JP2022546386A - Ｓｓｘ２抗原を識別する高親和性ｔｃｒ - Google Patents

Abstract

本発明は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合する特性を有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの結合親和性は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する野生型ＴＣＲの結合親和性よりも少なくとも２倍である。前記ＴＣＲは、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体を提示する腫瘍細胞を標的とするように、単独で使用することができ、治療剤と組み合わせて使用することができる。

Description

本発明は、生物技術分野に関し、より具体的には、ＳＳＸ２タンパク質に由来するポリペプチドを識別することができるＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）に関する。本発明は、前記受容体の調製および使用にさらに関する。

特異的方法で抗原を識別することができるのは、２種類の分子だけである。ここで、一つは、免疫グロブリンまたは抗体であり、もう一つは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、それは、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖がヘテロ二量体の形態で存在する細胞膜表面の糖タンパク質である。免疫系のＴＣＲレパートリーの成分は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えし、次に陽性および陰性選択することによって胸腺で生成されるものである。末梢環境において、ＴＣＲは、主要組織適合性遺伝子複合体―ペプチド複合体（ｐＭＨＣ）に対するＴ細胞の特異的識別を媒介するため、免疫系の細胞免疫機能にとって非常に常用である。

ＴＣＲは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）に提示される特異的抗原ペプチドの唯一の受容体であり、このような外因性ペプチドまたは内因性ペプチドは、異常細胞の唯一の兆候である可能性がある。免疫系において、抗原特異的ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合によって、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との直接的な物理的接触を引き起こし、次に、Ｔ細胞およびＡＰＣの両方の他の細胞膜表面分子が相互作用し、これにより、一連の後続の細胞シグナル伝達および他の生理学的応答が引き起こされ、従って異なる抗原特異性を有するＴ細胞が標的細胞に免疫効果を発揮することができるようになる。

ＴＣＲに対応するＭＨＣＩ種類およびＩＩ種類の分子リガンドも、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であるが、抗原提示に特異性を有し、異なる個体は、異なるＭＨＣを有することにより、それぞれのＡＰＣ細胞表面にタンパク質抗原の異なる短いペプチドを提示することができる。ヒトＭＨＣは、通常、ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。

ＳＳＸ２は、ＨＯＭ―ＭＥＬ―４０とも呼ばれる滑膜肉腫Ｘブレークポイントである。ＳＳＸ２は、ＳＳＸファミリーの１０種類の同一性の高い核酸タンパク質の一つである。ＳＳＸタンパク質は、腫瘍精巣抗原であり、腫瘍細胞およびＭＨＣ発現なしの的精巣芽細胞でのみ発現される。ＳＳＸ２は、肝臓がん、肺がん、線維肉腫、乳がん、結腸がん、前立腺がんを含むがこれらに限定されない、様々なヒト癌細胞で発現される。ＳＳＸ２は、細細胞内で精製された後に小分子ポリペプチドに分解され、ＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）分子と結合して複合体を形成し、細胞表面に提示される。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶは、ＳＳＸ２抗原に由来する短いペプチドであり、ＳＳＸ２関連疾患の治療の標的である。

従って、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体は、ＴＣＲが腫瘍細胞を標的とすることができるマーカーを提供する。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合できるＴＣＲは、腫瘍の治療に対して高い応用価値を有する。例えば、当該腫瘍細胞マーカーを標的とすることができるＴＣＲは、細胞毒性剤または免疫刺激剤を標的細胞に送達するために、またはＴ細胞に形質転換するために使用されることができ、養子免疫療法として知られている治療過程で患者に投与するために、当該ＴＣＲ発現するＴ細胞が腫瘍細胞を破壊できるようにする。前者の目的については、理想的なＴＣＲは、より高い親和性を有することにより、当該ＴＣＲが標的細胞に長期間存在することができる。後者の目的については、中程度の親和性のＴＣＲを使用することが好ましい。従って、当業者は、様々な目的のために腫瘍マーカーを標的するために使用されることができるＴＣＲの開発に専念している。

本発明の目的は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対してより高い親和性を有するＴＣＲを提供することである。
本発明の別の目的は、上記種類のＴＣＲの調製方法および上記種類のＴＣＲの使用を提供することである。

本発明の第１の態様は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合する活性を有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
別の好ましい例において、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合する活性を有し、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、
ＣＤＲ１α：ＤＳＳＳＴＹ、
ＣＤＲ２α：ＩＦＳＮＭＤＭ、
ＣＤＲ３α：ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、

および／または、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、
ＣＤＲ１β：ＭＮＨＥＹ、
ＣＤＲ２β：ＳＶＧＥＧＴ、
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。

別の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍である。
本発明の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも５倍、より好ましくは、少なくとも１０倍である。

別の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも５０倍、好ましくは、少なくとも１００倍、より好ましくは、少なくとも１０００倍である。
別の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも１０^４倍、好ましくは、少なくとも１０^５倍、より好ましくは、少なくとも５×１０^５倍である。

具体的には、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、Ｋ_Ｄ≦２０μＭである。
別の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、５μＭ≦Ｋ_Ｄ≦１０μＭ、好ましくは、０．１μＭ≦Ｋ_Ｄ≦１μＭ、より好ましくは、１ｎＭ≦Ｋ_Ｄ≦１００ｎＭ、より好ましくは、１０ｐＭ≦Ｋ_Ｄ≦１００ｐＭである。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖および／またはβ鎖の可変ドメインの一つまたは複数のＣＤＲ領域で発生される。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域における突然変異の数は、１～１１個であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域における突然変異の数は、１～８個である。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域における突然変異の数は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個であり得る。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域における突然変異の数は、１個、２個、三つの、４個、５個、６個、７個または８個であり得る。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は、ＭＮＨＥＹである。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は、ＡＳ［３βＸ１］［３βＸ２］［３βＸ３］［３βＸ４］ＤＰ［３βＸ５］［３βＸ６］［３βＸ７］［３βＸ８］であり、ここで、［３βＸ１］は、ＡまたはＳであり、および／または［３βＸ２］は、ＳまたはＤであり、および／または［３βＸ３］は、ＬまたはＩまたはＶであり、および／または［３βＸ４］は、ＥまたはＱまたはＴであり、および／または［３βＸ５］は、ＹまたはＦであり、および／または［３βＸ６］は、ＥまたはＩまたはＰまたはＶであり、および／または［３βＸ７］は、ＱまたはＫまたはＬまたはＭまたはＶであり、および／または［３βＸ８］は、ＹまたはＡまたはＥまたはＩまたはＬまたはＮまたはＱまたはＲまたはＳまたはＴまたはＶである。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、ＣＤＲ３βは、ＡＳＳＳＬＥＤＰＦＶＫＲ、ＡＳＡＤＶＱＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＡＤＩＱＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＭＴ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＫＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＶＴ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＫＩ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＫＴ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＬＮ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＬＴ、ＡＳＳＤＶＴＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＭＡ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＬＥ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＰＭＬ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＶＳ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＭＶおよびＡＳＳＳＶＥＤＰＹＥＱＹからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は、ＳＶＧＥＧＴ、ＳＬＥＶＧＴ、ＨＤＷＬＧＴおよびＳＤＷＬＧＴから選択される。好ましくは、前記ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は、ＳＶＧＥＧＴである。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は、ＤＳＳＳＴＹ、ＤＰＷＡＴＹ、ＤＲＭＳＴＹ、ＤＴＭＳＴＹおよびＤＫＭＳＴＹからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＩＦＳＮＭＤＭ、ＩＦＳＹＱＳＴ、ＩＦＳＹＭＴＥおよびＩＦＳＹＱＳＥからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は、ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ、ＡＥＰＮＮＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＡＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＫＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＳＳＨＳＡＬＩおよびＥＰＮＱＳＨＳＡＬＩからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は、ＤＳＳＳＴＹであり、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＩＦＳＮＭＤＭであり、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は、ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩである。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。

別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖および／またはβ鎖の可変ドメインの一つまたは複数のＣＤＲ領域で発生される。
別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３で発生され、および／または前記突然変異は、β鎖のＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３で発生される。

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合する活性を有し、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるα鎖可変ドメインにおいて突然変異が発生され、前記突然変異アミノ酸残基の部位は、２７Ｓ、２８Ｓ、２９Ｓ、５２Ｎ、５３Ｍ、５４Ｄ、５５Ｍ、９４Ｑ、９５Ａ、９６Ｇ、９７Ｔのうちの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるβ鎖可変ドメイン番号を採用し、および／または前記ＴＣＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるβ鎖可変ドメインにおいて突然変異が発生され、前記突然変異アミノ酸残基の部位は、４９Ｓ、５０Ｖ、５１Ｇ、５２Ｅ、９４Ｓ、９５Ｓ、９６Ｌ、９７Ｅ、１００Ｙ、１０１Ｅ、１０２Ｑ、１０３Ｙのうちの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される番号を採用する。

好ましくは、突然変異した後の前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２７Ｋまたは２７Ｐまたは２７Ｒまたは２７Ｔ、２８Ｍまたは２８Ｗ、２９Ａ、５２Ｙ、５３Ｑ、５４Ｓまたは５４Ｔ、５５ＥまたはＴ、９４Ａまたは９４Ｄまたは９４Ｅまたは９４Ｋまたは９４Ｎまたは９４Ｒまたは９４Ｓまたは９４Ｔ、９５Ｓまたは９５Ｖ、９６Ｈまたは９６Ｑまたは９６Ｔおよび９７Ｓからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される番号を採用し、および／または突然変異した後の前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、４９Ｈ、５０Ｄまたは５０Ｌ、５１Ｅまたは５１Ｗ、５２Ｌまたは５２Ｖ、９４Ａ、９５Ｄ、９６Ｉまたは９６Ｖ、９７Ｑまたは９７Ｔ、１００Ｆ、１０１Ｉまたは１０１Ｐまたは１０１Ｖ、１０２Ｋまたは１０２Ｌまたは１０２Ｍまたは１０２Ｖおよび１０３Ａまたは１０３Ｅまたは１０３Ｉまたは１０３Ｌまたは１０３Ｎまたは１０３Ｑまたは１０３Ｒまたは１０３Ｓまたは１０３Ｔまたは１０３Ｖからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される番号を採用する。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、以下の群から選択されるＣＤＲを有する。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、可溶性である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲまたは一本鎖ＴＣＲである。
別の好ましい例において、本発明の前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖定常領域配列ＴＲＡＣ＊０１およびβ鎖定常領域配列ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を有する。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目位置のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目位置のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目位置のアミノ酸、
またはＴＲＡＶの４７番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目位置のアミノ酸からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換する。

別の好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれるＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインならびに膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、それはα鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、β鎖とヘテロ二量体を形成する。

別の好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれるＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含む。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含む、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、
およびＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換する。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～８７から選択され、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８～１１４から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、以下の群から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲである。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインからなる一本鎖ＴＣＲであり、前記α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列（ｌｉｎｋｅｒ）によってリンクされる。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインおよび／またはβ鎖可変ドメインの疎水性コアに突然変異が発生される。
別の好ましい例において、前記疎水性コアに突然変異が発生されるＴＣＲは、α可変ドメインおよびβ可変ドメインで構成される一本鎖ＴＣＲであり、前記α可変ドメインおよびβ可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列（ｌｉｎｋｅｒ）によってリンクされる。

別の好ましい例において、本発明の前記ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、可以是少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％的配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～３２から選択され、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～５９から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、以下の群から選択される。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ―末端またはＮ―末端には、コンジュゲートが結合される。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲに結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせである。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲに結合する治療剤は、前記ＴＣＲのα鎖またはβ鎖のＣ―末端またはＮ―末端にリンクされる抗―ＣＤ３抗体である。

本発明の第２の態様は、少なくとも二つのＴＣＲ分子を含む、多価ＴＣＲ複合体を提供し、そのうちの少なくとも一つのＴＣＲ分子は、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲである。

本発明の第３の態様は、核酸分子を提供し、前記核酸分子は、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ分子または本発明の第２の態様に記載の多価ＴＣＲ複合体をコードする核酸配列またはその相補配列を含む。

本発明の第４の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第３の態様に記載の核酸分子を含む。

本発明の第５の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞には、本発明の第４の態様に記載のベクターが含まれるか、または染色体には、外因性本発明の第３の態様に記載の核酸分子が組み込まれる。

