 μM이며; 바람직하게, 0.1 μM ≤ KD ≤ 1 μM이고; 더욱 바람직하게, 1 nM ≤ KD ≤ 100 nM이며;
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 100 pM ≤ KD ≤ 1000 pM이고; 바람직하게, 10 pM ≤ KD ≤ 100 pM이며; 더욱 바람직하게, 1 pM ≤ KD ≤ 10 pM이다.
임의의 적합한 방법으로 돌연변이시킬 수 있고, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 따른 그런한 것들, 제한 효소에 의한 클로닝 또는 라이게이션 독립적 클로닝(LIC) 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 많은 표준 분자 생물학 교과서에서 이러한 방법을 상세히 설명하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 돌연변이와 제한 효소에 의한 클로닝에 대한 더 많은 상세한 내용은 CSHL 출판사의 Sambrook 및 Russell, (2001) 분자 클로닝-실험실 매뉴얼(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3 판)을 참조할 수 있다. LIC 방법에 대한 더 많은 정보는 (Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6)를 참조할 수 있다.
본 발명의 TCR을 생성하는 방법은 이러한 TCR을 나타내는 파지 입자의 다양한 라이브러리(library)로부터 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 대하여 고친화력을 갖는 TCR을 선별하는 것일 수 있지만 이에 한정되지 않으며, 예를 들어 문헌 (Li, et al(2005)Nature Biotech 23(3):349-354)에 기술된 바와 같다.
야생형 TCRα와 β사슬 가변 도메인 아미노산을 발현하는 유전자 또는 약간 변형된 야생형 TCR의 α 및 β사슬 가변 도메인 아미노산을 발현하는 유전자는 모두 주형 TCR을 제조하는데 사용될 수 있는 것을 이해하여야 한다. 다음, 상기 주형 TCR의 가변 도메인을 코딩하는 DNA로 본 발명의 고친화력의 TCR을 생성하는데 필요한 변화가 도입된다.
본 발명의 고친화성 TCR은 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 중의 하나 및/또는 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 중의 하나를 포함한다. 따라서, 야생형 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 함유한 TCRα사슬은 SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 중의 하나를 함유한 TCRβ사슬과 이형질 이합체 TCR 또는 단일 사슬 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, 야생형 TCR의 β가변 도메인 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 함유한 TCRβ사슬은 SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 중의 하나를 함유한 TCRα사슬과 이형질 이합체 TCR 또는 단일 사슬 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, TCRα사슬 가변 도메인 아미노산 서열SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 중의 하나를 함유한 TCRα사슬은 TCRβ사슬 가변 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 중의 하나를 함유한 TCRβ사슬과 이형질 이합체 TCR 또는 단일 사슬 TCR 분자를 형성할 수 있다. 본 발명에서, 이형질 이합체 TCR 분자를 형성하는 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게 하기 표 1로부터 선택된다.
TCR서열 번호 α사슬 가변 도메인 서열
SEQ ID NO:		 β사슬 가변 도메인 서열
SEQ ID NO:
1 58 2
2 59 87
3 60 87
4 60 88
5 60 89
6 61 90
7 62 90
8 63 87
9 64 91
10 65 90
11 66 89
12 1 92
13 1 93
14 1 94
15 1 95
16 1 96
17 1 97
18 1 98
19 67 2
20 68 2
21 69 2
22 70 2
23 71 2
24 72 2
25 73 2
26 74 2
27 75 2
28 76 2
29 77 2
30 78 2
31 79 2
32 80 2
33 81 2
34 82 2
35 83 2
36 59 2
37 63 2
38 84 2
39 85 2
40 86 2
41 1 99
42 1 100
43 1 101
44 1 102
본 발명의 목적에 기반하여, 본 발명의 TCR은 적어도 하나의 TCRα 및/또는 TCRβ사슬 가변 도메인을 갖는 부분이다. 통상적으로 이들은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 동시에 포함한다. 이들은 αβ 헤테로다이머 또는 단일 사슬 형식 또는 다른 임의의 안정적으로 존재할 수 있는 형식일 수 있다. 양자 면역 요법에서, αβ 헤테로다이머 TCR의 전장 사슬(세포질과 막 관통 도메인을 포함)이 형질감염될 수 있다. 본 발명의 TCR은 치료제를 항원 제시 세포에 전달하기 위한 표적제 또는 효과 세포를 지향시키는 이중 기능 폴리펩티드를 제조하기 위한 다른 분자와 결합하여 사용될 수 있으며, 바람직하게, TCR은 가용 형식이다.
안정성에 관하여, 선행 기술에서 TCR의 α와 β 사슬 불변 도메인 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 도입하면 가용적이고 안정적인 TCR 분자를 얻을 수 있는 것을 개시하였으며, 예를 들어 특허 문헌 PCT/CN2015/093806에 기술된 바와 같다. 따라서, 본 발명의 TCR은 이의 α 및 β사슬 불변 도메인의 잔기 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 도입하는 TCR일 수 있다. 시스테인 잔기는 상기 TCR의 α 및 β 사슬 불변 도메인 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성한다. 시스테인 잔기는 천연 TCR 내 적합한 부위의 다른 아미노산 잔기에 치환되어 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성한다. 예를 들어, TRAC*01 엑손1의 Thr48을 치환하고, 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57을 치환하여 이황화 결합을 형성한다. 시스테인 잔기를 도입하여 이황화 결합을 형성하는 다른 부위는, TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser77; TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser17; TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Asp59; TRAC*01 엑손1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu15; TRAC*01 엑손1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser54; TRAC*01 엑손1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ala19; 또는 TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu20일 수도 있다. 즉, 시스테인 잔기가 상기 α와 β 사슬 불변 도메인 중의 임의의 부위에 치환되었다. 시스테인 잔기를 포함하지 않으면서 천연 사슬 간 이황화 결합을 결실하는 목적을 달성하도록, 본 발명의 TCR불변 도메인의 하나 또는 복수의 C말단에서 최대 15개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 또는 더욱 적은 아미노산을 절단할 수 있으며, 천연 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 다른 하나의 아미노산으로 돌연변이시켜 상기 목적을 달성할 수도 있다.
상술된 바와 같이, 본 발명의 TCR은 이의 α 및 β 사슬 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 인공 사슬 간 이황화 결합을 포함할 수 있다. 불변 도메인 사이에 상술된 바와 같이 도입된 인공 이황화 결합이 함유되거나 함유되지 않더라도, 본 발명의 TCR은 TRAC불변 도메인 서열과 TRBC1 또는 TRBC2불변 도메인 서열을 모두 함유할 수 있는 것을 유의하여야 한다. TCR의 TRAC불변 도메인 서열과 TRBC1 또는 TRBC2불변 도메인 서열은 TCR 중에 존재하는 천연 사슬 간 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다.
이 외에, 안정성에 관하여, 특허 문헌 PCT/CN2016/077680에서 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 도입하여 TCR의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있는 것을 개시하였다. 따라서, 본 발명의 고친화력 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 더 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 형성된 시스테인 잔기는, TRAV의 46번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 60번 아미노산; TRAV의 47번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산; TRAV의 46번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산; 또는 TRAV의 47번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 60번 아미노산을 치환하였다. 바람직하게, 이러한 TCR은, (ⅰ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ⅱ) 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함할 수 있고, 여기서(ⅰ) 및 (ⅱ)은 모두 TCR사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함하며, α사슬과 β사슬은 이형질 이합체를 형성한다. 더욱 바람직하게, 이러한 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인 및 이의 막 관통 도메인 외의 전부 또는 부분적 β사슬 불변 도메인을 포함할 수 있지만, α사슬 불변 도메인을 포함하지 않고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 β사슬과 이형질 이합체를 형성한다.
안정성에 관하여, 한편, 본 발명의 TCR은 이의 소수성 코어 영역에서 돌연변이된 TCR을 더 포함하고, 바람직하게 이러한 소수성 코어 영역의 돌연변이는 본 발명의 TCR의 안정성을 향상시킬 수 있는 돌연변이이며, 예를 들어, 공개 번호 WO2014/206304의 특허 문헌에 기재된 바와 같다. 이러한 TCR은, (α 및/또는 β사슬) 가변 영역 아미노산 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 94번, 및/또는 α사슬 J유전자(TRAJ) 올리고펩티드 아미노산 위치 뒤로부터 3, 5, 7번, 및/또는 β 사슬 J유전자(TRBJ) 올리고펩티드 아미노산 위치 뒤로부터 2, 4, 6번의 가변 도메인 소수성 코어 위치에서 돌연변이 될 수 있고, 여기서, 아미노산 서열의 위치 번호는 국제 면역 유전학 정보 시스템(IMGT)에 열거된 위치에 따라 넘버링된다. 당업자는 상기 국제 면역 유전학 정보 시스템을 알고 있고, 상기 데이터베이스에 따라 IMGT에서의 상이한 TCR의 아미노산 잔기의 위치 번호를 얻을 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에서 소수성 코어 영역이 돌연변이된 TCR은 α와 β사슬의 가변 도메인을 연성 펩티드 사슬로 연결하여 구성된 고안정성의 단일 사슬 TCR일 수 있다. TCR 가변 영역의 CDR 영역은 이와 올리고펩티드-HLA 복합체 사이의 친화력을 결정하였고, 소수성 코어의 돌연변이는 TCR을 더욱 안정시킬 수 있지만, 이와 올리고펩티드-HLA 복합체 사이의 친화력에 영향을 미치지 않는다. 본 발명에서 연성 펩티드 사슬은 임의의 적합한 TCRα와 β사슬 가변 도메인을 연결하는 펩티드 사슬일 수 있는 것을 유의하여야 한다. 본 발명의 실시예1에서 구축된 고친화성 TCR 선별용 주형 가닥은 상기 소수성 코어 돌연변이를 함유한 고안정적인 단일 사슬 TCR이다. 안정성이 비교적 높은 TCR을 사용하여, TCR과 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체 사이의 친화력을 용이하게 평가할 수 있다.
상기 단일 사슬 주형TCR의 α사슬 가변 도메인 및 β사슬 가변 도메인의 CDR 영역과 야생형 TCR의 CDR 영역은 완전히 동일하다. 즉, α사슬 가변 도메인의 3개의 CD은 각각 CDR1α: TSINN, CDR2α: IRSNERE, CDR3α: ATDANGKII이고, β사슬 가변 도메인의 3개의 CDR은 각각 CDR1β: SGHDY, CDR2β: FNNNVP, CDR3β: ASSLGSNEQY이다. 상기 단일 사슬 주형 TCR의 아미노산 서열(SEQ ID NO:54) 및 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:55)은 각각 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같다. 이에 따라 SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 고친화성이 있는 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인으로 구성된 단일 사슬 TCR을 선별하였다.
