CN104185642A - 轻链桥连的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于临床治疗的具有免疫激活性质的新形式单体双特异性融合蛋白。双特异性融合蛋白包括对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域；衍生自免疫球蛋白的轻链或重链的恒定区的桥连结构域，该免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域。双特异性融合蛋白还可以包括融合到桥连结构域的N-端或C-端的接头。第一靶向结构域融合到桥连结构域并且第二靶向结构域融合到桥连结构域或接头上。接头可以包括GGGGS序列。感兴趣的第一靶标可以是CD20、Her2/neu或EpCAM，并且第二靶向结构域是T-淋巴细胞激活结构域。

Description

轻链桥连的双特异性抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月27日提交的临时申请系列号61/580,491的优先权，其公开通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及双特异性或多重特异性生物分子，诸如双特异性抗体的制备方法及其产物。
发明背景
结合具有不同功能的生物分子可能产生具有需要或改良性质的新分子。例如，在多特异性抗体，包括双特异性抗体和双特异性肿瘤靶向T-淋巴细胞衔接子(engager)中的最新进展已经证明与单克隆抗肿瘤治疗相比，具有免疫激活性质的多重特异性分子经常在肿瘤治疗中递送增强的功效。
例如，双特异性抗体(BsAb)可以由来自不同抗体的两种不同结合结构域(即，可变区)的片段组成。两种不同的结合结构域可以结合两种不同类型的抗原。这些分子可以在临床治疗中有所应用，诸如肿瘤免疫治疗。对于这类应用，BsAbs可以被设计成同时结合细胞毒性细胞(使用受体如CD3(Kurbyimmunology(Kurby免疫学).San Francisco：W.H.Freeman.ISBN1-492-0211-4))和靶标如癌细胞(例如，癌细胞上的抗原)。
双特异性和多重特异性蛋白的构建包括多个蛋白结构域的融合。然而，这样的融合可能由于融合伙伴不同的生物和/或生理性质而造成融合伙伴之间的不相容。另外，生理限制，包括肾过滤或循环途径的渗透性，也可能挑战医学上可用的多重特异性肿瘤靶向分子的设计。
发明内容
本发明的实施方式涉及用于生物医学应用如临床治疗的具有免疫激活性质的新形式双特异性或多重特异性融合蛋白。这些蛋白包括通过桥连结构域连接的两个特异性结合结构域(靶向结构域)，桥连结构域可以包括一个或两个任选的接头。桥连结构域可以衍生自抗体的免疫球蛋白结构域，使得融合蛋白中的不同伙伴是相容的并且可以保留需要的生物性质。可以用作桥的免疫球蛋白结构域可包括轻链恒定区或重链恒定区。这样的融合蛋白可以被称为轻链桥连的抗体或重链桥连的抗体。
例如，本发明的实施方式所述的双特异性融合蛋白可以包括抗肿瘤生物标记，诸如CD20(Hybridoma.19832；17)、Her2/neu(Am J Clin Pathol 2003 120(suppl 1)；S53)或EpCAM(J.Immunol.1992 148(2)；590)，作为细胞靶向或生物分子靶向结构域的单链连接的Fv片段(ScFv)，作为桥的轻链恒定结构域，任选的接头(其可以省去)，和作为T-淋巴细胞激活结构域的抗-CD3 ScFv。这样的轻链桥连的双特异性免疫激活剂同时显示出对肿瘤表达的细胞靶标和T-淋巴细胞的结合特异性。结合两个靶标特异性地诱导对肿瘤靶标的T-淋巴细胞-介导的细胞毒作用。
除了上述的抗肿瘤ScFv示例以外，也可使用其他细胞-靶向结构域。这类其他分子可以具有对其他细胞靶标的特异性结合能力。除了T-淋巴细胞激活结构域以外，其他细胞靶向结构域的示例可以包括具有所需特异性的ScFv或毒素多肽、酶、激素、细胞因子、信号分子。此外，本发明的实施方式所述的融合蛋白可以在原核或真核细胞中表达。另外，ScFv的取向可以是轻链可变区连接到重链可变区上，或反之。这样的双特异性分子的应用包括药物应用，诸如载特定生物标记细胞的消耗治疗，诸如肿瘤治疗。另外，这样的分子可以在诊断应用中使用。
本发明的一个方面涉及双特异性融合蛋白。本发明的一个实施方式所述的双特异性融合蛋白可以包括对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域；衍生自免疫球蛋白的轻链或重链的恒定区的桥连结构域，该免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域。靶向结构域可以对靶标生物分子或细胞有特异性。