本発明の第６の態様は、単離された細胞を提供し、前記細胞は、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲを発現する。

本発明の第７の態様は、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容される担体および本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞を含む。

本発明の第８の態様は、適切な量の本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞、または本発明の第７の態様に記載の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与する段階を含む、疾患を治療する方法を提供する。

本発明の第９の態様は、腫瘍を治療するための薬物の調製に使用される、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞の使用を提供し、好ましくは、前記腫瘍は、ＳＳＸ２陽性腫瘍である。

本発明の第１０の態様は、腫瘍を治療するための薬物として使用される、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞を提供する。

本発明の第１１の態様は、
（ｉ）本発明の第５の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、本発明の第１の態様に記載のＴ細胞受容体を発現する段階と、
（ｉｉ）前記Ｔ細胞受容体を単離または精製する段階とを含む、本発明の第１の態様に記載のＴ細胞受容体を調製する方法を提供する。

本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

それぞれＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に特異的に結合できる野生型ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。 それぞれ本発明によって構築された一本鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。 それぞれ本発明によって構築された一本鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインのＤＮＡ配列およびβ鎖可変ドメインのＤＮＡ配列である。

それぞれ本発明によって構築された一本鎖テンプレートＴＣＲのリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。 それぞれＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する一本鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異した残基は、下線で表される。 それぞれＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する一本鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異した残基は、下線で表される。

それぞれ本発明によって構築された一本鎖テンプレートＴＣＲのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列である。 それぞれ本発明の可溶性参照ＴＣＲα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。 それぞれＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異した残基は、下線で表される。

それぞれＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異した残基は、下線で表される。 それぞれＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に特異的に結合できる野生型ＴＣＲα鎖およびβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。 それぞれＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に特異的に結合できる野生型ＴＣＲα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。

可溶性参照ＴＣＲ、即ち、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する野生型ＴＣＲの結合曲線である。 本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞のＩＦＮ―γ活性化機能実験の結果を示す（標的細胞は腫瘍細胞株である）。 本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞のＩＦＮ―γ活性化機能実験の結果を示す（標的細胞はＴ２がロードされた短いペプチドである）。

本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトエフェクター細胞のＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷機能実験の結果である。 本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞のＬＤＨ殺傷機能実験の結果である。 エフェクター細胞に対する融合タンパク質のリダイレクト実験の結果を示すグラフである。

本発明は、広範囲にわたる詳細な研究を通じて、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ短いペプチド（ＡＦＰタンパク質に由来する）を識別する高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を取得し、前記ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ短いペプチドは、ペプチド―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体の形態で提示される。前記高親和性ＴＣＲにおいて、
ＣＤＲ１α：ＤＳＳＳＴＹ、
ＣＤＲ２α：ＩＦＳＮＭＤＭ、
ＣＤＲ３α：ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩのα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域で突然変異が発生され、および／または
ＣＤＲ１β：ＭＮＨＥＹ、
ＣＤＲ２β：ＳＶＧＥＧＴ、
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹのβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域で突然変異が発生され、また、突然変異した後の上記ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する本発明のＴＣＲの親和性および／または結合半減期は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍である。

本発明を説明する前に、本発明は、記載された具体的な方法および実験条件に限定されないため、このような方法および条件を変化させることができることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。

特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語の両方とも、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明の実施または試験で本発明に記載の類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、本明細書では好ましい方法および材料を例示する。

用語
Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）
国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）を使用してＴＣＲを説明することができる。天然αβヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。大まかに言えば、各鎖は、可変領域、リンカー領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、可変領域とリンカー領域との間に短い可変領域を含むが、当該可変領域は、しばしばリンカー領域の一部と見なされる。ユニークなＩＭＧＴのＴＲＡＪおよびＴＲＢＪを介して、ＴＣＲのリンカー領域を決定し、ＩＭＧＴのＴＲＡＣおよびＴＲＢＣを介して、ＴＣＲの定常領域を決定する。

各可変領域は、フレームワーク配列に勘合されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の三つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含む。ＩＭＧＴの命名法において、ＴＲＡＶおよびＴＲＢＶの異なる番号は、それぞれ異なるＶα種類およびＶβ種類を指す。ＩＭＧＴシステムにおいて、α鎖定常ドメインは、ＴＲＡＣ＊０１の記号を有し、ここで、「ＴＲ」は、Ｔ細胞受容体遺伝子を表し、「Ａ」は、α鎖遺伝子を表し、Ｃは、定常領域を表し、「＊０１」は、対立遺伝子１を表す。β鎖定常ドメインは、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１の記号を有し、ここで、「ＴＲ」は、Ｔ細胞受容体遺伝子を表し、「Ｂ」は、β鎖遺伝子を表し、Ｃは、定常領域を表し、「＊０１」は、対立遺伝子１を表す。α鎖の定常領域は、一意に決定され、β鎖の形態において、二つの可能な定常領域遺伝子「Ｃ１」および「Ｃ２」が存在する。当業者は、公開されたＩＭＧＴデータベースを介して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の定常領域遺伝子配列を取得することができる。

ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般にそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインの二つの「ドメイン」を有すると見なされる。可変ドメインは、リンクされた可変領域およびリンカー領域で構成される。従って、本出願の明細書および特許請求の範囲において、「ＴＣＲα鎖可変ドメイン」は、リンクされたＴＲＡＶおよびＴＲＡＪ領域を指し、同様に、「ＴＣＲβ鎖可変ドメイン」は、リンクされたＴＲＢＶおよびＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域を指す。ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αであり、ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βである。本発明のＴＣＲ可変ドメインのフレームワーク配列は、マウスまたはヒト由来、好ましくはヒト由来である。ＴＣＲの定常ドメインは、細胞内部分、膜貫通領域および細胞外部分を含む。可溶性ＴＣＲを得るために、ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の親和性を測定するために、本発明のＴＣＲは、好ましくは膜貫通領域を含まない。より好ましくは、本発明のＴＣＲのアミノ酸配列は、ＴＣＲの細胞外アミノ酸配列を指す。

本発明で使用されるＴＣＲ配列は、ヒト由来である。図１２ａおよび１２ｂに示されるように、本発明における前記「野生型ＴＣＲ」のα鎖アミノ酸配列およびβ鎖アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８である。図８ａおよび８ｂに示されるように、本発明における前記「参照ＴＣＲ」のα鎖アミノ酸配列およびβ鎖アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３である。図１１ａおよび１１ｂに示されるように、本発明における前記「野生型ＴＣＲ」のα鎖およびβ鎖細胞外アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６である。本発明において、図１ａおよび１ｂに示されるように、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合できる野生型ＴＣＲのα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。本発明において、「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」、「本発明のＴ細胞受容体」という用語は、交換可能に使用される。

本発明の好ましい実施形態中において、本発明によるＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、およびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含む。

別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、配列Ｄ［１αＸ１］［１αＸ２］［１αＸ３］ＴＹを含み、ここで、［１αＸ１］、［１αＸ２］、［１αＸ３］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＳまたはＫまたはＰまたはＲまたはＴである。

別の好ましい例において、前記［１αＸ２］は、ＳまたはＭまたはＷである。
別の好ましい例において、前記［１αＸ３］は、ＳまたはＡである。
別の好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＳまたはＫまたはＰまたはＲまたはＴであり、［１αＸ２］は、ＳまたはＭまたはＷであり、［１αＸ３］は、ＳまたはＡである。

別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、ＤＳＳＳＴＹ、ＤＫＭＳＴＹ、ＤＰＷＡＴＹ、ＤＲＭＳＴＹおよびＤＴＭＳＴＹからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２αは、配列ＩＦＳ［２αＸ１］［２αＸ２］［２αＸ３］［２αＸ４］を含み、ここで、［２αＸ１］、［２αＸ２］、［２αＸ３］、［２αＸ４］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。

別の好ましい例において、前記［２αＸ１］は、ＮまたはＹである。
別の好ましい例において、前記［２αＸ２］は、ＭまたはＱである。
別の好ましい例において、前記［２αＸ３］は、ＤまたはＳまたはＴである。
別の好ましい例において、前記［２αＸ４］は、ＭまたはＥまたはＴである。

別の好ましい例において、前記［２αＸ１］は、ＮまたはＹであり、［２αＸ２］は、ＭまたはＱであり、［２αＸ３］は、ＤまたはＳまたはＴであり、［２αＸ４］は、ＭまたはＥまたはＴである。
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２αは、ＩＦＳＮＭＤＭ、ＩＦＳＹＭＴＥ、ＩＦＳＹＱＳＥおよびＩＦＳＹＱＳＴからなる群から選択される配列を含む。

別の好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、配列ＡＥＰＮ［３αＸ１］［３αＸ２］［３αＸ３］［３αＸ４］ＡＬＩを含み、ここで、［３αＸ１］、［３αＸ２］、［３αＸ３］および［３αＸ４］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＱまたはＡまたはＤまたはＥまたはＫまたはＮまたはＲまたはＳまたはＴである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ２］は、ＡまたはＳまたはＶである。

別の好ましい例において、前記［３αＸ３］は、ＧまたはＨまたはＱまたはＴである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ４］は、ＴまたはＳである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＴまたはＦであり、［３αＸ２］は、ＲまたはＮであり、［３αＸ３］は、ＧまたはＨまたはＱまたはＴであり、［３αＸ４］は、ＴまたはＳである。

別の好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ、ＡＥＰＮＮＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＡＡＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＡＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＳＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＳＡＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＮＡＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＫＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＱＡＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＱＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＲＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＫＡＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＴＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＤＶＴＴＡＬＩ、ＡＥＰＮＥＳＱＳＡＬＩからなる群から選択される配列を含む。

本発明の好ましい実施形態中において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、およびＣＤＲ３αを含み、および前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ１βは、配列ＭＮＨＥＹを含む。

別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、配列［２βＸ１］［２βＸ２］［２βＸ３］［２βＸ４］を含み、ここで、［２βＸ１］、［２βＸ２］、［２βＸ３］および［２βＸ４］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。

別の好ましい例において、前記［２βＸ１］は、ＳまたはＨである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ２］は、ＶまたはＤまたはＬである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ３］は、ＧまたはＥまたはＷである。

別の好ましい例において、前記［２βＸ４］は、ＥまたはＬまたはＶである。
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、ＳＶＧＥＧＴ、ＨＤＷＬＧＴ、ＳＤＷＬＧＴおよびＳＬＥＶＧＴからなる群から選択される配列を含む。

別の好ましい例において、前記ＣＤＲ３βは、配列ＡＳ［３βＸ１］［３βＸ２］［３βＸ３］［３βＸ４］ＤＰ［３βＸ５］［３βＸ６］［３βＸ７］［３βＸ８］を含む。ここで、［３βＸ１］、［３βＸ２］、［３βＸ３］、［３βＸ４］、［３βＸ５］、［３βＸ６］、［３βＸ７］および［３βＸ８］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。

別の好ましい例において、前記［３βＸ１］は、ＡまたはＳである。
別の好ましい例において、前記［３βＸ２］は、ＳまたはＤである。
別の好ましい例において、前記［３βＸ３］は、ＬまたはＩまたはＶである。
別の好ましい例において、前記［３βＸ４］は、ＥまたはＱまたはＴである。

別の好ましい例において、前記［３βＸ５］は、ＹまたはＦである。
別の好ましい例において、前記［３βＸ６］は、ＥまたはＩまたはＰまたはＶである。
別の好ましい例において、前記［３βＸ７］は、ＱまたはＫまたはＬまたはＭまたはＶである。
別の好ましい例において、前記［３βＸ８］は、ＹまたはＡまたはＥまたはＩまたはＬまたはＮまたはＱまたはＲまたはＳまたはＴまたはＶである。

別の好ましい例において、前記ＣＤＲ３βは、ＡＳＳＳＬＥＤＰＦＶＫＲ、ＡＳＡＤＶＱＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＡＤＩＱＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＭＴ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＫＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＶＴ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＫＩ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＫＴ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＬＮ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＬＴ、ＡＳＳＤＶＴＤＰＹＥＱＹ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＩＭＡ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＬＥ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＰＭＬ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＶＳ、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＶＭＶおよびＡＳＳＳＶＥＤＰＹＥＱＹからなる群から選択される配列を含む。