본 발명에서, 단일 사슬 주형 TCRα사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 3의 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 3의 27 ~ 31번, 49 ~ 55번 및 90 ~ 98번에 위치된다. 이에 따라, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 번호를 사용하고, 27T는 CDR1α의 1번 T이며, 28S는 CDR1α의 2번 S이고, 29I는 CDR1α의 3번 I이며, 30N은 CDR1α의 4번 N이고, 51S는 CDR2α의 3번 S이며, 52N은 CDR2α의 4번 N이고, 53E는 CDR2α의 5번 E이며, 54R은 CDR2α의 6번 R이고, 90A는 CDR3α의 1번 A이며, 91T는 CDR3α의 2번 T이고, 93A는 CDR3α의 4번 A이며, 94N는 CDR3α의 5번 N이고, 95G는 CDR3α의 6번 G이며, 96K는 CDR3α의 7번 K이고, 97I는 CDR3α의 8번 I이며, 98I는 CDR3α의 9번 I이다.
마찬가지로, 본 발명에서 단일 사슬 주형 TCRβ사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 4의 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 2의 27 ~ 31번, 49 ~ 54번 및 93 102번에 위치된다. 따라서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하고, 51N은 CDR2β의 3번 N이며, 52N은 CDR2β의 4번 N이고, 53V는 CDR2β의 5번 V이며, 54P는 CDR2β의 6번 P이고, 95S는 CDR3β의 3번 S이며, 96L은 CDR3β의 4번 L이고, 98S는 CDR3β의 6번 S이다.
본 발명의 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 대하여 고친화성이 있는 αβ 이형질 이합체의 획득은 선별된 고친화성 단일 사슬 TCR의 α와 β사슬 가변 도메인의 CDR 영역을 야생형 TCRα사슬 가변 도메인(SEQ ID NO:1)과 β사슬 가변 도메인(SEQ ID NO:2)의 대응되는 위치에 전이하여 얻은 것이다.
본 발명의 일부 실시예에서, SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하고, 본 발명의 TCR의 α사슬 가변 도메인 소수성 코어 아미노산 잔기19A(즉 IMGT에 열거된 α사슬 가변 영역 19번), 21M(즉 IMGT에 열거된 α사슬 가변 영역 21번), 79S(즉 IMGT에 열거된 α사슬 가변 영역 94번) 중의 하나 또는 복수가 돌연변이되며, 및/또는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인 소수성 코어 아미노산 잔기13T(즉 IMGT에 열거된 β사슬 가변 영역 13번), 82S(즉 IMGT에 열거된 β 사슬 가변 영역 94번) 중의 하나 또는 복수가 돌연변이된다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 일부 바람직한 실시예에서, SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하고, 본 발명의 α사슬 가변 도메인 소수성 코어는 아미노산 잔기19V, 21I 및 79V 중의 하나 또는 복수를 포함하며, SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하고, 상기 TCRβ가변 도메인 소수성 코어는 아미노산 잔기13V 및 82V 중의 하나 또는 복수를 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 TCRα가변 도메인 소수성 코어의 돌연변이 형식은 A19V, M21I 및 S79V 중의 하나의 그룹 또는 복수 그룹을 포함하고; 상기 TCRβ가변 도메인 소수성의 돌연변이 형식은 T13V 및 S82V 중의 하나의 그룹 또는 복수 그룹을 포함한다.
본 발명의 고친화성 TCR은 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO:9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중의 하나, 및/또는 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53 중의 하나를 더 포함한다. 따라서, 상기 주형 가닥의 고안정적인 단일 사슬 TCRα사슬 가변 도메인(SEQ ID NO: 3)을 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53인 TCRβ사슬 가변 도메인과 조합하여 상기 단일 사슬 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, 상기 주형 가닥으로 하는 고안정적인 단일 사슬 TCRβ사슬 가변 도메인(SEQ ID NO: 4)을 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37인 TCRα사슬 가변 도메인과 조합하여 상기 단일 사슬 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, TCRα사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중의 하나를 TCRβ사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53 중의 하나를 조합하여 상기 단일 사슬 TCR 분자를 형성한다. 본 발명에서, 바람직하게 고친화력 단일 사슬 TCR 분자의 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 하기 표 2로부터 선택된다.
TCR 번호 α사슬 가변 도메인 서열
SEQ ID NO:		 β사슬 가변 도메인 서열
SEQ ID NO:
s-1 9 4
s-2 10 38
s-3 11 38
s-4 11 39
s-5 11 40
s-6 12 41
s-7 13 41
s-8 14 38
s-9 15 42
s-10 16 41
s-11 17 40
s-12 3 43
s-13 3 44
s-14 3 45
s-15 3 46
s-16 3 47
s-17 3 48
s-18 3 49
s-19 18 4
s-20 19 4
s-21 20 4
s-22 21 4
s-23 22 4
s-24 23 4
s-25 24 4
s-26 25 4
s-27 26 4
s-28 27 4
s-29 28 4
s-30 29 4
s-31 30 4
s-32 31 4
s-33 32 4
s-34 33 4
s-35 34 4
s-36 10 4
s-37 14 4
s-38 35 4
s-39 36 4
s-40 37 4
s-41 3 50
s-42 3 51
s-43 3 52
s-44 3 53
본 발명의 TCR 다가 복합체의 형식으로 제공될 수도 있다. 본 발명의 다가 TCR 복합체는 p53의 4합체 도메인을 사용하여 형성된 4합체, 또는 복수 개의 본 발명의 TCR이 다른 하나의 분자와 결합되어 형성된 복합체와 같은 2개, 3개, 4개 또는 복수 개의 본 발명의 TCR과 결합되어 형성된 중합체를 포함한다. 본 발명의 TCR 복합체는 제시 특정 항원을 체외 또는 체내 추적하거나 표적화하는데 사용될 수 있으며, 이러한 유형의 응용이 있는 다른 다가 TCR 복합체의 중간체를 생산하는데 사용될 수도 있다.
본 발명의 TCR은 단독으로 사용될 수 있고, 접합체와 공유 결합 또는 다른 방식으로 결합될 수도 있으며, 바람직하게, 공유 방식으로 결합된다. 상기 접합체는 검출 가능한 마커(진단 목적을 위한 것이고, 여기서, 상기 TCR은 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체를 나타내는 세포의 존재를 검출하기 위한 것임), 치료제, PK(단백질키나아제(Protein kinase)) 변형 부분 또는 임의의 상기 이러한 물질의 조합 결합 또는 접합을 포함한다.
진단용 검출 가능한 마커로, 형광 또는 형광마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 단층 촬영 ) 조영제, 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TCR과 결합되거나 접합될 수 있는 치료제로, 1. 방사성 핵종(Koppe 등, 2005, 암 전이 평론(Cancer metastasis reviews)24, 539); 2. 생물독(Chaudhary 등, 1989, 자연(Nature)339, 394; Epel 등, 2002, 암 면역학 및 면역 치료(Cancer Immunology and Immunotherapy)51, 565); 3. IL-2 등과 같은 사이토카인(Cytokine)(Gillies 등, 1992, 미국 국립 과학 아카데미(PNAS)89, 1428; Card 등, 2004, 암 면역학 및 면역 치료(Cancer Immunology and Immunotherapy) 53, 345; Halin 등, 2003, 암 연구(Cancer Research)63, 3202); 4. 항체Fc 단편(Mosquera 등, 2005, 면역학 잡지(The Journal Of Immunology) 174, 4381); 5. 항체scFv 단편 (Zhu 등, 1995, 암 국제 저널(International Journal of Cancer)62, 319) ; 6. 금 나노 입자/나노 봉(Lapotko 등, 2005, 암통신(Cancer letters )239, 36; Huang 등, 2006, 미국 화학 학회 잡지(Journal of the American Chemical Society)128, 2115); 7. 바이러스 입자(Peng 등, 2004, 유전자 치료(Gene therapy) 11, 1234); 8. 리포좀(Liposomes)(Mamot 등, 2005, 암 연구(Cancer research)65, 11631); 9. 나노 자성 입자; 10. 프로드러그(Prodrug) 활성 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DTD) 또는 비페닐 가수분해 효소 유사 단백질(BPHL)); 11. 화학치료(예를 들어, 시스플라틴(Cisplatin)) 또는 임의의 형식의 나노 입자 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TCR에 결합되는 항체 또는 이의 단편으로 항-CD3 또는 항-CD28 또는 항-CD16항체와 같은 항-T 세포 또는 NK-세포 결정 항체를 포함하고, 상기 항체 또는 이의 단편과 TCR의 결합은 효과 세포에 대하여 정향하여 표적 세포를 더욱 효과적으로 표적화할 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 TCR은 항-CD3항체 또는 상기 항-CD3항체의 기능 단편 또는 변이체와 결합된다. 구체적으로, 본 발명의 TCR과 항CD3 단일 사슬 항체의 융합 분자로, SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86로부터 선택되는 TCRα사슬 가변 도메인 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102로부터 선택되는 TCRβ사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 분자는 DNA 형식 또는 RNA 형식일 수 있다. DNA는 코딩 사슬 또는 비코딩 사슬일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 서열은 본 발명의 도면에 도시된 핵산 서열과 동일하거나 변형된 변이체일 수 있다. "변형된 변이체"의 의미를 예를 들어 설명하면, 본문에 사용된 바와 같이, "변형된 변이체"는 본 발명에서 SEQ ID NO: 54의 단백질 서열을 구비하지만, SEQ ID NO:55의 서열과 다른 핵산 서열을 코딩하는 것을 지칭한다.
통상적으로, 본 발명의 핵산 분자 전장 서열 또는 이의 단편은 PCR 증폭법, 재조합 방법 또는 인공 합성 방법으로 얻을 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 현재, 본 발명의 TCR(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열을 화학 합성으로 완전히 얻을 수 있다. 다음, 상기 DNA 서열은 본 분야에 공지된 기존 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터) 및 세포에 도입될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 벡터 또는 코딩 서열로 유전자 공학에 의해 생성된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 TCR을 발현하는 분리 세포, 특히 T 세포를 더 포함한다. 본 발명의 고친화력 TCR을 코딩하는 DNA 또는 RNA로의 T 세포 형질 감염에 적합한 여러가지 방법이 있다(예를 들어, Robbins 등., (2008)J. Immunol.180:6116-6131). 본 발명의 고친화적인 TCR을 발현하는 T 세포는 양자 면역 치료에 사용될 수 있다. 당업자는 양자 면역 치료를 수행하기 위한 많은 적합한 방법을 알고 있다(예를 들어, Rosenberg 등., (2008)Nat Rev Cancer8(4): 299-308).