按照本发明的一些实施方式，双特异性融合蛋白还可以包括与桥连结构域的N-端或C-端融合的接头。第一靶向结构域融合到桥连结构域或接头上而第二靶向结构域融合到桥连结构域或接头上。接头可以包括GGGGS序列。感兴趣的第一靶标可以是CD20、Her2/neu、EpCAM等，并且第二靶向结构域可以是T-淋巴细胞激活结构域，诸如抗-CD3。
按照本发明的一些实施方式，双特异性融合蛋白可以省去上述的接头结构域，例如，其中对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域和对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域各直接融合到桥连结构域的两个末端。
按照本发明的一些实施方式，双特异性融合蛋白可以包括间插在第一靶向结构域和桥连结构域之间，以及桥连结构域和第二靶向结构域之间的一个或多个上述的接头。即，第一靶向结构域和第二靶向结构域都与接头单独融合，这些接头与桥连结构域的两个末端融合。
在任意的上述实施方式中，第一靶向结构域可以包括对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一ScFv，并且第二靶向结构域可以包括对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二ScFv。
在任意的上述实施方式中，第一ScFv和第二ScFv各自可以包括人免疫球蛋白序列。在上述实施方式中，第一ScFv可以包括对第一抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH，并且第二ScFv可以包括对第二抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH。
在任意上述实施方式中，接头可以包括一个或多个GGGGS(G4S)序列。例如，接头可以包括1个G4S序列、2个G4S序列(重复)、3个G4S序列等。另外，接头可以包括与G4S序列结合的其他氨基酸序列。例如，这类其他氨基酸序列可以包括铰链序列(例如，CPPCP)。
从下面的详述和所附权利要求书很容易了解本发明的其他方面和优点。
附图简要说明
图1A和图1B显示了说明本发明的实施方式所述的各种双特异性T-淋巴细胞激活剂的构建体的示意图。
图2A和图2B显示了本发明的实施方式所述来自真核和原核表达系统的轻链桥连双特异性T-淋巴细胞激活剂的表达和纯化。图2B显示了考马斯亮蓝染色(组图A)和由BL-21(DE3)pLysS表达的可溶蛋白上针对带His-标签的LCBTA的Western印迹(组图B)。两个组图中的泳道1和3是IPTG诱导前的提取物。两个组图中的泳道2和4是用IPTG诱导的提取物。泳道1和2表示Ka LCBTA-1的EpCAM靶向。泳道3和4表示Ka LCBTA-1的Her2/neu靶向。
图3A显示选择的肿瘤靶向单克隆抗体和轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的尺寸排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)分析。图3B显示SEC-HPLC分析轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的均匀性和它们的抗原结合活性以及产率的改善。
图4A和4B显示了本发明的实施方式所述的结合CD20+拉吉(Raji)淋巴瘤细胞、Her2/neu+BT474乳腺癌细胞、EpCAM+HT29结直肠癌细胞(图4A)和Jurkat淋巴瘤细胞的CD3(图4B)的不同肿瘤靶向轻链桥连的双特异性抗体的示例。
图5显示了本发明的实施方式所述的几个双特异性抗体的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴激活剂的瞬时表达的比较。
图6证明了La LCBTA和Ka LCBTA的体外血清稳定性分析。
图7显示在单克隆抗体和本发明的实施方式所述肿瘤靶向双特异性抗体(同时靶向EpCAM和Her2)的刺激之后外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子分泌概况的示例。
图8A显示了本发明的实施方式所述Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂对CD20+B-淋巴瘤(拉吉)的细胞毒性。图8B显示了本发明的实施方式所述Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂对Her2/neu+/EpCAM+结直肠癌(HT29)的细胞毒性。图8C显示了本发明的实施方式所述Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂对Her2/neu+/EpCAM+胰腺癌(Capan-1)的细胞毒性。
