TWI492953B - 雙特異性ｔ細胞活化劑抗體 - Google Patents

Description

雙特異性T細胞活化劑抗體

本發明係關於製備雙特異性或多特異性生物分子，諸如雙特異性抗體的方法，及其產物。特言之，本發明係有關用於分子交聯的新穎交聯子及使用其的方法。

相關申請案之交叉參考

本案主張2011年12月22日所申請之臨時申請案第61/579,450號的權利，該案之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中。

組合具有不同功能的生物分子可產生具有所要或改良性質的新分子。舉例而言，組合分子可具有雙重功能且可具有改良之穩定性。組合生物分子的常見方法為使用化學連接劑將此等分子交聯。然而，當化學交聯時，組合分子之生物學活性並不總是得以保存。因此，仍需要用於生物分子交聯的更好方法。

本發明係關於製備雙特異性或多特異性生物分子，諸如雙特異性抗體(BsAb)的方法，及由此製得之產物。特言之，本發明係有關用於連接生物分子的新穎連接子-鉸鏈域，及使用其的方法。

本發明之一個態樣係關於稱為「連接子-鉸鏈域」(LHD)的蛋白質域。根據本發明之一個實施例的LHD包括連接子序列及鉸鏈序列，其中該連接子序列包含甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸 (GGGGS)(SEQ ID NO：9)，且該鉸鏈序列包含半胱胺酸-脯胺酸-脯胺酸-半胱胺酸-脯胺酸(CPPCP)。LHD可包括兩個或兩個以上連接子序列。LHD域之實例可包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6之序列。

本發明之一個態樣係關於具有上述LHD域的蛋白質。根據本發明之一個實施例的蛋白質可進一步包括一個N末端部分，其經肽鍵融合至蛋白質域之N末端；及/或一個C末端部分，其經肽鍵融合至蛋白質域之C末端。N末端部分及C末端部分可各獨立地為肽、全長免疫球蛋白或抗體之單鏈可變區片段(ScFv)。舉例而言，N末端部分及C末端部分之一者可包括T淋巴細胞活化域，該T淋巴細胞活化域包含抗CD3抗體或抗CD3抗體之單鏈可變區片段(ScFv)，而N末端部分及C末端部分之另一者可包括腫瘤識別域，該腫瘤識別域包含抗CD20抗體或抗CD20抗體之單鏈可變區片段(ScFv)。或者，N末端部分包含抗腫瘤特異性標記、發炎疾病標記、自體免疫性疾病標記或過敏症相關標記。

本發明之一個態樣係關於生物分子，各生物分子包含上述蛋白質之二聚體，該二聚體之鉸鏈序列之間具有二硫鍵。生物分子維持T淋巴細胞活化能力，或生物分子維持抗體結合至抗原之能力。生物分子可具有改良之溶解性、穩定性及藥物動力學。

本發明之其他態樣及優點由以下實施方式及隨附申請專利範圍將顯而易見。

圖1A至1E顯示示意圖，其說明根據本發明實施例之各種雙特異性抗體(BsAb)之構築體。

圖2顯示電泳結果，說明IgG-FL ΔH BsAb之聚集。

圖3顯示各種BsAb在長期儲存後的穩定性。

圖4A及4B顯示LHD中無鉸鏈之BsAb及根據本發明實施例之具有 各種連接子長度之BsAb之結合親和力。

圖5A至5C顯示根據本發明實施例之各種BsAb之細胞毒性。

圖6顯示根據本發明實施例之BsAb誘導PBMC增殖。

圖7顯示根據本發明之一個實施例之LHD融合BsAb之藥物動力學(PK)分析。

本發明之實施例係關於製備雙特異性或多特異性生物分子，諸如雙特異性抗體的方法，及其產物。本發明之一些實施例係有關用於分子交聯的新穎交聯子及使用其的方法。本發明之交聯子可包含連接子域及鉸鏈域。因此，此等交聯子可稱為「連接子-鉸鏈域」或LHD。

