KR20210142666A - Ａｆｐ 항원을 식별하기 위한 고친화력 ｔｃｒ - Google Patents

Ａｆｐ 항원을 식별하기 위한 고친화력 ｔｃｒ Download PDF

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KR20210142666A
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Abstract

본 발명은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합되는 특성을 구비하고; 상기 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 결합 친화력은 적어도 야생형 TCR이 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 결합 친화력의 5배인 T세포 수용체(TCR)를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 유형의 TCR과 치료제의 융합 분자를 제공한다. 이러한 유형의 TCR은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 종양 세포를 표적화 제시하기 위해 단독으로 사용될 수 있고, 치료제와 함께 병용될 수도 있다.

Description

ＡＦＰ 항원을 식별하기 위한 고친화력 ＴＣＲ
본 발명은 생명 기술 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 AFP 단백질 유래의 폴리펩티드를 식별할 수 있는 T세포 수용체(T cell receptor, TCR)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 수용체의 제조 및 용도에 관한 것이다.
특이적인 방식으로 항원을 식별할 수 있는 분자에는 2가지 유형만이 존재한다. 하나는 면역글로블린 또는 항체이고; 다른 하나는 T세포 수용체(TCR)이며, 이는 α사슬/β사슬 또는 γ사슬/δ사슬에 의해 헤테로다이머(heterodimer) 형식으로 존재하는 세포막 표면의 당단백질이다. 면역계의 TCR 총 스팩트럼의 조성은 흉선에서 V(D)J에 의해 재조합된 후, 양성 및 음성의 선택에 의해 생성된다. 말초 환경에서, TCR은 주조직적합성 복합체-펩티드 복합체(pMHC)에 대한 T세포의 특이적인 식별을 매개하므로, 이의 면역계의 세포 면역 기능에 있어서 매우 중요하다.
TCR은 주조직적합성 복합체(MHC) 상에 제시되는 특이적 항원 펩티드의 유일한 수용체로서, 이러한 외인성 펩티드 또는 내인성 펩티드는 세포에서 이상이 나타나는 유일한 현상일 수 있다. 면역계에서, 항원 특이적 TCR과 pMHC 복합체의 결합에 의해 T세포와 항원제시세포(APC)의 직접적인 물리적 접촉을 유발한 후, T세포 및 APC 양자의 다른 세포막 표면 분자가 상호작용하여, 일련의 후속적인 세포 신호전달 및 다른 생리적 반응을 일으켜, 상이한 항원 특이적 T세포가 이의 표적 세포에 면역 효과를 발휘하도록 하였다.
TCR에 대응되는 MHC I유형과 II유형의 분자 리간드도 면역글로블린 슈퍼패밀리의 단백질이지만, 항원의 제시에 특이적이고, 상이한 개체가 상이한 MHC를 가지므로, 단백질 항원 내의 상이한 올리고펩티드가 각각의 APC 세포 표면에 제시될 수 있다. 인간의 MHC를 통상적으로 HLA 유전자 또는 HLA 복합체라고 한다.
알파태아단백이라고도 불리는 AFP(α Fetoprotein)는, 태아 발육과정에서 발현되는 단백질로서 태아혈청의 주성분이다. 발육과정에서 AFP는 난황낭과 간에서 비교적 높은 수준의 발현을 보이고 이후에 억제된다. 간세포암에서 AFP의 발현이 활성화된다. AFP는 세포 내에서 생성된 후 소분자 폴리펩티드로 분해되고, MHC(주조직적합성 복합체) 분자에 결합되어 복합체를 형성하며, 세포 표면에 제시된다. FMNKFIYEI(SEQ ID NO: 25)는 AFP 항원 유래의 올리고펩티드로, AFP 관련 질환 치료의 표적이다.
따라서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체는 종양 세포 표지를 표적화 할 수 있는 TCR을 제공한다. FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합될 수 있는 TCR은 종양의 치료에 대한 높은 적용 가치를 가지고 있다. 예를 들어, 상기 종양 세포 표지를 표적화 할 수 있는 TCR은 상기 TCR을 발현하는 T세포가 종양 세포를 파괴할 수 있도록 세포 독성제 또는 면역 자극제를 표적 세포에 전달하거나, T세포에 형질전환되어, 양자 면역 치료로 불리는 치료 과정에서 환자에게 투여될 수 있다. 전자의 목적인 경우, 이상적인 TCR은 높은 친화력을 가진 것으로, 상기 TCR이 표적 세포 상에 오랫동안 머무를 수 있도록 한다. 후자의 목적인 경우, 중등 친화력의 TCR을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 당업자는 상이한 목적을 만족시킬 수 있는 종양 세포 표지를 표적화하는 TCR 개발에 전념하고자 한다.
본 발명은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 고친화력을 가진 TCR을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 유형의 TCR의 제조 방법 및 상기 유형의 TCR의 용도를 제공하는 것을 다른 하나의 목적으로 한다.
본 발명의 제1 측면에서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합되는 활성을 구비한 T세포 수용체(TCR)를 제공하였다.
다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 T세포 수용체(TCR)는 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합되는 활성을 구비하고, 또한 상기 T세포 수용체는 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하며, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 3개 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같으며,
CDR1α: DSAIYN
CDR2α: IQSSQRE
CDR3α: AVNSGGSNYKLT, 또한 CDR3α는 하기의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하고,
Figure pct00001
및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 즉 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRα사슬 가변 도메인에서 CDR3α의 돌연변이 수는 1 내지 4개이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 5배다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 즉 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다:
CDR1β: SGHVS
CDR2β: FQNEAQ
CDR3β: ASSLFGQGREKLF.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRβ사슬의 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하며, 여기서 CDR1α의 아미노산 서열은 DSAIYN이고, CDR2α의 아미노산 서열은 IQSSQRE이며; 및 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하고, 여기서 CDR1β의 아미노산 서열은 SGHVS이고, CDR2β의 아미노산 서열은 FQNEAQ이고, CDR3β의 아미노산 서열은 ASSLFGQGREKLF이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하며, 여기서 CDR1α의 아미노산 서열은 DSAIYN이고, CDR2α의 아미노산 서열은 IQSSQRE이며, CDR3α의 아미노산 서열은 AV[3aX1][3aX2][3aX3][3aX4][3aX5][3aX6]YKLT이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3aX1]은 N 또는 D 또는 E이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3aX2]는 S 또는 D 또는 G 또는 A 또는 W 또는 T 또는 H이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3aX3]은 G 또는 Q 또는 A 또는 V 또는 H 또는 W 또는 Y 또는 M 또는 I이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3aX4]는 G 또는 D 또는 R 또는 P 또는 Q 또는 T 또는 Y이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3aX5]는 S 또는 G 또는 D이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 [3aX6]은 N 또는 G 또는 D이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 하기로부터 선택되는 CDR을 포함한다.
Figure pct00002
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 가용인 것이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 α사슬 TRAC 불변 영역 서열 및 β사슬 TRBC1 또는 TRBC2 불변 영역 서열을 포함하는 αβ 이형질 이합체 TCR이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 (i) 이의 막 관통 구조 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ii) 이의 막 관통 구조 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함하며, 여기서 (i)과 (ii)은 모두 TCR 사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 α사슬 불변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 함유된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCRα와 β사슬의 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인(Cysteine) 잔기가,
TRAC*01 엑손(Exon)1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57;
TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser77;
TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser17;
TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Asp59;
TRAC*01 엑손1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu15;
TRAC*01 엑손1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser54;
TRAC*01 엑손1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ala19; 및
TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu20으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 사이트를 치환한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11 ~ 24로부터 선택되고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 하기로부터 선택된다.
Figure pct00003
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 단일 사슬 TCR이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인으로 이루어진 단일 사슬 TCR이고, 상기 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인은 연성 올리고펩티드(oligopeptide) 서열(linker)에 의해 연결된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR의 α사슬 및/또는 β사슬의 C- 또는 N- 말단에 접합체가 결합된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR에 결합되는 접합체는 검출 가능한 마커, 치료제, PK 변형 부분 또는 임의의 이러한 물질들의 조합이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR에 결합되는 치료제는 상기 TCR의 α 또는 β사슬의 C- 또는 N- 말단에 연결되는 항-CD3 항체이다.
본 발명의 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 더욱 바람직하게는 적어도 50배이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 100배, 바람직하게는 적어도 500배, 더욱 바람직하게는 적어도 1000배이다.
구체적으로, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 KD ≤ 20 μM이며; 바람직하게는, 5 μM ≤ KD ≤ 10 μM이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 0.1 μM ≤ KD ≤ 1 μM이며; 바람직하게는, 1 nM ≤ KD ≤ 100 nM이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 T세포 수용체(TCR)는, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합되는 활성을 구비하고, TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하며, 상기 TCR은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 α사슬 가변 도메인에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기의 사이트는 93N, 94S, 95G, 96G, 97S 및 98N 중의 하나 또는 복수를 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 번호를 사용한다.
바람직하게는, 돌연변이 후의 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 93D 또는 93E; 94D 또는 94G 또는 94A 또는 94W 또는 94T 또는 94H; 95Q 또는 95A 또는 95V 또는 95H 또는 95W 또는 95Y 또는 95M 또는 95I; 96D 또는 96R 또는 96P 또는 96Q 또는 96T 또는 96Y; 97G 또는 97D; 및98G 또는 98D로부터 선택되는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 번호를 사용한다.
본 발명의 제2 측면에서, 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하고, 그 중의 적어도 하나의 TCR 분자는 본 발명의 제1 측면에 따른 TCR인 다가 TCR복합체를 제공하였다.
본 발명의 제3 측면에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 TCR 분자 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 다가 TCR복합체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하였다.
본 발명의 제4 측면에서, 본 발명의 제3 측면에 따른 핵산 분자를 함유하는 벡터를 제공하였다.
본 발명의 제5 측면에서, 본 발명의 제4 측면에 따른 벡터 또는 염색체 내에 외인성이 통합된 본 발명의 제3 측면에 따른 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 제공하였다.
본 발명의 제6 측면에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 TCR을 발현하는 분리된 세포를 제공하였다.
본 발명의 제7 측면에서, 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 본 발명의 제1 측면에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 측면에 따른 세포를 함유하는 약물 조성물을 제공하였다.
본 발명의 제8 측면에서, 치료가 필요한 대상에게 본 발명의 제1 측면에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 측면에 따른 세포, 또는 본 발명의 제7 측면에 따른 약물 조성물을 적정량 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 제공하였다.
바람직하게는, 상기 질환은 AFP 양성 종양이다.
바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양은 간암, 유선암 또는 생식 세포 종양이고; 더욱 바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양은 간세포 암종이다.
본 발명의 제9 측면에서, 종양을 치료하기 위한 약물의 제조에서의 본 발명의 제1 측면에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 측면에 따른 세포의 용도를 제공하였다.
바람직하게는, 상기 종양은 AFP 양성 종양이다.
바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양은 간암, 유선암 또는 생식 세포 종양이고; 더욱 바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양은 간세포 암종이다.
본 발명의 제10 측면에서, (i) 본 발명의 제5 측면에 따른 숙주 세포를 배양하여, 본 발명의 제1 측면에 따른 T세포 수용체를 발현하는 단계; (ii) 상기 T세포 수용체를 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는 본 발명의 제1 측면에 따른 T세포 수용체를 제조하는 방법을 제공하였다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술적 특징과 이하(예를 들어 실시예)에 구체적으로 기술된 각 기술적 특징은 모두 서로 조합되어 새롭거나 바람직한 기술 수단을 구성할 수 있음을 이해하여야 한다. 편폭의 제한으로 인해, 더 이상 상세히 설명하지 않을 것이다.
도 1a 및 도 1b는 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 특이적으로 결합될 수 있는 야생형 TCRα와 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형 TCR의 α가변 도메인의 아미노산 서열과 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형 TCR의 α가변 도메인의 DNA 서열과 β사슬 가변 도메인의 DNA 서열이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형 TCR의 연결 올리고펩티드(linker)의 아미노산 서열과 뉴클레오티드(Nucleotide) 서열이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 본 발명에서 구축된 단일 사슬 주형 TCR의 아미노산 서열과 DNA 서열을 나타낸다.