图9A显示由本发明的实施方式所述靶向CD20的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂根除肿瘤的移植研究。图9B显示由本发明的实施方式所述靶向Her2/neu的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂根除肿瘤的移植研究。图9C显示由本发明的实施方式所述靶向EpCAM的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂根除肿瘤的移植研究。
发明详述
本发明的实施方式涉及用于生物医学应用如临床治疗的具有免疫激活性质的新形式双特异性或多重特异性融合蛋白。本发明的实施方式所述的单体双特异性或多重特异性免疫激活分子可以指轻链桥连的双特异性免疫激活剂(LCBTA)，或更具体地指免疫球蛋白桥连的双特异性或多重特异性生物分子。本发明的实施方式所述的生物分子可以是双特异性的或多重特异性的。然而，为清楚起见，下面的说明书将这些分子称为“双特异性”分子。应理解这样提及“双特异性”旨在包括“双特异性”和“多重特异性”。
本发明的实施方式所述的双特异性分子可以包括连接两个靶向结构域的桥连结构域。本发明的实施方式所述的桥连结构域可以包括蛋白或肽，并且这两个靶向结构域可以分别连接桥连结构域的N-端和C-端。本发明的实施方式所述的这两个靶向结构域可以衍生自抗体的特异性结合结构域(即，可变区)。这两个靶向结构域之一可以是T-淋巴细胞-激活结构域，而另一个靶向结构域可以对靶标分子或细胞，诸如肿瘤细胞、肿瘤抗原、病毒、细菌等有特异性。
本发明的双特异性分子的示例可以包括下式(I)和(VI)中所示的那些，其中TgD是靶向结构域，BD是桥连结构域，TAD是T-淋巴细胞激活结构域，并且LNK是接头：
TgD - BD - TAD         式(I)
TAD - BD - TgD        式(II)
TgD - LNK - BD - TAD      式(III)
TAD - BD - LNK - TgD     式(IV)
TgD - LNK - BD - LNK - TAD    式(V)
TAD - LNK - BD - LNK - TgD    式(VI)
一些示例可以包括靶向结构域和桥连结构域之间的接头。一些示例可以包括T-淋巴细胞-激活结构域和桥连结构域之间的接头。一些示例可以包括靶向结构域和桥连结构域之间的接头和T-淋巴细胞-激活结构域和桥连结构域之间的另一个接头。
按照本发明的实施方式，靶向结构域(TD)(例如，肿瘤靶向结构域、抗原靶向结构域、生物分子靶向结构域等)可以衍生自抗体的可变区。抗体衍生的靶向结构域可以包括轻链可变区和重链可变区，其可以两种构型(取向)存在：(1)轻链可变区在N-端而重链可变区在C-端，或(2)重链可变区在N-端而轻链可变区在C-端。
在靶向结构域(例如，肿瘤靶向结构域)中，重链可变区和轻链可变区可以与接头连接，其可以包括任意合适的接头，诸如短肽片段。例如，本发明的实施方式所述的接头可以包括短肽，其通常包括小氨基酸残基或亲水氨基酸残基(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等)。这样的肽的一个示例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)。其他示例可以在序列中包含这些氨基酸的变换，诸如GGGSG、GGSGG、GSGGG或SGGGG。其他示例可以包括含有G或S以外的氨基酸残基的肽，诸如GGTGS、GTSPGG、GNGGGS等。本领域技术人员会理解许多常用的肽接头可以用于本发明的实施方式中。
按照本发明的实施方式，这样的短肽接头可以包括重复单元以增加接头长度。例如，一些接头可以包括2个G4S-重复的接头、3个G4S-重复的接头、或4个G4S-重复的接头。此外，一些“重复-样”接头可以包括不同肽序列的混合物，诸如G4S-GGSGG-G4S-SGGGG。
按照本发明的实施方式，桥连接头可以包括肽片段，优选衍生自抗体的片段。在优选的实施方式中，桥连结构域可以衍生自重链、轻链，具体地重链或轻链中的恒定区。例如，本发明的实施方式所述的桥可以衍生自轻链，诸如kappa(κ)链、lambda-2(λ-2)链、或lambda-5(λ-5)链(或替代轻链)。在一些实施方式中，桥可以包括衍生自轻链的区域或结构域，诸如kappa(κ)链、lambda-2(λ-2)链，或lambda-5(λ-5)链的恒定区。相似地，桥连结构域可以衍生自重链或重链的区域(例如，恒定区)。本文使用的术语“衍生自”是指桥连结构域与轻链或重链的结构域(例如，恒定区)的全长序列具有基本的同源性(例如，≥50％，优选≥70％，更优选≥80％，最优选≥90％)。