別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は、ＶＧＩＳＡであり、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＬＳＳＧＫであり、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は、ＡＶＥＴＳＹＤＫＶＩである。

天然鎖間ジスルフィド結合および人工的な鎖間ジスルフィド結合
天然ＴＣＲの膜近位領域のＣα鎖とＣβ鎖との間には、一つの群のジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。

容易に説明するために、本発明におけるＴＲＡＣ＊０１およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１アミノ酸配列の位置番号は、Ｎ端からＣ端まで順番に位置番号を付け、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順番の順序の６０番目位置のアミノ酸は、Ｐ（プロリン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＰｒｏ６０と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目位置のアミノ酸と表現することもでき、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順次的順序の６１番目位置のアミノ酸は、Ｑ（グルタミン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｎ６１と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目位置のアミノ酸と表現することもでき、他は、類推によって推測することができる。本発明において、可変領域のＴＲＡＶとＴＲＢＶとのアミノ酸配列の位置番号は、ＩＭＧＴに記載の位置番号に従って番号が付けられる。例えば、ＴＲＡＶの特定のアミノ酸について、ＩＭＧＴに記載された位置番号が４６であると、本発明においてＴＲＡＶの４６番目位置のアミノ酸と表現され、他は、類推によって推測することができる。本発明において、他のアミノ酸の配列位置番号について特別な指示がある場合、特別な指示に従う。

腫瘍
「腫瘍」という用語は、病理学的タイプまたは感染の段階に関係なく、すべてのタイプの癌細胞増殖または発癌過程、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織または器官を含むことを意味する。腫瘍の実施例は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移性病変を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は、例えば、肉腫、肺扁平上皮癌および癌等の様々な臓器系の悪性腫瘍を含む。例えば、感染された前立腺、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖器（例えば、腎臓、上皮細胞）、咽頭である。肺扁平上皮癌は、例えば、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌および食道癌等の悪性腫瘍を含む。前記癌の転移性病変は、本発明の方法および組成物を使用して治療および予防することができる。

発明の詳細な説明
周知されたように、ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとは、それぞれ三つのＣＤＲを含み、抗体の相補性決定領域に類似している。ＣＤＲ３は、抗原の短いペプチドと相互作用し、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とは、ＨＬＡと相互作用する。従って、ＴＣＲ分子のＣＤＲは、抗原の短いペプチド－ＨＬＡ複合体との相互作用を決定する。抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ与ＨＬＡ Ａ０２０１複合体（即ち、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体）に結合できる野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、当該配列は、本発明者らによって初めて発見された。

α鎖可変ドメインＣＤＲ ＣＤＲ１α：ＤＳＳＳＴＹ
ＣＤＲ２α：ＩＦＳＮＭＤＭ
ＣＤＲ３α：ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ
β鎖可変ドメインＣＤＲ ＣＤＲ１β：ＭＮＨＥＹ
ＣＤＲ２β：ＳＶＧＥＧＴ
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹのようなＣＤＲ領域を有する。

本発明は、上記ＣＤＲ領域に対して突然変異のスクリーニングすることにより、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との親和性が野生型ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との親和性の少なくとも２倍である高親和性ＴＣＲを得た。
本発明は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合できる活性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。

前記Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、
ＣＤＲ１α：ＤＳＳＳＴＹ
ＣＤＲ２α：ＩＦＳＮＭＤＭ
ＣＤＲ３α：ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、

および／または、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、
ＣＤＲ１β：ＭＮＨＥＹ
ＣＤＲ２β：ＳＶＧＥＧＴ
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。

本発明において、野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２６～３１番目、４９～５５番目および９０～１００番目に位置する。これに従って、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される番号を採用し、２７Ｓは、ＣＤＲ１αの２番目位置のＳであり、２８Ｓは、ＣＤＲ１αの３番目位置のＳであり、２９Ｓは、ＣＤＲ１αの３番目位置のＳであり、５２Ｎは、ＣＤＲ２αの４番目位置のＮであり、５３Ｍは、ＣＤＲ２αの５番目位置のＭであり、５４Ｇは、ＣＤＲ２αの６番目位置のＧであり、５５Ｍは、ＣＤＲ２αの７番目位置のＭであり、９４Ｑは、ＣＤＲ３αの５番目位置のＱであり、９５Ａは、ＣＤＲ３αの６番目位置のＡであり、９６Ｇは、ＣＤＲ３αの７番目位置のＧであり、および９７Ｔは、ＣＤＲ３αの８番目位置のＴである。

同様に、本発明において、野生型ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２７～３１番目、４９～５４番目および９２～１０３番目に位置する。従って、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される番号を採用し、４９Ｓは、ＣＤＲ２βの１番目位置のＳであり、５０Ｖは、ＣＤＲ２βの２番目位置のＶであり、５１Ｇは、ＣＤＲ２βの３番目位置のＧであり、５２Ｅは、ＣＤＲ２βの４番目位置のＥであり、９４Ｓは、ＣＤＲ３βの３番目位置のＳであり、９５Ｓは、ＣＤＲ３βの４番目位置のＳであり、９６Ｌは、ＣＤＲ３βの５番目位置のＬであり、９７Ｅは、ＣＤＲ３βの６番目位置のＥであり、１００Ｙは、ＣＤＲ３βの９番目位置のＹであり、１０１Ｅは、ＣＤＲ１１βの１０番目位置のＥであり、１０２Ｑは、ＣＤＲ３βの１１番目位置のＱであり、および１０３Ｙは、ＣＤＲ３βの１２番目位置のＹである。

好ましくは、突然変異した後の前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２７Ｋまたは２７Ｐまたは２７Ｒまたは２７Ｔ、２８Ｍまたは２８Ｗ、２９Ａ、５２Ｙ、５３Ｑ、５４Ｓまたは５４Ｔ、５５ＥまたはＴ、９４Ａまたは９４Ｄまたは９４Ｅまたは９４Ｋまたは９４Ｎまたは９４Ｒまたは９４Ｓまたは９４Ｔ、９５Ｓまたは９５Ｖ、９６Ｈまたは９６Ｑまたは９６Ｔおよび９７Ｓからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される番号を採用し、および／または突然変異した後の前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、４９Ｈ、５０Ｄまたは５０Ｌ、５１Ｅまたは５１Ｗ、５２Ｌまたは５２Ｖ、９４Ａ、９５Ｄ、９６Ｉまたは９６Ｖ、９７Ｑまたは９７Ｔ、１００Ｆ、１０１Ｉまたは１０１Ｐまたは１０１Ｖ、１０２Ｋまたは１０２Ｌまたは１０２Ｍまたは１０２Ｖ、１０３Ａまたは１０３Ｅまたは１０３Ｉまたは１０３Ｌまたは１０３Ｎまたは１０３Ｑまたは１０３Ｒまたは１０３Ｓまたは１０３Ｔまたは１０３Ｖからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される番号を採用する。

より具体的には、α鎖可変ドメインにおける前記突然変異の具体的な形態は、Ｓ２７Ｋ／Ｐ／Ｒ／Ｔ、Ｓ２８Ｍ／Ｗ、Ｓ２９Ａ、Ｎ５２Ｙ、Ｍ５３Ｑ、Ｄ５４Ｓ／Ｔ、Ｍ５５Ｅ／Ｔ、Ｑ９４Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ａ９５Ｓ／Ｖ、Ｇ９６Ｈ／Ｑ／Ｔ、Ｔ９７Ｓのうちの一つまたは複数の群を含み、β鎖可変ドメインにおける前記突然変異の具体的な形態は、Ｓ４９Ｈ、Ｖ５０Ｄ／Ｌ、Ｇ５１Ｅ／Ｗ、Ｅ５２Ｌ／Ｖ、Ｓ９４Ａ、Ｓ９５Ｄ、Ｌ９６Ｉ／Ｖ、Ｅ９７Ｑ／Ｔ、Ｙ１００Ｆ、Ｅ１０１Ｉ／Ｐ／Ｖ、Ｑ１０２Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、Ｙ１０３Ａ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖのうちの一つまたは複数の群を含む。

より詳細には、前記ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域の突然変異の数は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個であり得、および／または前記ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域の突然変異の数は、１個、２個、三つの、４個、５個、６個、７個または８個であり得る。

さらに、本発明の前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

さらに、本発明の前記ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列有少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、可以是少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％的配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であり得る）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましくは、前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含む。

当業者に周知の部位特異的突然変異誘発の方法によれば、野生型ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８突然変異をシステインに突然変異し、β鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７突然変異をシステインに突然変異し、即ち、参照ＴＣＲを取得し、そのアミノ酸配列は、それぞれ図８ａおよび８ｂに示されたとおりであり、突然変異した後のシステイン残基は、太字で表される。上記システイン置換は、参照ＴＣＲのα鎖とβ鎖の定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成して、より安定した可溶性ＴＣＲを形成することにより、ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性および／または結合半減期をより容易に評価することができる。ＴＣＲ可変領域のＣＤＲ領域は、ｐＭＨＣ複合体との間の親和性を決定し、従って、上記ＴＣＲ定常領域のシステイン置換は、ＴＣＲの結合親和性および／または結合半減期に影響を与えないことを理解されたい。従って、本発明において、測定された参照ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性は、野生型ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性であると見なされる。同様に、本発明のＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性が参照ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性の少なくとも１０倍であると測定される場合、本発明のＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性が野生型ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性の少なくとも１０倍と同等である。

任意の適した方法によって結合親和性（解離平衡定数Ｋ_Ｄに反比例）および結合半減期（Ｔ_１／２として表される）を測定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴技術を使用して検出する。ＴＣＲの親和性を２倍にすると、Ｋ_Ｄが半分になることを理解されたい。Ｔ_１／２は、Ｉｎ２を解離速度（Ｋ_ｏｆｆ）で割ったものとものとして計算される。従って、Ｔ_１／２を２倍にすると、Ｋ_ｏｆｆが半分になる。好ましくは、同じ試験方案を使用して、所与ＴＣＲの結合親和性または結合半減期の回数、例えば、３回またはその以上を検出し、結果の平均値をとる。好ましい実施形態において、本明細書の実施例における表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）の方法で可溶性ＴＣＲの親和性を検出し、条件は、温度が２５℃であり、ＰＨ値が７．１～７．５である。当該方法は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する参照ＴＣＲの解離平衡定数Ｋ_Ｄが３０．１μＭである３．０１Ｅ～０５Ｍであることを検出し、即ち、本発明において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する野生型ＴＣＲの解離平衡定数Ｋ_Ｄも３０．１μＭであると見なされる。ＴＣＲの親和性を２倍にすると、Ｋ_Ｄが半分になるため、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する高親和性ＴＣＲの解離平衡定数Ｋ_Ｄが３．０１μＭである３．０１Ｅ～０６Ｍであると検出される場合、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する当該高親和性ＴＣＲの親和性は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する野生型ＴＣＲの親和性の１０倍であると説明される。当業者は、Ｋ_Ｄ値の単位間の変換関係、即ち、１Ｍ＝１０^６μＭ、１μＭ＝１０００ｎＭ、１ｎＭ＝１０００ｐＭに精通している。

本発明の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも５倍、より好ましくは、少なくとも１０倍である。
別の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも５０倍、好ましくは、少なくとも１００倍、より好ましくは、少なくとも５００倍である。

別の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも１０^４倍、好ましくは、少なくとも１０^５倍、より好ましくは、少なくとも５×１０^５倍である。
別の好ましい例において、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、５μＭ≦Ｋ_Ｄ≦１０μＭ、好ましくは、０．１μＭ≦Ｋ_Ｄ≦１μＭ、より好ましくは、１ｎＭ≦Ｋ_Ｄ≦１００ｎＭ、より好ましくは、１０ｐＭ≦Ｋ_Ｄ≦１００ｐＭである。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくもの、制限酵素に基づくグローニングまたはライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）方法を含むがこれらに限定されない、任意の適切な方法を使用して突然変異することができる。多くの標準的分子生物学の教科書は、これらの方法を詳述している。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の突然変異誘発および制限酵素に基づくクローニングのより多くの詳細は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、（２００１）分子クローニング―実験マニュアル、第３版、ＣＳＨＬ出版社を参照する。ＬＩＣ方法のより多くの情報は、（Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ、（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６（１）：３０―６）を参照することができる。