根據本發明之實施例，連接子域可具有甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸(GGGGS)之序列，且鉸鏈域可具有半胱胺酸-脯胺酸-脯胺酸-半胱胺酸-脯胺酸(CPPCP)之序列。一些交聯劑可包含一或多個連接子序列。鉸鏈序列可使含有此等序列之分子之二聚體之間形成二硫鍵。

根據本發明之實施例，此等LHD可用於構建雙特異性或多特異性生物分子。該生物分子可為抗體，亦即，雙特異性或多特異性抗體。在本說明書中，雙特異性抗體可稱為「BsAb」。

根據本發明實施例之雙特異性抗體可包含LHD，其經由肽鍵連接至免疫球蛋白(IgG)之恆定區片段(Fc)，亦即，融合蛋白IgG-Fc-LHD。兩個特異性配位體結合部分可連接至此融合蛋白之N末端及C末端，而產生雙特異性生物分子。位於LHD-IgGFc之N末端或C末端的特異性配位體結合部分可為蛋白質或肽。此等部分之實例可包括抗體之單鏈可變區(稱為「ScFv」)或結合特異性配位體(包括抗原)的肽。

本發明之雙特異性生物分子可具有抗體樣結構且稱為「雙特異性抗體」或BsAb。下文將描述一些實例以說明本發明之實施例。雖然僅描述有限數目個實例，但熟習此項技術者會瞭解，此等實例可具有其他變型或變化形式而不悖離本發明之範疇。

實例 構建靶向CD20的雙特異性抗體(具有LHD之BsAb)

為改良多特異性分子之生物學功能性，構建包含連接子-鉸鏈界面域(LHD)的雙特異性抗體(BsAb)且測試其功能。如本文所述，「連接子-鉸鏈」界面域(「LHD」)包括構建一或多個甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸(GGGGS或G₄ S連接子)連接子序列及單一的半胱胺酸-脯胺酸-脯胺酸-半胱胺酸-脯胺酸(CPPCP鉸鏈)鉸鏈序列。(表1)。

本發明之實施例使用此等LHD實際地將多個功能性生物分子(包括肽及蛋白質)連接。此等經連接的生物分子具有一或多種優點，包 括維持所連接分子/域之生物學活性、穩定新分子之生物學特性、維持化學、生物化學及物理性質、調節生物學特性等。

為說明LHD在構建多特異性分子中的益處，構建若干具有LHD形式的BsAb，該等BsAb可識別分別作為腫瘤標記及T淋巴細胞活化分子之CD20及CD3。此等BsAb構築體，包括抗CD20/ScFv-IgG/Fc-CH2-CH3-LHD-抗CD3/ScFv(ScFv-IgG BsAb)、抗CD20(完整mAb)-LHD-抗CD3/ScFv(IgG-FL BsAb)，及抗CD20(完整mAb)-LHD/△CPPCP-抗CD3/ScFv(IgG-FL△H)(圖1A-1E)。

圖1A說明產生雙特異性抗體(BsAb)之一實例，該抗體含有包含抗CD20單株抗體(mAb)之單鏈可變區片段(ScFv)的腫瘤識別域(TRD)及包含抗CD3 mAb之單鏈可變區片段(ScFv)的T細胞活化域(TAD)。在此實例中，構建腫瘤識別分子(TRM)，縮寫為ScFv-IgG，其包含兩部分：腫瘤識別域(TRD)及IgG重鏈恆定域。腫瘤識別域(TRD)包含抗CD20 mAb之ScFv。IgG重鏈恆定域包含免疫球蛋白G1恆定區片段(IgG1 Fc)之CH2及CH3域。

接著，使TRM連接至LHD(連接子鉸鏈域)，該LHD包含表1中所列之LHD序列中之任一LHD序列(除SEQ No.7外)。LHD共價融合至TRM之CH3域之C末端。最後，使T淋巴細胞活化域(TAD)(亦稱為單鏈抗CD3單株抗體域)融合至LHD之C末端。換言之，此重組蛋白包含(自N末端至C末端)：TRD(抗CD20 ScFv)、IgG1 Fc、LHD及TAD(抗CD3 ScFv)。