另外，按照本发明的实施方式，桥连结构域可以是模拟轻链恒定区的κ链、λ链、或λ-5(或替代轻链)的突变体，或κ链、λ链、或λ-5替代轻链的衍生物。本文使用的“突变体”是指保守性突变体或非保守性突变体。如本文所述，本发明的实施方式所述的突变体保留了用作桥连结构域的功能。本领域技术人员会理解保守性突变体包括用相似的氨基酸取代氨基酸并且通常会具有保持的生物活性或结构。保守性突变体可以包括1-50个氨基酸取代，优选1-30个氨基酸，更优选1-20个氨基酸，并且最优选1-10个氨基酸。非保守性突变体可能具有一个或多个氨基酸残基，例如1-50个氨基酸，优选1-30个氨基酸，更优选1-20个氨基酸，并且最优选1-10个氨基酸的删除、取代或插入。
按照本发明的一些实施方式，桥(或桥连结构域)可以与靶向结构域和T-淋巴细胞激活结构域直接连接。按照本发明的其他实施方式，可以在桥和靶向结构域或T-淋巴细胞激活结构域之间提供接头。按照本发明的其他实施方式，可以在桥和靶向结构域之间提供一个接头，并且在桥和T-淋巴细胞激活结构域之间提供第二个接头。
桥连结构域和靶向结构域或T-淋巴细胞激活结构域之间的接头可与上述的那些结构域内接头相似。例如，桥连结构域和靶向结构域或T-淋巴细胞激活结构域之间的接头可以包括G4S接头或G4S-重复接头(其可以是双重复、三重复等)。另外，如上述，接头可以包括其他氨基酸序列。
按照本发明的实施方式，T-淋巴细胞激活结构域可以用或不用间插结构域与桥连结构域的一个末端相连用于T-淋巴细胞激活。各种T-淋巴细胞激活分子为本领域已知，包括抗-CD3抗体(单克隆或多克隆)，或此类抗体的CD3-结合片段或配体或对4-1BB分子的抗体。例如，按照本发明的实施方式，T-淋巴细胞激活结构域可以包括针对CD3的单克隆抗体的可变区。在这样的实施方式中，可以在两个取向上使用可变区的重链和轻链：(1)轻链可变区位于N-端并且重链可变区位于C-端，或(2)重链可变区位于N-端并且轻链可变区位于C-端。
与靶向结构域的描述相似，接头可连接T-淋巴细胞结合结构域的重链可变区和轻链可变区。例如，这样的接头可以包括任意合适的氨基酸序列，诸如G4S或双、三或四G4S-重复的接头。另外，接头可以包括其他氨基酸序列。
本发明的双特异性分子可以用于靶向细胞或分子，同时激活T-淋巴细胞应答。用下面的工作实施例来说明这些分子的一些生物用途。
免疫球蛋白轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的产生
在第一组示例中，抗-CD20、抗-Her2/neu或抗-EpCAM ScFv(可变区的单链片段)用作细胞靶向结构域(CtD)，并且选择抗-CD3 ScFv作为T-淋巴细胞激活结构域(TAD)。所选的CtD和TAD通过桥连接，例如其可能包括衍生自抗体轻链或重链的免疫球蛋白结构域。这类桥的示例可以包括选自人免疫球蛋白恒定区的那些。这类选自人免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白链桥的具体示例可能包括，但不限于以下所示的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4：
·SEQ ID No.1：V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N NF Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T YS L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S FN R G E C
-人免疫球蛋白κ恒定区
·SEQ ID No.2：G Q P K A A P S V T L F P P S S E E L Q A N K A T L V C LI S D F Y P G A V T V A W K A D G S P V K A G V E T T T P S K Q S N NK Y A A S S Y L S L T P E Q W K S H R S Y S C Q V T H E G S T V E K TV A P T E C S
-人免疫球蛋白λ2恒定区
·SEQ ID No.3：V T H V F G S G T Q L T V L S Q P K A T P S V T L F P P S SE E L Q A N K A T L V C L Met N D F Y P G I L T V T W K A D G T P I T QG V E Met T T P S K Q S N N K Y A A S S Y L S L T P E Q W R S R R S Y SC Q V Met H E G S T V E K T V A P T E C S
-人免疫球蛋白λ5恒定区