도 6(1) ~ (14)는 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 고친화력을 갖는 이형질 이합체 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 7a 및 도 7b는 각각 본 발명의 대조 TCRα와 β사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 특이적으로 결합될 수 있는 야생형 TCRα와 β사슬 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9는 대조 TCR 즉 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 결합 곡선이다.
도 10a ~ f는 특이적인 올리고펩티드가 부착된 T2세포에 대한 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포의 활성화 기능 실험 결과도이다.
도 11은 종양 세포주에 대한 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포의 활성화 기능 실험 결과도이다.
도 12는 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포의 살상 기능 실험 결과도이다.
도 13은 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 T세포의 체내 효능 실험 결과도이다.
본 발명은 광범위하고 깊은 연구를 거쳐, FMNKFIYEI올리고펩티드(AFP 단백질 유래)를 식별하는 고친화성 T세포 수용체(TCR)를 획득하였고, 상기 FMNKFIYEI올리고펩티드는 펩티드-HLA A0201 복합체의 형식으로 제시된다. 상기 고친화성 TCR은 이의 α사슬 가변 도메인의 3개의 CDR 영역:
CDR1α: DSAIYN
CDR2α: IQSSQRE
CDR3α: AVNSGGSNYKLT에서 돌연변이되며;
또한, 상기 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 돌연변이 후의 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 적어도 야생형 TCR의 5배이다.
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 상기 구체적인 방법과 실험 조건에 제한되지 않으며, 그러한 방법 및 조건은 변경될 수 있음을 이해하여야 한다. 본문에 사용된 용어는 단지 구체적인 해결수단을 기술하기 위한 것으로, 이의 의도는 제한적인 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에만 의해 제한된다는 점도 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본문에 사용된 모든 기술과 과학 용어는 모두 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 실시 또는 테스트에서 본 발명에 따른 것과 흡사하거나 등가적인 임의의 방법과 재료를 사용할 수 있으나, 본문에서 바람직한 방법과 재료를 예로 든다.
용어
T세포 수용체 (T cell receptor, TCR)
국제 면역 유전학 정보 시스템(IMGT)을 사용하여 TCR을 기술할 수 있다. 천연 αβ 이종이합체 TCR은 α사슬과 β사슬을 갖는다. 광의적으로, 각 사슬은 가변 영역, 접합 영역 및 불변 영역을 포함하고, 통상적으로 β사슬은 가변 영역과 접합 영역 사이에 짧은 가변 영역을 포함하지만, 상기 가변 영역은 종종 접합 영역의 일부로 여겨진다. 독특한 IMGT의 TRAJ와 TRBJ로 TCR의 접합 영역을 결정하고, IMGT의 TRAC와 TRBC로 TCR의 불변 영역을 결정한다.
각 가변 영역은 프레임(frame) 서열에 키메라된(chimeric) CDR1, CDR2 및 CDR3 3개의 CDR(상보 결정 영역)을 포함한다. IMGT 명명법에서, TRAV와 TRBV의 상이한 번호는 각각 상이한 Vα 유형과 Vβ의 유형을 지칭한다. IMGT 시스템에서, α사슬 불변 구조 도메인은 TRAC*01 부호를 가지고, 여기서 “TR”은 T세포 수용체 유전자를 나타내며; “A”는 α사슬 유전자를 나타내고; C는 불변 영역을 나타내며; “*01”은 대립 유전자1을 나타낸다. β사슬 불변 구조 도메인은 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 부호를 가지고, 여기서 “TR”은 T세포 수용체 유전자를 나태내며; “B”는 β사슬 유전자를 나타내고; C는 불변 영역을 나타내며; “*01”은 대립 유전자1을 나타낸다. α사슬의 불변 영역은 유일하게 결정되는 것이고, β사슬의 형식에서, 2개의 가능한 불변 영역 유전자 “C1”과 “C2”가 존재한다. 당업자는 개시된 IMGT데이터베이스에 의해 TCRα와 β사슬의 불변 영역 유전자 서열을 얻을 수 있다.
일반적으로, TCR의 α와 β사슬에 각각 2개의 "구조 도메인", 즉 가변 도메인과 불변 구조 도메인이 있는 것으로 본다. 가변 도메인은 연결된 가변 영역과 접합 영역으로 구성된다. 따라서, 본원 발명의 명세서와 청구 범위에서, “TCRα사슬 가변 도메인”은 연결된 TRAV와 TRAJ 영역을 지칭하고, 마찬가지로, “TCRβ사슬 가변 도메인”은 연결된 TRBV와 TRBD/TRBJ영역을 지칭한다. TCRα사슬 가변 도메인의 3개의 CDR은 각각 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α이고; TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 CDR은 각각 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β이다. 본 발명의 TCR가변 도메인의 프레임 서열은 마우스 또는 인간화인 것일 수 있고, 바람직하게는 인간화인 것이다. TCR의 불변 구조 도메인은 세포 내 부분, 막 관통 영역과 세포 외 부분을 포함한다.
본 발명에 따른 “야생형 TCR”의 α사슬 아미노산 서열 및 β사슬 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 28과 SEQ ID NO: 29이고, 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같다. 본 발명에 따른 “대조 TCR”의 α사슬 아미노산 서열 및 β사슬 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 26과 SEQ ID NO: 27이고, 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같다. 본 발명에서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합될 수 있는 야생형 TCR의 α와 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1과 SEQ ID NO: 2이고, 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같다. 본 발명에서, 용어 “본 발명의 폴리펩티드 (Peptide)”, “본 발명의 TCR”, “본 발명의 T세포 수용체”는 상호 교환 사용할 수 있다.
천연 사슬 간 이황화 결합과 인공 사슬 간 이황화 결합
천연 TCR의 막 근위 영역 Cα와 Cβ 사슬 사이에 이황화 결합이 존재하고, 본 발명에서 “천연 사슬 간 이황화 결합”이라고 한다. 본 발명에서, 인공적으로 도입되고 천연 사슬 간 이황화 결합 위치와 상이한 위치를 갖는 사슬 간 공유 이황화 결합을 “인공 사슬 간 이황화 결합”이라고 한다.
설명의 편리를 위하여, 본 발명에서 TRAC*01과 TRBC1*01 또는 TRBC2*01아미노산 서열의 위치 번호를 N단에서 C단으로의 순서에 따라 위치 넘버링하고, 예를 들어 TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N단에서 C단으로의 순서에 따라 60번째 아미노산은 P(프롤린(Proline))이고, 본 발명에서 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Pro60이라 기술하며, 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 60번 아미노산이라고 기술할 수도 있으며, 또한 예를 들어 TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N단에서 C단으로의 순서에 따라 61번째 아미노산은 Q(글루타민(Glutamine))이고, 본 발명에서 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Gln61이라 기술하며, 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산이라고 기술할 수도 있으며, 다른 것들도 이로써 유추한다. 본 발명에서, 다른 아미노산의 서열 위치 번호에 관하여 특수한 설명이 있으면, 특수한 설명에 따른다.
종양
용어 “종양”은 병리학적 유형 또는 감염 단계에 관계없이 모든 유형의 암세포 성장 또는 발암 과정을 비롯한 전이성 조직 또는 악성 형질전환 세포, 조직 또는 기관을 의미한다. 종양의 구현예는 비제한적으로, 고형 종양, 연조직 종양 및 전이성 병변을 포함한다. 고형 종양의 구현예로 육종, 폐 편평세포암 및 암과 같은 상이한 기관 계통의 악성 종양을 포함한다. 예를 들어, 감염된 전립선, 폐, 유방, 림프, 위장관(예를 들어: 결장), 생식 요로(예를 들어: 신장, 상피 세포) 및 인두를 포함한다. 폐 편평세포암으로 대부분의 결장암, 직장암, 신세포암, 간암, 폐의 비소세포 암, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함한다. 상기 암의 전이성 병변은 마찬가지로 본 발명의 방법과 조성물에 의해 치료 및 예방될 수 있다.
발명의 상세한 설명
주지된 바와 같이, TCR의 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인은 각각 3개의 CDR을 포함하고, 항체의 상보 결정 영역과 유사하다. CDR3은 항원 올리고펩티드와 상호 작용하고, CDR1 및 CDR2는 HLA와 상호 작용한다. 따라서, TCR 분자의 CDR이 이와 항원 올리고펩티드-HLA 복합체의 상호 작용을 결정하였다. 항원 올리고펩티드 FMNKFIYEI와 HLA A0201 복합체(즉, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체)에 결합될 수 있는 야생형 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열과 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1과 SEQ ID NO: 2이고, 상기 서열은 본 발명자가 처음으로 발견하였다. 이는 하기 CDR 영역을 구비한다.
α사슬 가변 도메인 CDR CDR1α： DSAIYN
CDR2α： IQSSQRE
CDR3α： AVNSGGSNYKLT
및 β사슬 가변 도메인 CDR CDR1β： SGHVS
CDR2β： FQNEAQ
CDR3β： ASSLFGQGREKLF
본 발명은 상기 CDR 영역에 대한 돌연변이 선별을 통하여, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체와의 친화력이 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 친화력의 적어도 5배인 고친화력 TCR을 얻었다.
본 발명에서 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합되는 활성을 구비한 T세포 수용체(TCR)를 제공하였다.
상기 T세포 수용체는 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하며, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 3개의 CDR영역의 기준 서열은 하기와 같고,
CDR1α： DSAIYN
CDR2α： IQSSQRE
CDR3α： AVNSGGSNYKLT, 또한 하기 돌연변이 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며,
Figure pct00004
및/또는, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같다.
CDR1β： SGHVS
CDR2β： FQNEAQ
CDR3β： ASSLFGQGREKLF
더욱 상세하게, 상기 TCRα사슬 CDR 영역의 돌연변이 수는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개일 수 있다.
나아가, 본 발명의 상기 TCR은 αβ 이형질 이합체 TCR이고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %; 바람직하게는, 적어도 90 %; 더욱 바람직하게는, 적어도 92 %; 보다 더욱 바람직하게는, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 바람직하게는, 적어도 92 %; 더욱 바람직하게는, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
나아가, 본 발명의 TCR은 단일 사슬 TCR이고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게는, 적어도 90 %; 더욱 바람직하게는, 적어도 92 %; 가장 바람직하게는, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게는, 적어도 90 %; 더욱 바람직하게는, 적어도 92 %; 가장 바람직하게는, 적어도 94 %;(예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서, 야생형 TCRα사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 1의 3개의 CDR 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 1의 27 ~ 32번, 50 ~ 56번 및 91 ~ 102번에 위치된다. 이에 따라, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 번호를 사용하고, 93N은 CDR3α의 3번 N이며, 94S는 CDR3α의 4번 S이고, 95G는 CDR3α의 5번 G이며, 96G은 CDR3α의 6번 G이고, 97S는 CDR3α의 7번 S이며, 98N는 CDR3α의 8번 N이다.
본 발명에서 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합되는 특성을 구비하고 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인을 포함하는 TCR을 제공하였고, 상기 TCR이 SEQ ID NO: 1로 표시되는 α사슬 가변 도메인에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이 된 아미노산 잔기의 사이트는 93N, 94S, 95G, 96G, 97S 및 98N 중의 하나 또는 복수를 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 번호를 사용하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 돌연변이 후의 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 93D 또는 93E; 94D 또는 94G 또는 94A 또는 94W 또는 94T 또는 94H; 95Q 또는 95A 또는 95V 또는 95H 또는 95W 또는 95Y 또는 95M 또는 95I; 96D 또는 96R 또는 96P 또는 96Q 또는 96T 또는 96Y; 97G 또는 97D; 및 98G 또는 98D로부터 선택되는 하나의 그룹 또는 복수 그룹의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 번호를 사용한다.
더욱 구체적으로, α사슬 가변 도메인에서 상기 돌연변이의 구체적인 형식으로 N93/D/E, S94/D/G/A/W/T/H; G95/Q/A/V/H/W/Y/M/I; G96/D/R/P/Q/T/Y; S97/G/D; 및 N98/G/D 중의 하나의 그룹 또는 복수 그룹을 포함한다.