如同一般抗體，此ScFv-IgG雙特異性抗體(BsAb)之生物學活性形式將形成同型二聚體。二聚作用中，單體ScFv-IgG BsAb之LHD域中的CPPCP序列可與另一個單體ScFv-IgG之另一個LHD域中的CPPCP序列形成二硫鍵，如圖1A中所示。所得分子為抗體樣分子，其恆定鏈(亦即IgG1 Fc)之兩端(C末端及N末端)具有兩個不同可變域。因此，所 得分子可稱為雙特異性抗體(BsAb)。

圖1B說明形成雙特異性抗體(BsAb)的另一種方法，該抗體具有的雙特異性(亦即抗CD20及抗CD3)與圖1A中所示的雙特異性相同。除了TRM使用全長抗CD20 mAb代替單鏈抗CD20抗體之外，此BsAb類似於圖1A中所示之BsAb。全長mAb包括全長IgG1重鏈恆定域(IgG1 Fc)，亦即，重鏈恆定域包括CH1、CH2及CH3域。

如上所述ScFv-IgG BsAb(圖1A)中，LHD融合至TRM(亦即全長抗CD20 mAb)之C末端，亦即融合至TRM之CH3域之C末端。LHD序列可為表1中之任一序列，除SEQ No.8外。接著，使TAD(亦即抗CD3 ScFv)融合至LHD序列之C末端。如同圖1A所示之ScFv-IgG BsAb，此構築體將形成二聚體。二聚作用中，單體IgG-FL BsAb之LHD中的CPPCP序列可與另一單體IgG-FL之LHD形成二硫鍵，如圖1B中所示。此分子之雙特異性與圖1A中所示分子之雙特異性相同。

圖1C說明圖1A中所示之雙特異性抗體(BsAb)之變異體。其具有相同TRM及TAD。然而，此變異體中之LHD域具有序列SEQ ID NO：8(表1)，亦即，不含GGGGS連接子序列。此變異體稱為ScFv-IgG△L BsAb。如同母體形式，ScFv-IgG△L BsAb之LHD內的二硫鍵係在單體ScFv-IgG△L BsAb二聚之後產生，如圖1C中所示。

圖1D顯示圖1A中所示之雙特異性抗體之另一變異體。在此變異體中，LHD具有序列SEQ ID NO：7(表1)，其缺乏CPPCP鉸鏈序列。此變異體稱為IgG-FL△H BsAb。因為LHD缺乏用於形成二硫鍵的半胱胺酸殘基，所以IgG-FL△H BsAb不含介於兩個LHD之間的二硫鍵。

圖1E顯示圖1A之BsAb之類似物。在此類似物中，TRD與TAD域對換，亦即，TAD位於IgG1 Fc之N末端，而TRD位於LHD之C末端。此類似物(稱為「N末端TAD BsAb」)具有的雙特異性與圖1A中所示之BsAb的雙特異性相同。

上述BsAb具有改良之性質，諸如生產產量及穩定性，同時保留其結合特異性及效力，如下文所說明。

如下文所說明，上述BsAb具有改良之性質(生產產量及穩定性)，同時保留其結合特異性及效力。

具有LHD之BsAb提供產能的改良

在以蛋白質為基礎之治療劑的商業化中，產量扮演著關鍵的角色。根據本發明之實施例，蛋白質中包含LHD可改良多特異性分子之產量。為證明根據本發明實施例之LHD之效用，將ScFv-IgG、IgG-FL及IgG-FL△H BsAb選殖、表現，且用FS293哺乳動物細胞來測試，評估其產量及穩定性。

此等測試之結果顯示，不論LHD中之連接子序列之重複數為何，所有BsAb形式在短暫轉染生產下皆具有相似的產率(1 μg/ml)。儘管IgG-FL△H BsAb的粗物質產量與IgG-FL或ScFv-IgG BsAb形式之產量類似，但注意到IgG-FL△H BsAb純化之後的回收率不良(表2)。

