JP2022546386A - Ssx2抗原を識別する高親和性tcr - Google Patents
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Abstract
本発明は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合する特性を有する、T細胞受容体(TCR)を提供し、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの結合親和性は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する野生型TCRの結合親和性よりも少なくとも2倍である。前記TCRは、KASEKIFYV―HLA A0201複合体を提示する腫瘍細胞を標的とするように、単独で使用することができ、治療剤と組み合わせて使用することができる。
Description
本発明は、生物技術分野に関し、より具体的には、SSX2タンパク質に由来するポリペプチドを識別することができるT細胞受容体(T cell receptor、TCR)に関する。本発明は、前記受容体の調製および使用にさらに関する。
特異的方法で抗原を識別することができるのは、2種類の分子だけである。ここで、一つは、免疫グロブリンまたは抗体であり、もう一つは、T細胞受容体(TCR)であり、それは、α鎖/β鎖またはγ鎖/δ鎖がヘテロ二量体の形態で存在する細胞膜表面の糖タンパク質である。免疫系のTCRレパートリーの成分は、V(D)J組換えし、次に陽性および陰性選択することによって胸腺で生成されるものである。末梢環境において、TCRは、主要組織適合性遺伝子複合体―ペプチド複合体(pMHC)に対するT細胞の特異的識別を媒介するため、免疫系の細胞免疫機能にとって非常に常用である。
TCRは、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)に提示される特異的抗原ペプチドの唯一の受容体であり、このような外因性ペプチドまたは内因性ペプチドは、異常細胞の唯一の兆候である可能性がある。免疫系において、抗原特異的TCRとpMHC複合体との結合によって、T細胞と抗原提示細胞(APC)との直接的な物理的接触を引き起こし、次に、T細胞およびAPCの両方の他の細胞膜表面分子が相互作用し、これにより、一連の後続の細胞シグナル伝達および他の生理学的応答が引き起こされ、従って異なる抗原特異性を有するT細胞が標的細胞に免疫効果を発揮することができるようになる。
TCRに対応するMHCI種類およびII種類の分子リガンドも、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であるが、抗原提示に特異性を有し、異なる個体は、異なるMHCを有することにより、それぞれのAPC細胞表面にタンパク質抗原の異なる短いペプチドを提示することができる。ヒトMHCは、通常、HLA遺伝子またはHLA複合体と呼ばれる。
SSX2は、HOM―MEL―40とも呼ばれる滑膜肉腫Xブレークポイントである。SSX2は、SSXファミリーの10種類の同一性の高い核酸タンパク質の一つである。SSXタンパク質は、腫瘍精巣抗原であり、腫瘍細胞およびMHC発現なしの的精巣芽細胞でのみ発現される。SSX2は、肝臓がん、肺がん、線維肉腫、乳がん、結腸がん、前立腺がんを含むがこれらに限定されない、様々なヒト癌細胞で発現される。SSX2は、細細胞内で精製された後に小分子ポリペプチドに分解され、MHC(主要組織適合性遺伝子複合体)分子と結合して複合体を形成し、細胞表面に提示される。KASEKIFYVは、SSX2抗原に由来する短いペプチドであり、SSX2関連疾患の治療の標的である。
従って、KASEKIFYV―HLA A0201複合体は、TCRが腫瘍細胞を標的とすることができるマーカーを提供する。KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合できるTCRは、腫瘍の治療に対して高い応用価値を有する。例えば、当該腫瘍細胞マーカーを標的とすることができるTCRは、細胞毒性剤または免疫刺激剤を標的細胞に送達するために、またはT細胞に形質転換するために使用されることができ、養子免疫療法として知られている治療過程で患者に投与するために、当該TCR発現するT細胞が腫瘍細胞を破壊できるようにする。前者の目的については、理想的なTCRは、より高い親和性を有することにより、当該TCRが標的細胞に長期間存在することができる。後者の目的については、中程度の親和性のTCRを使用することが好ましい。従って、当業者は、様々な目的のために腫瘍マーカーを標的するために使用されることができるTCRの開発に専念している。
本発明の目的は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対してより高い親和性を有するTCRを提供することである。
本発明の別の目的は、上記種類のTCRの調製方法および上記種類のTCRの使用を提供することである。
本発明の別の目的は、上記種類のTCRの調製方法および上記種類のTCRの使用を提供することである。
本発明の第1の態様は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合する活性を有する、T細胞受容体(TCR)を提供する。
別の好ましい例において、前記T細胞受容体(TCR)は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合する活性を有し、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、三つのCDR領域を含み、前記TCRα鎖可変ドメインの三つのCDR領域の参照配列は、
CDR1α:DSSSTY、
CDR2α:IFSNMDM、
CDR3α:AEPNQAGTALIであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、
別の好ましい例において、前記T細胞受容体(TCR)は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合する活性を有し、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、三つのCDR領域を含み、前記TCRα鎖可変ドメインの三つのCDR領域の参照配列は、
CDR1α:DSSSTY、
CDR2α:IFSNMDM、
CDR3α:AEPNQAGTALIであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、
および/または、前記TCRβ鎖可変ドメインは、三つのCDR領域を含み、前記TCRβ鎖可変ドメインの三つのCDR領域の参照配列は、
CDR1β:MNHEY、
CDR2β:SVGEGT、
CDR3β:ASSSLEDPYEQYであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。
CDR1β:MNHEY、
CDR2β:SVGEGT、
CDR3β:ASSSLEDPYEQYであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも2倍である。
本発明の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも2倍、好ましくは、少なくとも5倍、より好ましくは、少なくとも10倍である。
本発明の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも2倍、好ましくは、少なくとも5倍、より好ましくは、少なくとも10倍である。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも50倍、好ましくは、少なくとも100倍、より好ましくは、少なくとも1000倍である。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも104倍、好ましくは、少なくとも105倍、より好ましくは、少なくとも5×105倍である。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも104倍、好ましくは、少なくとも105倍、より好ましくは、少なくとも5×105倍である。
具体的には、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの解離平衡定数は、KD≦20μMである。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの解離平衡定数は、5μM≦KD≦10μM、好ましくは、0.1μM≦KD≦1μM、より好ましくは、1nM≦KD≦100nM、より好ましくは、10pM≦KD≦100pMである。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの解離平衡定数は、5μM≦KD≦10μM、好ましくは、0.1μM≦KD≦1μM、より好ましくは、1nM≦KD≦100nM、より好ましくは、10pM≦KD≦100pMである。
別の好ましい例において、前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは、少なくとも92%、より好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは、少なくとも92%、より好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖および/またはβ鎖の可変ドメインの一つまたは複数のCDR領域で発生される。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインの三つのCDR領域における突然変異の数は、1~11個であり、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインの三つのCDR領域における突然変異の数は、1~8個である。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインの三つのCDR領域における突然変異の数は、1~11個であり、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインの三つのCDR領域における突然変異の数は、1~8個である。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖のCDR領域における突然変異の数は、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個または11個であり得る。
別の好ましい例において、前記TCRβ鎖のCDR領域における突然変異の数は、1個、2個、三つの、4個、5個、6個、7個または8個であり得る。
別の好ましい例において、前記TCRβ鎖のCDR領域における突然変異の数は、1個、2個、三つの、4個、5個、6個、7個または8個であり得る。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、CDR1βのアミノ酸配列は、MNHEYである。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、前記CDR3βのアミノ酸配列は、AS[3βX1][3βX2][3βX3][3βX4]DP[3βX5][3βX6][3βX7][3βX8]であり、ここで、[3βX1]は、AまたはSであり、および/または[3βX2]は、SまたはDであり、および/または[3βX3]は、LまたはIまたはVであり、および/または[3βX4]は、EまたはQまたはTであり、および/または[3βX5]は、YまたはFであり、および/または[3βX6]は、EまたはIまたはPまたはVであり、および/または[3βX7]は、QまたはKまたはLまたはMまたはVであり、および/または[3βX8]は、YまたはAまたはEまたはIまたはLまたはNまたはQまたはRまたはSまたはTまたはVである。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、CDR3βは、ASSSLEDPFVKR、ASADVQDPYEQY、ASSSLEDPYEQY、ASADIQDPYEQY、ASSSLEDPYVMT、ASSSLEDPYIKY、ASSSLEDPYIVT、ASSSLEDPYVKI、ASSSLEDPYIKT、ASSSLEDPYILN、ASSSLEDPYILT、ASSDVTDPYEQY、ASSSLEDPYIMA、ASSSLEDPYVLE、ASSSLEDPYPML、ASSSLEDPYVVS、ASSSLEDPYVMVおよびASSSVEDPYEQYからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、CDR2βのアミノ酸配列は、SVGEGT、SLEVGT、HDWLGTおよびSDWLGTから選択される。好ましくは、前記CDR2βのアミノ酸配列は、SVGEGTである。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、CDR1αのアミノ酸配列は、DSSSTY、DPWATY、DRMSTY、DTMSTYおよびDKMSTYからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、CDR2αのアミノ酸配列は、IFSNMDM、IFSYQST、IFSYMTEおよびIFSYQSEからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、CDR3αのアミノ酸配列は、AEPNQAGTALI、AEPNNSHSALI、AEPNASHSALI、AEPNKSHSALI、AEPNSSHSALIおよびEPNQSHSALIからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、ここで、CDR1αのアミノ酸配列は、DSSSTYであり、CDR2αのアミノ酸配列は、IFSNMDMであり、CDR3αのアミノ酸配列は、AEPNQAGTALIである。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1である。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1である。
別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖および/またはβ鎖の可変ドメインの一つまたは複数のCDR領域で発生される。
別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖のCDR1および/またはCDR2および/またはCDR3で発生され、および/または前記突然変異は、β鎖のCDR2および/またはCDR3で発生される。
別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖のCDR1および/またはCDR2および/またはCDR3で発生され、および/または前記突然変異は、β鎖のCDR2および/またはCDR3で発生される。
本発明の好ましい実施形態において、前記T細胞受容体(TCR)は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合する活性を有し、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRは、SEQ ID NO:1に示されるα鎖可変ドメインにおいて突然変異が発生され、前記突然変異アミノ酸残基の部位は、27S、28S、29S、52N、53M、54D、55M、94Q、95A、96G、97Tのうちの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:1に示されるβ鎖可変ドメイン番号を採用し、および/または前記TCRは、SEQ ID NO:2に示されるβ鎖可変ドメインにおいて突然変異が発生され、前記突然変異アミノ酸残基の部位は、49S、50V、51G、52E、94S、95S、96L、97E、100Y、101E、102Q、103Yのうちの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:2に示される番号を採用する。
好ましくは、突然変異した後の前記TCRα鎖可変ドメインは、27Kまたは27Pまたは27Rまたは27T、28Mまたは28W、29A、52Y、53Q、54Sまたは54T、55EまたはT、94Aまたは94Dまたは94Eまたは94Kまたは94Nまたは94Rまたは94Sまたは94T、95Sまたは95V、96Hまたは96Qまたは96Tおよび97Sからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:1に示される番号を採用し、および/または突然変異した後の前記TCRβ鎖可変ドメインは、49H、50Dまたは50L、51Eまたは51W、52Lまたは52V、94A、95D、96Iまたは96V、97Qまたは97T、100F、101Iまたは101Pまたは101V、102Kまたは102Lまたは102Mまたは102Vおよび103Aまたは103Eまたは103Iまたは103Lまたは103Nまたは103Qまたは103Rまたは103Sまたは103Tまたは103Vからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:2に示される番号を採用する。
別の好ましい例において、前記TCRは、可溶性である。
別の好ましい例において、前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRまたは一本鎖TCRである。
別の好ましい例において、本発明の前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、好ましくは、前記TCRは、α鎖定常領域配列TRAC*01およびβ鎖定常領域配列TRBC1*01またはTRBC2*01を有する。
別の好ましい例において、前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRまたは一本鎖TCRである。
別の好ましい例において、本発明の前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、好ましくは、前記TCRは、α鎖定常領域配列TRAC*01およびβ鎖定常領域配列TRBC1*01またはTRBC2*01を有する。
別の好ましい例において、前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは、少なくとも92%、より好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは、少なくとも92%、より好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記TCRは、(i)その膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含み、ここで、(i)および(ii)は、両方ともTCR鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含む。
別の好ましい例において、前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、前記TCRのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、前記TCRのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記TCRのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAVの46番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目位置のアミノ酸、
TRAVの47番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目位置のアミノ酸、
TRAVの46番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目位置のアミノ酸、
またはTRAVの47番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目位置のアミノ酸からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換する。
TRAVの46番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目位置のアミノ酸、
TRAVの47番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目位置のアミノ酸、
TRAVの46番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目位置のアミノ酸、
またはTRAVの47番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目位置のアミノ酸からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換する。
別の好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれるTCRは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインならびに膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、それはα鎖定常ドメインを含まず、前記TCRα鎖可変ドメインは、β鎖とヘテロ二量体を形成する。
別の好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれるTCRは、(i)その膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含み、ここで、(i)および(ii)は、両方ともTCR鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含む。
別の好ましい例において、前記TCRは、(i)その膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含む、αβヘテロ二量体TCRであり、ここで、(i)および(ii)は、両方ともTCR鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記TCRのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記TCRのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1のThr48およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer57、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer77、
TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer17、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAsp59、
TRAC*01エクソン1のSer15およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu15、
TRAC*01エクソン1のArg53およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer54、
TRAC*01エクソン1のPro89およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAla19、
およびTRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu20からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換する。
TRAC*01エクソン1のThr48およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer57、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer77、
TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer17、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAsp59、
TRAC*01エクソン1のSer15およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu15、
TRAC*01エクソン1のArg53およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer54、
TRAC*01エクソン1のPro89およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAla19、
およびTRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu20からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換する。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:64~87から選択され、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:88~114から選択される。
別の好ましい例において、前記TCRは、一本鎖TCRである。
別の好ましい例において、前記TCRは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインからなる一本鎖TCRであり、前記α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列(linker)によってリンクされる。
別の好ましい例において、前記TCRは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインからなる一本鎖TCRであり、前記α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列(linker)によってリンクされる。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインおよび/またはβ鎖可変ドメインの疎水性コアに突然変異が発生される。
別の好ましい例において、前記疎水性コアに突然変異が発生されるTCRは、α可変ドメインおよびβ可変ドメインで構成される一本鎖TCRであり、前記α可変ドメインおよびβ可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列(linker)によってリンクされる。
別の好ましい例において、前記疎水性コアに突然変異が発生されるTCRは、α可変ドメインおよびβ可変ドメインで構成される一本鎖TCRであり、前記α可変ドメインおよびβ可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列(linker)によってリンクされる。
別の好ましい例において、本発明の前記TCRは、一本鎖TCRであり、前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも92%、最も好ましくは、少なくとも94%(例えば、可以是少なくとも88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的配列相同性)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも92%、最も好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:9~32から選択され、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:33~59から選択される。
別の好ましい例において、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC―末端またはN―末端には、コンジュゲートが結合される。
別の好ましい例において、前記TCRに結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせである。
別の好ましい例において、前記TCRに結合する治療剤は、前記TCRのα鎖またはβ鎖のC―末端またはN―末端にリンクされる抗―CD3抗体である。
別の好ましい例において、前記TCRに結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせである。
別の好ましい例において、前記TCRに結合する治療剤は、前記TCRのα鎖またはβ鎖のC―末端またはN―末端にリンクされる抗―CD3抗体である。
本発明の第2の態様は、少なくとも二つのTCR分子を含む、多価TCR複合体を提供し、そのうちの少なくとも一つのTCR分子は、本発明の第1の態様に記載のTCRである。
本発明の第3の態様は、核酸分子を提供し、前記核酸分子は、本発明の第1の態様に記載のTCR分子または本発明の第2の態様に記載の多価TCR複合体をコードする核酸配列またはその相補配列を含む。
本発明の第4の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第3の態様に記載の核酸分子を含む。
本発明の第5の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞には、本発明の第4の態様に記載のベクターが含まれるか、または染色体には、外因性本発明の第3の態様に記載の核酸分子が組み込まれる。
本発明の第6の態様は、単離された細胞を提供し、前記細胞は、本発明の第1の態様に記載のTCRを発現する。
本発明の第7の態様は、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容される担体および本発明の第1の態様に記載のTCR、または本発明の第2の態様に記載のTCR複合体、または本発明の第6の態様に記載の細胞を含む。
本発明の第8の態様は、適切な量の本発明の第1の態様に記載のTCR、または本発明の第2の態様に記載のTCR複合体、または本発明の第6の態様に記載の細胞、または本発明の第7の態様に記載の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与する段階を含む、疾患を治療する方法を提供する。
本発明の第9の態様は、腫瘍を治療するための薬物の調製に使用される、本発明の第1の態様に記載のTCR、または本発明の第2の態様に記載のTCR複合体、または本発明の第6の態様に記載の細胞の使用を提供し、好ましくは、前記腫瘍は、SSX2陽性腫瘍である。
本発明の第10の態様は、腫瘍を治療するための薬物として使用される、本発明の第1の態様に記載のTCR、または本発明の第2の態様に記載のTCR複合体、または本発明の第6の態様に記載の細胞を提供する。
本発明の第11の態様は、
(i)本発明の第5の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、本発明の第1の態様に記載のT細胞受容体を発現する段階と、
(ii)前記T細胞受容体を単離または精製する段階とを含む、本発明の第1の態様に記載のT細胞受容体を調製する方法を提供する。
(i)本発明の第5の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、本発明の第1の態様に記載のT細胞受容体を発現する段階と、
(ii)前記T細胞受容体を単離または精製する段階とを含む、本発明の第1の態様に記載のT細胞受容体を調製する方法を提供する。
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下(例えば、実施例)に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
本発明は、広範囲にわたる詳細な研究を通じて、KASEKIFYV短いペプチド(AFPタンパク質に由来する)を識別する高親和性T細胞受容体(TCR)を取得し、前記KASEKIFYV短いペプチドは、ペプチド―HLA A0201複合体の形態で提示される。前記高親和性TCRにおいて、
CDR1α:DSSSTY、
CDR2α:IFSNMDM、
CDR3α:AEPNQAGTALIのα鎖可変ドメインの三つのCDR領域で突然変異が発生され、および/または
CDR1β:MNHEY、
CDR2β:SVGEGT、
CDR3β:ASSSLEDPYEQYのβ鎖可変ドメインの三つのCDR領域で突然変異が発生され、また、突然変異した後の上記KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する本発明のTCRの親和性および/または結合半減期は、野生型TCRの少なくとも2倍である。
CDR1α:DSSSTY、
CDR2α:IFSNMDM、
CDR3α:AEPNQAGTALIのα鎖可変ドメインの三つのCDR領域で突然変異が発生され、および/または
CDR1β:MNHEY、
CDR2β:SVGEGT、
CDR3β:ASSSLEDPYEQYのβ鎖可変ドメインの三つのCDR領域で突然変異が発生され、また、突然変異した後の上記KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する本発明のTCRの親和性および/または結合半減期は、野生型TCRの少なくとも2倍である。
本発明を説明する前に、本発明は、記載された具体的な方法および実験条件に限定されないため、このような方法および条件を変化させることができることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語の両方とも、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明の実施または試験で本発明に記載の類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、本明細書では好ましい方法および材料を例示する。
本発明の実施または試験で本発明に記載の類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、本明細書では好ましい方法および材料を例示する。
用語
T細胞受容体(T cell receptor、TCR)
国際免疫遺伝学情報システム(IMGT)を使用してTCRを説明することができる。天然αβヘテロ二量体TCRは、α鎖およびβ鎖を有する。大まかに言えば、各鎖は、可変領域、リンカー領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、可変領域とリンカー領域との間に短い可変領域を含むが、当該可変領域は、しばしばリンカー領域の一部と見なされる。ユニークなIMGTのTRAJおよびTRBJを介して、TCRのリンカー領域を決定し、IMGTのTRACおよびTRBCを介して、TCRの定常領域を決定する。
T細胞受容体(T cell receptor、TCR)
国際免疫遺伝学情報システム(IMGT)を使用してTCRを説明することができる。天然αβヘテロ二量体TCRは、α鎖およびβ鎖を有する。大まかに言えば、各鎖は、可変領域、リンカー領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、可変領域とリンカー領域との間に短い可変領域を含むが、当該可変領域は、しばしばリンカー領域の一部と見なされる。ユニークなIMGTのTRAJおよびTRBJを介して、TCRのリンカー領域を決定し、IMGTのTRACおよびTRBCを介して、TCRの定常領域を決定する。
各可変領域は、フレームワーク配列に勘合されたCDR1、CDR2およびCDR3の三つのCDR(相補性決定領域)を含む。IMGTの命名法において、TRAVおよびTRBVの異なる番号は、それぞれ異なるVα種類およびVβ種類を指す。IMGTシステムにおいて、α鎖定常ドメインは、TRAC*01の記号を有し、ここで、「TR」は、T細胞受容体遺伝子を表し、「A」は、α鎖遺伝子を表し、Cは、定常領域を表し、「*01」は、対立遺伝子1を表す。β鎖定常ドメインは、TRBC1*01またはTRBC2*01の記号を有し、ここで、「TR」は、T細胞受容体遺伝子を表し、「B」は、β鎖遺伝子を表し、Cは、定常領域を表し、「*01」は、対立遺伝子1を表す。α鎖の定常領域は、一意に決定され、β鎖の形態において、二つの可能な定常領域遺伝子「C1」および「C2」が存在する。当業者は、公開されたIMGTデータベースを介して、TCRα鎖およびβ鎖の定常領域遺伝子配列を取得することができる。
TCRのα鎖およびβ鎖は、一般にそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインの二つの「ドメイン」を有すると見なされる。可変ドメインは、リンクされた可変領域およびリンカー領域で構成される。従って、本出願の明細書および特許請求の範囲において、「TCRα鎖可変ドメイン」は、リンクされたTRAVおよびTRAJ領域を指し、同様に、「TCRβ鎖可変ドメイン」は、リンクされたTRBVおよびTRBD/TRBJ領域を指す。TCRα鎖可変ドメインの三つのCDRは、それぞれCDR1α、CDR2αおよびCDR3αであり、TCRβ鎖可変ドメインの三つのCDRは、それぞれCDR1β、CDR2βおよびCDR3βである。本発明のTCR可変ドメインのフレームワーク配列は、マウスまたはヒト由来、好ましくはヒト由来である。TCRの定常ドメインは、細胞内部分、膜貫通領域および細胞外部分を含む。可溶性TCRを得るために、TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の親和性を測定するために、本発明のTCRは、好ましくは膜貫通領域を含まない。より好ましくは、本発明のTCRのアミノ酸配列は、TCRの細胞外アミノ酸配列を指す。
本発明で使用されるTCR配列は、ヒト由来である。図12aおよび12bに示されるように、本発明における前記「野生型TCR」のα鎖アミノ酸配列およびβ鎖アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:117およびSEQ ID NO:118である。図8aおよび8bに示されるように、本発明における前記「参照TCR」のα鎖アミノ酸配列およびβ鎖アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:63である。図11aおよび11bに示されるように、本発明における前記「野生型TCR」のα鎖およびβ鎖細胞外アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:115およびSEQ ID NO:116である。本発明において、図1aおよび1bに示されるように、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合できる野生型TCRのα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2である。本発明において、「本発明のポリペプチド」、「本発明のTCR」、「本発明のT細胞受容体」という用語は、交換可能に使用される。
本発明の好ましい実施形態中において、本発明によるTCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2α、およびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含む。
別の好ましい例において、前記CDR1αは、配列D[1αX1][1αX2][1αX3]TYを含み、ここで、[1αX1]、[1αX2]、[1αX3]は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記[1αX1]は、SまたはKまたはPまたはRまたはTである。
別の好ましい例において、前記[1αX1]は、SまたはKまたはPまたはRまたはTである。
別の好ましい例において、前記[1αX2]は、SまたはMまたはWである。
別の好ましい例において、前記[1αX3]は、SまたはAである。
別の好ましい例において、前記[1αX1]は、SまたはKまたはPまたはRまたはTであり、[1αX2]は、SまたはMまたはWであり、[1αX3]は、SまたはAである。
別の好ましい例において、前記[1αX3]は、SまたはAである。
別の好ましい例において、前記[1αX1]は、SまたはKまたはPまたはRまたはTであり、[1αX2]は、SまたはMまたはWであり、[1αX3]は、SまたはAである。
別の好ましい例において、前記CDR1αは、DSSSTY、DKMSTY、DPWATY、DRMSTYおよびDTMSTYからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記CDR2αは、配列IFS[2αX1][2αX2][2αX3][2αX4]を含み、ここで、[2αX1]、[2αX2]、[2αX3]、[2αX4]は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記CDR2αは、配列IFS[2αX1][2αX2][2αX3][2αX4]を含み、ここで、[2αX1]、[2αX2]、[2αX3]、[2αX4]は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記[2αX1]は、NまたはYである。
別の好ましい例において、前記[2αX2]は、MまたはQである。
別の好ましい例において、前記[2αX3]は、DまたはSまたはTである。
別の好ましい例において、前記[2αX4]は、MまたはEまたはTである。
別の好ましい例において、前記[2αX2]は、MまたはQである。
別の好ましい例において、前記[2αX3]は、DまたはSまたはTである。
別の好ましい例において、前記[2αX4]は、MまたはEまたはTである。
別の好ましい例において、前記[2αX1]は、NまたはYであり、[2αX2]は、MまたはQであり、[2αX3]は、DまたはSまたはTであり、[2αX4]は、MまたはEまたはTである。
別の好ましい例において、前記CDR2αは、IFSNMDM、IFSYMTE、IFSYQSEおよびIFSYQSTからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記CDR2αは、IFSNMDM、IFSYMTE、IFSYQSEおよびIFSYQSTからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記CDR3αは、配列AEPN[3αX1][3αX2][3αX3][3αX4]ALIを含み、ここで、[3αX1]、[3αX2]、[3αX3]および[3αX4]は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記[3αX1]は、QまたはAまたはDまたはEまたはKまたはNまたはRまたはSまたはTである。
別の好ましい例において、前記[3αX2]は、AまたはSまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3αX1]は、QまたはAまたはDまたはEまたはKまたはNまたはRまたはSまたはTである。
別の好ましい例において、前記[3αX2]は、AまたはSまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3αX3]は、GまたはHまたはQまたはTである。
別の好ましい例において、前記[3αX4]は、TまたはSである。
別の好ましい例において、前記[3αX1]は、TまたはFであり、[3αX2]は、RまたはNであり、[3αX3]は、GまたはHまたはQまたはTであり、[3αX4]は、TまたはSである。
別の好ましい例において、前記[3αX4]は、TまたはSである。
別の好ましい例において、前記[3αX1]は、TまたはFであり、[3αX2]は、RまたはNであり、[3αX3]は、GまたはHまたはQまたはTであり、[3αX4]は、TまたはSである。
別の好ましい例において、前記CDR3αは、AEPNQAGTALI、AEPNNSHSALI、AEPNAAHSALI、AEPNASHSALI、AEPNSSHSALI、AEPNSAHSALI、AEPNNAHSALI、AEPNKSHSALI、AEPNQAHSALI、AEPNQSHSALI、AEPNRSHSALI、AEPNKAHSALI、AEPNTSHSALI、AEPNDVTTALI、AEPNESQSALIからなる群から選択される配列を含む。
本発明の好ましい実施形態中において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2α、およびCDR3αを含み、および前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βを含み、ここで、前記CDR1βは、配列MNHEYを含む。