본 발명은 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 본 발명의 TCR, 또는 본 발명의 TCR복합체, 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포를 포함하는 약물 조성물을 더 제공하였다.
본 발명은 치료가 필요한 대상에게 본 발명의 TCR, 또는 본 발명의 TCR복합체, 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포, 또는 본 발명의 약물 조성물을 적정량 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 더 제공하였다.
본문의 아미노산 명칭은 국제적으로 통용되는 단일 영어 알파벳을 사용하여 표시하고, 이에 대응되는 아미노산의 명칭은 3개의 영어 알파벳으로 약칭하며, 각각 Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y), Val (V)인 것을 이해하여야 하고;
본 발명에서, Pro60 또는 60P는 모두 60번 프롤린을 나타낸다. 이 외에, 본 발명에 따른 돌연변이의 구체적인 형식의 발현 방식은 예를 들어 “T27G”는 27번의 T가 G에 의해 치환된 것을 대표하고, 마찬가지로, “I29A/V”는 29번의 I가 A에 의해 치환된거나 V에 의해 치환된 것을 대표한다. 다른 것들도 이에 따라 유추한다.
본 분야에서, 성능이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 치환할 경우, 통상적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 통상적으로 C말단 및/또는 N말단에 하나 또는 복수의 아미노산을 첨가하여도 단백질의 구조와 기능을 변화시키지 않는다. 따라서, 본 발명의 TCR은 본 발명의 TCR의 최대 5개, 바람직하게는 3개, 더욱 바람직하게는 2개, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산(특히 CDR 영역 외에 위치된 아미노산)을 더 포함하고, 성질이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 대체되어도, 여전히 기능적 TCR을 유지할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 TCR에 대하여 약간 변형시킨 TCR을 더 포함한다. 변형(통상적으로 1차 구조는 변경되지 않음) 형식으로 아세틸화(Acetylation) 또는 카르복시화(Carboxylation)와 같은 본 발명의 TCR의 화학적 유도 형식을 포함한다. 변형은 글리코실화(glycosylation)를 더 포함하고, 예를 들어, 본 발명의 TCR의 합성 및 가공에서 또는 추가적인 가공 단계에서 글리코실화하여 생성된 TCR이다. 이러한 변형은 TCR을 글리코실화시킨 효소(예를 들어 포유 동물의 클리코실화효소 또는 탈클리코실화 효소)에 노출시켜 완성될 수 있다. 변형 형식으로 인산화 아미노산 잔기(예를 들어 포스포티로신(Phosphotyrosine), 포스포세린(Phosphoserine), 포스포트레오닌(Phosphothreonine))를 갖는 서열을 더 포함한다. 변형되어 이의 항 단백질 가수분해 성능을 향상시키거나 용해성을 최적화시킨 TCR을 더 포함한다.
본 발명의 TCR, TCR복합체 또는 본 발명의 TCR로 형질 감염된 T 세포는 약학적으로 허용 가능한 벡터와 함께 약물 조성물에 제공될 수 있다. 통상적으로 본 발명의 TCR, 다가 TCR복합체 또는 세포는 무균 약물 조성물의 일부분으로서 제공되고, 상기 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다. 상기 약물 조성물은 임의의 적합한 형식일 수 있다(환자에 투여되기 위한 방법에 의해 결정된다). 단위 제형으로 제공될 수 있고, 통상적으로 밀폐된 용기에 제공되며, 키트(Kit)의 일부분으로 제공될 수 있다. 이러한 유형의 키트(그러나 필수적인 것은 아님)는 사용 설명서가 포함된다. 복수 개의 상기 단위 제형을 포함할 수 있다.
이 외에, 본 발명의 TCR은 단독으로 사용될 수 있고, 다른 치료제와 결합하거나 접합하여 함께 사용될 수도 있다(예를 드렁 동일한 약물 조성물에 배합한다).
약물 조성물은 약학적으로 허용 가능한 벡터를 더 포함할 수 있다. 용어 “약학적으로 허용 가능한 벡터”는 치료제를 투여하기 위한 벡터를 의미한다. 상기 용어는 이들 자체로는 투여 받는 개체에게 해로운 항체를 유도하지 않고, 투여 후 과도한 독성이 없는 약제 벡터는 상기 조성물을 지칭한다. 이러한 벡터는 당업자에게 공지된 것이다. 레밍턴 제약 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991))에서 약학적으로 허용 가능한 부형제에 관한 충분한 논의를 찾을 수 있다. 이러한 벡터로 염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세린(Glycerin), 에탄올(ethanol), 좌제 및 이들의 조합을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않는다.
치료성 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 벡터는 물, 염수, 글리세린 및 에탄올과 같은 액체를 함유할 수 있다. 이 외에, 이러한 벡터에 습윤제 또는 유화제, pH완충 물질 등과 같은 보조적 물질이 더 존재할 수 있다.
통상적으로, 치료성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사 가능한 제제로 제조될 수 있고; 주사 전에 용액 또는 현탁액에 배합하기에 적합한 고체 형태의 액체 백터로 제조될 수도 있다.
본 발명의 조성물로 제조되면, 이를 통상적인 경로 투여할 수 있고, 여기서 안구 내, 근육 내, 정맥 내, 피 하, 피 내 또는 국소 투여를 포함하며(하지만 이에 한정되지 않음), 바람직하게 위장 외이고, 피 하, 근육 내 또는 정맥 내를 포함한다. 예방 또는 치료될 대상은 동물; 특히 사람일 수 있다.
본 발명의 약물 조성물이 실제 치료에 사용될 경우, 사용 정황에 따라 각종 상이한 제형의 약물 조성물을 사용할 수 있다. 바람직하게, 주사제, 경구제 등을 예로 들 수 있다.
이러한 약물 조성물은 통상적인 방법에 따라 혼합, 희석 또는 용해하여 배합될 수 있고, 또한 부형제, 붕괴제, 접착제, 윤활제, 희석제, 완충제, 등장제(isotonicities), 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정제 및 조용매와 같은 적합한 약물 첨가제를 간혹 추가하며, 상기 배합 과정은 제형은 통상적인 방식으로 진행될 수 있다.
본 발명의 약물 조성물은 서방형제제 형식으로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR은 서방형 중합체가 벡터인 알약 또는 마이크로 캡슐에 혼입된 후, 수술을 통해 치료하기 위한 조직으로 이식될 수 있다. 서방형 중합체의 예로 에틸렌-비닐아세테이트(Ethylene-vinyl acetate) 중합체, 폴리히드로메타아크릴레이트(polyhydrometaacrylate), 폴리아크릴아미드(Polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone), 메틸셀룰로오스(Methylcellulose), 락트산 중합체, 락트산-글리콜산 중합체 등을 예로 들 수 있고, 바람직하게, 락트산-글리콜산 공중합체와 같은 생분해성 중합체를 예로 들 수 있다.
본 발명의 약물 조성물이 실제 치료에 사용될 경우, 활성 성분인 본 발명의 TCR 또는 TCR복합체 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포는 치료될 각 환자의 체중, 연령, 성별 및 증상 정도에 따라 결정될 수 있으며, 최종적으로 의사에 의해 합리한 용량이 결정된다.
본 발명의 주요 장점은 하기와 같다.
(1) 상기 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 대한 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 적어도 야생형 TCR의 2배이고, 바람직하게, 적어도 10배이다.
(2) 상기 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 대한 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 적어도 야생형 TCR의 100배이고, 바람직하게 적어도 1000배이며, 더욱 바람직하게 104 ~ 107배일 수 있다.
(3) 본 발명의 고친화력 TCR을 형질 도입시키는 효과세포는 표적 세포에 대하여 아주 강한 살상 작용이 있다.
아래 구체적인 실시예에서, 본 발명을 더 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는 것을 이해하여야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 표시하지 않은 실험 방법은 예를 들어(Sambrook 및 Russell 등, 분자 클론: 실험실 매뉴얼(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3 판) (2001)CSHL출판사)에 기재된 조건, 또는 제조 업체에서 건의하는 조건과 같은 통상적인 조건에 따른다. 다른 설명이 없으면, 백분율과 분수는 중량에 따라 계산된다.
재료 및 방법
본 발명의 실시예에 사용된 실험 재료에 관하여 특별한 설명이 없으면 모두 시중에서 얻을 수 있고, 여기서, E.coli DH5α는 Tiangen로부터 구매되며, E.coli BL21(DE3)는 Tiangen로부터 구매되고, E. coli Tuner (DE3)은 Novagen로부터 구매되며, 플라스미드(Plasmid)pET28a는 Novagen로부터 구매된다.
실시예1. 소수성 코어 돌연변이된 안정적인 단일 사슬 TCR주형 가닥의 생성
본 발명은 부위 특정 돌연변이 방법으로, 특허 문헌 WO2014/206304에서의 기재에 따라, 하나의 연성 올리고펩티드(linker)에 의해 TCRα와 β사슬 가변 도메인을 연결하여 구성된 안정적인 단일 사슬 TCR 분자를 구축하였고, 이의 아미노산 및 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:55이며, 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같다. 상기 단일 사슬 TCR 분자를 주형으로 고친화성 TCR 분자를 선별하였다. 상기 주형 가닥의 α가변 도메인(SEQ ID NO:3) 및 β가변 도메인(SEQ ID NO:4)의 아미노산 서열은 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같고; 이에 대응되는 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:5 및 6이며, 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같고; 연성 올리고펩티드(linker)의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:7 및 8이며, 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같다.
주형 가닥을 지닌 목적 유전자를 NcoⅠ과 NotⅠ 이중 효소로 절단하고, NcoⅠ과 NotⅠ 이중 효소에 의해 절단된 pET28a벡터에 연결된다. 연결 산물을 E.coli DH5α에 형질 전환시키고, 카나마이신(Kanamycin)을 함유하는 LB플레이트에 코팅하며, 37 ℃의 온도에서 하룻밤 거꾸로 배양하고, 양성 클론을 취하여 PCR로 선별하며, 양성 재조합체에 대하여 시퀀싱(Sequencing)하고, 서열의 정확 여부를 확인한 후 재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 추출하여 E.coli BL21(DE3)에 형질 전환시켰다.