進一步分析顯示大量聚集物形成，下沉集結於IgG-FL△H BsAb之純化裝置之底部。隨後SDS分析顯示，BsAb為此等集結粒之主要組分(圖2)。

以液態儲存之蛋白質藥物在4℃的穩定性在蛋白質工程中已成問題，尤其含有連接子的蛋白質(參見美國專利申請公開案第2009/0175867 A1號)。本文所述之實例顯示，具有一至兩個連接子重複的BsAb被觀測到發生輕度的蛋白水解分裂，而其他LHD構築體發生的蛋白水解分裂則很少(圖3)。

具有LHD之BsAb的抗原結合能力未減小

為使BsAb獲得T細胞介導之細胞毒性，CD3與T細胞表面的結合為必需的。CD3分子為T細胞受體(TCR)之共受體且負責MHC與抗原複合物刺激之後的信號傳導。抗CD3 ScFv直接融合至ScFv-IgG、IgG-FL及IgG-FL△H BsAb之C末端會對此等分子之CD3結合能力產生一些負面影響，如表3中所示。

在此等BsAb中，IgG-FL△H BsAb與CD3的結合最顯著的降低(表3及圖4A)。此未預測到的結果凸顯了LHD在BsAb的生物學上有效性之必要性。然而，改變LHD內之連接子序列的長度並不足以完全恢復CD3與BsAb之結合能力(表3及圖4B)。相較於親本全長抗CD3抗體，ScFv-IgG與IgG-FL BsAb對配位體(CD3)的親和力均觀測到降低的現象(表3)。另一方面，三種BsAb(ScFv-IgG、IgG-FL及IgG-FL△H)對表現CD20之淋巴瘤的結合常數則不受影響(表3)。

具有LHD之BsAb可將B淋巴瘤的細胞毒性增強

由T細胞所介導，針對腫瘤的細胞毒性被視為BsAb療法中之聖品。以下實例顯示LHD有助於BsAb增強T淋巴細胞介導之腫瘤消除。如同化學結合之BsAb，IgG-FL與ScFv-IgG BsAb均能夠在低濃度下消除CD20⁺ B細胞淋巴瘤(圖5A)。自LHD(亦即ScFv-IgG△L BsAb)移除連接子序列(GGGGS)亦會消除T淋巴細胞介導之細胞毒性(圖5A)。

除了IgG-FL△H BsAb因缺乏CPPCP序列而不能在二聚之後形成LHD相關的二硫鍵之外，IgG-FL△H BsAb與IgG-FL BsAb具有高度的結構相似性。在缺乏LHD相關之二硫鍵下，會導致T淋巴細胞介導之細胞毒性顯著降低(圖5C)。

儘管TRM與TAD之間具有LHD的BsAb可提供改良之腫瘤特異性細胞毒性，但改良程度對於表1中所列之LHD序列並非普遍適用。已發現ScFv-IgG BsAb之最佳細胞毒性與SEQ ID 4、5或6相關(表1，圖5A)。然而，當使用全套抗CD20 mAb作為IgG-FL形式中之TRM時， 腫瘤特異性細胞毒性之變化會顯得難以分辨(圖5B)。Rituxan®(一種抗CD20 mAb)已顯示可經由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)介導B細胞消耗。實驗證明，相較於Rituxan®，包含LHD之BsAb(諸如IgG-FL及ScFv-IgG形式)能經由ADCC更有效地消除B淋巴瘤(圖5A、5B及表4)。先前結果顯示，Rituxan®誘導之ADCC需要較高的效應劑：目標比率(E：T比率為40：1或高於40：1)及較高的Rituxan®效價(μg/ml)以保持30-50%之最大細胞毒性。然而，所選LHD之IgG-FL BsAb形式不僅改良腫瘤消除能力(高達80%)，而且將E：T比率降低至10：1(表4)。

