CN111662391A

CN111662391A - 双特异性融合蛋白、其编码基因以及用途

Info

Publication number: CN111662391A
Application number: CN202010678114.7A
Authority: CN
Inventors: 郭晓芳; 朱小飞; 张月月; 谷川莎; 钟根深; 于海川
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2040-07-15
Also published as: CN111662391B

Abstract

本发明公开了一种双特异性融合蛋白，从N端到C端依次包括：特异性结合血管内皮细胞生长因子的第一靶向结合域、中间桥连结构域以及特异性结合表皮生长因子、转化生长因子‑α的第二靶向结合域；其中，所述第一靶向结合域为VEGFR1的免疫球蛋白样结构域1‑3或其一部分，或者，所述第一靶向结合域为抗VEGF单链抗体或其一部分；所述中间桥连结构域为免疫球蛋白Fc区，所述第二靶向结合域为EGFR胞外配体结合结构域或其一部分。本发明提供的双特异性融合蛋白抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、生长以及侵袭能力，显示出强烈的体内抗肿瘤活性，并且可以使用基因工程手段进行大规模发酵制备。

Description

双特异性融合蛋白、其编码基因以及用途

技术领域

本发明属于药用蛋白技术领域，尤其涉及一种双特异性融合蛋白、其编码基因、以该融合蛋白为活性成分的药物以及其制药用途。

背景技术

手术和放化疗仍然是目前恶性肿瘤治疗的主要手段，但由于肿瘤早期检测技术的有限性，很多肿瘤患者在发现时已进入临床中晚期，错过了最佳手术时机。传统的放化疗对肿瘤细胞的作用无选择性，对人体有明显的毒副作用，如骨髓抑制、胃肠道反应、肝肾损害、皮疹和呕吐等。分子靶向药物的出现为肿瘤治疗提供了新的选择，在白血病、非小细胞肺癌、结直肠癌和乳腺癌等多种肿瘤的治疗中已得到越来越广泛的应用。在众多的靶向性药物中，以表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)为靶点的药物尤其受到关注，它们在实体瘤的治疗中发挥着重要的作用。

EGFR和VEGF(R)介导的信号通路在肿瘤的存活、增殖和转移过程中发挥着关键调控作用，但EGFR和VEGF靶向性药物单独使用时临床疗效有限且耐药性现象突出。表皮生长因子受体EGFR是ErbB受体酪氨酸激酶家族的四个成员之一，除了EGFR外，该家族成员还包括ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。当EGF、TGF-α等配体与受体结合后可激活受体的酪氨酸激酶活性，并进而活化RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT等一系列重要的胞内信号通路，在促进细胞的生长、增殖、侵袭、迁移过程中发挥着重要作用。EGFR在包括肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、头颈癌等多种肿瘤中异常高表达或持续性活化，因而是肿瘤治疗的理想靶点。FDA已批准了多种以EGFR为靶点的药物，如cetuximab(爱必妥)、panitumumab(维克替比)gefitinib(易瑞沙)、erlotinib(特罗凯)等。这些药物在临床单独使用时疗效有限，如一个最近的临床III期试验数据显示，在全部309个从不吸烟的肺腺癌患者中，gefitinib治疗组和顺铂/吉西他滨化疗组相比疗效并没有显著差异，反应率分别为55.4％和46％(P＝0.101)，无进展生存期(5.8月vs 6.4月，P＝0.138)，总生存期(22.3月vs 22.9月，P＝0.604)。在42个EGFR发生突变的病人中，gefitinib治疗组的反应率显著高于化疗组(84.6％vs 37.5％)，但无进展生存期没有显著差异。在一个多中心、开放性III期临床试验中，1125名未接受过化疗的NSCLC患者被随机分为两组，分别接受化疗(顺铂和长春瑞滨)或化疗+cetuximab，结果显示化疗+cetuximab治疗组的中位生存期比单纯化疗组仅略有延长(11.3月vs 10.1月)。在EGFR靶向性药物的使用中发现，它们仅仅对一部分患者有效，如gefitinib和erlotinib仅对EGFR在19和21外显子发生缺失突变的病人有效，EGFR高表达的病人对cetuximab较为敏感，这种原发性耐药导致了很大一部分病人不能从EGFR靶向性药物中获益。更为重要的是，一些最初对EGFR抑制剂敏感的病人在使用短短几个月通常就会出现严重的获得性耐药。