실시예2. 실시예1에서 구축된 안정적인 단일 사슬 TCR의 발현, 재생 및 정제
실시예1에서 제조된 재조합 플라스미드 pET28a-주형 가닥을 함유하는 BL21(DE 3) 균락을 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 전부 접종하고, OD600이 0.6 ~ 0.8이 될 때까지 37 ℃의 온도에서 배양하며, IPTG를 넣어 최종 농도를 0.5 mM로 하고, 37 ℃의 온도에서 계속하여 4시간 동안 배양하였다. 5000 rpM으로 15분 동안 원심 분리하여 세포 침전물을 얻고, Bugbuster Master Mix(Merck)로 세포 침전물을 분해시키며, 6000 rpM으로 15분 동안 원심 분리하여 봉입체를 회수하고, 다시 Bugbuster(Merck)으로 세척하여 세포 파괴물과 막 성분을 제거하며, 6000 rpM으로 15분 동안 원심 분리하여 봉입체를 수집하였다. 봉입체를 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0,8 M의 요소)에 용해시키고, 고속 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하며, 상등액을 BCA법으로 정량한 다음 나누어 넣고, -80 ℃의 온도 하에 보관하여 사용하였다.
5 mg의 용해된 단일 사슬 TCR 봉입체 단백질에, 2.5 mL의 완충액(6 M Gua-HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA)을 넣고, DTT를 더 넣어 최종 농도를 10 mM으로 하며, 37 ℃의 온도에서 30분 동안 처리하였다. 주사기로 125 mL의 재생 완충액(100 mM Tris-HCl pH 8.1,0.4 M L-아르기닌(Arginine),5 M 요소, 2 mM EDTA, 6.5 mM β-mercapthoethylamine,1.87 mM Cystamine)에 상기 처리된 단일 사슬 TCR을 적가하고, 4 ℃의 온도 하에서 10분 동안 교반한 후, 재생액을 4 kDa의 셀루로오스막 투석백(dialysis bag)에 넣으며, 투석백을 1 L 의 예냉된 물에 넣고, 4 ℃의 온도 하에서 하룻밤 천천히 교반하였다. 17시간 후, 투석액을 1 L의 예냉된 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0)으로 바꾸고, 4 ℃의 온도에서 계속하여 8시간 동안 투석한 후, 투석액을 동일한 신선한 완충액으로 바꾸어 계속하여 하룻밤 투석하였다. 17시간 후, 샘플을 0.45 μm의 여과막으로 여과하고, 진공 탈기한 후 음 이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP, GE Healthcare)으로, 20 mM의 Tris-HCl pH 8.0로 제조된 0-1 M의 NaCl 선형 구배 용출액으로 단백질을 정제하며, 수집된 용출 성분을 SDS-PAGE로 분석하고, 단일 사슬 TCR을 함유하는 성분을 농축시킨 후 다시 겔 여과 칼럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)으로 정제하며, 목표 성분도 SDS-PAGE로 분석하였다.
BIAcore 분석에 사용되는 용출 성분을 다시 겔 여과법으로 그 순도를 측정하였다. 조건으로 크로마토그래피 칼럼은 Agilent Bio SEC-3(300 A, φ7.8×300 mm)이고, 이동상은 150 mM의 인산염 완충액이며, 유속은 0.5 mL/min이고, 칼럼 온도는 25 ℃이며,자외선 검출 파장은 214 nm이다.
실시예3. 결합 특성화
BIAcore 분석
BIAcore T200 실시간 분석 시스템으로 TCR 분자와 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체의 결합 활성을 측정하였다. 항스트렙타비딘(streptavidin)의 항체(GenScript)에 커플링 버퍼(Coupling buffer)(10 mM의 나트륨아세테이트(Sodium acetate) 완충액, pH 4.77)를 넣은 후, 항체를 사전에 EDC 및 NHS에 의해 활성화된 CM5 칩으로 흐르게 하여, 항체를 칩 표면에 고정시키고, 마지막으로 에탄올아민(Ethanolamine)의 염산 용액으로 미반응 활성 표면을 차단하여 커플링 과정을 완성하였으며, 커플링 수준은 약 15000 RU이다.
낮은 농도의 스트렙타비딘을 항체에 코팅된 칩 표면으로 흐르게 한 후, SLLMWITQC-HLA-A2 복합체를 검출 채널에 흐르게 하고, 다른 하나의 채널을 참조 채널로 하며, 다시 0.05 mM의 비오틴(biotin)을 10 μL/min의 유속으로 2분 동안 칩을 흐르게 하여, 스트렙타비딘의 나머지 결합 사이트를 차단시켰다. 단일 순환 동역학 분석 방법을 사용하여 친화력을 측정하고, TCR을 HEPES-EP완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA,0.005 % P20, pH 7.4)으로 몇 가지 상이한 농도로 희석하며, 30 μL/min의 유속으로 순차적으로 칩 표면을 흐르게 하고, 샘플 주입당 결합 시간은 120초이며, 마지막 샘플 주입 종료 후 이를 600초 동안 해리시킨다. 각 라운드당 측정 종료 후 pH 1.75 의 10 mM의 Gly-HCl로 칩을 재생시켰다. BIAcore Evaluation 소프트웨어로 동역학 파라미터를 계산하였다.
상기 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체의 제조 과정은 하기와 같다.
a. 정제
100 ml의 중쇄 또는 경쇄의 발현을 유도하는 E. coli 균액을 수집하고, 4 ℃의 온도 하에서 8000 g으로 10분 동안 원심 분리시킨 후, 10 ml의 PBS로 균체를 1번 세척하며, 다음 5 ml의 BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck) 로 격렬하게 진탕하여 균체를 재부유시키고, 실온 하에서 20분 동안 스핀 배양한 후, 4 ℃, 6000 g의 조건 하에서 15분 동안 원심 분리시키며, 상등액을 버리고, 봉입체를 수집하였다.
상기 봉입체를 5 ml의 BugBuster Master Mix에 재부유시키고, 실온 하에서 5분 동안 스핀 배양하며; 30 ml의 10배로 희석된 BugBuster을 넣어 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g의 조건 하에서 15분 동안 원심 분리하며; 상등액을 버리고, 30 ml의 10배로 희석된 BugBuster을 넣어 봉입체를 재부유하며, 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g의 조건 하에서 15 분 동안 원심 분리하며, 2번 반복하고, 30 ml의 20 mM의 Tris-HCl pH 8.0을 넣어 봉입체를 재부유하며, 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g의 조건 하에서 15 분 동안 원심 분리하며, 마지막으로 20 mM의 Tris-HCl 8 M의 요소로 봉입체를 용해하고, SDS-PAGE로 봉입체 순도를 측정하며, BCA 키트로 농도를 측정하였다.
b. 재생
합성된 올리고펩티드 SLLMWITQC(베이징 싸이바이성 유전자 기술 유한회사)를 20 mg/ml의 농도로 DMSO에 용해시켰다. 경쇄와 중쇄의 봉입체를 8 M의 요소, 20 mM의 Tris pH 8.0, 10 mM의 DTT로 용해시키고, 재생 이전에 3 M의 염산구아니딘(Guanidine hydrochloride), 10 mM의 나트륨아세테이트, 10 mM의 EDTA를 넣어 추가적으로 변성시켰다. SLLMWITQC 펩티드를 25 mg/L(최종 농도)로 재생 완충액(0.4 M L-아르기닌, 100 mM Tris pH 8.3, 2 mM EDTA, 0.5 mM 산화성 글루타티온(Glutathione), 5 mM 환원성 글루타티온, 0.2 mM pMSF, 4 ℃까지 냉각)에 넣은 후, 20 mg/L의 경쇄와 90 mg/L의 중쇄(최종 농도이고, 중쇄를 3차례에 나누어 넣으며, 8 h/번임)를 순차적으로 넣으며, 재생은 4 ℃의 온도에서 적어도 3일 동안에 완성하고, SDS-PAGE로 성공적으로 재생 되었는지를 측정하였다.
c. 재생 후 정제
10 체적의 20 mM의 Tris pH 8.0로 투석하여 재생 완충액을 바꾸고, 완충액을 적어도 2번 바꾸어 용액의 이온 강도를 줄인다. 투석 후 0.45 μm의 셀룰로오스아세테이트(Cellulose acetate) 여과막으로 단백질 용액을 여과한 후, HiTrap Q HP(GE 제너럴 전기 회사) 음 이온 교환 칼럼(5 ml 배드 볼륨(Bed Volume))에 넣었다. Akta 정제기(GE 제너럴 전기 회사)로, 20 mM의 Tris pH 8.0로 제조된 0 ~ 400 mM의 NaCl 선형 구배로 단백질을 용출하고, pMHC이 약 250 mM의 NaCl에서 용출하며, 피크 성분을 수집하고, SDS-PAGE로 순도를 측정하였다.
d. 비오틴화
Millipore 울트라 여과 튜브로 정제된 pMHC분자를 농축하는 동시에, 완충액을 20 mM의 Tris pH 8.0로 치환한 후, 비오틴화 시약 0.05 M의 Bicine pH 8.3, 10 mM의 ATP, 10 mM의 MgOAc, 50 μM의 D-Biotin, 100 μg/ml의 BirA 효소(GST-BirA)을 넣어, 실온 하에서 혼합액을 하룻밤 배양하며, SDS-PAGE로 비오틴화가 완료되었는지 여부를 검출하였다.
e. 비오틴화된 복합체의 정제
Millipore 울트라 여과 튜브로 비오틴화 표지된 pMHC 분자를 1 ml로 농축시키고, 겔 여과 크로마토그래피로 비오틴화된 pMHC를 정제하며, Akta 정제기(GE 제너럴 전기 회사)를 사용하여, 여과된 PBS로 HiPrepTM 16/60 S200 HR칼럼(GE 제너럴 전기 회사)를 전평형시키고, 1 ml의 농축된 비오틴화 pMHC 분자를 넣은 후, PBS로 1 ml/min의 유속으로 용출하였다. 비오틴화된 pMHC 분자는 약 55 ml에서 단일 피크 용출로 나타났다. 단백질이 함유된 성분을 합병하고, Millipore 울트라 여과 튜브로 농축하며, BCA법(Thermo)으로 단백질 농도를 측정하고, 프로테아제(Protease) 억제제 cocktail(Roche)를 넣어 비오틴화된 pMHC 분자를 나누어 -80 ℃의 온도 하에 보관하였다.