相較於親本抗CD3單株抗體，具有LHD之ScFv-IgG BsAb及具有LHD之IgG-FL BsAb可輕度誘導PBMC的增殖

全長單株抗CD3抗體為熟知之用於非特異性T細胞活化的促有絲 分裂誘導劑。已有人提出，在單株抗CD3抗體治療之後，此促有絲分裂性會引起較大的不良反應，諸如流感樣症狀及細胞激素釋放症候群(CRS)。申請人已發現，如同N末端TAD BsAb(圖1E)，親本抗CD3 mAb可顯著誘導新鮮培養之周邊血液單核細胞(PBMC)增殖(圖6)。相較於單獨抗CD3 mAb，藉由抗CD20 mAb與抗CD3 mAb化學結合而製備的BsAb顯示會稍微將低促有絲分裂的潛力。然而IgG-FL/15H BsAb僅在高濃度下展現促有絲分裂效應(圖6)。

具有LHD之BsAb使T細胞活化標記增強

增殖分析為量測T淋巴細胞活化之「標準」，不論活化後是否產生異質細胞。申請人已發現IgG-FL BsAb可增強對B淋巴瘤的細胞毒性效應，不論其是否會降低增殖概況(圖5及圖6)。為合理地說明此等觀測結果，將T淋巴細胞活化標記CD69與CD25均染色，且在各種刺激之後藉由FACS來顯示(表5)。實例顯示，含有LHD之IgG-FL BsAb在增強CD69與CD25表現方面，比抗CD3 mAb更有效。N末端TAD BsAb的活化概況與含有LHD之IgG-FL BsAb的活化概況亦相似。ScFv-IgG與LHD/△L融合不能有效消除腫瘤細胞(圖5A)，此生物功能喪失亦可由活化T淋巴細胞之能力的喪失來反映(表5)。

此等結果進一步證明功能性LHD域需要連接子與鉸鏈。此等實例證明本發明LHD(表1)可維持所連分子/域之生物學活性及調節所要的生物學特性。

具有LHD之IgG-FLBsAb顯示可改良藥物動力學性質

PK(藥物動力學)為藥物成功之主要指標，因為擴大之PK不僅轉化穩定性更好，可減少給藥頻率，且患者及臨床醫師更易接受。IgG-FL對小鼠之PK顯示約96個小時之T^1/2 (圖7)。

構建雙特異性抗體

限制酶購自各個供應商，DNA聚合酶、T4 DNA連接酶克列諾酶(Klenow enzyme)及T4 DNA聚合酶購自Invitrogen(Grand Island,NY)。所有酶根據製造商之建議使用。

用於PCR擴增的所有引子皆購自各個供應商。DNA擴增係在製造商之PCR機器中使用預變性步驟、隨後執行預定循環(含有變性步驟、黏接步驟及擴增步驟，各30分鐘)來執行。

所有表現模組示意性顯示於圖1A-1E中。

將抗CD20輕鏈及截斷之重鏈選殖於載體A及載體B中。將抗CD20 VH及VL之單鏈片段選殖於載體C中，且用於隨後的抗CD20 ScFv。

細胞株製備

本發明所用的Raji細胞為B淋巴瘤腫瘤細胞株，其獲自生物資源保存及研究中心(Biorescouce Collection and Research Center,BCRC)， 該中心為中華民國(R.O.C)臺灣食品工業研究發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的一個部門。Jurkat細胞為獲自ATCC的T淋巴瘤細胞株。Raji細胞與Jurkat細胞均在補充有10%胎牛血清(Hyclone)、0.03% L-麩醯胺酸及0.4 mM丙酮酸鈉的RPMI 1640培養基(GibcoBRL Life Technologies,Paisly,UK)中培養。在含有5% CO₂ 的37℃增濕恆溫箱中培育後，將細胞在無菌緩衝液中繼代培養或洗滌用於測試。

製備周邊血液單核細胞(PBMC)