·SEQ ID No.4：T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K DY F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S SV V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K A E P K S C
-人免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)
按照本发明的一些实施方式，CtD的C-端可以与所选桥(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定区的桥)的N-端融合。按照本发明的其他实施方式，CtD的C-端可以与所选的接头序列的N-端融合，并且该接头随后与所选桥(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定区的桥)的N-端融合。
在轻链桥的C-端，接头可以任选地与该桥的C-端融合。按照本发明的实施方式，接头可以包括任意合适的上述肽序列。例如，接头可以包括一个或多个GGGGS序列(G4S)，含有或不含其他序列(例如，铰链序列，CPPCP)。然后该构建体可以与TAD连接形成图1所示的双特异性分子。
如上述，本发明的一些实施方式可以在桥的N-端具有TAD，含有或不含间插接头，并且在桥的C-端具有CtD，含有或不含间插接头。此外，本领域技术人员会理解可以用针对其他靶标分子的其他特异性结合结构域取代CtD。
图1所示的LCBTA是二价(双特异性)分子，具有针对细胞靶标的一价特异性和针对T-淋巴细胞上的CD3分子的另一价特异性。该LCBTA可以在哺乳动物、真核或原核细胞中表达并纯化，例如通过轻链特异性亲和柱纯化至均一(图2)。SEC-HPLC(尺寸排阻HPLC)分析显示大多数的经纯化双特异性分子是单体形式(图3)。然而，ScFv的取向、结构域间接头的长度、ScFv结构域与桥连结构域的相容性、和/或翻译的效率可能影响双特异性分子的翻译和翻译后加工，其可能导致多聚体形成的增加和/或改变的生物功能(I和J，图3，表1)。
表1
除了取向、结构域间接头、结构域间相容性和翻译与翻译后修饰对单体或多聚体形成的影响以外，结构域内接头也可能影响双特异性分子的生物性质。如图3B所示，例如，包括G4SG4SG4S的结构域内接头的Ka Her2/neu靶向LCBTA-1经工程改造包括结构域内接头G4SG4S(Ka LCBTA-1-A)和G4SG4SG4SG4S(Ka LCBTA-1-B)。虽然对三种形式的SEC-HPLC和靶标结合分析显示出相似的结果，在最终的蛋白产率中发现了显著的变化。
参比双特异性抗体的构建
构建IgG-FL(免疫球蛋白G全长)双特异性抗体(BsAb)作为参比(参见图1)。该BsAb包括位于N-端的作为细胞靶向结构域(CtD)的全长抗-CD20单克隆抗体和位于C端的作为T-淋巴细胞-激活结构域(TAD)的两个抗-CD3ScFv。包括GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS肽，其中含两个接头(GGGGS或G4S)序列和铰链(CPPCP)序列的接头/铰链结构域可以插入到该参比IgG-FLBsAb的CtD和TAD之间(图1)。该IgG-FL BsAb是具有两个细胞靶标特异性结合位点和另两个CD3分子特异性结合位点的四价分子。
除了上述的IgG-FL BsAb以外，也构建了两个串联-重复BsAb作为参比。如图1所示，串联-重复-1具有位于N-端作为CtD的抗-CD20ScFv、紧跟CtD的C-端的GGGGS接头、和作为TAD的与接头C-端融合的抗-CD3 ScFv。串联-重复-2具有与串联-重复-1相反顺序的CtD和TAD，即，TAD位于接头的N-端而CtD位于接头的C-端。
结合试验
细胞靶标和T-淋巴细胞的结合特异性是双特异性分子治疗指标的重要部分。上述双特异性抗体的结果显示，具有作为CtD的一价抗-CD20、抗-Her2/neu或抗-EpCAM ScFv确实可以分别结合拉吉表达的CD20、BT474表达的Her2/neu(ErbB2)、或HT29表达的EpCAM。这种结合接近于单克隆抗-CD20、抗-Her2/neu或抗-EpCAM抗体(图4A)。与二价单克隆抗-CD3抗体相比，单价TAD(抗-CD3 ScFv)融合至LCBTA的C-端降低了与Jurkat表达的CD3分子的结合亲和力(图4B)。这样的降低与二价参比形式(IgG-FL BsAb)是相当的(图4B)。参比IgG-FL BsAb是类似于全抗体的双特异性抗体，只是有抗-CD3 ScFv共价融合至各重链的C-端(图1)。
免疫球蛋白轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的表达