당업자에게 공지된 부위 특이적 돌연변이 방법에 따라, 야생형 TCRα사슬 불변 영역 TRAC*01 엑손1의 Thr48을 시스테인으로 돌연변이시키고, β사슬 불변 영역TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57을 시스테인으로 돌연변이시켜, 대조 TCR을 얻고, 이의 아미노산 서열은 각각 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같으며, 돌연변이 후의 시스테인 잔기를 굵은 알파벳으로 표시하였다. 상기 시스테인의 치환으로 인해 대조 TCR의 α와 β사슬의 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 형성될 수 있어, 더욱 안정적인 가용성 TCR을 형성하므로, TCR과 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기를 더욱 편리하게 평가할 수 있다. TCR 가변 영역의 CDR 영역이 이와 pMHC 복합체 사이의 친화력을 결정하였고, 따라서, 상기 TCR 불변 영역의 시스테인 치환은 TCR의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기에 영향을 미치지 않는 것으로 이해될 것이다. 그러므로, 본 발명에서, 측정된 대조 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력은 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력으로 간주된다. 마찬가지로, 측정된 본 발명의 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력이 적어도 대조 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력의 10배이면, 본 발명의 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력이 적어도 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력의 10배인 것과 같다.
임의의 적합한 방법으로 결합 친화력(해리 평형 상수 KD와 반비례)과 결합 반감기(T1/2로 표시)를 측정할 수 있다. TCR의 친화력을 두 배로 하면 KD가 반으로 줄어드는 것을 이해하여야 한다. T1/2는 In2를 해리 속도(Koff)로 나눈 값으로 계산된다. 따라서, T1/2를 두 배로 하면 Koff가 반으로 줄어든다. 바람직하게는, 동일한 시험 방안으로 주어진 TCR의 결합 친화력 또는 결합 반감기 차수, 예를 들어 3번 또는 그 이상 측정하여 결과의 평균 값을 취하였다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 실시예에서의 표면 플라스몬 공명(BIAcore) 방법으로 이러한 측정을 진행하였다. 상기 방법으로 측정된 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 대한 대조 TCR의 해리 평형 상수 KD는 2.08E-04M, 즉 208 μM이고, 본 발명에서 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 대한 야생형 TCR의 해리 평형 상수 KD또한 208 μM인 것으로 간주된다. TCR의 친화력이 두 배가 되면 KD이 반으로 줄어들기 때문에, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 고친화력 TCR의 해리 평형 상수 KD가 2.08E-05M, 즉 20.8 μM으로 측정되면, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 고친화력 TCR의 친화력이 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 야생형 TCR의 친화력의 10배인 것을 설명한다. 당업자에게 공지된 KD값 단위들 사이의 환산 관계는 1 M = 1000 μM, 1μ M = 1000 nM, 1 nM = 1000 pM 이다.
본 발명의 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 5배이고; 바람직하게는, 적어도 10배이며; 더욱 바람직하게는, 적어도 50배이다.
또 또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 100배이고; 바람직하게는, 적어도 500배이며; 더욱 바람직하게는, 적어도 1000배이다.
구체적으로, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 KD ≤ 20 μM이다.
또 또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 5 μM ≤ KD ≤ 10 μM이며; 바람직하게는, 0.1 μM ≤ KD ≤ 1 μM이고; 더욱 바람직하게는, 1 nM ≤ KD ≤ 100 nM이다.
임의의 적합한 방법으로 돌연변이시킬 수 있고, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 따른 그런한 것들, 제한 효소에 의한 클로닝 또는 라이게이션 독립적 클로닝(LIC) 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 많은 표준 분자 생물학 교과서에서 이러한 방법을 상세히 설명하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 돌연변이와 제한 효소에 의한 클로닝에 대한 더 많은 상세한 내용은 CSHL 출판사의 Sambrook 및 Russell, (2001) 분자 클로닝-실험실 매뉴얼(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3 판)을 참조할 수 있다. LIC 방법에 대한 더 많은 정보는 (Rashtchian, (1995)Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6)을 참조할 수 있다.
본 발명의 TCR을 생성하는 방법은 이러한 TCR을 나타내는 파지 입자의 다양한 라이브러리(library)로부터 FMNKFIYEI-HLA-A2 복합체에 대하여 고친화성을 갖는 TCR을 선별하는 것일 수 있지만 이에 한정되지 않으며, 예를 들어 문헌 (Li, et al(2005)Nature Biotech 23(3): 349-354)에 기술된 바와 같다.
야생형 TCRα와 β사슬 가변 도메인 아미노산을 발현하는 유전자 또는 약간 변형된 야생형 TCR의 α 및 β사슬 가변 도메인 아미노산을 발현하는 유전자는 모두 주형 TCR을 제조하는데 사용될 수 있는 것을 이해하여야 한다.
본 발명의 고친화성 TCR은 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 중의 하나 및/또는 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 포함한다. 본 발명에서, 이형질 이합체 TCR 분자를 형성하는 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게는 하기 표 1로부터 선택된다.
TCR번호 α사슬 가변 도메인 서열
SEQ ID NO:		 β사슬 가변 도메인 서열
SEQ ID NO:
1 11 2
2 12 2
3 13 2
4 14 2
5 15 2
6 16 2
7 17 2
8 18 2
9 19 2
10 20 2
11 21 2
12 22 2
13 23 2
14 24 2
본 발명의 목적에 기반하여, 본 발명의 TCR은 적어도 하나의 TCRα 및/또는 TCRβ사슬 가변 도메인을 갖는 부분이다. 통상적으로 이들은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 동시에 포함한다. 이들은 αβ 헤테로다이머 또는 단일 사슬 형식 또는 다른 임의의 안정적으로 존재할 수 있는 형식일 수 있다. 양자 면역 요법에서, αβ 헤테로다이머 TCR의 전장 사슬(세포질과 막 관통 구조 도메인을 포함)이 형질감염될 수 있다. 본 발명의 TCR은 치료제를 항원 제시 세포에 전달하기 위한 표적제로 사용될 수 있거나 또는 효과 세포를 지향시키는 이중 기능 폴리펩티드를 제조하기 위해 다른 분자와 결합하여 사용될 수 있으며, 이 경우 TCR은 바람직하게는 가용 형식이다.
안정성에 관하여, 선행 기술에서 TCR의 α와 β사슬 불변 도메인 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 도입하면 가용적이고 안정적인 TCR 분자를 얻을 수 있는 것을 개시하였으며, 예를 들어 특허 문헌 PCT/CN2015/093806에 기술된 바와 같다. 따라서, 본 발명의 TCR은 이의 α 및 β사슬 불변 도메인의 잔기 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 도입하는 TCR일 수 있다. 시스테인 잔기는 상기 TCR의 α 및 β 사슬 불변 도메인 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성한다. 시스테인 잔기는 천연 TCR 내 적합한 부위의 다른 아미노산 잔기에 치환되어 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성한다. 예를 들어, TRAC*01 엑손1의 Thr48을 치환하고, 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57을 치환하여 이황화 결합을 형성한다. 시스테인 잔기를 도입하여 이황화 결합을 형성하는 다른 부위는, TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser77; TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser17; TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Asp59; TRAC*01 엑손1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu15; TRAC*01 엑손1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser54; TRAC*01 엑손1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ala19; 또는 TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu20일 수도 있다. 즉, 시스테인 잔기가 상기 α와 β사슬 불변 도메인 중의 임의의 부위에 치환되었다. 시스테인 잔기를 포함하지 않으면서 천연 사슬 간 이황화 결합을 결실하는 목적을 달성하도록, 본 발명의 TCR불변 도메인의 하나 또는 복수의 C말단에서 최대 15개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 또는 더욱 적은 아미노산을 절단할 수 있으며, 천연 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 다른 하나의 아미노산으로 돌연변이시켜 상기 목적을 달성할 수도 있다.
상술된 바와 같이, 본 발명의 TCR은 이의 α 및 β 사슬 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 인공 사슬 간 이황화 결합을 포함할 수 있다. 불변 도메인 사이에 상술된 바와 같이 도입된 인공 이황화 결합이 함유되거나 함유되지 않더라도, 본 발명의 TCR은 TRAC불변 도메인 서열과 TRBC1 또는 TRBC2불변 도메인 서열을 모두 함유할 수 있는 것을 유의하여야 한다. TCR의 TRAC불변 도메인 서열과 TRBC1 또는 TRBC2불변 도메인 서열은 TCR 중에 존재하는 천연 사슬 간 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다.
이 외에, 안정성에 관하여, 특허 문헌 PCT/CN2016/077680에서 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 도입하여 TCR의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있는 것을 개시하였다. 따라서, 본 발명의 고친화력 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 더 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 TCR의 α사슬 가변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는, TRAV의 46번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 60번 아미노산; TRAV의 47번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산; TRAV의 46번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 61번 아미노산; 또는 TRAV의 47번 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 60번 아미노산을 치환하였다. 바람직하게는, 이러한 TCR은, (ⅰ) 이의 막 관통 구조 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ⅱ) 이의 막 관통 구조 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함할 수 있고, 여기서 (ⅰ) 및 (ⅱ)은 모두 TCR 사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함하며, α사슬과 β사슬은 이형질 이합체를 형성한다. 더욱 바람직하게는, 이러한 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인 및 이의 막 관통 구조 도메인 외의 전부 또는 부분적 β사슬 불변 도메인을 포함할 수 있지만, α사슬 불변 도메인을 포함하지 않고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 β사슬과 이형질 이합체를 형성한다.
안정성에 관하여, 한편, 본 발명의 TCR은 이의 소수성 코어 영역에서 돌연변이된 TCR을 더 포함하고, 바람직하게 이러한 소수성 코어 영역의 돌연변이는 본 발명의 TCR의 안정성을 향상시킬 수 있는 돌연변이이며, 예를 들어, 공개 번호 WO2014/206304의 특허 문헌에 기재된 바와 같다. 이러한 TCR은, (α 및/또는 β사슬) 가변 영역 아미노산 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 94번, 및/또는 α사슬 J유전자(TRAJ) 올리고펩티드 아미노산 위치 뒤로부터 3, 5, 7번, 및/또는 β사슬 J유전자(TRBJ) 올리고펩티드 아미노산 위치 뒤로부터 2, 4, 6번의 가변 도메인 소수성 코어 위치에서 돌연변이 될 수 있고, 여기서, 아미노산 서열의 위치 번호는 국제 면역 유전학 정보 시스템(IMGT)에 열거된 위치에 따라 넘버링된다. 당업자는 상기 국제 면역 유전학 정보 시스템을 알고 있고, 상기 데이터베이스에 따라 IMGT에서의 상이한 TCR의 아미노산 잔기의 위치 번호를 얻을 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에서 소수성 코어 영역이 돌연변이된 TCR은 α와 β사슬의 가변 도메인을 연성 펩티드 사슬로 연결하여 구성된 고안정성의 단일 사슬 TCR일 수 있다. TCR 가변 영역의 CDR 영역은 이와 올리고펩티드-HLA 복합체 사이의 친화력을 결정하였고, 소수성 코어의 돌연변이는 TCR을 더욱 안정시킬 수 있지만, 이와 올리고펩티드-HLA 복합체 사이의 친화력에 영향을 미치지 않는다. 본 발명에서 연성 펩티드 사슬은 TCRα와 β사슬 가변 도메인을 연결하는 임의의 적합한 펩티드 사슬일 수 있는 것을 유의하여야 한다. 본 발명의 실시예1에서 구축된 고친화성 TCR 선별용 주형 가닥은 상기 소수성 코어 돌연변이를 함유한 고안정성의 단일 사슬 TCR이다. 안정성이 비교적 높은 TCR을 사용하여, TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체 사이의 친화력을 용이하게 평가할 수 있다.
상기 단일 사슬 주형TCR의 α사슬 가변 도메인 및 β사슬 가변 도메인의 CDR 영역과 야생형 TCR의 CDR 영역은 완전히 동일하다. 즉, α사슬 가변 도메인의 3개의 CDR은 각각 CDR1α: DSAIYN, CDR2α: IQSSQRE, CDR3α: AVNSGGSNYKLT이고, β사슬 가변 도메인의 3개의 CDR은 각각 CDR1β：SGHVS，CDR2β: FQNEAQ, CDR3β: ASSLFGQGREKLF이다. 상기 단일 사슬 주형 TCR의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9) 및 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 10)은 각각 도 5a 및 5b에 도시된 바와 같다. 이에 따라 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 고친화성을 가지며 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인으로 구성된 단일 사슬 TCR을 선별하였다.