別の好ましい例において、前記CDR2βは、配列[2βX1][2βX2][2βX3][2βX4]を含み、ここで、[2βX1]、[2βX2]、[2βX3]および[2βX4]は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記[2βX1]は、SまたはHである。
別の好ましい例において、前記[2βX2]は、VまたはDまたはLである。
別の好ましい例において、前記[2βX3]は、GまたはEまたはWである。
別の好ましい例において、前記[2βX2]は、VまたはDまたはLである。
別の好ましい例において、前記[2βX3]は、GまたはEまたはWである。
別の好ましい例において、前記[2βX4]は、EまたはLまたはVである。
別の好ましい例において、前記CDR2βは、SVGEGT、HDWLGT、SDWLGTおよびSLEVGTからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記CDR2βは、SVGEGT、HDWLGT、SDWLGTおよびSLEVGTからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記CDR3βは、配列AS[3βX1][3βX2][3βX3][3βX4]DP[3βX5][3βX6][3βX7][3βX8]を含む。ここで、[3βX1]、[3βX2]、[3βX3]、[3βX4]、[3βX5]、[3βX6]、[3βX7]および[3βX8]は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
別の好ましい例において、前記[3βX1]は、AまたはSである。
別の好ましい例において、前記[3βX2]は、SまたはDである。
別の好ましい例において、前記[3βX3]は、LまたはIまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3βX4]は、EまたはQまたはTである。
別の好ましい例において、前記[3βX2]は、SまたはDである。
別の好ましい例において、前記[3βX3]は、LまたはIまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3βX4]は、EまたはQまたはTである。
別の好ましい例において、前記[3βX5]は、YまたはFである。
別の好ましい例において、前記[3βX6]は、EまたはIまたはPまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3βX7]は、QまたはKまたはLまたはMまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3βX8]は、YまたはAまたはEまたはIまたはLまたはNまたはQまたはRまたはSまたはTまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3βX6]は、EまたはIまたはPまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3βX7]は、QまたはKまたはLまたはMまたはVである。
別の好ましい例において、前記[3βX8]は、YまたはAまたはEまたはIまたはLまたはNまたはQまたはRまたはSまたはTまたはVである。
別の好ましい例において、前記CDR3βは、ASSSLEDPFVKR、ASADVQDPYEQY、ASSSLEDPYEQY、ASADIQDPYEQY、ASSSLEDPYVMT、ASSSLEDPYIKY、ASSSLEDPYIVT、ASSSLEDPYVKI、ASSSLEDPYIKT、ASSSLEDPYILN、ASSSLEDPYILT、ASSDVTDPYEQY、ASSSLEDPYIMA、ASSSLEDPYVLE、ASSSLEDPYPML、ASSSLEDPYVVS、ASSSLEDPYVMVおよびASSSVEDPYEQYからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αを含み、ここで、CDR1αのアミノ酸配列は、VGISAであり、CDR2αのアミノ酸配列は、LSSGKであり、CDR3αのアミノ酸配列は、AVETSYDKVIである。
天然鎖間ジスルフィド結合および人工的な鎖間ジスルフィド結合
天然TCRの膜近位領域のCα鎖とCβ鎖との間には、一つの群のジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。
天然TCRの膜近位領域のCα鎖とCβ鎖との間には、一つの群のジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。
容易に説明するために、本発明におけるTRAC*01およびTRBC1*01またはTRBC2*01アミノ酸配列の位置番号は、N端からC端まで順番に位置番号を付け、例えば、TRBC1*01またはTRBC2*01において、N端からC端までの順番の順序の60番目位置のアミノ酸は、P(プロリン)であると、本発明では、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のPro60と表現することができ、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目位置のアミノ酸と表現することもでき、例えば、TRBC1*01またはTRBC2*01において、N端からC端までの順次的順序の61番目位置のアミノ酸は、Q(グルタミン)であると、本発明では、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGln61と表現することができ、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目位置のアミノ酸と表現することもでき、他は、類推によって推測することができる。本発明において、可変領域のTRAVとTRBVとのアミノ酸配列の位置番号は、IMGTに記載の位置番号に従って番号が付けられる。例えば、TRAVの特定のアミノ酸について、IMGTに記載された位置番号が46であると、本発明においてTRAVの46番目位置のアミノ酸と表現され、他は、類推によって推測することができる。本発明において、他のアミノ酸の配列位置番号について特別な指示がある場合、特別な指示に従う。
腫瘍
「腫瘍」という用語は、病理学的タイプまたは感染の段階に関係なく、すべてのタイプの癌細胞増殖または発癌過程、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織または器官を含むことを意味する。腫瘍の実施例は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移性病変を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は、例えば、肉腫、肺扁平上皮癌および癌等の様々な臓器系の悪性腫瘍を含む。例えば、感染された前立腺、肺、乳房、リンパ、胃腸(例えば、結腸)、泌尿生殖器(例えば、腎臓、上皮細胞)、咽頭である。肺扁平上皮癌は、例えば、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌および食道癌等の悪性腫瘍を含む。前記癌の転移性病変は、本発明の方法および組成物を使用して治療および予防することができる。
「腫瘍」という用語は、病理学的タイプまたは感染の段階に関係なく、すべてのタイプの癌細胞増殖または発癌過程、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織または器官を含むことを意味する。腫瘍の実施例は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移性病変を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は、例えば、肉腫、肺扁平上皮癌および癌等の様々な臓器系の悪性腫瘍を含む。例えば、感染された前立腺、肺、乳房、リンパ、胃腸(例えば、結腸)、泌尿生殖器(例えば、腎臓、上皮細胞)、咽頭である。肺扁平上皮癌は、例えば、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌および食道癌等の悪性腫瘍を含む。前記癌の転移性病変は、本発明の方法および組成物を使用して治療および予防することができる。
発明の詳細な説明
周知されたように、TCRα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとは、それぞれ三つのCDRを含み、抗体の相補性決定領域に類似している。CDR3は、抗原の短いペプチドと相互作用し、CDR1とCDR2とは、HLAと相互作用する。従って、TCR分子のCDRは、抗原の短いペプチド-HLA複合体との相互作用を決定する。抗原の短いペプチドKASEKIFYV与HLA A0201複合体(即ち、KASEKIFYV―HLA A0201複合体)に結合できる野生型TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2であり、当該配列は、本発明者らによって初めて発見された。
周知されたように、TCRα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとは、それぞれ三つのCDRを含み、抗体の相補性決定領域に類似している。CDR3は、抗原の短いペプチドと相互作用し、CDR1とCDR2とは、HLAと相互作用する。従って、TCR分子のCDRは、抗原の短いペプチド-HLA複合体との相互作用を決定する。抗原の短いペプチドKASEKIFYV与HLA A0201複合体(即ち、KASEKIFYV―HLA A0201複合体)に結合できる野生型TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2であり、当該配列は、本発明者らによって初めて発見された。
α鎖可変ドメインCDR CDR1α:DSSSTY
CDR2α:IFSNMDM
CDR3α:AEPNQAGTALI
β鎖可変ドメインCDR CDR1β:MNHEY
CDR2β:SVGEGT
CDR3β:ASSSLEDPYEQYのようなCDR領域を有する。
CDR2α:IFSNMDM
CDR3α:AEPNQAGTALI
β鎖可変ドメインCDR CDR1β:MNHEY
CDR2β:SVGEGT
CDR3β:ASSSLEDPYEQYのようなCDR領域を有する。
本発明は、上記CDR領域に対して突然変異のスクリーニングすることにより、KASEKIFYV―HLA A0201複合体との親和性が野生型TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との親和性の少なくとも2倍である高親和性TCRを得た。
本発明は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合できる活性を有するT細胞受容体(TCR)を提供する。
本発明は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合できる活性を有するT細胞受容体(TCR)を提供する。
前記T細胞受容体は、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、三つのCDR領域を含み、前記TCRα鎖可変ドメインの三つのCDR領域の参照配列は、
CDR1α:DSSSTY
CDR2α:IFSNMDM
CDR3α:AEPNQAGTALIであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、
CDR1α:DSSSTY
CDR2α:IFSNMDM
CDR3α:AEPNQAGTALIであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、
および/または、前記TCRβ鎖可変ドメインは、三つのCDR領域を含み、前記TCRβ鎖可変ドメインの三つのCDR領域の参照配列は、
CDR1β:MNHEY
CDR2β:SVGEGT
CDR3β:ASSSLEDPYEQYであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。
CDR1β:MNHEY
CDR2β:SVGEGT
CDR3β:ASSSLEDPYEQYであり、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。
本発明において、野生型TCRα鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1の三つのCDR、即ち、CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれSEQ ID NO:1の26~31番目、49~55番目および90~100番目に位置する。これに従って、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:1に示される番号を採用し、27Sは、CDR1αの2番目位置のSであり、28Sは、CDR1αの3番目位置のSであり、29Sは、CDR1αの3番目位置のSであり、52Nは、CDR2αの4番目位置のNであり、53Mは、CDR2αの5番目位置のMであり、54Gは、CDR2αの6番目位置のGであり、55Mは、CDR2αの7番目位置のMであり、94Qは、CDR3αの5番目位置のQであり、95Aは、CDR3αの6番目位置のAであり、96Gは、CDR3αの7番目位置のGであり、および97Tは、CDR3αの8番目位置のTである。
同様に、本発明において、野生型TCRβ鎖可変ドメインのSEQ ID NO:2の三つのCDR、即ち、CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれSEQ ID NO:2の27~31番目、49~54番目および92~103番目に位置する。従って、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:2に示される番号を採用し、49Sは、CDR2βの1番目位置のSであり、50Vは、CDR2βの2番目位置のVであり、51Gは、CDR2βの3番目位置のGであり、52Eは、CDR2βの4番目位置のEであり、94Sは、CDR3βの3番目位置のSであり、95Sは、CDR3βの4番目位置のSであり、96Lは、CDR3βの5番目位置のLであり、97Eは、CDR3βの6番目位置のEであり、100Yは、CDR3βの9番目位置のYであり、101Eは、CDR11βの10番目位置のEであり、102Qは、CDR3βの11番目位置のQであり、および103Yは、CDR3βの12番目位置のYである。
好ましくは、突然変異した後の前記TCRα鎖可変ドメインは、27Kまたは27Pまたは27Rまたは27T、28Mまたは28W、29A、52Y、53Q、54Sまたは54T、55EまたはT、94Aまたは94Dまたは94Eまたは94Kまたは94Nまたは94Rまたは94Sまたは94T、95Sまたは95V、96Hまたは96Qまたは96Tおよび97Sからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:1に示される番号を採用し、および/または突然変異した後の前記TCRβ鎖可変ドメインは、49H、50Dまたは50L、51Eまたは51W、52Lまたは52V、94A、95D、96Iまたは96V、97Qまたは97T、100F、101Iまたは101Pまたは101V、102Kまたは102Lまたは102Mまたは102V、103Aまたは103Eまたは103Iまたは103Lまたは103Nまたは103Qまたは103Rまたは103Sまたは103Tまたは103Vからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:2に示される番号を採用する。
より具体的には、α鎖可変ドメインにおける前記突然変異の具体的な形態は、S27K/P/R/T、S28M/W、S29A、N52Y、M53Q、D54S/T、M55E/T、Q94A/D/E/K/N/R/S/T、A95S/V、G96H/Q/T、T97Sのうちの一つまたは複数の群を含み、β鎖可変ドメインにおける前記突然変異の具体的な形態は、S49H、V50D/L、G51E/W、E52L/V、S94A、S95D、L96I/V、E97Q/T、Y100F、E101I/P/V、Q102K/L/M/V、Y103A/E/I/L/N/Q/R/S/T/Vのうちの一つまたは複数の群を含む。
より詳細には、前記TCRα鎖のCDR領域の突然変異の数は、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個または11個であり得、および/または前記TCRβ鎖のCDR領域の突然変異の数は、1個、2個、三つの、4個、5個、6個、7個または8個であり得る。
さらに、本発明の前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは、少なくとも92%、より好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは、少なくとも92%、より好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
さらに、本発明の前記TCRは、一本鎖TCRであり、前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列有少なくとも85%、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも92%、最も好ましくは、少なくとも94%(例えば、可以是少なくとも88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的配列相同性)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも92%、最も好ましくは、少なくとも94%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性であり得る)の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記TCRは、(i)その膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含み、ここで、(i)および(ii)は、両方ともTCR鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含む。
当業者に周知の部位特異的突然変異誘発の方法によれば、野生型TCRα鎖定常領域TRAC*01エクソン1のThr48突然変異をシステインに突然変異し、β鎖定常領域TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer57突然変異をシステインに突然変異し、即ち、参照TCRを取得し、そのアミノ酸配列は、それぞれ図8aおよび8bに示されたとおりであり、突然変異した後のシステイン残基は、太字で表される。上記システイン置換は、参照TCRのα鎖とβ鎖の定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成して、より安定した可溶性TCRを形成することにより、TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性および/または結合半減期をより容易に評価することができる。TCR可変領域のCDR領域は、pMHC複合体との間の親和性を決定し、従って、上記TCR定常領域のシステイン置換は、TCRの結合親和性および/または結合半減期に影響を与えないことを理解されたい。従って、本発明において、測定された参照TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性は、野生型TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性であると見なされる。同様に、本発明のTCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性が参照TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性の少なくとも10倍であると測定される場合、本発明のTCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性が野生型TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性の少なくとも10倍と同等である。
任意の適した方法によって結合親和性(解離平衡定数KDに反比例)および結合半減期(T1/2として表される)を測定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴技術を使用して検出する。TCRの親和性を2倍にすると、KDが半分になることを理解されたい。T1/2は、In2を解離速度(Koff)で割ったものとものとして計算される。従って、T1/2を2倍にすると、Koffが半分になる。好ましくは、同じ試験方案を使用して、所与TCRの結合親和性または結合半減期の回数、例えば、3回またはその以上を検出し、結果の平均値をとる。好ましい実施形態において、本明細書の実施例における表面プラズモン共鳴(BIAcore)の方法で可溶性TCRの親和性を検出し、条件は、温度が25℃であり、PH値が7.1~7.5である。当該方法は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する参照TCRの解離平衡定数KDが30.1μMである3.01E~05Mであることを検出し、即ち、本発明において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する野生型TCRの解離平衡定数KDも30.1μMであると見なされる。TCRの親和性を2倍にすると、KDが半分になるため、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する高親和性TCRの解離平衡定数KDが3.01μMである3.01E~06Mであると検出される場合、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する当該高親和性TCRの親和性は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する野生型TCRの親和性の10倍であると説明される。当業者は、KD値の単位間の変換関係、即ち、1M=106μM、1μM=1000nM、1nM=1000pMに精通している。