실시예4. 고친화성 단일 사슬 TCR의 생성
파지 디스플레이 기술은 고친화성 변이체를 선별하기 위한 TCR 고친화성 변이 라이브러리를 생성하는 수단이다. Li 등((2005)Nature Biotech 23(3):349-354)에 기술된 TCR 파지 디스플레이 및 선별 방법을 실시예1에서 단일 사슬 TCR주형에 응용하였다. 상기 주형 가닥의 CDR 영역을 돌연변이시켜 고친화성 TCR의 라이브러리를 구축하고 선택하였다. 몇 라운드에 거쳐 선택된 파지 라이브러리는 모두 대응되는 항원에 특이적으로 결합되고, 그 중에서 단일 클론을 선택하여 서열 분석을 진행하였다.
실시예3에서 BIAcore 방법을 사용하여 TCR 분자와 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체의 상호 작용을 분석하고, 친화력 및/또는 결합 반감기가 적어도 야생형 TCR의 2배인 고친화성 TCR을 선별하였으며, 즉 선별된 고친화성 TCR이 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 결합되는 해리 평형 상수 KD는 야생형 TCR이 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 결합된 해리 평형 상수 KD의 2분의 1보다 작거나 같으며, 결과는 하기 표3과 같다. 상기 방법을 이용하여 대조 TCR과 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체의 상호 작용의 KD 값이 43μM인 것을 측정하고, 이의 상호 작용 그라프는 도 12에 나타낸 바와 같으며, 즉 야생형 TCR과 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체의 상호 작용의 KD 값 또한 43μM이며, 즉 4.3E-05M이다.
구체적으로, SEQ ID NO:1로 표시된 번호를 사용하고, 이러한 고친화력 TCR 돌연변이체의 α사슬 가변 도메인은, 27T, 28S, 29I, 30N, 51S, 52N, 53E, 54R, 90A, 91T, 93A, 94N, 95G, 96K, 97I및 98I 중의 하나 또는 복수 사이트의 아미노산에서 돌연변이되며, 및/또는 SEQ ID NO:41로 표시되는 번호를 사용하고, 이러한 고친화력 TCR 돌연변이체의 β사슬 가변 도메인은, 51N, 52N, 53V, 54P, 95S, 96L 및 98S 중의 하나 또는 복수 사이트에서 돌연변이된다.
더욱 구체적으로, SEQ ID NO:1로 표시되는 번호를 사용하고, 이러한 고친화력 TCR의 α사슬 가변 도메인은, 27G, 28W, 29A 또는 29V, 30Q, 51T, 52G, 53Q, 54Q 또는 54A, 90M, 91Y, 93E 또는 93Q, 94F 또는 94Y 또는 94W, 95A 또는 95Q, 96W 또는 96R 또는 96T 또는 96S 또는 96M 또는 96L, 97W 또는 97V 또는 97Y 또는 97P, 및 98E 또는 98N 또는 98D 또는 98Q 또는 98K 또는 98V 또는 98G 또는 98M 또는 98S로부터 선택되는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하며; 및/또는 SEQ ID NO:2로 표시되는 번호를 사용하고, 이러한 고친화력 TCR의 β사슬 가변 도메인은, 51H, 52G, 53A, 54V, 95Q 또는 95M, 96R 또는 96K 또는 96M, 및 98A 또는 98G 또는 98P로부터 선택되는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함한다.
고친화성 단일 사슬 TCR의 α사슬 가변 도메인(SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37)과 β사슬 가변 도메인(SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53)의 구체적인 아미노산 서열은 각각 하기 도 5(1) ~ (29) 및 도 6(1) ~ (16)에 나타낸 바와 같다.
단일 사슬 TCR 번호 단일 사슬 TCR가변 도메인
(SEQ ID NO.)
α β		 KD(M)
s-1 9 4 2.97E-09
s-2 10 38 2.66E-10
s-3 11 38 2.78E-10
s-4 11 39 4.75E-10
s-5 11 40 3.57E-10
s-6 12 41 3.42E-10
s-7 13 41 2.95E-10
s-8 14 38 3.41E-10
s-9 15 42 3.17E-10
s-10 16 41 4.25E-10
s-11 17 40 5.72E-10
s-12 3 43 3.80E-07
s-13 3 44 1.58E-06
s-14 3 45 4.91E-06
s-15 3 46 8.51E-07
s-16 3 47 1.69E-06
s-17 3 48 1.01E-07
s-18 3 49 1.57E-07
s-19 18 4 4.73E-06
s-20 19 4 3.33E-07
s-21 20 4 1.08E-07
s-22 21 4 1.54E-07
s-23 22 4 3.25E-07
s-24 23 4 2.79E-07
s-25 24 4 1.97E-07
s-26 25 4 1.06E-07
s-27 26 4 1.09E-06
s-28 27 4 3.96E-07
s-29 28 4 1.27E-06
s-30 29 4 1.04E-06
s-31 30 4 1.31E-06
s-32 31 4 4.71E-10
s-33 32 4 3.14E-10
s-34 33 4 7.16E-10
s-35 34 4 5.11E-10
s-36 10 4 8.43E-10
s-37 14 4 8.55E-10
s-38 35 4 9.43E-10
s-39 36 4 1.08E-09
s-40 37 4 1.11E-09
s-41 3 50 5.21E-08
s-42 3 51 7.60E-08
s-43 3 52 9.39E-08
s-44 3 53 6.68E-08
실시예5. 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 생성
실시예4에서 선별된 고친화력의 단일 사슬 TCR의 CDR 영역 돌연변이를 αβ 이형질 이합체 TCR의 가변 도메인의 대응되는 사이트에 도입하고, BIAcore를 통하여 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체와의 친화력을 측정하였다. 상기 CDR 영역 고친화력 돌연변이의 도입은 당업자에게 공지된 부위 특정 돌연변이 방법을 사용하였다. 상기 야생형 TCR의 α사슬과 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 도 1a(SEQ ID NO:1)와 1b(SEQ ID NO:2)에 나타낸 바와 같다.
유의할 점은, TCR과 SLLMWITQC-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기를 더욱 용이하게 평가하기 위한 더욱 안정적인 가용성 TCR을 얻기 위해, αβ 이형질 이합체 TCR은 α 및 β사슬의 불변 영역에 각각 하나의 시스테인 잔기를 도입하여 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성한 TCR일 수 있고, 본 실시예에서 시스테인 잔기가 도입된 후 TCRα와 β 사슬의 아미노산 서열은 각각 도 8a(SEQ ID NO:56) 및 8b(SEQ ID NO:57)에 도시된 바와 같으며, 도입된 시스테인 잔기는 굵은 알파벳으로 표시하였다.
"분자 클론 실험실 매뉴얼"(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(제3 판, Sambrook 및 Russell)에 기술된 표준 방법에 의해 발현될 TCRα와 β사슬의 세포 외 서열 유전자를 합성한 후 각각 발현 벡터pET28a+(Novagene)에 삽입하며, 업스트림(Upstream) 및 다운스트림(Downstream)의 클론 사이트는 각각 NcoI와 NotI이다. CDR 영역의 돌연변이는 당업자에게 공지된 오버랩 PCR(overlap PCR)에 의해 도입된다. 삽입된 단편은 시퀀싱에 의해 정확 여부가 확인된다.
실시예6. αβ 이형질 이합체 TCR의 발현, 재생 및 정제
TCR α와 β 사슬의 발현 벡터를 각각 화학적 전환법에 의해 발현 박테리아 BL21(DE3)에 전환시키고, 박테리아를 LB 배양액으로 생장시키며, OD600 = 0.6시 최종 농도가 0.5 mM인 IPTG로 유도하고, TCR의 α 및 β 사슬로 발현시킨 후 형성된 봉입체를 BugBuster Mix (Novagene)로 추출하며, BugBuster 용액으로 여러번 반복하여 세척하고, 최종적으로 봉입체를 6 M의 염산구아니딘, 10 mM의 디티오트레이톨(DTT), 10 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 20 mM의 Tris(pH 8.1)에 용해시켰다.
용해된 TCR α과 β사슬을 1: 1의 질량비로 5 M의 요소, 0.4 M의 아르기닌, 20 mM의 Tris (pH 8.1), 3.7 mM의 cystamine, 6.6 mM의 β-mercapoethylamine (4 ℃)에 신속하게 용해시키고, 최종 농도는 60 mg/mL이다. 혼합 후 용액을 10 배 체적의 탈이온수에서 투석하고(4 ℃), 12시간 후 탈이온수를 완충액(20 mM Tris, pH 8.0)으로 바꾸어 계속하여 4 ℃의 온도 하에서 12시간 동안 투석하였다. 투석 완료된 용액을 0.45 μM의 여과막으로 여과한 후, 음 이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP, 5ml, GE Healthcare)으로 정제하였다. SDS-PAGE겔로 용출 피크에 성공적으로 재생된 α와 β 이합체가 함유된 것을 확인하였다. TCR를 겔 여과 크로마토그래피(HiPrep 16/60, Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)로 추가적으로 정제하였다. 정제된 TCR 순도는 SDS-PAGE에 의해 90 %보다 큰 것으로 측정되었고, 농도는 BCA법으로 측정하였다.
실시예7. BIAcore 분석 결과
실시예3에 따른 방법을 사용하여 고친화력 CDR 영역의 αβ 이형질 이합체 TCR과 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체의 친화력을 측정하였다.
고친화성의 단일 사슬 TCRα와 β사슬에서 선별된 CDR 영역을 각각 야생형 TCRα사슬 가변 도메인SEQ ID NO:1과 β사슬 가변 도메인SEQ ID NO:2의 대응되는 위치에 옮겨 αβ 이형질 이합체 TCR을 형성하였다. 얻은 새로운 TCRα와 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 도 9(1)-(29) 및 도 10(1)-(16)에 도시된 바와 같다. TCR 분자의 CDR 영역이 대응되는 pMHC 복합체와의 친화력을 결정하므로, 당업자는 고친화력 돌연변이를 도입한 αβ 이형질 이합체 TCR은 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 대한 고친화력도 갖는 것으로 기대할 수 있다. 실시예5에 따른 방법으로 발현 벡터를 구축하고, 실시예6에 따른 방법으로 상기 고친화력 돌연변이를 도입한 αβ 이형질 이합체 TCR을 발현시키고 재생하며 정제한 후, BIAcore T200로 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체와의 친화력을 측정하고, 표 4에 나타낸 바와 같다.