본 발명에서, 단일 사슬 주형 TCRα사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 3의 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 3의 27 ~ 32번, 50 ~ 56번 및 91 ~ 102번에 위치된다. 이에 따라, 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 번호를 사용하고, 93N는 CDR3α의 3번 N이며, 94S는 CDR3α의 4번 S이고, 95G는 CDR3α의 5번 G이며, 96G는 CDR3α의 6번 G이고, 97S는 CDR3α의 7번 S이며, 98N는 CDR3α의 8번 N이다.
본 발명의 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대한 고친화성을 갖는 αβ 이질이합체(heterodimer)는 선별된 고친화성 단일 사슬 TCR의 α 및 β사슬 가변 도메인의 CDR 영역을 야생형 TCRα 사슬 가변 도메인(SEQ ID NO: 1) 및 β사슬 가변 도메인(SEQ ID NO: 2)의 상응하는 위치로 이동시켜 얻어진다.
본 발명의 TCR은 다가 복합체의 형식으로 제공될 수도 있다. 본 발명의 다가 TCR 복합체는 p53의 4합체 구조 도메인을 사용하여 형성된 4합체, 또는 복수 개의 본 발명의 TCR이 다른 하나의 분자와 결합되어 형성된 복합체와 같은 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 본 발명의 TCR이 서로 결합되어 형성된 중합체를 포함한다. 본 발명의 TCR 복합체는 특정 항원 제시 세포를 체외 또는 체내 추적하거나 표적화하는데 사용될 수 있으며, 이러한 유형의 응용이 있는 다른 다가 TCR 복합체의 중간체를 생산하는데 사용될 수도 있다.
본 발명의 TCR은 단독으로 사용될 수 있고, 접합체와 공유 결합 또는 다른 방식으로 결합될 수도 있으며, 바람직하게는, 공유 방식으로 결합된다. 상기 접합체는 검출 가능한 마커(진단 목적을 위한 것이고, 여기서, 상기 TCR은 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체를 제시하는 세포의 존재를 검출하기 위한 것임), 치료제, PK(단백질 키나아제(Protein kinase)) 변형 부분 또는 임의의 상기 이러한 물질의 조합 결합 또는 접합을 포함한다.
진단용 검출 가능한 마커로, 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 단층 촬영) 조영제, 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TCR과 결합되거나 접합될 수 있는 치료제로, 1. 방사성 핵종(Koppe 등, 2005, 암 전이 평론(Cancer metastasis reviews)24, 539); 2. 생물독(Chaudhary 등, 1989, 자연(Nature)339, 394; Epel 등, 2002, 암 면역학 및 면역 치료(Cancer Immunology and Immunotherapy)51, 565); 3. IL-2 등과 같은 사이토카인(Cytokine)(Gillies 등, 1992, 미국 국립 과학 아카데미(PNAS)89, 1428; Card 등, 2004, 암 면역학 및 면역 치료(Cancer Immunology and Immunotherapy)53, 345; Halin 등, 2003, 암 연구(Cancer Research)63, 3202); 4. 항체Fc 단편(Mosquera 등, 2005, 면역학 잡지(The Journal Of Immunology)174, 4381); 5. 항체scFv 단편(Zhu 등, 1995, 암 국제 저널(International Journal of Cancer)62, 319); 6. 금 나노 입자/나노 봉(Lapotko 등, 2005, 암통신(Cancer letters )239, 36; Huang 등, 2006, 미국 화학 학회 잡지(Journal of the American Chemical Society)128, 2115); 7. 바이러스 입자(Peng 등, 2004, 유전자 치료(Gene therapy)11, 1234); 8. 리포좀(Liposomes)(Mamot 등, 2005, 암 연구(Cancer research)65, 11631); 9. 나노 자성 입자; 10. 프로드러그(Prodrug) 활성 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DTD) 또는 비페닐 가수분해 효소 유사 단백질(BPHL)); 11. 화학치료제(예를 들어, 시스플라틴(Cisplatin)) 또는 임의의 형식의 나노 입자 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TCR에 결합되는 항체 또는 이의 단편으로 항-CD3 또는 항-CD28 또는 항-CD16항체와 같은 항-T세포 또는 NK-세포 결정 항체를 포함하고, 상기 항체 또는 이의 단편과 TCR의 결합은 효과 세포를 정향하여 표적 세포를 더욱 효과적으로 표적화할 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 TCR은 항-CD3항체 또는 상기 항-CD3항체의 기능 단편 또는 변이체와 결합된다. 구체적으로, 본 발명의 TCR과 항CD3 단일 사슬 항체의 융합 분자로, SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24로부터 선택되는 TCRα사슬 가변 도메인 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 2로부터 선택되는 TCRβ사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 분자는 DNA 형식 또는 RNA 형식일 수 있다. DNA는 코딩 사슬 또는 비코딩 사슬일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 서열은 본 발명의 도면에 도시된 핵산 서열과 동일하거나 변형된 변이체일 수 있다. "변형된 변이체"의 의미를 예를 들어 설명하면, 본문에 사용된 바와 같이, "변형된 변이체"는 본 발명에서 SEQ ID NO: 3의 단백질 서열을 구비하지만, SEQ ID NO: 5의 서열과 다른 핵산 서열을 코딩하는 것을 지칭한다.
통상적으로, 본 발명의 핵산 분자 전장 서열 또는 이의 단편은 PCR 증폭법, 재조합 방법 또는 인공 합성 방법으로 얻을 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 현재, 본 발명의 TCR(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열을 화학 합성으로 완전히 얻을 수 있다. 다음, 상기 DNA 서열은 본 분야에 공지된 다양한 기존 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터) 및 세포에 도입될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 벡터 또는 코딩 서열로 유전자 공학에 의해 생성된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 TCR을 발현하는 분리 세포, 특히 T세포를 더 포함한다. 본 발명의 고친화력 TCR을 코딩하는 DNA 또는 RNA로의 T세포 형질감염에 적합한 여러가지 방법이 있다(예를 들어, Robbins 등., (2008)J. Immunol.180:6116-6131). 본 발명의 고친화성 TCR을 발현하는 T세포는 양자 면역 치료에 사용될 수 있다. 당업자는 양자 면역 치료를 수행하기 위한 많은 적합한 방법을 알고 있다(예를 들어, Rosenberg 등., (2008)Nat Rev Cancer8(4): 299-308).
본 발명은 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 본 발명의 TCR, 또는 본 발명의 TCR복합체, 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포를 포함하는 약물 조성물을 더 제공하였다.
본 발명은 치료가 필요한 대상에게 본 발명의 TCR, 또는 본 발명의 TCR복합체, 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포, 또는 본 발명의 약물 조성물을 적정량 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 더 제공하였다.
본문의 아미노산 명칭은 국제적으로 통용되는 단일 영어 알파벳을 사용하여 표시하고, 이에 대응되는 아미노산의 명칭은 3개의 영어 알파벳으로 약칭하며, 각각 Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y), Val (V)인 것을 이해하여야 하고;
본 발명에서, Pro60 또는 60P는 모두 60번 프롤린을 나타낸다. 이 외에, 본 발명에 따른 돌연변이의 구체적인 형식의 발현 방식은 예를 들어 “N93D”는 93번의 N이 D에 의해 치환된 것을 대표하고, 마찬가지로, “N93D/E”는 93번의 N이 D에 의해 치환되거나 E에 의해 치환된 것을 대표한다. 다른 것들도 이에 따라 유추한다.
본 분야에서, 성능이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 치환할 경우, 통상적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 통상적으로 C말단 및/또는 N말단에 하나 또는 복수의 아미노산을 첨가하여도 단백질의 구조와 기능을 변화시키지 않는다. 따라서, 본 발명의 TCR은 본 발명의 TCR의 최대 5개, 바람직하게는 3개, 더욱 바람직하게는 2개, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산(특히 CDR 영역 외에 위치된 아미노산)이 성질이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 대체되어도, 여전히 기능성을 유지할 수 있는 TCR을 더 포함한다.
본 발명은 본 발명의 TCR에 대하여 약간 변형시킨 TCR을 더 포함한다. 변형(통상적으로 1차 구조는 변경되지 않음) 형식으로 아세틸화(acetylation) 또는 카르복시화(carboxylation)와 같은 본 발명의 TCR의 화학적 유도 형식을 포함한다. 변형은 글리코실화(glycosylation)를 더 포함하고, 예를 들어, 본 발명의 TCR의 합성 및 가공에서 또는 추가적인 가공 단계에서 글리코실화 변형하여 생성된 TCR이다. 이러한 변형은 TCR을 글리코실화시킨 효소(예를 들어 포유 동물의 클리코실화효소 또는 탈클리코실화 효소)에 노출시켜 완성될 수 있다. 변형 형식으로 인산화 아미노산 잔기(예를 들어 포스포티로신(phosphotyrosine), 포스포세린(phosphoserine), 포스포트레오닌(phosphothreonine))를 갖는 서열을 더 포함한다. 변형되어 이의 항 단백질 가수분해 성능을 향상시키거나 용해 성능을 최적화시킨 TCR을 더 포함한다.
본 발명의 TCR, TCR복합체 또는 본 발명의 TCR로 형질감염된 T세포는 약학적으로 허용 가능한 벡터와 함께 약물 조성물에 제공될 수 있다. 통상적으로 본 발명의 TCR, 다가 TCR복합체 또는 세포는 무균 약물 조성물의 일부분으로서 제공되고, 상기 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다. 상기 약물 조성물은 임의의 적합한 형식일 수 있다(환자에 투여되기 위한 방법에 의해 결정된다). 단위 제형으로 제공될 수 있고, 통상적으로 밀폐된 용기에 제공되며, 키트(Kit)의 일부분으로 제공될 수 있다. 이러한 유형의 키트(그러나 필수적인 것은 아님)는 사용 설명서가 포함된다. 복수 개의 상기 단위 제형을 포함할 수 있다.
이 외에, 본 발명의 TCR은 단독으로 사용될 수 있고, 다른 치료제와 결합하거나 접합하여 함께 사용될 수도 있다(예를 들어 동일한 약물 조성물에 배합한다).
약물 조성물은 약학적으로 허용 가능한 벡터를 더 포함할 수 있다. 용어 “약학적으로 허용 가능한 벡터”는 치료제를 투여하기 위한 벡터를 의미한다. 상기 용어는 이들 자체로는 상기 조성물을 투여 받는 개체에게 해로운 항체를 유도하지 않고, 투여 후 과도한 독성이 없는 약제 벡터를 지칭한다. 이러한 벡터는 당업자에게 공지된 것이다. 레밍턴 제약 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991))에서 약학적으로 허용 가능한 부형제에 관한 충분한 논의를 찾을 수 있다. 이러한 벡터로 염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세린(glycerin), 에탄올(ethanol), 좌제 및 이들의 조합을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않는다).
치료성 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 벡터는 물, 염수, 글리세린 및 에탄올과 같은 액체를 함유할 수 있다. 이 외에, 이러한 벡터에 습윤제 또는 유화제, pH완충 물질 등과 같은 보조적 물질이 더 존재할 수 있다.
통상적으로, 치료성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사 가능한 제제로 제조될 수 있고; 주사 전에 용액 또는 현탁액에 배합하기에 적합한 액체 벡터의 고체 형태로 제조될 수도 있다.
본 발명의 조성물로 제조되면, 이를 통상적인 경로로 투여할 수 있고, 여기서 안구 내, 근육 내, 정맥 내, 피하, 피내 또는 국소 투여를 포함하며(하지만 이에 한정되지 않음), 바람직하게 피하, 근육 내 또는 정맥 내를 비롯한 위장관 외이다. 예방 또는 치료될 대상은 동물; 특히 사람일 수 있다.
본 발명의 약물 조성물이 실제 치료에 사용될 경우, 사용 정황에 따라 각종 상이한 제형의 약물 조성물을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 주사제, 경구제 등을 예로 들 수 있다.
이러한 약물 조성물은 통상적인 방법에 따라 혼합, 희석 또는 용해하여 배합될 수 있고, 또한 부형제, 붕괴제, 접착제, 윤활제, 희석제, 완충제, 등장제(isotonicities), 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정제 및 조용매와 같은 적합한 약물 첨가제를 간혹 추가하며, 상기 배합 과정은 제형에 따라 통상적인 방식으로 진행될 수 있다.