自1971年Folkman提出“肿瘤生长和转移依赖于血管生成”的观点以来，大量的研究已经证实了抑制肿瘤血管生成是治疗肿瘤的一条有效途径。肿瘤血管生成过程中涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节失衡，促血管生成因子分泌增加，而内源性血管生成抑制因子产生相应减少。VEGF(VEGF-A)是一个主要的促血管生成因子，最近从2000名转移性结肠癌病人中获得的数据显示，病人血清中VEGF含量可以作为病人预后的指标，VEGF含量的增加预示着病人无进展生存期和总生存期的缩短。已有多种VEGF或VEGFR靶向性药物应用于临床治疗，其中VEGF的中和性抗体bevacizumab(Avastin)是第一个获批的作用于肿瘤血管生成的药物，也是目前临床疗效最好的抗血管生成药物。Bevacizumab联合以5-氟尿嘧啶为基础的化疗用于晚期结直肠癌的治疗，可明显延长患者生存期。另一项TREE(Three Regimens of Eloxatin Evaluation)临床试验显示化疗和靶向治疗联合使用可使晚期大肠癌患者的中位生存期超过2年(FOLFOX+bevacizumab组的中位生存期为26个月，CapeOx+bevacizumab组的中位生存期为27个月)，其结果进一步确立了bevacizumab在晚期大肠癌一线治疗中的地位。此外，bevacizumab在非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌等的治疗中也取得了不错的疗效。随着适用肿瘤类型的不断增多，对bevacizumab的耐药现象也越来约普遍。耐药性出现的原因一方面是由于信号转导通路的冗余，当某一条信号途径被抑制后，肿瘤细胞可通过旁路途径进行信号传导。另一方面，调控肿瘤细胞生长、存活和转移的各信号通路之间还存在着复杂的交叉和代偿现象，因此，多靶点联合阻断信号传导是更为有效可行的抗肿瘤策略。

临床实践研究显示，同时抑制EGFR/VEGF(R)介导的信号通路可获得更为显著的抗肿瘤疗效。对EGFR/VEGF(R)信号通路的双重抑制包括两种策略，一是将作用于EGFR或VEGF(R)的两种靶向性药物联合使用；二是多靶标酪氨酸激酶抑制剂的开发，如vandetanib、AEE788等。但是这类药物的作用机制并没有真正研究清楚，很难对它们的疗效进行预测，且无法对其作用的所有靶点均达到最佳抑制浓度，脱靶效应也是不容忽视的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种双特异性融合蛋白，该融合蛋白可竞争性地与EGF类配体和VEGF的结合阻断配体-受体之间的相互作用及下游的信号转导，具有良好的体内外抗肿瘤活性。

本发明的目的之二在于提供该融合蛋白的编码基因。

本发明的目的之三在于提供以上述融合蛋白为活性成分的药物以及上述融合蛋白的制药用途。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种双特异性融合蛋白，从N端到C端依次包括：特异性结合血管内皮细胞生长因子的第一靶向结合域、中间桥连结构域以及特异性结合表皮生长因子和转化生长因子-α的第二靶向结合域；

其中，所述第一靶向结合域为VEGFR1的免疫球蛋白样结构域1-3或其一部分，或者，所述第一靶向结合域为抗VEGF单链抗体或其一部分；

所述中间桥连结构域为免疫球蛋白Fc区，所述第二靶向结合域为EGFR胞外配体结合结构域或其一部分。

进一步地，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1 Fc区。

进一步地，所述双特异性融合蛋白还包括设于所述中间桥连结构域与所述第二靶向结合域之间的连接肽，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)_n，其中，2≤n≤4。