TCR 번호 TCR가변 도메인
(SEQ ID NO)
α β		 KD(M)
1 58 2 2.90E-10
2 59 87 1.10E-11
3 60 87 1.13E-11
4 60 88 1.43E-11
5 60 89 1.35E-11
6 61 90 1.19E-11
7 62 90 6.63E-12
8 63 87 8.77E-12
9 64 91 8.41E-12
10 65 90 6.05E-12
11 66 89 9.70E-12
12 1 92 2.13E-06
13 1 93 1.72E-06
14 1 94 1.02E-06
15 1 95 1.04E-06
16 1 96 1.60E-06
17 1 97 3.01E-07
18 1 98 1.33E-07
19 67 2 9.69E-07
20 68 2 2.24E-05
21 69 2 3.26E-08
22 70 2 1.12E-07
23 71 2 3.57E-07
24 72 2 1.54E-07
25 73 2 3.10E-07
26 74 2 1.15E-07
27 75 2 5.69E-07
28 76 2 2.97E-07
29 77 2 5.90E-07
30 78 2 4.37E-07
31 79 2 6.86E-07
32 80 2 2.57E-11
33 81 2 3.80E-11
34 82 2 2.17E-11
35 83 2 4.55E-11
36 59 2 3.55E-11
37 63 2 3.03E-11
38 84 2 3.29E-11
39 85 2 5.70E-11
40 86 2 1.13E-10
41 1 99 1.59E-06
42 1 100 2.43E-06
43 1 101 1.04E-06
44 1 102 7.02E-06
상기 표 4로부터 CDR 영역 돌연변이가 도입된 αβ 이형질 이합체 TCR은 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 대한 고친화력을 유지하고 있음을 알 수 있다. 상기 이형질 이합체 TCR의 친화력은 적어도 야생형 TCR이 SLLMWITQC-HLA-A2 복합체에 대한 친화력의 2배이다.
실시예8. 항-CD3항체와 고친화성 단일 사슬 TCR의 융합체의 발현, 재생 및 정제
본 발명의 고친화성 단일 사슬 TCR분자와 항CD3항체의 단일 사슬 분자(scFv)를 융합하여 융합 분자를 구축하였다. 오버랩(overlap)PCR의 방법을 통하여, 프라이머를 설계하여 항-CD3항체와 고친화성 단일 사슬 TCR 분자의 유전자를 연결하고, 중간의 연결 올리고펩티드(linker)는 GGGGS로 설계되며, 융합 분자의 유전자 단편이 제한 효소 사이트 NcoⅠ와 NotⅠ를 갖도록 하였다. PCR 증폭 산물을 NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단하고, NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단된 pET28a벡터에 의해 연결된다. 연결 산물을 E. coli DH5α 컴피턴트(competent) 세포에 형질 전환시키고, 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에 코팅하며, 37 ℃의 온도 하에서 거꾸로 하룻밤 동안 배양하고, 양성 클론을 취하여 PCR 선별하며, 양성 재조합체에 대하여 시퀀싱하고, 서열의 정확 여부를 확인한 후 재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 추출하여 E.coli BL21(DE3) 컴피턴트 세포에 형질 전환시켰다.
융합 단백질의 발현
목적 유전자를 함유한 발현 플라스미드를 대장간균 균주 BL21(DE3)에 형질 전환시키고, LB 플레이트(카나마이신50 μg/ml)에 코팅하여, 37 ℃의 온도 하에서 거꾸로 하룻밤 배양하였다. 다음 날, 클론을 선택하여 10 ml의 LB 액체 배지(카나마이신50 μg/ml)에 2 ~ 3시간 동안 배양하고, 1:100의 체적비에 따라 1 L의 LB 배지(카나마이신50 μg/ml)에 접종하며, 계속하여 0.5 ~ 0.8의 OD600 까지 배양한 후, 0.5 mM의 최종 농도의 IPTG로 목적 단백질의 발현을 유도하였다. 4시간 동안 유도한 후, 6000 rpM으로 10분 동안 원심 분리하여 세포를 얻었다. PBS 완충액으로 균체를 1번 세척하여 균체를 나누어 넣고, 200 ml의 박테리아 배양물에 해당되는 균체를 취하여 5 ml의 BugBuster Master Mix(Novagen)로 박테리아를 해리하며, 6000 g으로 15분 동안 원심 분리하여 봉입체를 수집하였다. 다음, 세척제로 4번 세척하여 세포 파괴물과 막 성분을 제거하였다. 다음, PBS와 같은 완충액으로 봉입체를 세척하여 세척제와 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 8 M의요소를 함유한 Tris 완충액으로 용해시키고, 봉입체의 농도를 측정하며, 이를 나누어 넣고 -80 ℃의 온도 하에서 냉동 보관하였다.
융합 단백질의 리폴딩(refolding)
-80 ℃의 온도의 초저온 냉장고에서 약 10 mg의 봉입체를 취하여 해동하고, 디티오트레이톨(DTT)를 넣어 최종 농도를 10 mM으로 하며, 37 ℃의 온도에서 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션하여(Incubate) 이황화 결합이 완전히 해제되는 것을 확보하였다. 다음, 봉입체 샘플 용액을 각각 200 ml의 4 ℃의 예냉 리폴딩 완충액(100 mM Tris pH 8.1, 400 mM L-아르기닌, 2 mM EDTA, 5 M 요소, 6.5 mM β-mercapthoethylamine,1.87 mM Cystamine)에 적가하고, 약 4 ℃의 온도 하에서 30분 동안 천천히 교반하였다. 재생 용액을 8배 체적의 예냉된 H2O로 16 ~ 20시간 동안 투석하였다. 다시 8배 체적의 10 mM의 Tris pH 8.0로 2번 투석하고, 4 ℃의 온도에서 계속하여 약 8시간 동안 투석하며, 투석 후 샘플을 여과한 후 하기와 같이 정제하였다.
융합 단백질의 첫번째 단계 정제
투석된 리폴링 물질(10 mM Tris pH 8.0에)을 POROS HQ/20 음 이온 교환 크로마토그래피 전로딩 칼럼(Applied Biosystems)을 사용하여, AKTA 정제기(GE Healthcare)에서 0 ~ 600 mM의 NaCl로 구배 용출하였다. 쿠마시브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색된 SDS-PAGE로 각 성분을 분석한 후 합병하였다.
융합 단백질의 두번째 단계 정제
첫번째 단계 정제 합병된 샘플 용액을 농축하여 이 단계 정제에 제공하고, PBS완충액에서 사전 평형시킨 Superdex 75 10/300 GL 겔 여과 크로마토그래피 전로딩 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 융합 단백질을 정제하고, 쿠마시브릴리언트블루로 염색된 SDS-PAGE로 피크 성분을 분석한 후 합병하였다.
실시예9. 항-CD3항체와 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 융합체의 발현, 재생 및 정제
항-CD3의 단일 사슬 항체(scFv)와 αβ 이형질 이합체 TCR을 융합하여 융합 분자를 제조하였다. 항-CD3의 scFv와 TCR의 β 사슬을 융합하고, 상기 TCRβ사슬은 임의의 상기 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 β사슬 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 융합 분자의 TCRα사슬은 임의의 상기 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 α사슬 가변 도메인을 포함할 수 있다.
융합 분자 발현 벡터의 구축
1. α사슬 발현 벡터의 구축
αβ 이형질 이합체 TCR의 α사슬을 지닌 목적 유전자를 NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단하고, NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단된 pET28a벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α에 형질 전환시키고, 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에 코팅하며, 37 ℃의 온도 하에서 거꾸로 하룻밤 배양하고, 양성 클론을 취하여 PCR 선별하며, 양성 재조합체에 대하여 시퀀싱하고, 서열의 정확 여부를 확인한 후 재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 추출하여 E.coli BL21(DE3)에 형질 전환시켰다.
2. 항-CD3(scFv)-β 사슬 발현 벡터의 구축
오버랩(overlap)PCR의 방법으로, 프라이머를 설계하여 항-CD3 scFv와 고친화성 이형질 이합체 TCRβ사슬 유전자를 연결하며, 중간의 연결 올리고펩티드(linker)는 GGGGS이고, 항-CD3의 scFv와 고친화성 이형질 이합체 TCRβ사슬의 융합 단백질의 유전자 단편이 제한 효소 사이트 NcoⅠ(CCATGG)와 NotⅠ(GCGGCCGC)를 갖도록 하였다. PCR 증폭 산물을 NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단하고, NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단된 pET28a 벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α 컴피턴트 세포에 형질 전환시키고, 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에 코팅하며, 37 ℃의 온도 하에서 거꾸로 하룻밤 동안 배양하고, 양성 클론을 취하여 PCR 선별하며, 양성 재조합체에 대하여 시퀀싱하고, 서열의 정확 여부를 확인한 후 재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 추출하여 E.coli BL21(DE3) 컴피턴트 세포에 형질 전환시켰다.
융합 단백질의 발현, 재생 및 정제
발현 플라스미드를 각각 E. coli Tuner (DE3) 컴피턴트 세포에 형질 전환시키고, LB 플레이트(카나마이신50 μg/mL)에 코팅하여 37 ℃의 온도 하에서 하룻밤 배양하였다. 다음 날, 클론을 선택하여 10 ml의 LB 액체 배지(카나마이신50 μg/ml)에 2 ~ 3시간 동안 배양하고, 1:100의 체적비에 따라 1 L의 LB 배지(카나마이신50 μg/ml)에 접종하며, 계속하여 0.5 ~ 0.8의 OD600 까지 배양한 후, 최종 농도가 1 mM인 IPTG를 넣어 목적 단백질의 발현을 유도하였다. 4시간 동안 유도한 후, 6000 rpM으로 10분 동안 원심 분리하여 세포를 얻었다. PBS 완충액으로 균체를 1번 세척하여 균체를 나누어 넣고, 200 ml의 박테리아 배양물에 해당되는 균체를 취하여 5 ml의 BugBuster Master Mix(Novagen)로 박테리아를 해리하며, 6000 g으로 15분 동안 원심 분리하여 봉입체를 수집하였다. 다음, 세척제로 4번 세척하여 세포 파괴물과 막 성분을 제거하였다. 다음, PBS와 같은 완충액으로 봉입체를 세척하여 세척제와 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 6 M의 염산구아니딘, 10 mM의 디티오트레이톨(DTT), 10 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 20 mM의 Tris, pH 8.1을 함유한 완충액으로 용해하고, 봉입체 농도를 측정하며, 이를 나누어 넣고 -80 ℃의 온도 하에서 냉동 보관하였다.