本発明のＴＣＲを生成する方法は、例えば、文書（Ｌｉ、ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（３）：３４９―３５４）に記載されるように、このようなＴＣＲを表すファージ粒子を多様なライブラリーからＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するＴＣＲをスクリーニングすることができるが、これらに限定されない。

野生型ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸を発現する遺伝子またはわずかに修飾した野生型ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸を発現する遺伝子は、両方ともテンプレートＴＣＲを調製されることができることを理解されたい。次に、当該テンプレートＴＣＲの可変ドメインをコードするＤＮＡは、本発明の高親和性ＴＣＲを生成するために必要な変化を導入する。

本発明の高親和性ＴＣＲは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４―８７のうちの一つおよび／またはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８～１１４のうちの一つを含む。従って、野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８～１１４のうちの一つを含むＴＣＲβ鎖と組み合わせて、ヘテロ二量体ＴＣＲまたは一本鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、野生型ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含むＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～８７のうちの一つを含むＴＣＲα鎖と組み合わせて、ヘテロ二量体ＴＣＲまたは一本鎖ＴＣＲ分子を形成する。または、ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～８７のうちの一つを含むＴＣＲα鎖は、ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８～１１４のうちの一つを含むＴＣＲβ鎖と組み合わせて、ヘテロ二量体ＴＣＲまたは一本鎖ＴＣＲ分子を形成する。本発明において、ヘテロ二量体ＴＣＲ分子を形成するα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、以下の表１から選択される。

本発明の目的に基づいて、本発明のＴＣＲは、少なくとも一つのＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ鎖可変ドメインを有する一部である。通常、それらは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを同時に含む。それらは、αβヘテロ二量体または一本鎖形式または安定して存在することができる他の形態であり得る。養子免疫治療において、αβヘテロ二量体ＴＣＲの全長鎖（細胞質および膜貫通ドメインを含む）をトランスフェクションすることができる。本発明のＴＣＲは、治療剤を抗原提示細胞に送達するための標的剤として使用するか、または他の分子と組み合わせて、エフェクター細胞を標的とする二機能性ポリペプチドを調製することができ、この場合、ＴＣＲは、好ましくは、可溶性形態である。

安定性に関して、先行技術は、例えば、特許文書ＰＣＴ／ＣＮ２０１５／０９３８０６に記載されたように、ＴＣＲα鎖とβ鎖定常ドメインとの間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、可溶性で安定したＴＣＲ分子を得ることができることを開示している。従って、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入されるＴＣＲであり得る。システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖とβ鎖との定常ドメインの間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成する。システイン残基は、天然ＴＣＲの適切な部位にある他のアミノ酸残基を置換して、人工鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。例えば、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８を置換して、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７を置換することにより、ジスルフィド結合を形成する。システイン残基を導入して、ジスルフィド結合を形成する部位は、さらにＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、またはＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０であり得る。即ち、システイン残基は、前記α鎖およびβ鎖定常ドメインの任意の群の部位を置換する。最大１５個、または最大１０個、または最大８個またはその以下のアミノ酸を、本発明のＴＣＲ定常ドメインの一つまたは複数のＣ末端で切断して、システイン残基を含まないようにして、天然鎖間ジスルフィド結合を欠失する目的を達成し、天然鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を別のアミノ酸に突然変異することによって前記目的を達成することができる。

前記のように、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に導入された人工鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。定常ドメインの間に前記に記載の導入された人工鎖間ジスルフィド結合の有無に関係なく、本発明のＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含むことができることに留意されたい。ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列は、ＴＣＲに存在する天然鎖間ジスルフィド結合によって結合されることができる。

さらに、安定性に関して、特許文書ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７７６８０は、ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、ＴＣＲの安定性を大幅に向上させることができることも開示された。従って、本発明の高親和性ＴＣＲの鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。具体的には、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ＴＲＡＶの４６番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目位置のアミノ酸、ＴＲＡＶの４７番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目位置のアミノ酸、ＴＲＡＶの４６番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目位置のアミノ酸、またはＴＲＡＶの４７番目位置のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目位置のアミノ酸を置換した。好ましくは、そのようなＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含むことができ、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖およびβ鎖は、ヘテロ二量体を形成する。より好ましくは、そのようなＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメイン、ならびに膜貫通ドメインを除く全部または一部のβ鎖定常ドメインを含むことができるが、α鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびβ鎖は、ヘテロ二量体を形成する。

安定性に関して、一方、本発明のＴＣＲは、その疎水性コア領域で突然変異が発生するＴＣＲを含み、これらの疎水性コア領域における突然変異は、好ましくは、例えば、ＷＯ２０１４／２０６３０４の公開番号を有する特許文書に記載されるように、本発明のＴＣＲの安定性を向上させることができる。そのようなＴＣＲは、（α鎖および／またはβ鎖）可変領域アミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、９４番目、および／またはα鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＡＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後から３番目、最後から５番目、最後から７番目、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＢＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後から２番目、４番目、６番目位置の可変ドメイン疎水性コア位置で突然変異させることができ、ここで、アミノ酸配列の位置番号は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）に記載された位置番号による。当業者は、前記国際免疫遺伝学情報システムを知り、当該データベースに従って、ＩＭＧＴにおける異なるＴＣＲのアミノ酸残基の位置番号を得ることができる。

より具体的には、本発明において、疎水性コア領域で突然変異が発生するＴＣＲは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合する柔軟なペプチド鎖から構成される安定的な可溶性一本鎖ＴＣＲであり得る。ＴＣＲ可変領域のＣＤＲ領域は、短いペプチド－ＨＬＡ複合体との間の親和性を決定し、疎水性コアの突然変異により、ＴＣＲがより安定することができるが、短いペプチド－ＨＬＡ複合体との間の親和性に影響を与えない。本発明における柔軟なペプチド鎖は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合するのに適した任意のペプチド鎖であり得ることに留意されたい。本発明の実施例１で構築された高親和性ＴＣＲをスクリーニングするためのテンプレート鎖は、前記疎水性コア突然変異を含む高安定性一本鎖ＴＣＲである。より安定性の高いＴＣＲを使用して、ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との間の親和性をより容易に評価することができる。

当該一本鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのＣＤＲ領域は、野生型ＴＣＲのＣＤＲ領域と全く同じである。即ち、α鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１α：ＤＳＳＳＴＹ、ＣＤＲ２α：ＩＦＳＮＭＤＭ、ＣＤＲ３α：ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩであり、およびβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１β：ＭＮＨＥＹ、ＣＤＲ２β：ＳＶＧＥＧＴ、ＣＤＲ３β：ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹである。当該一本鎖テンプレートＴＣＲのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）およびヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）は、それぞれ図７ａおよび７ｂに示されたとおりである。このようにして、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインからなる一本鎖ＴＣＲをスクリーニングする。

本発明において、一本鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の２６～３１番目、４９～５５番目および９０～１００番目に位置する。これに従って、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される番号を採用し、２７Ｓは、ＣＤＲ１αの２番目位置のＳであり、２８Ｓは、ＣＤＲ１αの３番目位置のＳであり、２９Ｓは、ＣＤＲ１αの３番目位置のＳであり、５２Ｎは、ＣＤＲ２αの４番目位置のＮであり、５３Ｍは、ＣＤＲ２αの５番目位置のＭであり、５４Ｇは、ＣＤＲ２αの６番目位置のＧであり、５５Ｍは、ＣＤＲ２αの７番目位置のＭであり、９４Ｑは、ＣＤＲ３αの５番目位置のＱであり、９５Ａは、ＣＤＲ３αの６番目位置のＡであり、９６Ｇは、ＣＤＲ３αの７番目位置のＧであり、および９７Ｔは、ＣＤＲ３αの８番目位置のＴである。

同様に、本発明において、一本鎖テンプレートＴＣＲβ鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２７～３１番目、４９～５４番目および９２～１０３番目に位置する。従って、アミノ酸残基の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される番号を採用し、４９Ｓは、ＣＤＲ２βの１番目位置のＳであり、５０Ｖは、ＣＤＲ２βの２番目位置のＶであり、５１Ｇは、ＣＤＲ２βの３番目位置のＧであり、５２Ｅは、ＣＤＲ２βの４番目位置のＥであり、９４Ｓは、ＣＤＲ３βの３番目位置のＳであり、９５Ｓは、ＣＤＲ３βの４番目位置のＳであり、９６Ｌは、ＣＤＲ３βの５番目位置のＬであり、９７Ｅは、ＣＤＲ３βの６番目位置のＥであり、１００Ｙは、ＣＤＲ３βの９番目位置のＹであり、１０１Ｅは、ＣＤＲ１１βの１０番目位置のＥであり、１０２Ｑは、ＣＤＲ３βの１１番目位置のＱであり、および１０３Ｙは、ＣＤＲ３βの１２番目位置のＹである。

ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する本発明のαβヘテロ二量体は、スクリーニングされた高親和性一本鎖ＴＣＲのα鎖およびβ鎖可変ドメインのＣＤＲ領域を野生型ＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびβ鎖可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の対応する位置に移すことによって得られる。別の一部は、スクリーニングして得られたＣＤＲ領域の突然変異部位に基づいて、人工的に組み合わせることによって得られる。

本発明の高親和性ＴＣＲは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～３２のうちの一つおよび／またはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～５９のうちの一つを含む。従って、テンプレート鎖としての上記高安定性一本鎖ＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～５９のうちの一つであるＴＣＲβ鎖可変ドメインと組み合わせて、前記一本鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、テンプレート鎖としての上記高安定性一本鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～３２のうちの一つであるＴＣＲα鎖可変ドメインと組み合わせて、前記一本鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、ＴＣＲα鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～３２のうちの一つは、ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～５９のうちの一つと組み合わせて、前記一本鎖ＴＣＲ分子を形成する。本発明において、高親和性一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、以下の表２から選択される。

本発明のＴＣＲは、多価複合体の形態で提供することもできる。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、２個、３個、４個またはより多くの本発明のＴＣＲを結合して形成されるポリマーを含み、例えば、ｐ５３の四量体化ドメインを使用して、四量体、または複数の本発明のＴＣＲを別の分子と結合して形成する複合体を生成する。本発明のＴＣＲ複合体は、インビトロまたはインビボで特定の抗原を提示する細胞を追跡または標的化するために用いられることができ、そのような使用で他の多価ＴＣＲ複合体の中間体を生成するために使用することもできる。

本発明のＴＣＲは、単独で使用することができ、共有結合または他の方法で、好ましくは、共有結合の方法でコンジュゲートと結合することができる。前記コンジュゲートは、検出可能なマーカー（診断目的とし、ここで、前記ＴＣＲは、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体を提示する細胞の存在を検出する）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分またはこれらの物質の任意の組み合わせ結合またはカップリングを含む。

診断目的で使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（電子コンピューターX線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素を含むが、これらに限定されない。

本発明のＴＣＲと結合またはカップリングすることができる治療剤は、（１）放射性核種（Ｋｏｐｐｅら、２００５、癌転移レビュー（Ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｒｅｖｉｅｗｓ）２４、５３９）、（２）生物学的毒性（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９、自然（Ｎａｔｕｒｅ）３３９、３９４、Ｅｐｅｌら、２００２、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５１、５６５）、（３）ＩＬ－２等のサイトカイン（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２、米国国立科学アカデミーの学術誌（ＰＮＡＳ）８９、１４２８、Ｃａｒｄら、２００４、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５３、３４５、Ｈａｌｉｎら、２００３、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６３、３２０２）、（４）抗体Ｆｃフラグメント（Ｍｏｓｑｕｅｒａら、２００５、免疫学ジャーナル（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１７４、４３８１）、（５）抗体ｓｃＦｖフラグメント（Ｚｈｕら、１９９５、癌国際ジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）６２、 ３１９）、（６）金ナノ粒子／名のロッド（Ｌａｐｏｔｋｏら、２００５、癌コミュニケーション（Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ ）２３９、３６、Ｈｕａｎｇら、２００６、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）１２８、２１１５）、（７）ウイルス粒子（Ｐｅｎｇら、２００４、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）１１、１２３４）、（８）リポソーム（Ｍａｍｏｔら、２００５、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）６５、１１６３１）、（９）ナノ磁性粒子、（１０）プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、（１１）化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。