본 발명의 약물 조성물은 서방형제제 형태로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR은 서방형 중합체가 벡터인 알약 또는 마이크로 캡슐에 혼입된 후, 수술을 통해 치료할 조직으로 이식될 수 있다. 서방형 중합체의 예로 에틸렌-비닐아세테이트(Ethylene-vinyl acetate) 공중합체, 폴리히드로메타아크릴레이트(Polyhydrometaacrylate), 폴리아크릴아미드(Polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone), 메틸 셀룰로오스(Methylcellulose), 락트산 중합체, 락트산-글리콜산 공중합체 등을 예로 들 수 있고, 바람직하게는, 락트산 중합체 및 락트산-글리콜산 공중합체와 같은 생분해성 중합체를 예로 들 수 있다.
본 발명의 약물 조성물이 실제 치료에 사용될 경우, 활성 성분인 본 발명의 TCR 또는 TCR복합체 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포는 치료될 각 환자의 체중, 연령, 성별 및 증상 정도에 따라 합리적으로 결정될 수 있으며, 최종적으로 의사에 의해 합리적 용량이 결정된다.
본 발명의 주요 장점은 하기와 같다.
(1) 상기 FMNKFIYEI-HLA-A2 복합체에 대한 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 적어도 야생형 TCR의 5배이고, 바람직하게 적어도 10배이다.
(2) 상기 FMNKFIYEI-HLA-A2 복합체에 대한 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 적어도 야생형 TCR의 100배이고, 바람직하게 적어도 1000배이다.
(3) 본 발명의 고친화력 TCR이 형질도입된 효과 세포는 표적 세포에 대하여 아주 강한 살상 작용이 있다.
아래 구체적인 실시예에서, 본 발명을 더 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는 것을 이해하여야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 표시하지 않은 실험 방법은 예를 들어(Sambrook 및 Russell 등, 분자 클론: 실험실 매뉴얼(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3 판) (2001)CSHL출판사)에 기재된 조건, 또는 제조 업체에서 건의하는 조건과 같은 통상적인 조건에 따른다. 다른 설명이 없으면, 백분율과 부수는 중량에 따라 계산된다.
재료 및 방법
본 발명의 실시예에 사용된 실험 재료는 특별한 설명이 없으면 모두 시중에서 얻을 수 있으며, 여기서, E.coli DH5α는 Tiangen로부터 구매되고, E.coli BL21(DE3)은 Tiangen로부터 구매되며, E. coli Tuner(DE3)은 Novagen로부터 구매되고, 플라스미드(Plasmid)pET28a는 Novagen로부터 구매된다.
실시예1 소수성 코어 돌연변이된 안정적인 단일 사슬 TCR주형 가닥의 생성
본 발명은 부위 특정 돌연변이 방법으로, 특허 문헌 WO2014/206304에서의 기재에 따라, 하나의 연성 올리고펩티드(linker)에 의해 TCRα와 β사슬 가변 도메인을 연결하여 구성된 안정적인 단일 사슬 TCR 분자를 구축하였고, 이의 아미노산 및 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10이며, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같다. 상기 단일 사슬 TCR 분자를 주형으로 고친화성 TCR 분자를 선별하였다. 상기 주형 가닥의 α가변 도메인(SEQ ID NO: 3) 및 β가변 도메인(SEQ ID NO: 4)의 아미노산 서열은 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같고; 이에 대응되는 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO: 5 및 6이며, 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같고; 연성 올리고펩티드(linker)의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO: 7 및 8이며, 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같다.
주형 가닥을 지닌 목적 유전자를 NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단하고, NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소에 의해 절단된 pET28a벡터에 연결한다. 연결 생성물을 E.coli DH5α에 형질전환시키고, 카나마이신(Kanamycin)을 함유하는 LB플레이트에 코팅하며, 37 ℃의 온도에서 하룻밤 거꾸로 배양하고, 양성 클론을 취하여 PCR 선별하며, 양성 재조합체에 대하여 시퀀싱(Sequencing)하고, 서열의 정확 여부를 확인한 후 재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 추출하여 E.coli BL21(DE3)에 형질전환시켰다.
실시예2 실시예1에서 구축된 안정적인 단일 사슬 TCR의 발현, 재생 및 정제
실시예1에서 제조된 재조합 플라스미드 pET28a-주형 가닥을 함유하는 BL21(DE 3) 균락을 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 전부 접종하고, OD600이 0.6 ~ 0.8이 될 때까지 37 ℃의 온도에서 배양하며, IPTG를 넣어 최종 농도를 0.5 mM로 하고, 37 ℃의 온도에서 계속하여 4시간 동안 배양하였다. 5000 rpM으로 15분 동안 원심 분리하여 세포 침전물을 얻고, Bugbuster Master Mix(Merck)로 세포 침전물을 분해시키며, 6000 rpM으로 15분 동안 원심 분리하여 봉입체를 회수하고, 다시 Bugbuster(Merck)으로 세척하여 세포 파괴물과 막 성분을 제거하며, 6000 rpM으로 15분 동안 원심 분리하여 봉입체를 수집하였다. 봉입체를 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 8M의 요소)에 용해시키고, 고속 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하며, 상등액을 BCA법으로 정량한 다음 나누어 넣고, -80 ℃의 온도하에 보관하여 사용하였다.
5 mg의 용해된 단일 사슬 TCR 봉입체 단백질에, 2.5 mL의 완충액(6 M Gua-HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA)을 넣고, DTT를 더 넣어 최종 농도를 10 mM으로 하며, 37 ℃의 온도에서 30분 동안 처리하였다. 주사기로 125 mL의 재생 완충액(100 mM Tris-HCl pH 8.1, 0.4 M L-아르기닌(Arginine), 5 M 요소, 2 mM EDTA, 6.5 mM β-mercapthoethylamine, 1.87 mM Cystamine)에 상기 처리된 단일 사슬 TCR을 적가하고, 4 ℃의 온도하에서 10분 동안 교반한 후, 재생액을 4 kDa 크기의 셀루로오스막 투석백(dialysis bag)에 넣으며, 투석백을 1 L의 예냉된 물에 넣고, 4 ℃의 온도하에서 하룻밤 천천히 교반하였다. 17시간 후, 투석액을 1 L의 예냉된 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0)으로 바꾸고, 4 ℃의 온도에서 계속하여 8시간 동안 투석한 후, 투석액을 동일한 신선한 완충액으로 바꾸어 계속하여 하룻밤 투석하였다. 17시간 후, 샘플을 0.45 μM의 여과막으로 여과하고, 진공 탈기한 후 음이온 교환 컬럼(HiTrap Q HP, GE Healthcare)으로, 20 mM의 Tris-HCl pH 8.0로 제조된 0 ~ 1 M의 NaCl 선형 구배 용출액으로 단백질을 정제하며, 수집된 용출 성분을 SDS-PAGE로 분석하고, 단일 사슬 TCR을 함유하는 성분을 농축시킨 후 다시 겔 여과 컬럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)으로 정제하며, 목표 성분도 SDS-PAGE로 분석하였다.
BIAcore 분석에 사용되는 용출 성분을 다시 겔 여과법으로 그 순도를 측정하였다. 조건으로 크로마토그래피 컬럼은 Agilent Bio SEC-3(300 A, φ7.8×300 mm)이고, 이동상은 150 mM의 인산염 완충액이며, 유속은 0.5 mL/min이고, 컬럼 온도는 25 ℃이며, 자외선 검출 파장은 214 nM이다.
실시예3 결합 특성화
BIAcore 분석
BIAcore T200 실시간 분석 시스템으로 TCR 분자와 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 결합 활성을 측정하였다. 항스트렙타비딘(streptavidin)의 항체(GenScript)를 커플링 버퍼(coupling buffer)(10 mM의 나트륨아세테이트(sodium acetate) 완충액, pH 4.77)에 넣은 후, 항체를 사전에 EDC 및 NHS에 의해 활성화된 CM5 칩으로 흐르게 하여, 항체를 칩 표면에 고정시키고, 마지막으로 에탄올아민(ethanolamine)의 염산 용액으로 미반응 활성 표면을 차단하여 커플링 과정을 완성하였으며, 커플링 수준은 약 15,000 RU이다.
낮은 농도의 스트렙타비딘을 항체에 코팅된 칩 표면으로 흐르게 한 후, FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체를 검출 채널에 흐르게 하고, 다른 하나의 채널을 참조 채널로 하며, 다시 0.05 mM의 비오틴(biotin)을 10 μL/min의 유속으로 2분 동안 칩을 흐르게 하여, 스트렙타비딘의 나머지 결합 사이트를 차단시켰다. 단일 순환 동역학 분석 방법을 사용하여 친화력을 측정하고, TCR을 HEPES-EP완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % P20, pH 7.4)으로 몇 가지 상이한 농도로 희석하며, 30 μL/min의 유속으로 순차적으로 칩 표면을 흐르게 하고, 샘플 주입당 결합 시간은 120초이며, 마지막 샘플 주입 종료 후 이를 600초 동안 해리시킨다. 각 라운드당 측정 종료 후 pH 1.75 의 10 mM의 Gly-HCl로 칩을 재생시켰다. BIAcore Evaluation 소프트웨어로 동역학 파라미터를 계산하였다.
상기 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 제조 과정은 하기와 같다.
a. 정제
100 ml의 중쇄 또는 경쇄의 발현을 유도하는 E.coli 균액을 수집하고, 4 ℃의 온도하에서 8000 g으로 10분 동안 원심 분리시킨 후, 10 ml의 PBS로 균체를 1번 세척하며, 다음 5 ml의 BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck) 로 격렬하게 진탕하여 균체를 재부유시키고, 실온하에서 20분 동안 스핀 배양한 후, 4 ℃, 6000 g의 조건하에서 15분 동안 원심 분리시키며, 상등액을 버리고, 봉입체를 수집하였다.
상기 봉입체를 5 ml의 BugBuster Master Mix에 재부유시키고, 실온하에서 5분 동안 스핀 배양하며; 10배로 희석된 BugBuster을 30 ml 넣어 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g의 조건하에서 15분 동안 원심 분리하며; 상등액을 버리고, 10배로 희석된 BugBuster을 30 ml 넣어 봉입체를 재부유시키며, 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g의 조건하에서 15 분 동안 원심 분리하며, 2번 반복하고, 30 ml의 20 mM의 Tris-HCl pH 8.0을 넣어 봉입체를 재부유시키며, 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g의 조건하에서 15 분 동안 원심 분리하며, 마지막으로 20 mM의 Tris-HCl 8 M의 요소로 봉입체를 용해하고, SDS-PAGE로 봉입체 순도를 측정하며, BCA 키트로 농도를 측정하였다.
b. 재생
합성된 올리고펩티드 FMNKFIYEI(Beijing Biocytogen Co.,Ltd)를 20 mg/ml의 농도로 DMSO에 용해시켰다. 경쇄와 중쇄의 봉입체를 8 M의 요소, 20 mM의 Tris pH 8.0, 10 mM의 DTT로 용해시키고, 재생 이전에 3 M의 염산구아니딘(Guanidine hydrochloride), 10 mM의 나트륨아세테이트, 10 mM의 EDTA를 넣어 추가적으로 변성시켰다. FMNKFIYEI 펩티드를 25 mg/L(최종 농도)로 재생 완충액(0.4 M L-아르기닌, 100 mM Tris pH 8.3, 2 mM EDTA, 0.5 mM 산화성 글루타티온(Glutathione), 5 mM 환원성 글루타티온, 0.2 mM PMSF, 4 ℃까지 냉각)에 넣은 후, 20 mg/L의 경쇄와 90 mg/L의 중쇄(최종 농도이고, 중쇄를 3차례에 나누어 넣으며, 8 h/번임)를 순차적으로 넣으며, 재생은 4 ℃의 온도에서 적어도 3일 동안에 완성하고, SDS-PAGE로 성공적으로 재생되었는지를 측정하였다.
c. 재생 후 정제
10 체적의 20 mM의 Tris pH 8.0로 투석하여 재생 완충액을 바꾸고, 완충액을 적어도 2번 바꾸어 용액의 이온 강도를 충분히 줄인다. 투석 후 0.45 μM의 셀룰로오스아세테이트(Cellulose acetate) 여과막으로 단백질 용액을 여과한 후, HiTrap Q HP(GE 제너럴 전기 회사) 음이온 교환 컬럼(5 ml 배드 볼륨(Bed Volume))에 넣었다. Akta 정제기(GE 제너럴 전기 회사)로, 20 mM의 Tris pH 8.0로 제조된 0 ~ 400 mM의 NaCl 선형 구배액으로 단백질을 용출하고, pMHC이 약 250 mM의 NaCl에서 용출되며, 피크 성분을 수집하고, SDS-PAGE로 순도를 측정하였다.