进一步地，n优选为3。

进一步地，所述VEGFR1免疫球蛋白样结构域1-3的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述抗VEGF单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述EGFR胞外配体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：本发明还提供上述双特异性融合蛋白的编码基因。

进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以上述的双特异性融合蛋白为活性成分。

进一步地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的非小细胞肺癌。

进一步地，所述哺乳动物是人。

本发明的目的之四采用如下技术方案实现：本发明还提供上述双特异性融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。

进一步地，所述哺乳动物是人。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：(1)本发明提供的双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc和scFv-VEGFR/Fc可以使用基因工程手段进行大规模发酵制备。(2)本发明提供的双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc和scFv-VEGFR/Fc通过与EGF、TGF-α、VEGF等配体的竞争性结合阻断了配体对受体的激活及下游的信号传导，达到了对EGFR/VEGF(R)信号通路的双重抑制，从而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、生长以及侵袭能力，显示出强烈的体内抗肿瘤活性。另外，融合蛋白具有较低的药物毒性，具有发展成肿瘤靶向性治疗药物的潜能。

附图说明

图1为VEGFR-EGFR/Fc蛋白的结构示意图；

图2为scFv-EGFR/Fc蛋白的结构示意图；

图3为质粒proEM-VEGFR-EGFR/Fc琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA marker，1：proEM-VEGFR-EGFR/Fc质粒；

图4为质粒proEM-scFv-EGFR/Fc琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNAmarker；1：proEM-scFv-EGFR/Fc质粒；

图5为SDS-PAGE分析VEGFR-EGFR/Fc蛋白纯化情况，其中，M：蛋白marker，1：离心后细胞培养液上清组分，2：样品过Ni²⁺柱后穿透液，3-4：50mmol/L咪唑洗脱组分，5-7：500mmol/L咪唑洗脱组分；

图6为SDS-PAGE分析scFv-EGFR/Fc蛋白纯化情况，其中：，M：蛋白marker，1；离心后细胞培养液上清组分，2：样品过Ni²⁺柱后穿透液，3-4：50mmol/L咪唑洗脱组分，5-7：500mmol/L咪唑洗脱组分；

图7为SDS-PAGE分析VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白纯度，其中，M：蛋白分子量标准(kDa)，1：VEGFR-EGFR/Fc蛋白，2：scFv-EGFR/Fc蛋白；

图8为Westernblot鉴定VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白，其中，M：蛋白分子量标准(kDa)，1：VEGFR-EGFR/Fc蛋白，2：scFv-EGFR/Fc蛋白；

图9为ELISA法检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白与EGF、VEGF、TGF-α的亲和活性；

图10为ELISA法检测scFv-EGFR/Fc蛋白与EGF、VEGF、TGF-α的亲和活性；

图11为VEGFR-EGFR/Fc蛋白对A549细胞的增殖抑制作用检测(EGF刺激)；

图12为VEGFR-EGFR/Fc蛋白对A549细胞的增殖抑制作用检测(VEGF刺激)；

图13为scFv-EGFR/Fc蛋白对A549细胞的增殖抑制作用检测(EGF刺激)；

图14为scFv-EGFR/Fc蛋白对A549细胞的增殖抑制作用检测(VEGF刺激)；

图15为Transwell实验检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白对A549细胞迁移的抑制作用；

图16为Transwell实验检测scFv-EGFR/Fc蛋白对A549细胞迁移的抑制作用；

图17为Transwell实验检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白对A549细胞侵袭的抑制作用；

图18为Transwell实验检测scFv-EGFR/Fc蛋白对A549细胞侵袭的抑制作用；

图19为VEGFR-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用；

图20为scFv-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用；

图21为VEGFR-EGFR/Fc蛋白对裸鼠体重的影响；

图22为scFv-EGFR/Fc蛋白对裸鼠体重的影响。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，无特殊说明，均为市售购买产品。