本発明のＴＣＲに結合する抗体またはそのフラグメントは、例えば、抗―ＣＤ３または抗―ＣＤ２８または抗―ＣＤ１６抗体等の抗―Ｔ細胞またはＮＫ―細胞決定抗体を含み、上記抗体またはそのフラグメントとＴＣＲとの結合は、エフェクター細胞に対して、より適切に標的細胞を標的かすることができる。好ましい実施形態は、本発明のＴＣＲが抗―ＣＤ３抗体または前記抗―ＣＤ３抗体の機能的フラグメントまたは変異体と結合することである。具体的には、本発明のＴＣＲと抗ＣＤ３一本鎖抗体との融合分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～３２、６４～８７からなる群から選択されるＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～５９、８８～１１４からなる群から選択されるＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。

本発明は、本発明のＴＣＲをコードする核酸分子にさらに関する。本発明の核酸分子は、ＤＮＡの形態またはＲＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。例えば、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は、本発明の図面に示される核酸配列と同じであるか、または縮重変異体であり得る。「縮重変異体」の意味を説明すると、本明細書に使用されるように、本発明における「縮重変異体」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０を有するタンパク質配列をコードするが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１の配列とは異なる核酸配列を指す。

本発明の核酸分子の全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工的に合成法によって得ることができるが、これらに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはそのフラグメント、またはその誘導体由来物）をコードするＤＮＡ配列は、完全に化学的合成によって得ることができる。次に当該ＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入されることができる。

本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、および本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学によって生成される宿主細胞にも関する。

本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離された細胞、特にＴ細胞をさらに含む。本発明の高親和性ＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡによるＴ細胞トランスフェクション（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６―６１３１）に適した多くの方法がある。本発明の高親和性ＴＣＲを発現するＴ細胞は、養子免疫療法に使用することができる。当業者は、養子治療に適した多くの方法を知ることができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８（４）：２９９―３０８）。

本発明は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体および本発明のＴＣＲ、または本発明のＴＣＲ複合体、または本発明のＴＣＲを提示する細胞を含む。
本発明は、治療を必要とする対象に適切な量の本発明のＴＣＲ、または本発明のＴＣＲ複合体、または本発明のＴＣＲを提示する細胞、または本発明の医薬組成物を投与する段階を含む、疾患を治療する方法をさらに提供する。

本明細書におけるアミノ酸の名称は、国際的に使用される単一の英字で表示され、それに対応するアミノ酸の名称の三つの英字の略語は、それぞれＡｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）であり、本発明において、Ｐｒｏ６０または６０Ｐは、両方とも６０番目位置のプロリンを表す。さらに、本発明における前記突然変異の具体的な形態、例えば、「Ｓ２７Ｋ／Ｐ／Ｒ／Ｔ」は、２７番目位置のＳがＫによって置換されるか、またはＰによって置換されるか、またはＲによって置換されるか、またはＴによって置換されることを表し、同様に、「Ｓ２８Ｍ／Ｗ」は、２８番目位置のＳがＭによって置換されるか、またはＷによって置換されることを表す。他は、このような類推によって推測されることができる。

当技術分野において、同様または類似の性能を有するアミノ酸を使用して置換する場合、通常、タンパク質の機能は変化しない。Ｃ末端および／またはＮ末端に一つまたは複数のアミノ酸を追加しても、通常、タンパク質の構造および機能は変化しない。従って、本発明のＴＣＲは、本発明のＴＣＲのうち最大５個、好ましくは、３個、より好ましくは、２個、最も好ましくは、１個のアミノ酸（特に、ＣＤＲ領域の以下に位置するアミノ酸）が、類似または同様の性質を有するアミノ酸によって置換されても、依然としてその機能性を維持するＴＣＲを含む。

本発明は、本発明のＴＣＲに対してわずかに修飾したＴＣＲをさらに含む。修飾（通常、一次構造を変更しない）形態は、例えば、アセチル化またはカルボキシル化等の本発明のＴＣＲの化学的誘導形態を含む。修飾は、例えば、本発明のＴＣＲの合成および加工中またはさらなる加工段階において、グリコシル化修飾によって生成されたＴＣＲ等のグリコシル化をさらに含む。このような修飾は、ＴＣＲをグリコシル化した酵素（例えば、哺乳動物のグリコシラーゼまたはデグリコシラーゼ）によって曝露することによって達成することができる。修飾形態は、リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン）を有する配列をさらに含む。修飾されることによって、その抗タンパク質加水分解性能を向上させるか、または溶解性能を最適化したＴＣＲをさらに含む。

本発明のＴＣＲ、ＴＣＲ複合体または本発明のＴＣＲトランスフェクトされたＴ細胞は、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物に提供されることができる。本発明のＴＣＲ、多価ＴＣＲ複合体または細胞は、通常、無菌医薬組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。当該医薬組成物は、任意の適した形態（患者の所望の投与方法に依存する）であり得る。通常、密封された容器で、単位剤形で提供されることができ、キットの一部として提供されることができる。このようなキット（必須ではない）は、マニュアルを含む。それは、複数の単位剤形を含むことができる。

さらに、本発明のＴＣＲは、単独で使用することができ、他の治療剤と結合またはカップリングして一緒に使用することができる（例えば、同じ医薬組成物に調製される）。

医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤の投与に使用される担体を指す。当該用語は、それ自体が当該組成物を受け取る個体に有害な抗体の生成を誘発せず、投与後に過度の毒性を有さない等のような医薬担体を指す。これらの担体は、当業者によってよく知られている。レミントンンお薬物科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１））で、薬学的に許容される賦形剤の十分な議論を見つかることができる。このような担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、アジュバント、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。

治療性組成物の薬学的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール等の液体を含むことができる。さらに、これらの担体には、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助性物質が存在することができる。

通常、治療性組成物を、例えば、液体溶液または懸濁液等の注射可能な剤形に調製することができ、注射前に溶液または懸濁液、液体担体に処方されるのに適した固体形態に調製することができる。

本発明の組成物が処方されると、従来の経路によって投与することができ、ここで、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、または局所投与を含むが、これらに限定されず、好ましくは、皮下、肌肉内または静脈内を含む胃腸外である。予防または治療される対象は、動物であり、特にヒトであり得る。

本発明の医薬組成物が実際の治療に使用される場合、使用状況に応じて、様々な剤形の医薬組成物を使用することができる。好ましくは、注射剤および経口剤などが例示されることができる。

これらの医薬組成物は、従来の方法に基づいて混合、希釈または溶解することによって処方されることができ、また場合によって、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｉｅｓ）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤および共溶媒剤等の適切な薬物添加剤を加え、当該調製プロセスは、剤形に従って、通常の方法で実施することができる。

本発明の医薬組成物は、徐放剤の形態で投与することができる。例えば、本発明のＴＣＲは、担体として徐放性ポリマーを有するピルまたはマイクロカプセルに組み込まれることができ、次に当該ピルまたはマイクロカプセルを、手術を通じて、治療される組織に移植する。徐放性ポリマーの例として、エチレン―酢酸ビニルコポリマー（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ポリヒドロメタアクリレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｍｅｔａａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、乳酸ポリマー、乳酸―グリコール酸コポリマー等を含み、好ましくは、例えば、乳酸ポリマーおよび乳酸―グリコール酸コポリマー等の生分解性ポリマーを含む。

本発明の医薬組成物が実際の治療に使用される場合、有効成分としての本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ複合体または本発明のＴＣＲを提示する細胞は、治療される各患者の体重、年齢、性別および症状程度等に基づいて、合理的に決定することができ、最終に、医師によって合理的な投与量をけっていされる。

本発明の主な利点は次のとおりである。
（１）前記ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に対する本発明のＴＣＲの親和性および／または結合半減期は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも１０倍である。
（２）前記ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に対する本発明のＴＣＲの親和性および／または結合半減期は、野生型ＴＣＲの少なくとも１００倍、好ましくは、少なくとも１０^３倍であり、より好ましくは、１０^４～５×１０^５倍に達成することができる。
（３）本発明の高親和性ＴＣＲで形質導入されたエフェクター細胞は、標的細胞に対して強力な殺傷効果を有する。

以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。

材料および方法
本発明の実施例で使用される実験材料は、特に明記しない限り、商業チャネルから入手することができ、ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αは、Ｔｉａｎｇｅｎから購入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｔｉａｎｇｅｎから購入し、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｔｕｎｅｒ （ＤＥ３）は、Ｎｏｖａｇｅｎから購入し、プラスミドｐＥＴ２８ａは、Ｎｏｖａｇｅｎから購入する。

実施例１．疎水性コアの突然変異の安定性一本鎖ＴＣＲテンプレート鎖の生成
本発明は、特許文書ＷＯ２０１４／２０６３０４による部位特異的突然変異誘発の方法を使用して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインを結合する柔軟な短いペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）から構成される安定性一本鎖ＴＣＲ分子を構築し、図７ａおよび図７ｂに示されるように、そのアミノ酸およびＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１である。当該一本鎖ＴＣＲ分子をテンプレートとして使用して、高親和性ＴＣＲ分子をスクリーニングする。当該テンプレート鎖のα可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびβ可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸配列は、図２ａおよび２ｂに示されたとおりであり、図３ａおよび３ｂに示されるように、その対応するＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６であり、図４ａおよび４ｂに示されるように、柔軟な短いペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および８である。

テンプレート鎖を持つ標的遺伝子をＮｃｏＩとＮｏｔＩとで二重酵素消化し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩとで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩インキュベートし、陽性クローニングを選択して、ＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後に組換えプラスミドを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、発現に使用される。

実施例２．実施例１で構築された安定性一本鎖ＴＣＲの発現、再生および精製
実施例１で調製された組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ―テンプレート鎖を含むＢＬ２１（ＤＥ３）コロニーの全部を、カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ_６００が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が０．５ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、３７℃で引き続き４時間培養する。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞ペレットを採集し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細胞ペレットを熱分解し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して封入体を回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、封入体を収集する。封入体を緩衝液（２０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）―ＨＣｌ ｐＨ８．０、８Ｍ尿素）に溶解し、高速遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をＢＣＡ法で定量化した後に分注して、後で使用するために―８０℃で保存する。

５ｍｇの溶解した一本鎖ＴＣＲ封入体タンパク質に、２．５ｍＬの緩衝液（６ＭのＧｕａ―ＨＣｌ、５０ｍＭのトリス―ＨＣｌ ｐＨ８．１、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、最終濃度が１０ｍＭになるまでＤＴＴを加え、３７℃で３０分間処理する。注射器を使用して、１２５ｍＬの再生緩衝液（１００ｍＭのトリス―ＨＣｌ ｐＨ８．１、０．４ＭのＬ―アルギニン、５Ｍの尿素、２ｍＭのＥＤＴＡ、６．５ｍＭのβ―メルカプトエチルアミン（β―ｍｅｒｃａｐｔｈｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、１．８７ｍＭのシスタミン（Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ））に上記処理後の一本鎖ＴＣＲを滴下し、４℃で１０分間攪拌し、次に再生液をカットオフが４Ｋ_Ｄａであるセルロース膜透析バッグに入れ、透析バッグを１Ｌの予冷した水に入れ、４℃で一晩ゆっくりと攪拌する。１７時間後、透析液を１Ｌの予冷した緩衝液（２０ｍＭのトリス―ＨＣｌ ｐＨ８．０）に変更し、４℃で引き続き８時間透析し、次に透析液を同じ新しい緩衝液に変更し、引き続き一晩透析する。１７時間後、サンプルを０．４５μｍのフィルターメンブレンでろ過し、真空脱気した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過し、２０ｍＭのトリス―ＨＣｌ ｐＨ８．０で調製した０～１ＭのＮａＣｌ線形勾配溶出液でタンパク質を精製し、収集した溶出成分をＳＤＳ―ＰＡＧＥで分析し、一本鎖ＴＣＲを含む成分を濃縮した後、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製し、標的成分もＳＤＳ―ＰＡＧＥで分析する。

ＢＩＡｃｏｒｅ分析に使用される溶出成分は、ゲルろ過法でその純度をさらに試験する。条件は次のとおりである。クロマトグラフィーカラムＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ―３（３００Ａ、φ７．８×３００ｍＭ）、移動相が１５０ｍＭのリン酸塩緩衝液であり、流速が０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度が２５℃であり、UV検出波長が２１４ｎｍである。