本発明の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも2倍、好ましくは、少なくとも5倍、より好ましくは、少なくとも10倍である。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも50倍、好ましくは、少なくとも100倍、より好ましくは、少なくとも500倍である。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも50倍、好ましくは、少なくとも100倍、より好ましくは、少なくとも500倍である。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも104倍、好ましくは、少なくとも105倍、より好ましくは、少なくとも5×105倍である。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの解離平衡定数は、5μM≦KD≦10μM、好ましくは、0.1μM≦KD≦1μM、より好ましくは、1nM≦KD≦100nM、より好ましくは、10pM≦KD≦100pMである。
別の好ましい例において、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの解離平衡定数は、5μM≦KD≦10μM、好ましくは、0.1μM≦KD≦1μM、より好ましくは、1nM≦KD≦100nM、より好ましくは、10pM≦KD≦100pMである。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくもの、制限酵素に基づくグローニングまたはライゲーション非依存性クローニング(LIC)方法を含むがこれらに限定されない、任意の適切な方法を使用して突然変異することができる。多くの標準的分子生物学の教科書は、これらの方法を詳述している。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の突然変異誘発および制限酵素に基づくクローニングのより多くの詳細は、SambrookおよびRussell、(2001)分子クローニング―実験マニュアル、第3版、CSHL出版社を参照する。LIC方法のより多くの情報は、(Rashtchian、(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30―6)を参照することができる。
本発明のTCRを生成する方法は、例えば、文書(Li、et al(2005)Nature Biotech 23(3):349―354)に記載されるように、このようなTCRを表すファージ粒子を多様なライブラリーからKASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対して高親和性を有するTCRをスクリーニングすることができるが、これらに限定されない。
野生型TCRα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸を発現する遺伝子またはわずかに修飾した野生型TCRα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸を発現する遺伝子は、両方ともテンプレートTCRを調製されることができることを理解されたい。次に、当該テンプレートTCRの可変ドメインをコードするDNAは、本発明の高親和性TCRを生成するために必要な変化を導入する。
本発明の高親和性TCRは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:64―87のうちの一つおよび/またはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:88~114のうちの一つを含む。従って、野生型TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)を含むTCRα鎖は、SEQ ID NO:88~114のうちの一つを含むTCRβ鎖と組み合わせて、ヘテロ二量体TCRまたは一本鎖TCR分子を形成することができる。または、野生型TCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)を含むTCRβ鎖は、SEQ ID NO:64~87のうちの一つを含むTCRα鎖と組み合わせて、ヘテロ二量体TCRまたは一本鎖TCR分子を形成する。または、TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:64~87のうちの一つを含むTCRα鎖は、TCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:88~114のうちの一つを含むTCRβ鎖と組み合わせて、ヘテロ二量体TCRまたは一本鎖TCR分子を形成する。本発明において、ヘテロ二量体TCR分子を形成するα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、以下の表1から選択される。
本発明の目的に基づいて、本発明のTCRは、少なくとも一つのTCRαおよび/またはTCRβ鎖可変ドメインを有する一部である。通常、それらは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを同時に含む。それらは、αβヘテロ二量体または一本鎖形式または安定して存在することができる他の形態であり得る。養子免疫治療において、αβヘテロ二量体TCRの全長鎖(細胞質および膜貫通ドメインを含む)をトランスフェクションすることができる。本発明のTCRは、治療剤を抗原提示細胞に送達するための標的剤として使用するか、または他の分子と組み合わせて、エフェクター細胞を標的とする二機能性ポリペプチドを調製することができ、この場合、TCRは、好ましくは、可溶性形態である。
安定性に関して、先行技術は、例えば、特許文書PCT/CN2015/093806に記載されたように、TCRα鎖とβ鎖定常ドメインとの間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、可溶性で安定したTCR分子を得ることができることを開示している。従って、本発明のTCRは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入されるTCRであり得る。システイン残基は、前記TCRのα鎖とβ鎖との定常ドメインの間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成する。システイン残基は、天然TCRの適切な部位にある他のアミノ酸残基を置換して、人工鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。例えば、TRAC*01エクソン1のThr48を置換して、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer57を置換することにより、ジスルフィド結合を形成する。システイン残基を導入して、ジスルフィド結合を形成する部位は、さらにTRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer77、TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer17、TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAsp59、TRAC*01エクソン1のSer15およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu15、TRAC*01エクソン1のArg53およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer54、TRAC*01エクソン1のPro89およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAla19、またはTRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu20であり得る。即ち、システイン残基は、前記α鎖およびβ鎖定常ドメインの任意の群の部位を置換する。最大15個、または最大10個、または最大8個またはその以下のアミノ酸を、本発明のTCR定常ドメインの一つまたは複数のC末端で切断して、システイン残基を含まないようにして、天然鎖間ジスルフィド結合を欠失する目的を達成し、天然鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を別のアミノ酸に突然変異することによって前記目的を達成することができる。
前記のように、本発明のTCRは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に導入された人工鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。定常ドメインの間に前記に記載の導入された人工鎖間ジスルフィド結合の有無に関係なく、本発明のTCRは、TRAC定常ドメイン配列およびTRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列を含むことができることに留意されたい。TCRのTRAC定常ドメイン配列およびTRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列は、TCRに存在する天然鎖間ジスルフィド結合によって結合されることができる。
さらに、安定性に関して、特許文書PCT/CN2016/077680は、TCRのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、TCRの安定性を大幅に向上させることができることも開示された。従って、本発明の高親和性TCRの鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。具体的には、前記TCRのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、TRAVの46番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目位置のアミノ酸、TRAVの47番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目位置のアミノ酸、TRAVの46番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目位置のアミノ酸、またはTRAVの47番目位置のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目位置のアミノ酸を置換した。好ましくは、そのようなTCRは、(i)その膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含むことができ、ここで、(i)および(ii)は、両方ともTCR鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖およびβ鎖は、ヘテロ二量体を形成する。より好ましくは、そのようなTCRは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメイン、ならびに膜貫通ドメインを除く全部または一部のβ鎖定常ドメインを含むことができるが、α鎖定常ドメインを含まず、前記TCRα鎖可変ドメインおよびβ鎖は、ヘテロ二量体を形成する。
安定性に関して、一方、本発明のTCRは、その疎水性コア領域で突然変異が発生するTCRを含み、これらの疎水性コア領域における突然変異は、好ましくは、例えば、WO2014/206304の公開番号を有する特許文書に記載されるように、本発明のTCRの安定性を向上させることができる。そのようなTCRは、(α鎖および/またはβ鎖)可変領域アミノ酸の11、13、19、21、53、76、89、91、94番目、および/またはα鎖J遺伝子(TRAJ)の短いペプチドアミノ酸の最後から3番目、最後から5番目、最後から7番目、および/またはβ鎖J遺伝子(TRBJ)の短いペプチドアミノ酸の最後から2番目、4番目、6番目位置の可変ドメイン疎水性コア位置で突然変異させることができ、ここで、アミノ酸配列の位置番号は、国際免疫遺伝学情報システム(IMGT)に記載された位置番号による。当業者は、前記国際免疫遺伝学情報システムを知り、当該データベースに従って、IMGTにおける異なるTCRのアミノ酸残基の位置番号を得ることができる。
より具体的には、本発明において、疎水性コア領域で突然変異が発生するTCRは、TCRのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合する柔軟なペプチド鎖から構成される安定的な可溶性一本鎖TCRであり得る。TCR可変領域のCDR領域は、短いペプチド-HLA複合体との間の親和性を決定し、疎水性コアの突然変異により、TCRがより安定することができるが、短いペプチド-HLA複合体との間の親和性に影響を与えない。本発明における柔軟なペプチド鎖は、TCRのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合するのに適した任意のペプチド鎖であり得ることに留意されたい。本発明の実施例1で構築された高親和性TCRをスクリーニングするためのテンプレート鎖は、前記疎水性コア突然変異を含む高安定性一本鎖TCRである。より安定性の高いTCRを使用して、TCRとKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との間の親和性をより容易に評価することができる。
当該一本鎖テンプレートTCRα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのCDR領域は、野生型TCRのCDR領域と全く同じである。即ち、α鎖可変ドメインの三つのCDRは、それぞれCDR1α:DSSSTY、CDR2α:IFSNMDM、CDR3α:AEPNQAGTALIであり、およびβ鎖可変ドメインの三つのCDRは、それぞれCDR1β:MNHEY、CDR2β:SVGEGT、CDR3β:ASSSLEDPYEQYである。当該一本鎖テンプレートTCRのアミノ酸配列(SEQ ID NO:60)およびヌクレオチド配列(SEQ ID NO:61)は、それぞれ図7aおよび7bに示されたとおりである。このようにして、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対して高親和性を有するα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインからなる一本鎖TCRをスクリーニングする。
本発明において、一本鎖テンプレートTCRα鎖可変ドメインのSEQ ID NO:3の三つのCDR、即ち、CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれSEQ ID NO:3の26~31番目、49~55番目および90~100番目に位置する。これに従って、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:3に示される番号を採用し、27Sは、CDR1αの2番目位置のSであり、28Sは、CDR1αの3番目位置のSであり、29Sは、CDR1αの3番目位置のSであり、52Nは、CDR2αの4番目位置のNであり、53Mは、CDR2αの5番目位置のMであり、54Gは、CDR2αの6番目位置のGであり、55Mは、CDR2αの7番目位置のMであり、94Qは、CDR3αの5番目位置のQであり、95Aは、CDR3αの6番目位置のAであり、96Gは、CDR3αの7番目位置のGであり、および97Tは、CDR3αの8番目位置のTである。
同様に、本発明において、一本鎖テンプレートTCRβ鎖可変ドメインのSEQ ID NO:4の三つのCDR、即ち、CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれSEQ ID NO:2の27~31番目、49~54番目および92~103番目に位置する。従って、アミノ酸残基の番号は、SEQ ID NO:4に示される番号を採用し、49Sは、CDR2βの1番目位置のSであり、50Vは、CDR2βの2番目位置のVであり、51Gは、CDR2βの3番目位置のGであり、52Eは、CDR2βの4番目位置のEであり、94Sは、CDR3βの3番目位置のSであり、95Sは、CDR3βの4番目位置のSであり、96Lは、CDR3βの5番目位置のLであり、97Eは、CDR3βの6番目位置のEであり、100Yは、CDR3βの9番目位置のYであり、101Eは、CDR11βの10番目位置のEであり、102Qは、CDR3βの11番目位置のQであり、および103Yは、CDR3βの12番目位置のYである。
KASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対して高親和性を有する本発明のαβヘテロ二量体は、スクリーニングされた高親和性一本鎖TCRのα鎖およびβ鎖可変ドメインのCDR領域を野生型TCRα鎖可変ドメイン(SEQ ID NO:1)およびβ鎖可変ドメイン(SEQ ID NO:2)の対応する位置に移すことによって得られる。別の一部は、スクリーニングして得られたCDR領域の突然変異部位に基づいて、人工的に組み合わせることによって得られる。
本発明の高親和性TCRは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:9~32のうちの一つおよび/またはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:33~59のうちの一つを含む。従って、テンプレート鎖としての上記高安定性一本鎖TCRα鎖可変ドメイン(SEQ ID NO:3)は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:33~59のうちの一つであるTCRβ鎖可変ドメインと組み合わせて、前記一本鎖TCR分子を形成することができる。または、テンプレート鎖としての上記高安定性一本鎖TCRβ鎖可変ドメイン(SEQ ID NO:4)は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:9~32のうちの一つであるTCRα鎖可変ドメインと組み合わせて、前記一本鎖TCR分子を形成することができる。または、TCRα鎖可変ドメインのSEQ ID NO:9~32のうちの一つは、TCRβ鎖可変ドメインのSEQ ID NO:33~59のうちの一つと組み合わせて、前記一本鎖TCR分子を形成する。本発明において、高親和性一本鎖TCR分子のα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、以下の表2から選択される。
本発明のTCRは、多価複合体の形態で提供することもできる。本発明の多価TCR複合体は、2個、3個、4個またはより多くの本発明のTCRを結合して形成されるポリマーを含み、例えば、p53の四量体化ドメインを使用して、四量体、または複数の本発明のTCRを別の分子と結合して形成する複合体を生成する。本発明のTCR複合体は、インビトロまたはインビボで特定の抗原を提示する細胞を追跡または標的化するために用いられることができ、そのような使用で他の多価TCR複合体の中間体を生成するために使用することもできる。
本発明のTCRは、単独で使用することができ、共有結合または他の方法で、好ましくは、共有結合の方法でコンジュゲートと結合することができる。前記コンジュゲートは、検出可能なマーカー(診断目的とし、ここで、前記TCRは、KASEKIFYV―HLA―A0201複合体を提示する細胞の存在を検出する)、治療剤、PK(プロテインキナーゼ)修飾部分またはこれらの物質の任意の組み合わせ結合またはカップリングを含む。
診断目的で使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、MRI(磁気共鳴画像)またはCT(電子コンピューターX線断層撮影技術)造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明のTCRと結合またはカップリングすることができる治療剤は、(1)放射性核種(Koppeら、2005、癌転移レビュー(Cancer metastasis reviews)24、539)、(2)生物学的毒性(Chaudharyら、1989、自然(Nature)339、394、Epelら、2002、癌免疫学および免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)51、565)、(3)IL-2等のサイトカイン(Gilliesら、1992、米国国立科学アカデミーの学術誌(PNAS)89、1428、Cardら、2004、癌免疫学および免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)53、345、Halinら、2003、癌研究(Cancer Research)63、3202)、(4)抗体Fcフラグメント(Mosqueraら、2005、免疫学ジャーナル(The Journal Of Immunology)174、4381)、(5)抗体scFvフラグメント(Zhuら、1995、癌国際ジャーナル(International Journal of Cancer)62、 319)、(6)金ナノ粒子/名のロッド(Lapotkoら、2005、癌コミュニケーション(Cancer letters )239、36、Huangら、2006、米国化学会誌(Journal of the American Chemical Society)128、2115)、(7)ウイルス粒子(Pengら、2004、遺伝子治療(Gene therapy)11、1234)、(8)リポソーム(Mamotら、2005、癌研究(Cancer research)65、11631)、(9)ナノ磁性粒子、(10)プロドラッグ活性化酵素(例えば、DT-ジアホラーゼ(DTD)またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質(BPHL))、(11)化学療法剤(例えば、シスプラチン)または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
本発明のTCRに結合する抗体またはそのフラグメントは、例えば、抗―CD3または抗―CD28または抗―CD16抗体等の抗―T細胞またはNK―細胞決定抗体を含み、上記抗体またはそのフラグメントとTCRとの結合は、エフェクター細胞に対して、より適切に標的細胞を標的かすることができる。好ましい実施形態は、本発明のTCRが抗―CD3抗体または前記抗―CD3抗体の機能的フラグメントまたは変異体と結合することである。具体的には、本発明のTCRと抗CD3一本鎖抗体との融合分子は、SEQ ID NO:9~32、64~87からなる群から選択されるTCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO:33~59、88~114からなる群から選択されるTCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。