本发明提供的双特异性融合蛋白可特异地与肿瘤细胞的血管内皮细胞生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)结合，提供了两种双特异性融合蛋白。其中，第一种双特异性融合蛋白为VEGFR-EGFR/Fc蛋白，图1为该融合蛋白的结构示意图，是由VEGFR1的免疫球蛋白(Ig)样结构域1-3、人IgG1的Fc段以及EGFR胞外配体结合结构域三部分组成，其中VEGFR1的Ig样结构域1-3和EGFR胞外配体结合结构域分别位于IgG1的Fc段的N末端和C末端；为了避免各分子之间空间结构的相互干扰，在IgG Fc段和EGFR之间设计了(G₄S)₃的柔性连接肽。VEGFR-EGFR/Fc蛋白由1095个氨基酸组成(含六聚组氨酸标签)，分子量122095Da，其中VEGFR1基因Ig样结构区的1-3区含306个氨基酸，人IgG Fc段含232个氨基酸，人EGFR胞外区含536个氨基酸。第二种双特异性融合蛋白scFv-EGFR/Fc，图2为该融合蛋白的结构示意图，是由抗VEGF单链抗体、人IgG1的Fc段以及EGFR胞外配体结合结构域三部分组成，其中抗VEGF单链抗体和EGFR胞外配体结合结构域分别位于IgG1的Fc段的N末端和C末端，在IgG Fc段和EGFR之间由(G₄S)₃的柔性连接肽进行连接；scFv-EGFR/Fc蛋白由1029个氨基酸组成(含六聚组氨酸标签)，分子量113059Da，其中抗VEGF单链抗体含240个氨基酸，人IgG Fc段含232个氨基酸，人EGFR胞外区含536个氨基酸。

本发明提供的双特异性融合蛋白通过以下实验步骤获得：

抗VEGF单链抗体的筛选：在前期构建好的人源性噬菌体展示单链抗体库的基础上，以VEGF为靶抗原对抗体库进行了六轮筛选，得到了抗VEGF单链抗体，经基因测序获得了该单链抗体的DNA序列和氨基酸序列。

双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc真核表达载体的构建：将人VEGFR1基因(GenBank序列号：AAH39007)Ig样结构区的1-3区(27-332氨基酸)，连接到人IgG Fc段(GenBank序列号：AAA02914；245-476氨基酸)的N末端，将人EGFR胞外区基因(GenBank序列号：AAH94761.1；25-560氨基酸)连接到人IgG Fc段的C末端，其中在EGFR和IgG Fc段之间插入了(G₄S)₃连接肽。VEGFR-EGFR/Fc蛋白由1095个氨基酸组成(含六聚组氨酸标签)，分子量122095Da。VEGFR-EGFR/Fc蛋白采用德泰生物开发的密码子优化软件MaxCodon^TMOptimizationProgram(V13)对蛋白的核苷酸序列进行优化，并委托德泰生物技术公司对该蛋白进行全基因合成，并加入EcoRI和HindIII酶切位点。将该基因双酶切后插入到表达载体proEM中，经测序确认与最终表达载体的准确性。

双特异性融合蛋白scFv-EGFR/Fc真核表达载体的构建：将获得的抗VEGF单链抗体基因连接到人IgG Fc段的N末端，将人EGFR胞外区基因连接到人IgG Fc段的C末端，其中在IgG Fc段和EGFR和之间插入了(G₄S)₃连接肽。scFv-EGFR/Fc蛋白采用德泰生物开发的密码子优化软件MaxCodon^TMOptimizationProgram(V13)对蛋白的核苷酸序列进行优化，并委托德泰生物技术公司对该蛋白进行全基因合成，并加入EcoRI和HindIII酶切位点。将该基因双酶切后插入到表达载体proEM中，经测序确认与最终表达载体的准确性。