d. 비오틴화
Millipore 울트라 여과 튜브로 정제된 pMHC분자를 농축하는 동시에, 완충액을 20 mM의 Tris pH 8.0으로 교체한 후, 비오틴화 시약 0.05 M의 Bicine pH 8.3, 10 mM의 ATP, 10 mM의 MgOAc, 50 μM의 D-Biotin, 100 μg/ml의 BirA 효소(GST-BirA)을 넣어, 실온하에서 혼합물을 하룻밤 배양하며, SDS-PAGE로 비오틴화가 완료되었는지 여부를 검출하였다.
e. 비오틴화된 복합체의 정제
Millipore 울트라 여과 튜브로 비오틴화 표지된 pMHC 분자를 1 ml로 농축시키고, 겔 여과 크로마토그래피로 비오틴화된 pMHC를 정제하며, Akta 정제기(GE 제너럴 전기 회사)를 사용하여, 여과된 PBS로 HiPrepTM 16/60 S200 HR컬럼(GE 제너럴 전기 회사)을 전평형시키고, 1 ml의 농축된 비오틴화 pMHC 분자를 넣은 후, PBS로 1 ml/min의 유속으로 용출하였다. 비오틴화된 pMHC 분자는 약 55 ml에서 단일 피크 용출로 나타났다. 단백질이 함유된 성분을 합병하고, Millipore 울트라 여과 튜브로 농축하며, BCA법(Thermo)으로 단백질 농도를 측정하고, 프로테아제(Protease) 억제제 cocktail(Roche)를 넣어 비오틴화된 pMHC 분자를 나누어 -80 ℃의 온도하에 보관하였다.
실시예4 고친화성 단일 사슬 TCR의 생성
파지 디스플레이 기술은 고친화력 변이체를 선별하기 위한 TCR 고친화력 변이 라이브러리를 생성하는 수단이다. Li 등((2005)Nature Biotech 23(3):349-354)에 기술된 TCR 파지 디스플레이 및 선별 방법을 실시예1에서의 단일 사슬 TCR주형에 응용하였다. 상기 주형 가닥의 CDR 영역을 돌연변이시켜 고친화성 TCR의 라이브러리를 구축하고 선택하였다. 몇 라운드에 거쳐 선택된 파지 라이브러리는 모두 대응되는 항원에 특이적으로 결합되고, 그 중에서 단일 클론을 선택하여 서열 분석을 진행하였다.
실시예3에서의 BIAcore 방법을 사용하여 TCR 분자와 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 상호 작용을 분석하고, 친화력 및/또는 결합 반감기가 적어도 야생형 TCR의 5배인 고친화성 TCR을 선별하였으며, 즉 선별된 고친화성 TCR이 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 결합되는 해리 평형 상수 KD는 야생형 TCR이 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 결합된 해리 평형 상수 KD의 5분의 1보다 작거나 같으며, 결과는 하기 표3과 같다. 상기 방법을 이용하여 대조 TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 상호 작용의 KD값이 208 μM인 것을 측정하고, 이의 상호 작용 그래프는 도 9에 나타낸 바와 같으며, 즉 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 상호 작용의 KD값 또한 208 μM이며, 즉 2.08E-04M이다.
측정을 통해 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체와의 친화력이 적어도 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 친화력의 5배인 단일 사슬 TCR을 선별하였다.
실시예5 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 생성
실시예4에서 선별된 고친화력의 단일 사슬 TCR의 CDR 영역 돌연변이를 αβ 이형질 이합체 TCR의 가변 도메인의 대응되는 사이트에 도입하고, BIAcore를 통하여 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체와의 친화력을 측정하였다. 상기 CDR 영역 고친화력 돌연변이의 도입은 당업자에게 공지된 부위 특정 돌연변이 방법을 사용하였다. 상기 야생형 TCR 의 α사슬과 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 도 1a(SEQ ID NO: 1)와 1b(SEQ ID NO: 2)에 나타낸 바와 같다.
유의할 점은, TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기를 더욱 용이하게 평가하기 위한 더욱 안정적인 가용성 TCR을 얻기 위해, αβ 이형질 이합체 TCR은 α 및 β사슬의 불변 영역에 각각 하나의 시스테인 잔기를 도입하여 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성한 TCR일 수 있고, 본 실시예에서 시스테인 잔기가 도입된 후 TCRα와 β사슬의 아미노산 서열은 각각 도 7a(SEQ ID NO: 26) 및 7b(SEQ ID NO: 27)에 도시된 바와 같으며, 도입된 시스테인 잔기는 굵은 알파벳으로 표시하였다.
"분자 클론 실험실 매뉴얼"(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(제3 판, Sambrook 및 Russell)에 기술된 표준 방법에 의해 발현될 TCRα와 β사슬의 세포 외 서열 유전자를 합성한 후 각각 발현 벡터pET28a+(Novagene)에 삽입하며, 업스트림(Upstream) 및 다운스트림(Downstream)의 클론 사이트는 각각 NcoI와 NotI이다. CDR 영역의 돌연변이는 당업자에게 공지된 오버랩 PCR(overlap PCR)에 의해 도입된다. 삽입된 단편은 시퀀싱에 의해 정확 여부가 확인된다.
실시예6 αβ 이형질 이합체 TCR의 발현, 재생 및 정제
TCRα와 β사슬의 발현 벡터를 각각 화학적 전환법에 의해 발현 박테리아 BL21(DE3)에 전환시키고, 박테리아를 LB 배양액으로 성장시키며, OD600 = 0.6일 때 최종 농도가 0.5 mM인 IPTG로 유도하고, TCR의 α 및 β 사슬로 발현시킨 후 형성된 봉입체를 BugBuster Mix(Novagene)로 추출하며, BugBuster용액으로 여러번 반복하여 세척하고, 최종적으로 봉입체를 6 M의 염산구아니딘, 10 mM의 디티오트레이톨(DTT), 10 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 20 mM의 Tris(pH 8.1)에 용해시켰다.
용해된 TCRα와 β사슬을 1: 1의 질량비로 5 M의 요소, 0.4 M의 아르기닌, 20 mM의 Tris(pH 8.1), 3.7 mM의 cystamine, 6.6 mM의 β-mercapoethylamine (4 ℃)에 신속하게 혼합시키고, 최종 농도는 60 mg/mL이다. 혼합 후 용액을 10 배 체적의 탈이온수에서 투석하고(4 ℃), 12시간 후 탈이온수를 완충액(20 mM Tris, pH 8.0)으로 바꾸어 계속하여 4 ℃의 온도하에서 12시간 동안 투석하였다. 투석 완료된 용액을 0.45 μM의 여과막으로 여과한 후, 음이온 교환 컬럼(HiTrap Q HP, 5ml, GE Healthcare)으로 정제하였다. SDS-PAGE겔로 용출 피크에 성공적으로 재생된 α와 β 이합체가 함유된 TCR을 확인하였다. TCR을 겔 여과 크로마토그래피(HiPrep 16/60, Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)로 추가적으로 정제하였다. 정제된 TCR 순도는 SDS-PAGE에 의해 90 %보다 큰 것으로 측정되었고, 농도는 BCA법으로 측정하였다.
실시예7 BIAcore 분석 결과
실시예 3에 따른 방법을 사용하여 고친화력 CDR 영역이 도입된 αβ 이형질 이합체 TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 친화력을 측정하였다.
고친화성의 단일 사슬 TCRα와 β사슬에서 선별된 CDR 영역을 각각 야생형 TCRα사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 1과 β사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 2의 대응되는 위치에 옮겨 αβ 이형질 이합체 TCR을 형성하였다. 얻은 새로운 TCRα와 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 각각 도 6(1) ~ (14)에 도시된 바와 같다. TCR 분 자의 CDR 영역이 대응되는 pMHC 복합체와의 친화력을 결정하므로, 당업자는 고친화력 돌연변이를 도입한 αβ 이형질 이합체 TCR도 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대한 고친화력을 갖는 것으로 기대할 수 있다. 실시예 5에 따른 방법으로 발현 벡터를 구축하고, 실시예 6에 따른 방법으로 상기 고친화력 돌연변이를 도입한 αβ 이형질 이합체 TCR을 발현시키고 재생하며 정제한 후, BIAcore T200으로 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체와의 친화력을 측정하였고, 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
TCR번호 TCR가변 도메인(SEQ ID NO)
α β		 KD(M)
1 11 2 5.482E-06
2 12 2 2.073E-06
3 13 2 1.377E-07
4 14 2 1.967E-05
5 15 2 7.453E-07
6 16 2 9.664E-08
7 17 2 1.620E-05
8 18 2 1.472E-05
9 19 2 9.672E-08
10 20 2 3.553E-07
11 21 2 2.091E-05
12 22 2 4.628E-08
13 23 2 2.943E-07
14 24 2 4.065E-07
상기 표 2로부터 CDR 영역 돌연변이가 도입된 αβ 이형질 이합체 TCR은 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대한 고친화력을 유지하고 있음을 알 수 있다. 상기 이형질 이합체 TCR의 친화력은 적어도 야생형 TCR이 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대한 친화력의 5배이다.
실시예8 항-CD3항체와 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 융합체의 발현, 재생 및 정제
항-CD3의 단일 사슬 항체(scFv)와 αβ 이형질 이합체 TCR을 융합하여 융합 분자를 제조하였다. 항-CD3의 scFv은 TCR의 β사슬과 융합되고, 상기 TCRβ사슬은 임의의 상기 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 β사슬 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 융합 분자의 TCRα사슬은 임의의 상기 고친화성 αβ 이형질 이합체 TCR의 α사슬 가변 도메인을 포함할 수 있다.
융합 분자 발현 벡터의 구축
1. α사슬 발현 벡터의 구축
αβ 이형질 이합체 TCR의 α사슬을 지닌 목적 유전자를 NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단하고, NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단된 pET28a벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α에 형질전환시키고, 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에 코팅하며, 37 ℃의 온도하에서 거꾸로 하룻밤 배양하고, 양성 클론을 취하여 PCR 선별하며, 양성 재조합체에 대하여 시퀀싱하고, 서열의 정확 여부를 확인한 후 재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 추출하여 E.coli Tuner(DE3)에 형질전환시켰다.
2. 항-CD3(scFv)-β 사슬 발현 벡터의 구축
오버랩(overlap)PCR의 방법으로, 프라이머를 설계하여 항-CD3 scFv와 고친화성 이형질 이합체 TCRβ사슬 유전자를 연결하며, 중간의 연결 올리고펩티드(linker)는 GGGGS(SEQ ID NO: 30)이고, 항-CD3의 scFv와 고친화성 이형질 이합체 TCRβ 사슬의 융합 단백질의 유전자 단편이 제한 효소 사이트 NcoⅠ(CCATGG(SEQ ID NO: 31))와 NotⅠ(GCGGCCGC(SEQ ID NO: 32))를 갖도록 하였다. PCR 증폭 산물을 NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단하고, NcoⅠ와 NotⅠ 이중 효소로 절단된 pET28a 벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에 코팅하며, 37 ℃의 온도하에서 거꾸로 하룻밤 동안 배양하고, 양성 클론을 취하여 PCR 선별하며, 양성 재조합체에 대하여 시퀀싱하고, 서열의 정확 여부를 확인한 후 재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 추출하여 E.coli Tuner(DE3) 컴피턴트 세포에 형질전환시켰다.