本発明は、本発明のTCRをコードする核酸分子にさらに関する。本発明の核酸分子は、DNAの形態またはRNAの形態であり得る。DNAは、コード鎖または非コード鎖であり得る。例えば、本発明のTCRをコードする核酸配列は、本発明の図面に示される核酸配列と同じであるか、または縮重変異体であり得る。「縮重変異体」の意味を説明すると、本明細書に使用されるように、本発明における「縮重変異体」は、SEQ ID NO:60を有するタンパク質配列をコードするが、SEQ ID NO:61の配列とは異なる核酸配列を指す。
本発明の核酸分子の全長配列またはそのフラグメントは、通常、PCR増幅法、組換え法または人工的に合成法によって得ることができるが、これらに限定されない。現在、本発明のTCR(またはそのフラグメント、またはその誘導体由来物)をコードするDNA配列は、完全に化学的合成によって得ることができる。次に当該DNA配列は、当技術分野で知られている様々な既存のDNA分子(またはベクター等)および細胞に導入されることができる。
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、および本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学によって生成される宿主細胞にも関する。
本発明は、本発明のTCRを発現する単離された細胞、特にT細胞をさらに含む。本発明の高親和性TCRをコードするDNAまたはRNAによるT細胞トランスフェクション(例えば、Robbinsら、(2008)J.Immunol.180:6116―6131)に適した多くの方法がある。本発明の高親和性TCRを発現するT細胞は、養子免疫療法に使用することができる。当業者は、養子治療に適した多くの方法を知ることができる(例えば、Rosenbergら、(2008)Nat Rev Cancer 8(4):299―308)。
本発明は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体および本発明のTCR、または本発明のTCR複合体、または本発明のTCRを提示する細胞を含む。
本発明は、治療を必要とする対象に適切な量の本発明のTCR、または本発明のTCR複合体、または本発明のTCRを提示する細胞、または本発明の医薬組成物を投与する段階を含む、疾患を治療する方法をさらに提供する。
本発明は、治療を必要とする対象に適切な量の本発明のTCR、または本発明のTCR複合体、または本発明のTCRを提示する細胞、または本発明の医薬組成物を投与する段階を含む、疾患を治療する方法をさらに提供する。
本明細書におけるアミノ酸の名称は、国際的に使用される単一の英字で表示され、それに対応するアミノ酸の名称の三つの英字の略語は、それぞれAla(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)であり、本発明において、Pro60または60Pは、両方とも60番目位置のプロリンを表す。さらに、本発明における前記突然変異の具体的な形態、例えば、「S27K/P/R/T」は、27番目位置のSがKによって置換されるか、またはPによって置換されるか、またはRによって置換されるか、またはTによって置換されることを表し、同様に、「S28M/W」は、28番目位置のSがMによって置換されるか、またはWによって置換されることを表す。他は、このような類推によって推測されることができる。
当技術分野において、同様または類似の性能を有するアミノ酸を使用して置換する場合、通常、タンパク質の機能は変化しない。C末端および/またはN末端に一つまたは複数のアミノ酸を追加しても、通常、タンパク質の構造および機能は変化しない。従って、本発明のTCRは、本発明のTCRのうち最大5個、好ましくは、3個、より好ましくは、2個、最も好ましくは、1個のアミノ酸(特に、CDR領域の以下に位置するアミノ酸)が、類似または同様の性質を有するアミノ酸によって置換されても、依然としてその機能性を維持するTCRを含む。
本発明は、本発明のTCRに対してわずかに修飾したTCRをさらに含む。修飾(通常、一次構造を変更しない)形態は、例えば、アセチル化またはカルボキシル化等の本発明のTCRの化学的誘導形態を含む。修飾は、例えば、本発明のTCRの合成および加工中またはさらなる加工段階において、グリコシル化修飾によって生成されたTCR等のグリコシル化をさらに含む。このような修飾は、TCRをグリコシル化した酵素(例えば、哺乳動物のグリコシラーゼまたはデグリコシラーゼ)によって曝露することによって達成することができる。修飾形態は、リン酸化アミノ酸残基(例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン)を有する配列をさらに含む。修飾されることによって、その抗タンパク質加水分解性能を向上させるか、または溶解性能を最適化したTCRをさらに含む。
本発明のTCR、TCR複合体または本発明のTCRトランスフェクトされたT細胞は、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物に提供されることができる。本発明のTCR、多価TCR複合体または細胞は、通常、無菌医薬組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。当該医薬組成物は、任意の適した形態(患者の所望の投与方法に依存する)であり得る。通常、密封された容器で、単位剤形で提供されることができ、キットの一部として提供されることができる。このようなキット(必須ではない)は、マニュアルを含む。それは、複数の単位剤形を含むことができる。
さらに、本発明のTCRは、単独で使用することができ、他の治療剤と結合またはカップリングして一緒に使用することができる(例えば、同じ医薬組成物に調製される)。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤の投与に使用される担体を指す。当該用語は、それ自体が当該組成物を受け取る個体に有害な抗体の生成を誘発せず、投与後に過度の毒性を有さない等のような医薬担体を指す。これらの担体は、当業者によってよく知られている。レミントンンお薬物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.、N.J.1991))で、薬学的に許容される賦形剤の十分な議論を見つかることができる。このような担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、アジュバント、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
治療性組成物の薬学的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール等の液体を含むことができる。さらに、これらの担体には、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質等の補助性物質が存在することができる。
通常、治療性組成物を、例えば、液体溶液または懸濁液等の注射可能な剤形に調製することができ、注射前に溶液または懸濁液、液体担体に処方されるのに適した固体形態に調製することができる。
本発明の組成物が処方されると、従来の経路によって投与することができ、ここで、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、または局所投与を含むが、これらに限定されず、好ましくは、皮下、肌肉内または静脈内を含む胃腸外である。予防または治療される対象は、動物であり、特にヒトであり得る。
本発明の医薬組成物が実際の治療に使用される場合、使用状況に応じて、様々な剤形の医薬組成物を使用することができる。好ましくは、注射剤および経口剤などが例示されることができる。
これらの医薬組成物は、従来の方法に基づいて混合、希釈または溶解することによって処方されることができ、また場合によって、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張剤(isotonicities)、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤および共溶媒剤等の適切な薬物添加剤を加え、当該調製プロセスは、剤形に従って、通常の方法で実施することができる。
本発明の医薬組成物は、徐放剤の形態で投与することができる。例えば、本発明のTCRは、担体として徐放性ポリマーを有するピルまたはマイクロカプセルに組み込まれることができ、次に当該ピルまたはマイクロカプセルを、手術を通じて、治療される組織に移植する。徐放性ポリマーの例として、エチレン―酢酸ビニルコポリマー(ethylene-vinyl acetate copolymer)、ポリヒドロメタアクリレート(polyhydrometaacrylate)、ポリアクリルアミド(polyacrylamide)、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)、メチルセルロース(methylcellulose)、乳酸ポリマー、乳酸―グリコール酸コポリマー等を含み、好ましくは、例えば、乳酸ポリマーおよび乳酸―グリコール酸コポリマー等の生分解性ポリマーを含む。
本発明の医薬組成物が実際の治療に使用される場合、有効成分としての本発明のTCRまたはTCR複合体または本発明のTCRを提示する細胞は、治療される各患者の体重、年齢、性別および症状程度等に基づいて、合理的に決定することができ、最終に、医師によって合理的な投与量をけっていされる。
本発明の主な利点は次のとおりである。
(1)前記KASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対する本発明のTCRの親和性および/または結合半減期は、野生型TCRの少なくとも2倍、好ましくは、少なくとも10倍である。
(2)前記KASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対する本発明のTCRの親和性および/または結合半減期は、野生型TCRの少なくとも100倍、好ましくは、少なくとも103倍であり、より好ましくは、104~5×105倍に達成することができる。
(3)本発明の高親和性TCRで形質導入されたエフェクター細胞は、標的細胞に対して強力な殺傷効果を有する。
(1)前記KASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対する本発明のTCRの親和性および/または結合半減期は、野生型TCRの少なくとも2倍、好ましくは、少なくとも10倍である。
(2)前記KASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対する本発明のTCRの親和性および/または結合半減期は、野生型TCRの少なくとも100倍、好ましくは、少なくとも103倍であり、より好ましくは、104~5×105倍に達成することができる。
(3)本発明の高親和性TCRで形質導入されたエフェクター細胞は、標的細胞に対して強力な殺傷効果を有する。
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、(SambrookおよびRussellら、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第3版)(2001)CSHL出版社)に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。
材料および方法
本発明の実施例で使用される実験材料は、特に明記しない限り、商業チャネルから入手することができ、ここで、E.coli DH5αは、Tiangenから購入し、E.coli BL21(DE3)は、Tiangenから購入し、E. coli Tuner (DE3)は、Novagenから購入し、プラスミドpET28aは、Novagenから購入する。
本発明の実施例で使用される実験材料は、特に明記しない限り、商業チャネルから入手することができ、ここで、E.coli DH5αは、Tiangenから購入し、E.coli BL21(DE3)は、Tiangenから購入し、E. coli Tuner (DE3)は、Novagenから購入し、プラスミドpET28aは、Novagenから購入する。
実施例1.疎水性コアの突然変異の安定性一本鎖TCRテンプレート鎖の生成
本発明は、特許文書WO2014/206304による部位特異的突然変異誘発の方法を使用して、TCRα鎖およびβ鎖可変ドメインを結合する柔軟な短いペプチド(linker)から構成される安定性一本鎖TCR分子を構築し、図7aおよび図7bに示されるように、そのアミノ酸およびDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:60およびSEQ ID NO:61である。当該一本鎖TCR分子をテンプレートとして使用して、高親和性TCR分子をスクリーニングする。当該テンプレート鎖のα可変ドメイン(SEQ ID NO:3)およびβ可変ドメイン(SEQ ID NO:4)のアミノ酸配列は、図2aおよび2bに示されたとおりであり、図3aおよび3bに示されるように、その対応するDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:5および6であり、図4aおよび4bに示されるように、柔軟な短いペプチド(linker)のアミノ酸配列およびDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:7および8である。
本発明は、特許文書WO2014/206304による部位特異的突然変異誘発の方法を使用して、TCRα鎖およびβ鎖可変ドメインを結合する柔軟な短いペプチド(linker)から構成される安定性一本鎖TCR分子を構築し、図7aおよび図7bに示されるように、そのアミノ酸およびDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:60およびSEQ ID NO:61である。当該一本鎖TCR分子をテンプレートとして使用して、高親和性TCR分子をスクリーニングする。当該テンプレート鎖のα可変ドメイン(SEQ ID NO:3)およびβ可変ドメイン(SEQ ID NO:4)のアミノ酸配列は、図2aおよび2bに示されたとおりであり、図3aおよび3bに示されるように、その対応するDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:5および6であり、図4aおよび4bに示されるように、柔軟な短いペプチド(linker)のアミノ酸配列およびDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:7および8である。
テンプレート鎖を持つ標的遺伝子をNcoIとNotIとで二重酵素消化し、NcoIとNotIとで二重酵素消化したpET28aベクターに結合する。結合生成物をE.coli DH5αに形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートにコーティングし、37℃で転倒して一晩インキュベートし、陽性クローニングを選択して、PCRスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後に組換えプラスミドを抽出し、E.coli BL21(DE3)に形質転換して、発現に使用される。
実施例2.実施例1で構築された安定性一本鎖TCRの発現、再生および精製
実施例1で調製された組換えプラスミドpET28a―テンプレート鎖を含むBL21(DE3)コロニーの全部を、カナマイシンを含むLB培地に接種し、37℃でOD600が0.6~0.8になるまで培養し、最終濃度が0.5mMになるまでIPTGを加え、37℃で引き続き4時間培養する。5000rpmで15分間遠心分離して細胞ペレットを採集し、Bugbuster Master Mix(Merck)で細胞ペレットを熱分解し、6000rpmで15分間遠心分離して封入体を回収し、Bugbuster(Merck)で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、6000rpmで15分間遠心分離して、封入体を収集する。封入体を緩衝液(20mM トリス(Tris)―HCl pH8.0、8M尿素)に溶解し、高速遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をBCA法で定量化した後に分注して、後で使用するために―80℃で保存する。
実施例1で調製された組換えプラスミドpET28a―テンプレート鎖を含むBL21(DE3)コロニーの全部を、カナマイシンを含むLB培地に接種し、37℃でOD600が0.6~0.8になるまで培養し、最終濃度が0.5mMになるまでIPTGを加え、37℃で引き続き4時間培養する。5000rpmで15分間遠心分離して細胞ペレットを採集し、Bugbuster Master Mix(Merck)で細胞ペレットを熱分解し、6000rpmで15分間遠心分離して封入体を回収し、Bugbuster(Merck)で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、6000rpmで15分間遠心分離して、封入体を収集する。封入体を緩衝液(20mM トリス(Tris)―HCl pH8.0、8M尿素)に溶解し、高速遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をBCA法で定量化した後に分注して、後で使用するために―80℃で保存する。
5mgの溶解した一本鎖TCR封入体タンパク質に、2.5mLの緩衝液(6MのGua―HCl、50mMのトリス―HCl pH8.1、100mMのNaCl、10mMのEDTA)を加え、最終濃度が10mMになるまでDTTを加え、37℃で30分間処理する。注射器を使用して、125mLの再生緩衝液(100mMのトリス―HCl pH8.1、0.4MのL―アルギニン、5Mの尿素、2mMのEDTA、6.5mMのβ―メルカプトエチルアミン(β―mercapthoethylamine)、1.87mMのシスタミン(Cystamine))に上記処理後の一本鎖TCRを滴下し、4℃で10分間攪拌し、次に再生液をカットオフが4KDaであるセルロース膜透析バッグに入れ、透析バッグを1Lの予冷した水に入れ、4℃で一晩ゆっくりと攪拌する。17時間後、透析液を1Lの予冷した緩衝液(20mMのトリス―HCl pH8.0)に変更し、4℃で引き続き8時間透析し、次に透析液を同じ新しい緩衝液に変更し、引き続き一晩透析する。17時間後、サンプルを0.45μmのフィルターメンブレンでろ過し、真空脱気した後、陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP、GE Healthcare)に通過し、20mMのトリス―HCl pH8.0で調製した0~1MのNaCl線形勾配溶出液でタンパク質を精製し、収集した溶出成分をSDS―PAGEで分析し、一本鎖TCRを含む成分を濃縮した後、ゲルろ過カラム(Superdex 75 10/300、GE Healthcare)でさらに精製し、標的成分もSDS―PAGEで分析する。
BIAcore分析に使用される溶出成分は、ゲルろ過法でその純度をさらに試験する。条件は次のとおりである。クロマトグラフィーカラムAgilent Bio SEC―3(300A、φ7.8×300mM)、移動相が150mMのリン酸塩緩衝液であり、流速が0.5mL/minであり、カラム温度が25℃であり、UV検出波長が214nmである。
実施例3.結合の特性化
BIAcore分析
BIAcore T200リアルタイム分析システムを使用して、TCR分子とKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との結合活性を検出する。抗ストレプトアビジン抗体(GenScript)をカップリング緩衝液(10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.77)に加え、次に事前にEDCおよびNHS活性化されたCM5チップに抗体を流して、抗体がチップ表面に固定させ、最後にエタノールアミンの塩酸溶液で未反応の活性化表面を密封して、カップリング過程を完了し、カップリングレベルは、約15000RUである。条件は次のとおりである。温度が25℃であり、PH値が7.1~7.5である。
BIAcore分析
BIAcore T200リアルタイム分析システムを使用して、TCR分子とKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との結合活性を検出する。抗ストレプトアビジン抗体(GenScript)をカップリング緩衝液(10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.77)に加え、次に事前にEDCおよびNHS活性化されたCM5チップに抗体を流して、抗体がチップ表面に固定させ、最後にエタノールアミンの塩酸溶液で未反応の活性化表面を密封して、カップリング過程を完了し、カップリングレベルは、約15000RUである。条件は次のとおりである。温度が25℃であり、PH値が7.1~7.5である。
低濃度のストレプトアビジンを抗体でコーティングされたチップ表面に流し、次にKASEKIFYV―HLA―A0201複合体を検出チャネルに流し、別のチャネルを参照チャネルとして、0.05mMのビオチンを10μL/minの流速で2分間チップに流し、ストレプトアビジンの残りの結合部位を密閉する。単一サイクルの動力学解析方法を使用して、その親和性を測定し、TCRをHEPES―EP緩衝液(10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%P20、pH7.4)でいくつかの異なる濃度に希釈し、30μL/minの流速で、チップ表面を順次に流し、毎回注入の結合時間は、120秒であり、最後の注入が完了後、600秒間解離させる。各ラウンドを測定した後、チップをpH1.75である10mMのGly―HClで再生する。BIAcore Evaluationソフトウェアを使用して動力学パラメーターを計算する。
上記KASEKIFYV―HLA―A0201複合体の調製プロセスは、次のとおりである。