使用Ficoll-Paque PLUS，藉由密度離心自正常健康成人供者之全血分離周邊血液單核細胞(PBMC)。分離之後，PBMC在補充有10 ng/ml抗CD3 mAb、75 IU/ml介白素-2(IL-2)及10% FBS的RPMI-1640培養基中培養且活化6至14天。

細胞毒性分析(鈣黃綠素AM細胞毒性)

目標細胞(Raji)在補充有5% FBS之無酚紅RPM1 1640培養基中、在37℃用10 μM鈣黃綠素標記30分鐘。在鈣黃綠素培育結束時，細胞用具有5% FBS之無酚紅RPMI 1640培養基洗滌兩次且用具有5% FBS之無酚紅RPMI 1640將細胞密度調節至3×10⁵ 個細胞/毫升。作為反應混合物，將含有3×10⁴ 個細胞的100 μl培養基置放於96孔培養盤之各孔中。計算效應細胞(PBMC)培養物之細胞密度且用具有5% FBS之無酚紅RPMI 1640培養基調節至3×10⁶ 個細胞/毫升。對於細胞毒性反應，將不同量的不同BsAb及100 μl(3×10⁵ 個細胞)效應細胞添加至96孔培養盤之Raji預加料中且在37℃ 5% CO₂ 富集恆溫箱中培育4小時。在培育結束時，培養盤以700 g離心5分鐘，接著自各反應孔個別地轉移130 μl上清液至新盤中且用Fusion alpha微盤讀取器定量所釋放的染料。根據下式計算細胞毒性百分比：[螢光(樣品)-螢光(對照)]/[螢光(總溶胞)-螢光(對照)]*100。

總溶胞定義為經0.9% Triton處理10分鐘的目標細胞。

流式細胞術分析 對腫瘤目標(B-淋巴瘤)的結合親和力

Raji細胞(1×10⁶ 個細胞/反應)用不同濃度的不同BsAb在室溫下處理30分鐘。在培育結束時，所有反應物用補充有2% FBS的PBS洗滌兩次。洗滌之後，細胞與1 μl結合FITC之親和力純化F(ab')2片段(山羊抗人類IgG(Fab')2片段)特異性抗體，在室溫下再培育30分鐘。培育之後，細胞用補充有2% FBS的冰冷PBS洗滌兩次且藉由FACS裝置監測。

Jurkat細胞(1×10⁶ 個細胞/反應)用不同濃度的不同BsAb在室溫下處理30分鐘。在培育結束時，所有反應物用補充有2% FBS的PBS洗滌兩次。洗滌之後，細胞與1 μl結合FITC之親和力純化F(ab')2片段(山羊抗人類IgG(Fab')2片段)特異性抗體在室溫下再培育30分鐘。培育之後，細胞用補充有2% FBS的冰冷PBS洗滌兩次且藉由FACS裝置監測。

T淋巴細胞活化標記分析

除了將所分離之PMBC活化2或4天之外，如「製備周邊血液單核細胞(PBMC)」章節中所述分離周邊血液單核細胞(PBMC)。除了所用目標細胞為活化PBMC之外，如「對腫瘤目標之結合親和力」章節中所述，用抗人類CD25及CD69標記對PMBC進行免疫螢光染色。簡言之，1×10⁶ 個細胞/反應用不同濃度之螢光結合抗人類CD25或CD69單株抗體在室溫下處理30分鐘。在培育結束時，所有反應物用補充有2% FBS的PBS洗滌兩次。洗滌之後，藉由FACS裝置監測細胞。

對包含LHD融合雙特異性抗體之融合蛋白的PK分析

向Balb/c小鼠(n=4)注射3 mg/kg抗CD20 IgG-LHD-抗CD3/ScFcBsAb，且在多個時間點收集血液樣品。經由離心收集所集 中的動物血清，且經由ELISA量測BsAb濃度。簡言之，將連續稀釋的小鼠血清，在預塗有抗人類Fab抗體(Jackson Lab)的ELISA盤中培育1小時。培育之後，將微量滴定盤用PBST緩衝液洗滌若干次，且藉由5%脫脂乳阻斷1小時。在阻斷結束時，將微量滴定盤用PBST再次洗滌，且與結合HRP之抗人類Fc抗體再培育1小時。此培育之後，再次洗滌微量滴定盤且根據製造商建議加以顯色及偵測。