융합 단백질의 발현, 재생 및 정제
발현 플라스미드를 각각 E.coli Tuner(DE3) 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, LB 플레이트(카나마이신50 μg/mL)에 코팅하여 37 ℃의 온도하에서 하룻밤 배양하였다. 다음 날, 클론을 선택하여 10 ml의 LB 액체 배지(카나마이신50 μg/ml)에 접종하여 2 ~ 3시간 동안 배양하고, 1:100의 체적비에 따라 1 L의 LB 배지에 접종하며, 계속하여 0.5 ~ 0.8의 OD600까지 배양한 후, 최종 농도가 1 mM인 IPTG를 넣어 목적 단백질의 발현을 유도하였다. 4시간 동안 유도한 후, 6000 rpM으로 10분 동안 원심 분리하여 세포를 얻었다. PBS 완충액으로 균체를 1번 세척하여 균체를 나누어 넣고, 200 ml의 박테리아 배양물에 해당되는 균체를 취하여 5 ml의 BugBuster Master Mix(Merck)로 박테리아를 해리하며, 6000 g으로 15분 동안 원심 분리하여 봉입체를 수집하였다. 다음, 세척제로 4번 세척하여 세포 파괴물과 막 성분을 제거하였다. 다음, PBS와 같은 완충액으로 봉입체를 세척하여 세척제와 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 6 M의 염산구아니딘, 10 mM의 디티오트레이톨(DTT), 10 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 20 mM의 Tris, pH 8.1을 함유한 완충액으로 용해하고, 봉입체 농도를 측정하며, 이를 나누어 넣고 -80 ℃의 온도하에서 냉동 보관하였다.
용해된 TCRα사슬과 항-CD3(scFv)-β 사슬을 2: 5의 질량비로 5 M의 요소(urea), 0.4 M의 L-아르기닌(Larginine), 20 mM의 Tris pH 8.1, 3.7 mM의 cystamine, 6.6 mM의 β-mercapoethylamine (4 ℃)에 신속하게 혼합하고, α사슬과 항-CD3(scFv)-β 사슬의 최종 농도는 각각 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL이다.
혼합 후의 용액을 10배 체적의 탈이온수에서 투석하고(4 ℃), 12시간 후 탈이온수를 완충액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 바꾸어 계속하여 4 ℃의 온도에서 12시간 동안 투석하였다. 투석 완료된 용액을 0.45 μM의 여과막으로 여과한 후, 음이온 교환 컬럼(HiTrap Q HP, 5ml, GE Healthcare)으로 정제하였다. SDS-PAGE겔로 용출 피크에 성공적으로 재생된 TCRα사슬과 항-CD3 (scFv)-β사슬의 이합체의 TCR이 함유된 것을 확인하였다. TCR 융합 분자를 크기 배제 크로마토그래피(S-100 16/60, GE healthcare)로 추가적으로 정제하고, 음이온 교환 컬럼(HiTrap Q HP 5ml, GE healthcare)으로 다시 정제하였다. 정제된 TCR 융합 분자의 순도는 SDS-PAGE에 의해 90 %보다 큰 것으로 측정되었고, 농도는 BCA법으로 측정하였다.
실시예9 특이적 올리고펩티드가 부착된 T2세포에 대한 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포의 활성화 기능 실험
ELISPOT 방안
본 발명의 TCR이 형질도입된 T세포의 표적 세포에 대한 특이적 활성화 반응을 입증하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. ELISPOT 시험으로 측정한 IFN-γ생성량을 T세포 활성화의 판독값으로 사용하였다.
시약
시험 배지: 10 % FBS(Gibco회사, 카탈로그 번호 16000-044), RPMI 1640(Gibco회사, 카탈로그 번호 C11875500bt)
세척 완충액(PBST): 0.01 M PBS/0.05 % Tween 20
PBS(Gibco회사, 카탈로그 번호 C10010500BT)
PVDF ELISPOT 96웰 플레이트(Merck Millipore, 카탈로그 번호 MSIPS4510)
필요한 모든 다른 시약(포획 및 검출 항체, 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 및 BCIP/NBT 용액)이 들어있는 인간 IFN-γELISPOT PVDF-효소키트(BD)
방법
표적 세포
본 실험에 사용된 표적 세포는 특이적 올리고펩티드 FMNKFIYEI가 부착된 T2세포이다. 실험 배지에서 표적 세포의 제조: 표적 세포의 농도를 1.0 × 105 개/ml로 조절하고, 웰당 100 μL를 취하여 1.0 × 104 개 세포/웰을 얻는다.
효과 세포
본 실험에서 효과 세포(T세포)는 본 발명의 AFP 항원 올리고펩티드 특이성에 고친화적인 TCR로 형질감염된 CD3+ T세포이며, 형질감염 고친화력 TCR 분자는 다음과 같다(본 실시예 및 하기 실시예에서 사용된 TCR1, TCR2 등과 같은 특정 TCR 명칭은 상기 표 1 및 표 2 중의 TCR 번호와 동일하지 않으며, 구체적으로 α사슬 가변 도메인 및 β사슬 가변 도메인의 서열을 기준으로 함): TCR1(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 11, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR2(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 13, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR3(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 14, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR4(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 15, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR5(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 17, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2) 및 TCR6(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 18, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2). 동일한 지원자로 본 발명의 고친화력 TCR에 대응되는 야생형 TCR(A0B0으로 명명, α사슬 SEQ ID NO: 28, β사슬 SEQ ID NO: 29)로 형질감염시키고, 및 다른 고친화력 TCR(A6으로 명명)로 형질감염시킨 CD3+ T세포를 대조군으로 사용하였다.
올리고펩티드 용액
해당 표적 세포(T2) 실험군에 대응되는 올리고펩티드를 넣은 후, 최종 농도가 10-8 M ~ 10-13 M이 되도록 순차적으로 희석하였다.
ELISPOT
제조업체가 제공한 설명서에 따라 다음과 같이 웰 플레이트를 준비하였다: 플레이트당 10 ml 멸균 PBS로 항-인간 IFN-γ포획 항체를 1:200으로 희석한 후, 희석된 포획 항체 분취액 50 μl를 각 웰에 넣었다. 4 ℃의 온도하에서 플레이트를 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 웰 플레이트를 세척하여 여분의 포획 항체를 제거하였다. 5 % FBS가 함유된 PBS 배지를 200 μl/웰 넣고, 플레이트를 차단하기 위해 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양하였다. 다음, 배지를 웰 플레이트에서 씻어내고, ELISPOT 웰 플레이트를 종이 상에서 가볍게 두드려서 임의의 잔여 세척 완충액을 제거하였다.
다음, 시험할 각 성분을 하기 순서로 ELISPOT 웰 플레이트에 넣었다.
100 μl의 표적 세포 1 * 105개 세포/ml(총 약 1 * 104개 표적 세포/웰 획득).
100 μl의 효과 세포(1 * 103개 대조 효과 세포/웰 및 AFP TCR 양성 T세포/웰).
모든 웰은 각각 이중으로 제조되어 추가된다.
다음, 웰 플레이트를 하룻밤 배양(37 ℃/5 % CO2)하고 다음날, 배지를 버리고 이중 증류수로 웰 플레이트를 2번 세척한 후, 세척 완충액으로 3번 세척하고, 종이 타월 상에서 가볍게 두드려서 잔여 세척 완충액을 제거하였다. 다음, 검출 항체를 5 % FBS가 함유된 PBS로 1:200으로 희석하고, 50 μl/웰씩 각 웰에 첨가하였다. 웰 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한 후, 세척 완충액으로 3번 세척하고, 웰 플레이트를 종이 타월 상에서 가볍게 두드려서 여분의 세척 완충액을 제거하였다.
스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제를 5 % FBS가 함유된 PBS로 1:100으로 희석하고, 희석된 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제를 웰당 50 μl를 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 세척 완충액으로 4번, PBS로 2번 세척하고, 웰 플레이트를 종이 타월 상에서 가볍게 두드려서 여분의 세척 완충액과 PBS를 제거하였다. 세척 완료후 키트에 제공된 BCIP/NBT 용액을 50 μl/웰 가하여 조영시켰다. 조영동안 은박지로 웰 플레이트를 덮어 차광하고, 2 ~ 5분 동안 방치하였다. 이 기간 동안 조영 웰 플레이트의 반점을 일상적으로 확인하여, 반응을 종료할 최적의 시간을 결정하였다. BCIP/NBT 용액을 제거하고 증류수로 웰 플레이트를 2번 헹구어 조영 반응을 멈추고, 회전 건조시킨 후, 웰 플레이트의 바닥을 제거하고, 각 웰이 완전히 건조될 때까지 실온에서 웰 플레이트를 건조시킨 후, 면역스팟 플레이트 판독기(CTL, 세포기술유한회사(Cellular Technology Limited))로 웰 플레이트 내의 바닥 막에 형성된 반점을 계수하였다.
결과
ELISPOT 실험(상기 기재된 바와 같음)을 통하여 AFP 항원 올리고펩티드 FMNKFIYEI가 부착된 표적 세포에 반응하는 본 발명의 TCR이 형질도입된 T세포의 IFN-γ방출을 검증하였다. graphpad prism6으로 각 웰에서 관찰된 ELSPOT 반점의 수를 제도하였다.
실험 결과는 각각 도 10a, 10b, 10c, 10d, 10e 및 10f에 나타낸 바와 같으며, 본 발명의 고친화력 TCR이 형질도입된 T세포(효과 세포)는 특이적 올리고펩티드가 부착된 표적 세포에 대해 높은 활성화 반응을 보이고, IFN-γ의 방출은 야생형 TCR이 형질도입된 효과 세포보다 훨씬 높은 반면, 다른 TCR(A6)이 형질도입된 T세포(효과 세포)는 해당 표적 세포에 대한 활성화 반응이 기본적으로 없다.
실시예10 종양 세포주에 대한 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포의 활성화 기능 실험
본 실시예에서 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포가 표적 세포에 대하여 우수한 특이적 활성 작용이 있는 것을 검증하였다.
ELISPOT 실험을 통하여 세포에서의 본 발명의 고친화력 TCR의 기능 및 특이성을 측정하였다. ELISPOT 실험을 통하여 세포 기능을 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 본 실시예IFN-γ ELISPOT 실험은 건강한 지원자의 혈액으로부터 분리된 CD3+ T세포를 사용하여 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염시켜 효과 세포로 한다.
효과 세포는 본 발명의 TCR을 TCR1(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 11, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR3(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 14, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR5(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 17, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2) 및 TCR6(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 18, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2)로 무작위로 선택하여 형질감염시켰다. 대조군의 효과 세포는 A0B0(야생형 TCR로 형질감염됨, α사슬 SEQ ID NO: 28, β사슬 SEQ ID NO: 29)와 A6(본 발명 이외의 다른 TCR로 형질감염됨)으로 표지하였다. 표적 세포주는 HepG2, HUH-6, Hep3B, HCCC9810 및 SNU-398 세포이다. 여기서, 표적 세포주 HepG2는 관련 항원을 발현하고 유전자형도 양성 세포주에 부합되며, HUH-6, Hep3B, HCCC9810 및 SNU-398은 대조군으로 음성 세포주이다.
우선, ELISPOT 플레이트를 준비하였다. ELISPOT 플레이트를 에탄올로 활성화하여 코팅하고, 4 ℃의 온도하에서 하룻밤 경과하였다, 실험 1일 째에, 코팅액을 제거하고, 세척하여 차단하며, 실온하에서 2시간 동안 배양하고, 차단액을 제거하며, 배지로 효과 세포를 1 × 104개 세포/ml로 조절하고, 배지로 표적 세포주를 2 × 105개 세포 /ml로 조절하는 순서에 따라 시험할 각 성분을 ELISPOT 플레이트에 넣었다. 균일하게 혼합한 후 100 μL 의 표적 세포주(즉 20,000개 세포/웰), 100 μL의 효과 세포(즉 1000개 세포/웰)를 취하여 대응되는 웰에 넣고, 2개의 듀플리케이트 웰(Duplicate Well)을 설정하였다. 하룻밤 인큐베이션하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일 째에, 플레이트를 세척하고 2차 검출과 발색을 진행하며, 플레이트를 건조하고, 다시 면역스팟 플레이트 판독기(ELISPOT READER system; AID20 회사)로 막에 형성된 반점을 계수하였다.
실험 결과는 도 11에 나타낸 바와 같고, 음성 표적 세포의 경우 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포는 기본적으로 활성 작용이 없으나, 양성 표적 세포의 경우 우수한 특이적 활성 작용이 있고, 그 효과는 야생형 TCR로 형질감염된 효과 세포보다 훨씬 우수하다.