a.精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するE.coli菌溶液を100mL収集し、8000gで、4℃で10分間遠心分離した後、10mLのPBSで菌体を1回洗浄し、その後に5mLのBugBuster Master Mix Extraction 試薬s(Merck)で激しく振とうして菌体を再懸濁し、室温で回転させながら20分間インキュベートし、その後に6000gで、4℃で15分間遠心分離し、上清を捨て、封入体を収集する。
a.精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するE.coli菌溶液を100mL収集し、8000gで、4℃で10分間遠心分離した後、10mLのPBSで菌体を1回洗浄し、その後に5mLのBugBuster Master Mix Extraction 試薬s(Merck)で激しく振とうして菌体を再懸濁し、室温で回転させながら20分間インキュベートし、その後に6000gで、4℃で15分間遠心分離し、上清を捨て、封入体を収集する。
上記封入体を5mLのBugBuster Master Mixに再懸濁し、室温で回転させながら5分間インキュベートし、10倍希釈した30mLのBugBusterを加え、均等に混合し、6000gで、4℃で15分間遠心分離し、上清を捨て、10倍希釈した30mLのBugBusterを加えて封入体を再懸濁し、均等に混合し、6000gで、4℃で15分間遠心分離し、2回繰り返し、30mLの20mM トリス―HCl pH8.0を加えて封入体を再懸濁し、均等に混合し、6000gで、4℃で15分間遠心分離し、最後に、20mMのトリス―HCl 8M尿素で封入体を溶解し、SDS―PAGEで封入体の純度を検出し、BCAキットで濃度を測定する。
b.再生
合成された短いペプチドKASEKIFYV(北京サイバイシェン遺伝子技術会社)をDMSOに20mg/mlの濃度になるまで溶解する。軽鎖および重鎖の封入体を、8M尿素、20mMのトリス pH8.0、10mMのDTTで溶解し、再生前に、3Mの塩酸グアニジン、10mMの酢酸ナトリウム、10mMのEDTAを加えてさらに変性する。KASEKIFYVペプチドを25mg/L(最終濃度)で再生緩衝液(0.4MのL―アルギニン、100mMのトリス pH8.3、2mMのEDTA、0.5mMの酸化型グルタチオン、5mMの還元型グルタチオン、0.2mMのPMSF、4℃に冷却する)に加え、次に20mg/Lの軽鎖および90mg/Lの重鎖(最終濃度、重鎖は8時間/回で3回に分けて加える)を順次に加え、再生は、4℃で少なくとも三日で完了し、SDS―PAGEで再生が成功したかどうかを検出する。
合成された短いペプチドKASEKIFYV(北京サイバイシェン遺伝子技術会社)をDMSOに20mg/mlの濃度になるまで溶解する。軽鎖および重鎖の封入体を、8M尿素、20mMのトリス pH8.0、10mMのDTTで溶解し、再生前に、3Mの塩酸グアニジン、10mMの酢酸ナトリウム、10mMのEDTAを加えてさらに変性する。KASEKIFYVペプチドを25mg/L(最終濃度)で再生緩衝液(0.4MのL―アルギニン、100mMのトリス pH8.3、2mMのEDTA、0.5mMの酸化型グルタチオン、5mMの還元型グルタチオン、0.2mMのPMSF、4℃に冷却する)に加え、次に20mg/Lの軽鎖および90mg/Lの重鎖(最終濃度、重鎖は8時間/回で3回に分けて加える)を順次に加え、再生は、4℃で少なくとも三日で完了し、SDS―PAGEで再生が成功したかどうかを検出する。
c.再生後の精製
透析用として10倍量の20mMのトリス pH8.0を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも2回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、0.45μMの醋酸セルロースフィルターメンブレンでタンパク質溶液をろ過し、次にHiTrap Q HP(GEゼネラルエレクトリックカンパニー(GEゼネラルエレクトリックカンパニー(GE General Electric Company))陰イオン交換カラム上(5mLベッド倍量)にロードする。Akta精製器(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)、20mMのトリス pH8.0で調製した0~400mMのNaCl線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、pMHCは、約250mMのNaClで溶出され、ピーク成分を収集し、SDS―PAGEで純度を検出する。
透析用として10倍量の20mMのトリス pH8.0を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも2回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、0.45μMの醋酸セルロースフィルターメンブレンでタンパク質溶液をろ過し、次にHiTrap Q HP(GEゼネラルエレクトリックカンパニー(GEゼネラルエレクトリックカンパニー(GE General Electric Company))陰イオン交換カラム上(5mLベッド倍量)にロードする。Akta精製器(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)、20mMのトリス pH8.0で調製した0~400mMのNaCl線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、pMHCは、約250mMのNaClで溶出され、ピーク成分を収集し、SDS―PAGEで純度を検出する。
d.ビオチン化
精製したpMHC分子をMillipore限外ろ過チューブで濃縮し、同時に緩衝液を20mMのトリス pH8.0に交換し、次にビオチン化試薬0.05MのBicine pH8.3、10mMのATP、10mMのMgOAc、50μMのD―ビオチン(Biotin)、100μg/mlのBirA酵素(GST―BirA)を加え、室温下で混合物を一晩インキュベートし、SDS―PAGEでビオチン化が完了したかどうかを検出する。
精製したpMHC分子をMillipore限外ろ過チューブで濃縮し、同時に緩衝液を20mMのトリス pH8.0に交換し、次にビオチン化試薬0.05MのBicine pH8.3、10mMのATP、10mMのMgOAc、50μMのD―ビオチン(Biotin)、100μg/mlのBirA酵素(GST―BirA)を加え、室温下で混合物を一晩インキュベートし、SDS―PAGEでビオチン化が完了したかどうかを検出する。
e.ビオチン化後の複合体の精製
Millipore限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化pMHC分子を1mLに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化pMHCを精製し、Akta精製器(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)を使用し、ろ過したPBSを使用してHiPrepTM16/60 S200HRカラム(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)を事前平衡化し、濃縮した1mLのビオチン化pMHC分子をロードし、次にPBSで1mL/minの流速で溶出する、ビオチン化pMHC分子は、約55mLで単一のピークとして溶出される。タンパク質を含む成分を合併し、Millipore限外ろ過チューブで濃縮し、BCA法(Thermo)でタンパク質の濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Roche)を加えて、ビオチン化pMHC分子を分注して、―80℃で保存する。
Millipore限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化pMHC分子を1mLに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化pMHCを精製し、Akta精製器(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)を使用し、ろ過したPBSを使用してHiPrepTM16/60 S200HRカラム(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)を事前平衡化し、濃縮した1mLのビオチン化pMHC分子をロードし、次にPBSで1mL/minの流速で溶出する、ビオチン化pMHC分子は、約55mLで単一のピークとして溶出される。タンパク質を含む成分を合併し、Millipore限外ろ過チューブで濃縮し、BCA法(Thermo)でタンパク質の濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Roche)を加えて、ビオチン化pMHC分子を分注して、―80℃で保存する。
実施例4.高親和性一本鎖TCRの生成
ファージディスプレイ技術は、TCR高親和性変異体ライブラリーを生成して、高親和性変異体をスクリーニングする手段である。Liら((2005)Nature Biotech 23(3):349―354)によって説明されたTCRファージディスプレイおよびスクリーニング方法を、実施例1における一本鎖TCRテンプレートに応用する。当該テンプレート鎖のCDR領域を突然変異させることにより、高親和性TCRのライブラリーを構築して、パンニングする。数回のパンニング後、ファージライブラリーは、対応する抗原に特異的に結合し、その中から単一のクローニングを選択し、配列分析を実行する。
ファージディスプレイ技術は、TCR高親和性変異体ライブラリーを生成して、高親和性変異体をスクリーニングする手段である。Liら((2005)Nature Biotech 23(3):349―354)によって説明されたTCRファージディスプレイおよびスクリーニング方法を、実施例1における一本鎖TCRテンプレートに応用する。当該テンプレート鎖のCDR領域を突然変異させることにより、高親和性TCRのライブラリーを構築して、パンニングする。数回のパンニング後、ファージライブラリーは、対応する抗原に特異的に結合し、その中から単一のクローニングを選択し、配列分析を実行する。
実施例3のBIAcore方法を使用して、TCR分子とKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との相互作用を分析し、親和性および/または結合半減期が野生型TCRの少なくとも2倍である高親和性TCRをスクリーニングし、即ち、スクリーニングされた高親和性TCRがKASEKIFYV―HLA―A0201複合体に結合する解離平衡定数KDは、野生型TCRがKASEKIFYV―HLA―A0201複合体に結合する解離平衡定数KDの半分以下であり、結果は、以下の表3に示されたとおりである。上記方法を使用して検出された参照TCRとKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との相互作用のKD値は、30.1μMであり、その相互作用の曲線は、図12に示されたとおりであり、即ち、野生型TCRとKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との相互作用のKD値も、30.1μM、即ち、3.01E―05Mである。
具体的には、SEQ ID NO:1に示される番号を使用すると、これらの高親和性TCR突然変異体のα鎖可変ドメインは、27S、28S、29S、52N、53M、54D、55M、94Q、95A、96G、97Tの一つまたは複数の群の部位のアミノ酸で突然変異が発生し、および/またはSEQ ID NO:2に示される番号を使用すると、これらの高親和性TCR突然変異体のβ鎖可変ドメインは、49S、50V、51G、52E、94S、95S、96L、97E、100Y、101E、102Q、103Yの一つまたは複数の群の部位で突然変異が発生する。
より具体的には、SEQ ID NO:1に示される番号を使用すると、これらの高親和性TCRα鎖可変ドメインは、27Kまたは27Pまたは27Rまたは27T、28Mまたは28W、29A、52Y、53Q、54Sまたは54T、55EまたはT、94Aまたは94Dまたは94Eまたは94Kまたは94Nまたは94Rまたは94Sまたは94T、95Sまたは95V、96Hまたは96Qまたは96Tおよび97Sからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、および/またはSEQ ID NO:2に示される番号を使用すると、これらの高親和性TCRβ鎖可変ドメインは、49H、50Dまたは50L、51Eまたは51W、52Lまたは52V、94A、95D、96Iまたは96V、97Qまたは97T、100F、101Iまたは101Pまたは101V、102Kまたは102Lまたは102Mまたは102V、103Aまたは103Eまたは103Iまたは103Lまたは103Nまたは103Qまたは103Rまたは103Sまたは103Tまたは103Vからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
高親和性一本鎖TCRα鎖可変ドメイン(SEQ ID NO:9~32)およびβ鎖可変ドメイン(SEQ ID NO:32~59)の具体的なアミノ酸配列は、それぞれ図5(1)~(24)および図6(1)~(27)に示されたとおりである。
実施例5.高親和性αβヘテロ二量体TCRの生成
実施例4でスクリーニングされた高親和性一本鎖TCRのCDR領域の突然変異は、αβヘテロ二量体TCRの可変ドメインに対応する部位に導入され、BIAcoreを通じて、KASEKIFYV―HLA―A0201複合体との親和性を検出する。上記CDR領域における高親和性突然変異点の導入は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発の方法を採用する。上記野生型TCRのα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図1a(SEQ ID NO:1)および1b(SEQ ID NO:2)に示されたとおりである。
実施例4でスクリーニングされた高親和性一本鎖TCRのCDR領域の突然変異は、αβヘテロ二量体TCRの可変ドメインに対応する部位に導入され、BIAcoreを通じて、KASEKIFYV―HLA―A0201複合体との親和性を検出する。上記CDR領域における高親和性突然変異点の導入は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発の方法を採用する。上記野生型TCRのα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図1a(SEQ ID NO:1)および1b(SEQ ID NO:2)に示されたとおりである。
より安定した可溶性TCRを得て、TCRとKASEKIFYV―HLA A0201複合体との間の結合親和性および/または結合半減期をより容易に評価するために、αβヘテロ二量体TCRは、α鎖およびβ鎖の定常領域にそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するTCRであり得ることに留意されたく、本実施例でシステイン残基を導入した後、TCRα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図8a(SEQ ID NO:62)および8b(SEQ ID NO:63)に示されたとおりであり、導入されたシステイン残基は、太字で表される。
「分子グローニング-実験マニュアル」(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第3版、SambrookおよびRussell)で記載された標準方法を通じて、発現されるTCRα鎖およびβ鎖の細胞外配列遺伝子を合成した後、それぞれ発現ベクターpET28a+(Novagene)に挿入され、アップストリームおよびダウンストリームのクローニング部位は、それぞれNcoIおよびNotIである。CDR領域の突然変異は、当業者に周知のオーバーラップPCR(overlap PCR)によって導入される。挿入フラグメントは、シーケンシングによって確認される。
実施例6.αβヘテロ二量体TCRの発現、再生および精製
TCRα鎖およびβ鎖の発現ベクターをそれぞれ化学的形質転換法によって発現細菌BL21(DE3)に形質転換し、細菌をLB培養液で増殖させ、OD600=0.6である場合、最終濃度0.5mM IPTGで誘導し、BugBuster Mix(Novagene)を通じてTCRのα鎖およびβ鎖を発現した後に形成された封入体を抽出し、BugBuster溶液で複数回繰り返して洗浄し、最後に封入体を6Mの塩酸グアニジン、10mMのジチオスレイトール(DTT)、10mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、20mMのトリス(pH8.1)に溶解させる。
TCRα鎖およびβ鎖の発現ベクターをそれぞれ化学的形質転換法によって発現細菌BL21(DE3)に形質転換し、細菌をLB培養液で増殖させ、OD600=0.6である場合、最終濃度0.5mM IPTGで誘導し、BugBuster Mix(Novagene)を通じてTCRのα鎖およびβ鎖を発現した後に形成された封入体を抽出し、BugBuster溶液で複数回繰り返して洗浄し、最後に封入体を6Mの塩酸グアニジン、10mMのジチオスレイトール(DTT)、10mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、20mMのトリス(pH8.1)に溶解させる。
溶解後のTCRα鎖およびβ鎖は、5Mの尿素、0.4Mのアルギニン、20mMのトリス(pH8.1)、3.7mMのシスタミン、6.6mMのβ―mercapoethylamine(4℃)を1:1の質量比ですばやく混合され、最終濃度は、60mg/mLである。混合後、溶液を10倍量の脱イオン水(4℃)に入れて透析し、12時間後、脱イオン水を緩衝液(20mMのトリス、pH8.0)に交換して、引き続き4℃で12時間透析する。透析完了後、溶液を0.45μMのフィルターメンブレンでろ過した後、陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP、5ml、GE Healthcare)で精製する。溶出ピークは、再生に成功したαおよびβ二量体のTCRを含み、SDS―PAGEゲルによって確認される。次に、ゲルろ過クロマトグラフィー(HiPrep 16/60、Sephacryl S―100 HR、GE Healthcare)を通じてTCRをさらに精製する。精製されたTCRの純度は、SDS―PAGEによって90%を超えると測定され、濃度は、BCA法によって決定される。
実施例7.BIAcore分析結果
実施例3に記載の方法を使用して、高親和性CDR領域に導入されたαβヘテロ二量体TCRとKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との親和性を検出する。
実施例3に記載の方法を使用して、高親和性CDR領域に導入されたαβヘテロ二量体TCRとKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との親和性を検出する。
高親和性一本鎖TCRα鎖およびβ鎖からスクリーニングされたCDR領域を、それぞれ野生型TCRα鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1およびβ鎖可変ドメインのSEQ ID NO:2に対応する位置に移して、αβヘテロ二量体TCRを形成する。さらに、スクリーニングによって得られたCDR領域の突然変異部位を人工的に組み合わせて、αβヘテロ二量体TCRを形成し、得られた新しいTCRα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図9(1)~(24)および図10(1)~(27)に示されたとおりである。TCR分子のCDR領域が対応するpMHC複合体との親和性を决定するため、当業者は、高親和性突然変異点に導入されたαβヘテロ二量体TCRもKASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対する高親和性を有することを予期することができる。以下の表4に示されるように、実施例5に記載の方法を使用して発現ベクターを構築し、実施例6に記載の方法を使用して上記高親和性突然変異を導入したαβヘテロ二量体TCRに対して発現、再生および精製し、次にBIAcore T200を使用してKASEKIFYV―HLA―A0201複合体との親和性を測定する。
上記の表4から、CDR領域の突然変異点に導入されたαβヘテロ二量体TCRは、KASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対する高親和性を維持していることが分かる。前記ヘテロ二量体TCRの親和性は、KASEKIFYV―HLA―A0201複合体に対する野生型TCRの親和性の少なくとも2倍である。
実施例8.抗―CD3抗体と高親和性一本鎖TCRとの融合体の発現、再生および精製
本発明の高親和性一本鎖TCR分子を抗CD3抗体の一本鎖分子(scFv)と融合させて、融合分子を構築する。オーバーラップ(overlap)PCRの方法により、抗―CD3抗体と高親和性一本鎖TCR分子の遺伝子とを結合するプライマーを設計し、中央のリンカー(linker)をGGGGSに設計し、また、融合分子の遺伝子フラグメントに制限性エンドヌクレアーゼ部位NcoIおよびNotIを持たせる。PCR増幅生成物をNcoIおよびNotIで二重酵素消化し、NcoIおよびNotIで二重酵素消化したpET28aベクターに結合する。結合生成物をE.coli DH5αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートにコーティングし、37℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してPCRスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出して、E.coli BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用する。