용해된 TCRα사슬과 항-CD3 (scFv)-β 사슬을 2: 5의 질량비로 5 M의 요소(urea), 0.4 M의 L-아르기닌(L-arginine), 20 mM의 Tris pH 8.1, 3.7 mM의 cystamine, 6.6 mM의 β-mercapoethylamine (4 ℃)에 신속하여 혼합하고, α사슬과 항-CD3 (scFv)-β 사슬의 최종 농도는 각각 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL이다.
혼합 후의 용액을 10배 체적의 탈이온수에서 투석하고(4 ℃), 12시간 후 탈이온수를 완충액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 바꾸어 계속하여 4 ℃의 온도에서 12시간 동안 투석하였다. 투석 완료된 용액을 0.45 μM의 여과막으로 여과한 후, 음 이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP, 5ml, GE Healthcare)으로 정제하였다. SDS-PAGE겔로 용출 피크에 성공적으로 재생된 TCRα사슬과 항-CD3 (scFv)-β 사슬의 이합체의 TCR이 함유된 것을 확인하였다. TCR 융합 분자를 크기 배제 크로마토그래피(S-100 16/60, GE healthcare)로 추가적으로 정제하고, 음 이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP 5ml, GE healthcare)으로 다시 정제하였다. 정제된 TCR 융합 분자의 순도는 SDS-PAGE에 의해 90 %보다 큰 것으로 측정되었고, 농도는 BCA법으로 측정하였다.
실시예10. 본 발명의 고친화력 TCR이 형질 감염된 효과 세포의 활성화 기능 실험
본 실시예에서 본 발명의 고친화력 TCR이 형질 감염된 효과 세포가 표적 세포에 대하여 우수한 특이적 활성 작용이 있는 것을 검증하였다.
ELISPOT 실험을 통하여 세포에서의 본 발명의 고친화력 TCR의 기능 및 특이성을 측정하였다. ELISPOT 실험을 통하여 세포 기능을 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 본 실시예IFN-γ ELISPOT 실험은 건강한 지원자의 혈액으로부터 분리된 CD8+ T 세포를 사용하여 렌티바이러스(Lentivirus)에 의해 형질 감염된 TCR을 효과 세포로 하고, 각각 TCR1(α사슬 가변 도메인SEQ ID NO:67, β사슬 가변 도메인SEQ ID NO:2) 및 TCR2(α사슬 가변 도메인SEQ ID NO:68, β사슬 가변 도메인SEQ ID NO:2)로 태깅하고, 대조군 효과 세포를 WT-TCR(형질 감염 야생형 TCR) 및 GFP(녹색 형광 단백질)(형질 감염 GFP)로 태깅하였다. 표적 세포주는 A375, Mel624, Mel526 및 NCI-H1650 세포이다. 여기서, 표적 세포주 A375와 Mel624은 관련 항원을 발현하고, Mel526과 NCI-H1650은 관련 항원을 발현하지 않으므로 대조로 하였다.
우선, ELISPOT 플레이트를 준비하였다. ELISPOT 플레이트를 에탄올로 활성화하여 코팅하고, 4 ℃의 온도 하에서 하룻밤 경과하였다, 실험 1일 째에, 코팅액을 제거하고, 세척하여 차단하며, 실온 하에서 2시간 동안 배양하고, 차단액을 제거하며, 배지로 효과 세포를 1 × 105개 세포/ml로 조절하고, 배지로 표적 세포주를 2 × 105개 세포/ml로 조절하는 순서에 따라 테스트되는 각 성분을 ELISPOT 플레이트에 넣었다. 균일하게 혼합한 후 2 × 105개 세포/ml(즉 20000개 세포/웰)의 100 μL의 표적 세포주, 1 × 105개 세포/ml(즉 10000개 세포/웰)의 100 μL의 효과 세포를 취하여 대응되는 웰에 넣고, 2개의 듀플리케이트 웰(Duplicate Well)을 설정하였다. 하룻밤 인큐베이션하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일 째에, 플레이트를 세척하고 2차 검출과 발색을 진행하며, 플레이트를 건조하고, 다시 면역 도트 플레이트 판독기(ELISPOT READER system; AID20 회사)로 막에 형성된 반점을 계수하였다. 실험 결과는 도 13에 나타낸 바와 같고, 본 발명의 고친화력 TCR을 형질 감염시킨 효과 세포는 표적 세포에 대하여 우수한 특이적 활성 작용이 있다.
실시예11. 본 발명의 고친화력 TCR을 형질 감염시킨 효과 세포의 살상 기능 실험
본 실시예는 비방사성 세포 독성 실험을 통하여, LDH의 방출을 측정함으로써, 본 발명의 TCR을 형질 도입시킨 세포의 살상 기능을 검증하였다. 상기 시험은 51Cr 방출 세포 독성 시험의 비색 대체 시험으로, 세포 분해 후 방출된 유산탈수소효소(LDH)를 정량 분석하였다. 30분 동안 커플링된 효소 반응으로 배지에 방출된 LDH를 검출하고, 효소 반응에서 LDH은 라졸륨염(INT)을 적색의 포르마잔(formazan)으로 전환시킬 수 있다. 생성된 적색의 산물의 양과 분해된 세포 수는 정비례된다. 표준 96웰 플레이트 판독기로 490 nm의 가시광선 데이터를 수집할 수 있다.
LDH의 방출 실험으로 세포 기능을 검출하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 본 실시예의 LDH 실험은 건강한 지원자의 혈액으로부터 분리된 CD8+ T 세포를 사용하여 렌티바이러스에 의해 형질 감염된 TCR을 효과 세포로 하였다. 표적 세포주는 A375(3525), MEL624 (1605), NCI-H1650(2) 및 MEL526 (4) 세포이다. 여기서, A375(3525)와 MEL624(1605)는 NY-ESO-1 항원을 발현하였다. NCI-H1650(2)와 MEL526(4)는 NY-ESO-1항원을 기본적으로 발현하지 않고, 이를 대조로 하였다.
우선, LDH 플레이트를 제조하였다. 실험 1일 째에, 배지로 효과 세포를 2 × 106개 세포/ml로 조절하고, 배지로 표적 세포주를 5 × 105개 세포/ml조절하는 순서에 따라 테스트되는 각 성분을 플레이트에 넣었다. 균일하게 혼합한 후 5 × 105개 세포/ml(즉 50000개 세포/웰)의 100 μL의 표적 세포주, 2 × 106개 세포/ml(즉 200000개 세포/웰)의 100 μL의 효과 세포를 취하여 대응되는 웰에 넣고, 2개의 듀플리케이트 웰을 설정하였다. 동시에, 효과 세포 자발적 웰, 표적 세포 자발적 웰, 표적 세포 최대 웰, 체적 교정 대조 웰 및 배지 배경 대조 웰을 설정하였다. 하룻밤 인큐베이션하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일 째에, 발색을 측정하고, 반응 종료 후 마이크로 플레이트 리더(Bioteck)로 490 nm 하에서 흡광치를 기록하였다. 실험 결과는 도 14에 나타낸 바와 같고, 본 발명의 TCR이 형질 도입된 세포는 관련 항원을 발현하는 표적 세포에 대하여 아주 강한 살상 작용이 있으나, 관련 항원을 발현하지 않은 표적 세포에 대하여 살상 작용이 없다.
실시예12. 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3항체의 융합 단백질의 기능 실험
본 실시예는 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3항체의 융합 단백질이 효과 세포에 대하여 다시 정향할 수 있고 우수한 활성 작용이 있는 것을 검증하였다.
ELISPOT 실험을 통하여 세포 기능을 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 본 실시예IFN-γ ELISPOT 실험에 사용된 효과 세포는 건강한 지원자의 혈액으로부터 분리된 CD8+ T 세포이고, 표적 세포주는 IM9와 293T이며, 여기서, IM9는 관련 항원을 발현하고, 293T는 관련 항원을 발현하지 않는다. 본 발명의 고친화력 TCR을 무작위로 선택하여 실시예8에 따라 융합 단백질을 제조하고, 구체적으로, 선택된 고친화력 TCR의 α와 β사슬은 하기와 같다. α사슬 SEQ ID NO:14, β사슬 SEQ ID NO:38; α사슬SEQ ID NO:17, β사슬 SEQ ID NO:40; α사슬 SEQ ID NO:13, β사슬 SEQ ID NO:41; α사슬 SEQ ID NO:11, β사슬 SEQ ID NO:40; α사슬 SEQ ID NO:15, β사슬 SEQ ID NO:42; α사슬 SEQ ID NO:16, β사슬 SEQ ID NO:41; α사슬 SEQ ID NO:11, β사슬 SEQ ID NO:38; α사슬 SEQ ID NO:11, β사슬 SEQ ID NO:39; α사슬 SEQ ID NO:10, β사슬 SEQ ID NO:38; α사슬 SEQ ID NO:12, β사슬 SEQ ID NO:41이다.
우선, ELISPOT 플레이트를 준비하였다. ELISPOT 플레이트를 에탄올로 활성화하여 코팅하고, 4 ℃의 온도 하에서 하룻밤 경과하였다, 실험 1일 째에, 코팅액을 제거하고, 세척하여 차단하며, 실온 하에서 2시간 동안 배양하고, 차단액을 제거하며, 하기 순서에 따라 테스트되는 각 성분을 ELISPOT 플레이트에 넣었다: 배지로 CD8+ T 세포를 2 × 104개 세포/ml로 조절하고, 배지로 표적 세포주를 2 × 105개 세포/ml로 조절하며, 배지를 넣어 융합 단백질을 0.04μM의 농도로 희석하고, 차례로 10배 구배로 희석하며, 총 6개 농도의 구배이다. 균일하게 혼합한 후 50 μL의 융합 단백질 희석액, 2 × 105개 세포/ml(즉 10000개 세포/웰)의 50 μL의 표적 세포주, 2 × 104개 세포/ml(즉 2000개 효과 세포/웰)의 100 μL의 효과 세포를 취하여 대응되는 웰에 넣고, 2개의 듀플리케이트 웰을 설정하였다. 하룻밤 인큐베이션하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일 째에, 플레이트를 세척하고 2차 검출과 발색을 진행하며, 플레이트를 건조하고, 다시 면역 도트 플레이트 판독기(ELISPOT READER system; AID20 회사)로 막에 형성된 반점을 계수하였다. 실험 결과는 도 15a 및 15b에 도시된 바와 같이, 본 발명의 고친화력 TCR와 항-CD3항체의 융합 단백질은 효과 세포에 다시 정향될 수 있고, 우수한 활성 작용이 있다.