実施例３．結合の特性化
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００リアルタイム分析システムを使用して、ＴＣＲ分子とＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との結合活性を検出する。抗ストレプトアビジン抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をカップリング緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ４．７７）に加え、次に事前にＥＤＣおよびＮＨＳ活性化されたＣＭ５チップに抗体を流して、抗体がチップ表面に固定させ、最後にエタノールアミンの塩酸溶液で未反応の活性化表面を密封して、カップリング過程を完了し、カップリングレベルは、約１５０００ＲＵである。条件は次のとおりである。温度が２５℃であり、ＰＨ値が７．１～７．５である。

低濃度のストレプトアビジンを抗体でコーティングされたチップ表面に流し、次にＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体を検出チャネルに流し、別のチャネルを参照チャネルとして、０．０５ｍＭのビオチンを１０μＬ／ｍｉｎの流速で２分間チップに流し、ストレプトアビジンの残りの結合部位を密閉する。単一サイクルの動力学解析方法を使用して、その親和性を測定し、ＴＣＲをＨＥＰＥＳ―ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％Ｐ２０、ｐＨ７．４）でいくつかの異なる濃度に希釈し、３０μＬ／ｍｉｎの流速で、チップ表面を順次に流し、毎回注入の結合時間は、１２０秒であり、最後の注入が完了後、６００秒間解離させる。各ラウンドを測定した後、チップをｐＨ１．７５である１０ｍＭのＧｌｙ―ＨＣｌで再生する。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して動力学パラメーターを計算する。

上記ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体の調製プロセスは、次のとおりである。
ａ．精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するＥ．ｃｏｌｉ菌溶液を１００ｍＬ収集し、８０００ｇで、４℃で１０分間遠心分離した後、１０ｍＬのＰＢＳで菌体を１回洗浄し、その後に５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 試薬ｓ（Ｍｅｒｃｋ）で激しく振とうして菌体を再懸濁し、室温で回転させながら２０分間インキュベートし、その後に６０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、封入体を収集する。

上記封入体を５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに再懸濁し、室温で回転させながら５分間インキュベートし、１０倍希釈した３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加え、均等に混合し、６０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、１０倍希釈した３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加えて封入体を再懸濁し、均等に混合し、６０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離し、２回繰り返し、３０ｍＬの２０ｍＭ トリス―ＨＣｌ ｐＨ８．０を加えて封入体を再懸濁し、均等に混合し、６０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離し、最後に、２０ｍＭのトリス―ＨＣｌ ８Ｍ尿素で封入体を溶解し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで封入体の純度を検出し、ＢＣＡキットで濃度を測定する。

ｂ．再生
合成された短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（北京サイバイシェン遺伝子技術会社）をＤＭＳＯに２０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで溶解する。軽鎖および重鎖の封入体を、８Ｍ尿素、２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１０ｍＭのＤＴＴで溶解し、再生前に、３Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡを加えてさらに変性する。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶペプチドを２５ｍｇ／Ｌ（最終濃度）で再生緩衝液（０．４ＭのＬ―アルギニン、１００ｍＭのトリス ｐＨ８．３、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン、５ｍＭの還元型グルタチオン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、４℃に冷却する）に加え、次に２０ｍｇ／Ｌの軽鎖および９０ｍｇ／Ｌの重鎖（最終濃度、重鎖は８時間／回で３回に分けて加える）を順次に加え、再生は、４℃で少なくとも三日で完了し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで再生が成功したかどうかを検出する。

ｃ．再生後の精製
透析用として１０倍量の２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも２回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、０．４５μＭの醋酸セルロースフィルターメンブレンでタンパク質溶液をろ過し、次にＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー（ＧＥ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ））陰イオン交換カラム上（５ｍＬベッド倍量）にロードする。Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）、２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０で調製した０～４００ｍＭのＮａＣｌ線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、ｐＭＨＣは、約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出され、ピーク成分を収集し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで純度を検出する。

ｄ．ビオチン化
精製したｐＭＨＣ分子をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、同時に緩衝液を２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０に交換し、次にビオチン化試薬０．０５ＭのＢｉｃｉｎｅ ｐＨ８．３、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのMｇＯＡｃ、５０μＭのＤ―ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、１００μｇ／ｍｌのＢｉｒＡ酵素（ＧＳＴ―ＢｉｒＡ）を加え、室温下で混合物を一晩インキュベートし、ＳＤＳ―ＰＡＧＥでビオチン化が完了したかどうかを検出する。

ｅ．ビオチン化後の複合体の精製
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化ｐＭＨＣ分子を１ｍＬに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化ｐＭＨＣを精製し、Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用し、ろ過したＰＢＳを使用してＨｉＰｒｅｐＴＭ１６／６０ Ｓ２００ＨＲカラム（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を事前平衡化し、濃縮した１ｍＬのビオチン化ｐＭＨＣ分子をロードし、次にＰＢＳで１ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出する、ビオチン化ｐＭＨＣ分子は、約５５ｍＬで単一のピークとして溶出される。タンパク質を含む成分を合併し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質の濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を加えて、ビオチン化ｐＭＨＣ分子を分注して、―８０℃で保存する。

実施例４．高親和性一本鎖ＴＣＲの生成
ファージディスプレイ技術は、ＴＣＲ高親和性変異体ライブラリーを生成して、高親和性変異体をスクリーニングする手段である。Ｌｉら（（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（３）：３４９―３５４）によって説明されたＴＣＲファージディスプレイおよびスクリーニング方法を、実施例１における一本鎖ＴＣＲテンプレートに応用する。当該テンプレート鎖のＣＤＲ領域を突然変異させることにより、高親和性ＴＣＲのライブラリーを構築して、パンニングする。数回のパンニング後、ファージライブラリーは、対応する抗原に特異的に結合し、その中から単一のクローニングを選択し、配列分析を実行する。

実施例３のＢＩＡｃｏｒｅ方法を使用して、ＴＣＲ分子とＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との相互作用を分析し、親和性および／または結合半減期が野生型ＴＣＲの少なくとも２倍である高親和性ＴＣＲをスクリーニングし、即ち、スクリーニングされた高親和性ＴＣＲがＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に結合する解離平衡定数Ｋ_Ｄは、野生型ＴＣＲがＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に結合する解離平衡定数Ｋ_Ｄの半分以下であり、結果は、以下の表３に示されたとおりである。上記方法を使用して検出された参照ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との相互作用のＫ_Ｄ値は、３０．１μＭであり、その相互作用の曲線は、図１２に示されたとおりであり、即ち、野生型ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との相互作用のＫ_Ｄ値も、３０．１μＭ、即ち、３．０１Ｅ―０５Ｍである。

具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲ突然変異体のα鎖可変ドメインは、２７Ｓ、２８Ｓ、２９Ｓ、５２Ｎ、５３Ｍ、５４Ｄ、５５Ｍ、９４Ｑ、９５Ａ、９６Ｇ、９７Ｔの一つまたは複数の群の部位のアミノ酸で突然変異が発生し、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲ突然変異体のβ鎖可変ドメインは、４９Ｓ、５０Ｖ、５１Ｇ、５２Ｅ、９４Ｓ、９５Ｓ、９６Ｌ、９７Ｅ、１００Ｙ、１０１Ｅ、１０２Ｑ、１０３Ｙの一つまたは複数の群の部位で突然変異が発生する。

より具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２７Ｋまたは２７Ｐまたは２７Ｒまたは２７Ｔ、２８Ｍまたは２８Ｗ、２９Ａ、５２Ｙ、５３Ｑ、５４Ｓまたは５４Ｔ、５５ＥまたはＴ、９４Ａまたは９４Ｄまたは９４Ｅまたは９４Ｋまたは９４Ｎまたは９４Ｒまたは９４Ｓまたは９４Ｔ、９５Ｓまたは９５Ｖ、９６Ｈまたは９６Ｑまたは９６Ｔおよび９７Ｓからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、４９Ｈ、５０Ｄまたは５０Ｌ、５１Ｅまたは５１Ｗ、５２Ｌまたは５２Ｖ、９４Ａ、９５Ｄ、９６Ｉまたは９６Ｖ、９７Ｑまたは９７Ｔ、１００Ｆ、１０１Ｉまたは１０１Ｐまたは１０１Ｖ、１０２Ｋまたは１０２Ｌまたは１０２Ｍまたは１０２Ｖ、１０３Ａまたは１０３Ｅまたは１０３Ｉまたは１０３Ｌまたは１０３Ｎまたは１０３Ｑまたは１０３Ｒまたは１０３Ｓまたは１０３Ｔまたは１０３Ｖからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含む。

高親和性一本鎖ＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～３２）およびβ鎖可変ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２～５９）の具体的なアミノ酸配列は、それぞれ図５（１）～（２４）および図６（１）～（２７）に示されたとおりである。

実施例５．高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲの生成
実施例４でスクリーニングされた高親和性一本鎖ＴＣＲのＣＤＲ領域の突然変異は、αβヘテロ二量体ＴＣＲの可変ドメインに対応する部位に導入され、ＢＩＡｃｏｒｅを通じて、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との親和性を検出する。上記ＣＤＲ領域における高親和性突然変異点の導入は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発の方法を採用する。上記野生型ＴＣＲのα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図１ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および１ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示されたとおりである。

より安定した可溶性ＴＣＲを得て、ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との間の結合親和性および／または結合半減期をより容易に評価するために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖の定常領域にそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するＴＣＲであり得ることに留意されたく、本実施例でシステイン残基を導入した後、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図８ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）および８ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）に示されたとおりであり、導入されたシステイン残基は、太字で表される。

「分子グローニング－実験マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）で記載された標準方法を通じて、発現されるＴＣＲα鎖およびβ鎖の細胞外配列遺伝子を合成した後、それぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に挿入され、アップストリームおよびダウンストリームのクローニング部位は、それぞれＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである。ＣＤＲ領域の突然変異は、当業者に周知のオーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）によって導入される。挿入フラグメントは、シーケンシングによって確認される。

実施例６．αβヘテロ二量体ＴＣＲの発現、再生および精製
ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現ベクターをそれぞれ化学的形質転換法によって発現細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、細菌をＬＢ培養液で増殖させ、ＯＤ_６００＝０．６である場合、最終濃度０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）を通じてＴＣＲのα鎖およびβ鎖を発現した後に形成された封入体を抽出し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液で複数回繰り返して洗浄し、最後に封入体を６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．１）に溶解させる。

溶解後のＴＣＲα鎖およびβ鎖は、５Ｍの尿素、０．４Ｍのアルギニン、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．１）、３．７ｍＭのシスタミン、６．６ｍＭのβ―ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（４℃）を１：１の質量比ですばやく混合され、最終濃度は、６０ｍｇ／ｍＬである。混合後、溶液を１０倍量の脱イオン水（４℃）に入れて透析し、１２時間後、脱イオン水を緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）に交換して、引き続き４℃で１２時間透析する。透析完了後、溶液を０．４５μＭのフィルターメンブレンでろ過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する。溶出ピークは、再生に成功したαおよびβ二量体のＴＣＲを含み、ＳＤＳ―ＰＡＧＥゲルによって確認される。次に、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／６０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ―１００ ＨＲ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じてＴＣＲをさらに精製する。精製されたＴＣＲの純度は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥによって９０％を超えると測定され、濃度は、ＢＣＡ法によって決定される。

実施例７．ＢＩＡｃｏｒｅ分析結果
実施例３に記載の方法を使用して、高親和性ＣＤＲ領域に導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との親和性を検出する。

高親和性一本鎖ＴＣＲα鎖およびβ鎖からスクリーニングされたＣＤＲ領域を、それぞれ野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびβ鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応する位置に移して、αβヘテロ二量体ＴＣＲを形成する。さらに、スクリーニングによって得られたＣＤＲ領域の突然変異部位を人工的に組み合わせて、αβヘテロ二量体ＴＣＲを形成し、得られた新しいＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図９（１）～（２４）および図１０（１）～（２７）に示されたとおりである。ＴＣＲ分子のＣＤＲ領域が対応するｐＭＨＣ複合体との親和性を决定するため、当業者は、高親和性突然変異点に導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲもＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に対する高親和性を有することを予期することができる。以下の表４に示されるように、実施例５に記載の方法を使用して発現ベクターを構築し、実施例６に記載の方法を使用して上記高親和性突然変異を導入したαβヘテロ二量体ＴＣＲに対して発現、再生および精製し、次にＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を使用してＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体との親和性を測定する。