双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc和scFv-EGFR/Fc在哺乳动物细胞HEK293中的表达与纯化：将表达载体proEM-VEGFR-EGFR/Fc、proEM-scFv-EGFR/Fc转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过质粒大量抽提试剂盒提取转染级质粒，之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达，再通过亲和层析纯化EGFR-VEGFR/Fc蛋白和scFv-VEGFR/Fc蛋白。

双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc、scFv-VEGFR/Fc的生物学活性测定：主要采用ELISA法检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-VEGFR/Fc蛋白与EGF、TGF-α、VEGF等配体的亲和能力；采用MTT法检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白、scFv-VEGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制能力；采用划痕愈合实验和transwell实验检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白、scFv-VEGFR/Fc蛋白对A549细胞的侵袭、迁移的抑制作用；采用人A549裸鼠移植瘤模型检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白、scFv-VEGFR/Fc蛋白的体内抗肿瘤活性和对裸鼠的毒性评价。

本发明提供的双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc和scFv-VEGFR/Fc可以使用基因工程手段进行大规模发酵制备。并且，双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc和scFv-VEGFR/Fc通过与EGF、TGF-α、VEGF等配体的竞争性结合阻断了配体对受体的激活及下游的信号传导，达到了对EGFR/VEGF(R)信号通路的双重抑制，从而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、生长以及侵袭能力，显示出强烈的体内抗肿瘤活性。另外，融合蛋白具有较低的药物毒性，具有发展成肿瘤靶向性治疗药物的潜能。

实施例1

重组表达质粒proEM-VEGFR-EGFR/Fc的构建：

本实施例中的免疫球蛋白Fc区为人IgG1 Fc区，根据GenBank数据库中VEGFR1(GenBank序列号：XM_017020485.1)、人IgG(GenBank序列号：JQ666008.1)和人EGFR(GenBank序列号：NM_005228.5)的基因序列设计出VEGFR-EGFR/Fc的基因序列，并使用德泰生物开发的密码子优化软件MaxCodon^TMOptimizationProgram(V13)对蛋白的核苷酸序列进行优化，之后由南京德泰生物技术公司合成VEGFR-EGFR/Fc的基因，并引入EcoRI和HindIII酶切位点。将该基因用EcoRI和HindIII双酶切后插入到表达载体proEM中，并通过测序确认了最终表达载体的准确性。

构建成功的VEGFR-EGFR/Fc基因(SEQ ID NO:5)由人VEGFR1基因免疫球蛋白(Ig)样结构区的1-3区(918bp)、人IgG Fc段(696bp)、人EGFR胞外区基因(1608bp)三部分组成，其中在EGFR和IgG Fc段之间插入了(G₄S)₃连接肽(45bp)。该基因编码的VEGFR-EGFR/Fc蛋白由1095个氨基酸组成(含六聚组氨酸标签)，分子量122095Da。测序结果和预期一致，表明载体构建成功。其中，VEGFR1免疫球蛋白样结构域1-3的氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO:1，EGFR胞外配体结合结构域的氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO:3，免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO:4，融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc的氨基酸序列参见序列表SEQ IDNO:7。