실시예11 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과 세포의 살상 기능 실험
본 실시예는 비방사성 세포 독성 실험을 통하여, LDH의 방출을 측정함으로써, 본 발명의 TCR을 형질도입시킨 세포의 살상 기능을 검증하였다. 상기 시험은 51Cr 방출 세포 독성 시험의 비색 대체 시험으로, 세포 분해 후 방출된 유산탈수소효소(LDH)를 정량 분석하였다. 30분 동안 커플링된 효소 반응으로 배지에 방출된 LDH를 검출하고, 효소 반응에서 LDH은 라졸륨염(INT)을 적색의 포르마잔(formazan)으로 전환시킬 수 있다. 생성된 적색의 산물의 양과 분해된 세포 수는 정비례된다. 표준 96웰 플레이트 판독기로 490 nM의 가시광선 흡광치 데이터를 수집할 수 있다.
LDH의 방출 실험으로 세포 기능을 검출하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 본 실시예의 LDH 실험은 건강한 지원자의 혈액으로부터 분리된 PBL 세포를 사용하여 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염시켜 효과 세포로 하였다. 표적 세포주는 HepG2, HCCC9810 및 SNU-398이고, 여기서, HepG2는 관련 항원을 발현하고 유전자형도 양성 세포주에 부합되며, HCCC9810 및 SNU-398은 대조로 음성 세포주이다.
효과 세포를 각각 TCR1(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 11, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR3(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 14, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2), TCR5(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 17, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2) 및 TCR6(α사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 18, β사슬 가변 도메인 SEQ ID NO: 2)으로 형질감염시키고, 대조군 효과 세포는 A6(본 발명 이외의 다른 TCR로 형질감염됨)으로 표지하였다.
우선, LDH 플레이트를 준비하였다. 실험 1일 째에, 배지로 효과 세포를 3 × 105개 세포/ml로 조절하고, 배지로 각 표적 세포주를 3 × 105개 세포/ml조절하는 순서에 따라 시험할 각 성분을 플레이트에 넣었다. 균일하게 혼합한 후 100 μL 의 표적 세포주(즉 30,000개 세포/웰), 100 μL의 효과 세포(즉 30,000개 세포/웰)를 취하여 대응되는 웰에 넣고, 3개의 듀플리케이트 웰을 설정하였다. 동시에, 효과 세포 자발적 웰, 표적 세포 자발적 웰, 표적 세포 최대 웰, 체적 교정 대조 웰 및 배지 배경 대조 웰을 모두 200μL로 설정하였다. 하룻밤 인큐베이션하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일 째에, 발색을 측정하고, 반응 종료 후 마이크로 플레이트 리더(Bioteck)로 490 nM하에서 흡광치를 기록하였다.
실험 결과는 도 12에 나타낸 바와 같고, 본 발명의 TCR이 형질도입된 세포는 관련 항원을 발현하는 표적 세포에 대하여 아주 강한 살상 작용이 있으나, 관련 항원을 발현하지 않은 표적 세포에 대해서는 기본적으로 살상 작용이 없다.
실시예12 본 발명의 고친화력 TCR 분자의 체내 효능
본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 T세포를 인간 간암세포 이종 이식 모델의 마우스 체내에 주사하고, 체내에서 종양에 대한 억제 효과를 측정하였다.
실험에 NSG 마우스(Beijing Biocytogen Co.,Ltd)(자성, 실험 주령 6 ~ 8주)를 실험 대상으로 사용하고, 실험 시작 20일 전에 배양 후 수집하고 부유시킨 HEPG2 종양 세포(ATCC) 부유액을 1 * 10^7 개/마리(주사 체적 200 ul)의 수량으로 마우스 복부 단측 피하에 주사하여, 인간 간암세포 이종 이식 마우스 모델을 구축하였다.
실험 시작 당일에 슬라이드 캘리퍼스(slide calipers)로 각 마우스의 성형된 종양의 긴 직경(a), 짧은 직경(b)을 각각 측정하고, V=a*b^2/2 공식에 따라 종양 체적을 측정한 후; 그룹 나누기에 따라 A6으로 표지된 대조군(무관한 TCR로 형질감염된 T세포) 6마리, TCR1(α사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 11, β사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 2)로 형질감염된 T세포군 6마리 및 TCR5(α사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 17, β사슬 가변 도메인SEQ ID NO: 2)로 형질감염된 T세포군 6마리로 설정하고, 종양 체적에 따라 마우스를 무작위로 나눈다. 그룹을 나눈 후 제조된 T세포를 2.5 * 10^7개/마리로 각각 상기 그룹의 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다.
세포 주사 후, 제조된 IL-2 용액(50000 IU/100 UL)을 다시 취하여 각 마우스의 복강에 100 ul씩 주사한 후, 4일 동안 매일 같은 량의 IL-2 용액을 주사하였다. 실험 시작부터 상기 방법에 따라 3일 간격으로 마우스 종양 직경을 측정하여 체적을 계산하고, 마우스 종양이 너무 커 행동에 영향을 주거나 종양이 가라앉을 때까지 지속하며, 상기 데이터를 정리하여 각 그룹의 마우스 종양 체적에 관하여 데이터 통계 분석 처리하였다.
얻은 실험 결과는 도 13에 나타낸 바와 같고, 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 T세포를 주사한 마우스 군의 종양 성장은 현저하게 억제되고 축소되는 경향이 있으나, 무관한 TCR로 형질감염된 T세포를 주사한 마우스 군의 종양 체적은 매우 빠르게 증가하였다.
본 발명에서 언급되는 모든 문헌은 본원 발명에서 각각의 문헌이 단독으로 참조로 인용되는 것처럼 참조로 인용된다. 이 외에 본 발명의 상기 교시 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대하여 다양한 변경 또는 수정을 할 수 있으며, 이런한 등가 형식도 본원에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속하는 것을 이해하여야 한다.
Sequence Listing <110> GUANGDONG XIANGXUE LIFE SCIENCES LTD <120> HIGH-AFFINITY TCR FOR RECOGNIZING AFP ANTIGEN <130> P2020-0344 <150> CN2019101768336 <151> 2019-03-08 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 35 40 45 Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 50 55 60 Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser 65 70 75 80 Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gly Gly 85 90 95 Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn 100 105 110 Pro <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asp 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Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gly Gly 85 90 95 Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn 100 105 110 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 195 200 205 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 210 215 220 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 225 230 235 240 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 245 250 <210> 29 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 29 Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Arg Glu Lys Leu Phe Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Ser Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 115 120 125 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 130 135 140 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 145 150 155 160 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln 165 170 175 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 180 185 190 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 195 200 205 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 210 215 220 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 225 230 235 240 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly 245 250 255 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 260 265 270 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 275 280 285 Arg Lys Asp Phe 290 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotides <400> 31 ccatgg 6 <210> 32 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotides <400> 32 gcggccgc 8

Claims (39)

  1. FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합되는 활성을 구비하고, TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하며, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 3개 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같으며,
    CDR1α: DSAIYN
    CDR2α: IQSSQRE
    CDR3α: AVNSGGSNYKLT, 또한 CDR3α는 하기의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하고,
    Figure pct00005

    및/또는 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열인 T세포 수용체(TCR).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TCR의 β사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 TCR.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TCRα사슬 가변 도메인에서 CDR3α의 돌연변이 수는 1 내지 4개인 것을 특징으로 하는 TCR.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 적어도 야생형 TCR의 5배인 것을 특징으로 하는 TCR.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 TCR.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 3개 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같은 것을 특징으로 하는 TCR:
    CDR1β: SGHVS
    CDR2β: FQNEAQ
    CDR3β: ASSLFGQGREKLF.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2인 것을 특징으로 하는 TCR.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하며, 여기서 CDR1α의 아미노산 서열은 DSAIYN이고, CDR2α의 아미노산 서열은 IQSSQRE이며; 및 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 CDR1β, CDR2β및 CDR3β를 포함하고, 여기서 CDR1β의 아미노산 서열은 SGHVS이고, CDR2β의 아미노산 서열은 FQNEAQ이고, CDR3β의 아미노산 서열은 ASSLFGQGREKLF인 것을 특징으로 하는 TCR.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인과 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하며, 여기서 CDR1α의 아미노산 서열은 DSAIYN이고, CDR2α의 아미노산 서열은 IQSSQRE이며, CDR3α의 아미노산 서열은 AV[3aX1][3aX2][3aX3][3aX4][3aX5][3aX6]YKLT인 것을 특징으로 하는 TCR.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 [3aX1]은 N 또는 D 또는 E인 것을 특징으로 하는 TCR.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 [3aX2]는 S 또는 D 또는 G 또는 A 또는 W 또는 T 또는 H인 것을 특징으로 하는 TCR.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 [3aX3]은 G 또는 Q 또는 A 또는 V 또는 H 또는 W 또는 Y 또는 M 또는 I인 것을 특징으로 하는 TCR.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 [3aX4]는 G 또는 D 또는 R 또는 P 또는 Q 또는 T 또는 Y인 것을 특징으로 하는 TCR.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 [3aX5]는 S 또는 G 또는 D인 것을 특징으로 하는 TCR.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 [3aX6]은 N 또는 G 또는 D인 것을 특징으로 하는 TCR.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 하기로부터 선택되는 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 TCR:
    Figure pct00006

    .
  17. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 가용인 것을 특징으로 하는 TCR.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 α사슬 TRAC 불변 영역 서열 및 β사슬 TRBC1 또는 TRBC2 불변 영역 서열을 포함하는 αβ 이형질 이합체 TCR인 것을 특징으로 하는 TCR.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 (i) 이의 막 관통 구조 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRα사슬, 및 (ii) 이의 막 관통 구조 도메인 외의 전부 또는 부분적 TCRβ사슬을 포함하고, 여기서 (i)과 (ii)은 모두 TCR 사슬의 가변 도메인과 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 TCR.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 불변 영역과 β사슬 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합이 함유되는 것을 특징으로 하는 TCR.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 TCRα와 β사슬의 불변 영역 사이에 인공 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인(Cysteine) 잔기가,
    TRAC*01 엑손(Exon)1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser57;
    TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser77;
    TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser17;
    TRAC*01 엑손1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Asp59;
    TRAC*01 엑손1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu15;
    TRAC*01 엑손1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ser54;
    TRAC*01 엑손1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Ala19; 및
    TRAC*01 엑손1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손1의 Glu20으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 사이트를 치환한 것을 특징으로 하는 TCR.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11 ~ 24로부터 선택되고; 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 TCR.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 TCR:
    Figure pct00007

    .
  24. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 단일 사슬 TCR인 것을 특징으로 하는 TCR.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인으로 이루어진 단일 사슬 TCR이고, 상기 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인은 연성 올리고펩티드(oligopeptide) 서열(linker)에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 TCR.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 및/또는 β사슬의 C- 또는 N- 말단에 접합체가 결합되는 것을 특징으로 하는 TCR.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 TCR에 결합되는 접합체는 검출 가능한 마커, 치료제, PK 변형 부분 또는 임의의 이러한 물질들의 조합인 것을 특징으로 하는 TCR.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 TCR에 결합되는 치료제는 상기 TCR의 α 또는 β사슬의 C- 또는 N- 말단에 연결되는 항-CD3 항체인 것을 특징으로 하는 TCR.
  29. 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하고, 그 중의 적어도 하나의 TCR 분자는 상기 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 TCR인 것을 특징으로 하는 다가 TCR복합체.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  31. 제30항에 따른 핵산 분자를 함유하는 벡터.
  32. 제31항에 따른 벡터 또는 염색체 내에 외인성이 통합된 제30항에 따른 핵산 분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  33. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 발현하는 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  34. 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 또는 제29항에 따른 TCR 복합체, 또는 제33항에 따른 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  35. 치료가 필요한 대상에게 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 또는 제29항에 따른 TCR 복합체, 또는 제33항에 따른 세포, 또는 제34항에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 질환은 AFP 양성 종양이고; 바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양이 간암, 유선암 또는 생식 세포 종양이고; 더욱 바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양이 간세포 암종인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 종양을 치료하기 위한 약물의 제조에서의 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 T세포 수용체, 제29항에 따른 TCR 복합체 또는 제33항에 따른 세포의 용도.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 종양은 AFP 양성 종양이고; 바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양이 간암, 유선암 또는 생식 세포 종양이고; 더욱 바람직하게는, 상기 AFP 양성 종양이 간세포 암종인 것을 특징으로 하는 종양을 치료하기 위한 약물.
  39. (i) 제32항에 따른 숙주 세포를 배양하여, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 T세포 수용체를 발현하는 단계;
    (ii) 상기 T세포 수용체를 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 T세포 수용체를 제조하는 방법.
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