雖然例示了雙特異性生物分子，但熟習此項技術者瞭解亦可利用此方法製備多特異性生物分子。類似地，此處例示使用GGGGS的連接子序列且例示使用CPPCP的鉸鏈序列。然而，熟習此項技術者瞭解可使用其他類似序列。連接子序列係為不同域提供適當空間，而鉸鏈域係為同型二聚體中之二硫鍵形成提供殘基。

雖然本發明已結合有限數目個實施例加以描述，但受益於本發明的熟習此項技術者將瞭解，可構想不悖離如本文揭示之本發明範疇之其他實施例。因此，本發明範疇應僅由隨附申請專利範圍限定。

<110> 財團法人生物技術開發中心

<120> 雙特異性T細胞活化劑抗體

<130> 17787/004WO1

<140> TW102100347

<141> 2013-01-04

<150> US 61/579,450

<151> 2011-12-22

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 連接子

<400> 1

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

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<223> 連接子

<400> 2

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

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<223> 連接子

<400> 3

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<212> PRT

<213> 人工

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<223> 連接子

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<210> 5

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<210> 6

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<210> 7

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工

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<223> 鉸鏈

<400> 8

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 連接子

<400> 9

Claims (8)

1. 一種包含兩個雙特異性蛋白質之生物分子，其中各別的該雙特異性蛋白質包含蛋白質域、經由肽鍵融合至該蛋白質域之N末端的N末端部分及經由肽鍵融合至該蛋白質域之C末端的C末端部分，該蛋白質域係為一種連接子鉸鏈域(LHD)，該LHD包含連接子序列，該連接子序列藉由肽鍵直接與鉸鏈序列連接形成共軛蛋白質域，其中該連接子序列係由甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸(SEQ ID NO：9)所組成，且該鉸鏈序列係由半胱胺酸-脯胺酸-脯胺酸-半胱胺酸-脯胺酸(SEQ ID NO：8)所組成，其中該兩個雙特異性蛋白質彼此間係藉由介於該兩個雙特異性蛋白質的該鉸鏈序列之間的一或多個二硫鍵連結，及其中於各別的該雙特異性蛋白質中，該N末端部分及該C末端部分各自獨立地為全長免疫球蛋白或抗體之單鏈可變區片段(ScFv)。
2. 如請求項1之生物分子，其中於各別的該雙特異性蛋白質中，該N末端部分及該C末端部分之一包含選自由下列組成之群的域：包含抗CD3抗體的T淋巴細胞活化域及抗CD3抗體之單鏈可變區片段(ScFv)，且其中該N末端部分及該C末端部分之另一者包含選自由下列組成之群的域：包含抗CD20抗體的腫瘤識別域及抗CD20抗體之單鏈可變區片段(ScFv)。
3. 如請求項1之生物分子，其中於各別的該雙特異性蛋白質中，該N末端部分包含抗腫瘤特異性標記、發炎疾病標記、自體免疫性疾病標記或過敏症相關標記。
4. 如請求項3之生物分子，其中於各別的該雙特異性蛋白質中，該C末端部分包含抗CD3抗體，且該N末端部分包含抗CD20抗體。
5. 如請求項1之生物分子，其中該生物分子在表現、產生或純化期間維持溶解性。
6. 如請求項1之生物分子，其中該生物分子的促有絲分裂性低於抗CD3單株抗體的促有絲分裂性。
7. 如請求項1之生物分子，其中該生物分子能夠在不低於抗CD3單株抗體誘導之水準的水準下誘導CD69及CD25表現。
8. 如請求項1至7中任一項之生物分子，其中於各別的該雙特異性蛋白質中，該蛋白質域包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6之序列。