实施例2

抗VEGF单链抗体的筛选：

将免疫管用VEGF蛋白进行包被，包被完毕用PBS洗管3次。加入封闭液(2％脱脂奶粉/PBS)封闭免疫管，37℃封闭2h。倒掉封闭液，用PBS洗管3次。向封闭好的免疫管中加入初级抗体库噬菌体上清混合液，37℃轻摇温育30min后，再37℃静置温育1.5h。弃去免疫管内噬菌体上清，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次。此时，和VEGF抗原发生特异性结合的噬菌体被结合在免疫管内，之后加入宿主菌TG1(OD600＝0.5)，2ml/管，37℃，150rpm振荡培养1h将特异性结合的噬菌体洗脱下来。此时完成了第一轮的淘筛，获得了一级抗体库取振荡培养的菌液，用2YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOBAG平板，30℃培养过夜，计算一级抗体库的滴度，滴度(pfu)＝菌落数×稀释倍数×10。第二轮淘筛：向一级库中加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和2％的葡萄糖，同时加入4×10¹⁰pfu的M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min后，再250rpm振荡培养30min。1000g离心10min，去上清，用100ml 2YT-AK培养基重悬细胞，37℃，250rpm振荡培养过夜。后面的淘筛步骤同第一轮筛选，共进行六轮的筛选。从六级库中随机挑选48个克隆，用VEGF蛋白包被酶标板，采用ELISA法检测挑选出吸光值最高的克隆，即为筛选获得的抗VEGF单链抗体，由上海英骏公司对该克隆进行测序，获得抗VEGF单链抗体的DNA序列。

实施例3

重组表达质粒proEM-scFv-EGFR/Fc的构建：

本实施例中的免疫球蛋白Fc区为人IgG1 Fc区，根据测序获得的抗VEGF单链抗体的基因序列、人IgG和人EGFR的基因序列设计出scFv-EGFR/Fc的基因序列，并使用德泰生物开发的密码子优化软件MaxCodon^TMOptimization Program(V13)对蛋白的核苷酸序列进行优化，之后由南京德泰生物技术公司全合成scFv-EGFR/Fc的基因，并引入EcoRI和HindIII酶切位点。将该基因用EcoRI和HindIII双酶切后插入到表达载体proEM中，并通过测序确认了最终表达载体的准确性。

构建成功的scFv-EGFR/Fc基因(SEQ ID NO:6)由抗VEGF单链抗体(720bp)、人IgGFc段(696bp)、人EGFR胞外区基因(1608bp)三部分组成，其中在IgG Fc段和EGFR之间插入了(G₄S)₃连接肽(45bp)。该基因编码的scFv-EGFR/Fc蛋白由1029个氨基酸组成(含六聚组氨酸标签)，分子量113059Da。测序结果和预期一致，表明载体构建成功。其中，抗VEGF单链抗体的氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO:2，EGFR胞外配体结合结构域的氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO:3，免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO:4，融合蛋白scFv-EGFR/Fc的氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO:8。

实施例4

双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc在哺乳动物细胞HEK293中的表达：

将表达载体proEM-VEGFR-EGFR/Fc和proEM-scFv-EGFR/Fc首先转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过质粒大量抽提试剂盒提取转染级质粒，之后再将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达。

4.1proEM-VEGFR-EGFR/Fc、proEM-scFv-EGFR/Fc质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞

从-80℃冰箱中取出预先制备好的DH5α感受态细胞100μl，置于冰上融化，将100ng的proEM-VEGFR-EGFR/Fc质粒或proEM-scFv-EGFR/Fc质粒加入DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min，之后于42℃水浴锅中热激90sec，再放置于冰上2min。在转化后的感受态细胞中加入LB液体培养基，放入摇床中37℃、200rpm振荡培养1h。吸出100μl的感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体平板上，放入培养箱中，37℃倒置培养过夜。次日用接种环从平板上挑取一个单克隆接种至LB/Amp培养基中，37℃、200rpm振荡培养8h。按1/500的比例吸取菌液接种于200mlLB/Amp培养基中，37℃、200rpm振荡培养16h。