在哺乳动物细胞系中瞬时转染的LCBTA的表达示于图2、3和5。参比形式(IgG-FL BsAb)显示出表达率不低于1μg/ml，这与λ或κ桥连的LCBTA形式或其衍生物相似。桥连的结构域的生理学性质对于双特异性T-细胞激活剂的表达和稳定性是重要的。例如，λ5，也称为替代轻链，是由未成熟B-淋巴细胞表达的免疫球蛋白轻链样蛋白。与λ或κ桥连的LCBTA相比，由哺乳动物的λ5桥连的LCBTA的瞬时表达降低。另外，与参比(如λ或κ桥连的LCBTA)相比，作为λ或κ桥取代的来自IgG1的恒定重链结构域的CH1也导致弱表达率。
桥连的LCBTA包括4个主要结构域；肿瘤靶向结构域，轻链桥，接头和T-细胞激活结构域。与全分子相比，对任意这些结构域的改变可能诱导结构域间干扰并且导致功能的降低或丧失。如表1所示，将肿瘤靶向ScFv的取向/结构从轻链-重链(Ka LCBTA-1)改为重链-轻链会造成与T-细胞激活结构域的结合降低，反之亦然。基于SEC-HPLC分析，这类取向操作也改变了单体产生的形成(图3A)。在这些实施例中的接头结构域包括一小段重复的4个甘氨酸和1个丝氨酸。结果显示结构域间接头的长度或大小可以大幅度影响桥连LCBTA分子的生物特征(表2)。
表2
也通过SEC-HPLC检查表达的桥连LCBTA来评价多聚体LCBTA的污染。不希望的多聚体双特异性分子污染的升高造成使用ScFv作为组分的其它开发者的问题。如图3所示，无论何种靶向分子，大多数经纯化的桥连LCBTA是单体形式。另外，κ或λ作为桥连并不影响LCBTA单体的均匀性。
串联重复BsAb的表达是高度ScFv依赖性的，因为从N端到C端颠倒ScFv抗体或相反会造成蛋白表达率的显著变化。结果，LCBTA展现出的表达率优于串联重复BsAb形式(参见，例如，泳道1和2，图5)，并且当TAD位于分子的C-端时，这样的差异进一步扩大。
ScFv或片段化的Ig分子的短血清稳定性已经是生物制药界中的常识(Cancer Res August8，200060；433)。轻链作为桥时，含有ScFv的双特异性分子的稳定性示于图6。结果表明即使在血清中37℃孵育一周后，两种形式的LBCTA仍使得超过50％的ScFv稳定。
Ka LCBTA和单克隆抗体处理的PBMC的炎性细胞因子分泌概况。
已知抗-CD3单克隆抗体处理诱导T-淋巴细胞的激活和炎性细胞因子的增强分泌(图7)。如图7所示，除了IL-8，桥连LCBTA并不诱导炎性细胞因子的分泌。桥连LCBTA并不包括任意重链恒定序列，并且，因此FcR介导的激活无法解释IL8的升高。低炎性细胞因子分泌概况表明T-淋巴细胞依赖性治疗的副作用的风险降低。
免疫球蛋白轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的细胞毒性
为了证明本发明的实施方式的生物功能，测试了靶向CD20的κ-桥连的LCBTA、抗-CD20 mAb和IgG-FL BsAb的抗肿瘤能力(图1和8)。如图8所示，κ-桥连的LCBTA在肿瘤根除中高度有效，具有亚pM范围内的EC50，与抗-CD20mAb的22pM或IgG-FL BsAb的个位数pM形成对比。κ-桥连的LCBTA也显示出最高达90％的最大肿瘤根除率，而抗-CD20mAb只有35％，IgG-FL BsAb为75％。
为了证明本发明的实施方式的生物功能，在Her2/neu+和EpCAM+HT29结直肠癌细胞上测试靶向Her2/neu或EpCAM的κ-桥连的LCBTA以评价它们的肿瘤根除能力(图8B)。如图8B所示，靶向Her2/neu和EpCAM的κ-桥连的LCBTA在肿瘤根除中高度有效，具有最高达100％的最大细胞毒性，与抗-Her2/neu和抗-EpCAM mAb分别为28％和51％的肿瘤杀伤率形成对比。
为了证明本发明的实施方式的生物功能，在Her2/neu+和EpCAM+Capan-1胰腺癌细胞上测试靶向Her2/neu或EpCAM的κ-桥连的LCBTA以评价它们的肿瘤根除能力(图8C)。如图8C所示，靶向Her2/neu和EpCAM的κ-桥连的LCBTA在肿瘤根除中都是高度有效的，靶向Her2/neu和EpCAM的κ-桥连的LCBTA分别具有超过75％和100％的最大细胞毒性率，与抗-Her2/neu和抗-EpCAM mAb分别为39％和34％的肿瘤杀伤率形成对比。
荷瘤动物的异种移植分析
为了证明本发明的实施方式的治疗潜力，在荷有CD20+人淋巴瘤(拉吉细胞)的SCID小鼠上测试靶向CD20的κ-桥连的LCBTA和抗-CD20mAb的抗肿瘤能力(图1和8)。在治疗之前，用拉吉细胞和PBMC皮下接种SCID小鼠。如图9A所示，用Ka LCBTA作为治疗剂处理的动物与用抗-CD20mAb作为治疗剂处理的动物相比，发展出的肿瘤小得多。
为了证明本发明的实施方式的治疗潜力，在荷有Her2/neu+人结直肠癌(HT29细胞)的SCID小鼠上测试靶向Her2/neu的κ-桥连的LCBTA和抗-Her2/neu mAb的抗肿瘤能力(图1和8)。在治疗之前，用预混有预激活的或未处理(naive)的PBMC的HT29细胞皮下接种SCID小鼠。如图9B所示，用靶向Her2/neu的Ka LCBTA作为治疗剂处理的动物与用抗-Her2/neu mAb作为治疗剂处理的动物相比，发展出的肿瘤明显较小。