上記の表４から、ＣＤＲ領域の突然変異点に導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲは、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に対する高親和性を維持していることが分かる。前記ヘテロ二量体ＴＣＲの親和性は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ―Ａ０２０１複合体に対する野生型ＴＣＲの親和性の少なくとも２倍である。

実施例８．抗―ＣＤ３抗体と高親和性一本鎖ＴＣＲとの融合体の発現、再生および精製
本発明の高親和性一本鎖ＴＣＲ分子を抗ＣＤ３抗体の一本鎖分子（ｓｃＦｖ）と融合させて、融合分子を構築する。オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲの方法により、抗―ＣＤ３抗体と高親和性一本鎖ＴＣＲ分子の遺伝子とを結合するプライマーを設計し、中央のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）をＧＧＧＧＳに設計し、また、融合分子の遺伝子フラグメントに制限性エンドヌクレアーゼ部位ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを持たせる。ＰＣＲ増幅生成物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素消化し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用する。

融合タンパク質の発現
標的遺伝子を含む発現プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢプレート（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）にコーティングして、３７℃で一晩培養する。翌日、クローニングを選択して１０ｍＬのＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に接種して、２～３時間培養し、体積比１：１００で１ＬのＬＢ培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に接種し、引き続きＯＤ_６００が０．５～０．８になるまで培養し、次に最終濃度が０．５ｍＭであるＩＰＴＧを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。４時間誘導した後、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を取得する。ＰＢＳ緩衝液で菌体を１回洗浄し、菌体を分注し、２００ｍＬの細菌培養物に相当する菌体を選択して、５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で細菌を熱分解し、６０００ｇで１５分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で４回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えば、ＰＢＳ等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を８Ｍの尿素を含むトリス緩衝溶液に溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、―８０℃冷凍保存する。

融合タンパク質のリフォールディング
―８０℃の超低温冷蔵庫から約１０ｍｇの封入体を取り出して解凍し、最終濃度が１０ｍＭになるまでジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、３７℃で３０分間～１時間インキュベートして、ジスルフィド結合が完全に開くように確保する。次に封入体サンプル溶液をそれぞれ２００ｍＬの４℃予冷リフォールディング緩衝液（１００ｍＭのトリス ｐＨ８．１、４００ｍＭのＬ―アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、５Ｍの尿素、６．５ｍＭのβ―メルカプトエチルアミン、１．８７ｍＭのシスタミン）に滴下し、４℃で約３０分間ゆっくりと攪拌する。再生溶液を８倍量の予冷したＨ_２Ｏで１６～２０時間透析する。再び８倍量の１０ｍＭのトリス ｐＨ８．０で２回透析し、４℃で引き続き約８時間透析し、透析後、サンプルをろ過して、次のように精製する。

融合タンパク質の第１段階の精製
透析されたリフォールディング物（１０ｍＭのトリス ｐＨ８．０）は、ＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０陰イオン交換クロマトグラフィープレパックカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＫＴＡ精製器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で０～６００ｍＭのＮａＣｌで勾配溶出する。クマシーブリリアントブルー染色されたＳＤＳ―ＰＡＧＥで各成分を分析して、合併する。

融合タンパク質の第２段階の精製
この段階の精製のために、第１段階で精製および合併されたサンプル溶液を濃縮し、ＰＢＳ緩衝液で事前に平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ＧＬゲルろ過クロマトグラフィープレパックカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、融合タンパク質を精製し、クマシーブリリアントブルーで染色されたＳＤＳ―ＰＡＧＥでピークの成分を分析して、合併する。

実施例９．抗―ＣＤ３抗体と高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲとの融合体の発現、再生および精製
抗―ＣＤ３の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をαβヘテロ二量体ＴＣＲと融合させて、融合分子を調製する。抗―ＣＤ３のｓｃＦｖは、ＴＣＲβ鎖と融合し、当該ＴＣＲβ鎖は、上記高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのいずれかを含むことができ。融合分子のＴＣＲα鎖は、上記高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのいずれかを含むことができる。

融合分子発現ベクターの構築
１．α鎖発現ベクターの構築
αβヘテロ二量体ＴＣＲα鎖を持つ標的遺伝子をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素消化し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）に形質転換して、発現に使用する。

２．抗―ＣＤ３（ｓｃＦｖ）―β鎖発現ベクターの構築
オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲの方法により、プライマーを設計して、抗―ＣＤ３ ｓｃＦｖと高親和性ヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖遺伝子とを結合し、中央のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）は、ＧＧＧＧＳであり、また、抗―ＣＤ３のｓｃＦｖと高親和性ヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖との融合タンパク質の遺伝子フラグメントは、制限性エンドヌクレアーゼ部位ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）およびＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を備える。ＰＣＲ増幅生成物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素消化し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用される。

融合タンパク質の発現、再生および精製
発現プラスミドをそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ＬＢプレート（カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）にコーティングして、３７℃で一晩培養する。翌日、クローニングを選択して１０ｍＬのＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）に接種して、２～３時間培養し、体積比１：１００で１ＬのＬＢ培地に接種し、引き続きＯＤ_６００が０．５～０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍＭであるＩＰＴＧを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。４時間誘導した後、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を取得する。ＰＢＳ緩衝液で菌体を１回洗浄し、菌体を分注し、２００ｍＬの細菌培養物に相当する菌体を選択して、５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細菌を熱分解し、６０００ｇで１５分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で４回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えば、ＰＢＳ等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．１を含む緩衝溶液で溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、―８０℃で冷凍保存する。

溶解後のＴＣＲα鎖および抗―ＣＤ３（ｓｃＦｖ）―β鎖は、２：５の質量比で５Ｍの尿素（ｕｒｅａ）、０．４ＭのＬ―アルギニン（Ｌ―ａｒｇｉｎｉｎｅ）、２０ｍＭのトリス ｐＨ８．１、３．７ｍＭのシスタミン、６．６ｍＭのβ―ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（４℃）にすばやく混合し、α鎖および抗―ＣＤ３（ｓｃＦｖ）―β鎖の最終濃度は、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．２５ｍｇ／ｍＬである。

混合後、溶液を１０倍量の脱イオン水（４℃）に入れて透析し、１２時間後、脱イオン水を緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）に交換して、引き続き４℃で１２時間透析する。透析完了後の溶液は、０．４５μＭのフィルターメンブレンでろ過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍｌ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する。溶出ピークは、再生に成功したＴＣＲα鎖および抗―ＣＤ３（ｓｃＦｖ）―β鎖二量体のＴＣＲが含まれることをＳＤＳ―ＰＡＧＥゲルを通じて確認される。次に、ＴＣＲ融合分子を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ―１００ １６／６０、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じてさらに精製し、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍｌ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じて再び生成する。精製後のＴＣＲ融合分子の純度は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥによって９０％を超えることを測定され、濃度は、ＢＣＡ法によって測定される。

実施例１０．本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞の活性化機能実験（標的細胞は腫瘍細胞株である）
本実施例は、本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性効果を有することを検証する。ＥＬＩＳＰＯＴ実験によって、細胞における本発明の高親和性ＴＣＲの機能および特異性を検出する。

当業者は、細胞機能を検出するためにＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用する方法に精通している。本発明のＴＣＲでトランスフェクトされた健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、エフェクター細胞としてランダムに選択される。前記ＴＣＲおよびその番号は、表４から知り、それぞれＴＣＲ４（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）、ＴＣＲ２５（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）、ＴＣＲ５（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）、ＴＣＲ６（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）、ＴＣＲ７（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、ＴＣＲ１０（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）およびＴＣＲ１（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型ＴＣＲ（野生型ＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）およびＡ６（他のＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）としてラベル付けされる。標的細胞株は、Ａ３７５、Ｋ５６２―Ａ２（Ａ２過剰発現）、ＳＷ６２０―ＳＳＸ２（ＳＳＸ２過剰発現）、ＮＣＩ―Ｈ１２９９―ＳＳＸ２（ＳＳＸ２過剰発現）、Ｋ５６２―Ａ１１（Ａ１１過剰発現）およびＳＷ６２０細胞である。ここで、標的細胞株Ａ３７５、Ｋ５６２―Ａ２およびＳＷ６２０―ＳＳＸ２は、陽性腫瘍細胞株として使用され、ＮＣＩ―Ｈ１２９９―ＳＳＸ２、Ｋ５６２―Ａ１１およびＳＷ６２０は、陰性腫瘍細胞株であり、対照として使用される。

まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールで活性化して、４℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で２時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、次のような試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加える。標的細胞は、２×１０^４細胞／ウェルであり、エフェクター細胞は、１０^３細胞／ウェル（トランスフェクトされた陽性率に従って計算する）であり、二つのデュープリケートウェルを設置する。一晩インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ_２）。実験の２日に目に、プレートを洗浄し、かつ2次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ ＲＥＡＤＥＲ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０会社）でメンブレンに形成されたスポットをカウントする。

実験結果は、図１４に示されたとおりであり、陽性標的細胞株の場合、本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞は、非常に良好な特異的活性化効果を有し、その機能は、野生型ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞の機能よりもはるかに優れ、他のＴＣＲで形質導入された細胞は、ほとんど活性化を示さない。

実施例１１．本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞の活性化機能実験（標的細胞はＴ２ロード関連短いペプチドである）
本実施例は、本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞が人工的に調製された標的細胞に対して非常に良好な特異的活性化効果を有することを別の態様で検証する。当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用して細胞の活性化機能を検出する方法に精通している。本発明のＴＣＲでトランスフェクトされた健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター細胞としてランダムに選択される。前記ＴＣＲおよびその番号は、表４から知り、それぞれＴＣＲ７（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、ＴＣＲ８（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）、ＴＣＲ２６（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）、ＴＣＲ９（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）およびＴＣＲ１０（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型ＴＣＲ（野生型ＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）およびＡ６（他のＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）としてラベル付けされる。本実施例の標的細胞は、特異的短いペプチドがロードされたＴ２細胞である。

まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールで活性化して、４℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で２時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、次のような試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加える。短いペプチド（ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートの最終濃度１×１０^―１３ｇ／ｍｌ～１×１０^―８ｇ／ｍｌの合計六つの勾配）、標的細胞は、２×１０^４細胞／ウェルであり、エフェクター細胞は、１０^３細胞／ウェル（トランスフェクトされた陽性率に従って計算する）であり、二つのデュープリケートウェルを設置する。一晩インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ_２）。実験の２日目に、プレートを洗浄し、かつ２次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ ＲＥＡＤＥＲ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０会社）でメンブレンに形成されたスポットをカウントする。

実験結果は、図１５（ａ）～図１５（ｅ）に示されたとおりであり、本発明のＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞は、特異的短いペプチドがロードされた標的細胞に対して非常に強い活性化効果を有し、機能は、野生型ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞の機能よりも有意に優れるが、他のＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞は、標的細胞に対して活性化効果を有さない。

実施例１２．本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞的ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷機能実験
本実施例は、本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞が標的細胞に対して良好な特異的殺傷効果を有することを検証する。

当業者は、細胞のリアルタイム増殖状態を記録するための非侵襲的方法である、細胞機能を検出するためにＩｎｃｕＣｙｔｅ実験を使用する方法に精通している。本発明のＴＣＲでトランスフェクトされたオーストラリアの胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１００９９―１４１）から単離されたＰＢＬ細胞をエフェクター細胞としてランダムに選択する。前記ＴＣＲおよびその番号は、表４から知り、それぞれＴＣＲ２（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）およびＴＣＲ１（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型ＴＣＲ（野生型ＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）およびＡ６（他のＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）としてラベル付けされる。標的細胞株は、Ａ３７５、ＳＷ６２０およびＨＣＣＣ９８１０細胞である。ここで、標的細胞株Ａ３７５は、陽性腫瘍細胞株であり、ＳＷ６２０およびＨＣＣＣ９８１０は、陰性腫瘍細胞株であり、対照として使用される。