本発明の高親和性一本鎖TCR分子を抗CD3抗体の一本鎖分子(scFv)と融合させて、融合分子を構築する。オーバーラップ(overlap)PCRの方法により、抗―CD3抗体と高親和性一本鎖TCR分子の遺伝子とを結合するプライマーを設計し、中央のリンカー(linker)をGGGGSに設計し、また、融合分子の遺伝子フラグメントに制限性エンドヌクレアーゼ部位NcoIおよびNotIを持たせる。PCR増幅生成物をNcoIおよびNotIで二重酵素消化し、NcoIおよびNotIで二重酵素消化したpET28aベクターに結合する。結合生成物をE.coli DH5αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートにコーティングし、37℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してPCRスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出して、E.coli BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用する。
融合タンパク質の発現
標的遺伝子を含む発現プラスミドを大腸菌株BL21(DE3)に形質転換し、LBプレート(カナマイシン50μg/ml)にコーティングして、37℃で一晩培養する。翌日、クローニングを選択して10mLのLB液体培地(カナマイシン50μg/ml)に接種して、2~3時間培養し、体積比1:100で1LのLB培地(カナマイシン50μg/ml)に接種し、引き続きOD600が0.5~0.8になるまで培養し、次に最終濃度が0.5mMであるIPTGを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。4時間誘導した後、6000rpmで10分間遠心分離して細胞を取得する。PBS緩衝液で菌体を1回洗浄し、菌体を分注し、200mLの細菌培養物に相当する菌体を選択して、5mlのBugBuster Master Mix(Novagen)で細菌を熱分解し、6000gで15分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で4回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えば、PBS等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を8Mの尿素を含むトリス緩衝溶液に溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、―80℃冷凍保存する。
標的遺伝子を含む発現プラスミドを大腸菌株BL21(DE3)に形質転換し、LBプレート(カナマイシン50μg/ml)にコーティングして、37℃で一晩培養する。翌日、クローニングを選択して10mLのLB液体培地(カナマイシン50μg/ml)に接種して、2~3時間培養し、体積比1:100で1LのLB培地(カナマイシン50μg/ml)に接種し、引き続きOD600が0.5~0.8になるまで培養し、次に最終濃度が0.5mMであるIPTGを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。4時間誘導した後、6000rpmで10分間遠心分離して細胞を取得する。PBS緩衝液で菌体を1回洗浄し、菌体を分注し、200mLの細菌培養物に相当する菌体を選択して、5mlのBugBuster Master Mix(Novagen)で細菌を熱分解し、6000gで15分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で4回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えば、PBS等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を8Mの尿素を含むトリス緩衝溶液に溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、―80℃冷凍保存する。
融合タンパク質のリフォールディング
―80℃の超低温冷蔵庫から約10mgの封入体を取り出して解凍し、最終濃度が10mMになるまでジチオスレイトール(DTT)を加え、37℃で30分間~1時間インキュベートして、ジスルフィド結合が完全に開くように確保する。次に封入体サンプル溶液をそれぞれ200mLの4℃予冷リフォールディング緩衝液(100mMのトリス pH8.1、400mMのL―アルギニン、2mMのEDTA、5Mの尿素、6.5mMのβ―メルカプトエチルアミン、1.87mMのシスタミン)に滴下し、4℃で約30分間ゆっくりと攪拌する。再生溶液を8倍量の予冷したH2Oで16~20時間透析する。再び8倍量の10mMのトリス pH8.0で2回透析し、4℃で引き続き約8時間透析し、透析後、サンプルをろ過して、次のように精製する。
―80℃の超低温冷蔵庫から約10mgの封入体を取り出して解凍し、最終濃度が10mMになるまでジチオスレイトール(DTT)を加え、37℃で30分間~1時間インキュベートして、ジスルフィド結合が完全に開くように確保する。次に封入体サンプル溶液をそれぞれ200mLの4℃予冷リフォールディング緩衝液(100mMのトリス pH8.1、400mMのL―アルギニン、2mMのEDTA、5Mの尿素、6.5mMのβ―メルカプトエチルアミン、1.87mMのシスタミン)に滴下し、4℃で約30分間ゆっくりと攪拌する。再生溶液を8倍量の予冷したH2Oで16~20時間透析する。再び8倍量の10mMのトリス pH8.0で2回透析し、4℃で引き続き約8時間透析し、透析後、サンプルをろ過して、次のように精製する。
融合タンパク質の第1段階の精製
透析されたリフォールディング物(10mMのトリス pH8.0)は、POROS HQ/20陰イオン交換クロマトグラフィープレパックカラム(Applied Biosystems)を使用して、AKTA精製器(GE Healthcare)で0~600mMのNaClで勾配溶出する。クマシーブリリアントブルー染色されたSDS―PAGEで各成分を分析して、合併する。
透析されたリフォールディング物(10mMのトリス pH8.0)は、POROS HQ/20陰イオン交換クロマトグラフィープレパックカラム(Applied Biosystems)を使用して、AKTA精製器(GE Healthcare)で0~600mMのNaClで勾配溶出する。クマシーブリリアントブルー染色されたSDS―PAGEで各成分を分析して、合併する。
融合タンパク質の第2段階の精製
この段階の精製のために、第1段階で精製および合併されたサンプル溶液を濃縮し、PBS緩衝液で事前に平衡化したSuperdex 75 10/300GLゲルろ過クロマトグラフィープレパックカラム(GE Healthcare)を使用して、融合タンパク質を精製し、クマシーブリリアントブルーで染色されたSDS―PAGEでピークの成分を分析して、合併する。
この段階の精製のために、第1段階で精製および合併されたサンプル溶液を濃縮し、PBS緩衝液で事前に平衡化したSuperdex 75 10/300GLゲルろ過クロマトグラフィープレパックカラム(GE Healthcare)を使用して、融合タンパク質を精製し、クマシーブリリアントブルーで染色されたSDS―PAGEでピークの成分を分析して、合併する。
実施例9.抗―CD3抗体と高親和性αβヘテロ二量体TCRとの融合体の発現、再生および精製
抗―CD3の一本鎖抗体(scFv)をαβヘテロ二量体TCRと融合させて、融合分子を調製する。抗―CD3のscFvは、TCRβ鎖と融合し、当該TCRβ鎖は、上記高親和性αβヘテロ二量体TCRβ鎖可変ドメインのいずれかを含むことができ。融合分子のTCRα鎖は、上記高親和性αβヘテロ二量体TCRα鎖可変ドメインのいずれかを含むことができる。
抗―CD3の一本鎖抗体(scFv)をαβヘテロ二量体TCRと融合させて、融合分子を調製する。抗―CD3のscFvは、TCRβ鎖と融合し、当該TCRβ鎖は、上記高親和性αβヘテロ二量体TCRβ鎖可変ドメインのいずれかを含むことができ。融合分子のTCRα鎖は、上記高親和性αβヘテロ二量体TCRα鎖可変ドメインのいずれかを含むことができる。
融合分子発現ベクターの構築
1.α鎖発現ベクターの構築
αβヘテロ二量体TCRα鎖を持つ標的遺伝子をNcoIおよびNotIで二重酵素消化し、NcoIおよびNotIで二重酵素消化したpET28aベクターに結合する。結合生成物をE.coli DH5αに形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートにコーティングし、37℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してPCRスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出し、E.coli Tuner(DE3)に形質転換して、発現に使用する。
1.α鎖発現ベクターの構築
αβヘテロ二量体TCRα鎖を持つ標的遺伝子をNcoIおよびNotIで二重酵素消化し、NcoIおよびNotIで二重酵素消化したpET28aベクターに結合する。結合生成物をE.coli DH5αに形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートにコーティングし、37℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してPCRスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出し、E.coli Tuner(DE3)に形質転換して、発現に使用する。
2.抗―CD3(scFv)―β鎖発現ベクターの構築
オーバーラップ(overlap)PCRの方法により、プライマーを設計して、抗―CD3 scFvと高親和性ヘテロ二量体TCRβ鎖遺伝子とを結合し、中央のリンカー(linker)は、GGGGSであり、また、抗―CD3のscFvと高親和性ヘテロ二量体TCRβ鎖との融合タンパク質の遺伝子フラグメントは、制限性エンドヌクレアーゼ部位NcoI(CCATGG)およびNotI(GCGGCCGC)を備える。PCR増幅生成物をNcoIおよびNotIで二重酵素消化し、NcoIおよびNotIで二重酵素消化したpET28aベクターに結合する。結合生成物をE.coli DH5αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートにコーティングし、37℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してPCRスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出して、E.coli Tuner(DE3)コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用される。
オーバーラップ(overlap)PCRの方法により、プライマーを設計して、抗―CD3 scFvと高親和性ヘテロ二量体TCRβ鎖遺伝子とを結合し、中央のリンカー(linker)は、GGGGSであり、また、抗―CD3のscFvと高親和性ヘテロ二量体TCRβ鎖との融合タンパク質の遺伝子フラグメントは、制限性エンドヌクレアーゼ部位NcoI(CCATGG)およびNotI(GCGGCCGC)を備える。PCR増幅生成物をNcoIおよびNotIで二重酵素消化し、NcoIおよびNotIで二重酵素消化したpET28aベクターに結合する。結合生成物をE.coli DH5αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートにコーティングし、37℃で転倒して一晩培養し、陽性クローニングを選択してPCRスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出して、E.coli Tuner(DE3)コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用される。
融合タンパク質の発現、再生および精製
発現プラスミドをそれぞれE.coli Tuner(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、LBプレート(カナマイシン50μg/mL)にコーティングして、37℃で一晩培養する。翌日、クローニングを選択して10mLのLB液体培地(カナマイシン50μg/mL)に接種して、2~3時間培養し、体積比1:100で1LのLB培地に接種し、引き続きOD600が0.5~0.8になるまで培養し、最終濃度が1mMであるIPTGを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。4時間誘導した後、6000rpmで10分間遠心分離して細胞を取得する。PBS緩衝液で菌体を1回洗浄し、菌体を分注し、200mLの細菌培養物に相当する菌体を選択して、5mLのBugBuster Master Mix(Merck)で細菌を熱分解し、6000gで15分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で4回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えば、PBS等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を6Mの塩酸グアニジン、10mMのジチオスレイトール(DTT)、10mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、20mMのトリス、pH8.1を含む緩衝溶液で溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、―80℃で冷凍保存する。
発現プラスミドをそれぞれE.coli Tuner(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、LBプレート(カナマイシン50μg/mL)にコーティングして、37℃で一晩培養する。翌日、クローニングを選択して10mLのLB液体培地(カナマイシン50μg/mL)に接種して、2~3時間培養し、体積比1:100で1LのLB培地に接種し、引き続きOD600が0.5~0.8になるまで培養し、最終濃度が1mMであるIPTGを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。4時間誘導した後、6000rpmで10分間遠心分離して細胞を取得する。PBS緩衝液で菌体を1回洗浄し、菌体を分注し、200mLの細菌培養物に相当する菌体を選択して、5mLのBugBuster Master Mix(Merck)で細菌を熱分解し、6000gで15分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で4回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えば、PBS等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を6Mの塩酸グアニジン、10mMのジチオスレイトール(DTT)、10mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、20mMのトリス、pH8.1を含む緩衝溶液で溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、―80℃で冷凍保存する。
溶解後のTCRα鎖および抗―CD3(scFv)―β鎖は、2:5の質量比で5Mの尿素(urea)、0.4MのL―アルギニン(L―arginine)、20mMのトリス pH8.1、3.7mMのシスタミン、6.6mMのβ―mercapoethylamine(4℃)にすばやく混合し、α鎖および抗―CD3(scFv)―β鎖の最終濃度は、それぞれ0.1mg/mLおよび0.25mg/mLである。
混合後、溶液を10倍量の脱イオン水(4℃)に入れて透析し、12時間後、脱イオン水を緩衝液(10mMのトリス、pH8.0)に交換して、引き続き4℃で12時間透析する。透析完了後の溶液は、0.45μMのフィルターメンブレンでろ過した後、陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP 5ml、GE healthcare)で精製する。溶出ピークは、再生に成功したTCRα鎖および抗―CD3(scFv)―β鎖二量体のTCRが含まれることをSDS―PAGEゲルを通じて確認される。次に、TCR融合分子を、サイズ排除クロマトグラフィー(S―100 16/60、GE healthcare)を通じてさらに精製し、陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP 5ml、GE healthcare)を通じて再び生成する。精製後のTCR融合分子の純度は、SDS―PAGEによって90%を超えることを測定され、濃度は、BCA法によって測定される。
実施例10.本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞の活性化機能実験(標的細胞は腫瘍細胞株である)
本実施例は、本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性効果を有することを検証する。ELISPOT実験によって、細胞における本発明の高親和性TCRの機能および特異性を検出する。
本実施例は、本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性効果を有することを検証する。ELISPOT実験によって、細胞における本発明の高親和性TCRの機能および特異性を検出する。
当業者は、細胞機能を検出するためにELISPOT実験を使用する方法に精通している。本発明のTCRでトランスフェクトされた健康なボランティアの血液から単離されたCD3+T細胞は、エフェクター細胞としてランダムに選択される。前記TCRおよびその番号は、表4から知り、それぞれTCR4(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:91)、TCR25(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:98)、TCR5(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:92)、TCR6(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:93)、TCR7(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:94)、TCR10(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:97)およびTCR1(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:88)であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型TCR(野生型TCRでトランスフェクトされた細胞)およびA6(他のTCRでトランスフェクトされた細胞)としてラベル付けされる。標的細胞株は、A375、K562―A2(A2過剰発現)、SW620―SSX2(SSX2過剰発現)、NCI―H1299―SSX2(SSX2過剰発現)、K562―A11(A11過剰発現)およびSW620細胞である。ここで、標的細胞株A375、K562―A2およびSW620―SSX2は、陽性腫瘍細胞株として使用され、NCI―H1299―SSX2、K562―A11およびSW620は、陰性腫瘍細胞株であり、対照として使用される。
まず、ELISPOTプレートを準備する。ELISPOTプレートをエタノールで活性化して、4℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で2時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、次のような試験の各成分をELISPOTプレートに加える。標的細胞は、2×104細胞/ウェルであり、エフェクター細胞は、103細胞/ウェル(トランスフェクトされた陽性率に従って計算する)であり、二つのデュープリケートウェルを設置する。一晩インキュベートする(37℃、5%CO2)。実験の2日に目に、プレートを洗浄し、かつ2次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー(ELISPOT READER system、AID20会社)でメンブレンに形成されたスポットをカウントする。
実験結果は、図14に示されたとおりであり、陽性標的細胞株の場合、本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞は、非常に良好な特異的活性化効果を有し、その機能は、野生型TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞の機能よりもはるかに優れ、他のTCRで形質導入された細胞は、ほとんど活性化を示さない。
実施例11.本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞の活性化機能実験(標的細胞はT2ロード関連短いペプチドである)
本実施例は、本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞が人工的に調製された標的細胞に対して非常に良好な特異的活性化効果を有することを別の態様で検証する。当業者は、ELISPOT実験を使用して細胞の活性化機能を検出する方法に精通している。本発明のTCRでトランスフェクトされた健康なボランティアの血液から単離されたCD8+T細胞は、エフェクター細胞としてランダムに選択される。前記TCRおよびその番号は、表4から知り、それぞれTCR7(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:94)、TCR8(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:95)、TCR26(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:99)、TCR9(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:96)およびTCR10(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:97)であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型TCR(野生型TCRでトランスフェクトされた細胞)およびA6(他のTCRでトランスフェクトされた細胞)としてラベル付けされる。本実施例の標的細胞は、特異的短いペプチドがロードされたT2細胞である。