为了证明本发明的实施方式的治疗潜力，在荷有EpCAM+人结直肠癌(HT29细胞)的SCID小鼠上测试靶向EpCAM的κ-桥连的LCBTA和抗-EpCAM mAb的抗肿瘤能力(图1和8)。在治疗之前，用预混有预激活的PBMC的HT29细胞皮下接种SCID小鼠。如图9B所示，靶向EpCAM的Ka LCBTA有效抑制了肿瘤发展。
构建双特异性抗体
限制性酶购自多个供应商。DNA聚合酶、T4DNA连接酶Klenow酶和T4DNA聚合酶来自英杰公司(纽约州格兰德岛(Grand Island，NY))。所有的酶按照制造商所推荐地使用。
所有用于PCR扩增的引物购自供应商。DNA扩增在PCR仪器中如下进行：使用94℃下2分钟的预变性步骤，之后是35个如下循环：变性步骤(94℃)、退火步骤(50℃)和延伸步骤(72℃)各持续50秒。
所有的表达模块如图1所示。
抗-CD20、抗-Her2/neu和抗-EpCAM轻链以及截短的重链被分别克隆到载体pGEM中。抗-CD20、抗-Her2/neu和抗-EpCAM VH以及VL的单链片段被克隆到载体TCAE8并用于后续的抗肿瘤ScFv。
细胞系制备
用于本发明的拉吉、BT474、Capan-1和HT29细胞分别是从生物资源收集和研究中心(BCRC)得到的B-淋巴肿瘤细胞系、乳腺癌细胞系、胰腺癌细胞系和结直肠癌细胞系，该研究中心是中国台湾的食品工业发展研究研究所(FIRDI)的分支机构。Jurkat细胞是来自ATCC的T-淋巴瘤细胞系。拉吉和Jurkat细胞都培养在补充10％胎牛血清(海克隆公司(Hyclone))、0.03％L-谷胺酰胺和0.4mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基(英国佩斯利的GibcoBRL生命技术公司(GibcoBRL Life Technologies))中。在37℃下含有5％的CO2的潮湿培养箱中孵育之后，细胞传代培养或在无菌缓冲液中洗涤用于测试。按照ATCC的指南来培养BT474、Capan-1和HT29。
外周血单核细胞(PBMC)的制备
用Ficoll-Paque PLUS通过密度离心从正常健康成人供体的全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。在分离后，PBMC在补充10ng/ml的抗-CD3mAb、75IU/ml的白介素-2(IL-2)、和10％FBS的RPMI-1640培养基中培养并预激活5-10天。
细胞毒性试验(钙黄绿素AM细胞毒性)
靶细胞(拉吉细胞)在补充5％FBS的无酚红RPMI1640培养基中在37℃下用10μM的钙黄绿素标记30分钟。在钙黄绿素孵育结束时，用含有5％FBS的无酚红RPMI1640培养基洗涤细胞2次，并且用含有5％FBS的无酚红RPMI1640培养基将细胞密度调节至3×105细胞/ml。对于反应混合物，各自含有3×104细胞的100μl等分的培养基被放置在96-孔培养平板的各孔中。计算效应细胞(PBMC)培养物的细胞密度并且用含有5％FBS的无酚红RPMI1640培养基调节至3×106细胞/ml。对于细胞毒性试验，不同量的不同BsAb和100μl(3×105细胞)的效应细胞被加入到预加载拉吉细胞的96孔培养板中并且在37℃下，5％CO2富集的培养箱中孵育4小时。在孵育结束时，培养板在700g下离心5分钟。然后，130μl来自各反应孔的上清被单独转移至新的平板上并在融合α微板读数仪(Fusion alpha micro-plate reader)中定量释放的染料。细胞毒性的百分比按照下式计算：
[荧光(样品)-荧光(对照)]/[荧光(总-裂解)-荧光(对照)]*100。
总-裂解定义为用0.9％的曲通处理10分钟的靶细胞。
流式细胞分析试验
肿瘤靶标(B-淋巴瘤)的结合亲和力
靶细胞，包括拉吉、BT474和HT29细胞(1x106细胞/反应)，在室温下用不同浓度的不同BsAb处理30分钟。在孵育结束时，所有反应用补充2％FBS的PBS洗涤2次。在洗涤之后，细胞用1μl的FITC偶联的、亲和纯化的F(ab’)2片段、羊抗人IgG(Fab’)2片段特异性抗体在室温下再次孵育30分钟。在孵育之后，细胞用冰冷的补充2％FBS的PBS洗涤2次并且由FACS设备监测。
Jurkat细胞(1x106细胞/反应)在室温下用不同浓度的不同BsAb处理30分钟。在孵育结束时，所有反应用补充2％FBS的PBS洗涤2次。在洗涤之后，细胞用1μl的FITC偶联的、亲和纯化的F(ab’)2片段、羊抗人IgG(Fab’)2片段特异性抗体在室温下再次孵育30分钟。在孵育之后，细胞用冰冷的补充2％FBS的PBS洗涤2次并且由FACS设备监测。