실시예13. 본 발명의 고친화력 TCR 분자의 체내 효능
본 발명의 고친화력 TCR로 형질 감염된 T 세포를 흑색종 이종 이식 모델의 마우스 체내에 주사하고, 체내에서 종양에 대한 억제 효과를 측정하였다.
실험에 NSG 마우스(난징 대학-난징 생물 의학 연구소)(자성, 실험 주령 6 ~ 8주)를 실험 대상으로 사용하고, 실험 시간 10일 전에 배양 후 수집하고 부유된 A375 종양 세포(ATCC) 부유액을 3*106개/마리(주사 체적 200 ul)의 개수로 마우스 복부 단측 피하에 주사하여, 흑색종 이종 이식 마우스 모델을 구축하였다.
실험 시작 당일에 슬라이드 캘리퍼스(slide calipers)로 각 마우스의 성형된 종양의 긴 직경(a), 짧은 직경(b)을 각각 측정하고, V=a*b^2/2 공식에 따라 종양 체적을 측정한 후; 그룹 나누기 설정은, PBS군 5마리, 대조군(TCR를 형질 감염시키지 않은 T 세포) 7마리, TCR1(α사슬 가변 도메인SEQ ID NO:67, β사슬 가변 도메인SEQ ID NO:2)이 형질 감염된 T 세포군 10마리 및 TCR2(α사슬 가변 도메인SEQ ID NO:68, β사슬 가변 도메인SEQ ID NO:2)이 형질 감염된 T 세포군 10마리이고, 종양 체적에 따라 마우스를 무작위로 나눈다. 그룹을 나눈 후 제조된 T 세포를 1*107개/마리로 각각 상기 그룹의 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고, PBS 그룹 마우스의 꼬리 정맥에 100 ul의 PBS를 주사하였다.
TCR-T 세포 주사 후, 제조된 IL-2 용액(50000 IU/100 UL) 을 다시 취하여 각 마우스의 복강에 100 ul 주사한 후, 4일 동안에 매일 같은 량의 IL-2 용액을 연속으로 주사하였다. 실험 시작으로부터 상기 방법에 따라 3일 간격으로 마우스 종양 직경을 측정하여 체적을 계산하고, 마우스 종양이 너무 커 행동에 영향을 주거나 종양이 가라앉을 때까지 유지하며, 상기 데이터를 정리하여 각 그룹의 마우스 종양 체적에 관하여 데이터 통계 분석 처리하였다.
얻은 실험 결과는 도 16에 나타낸 바와 같고, 본 발명의 고친화력 TCR를 형질 감염시킨 T 세포를 주사한 마우스 군의 종양 생장은 현저하게 억제되고 축소되는 경향이 있으나, TCR를 형질 감염시키지 않은 T 세포르 주사한 군 및 PBS를 주사한 군의 마우스 군의 종양 체적은 여전히 빠르게 증가하였다.
본 발명에서 언급되는 모든 문헌은 본원 발명에서 각각의 문헌이 단독으로 참조로 인용되는 것처럼 참조로 인용된다. 이 외에 본 발명의 상기 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대하여 다양한 변경 또는 수정을 할 수 있으며, 이런한 등가 형식도 본원에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속하는 것을 이해하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> GUANGDONG XIANGXUE LIFE SCIENCES, LTD. <120> HIGH-AFFINITY TCR FOR NY-ESO <130> IPA190803-CN <150> CN 201611078596.2 <151> 2016-11-29 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Gly Lys 85 90 95 Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 3 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Glu Ile Thr Ala Val Arg 65 70 75 80 Pro Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Gly Lys 85 90 95 Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Arg 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tcacgcagtc tccgcgtcat gaaagtgtgg aaatgggcca agaagttacg 60 ctgcgctgca aaccgatcag cggtcacgac tacctgtttt ggtaccgtca gaccccgaaa 120 cgcggcctgg aactgctgat ctacttcaac aataacgttc cgattgatga ctcgggtatg 180 ccggaagatc gttttagcgc gaaaatgccg aatgcctcgt tcagcacgct gaaaattcag 240 ccggtcgaac cgcgtgactc cgcagtgtat ttttgtgctt cctcactggg cagtaacgaa 300 cagtacttcg gcccgggtac ccgtctgacc gtgacg 336 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 7 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly 20 <210> 8 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ggcggtggct ccgaaggtgg cggttcagaa ggcggtggct cggaaggtgg cggtagcgaa 60 ggcggtaccg gt 72 <210> 9 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 9 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Glu Ile Thr Ala Val Arg 65 70 75 80 Pro Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Phe Ala Trp 85 90 95 Trp Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Gly Trp Ala Gln Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Thr Gly Glu Gln Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Glu Ile Thr Ala Val Arg 65 70 75 80 Pro Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Ala Arg 85 90 95 Trp Asn Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 11 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser 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Trp Ala Gln Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Thr Gly Gln Ala Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Ala Arg 85 90 95 Trp Glu Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 82 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 82 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Gly Ser Ile Gln Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Phe Ala Trp 85 90 95 Trp Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 83 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 83 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Gly Trp Val Gln Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Thr Gly Glu Gln Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Ala Arg 85 90 95 Trp Asn Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 84 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 84 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Gly Ser Ile Gln Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Thr Gly Glu Gln Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Trp Ala Arg 85 90 95 Trp Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 85 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 85 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Gly Trp Val Gln Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Thr Gly Gln Ala Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Ala Arg 85 90 95 Trp Glu Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 86 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 86 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Gly Ser Ile Gln Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Thr Gly Glu Gln Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Ala Arg 85 90 95 Trp Asn Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro 100 105 <210> 87 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 87 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn His Gly Ala Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 88 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 88 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn His Gly Ala Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Arg 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 89 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 89 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn His Gly Ala Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Lys 85 90 95 Gly Ala Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 90 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 90 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn His Gly Ala Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 91 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 91 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn His Gly Ala Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu 85 90 95 Gly Ala Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 92 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 92 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu 85 90 95 Gly Gly Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 93 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 93 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Lys 85 90 95 Gly Ala Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 94 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 94 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu 85 90 95 Gly Pro Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 95 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 95 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Arg 85 90 95 Gly Ala Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 96 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 96 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Met 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 97 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 97 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 98 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 98 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu 85 90 95 Gly Ala Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 99 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 99 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Met 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 100 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 100 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Arg 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 101 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Met 85 90 95 Gly Ala Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 102 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 102 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Met Leu 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 103 <211> 203 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 103 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Ala Asn Gly Lys 85 90 95 Ile Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu His Ile Leu Pro Asn Ile Gln 100 105 110 Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp 115 120 125 Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser 130 135 140 Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp 145 150 155 160 Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn 165 170 175 Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro 180 185 190 Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 <210> 104 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 104 Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly 1 5 10 15 Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Ser Asn Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 210 215 220 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240 Ala Asp

Claims (53)

  1. SLLMWITQC-HLA A2 복합체에 결합하는 활성을 갖고, TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)로서,
    상기 TCRα사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하며, 상기 TCR은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR을 가지는, TCR:
    Figure 112021017377439-pct00050

    Figure 112021017377439-pct00051

    Figure 112021017377439-pct00052
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TCR는 가용성인, TCR.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 αβ 이형질 이합체 TCR인, TCR.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 TCR은 (i) 막 관통 도메인 이외의 TCRα사슬의 전부 또는 부분 및 (ii) 막 관통 도메인 이외의 TCRβ사슬의 전부 또는 부분을 포함하고, (i)과 (ii)은 모두 TCR 사슬의 가변 도메인 및 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함하는, TCR.
  5. 제4항에 있어서,
    인공적인 사슬 간 이황화 결합이 TCR의 α사슬 불변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 포함되는, TCR.
  6. 제5항에 있어서,
    TCR의 α사슬 불변 영역과 β사슬 불변 영역 사이의 인공적인 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인(Cysteine) 잔기가,
    TRAC*01 엑손(Exon)1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57;
    TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser77;
    TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser17;
    TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Asp59;
    TRAC*01 엑손1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu15;
    TRAC*01 엑손1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser54;
    TRAC*01 엑손1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ala19; 및
    TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu20로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 그룹을 치환한 것인, TCR:
  7. 제1항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 58 ~ 86으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; 또는
    상기 TCR의 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 87 ~ 102로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; 또는
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 58 ~ 86으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 87 ~ 102로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, TCR.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, TCR:
    Figure 112021017377439-pct00053

    Figure 112021017377439-pct00054

    Figure 112021017377439-pct00055
    .
  9. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 단일 사슬 TCR인, TCR.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인으로 이루어진 단일 사슬 TCR이고, 상기 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인은 연성 올리고펩티드 서열(linker)에 의해 연결되는, TCR.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인 및 β사슬 가변 도메인의 소수성 코어(Hydrophobic core)의 적어도 하나가 돌연변이된, TCR.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9 ~ 37로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; 또는
    상기 TCR의 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 38 ~ 53으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; 또는
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9 ~ 37로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 38 ~ 53으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, TCR.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, TCR:
    Figure 112021017377439-pct00056

    Figure 112021017377439-pct00057

    Figure 112021017377439-pct00058
    .
  14. 제1항에 있어서,
    접합체가 상기 TCR의 α사슬 및 β사슬 중 적어도 하나의 C- 또는 N- 말단에 결합하는, TCR.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 TCR에 결합하는 접합체는 검출 가능한 마커, 치료제, PK 변형 부분 또는 임의의 이러한 물질들의 조합인, TCR.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 TCR에 결합하는 치료제는 TCR의 α 또는 β 사슬의 C- 또는 N- 말단에 결합되는 항-CD3 항체인, TCR.
  17. 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하고, 적어도 하나의 TCR 분자가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR인, 다가 TCR 복합체.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR을 코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제18항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  20. 제18항의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하거나, 또는 게놈 내에 통합된 외인성의 제18항의 핵산 분자를 가지는 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR을 발현하는 분리된 세포.
  22. 약학적으로 허용 가능한 캐리어, 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR; 또는 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하고, 적어도 하나의 TCR 분자가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR인, TCR 복합체; 또는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR을 발현하는 분리된 세포를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약물 조성물.
  23. (i) 숙주 세포를 배양하여 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR을 발현하는 단계;
    (ii) 상기 TCR을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR을 제조하는 방법으로서,
    상기 숙주 세포가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 TCR을 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유하는 벡터를 포함하거나, 또는 상기 숙주 세포가 게놈 내에 통합된 외인성의 상기 핵산 분자를 가지는, 방법.
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