本実施例は、本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞が人工的に調製された標的細胞に対して非常に良好な特異的活性化効果を有することを別の態様で検証する。当業者は、ELISPOT実験を使用して細胞の活性化機能を検出する方法に精通している。本発明のTCRでトランスフェクトされた健康なボランティアの血液から単離されたCD8+T細胞は、エフェクター細胞としてランダムに選択される。前記TCRおよびその番号は、表4から知り、それぞれTCR7(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:94)、TCR8(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:95)、TCR26(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:99)、TCR9(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:96)およびTCR10(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:97)であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型TCR(野生型TCRでトランスフェクトされた細胞)およびA6(他のTCRでトランスフェクトされた細胞)としてラベル付けされる。本実施例の標的細胞は、特異的短いペプチドがロードされたT2細胞である。
まず、ELISPOTプレートを準備する。ELISPOTプレートをエタノールで活性化して、4℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で2時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、次のような試験の各成分をELISPOTプレートに加える。短いペプチド(ELISPOTウェルプレートの最終濃度1×10―13g/ml~1×10―8g/mlの合計六つの勾配)、標的細胞は、2×104細胞/ウェルであり、エフェクター細胞は、103細胞/ウェル(トランスフェクトされた陽性率に従って計算する)であり、二つのデュープリケートウェルを設置する。一晩インキュベートする(37℃、5%CO2)。実験の2日目に、プレートを洗浄し、かつ2次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー(ELISPOT READER system、AID20会社)でメンブレンに形成されたスポットをカウントする。
実験結果は、図15(a)~図15(e)に示されたとおりであり、本発明のTCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞は、特異的短いペプチドがロードされた標的細胞に対して非常に強い活性化効果を有し、機能は、野生型TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞の機能よりも有意に優れるが、他のTCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞は、標的細胞に対して活性化効果を有さない。
実施例12.本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞的IncuCyte殺傷機能実験
本実施例は、本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞が標的細胞に対して良好な特異的殺傷効果を有することを検証する。
本実施例は、本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞が標的細胞に対して良好な特異的殺傷効果を有することを検証する。
当業者は、細胞のリアルタイム増殖状態を記録するための非侵襲的方法である、細胞機能を検出するためにIncuCyte実験を使用する方法に精通している。本発明のTCRでトランスフェクトされたオーストラリアの胎児血清(Gibco、#10099―141)から単離されたPBL細胞をエフェクター細胞としてランダムに選択する。前記TCRおよびその番号は、表4から知り、それぞれTCR2(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:89)およびTCR1(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:88)であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型TCR(野生型TCRでトランスフェクトされた細胞)およびA6(他のTCRでトランスフェクトされた細胞)としてラベル付けされる。標的細胞株は、A375、SW620およびHCCC9810細胞である。ここで、標的細胞株A375は、陽性腫瘍細胞株であり、SW620およびHCCC9810は、陰性腫瘍細胞株であり、対照として使用される。
標的細胞を紹介して遠心分離し、フェノールレッドを含まないRPMI1640+10%FBSの完全培地に再懸濁し、1×104細胞/ウェルでカウントされ、標的細胞を96ウェルプレートに均一に播種し、37℃、5%CO2のインキュベーターに戻し、一晩インキュベートし、翌日、96ウェルプレートの培地を捨て、フェノールレッドを含まずに染料カスパーゼ(caspase)3/7試薬(reagent)を含むRPMI1640+10%FBS培地に交換して、染料の濃度が2滴/mlになるようにする。エフェクター細胞を準備し、遠心分離し、古い培地を捨て、フェノールレッドを含まない新しいRPMI1640+10%FBS培地に交換し、エフェクター細胞(1×104細胞/ウェル、トランスフェクトされた陽性率に従って計算する)および標的細胞がプレーティングされた実験群を共培養し、標的細胞のみを有する対照群には、各ウェルに同量の完全培地を補充し、Incucyte検出専用のリアルタイムダイナミック生細胞イメージング分析器―IncuCyte ZooMにプレートを置き、30分間インキュベートした後、リアルタイムで観察および写真を撮り、IncuCyte ZooM 2016Aを使用して、テスト結果を処理し、データを分析して導出する。
図16a~図16cの検出結果に示されるように、本発明のTCRで形質導入された細胞は、陽性標的に対して非常に強い殺傷効果を有し、機能は、野生型TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞の機能よりも有意に優れ、陰性標的細胞に対して、基本的に殺傷効果を有さず、他のTCRで形質導入された細胞は、陽性標的細胞に対して基本的に殺傷効果を有さない。
実施例13.本発明の高親和性TCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞のLDH殺傷機能の実験
本実施例は、非放射性細胞毒性実験を使用して、LDHの放出を測定することにより、本発明のTCRで形質導入された細胞の殺傷機能を検証する。当該試験は、51Cr放出細胞毒性試験の比色代替試験であり、細胞熱分解後に放出した乳酸脱水素酵素(LDH)を定量測定する。30分間のカップリング酵素反応を使用して、培地に放出されたLDHを検出し、酵素反応において、LDHは、テトラゾリウム塩(INT)を赤色のホルマザン(formazan)に形質転換することができる。生成された赤色の生成物の量は、熱分解された細胞の数に比例する。標準の96ウェルプレートリーダーを使用して、490nmでの可視光吸光値データを収集することができる。
本実施例は、非放射性細胞毒性実験を使用して、LDHの放出を測定することにより、本発明のTCRで形質導入された細胞の殺傷機能を検証する。当該試験は、51Cr放出細胞毒性試験の比色代替試験であり、細胞熱分解後に放出した乳酸脱水素酵素(LDH)を定量測定する。30分間のカップリング酵素反応を使用して、培地に放出されたLDHを検出し、酵素反応において、LDHは、テトラゾリウム塩(INT)を赤色のホルマザン(formazan)に形質転換することができる。生成された赤色の生成物の量は、熱分解された細胞の数に比例する。標準の96ウェルプレートリーダーを使用して、490nmでの可視光吸光値データを収集することができる。
当業者は、LDH放出実験を使用して細胞機能を検出するための方法に精通している。本発明のTCRでトランスフェクトされた健康なボランティアの血液から単離されたCD3+T細胞は、エフェクター細胞としてランダムに選択される。前記TCRおよびその番号は、表4から知り、それぞれTCR2(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:89)およびTCR1(α鎖可変ドメインのSEQ ID NO:1、β鎖可変ドメインのSEQ ID NO:88)であり、対照群のエフェクター細胞は、野生型TCR(野生型TCRでトランスフェクトされた細胞)およびA6(他のTCRでトランスフェクトされた細胞)としてラベル付けされる。標的細胞株HLF―A2(A2過剰発現)、HUH―1―A2(A2過剰発現)、HT1080―A2(A2過剰発現)、IM9およびHCCC9810細胞。ここで、HLF―A2、HUH―1―A2およびHT1080―A2は、陽性腫瘍細胞株であり、IM9およびHCCC9810は、陰性腫瘍細胞株であり、対照として使用される。
まず、LDHプレートを準備する。実験の初日に、試験の各成分を次のような順序でプレートに加える。標的細胞株3×104個細胞/ウェル、エフェクター細胞3×104個細胞/ウェル(トランスフェクトされた陽性率に従って計算する)、三つのデュープリケートウェルを設置する。エフェクター細胞の自発的ウェル、標的細胞の自発的ウェル、標的細胞の最大ウェル、倍量補正対照ウェルおよび培地バックグラウンド対照ウェルを同時に設置する。一晩インキュベートする(37℃、5%CO2)。実験の2日目に、発色を検出し、反応終了後、マイクロプレートリーダー(Bioteck)を用いて490nmでの吸光値を記録する。
実験結果は、図17に示されたとおりであり、本発明のTCRで形質導入された細胞は、陽性標的細胞に対して非常に強い殺傷効果を有し、殺傷効果は、野生型TCRで形質導入された細胞よりもはるかに高いが、他のTCRで形質導入された細胞は、陽性標的細胞に対して基本的に殺傷効果を有さない。
実施例14.本発明の高親和性TCRと抗―CD3抗体との融合タンパク質の機能実験
本実施例は、本発明の高親和性TCRト抗―CD3抗体との融合タンパク質がエフェクター細胞をリダイレクトすることができ、良好な活性化効果を有することを検証する。
本実施例は、本発明の高親和性TCRト抗―CD3抗体との融合タンパク質がエフェクター細胞をリダイレクトすることができ、良好な活性化効果を有することを検証する。
当業者は、ELISPOT実験を使用して細胞機能を検出するための方法を精通している。本実施例のIFN―γ ELISPOT実験で使用されるエフェクター細胞は、健康なボランティアの血液から単離されたCD8+T細胞であり、標的細胞株は、T2、A375、U251、SW620―SSX2(SSX2過剰発現)、SW620およびK562―A11(A11過剰発現)細胞であり、ここで、A375、U251およびSW620―SSX2は、関連する抗原を発現し、T2、SW620およびK562―A11は、関連する抗原を発現しない。本発明の高親和性TCRをランダムに選択し、実施例8に記載のように融合タンパク質を調製し、それぞれ融合タンパク質1(α鎖SEQ ID NO:78、β鎖SEQ ID NO:105)、融合タンパク質2(α鎖SEQ ID NO:79、β鎖SEQ ID NO:105)、融合タンパク質3(α鎖SEQ ID NO:81、β鎖SEQ ID NO:105)および融合タンパク質4(α鎖SEQ ID NO:83、β鎖SEQ ID NO:105)と名付けられる。
まず、ELISPOTプレートを準備する。ELISPOTプレートをエタノールで活性化して、4℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で2時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、次のような試験の各成分をELISPOTプレートに加える。融合タンパク質(ELISPOTウェルプレートの最終濃度1×10―13g/ml~1×10―8g/mlの合計六つの勾配)、標的細胞株(2×104細胞/ウェル)、エフェクター細胞(4×103エフェクター細胞/ウェル)を対応するウェルに加え、二つのデュープリケートウェルを設置する。一晩インキュベートする(37℃、5%CO2)。実験の2日目に、プレートを洗浄し、かつ2次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー(ELISPOT READER system、AID20会社)を使用して、メンブレン上に形成されたスポットをカウントする。
実験結果は、図18a~18dに示されたとおりであり、本発明の高親和性TCRと抗―CD3抗体との融合タンパク質は、T2をロードした特異的短いペプチドを十分に識別および結合し、エフェクター細胞をリダイレクトすることができ、非常に良好な活性化効果を有し、T2に対して、ローディングは非特異的であるか、またはロードしない場合は、基本的に反応しない。
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
Claims (32)
- T細胞受容体(TCR)であって、
前記TCRは、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合する活性を有し、また、前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記T細胞受容体。 - KASEKIFYV―HLA A0201複合体に対する前記TCRの親和性は、野生型TCRの少なくとも2倍であることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、可溶性であることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、αβヘテロ二量体TCRであり、好ましくは、前記TCRは、α鎖定常領域配列TRAC*01およびβ鎖定常領域配列TRBC1*01またはTRBC2*01を有することを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αの三つのCDR領域を含み、ここで、CDR1αのアミノ酸配列は、DSSSTYであり、CDR2αのアミノ酸配列は、IFSNMDMであり、CDR3αのアミノ酸配列は、AEPNQAGTALIであることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βの三つのCDR領域を含み、ここで、CDR1βのアミノ酸配列は、MNHEYであり、CDR2βのアミノ酸配列は、SVGEGTであることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βの三つのCDR領域を含み、CDR3βの参照アミノ酸配列は、ASSSLEDPYEQYであり、前記TCRは、CDR3βにおいて少なくとも一つの突然変異を含み、好ましくは、突然変異の数は、四つであることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1であることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRα鎖可変ドメインは、CDR1α、CDR2αおよびCDR3αの三つのCDRを含み、CDR1αのアミノ酸配列は、DSSSTY、DPWATY、DRMSTY、DTMSTYおよびDKMSTYからなる群から選択され、および/またはCDR2αのアミノ酸配列は、IFSNMDM、IFSYQST、IFSYMTEおよびIFSYQSEからなる群から選択され、および/またはCDR3αのアミノ酸配列は、AEPNQAGTALI、AEPNNSHSALI、AEPNASHSALI、AEPNKSHSALI、AEPNSSHSALIおよびAEPNQSHSALIからなる群から選択されることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βの三つのCDR領域を含み、ここで、前記TCRのCDR3βは、ASSSLEDPFVKR、ASADVQDPYEQYおよびASADIQDPYEQYからなる群から選択されることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRβ鎖可変ドメインは、CDR1β、CDR2βおよびCDR3βの三つのCDR領域を含み、ここで、前記TCRのCDR2βは、SVGEGT、SLEVGT、HDWLGTおよびSDWLGTからなる群から選択されることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、(i)その膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含み、ここで、(i)および(ii)は、両方ともTCR鎖の可変ドメイン、および、定常ドメインの少なくとも一部を含むことを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれ、好ましくは、前記TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1のThr48およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer57、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer77、
TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer17、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAsp59、
TRAC*01エクソン1のSer15およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu15、
TRAC*01エクソン1のArg53およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer54、
TRAC*01エクソン1のPro89およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAla19、
およびTRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu20からなる群から選択される一つまたは複数の群の部位を置換することを特徴とする
請求項16に記載のTCR。 - 前記TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1および64~87から選択され、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:88~114から選択されることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、一本鎖TCRであることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインからなる一本鎖TCRであり、前記α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインは、柔軟な短いペプチド配列(linker)によってリンクされることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 上記の請求項のいずれか1項に記載のTCRであって、
前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC―末端またはN―末端には、コンジュゲートが結合され、好ましくは、前記コンジュゲートは、検出可能なマーカーであり、より好ましくは、前記コンジュゲートは、抗―CD3抗体であることを特徴とする、前記上記の請求項のいずれか1項に記載のTCR。 - 多価TCR複合体であって、
前記TCR複合体は、少なくとも二つのTCR分子を含み、そのうちの少なくとも一つのTCR分子は、前記請求項のいずれか1項に記載のTCRであることを特徴とする、前記多価TCR複合体。 - 核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項1~22のいずれか1項に記載のTCRをコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする、前記核酸分子。 - ベクターであって、
前記ベクターは、請求項24に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、前記ベクター。 - 宿主細胞であって、
前記宿主細胞は、請求項27に記載のベクターを含むか、または染色体には外因性の請求項24に記載の核酸分子が組み込まれることを特徴とする、前記宿主細胞。 - 単離された細胞であって、
前記細胞は、請求項1~22のいずれか1項に記載のTCRを発現することを特徴とする、前記単離された細胞。 - 医薬組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容される担体および請求項1~22のいずれか1項に記載のTCR、または請求項23に記載のTCR複合体、または請求項27に記載の細胞を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。 - 疾患を治療する方法であって、
請求項1~22のいずれか1項に記載のTCR、または請求項23に記載のTCR複合体、または請求項27に記載の細胞、または請求項28に記載の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与する段階を含むことを特徴とする、前記疾患を治療する方法。 - 請求項1~22のいずれか1項に記載のT細胞受容体、請求項23に記載のTCR複合体または請求項27に記載の細胞の使用であって、
腫瘍を治療するための薬物の調製に用いられることを特徴とする、前記使用。 - 腫瘍を治療するための薬物として使用される、請求項1~22のいずれか1項に記載のT細胞受容体、請求項23に記載のTCR複合体または請求項27に記載の細胞。
- 請求項1~22のいずれか1項に記載のT細胞受容体を調製する方法であって、
(i)請求項26に記載の宿主細胞を培養することにより、請求項1~22のいずれか1項に記載のT細胞受容体を発現する段階、および
(ii)前記T細胞受容体を単離または精製する段階を含むことを特徴とする、前記請求項1~22のいずれか1項に記載のT細胞受容体を調製する方法。
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