免疫球蛋白轻链桥连的双特异性抗体的原核克隆和表达
需要的肿瘤靶向轻链桥连的双特异性抗体的相应合成基因使用Nco I和Xho I限制性位点克隆进pET20b载体中。大约20ng的各重组构建体被转化到BL21(DE3)pLysS(EMD密理博公司(EMD Millipore))中，在补充氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选转化体。
含有重组构建体的BL21(DE3)pLysS的单菌落在5mL的补充有氨苄青霉素的LB中37℃生长过夜。培养物在振荡条件下37℃下孵育。然后当菌群达到0.6-0.7的OD600时加入诱导剂(IPTG)。在0小时和过夜孵育后通过离心(4000×g持续15分钟)来收获等分。为了验证靶标特异性轻链桥连的双特异性抗体的表达，通过SDS-PAGE(4～12％丙烯酰胺)来分析溶解部分的总蛋白提取物。通过加入样品缓冲液并且煮沸5分钟来制备样品。在分离后，用0.1％考马斯亮蓝R-250对胶进行染色。使用抗-His mAb分析Western印迹。
上述实施例证明了本发明的实施方式的效用，这些实施方式是双特异性或多重特异性分子。上述实施例也表明可以使用各种靶向结构域来靶向不同的分子或细胞。因此，本领域技术人员会理解可以与在本文所述的双特异性分子相同的框架中使用对于不同靶标的其他靶向结构域。因此，本发明的范围不限于实施例中所显示的特别优选的实施方式。
尽管已经用有限数量的实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员得益于本发明的公开，会理解能设计出其他的实施方式而在不偏离本文所揭示的本发明范围。因此，本发明的范围应仅由所附权利要求书限定。

Claims (12)

1.一种双特异性融合蛋白，所述蛋白包含：
对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域；
衍生自免疫球蛋白的轻链或重链的恒定区的桥连结构域；和
对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域。
2.如权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，还包含融合到所述桥连结构域的N-端或C-端的接头。
3.如权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向结构域融合到所述桥连结构域或所述接头上并且所述第二靶向结构域融合到所述桥连结构域或所述接头上。
4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
5.如权利要求4所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述桥连结构域是κ链，λ链，λ-5替代轻链，或模拟轻链恒定区的所述κ链、所述λ链、所述λ-5替代轻链的突变体，或所述κ链、所述λ链、所述λ-5替代轻链的衍生物。
6.如权利要求2-5中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述接头包含GGGGS序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第二靶向结构域是T-淋巴细胞激活结构域。
8.如权利要求1-7中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述感兴趣的第一靶标是CD20、Her2/neu或EpCAM。
9.如权利要求1-8中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向结构域包含对所述感兴趣的第一靶标具有特异性的第一ScFv，并且所述第二靶向结构域包含对所述感兴趣的第二靶标具有特异性的第二ScFv。
10.如权利要求9所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv和所述第二ScFv各包含人序列。
11.如权利要求9或10所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv包含对第一抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH，并且所述第二ScFv包含对第二抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH。
12.如权利要求11所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述接头包含GGGGS序列。
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