標的細胞を紹介して遠心分離し、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳの完全培地に再懸濁し、１×１０^４細胞／ウェルでカウントされ、標的細胞を９６ウェルプレートに均一に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに戻し、一晩インキュベートし、翌日、９６ウェルプレートの培地を捨て、フェノールレッドを含まずに染料カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）３／７試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）を含むＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地に交換して、染料の濃度が２滴／ｍｌになるようにする。エフェクター細胞を準備し、遠心分離し、古い培地を捨て、フェノールレッドを含まない新しいＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地に交換し、エフェクター細胞（１×１０^４細胞／ウェル、トランスフェクトされた陽性率に従って計算する）および標的細胞がプレーティングされた実験群を共培養し、標的細胞のみを有する対照群には、各ウェルに同量の完全培地を補充し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ検出専用のリアルタイムダイナミック生細胞イメージング分析器―ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺｏｏＭにプレートを置き、３０分間インキュベートした後、リアルタイムで観察および写真を撮り、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺｏｏＭ ２０１６Ａを使用して、テスト結果を処理し、データを分析して導出する。

図１６ａ～図１６ｃの検出結果に示されるように、本発明のＴＣＲで形質導入された細胞は、陽性標的に対して非常に強い殺傷効果を有し、機能は、野生型ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞の機能よりも有意に優れ、陰性標的細胞に対して、基本的に殺傷効果を有さず、他のＴＣＲで形質導入された細胞は、陽性標的細胞に対して基本的に殺傷効果を有さない。

実施例１３．本発明の高親和性ＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞のＬＤＨ殺傷機能の実験
本実施例は、非放射性細胞毒性実験を使用して、ＬＤＨの放出を測定することにより、本発明のＴＣＲで形質導入された細胞の殺傷機能を検証する。当該試験は、５１Ｃｒ放出細胞毒性試験の比色代替試験であり、細胞熱分解後に放出した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量測定する。３０分間のカップリング酵素反応を使用して、培地に放出されたＬＤＨを検出し、酵素反応において、ＬＤＨは、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を赤色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に形質転換することができる。生成された赤色の生成物の量は、熱分解された細胞の数に比例する。標準の９６ウェルプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍでの可視光吸光値データを収集することができる。

当業者は、ＬＤＨ放出実験を使用して細胞機能を検出するための方法に精通している。本発明のＴＣＲでトランスフェクトされた健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、エフェクター細胞としてランダムに選択される。前記ＴＣＲおよびその番号は、表４から知り、それぞれＴＣＲ２（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）およびＴＣＲ１（α鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、β鎖可変ドメインのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型ＴＣＲ（野生型ＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）およびＡ６（他のＴＣＲでトランスフェクトされた細胞）としてラベル付けされる。標的細胞株ＨＬＦ―Ａ２（Ａ２過剰発現）、ＨＵＨ―１―Ａ２（Ａ２過剰発現）、ＨＴ１０８０―Ａ２（Ａ２過剰発現）、ＩＭ９およびＨＣＣＣ９８１０細胞。ここで、ＨＬＦ―Ａ２、ＨＵＨ―１―Ａ２およびＨＴ１０８０―Ａ２は、陽性腫瘍細胞株であり、ＩＭ９およびＨＣＣＣ９８１０は、陰性腫瘍細胞株であり、対照として使用される。

まず、ＬＤＨプレートを準備する。実験の初日に、試験の各成分を次のような順序でプレートに加える。標的細胞株３×１０^４個細胞／ウェル、エフェクター細胞３×１０^４個細胞／ウェル（トランスフェクトされた陽性率に従って計算する）、三つのデュープリケートウェルを設置する。エフェクター細胞の自発的ウェル、標的細胞の自発的ウェル、標的細胞の最大ウェル、倍量補正対照ウェルおよび培地バックグラウンド対照ウェルを同時に設置する。一晩インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ_２）。実験の２日目に、発色を検出し、反応終了後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｃｋ）を用いて４９０ｎｍでの吸光値を記録する。

実験結果は、図１７に示されたとおりであり、本発明のＴＣＲで形質導入された細胞は、陽性標的細胞に対して非常に強い殺傷効果を有し、殺傷効果は、野生型ＴＣＲで形質導入された細胞よりもはるかに高いが、他のＴＣＲで形質導入された細胞は、陽性標的細胞に対して基本的に殺傷効果を有さない。

実施例１４．本発明の高親和性ＴＣＲと抗―ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能実験
本実施例は、本発明の高親和性ＴＣＲト抗―ＣＤ３抗体との融合タンパク質がエフェクター細胞をリダイレクトすることができ、良好な活性化効果を有することを検証する。

当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用して細胞機能を検出するための方法を精通している。本実施例のＩＦＮ―γ ＥＬＩＳＰＯＴ実験で使用されるエフェクター細胞は、健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であり、標的細胞株は、Ｔ２、Ａ３７５、Ｕ２５１、ＳＷ６２０―ＳＳＸ２（ＳＳＸ２過剰発現）、ＳＷ６２０およびＫ５６２―Ａ１１（Ａ１１過剰発現）細胞であり、ここで、Ａ３７５、Ｕ２５１およびＳＷ６２０―ＳＳＸ２は、関連する抗原を発現し、Ｔ２、ＳＷ６２０およびＫ５６２―Ａ１１は、関連する抗原を発現しない。本発明の高親和性ＴＣＲをランダムに選択し、実施例８に記載のように融合タンパク質を調製し、それぞれ融合タンパク質１（α鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、β鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、融合タンパク質２（α鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、β鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、融合タンパク質３（α鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、β鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）および融合タンパク質４（α鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、β鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）と名付けられる。

まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールで活性化して、４℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で２時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、次のような試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加える。融合タンパク質（ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートの最終濃度１×１０^―１３ｇ／ｍｌ～１×１０^―８ｇ／ｍｌの合計六つの勾配）、標的細胞株（２×１０^４細胞／ウェル）、エフェクター細胞（４×１０^３エフェクター細胞／ウェル）を対応するウェルに加え、二つのデュープリケートウェルを設置する。一晩インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ_２）。実験の２日目に、プレートを洗浄し、かつ２次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ ＲＥＡＤＥＲ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０会社）を使用して、メンブレン上に形成されたスポットをカウントする。

実験結果は、図１８ａ～１８ｄに示されたとおりであり、本発明の高親和性ＴＣＲと抗―ＣＤ３抗体との融合タンパク質は、Ｔ２をロードした特異的短いペプチドを十分に識別および結合し、エフェクター細胞をリダイレクトすることができ、非常に良好な活性化効果を有し、Ｔ２に対して、ローディングは非特異的であるか、またはロードしない場合は、基本的に反応しない。

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (32)

1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
   前記ＴＣＲは、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合する活性を有し、また、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記Ｔ細胞受容体。
2. ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍であることを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
3. 前記ＴＣＲは、可溶性であることを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
4. 前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖定常領域配列ＴＲＡＣ＊０１およびβ鎖定常領域配列ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を有することを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
5. 前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αの三つのＣＤＲ領域を含み、ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は、ＤＳＳＳＴＹであり、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＩＦＳＮＭＤＭであり、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は、ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩであることを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
6. 前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βの三つのＣＤＲ領域を含み、ここで、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は、ＭＮＨＥＹであり、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は、ＳＶＧＥＧＴであることを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
7. 前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βの三つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ３βの参照アミノ酸配列は、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹであり、前記ＴＣＲは、ＣＤＲ３βにおいて少なくとも一つの突然変異を含み、好ましくは、突然変異の数は、四つであることを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
8. 前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であることを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
9. 前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする
   請求項１に記載のＴＣＲ。
10. 前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αの三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、
    ＣＤＲ１α：ＤＳＳＳＴＹ、
    ＣＤＲ２α：ＩＦＳＮＭＤＭ、
    ＣＤＲ３α：ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩであり、
    少なくとも一つの次のような突然変異を含むことを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
    

    
11. 前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βの三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、
    ＣＤＲ１β：ＭＮＨＥＹ、
    ＣＤＲ２β：ＳＶＧＥＧＴ、
    ＣＤＲ３β：ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹであり、
    少なくとも一つの次のような突然変異を含むことを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
    

    
12. 前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αの三つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は、ＤＳＳＳＴＹ、ＤＰＷＡＴＹ、ＤＲＭＳＴＹ、ＤＴＭＳＴＹおよびＤＫＭＳＴＹからなる群から選択され、および／またはＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＩＦＳＮＭＤＭ、ＩＦＳＹＱＳＴ、ＩＦＳＹＭＴＥおよびＩＦＳＹＱＳＥからなる群から選択され、および／またはＣＤＲ３αのアミノ酸配列は、ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ、ＡＥＰＮＮＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＡＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＫＳＨＳＡＬＩ、ＡＥＰＮＳＳＨＳＡＬＩおよびＡＥＰＮＱＳＨＳＡＬＩからなる群から選択されることを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
13. 前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βの三つのＣＤＲ領域を含み、ここで、前記ＴＣＲのＣＤＲ３βは、ＡＳＳＳＬＥＤＰＦＶＫＲ、ＡＳＡＤＶＱＤＰＹＥＱＹおよびＡＳＡＤＩＱＤＰＹＥＱＹからなる群から選択されることを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
14. 前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βの三つのＣＤＲ領域を含み、ここで、前記ＴＣＲのＣＤＲ２βは、ＳＶＧＥＧＴ、ＳＬＥＶＧＴ、ＨＤＷＬＧＴおよびＳＤＷＬＧＴからなる群から選択されることを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
15. 前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αの三つのＣＤＲを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βの三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインは、以下からなる群から選択されるＣＤＲを有することを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
    

    

    
16. 前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含むことを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
17. 前記ＴＣＲのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれ、好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
    ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
    ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
    ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
    ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
    ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
    ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
    ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、
    およびＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換することを特徴とする
    請求項１６に記載のＴＣＲ。
18. 前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および６４～８７から選択され、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８～１１４から選択されることを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
19. 前記ＴＣＲは、以下の群から選択されることを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
    

    

    
20. 前記ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲであることを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
21. 前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインからなる一本鎖ＴＣＲであり、前記α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列（ｌｉｎｋｅｒ）によってリンクされることを特徴とする
    請求項１に記載のＴＣＲ。
22. 上記の請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲであって、
    前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ―末端またはＮ―末端には、コンジュゲートが結合され、好ましくは、前記コンジュゲートは、検出可能なマーカーであり、より好ましくは、前記コンジュゲートは、抗―ＣＤ３抗体であることを特徴とする、前記上記の請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
23. 多価ＴＣＲ複合体であって、
    前記ＴＣＲ複合体は、少なくとも二つのＴＣＲ分子を含み、そのうちの少なくとも一つのＴＣＲ分子は、前記請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲであることを特徴とする、前記多価ＴＣＲ複合体。
24. 核酸分子であって、
    前記核酸分子は、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする、前記核酸分子。
25. ベクターであって、
    前記ベクターは、請求項２４に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、前記ベクター。
26. 宿主細胞であって、
    前記宿主細胞は、請求項２７に記載のベクターを含むか、または染色体には外因性の請求項２４に記載の核酸分子が組み込まれることを特徴とする、前記宿主細胞。
27. 単離された細胞であって、
    前記細胞は、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴＣＲを発現することを特徴とする、前記単離された細胞。
28. 医薬組成物であって、
    前記組成物は、薬学的に許容される担体および請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴＣＲ、または請求項２３に記載のＴＣＲ複合体、または請求項２７に記載の細胞を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
29. 疾患を治療する方法であって、
    請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴＣＲ、または請求項２３に記載のＴＣＲ複合体、または請求項２７に記載の細胞、または請求項２８に記載の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与する段階を含むことを特徴とする、前記疾患を治療する方法。
30. 請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、請求項２３に記載のＴＣＲ複合体または請求項２７に記載の細胞の使用であって、
    腫瘍を治療するための薬物の調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
31. 腫瘍を治療するための薬物として使用される、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、請求項２３に記載のＴＣＲ複合体または請求項２７に記載の細胞。
32. 請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を調製する方法であって、
    （ｉ）請求項２６に記載の宿主細胞を培養することにより、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を発現する段階、および
    （ｉｉ）前記Ｔ細胞受容体を単離または精製する段階を含むことを特徴とする、前記請求項１～２２のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を調製する方法。
    

Images