4.2proEM-VEGFR-EGFR/Fc、proEM-scFv-EGFR/Fc质粒抽提

proEM-VEGFR-EGFR/Fc、proEM-scFv-EGFR/Fc质粒抽提采用Qiagen公司的转染级质粒抽提试剂盒，按照试剂盒的说明，首先将培养好的菌液6000g、4℃离心15min收集菌体沉淀，弃上清。将菌体沉淀用10ml P1缓冲液进行重悬，加入10ml P2缓冲液，上下颠倒离心管4-6次充分混匀，于室温孵育5min。在上述裂解菌液中加入10ml预冷的P3缓冲液，上下颠倒离心管4-6次充分混匀。将裂解液倒入试剂盒中QIAfilter Cartridge的过滤桶中，室温孵育10min，不要放入柱塞。取下滤筒出口处的盖子，轻轻地将过滤柱的柱塞推入过滤柱中，将裂解液过滤到一个50ml的离心管中。加入2.5ml的ER缓冲液，上下颠倒离心管10次充分混匀，冰上孵育30min。在QIAGEN-tip离心柱中加入10ml QBT缓冲液以平衡离心柱，然后将上一步中获得的裂解液加入到离心柱中，利用重力使裂解液自然流过离心柱的树脂。用30ml的QC缓冲液洗涤离心柱2次，最后用15ml的QN缓冲液将吸附在树脂上的质粒DNA洗脱下来。在质粒DNA溶液中加入0.7倍体积的异丙醇混匀，之后于15,000g、4℃离心30min以沉淀DNA，小心地将上清倒掉。用5ml不含内毒素的70％乙醇对DNA沉淀洗涤一次，15,000g、4℃离心10min，小心地将上清倒掉。将离心管盖子打开，DNA沉淀在空气中干燥5-10min，最后加入适量的不含内毒素的TE缓冲液将DNA溶解，取适量质粒进行琼脂糖凝胶电泳，请参阅图3和图4，其中，图3为质粒proEM-VEGFR-EGFR/Fc琼脂糖凝胶电泳图，图4为质粒proEM-scFv-EGFR/Fc琼脂糖凝胶电泳图。

对质粒DNA的质量，包括A260/A280、内毒素含量以及无菌性进行检测，结果显示，proEM-EGFR-VEGFR/Fc质粒A260/A280比值为1.91，proEM-scFv-VEGFR/Fc质粒的A260/A280比值为1.96。两种质粒经鲎试剂检测，其内毒素水平均<50EU/mg，且涂布在LB平板上培养后无菌落长出，符合无菌要求。

4.3HEK293细胞复苏与传代

提前将水浴锅打开，预热至37℃，细胞培养液也进行37℃预热。从液氮罐中取出冻存的HEK293细胞并立即放入37℃水浴中，轻微晃动使其快速融化。用75％乙醇消毒冻存管外壁，放入超净工作台内，转移到含10ml细胞培养液的离心管中，800rpm室温离心5min，去掉上清。将细胞沉淀用少量新鲜培养液重悬，转移到细胞培养瓶中，加入新鲜的细胞培养液轻轻摇动，使细胞分散均匀，取出适量细胞进行计数及活力检测，使细胞密度控制在3-4×10⁵cells/mL，活力大于95％，置于培养箱中110rpm、37℃、5％CO₂培养。细胞培养2-3天，密度达到2×10⁶cells/mL时需要对细胞进行传代。从培养瓶中取出部分培养物弃掉，再向培养瓶中补加新鲜培养液，对剩余的细胞培养物稀释，放入培养箱中110rpm、37℃、5％CO₂继续培养，每天需要对细胞密度及活力进行检测。

4.4proEM-VEGFR-EGFR/Fc、proEM-scFv-VEGFR/Fc质粒转染HEK293细胞

扩大培养HEK293细胞使细胞密度至少达到3-5×10⁶cells/mL，对HEK293细胞进行传代，调整密度为2.5-3×10⁶cells/mL左右，然后常规细胞培养过夜。转染前对细胞密度和细胞活力进行计数，转染当天细胞密度应控制在4.5-5.5×10⁶cells/mL，且细胞活力大于95％。加入新鲜的细胞培养液对细胞进行稀释为3×10⁶cells/mL，轻轻晃动培养瓶混匀细胞。轻柔地上下颠倒ExpiFectamine ^TM 293试剂瓶4-5次以充分混匀。使用Opti-Plex^TMComplexationbuffer对质粒DNA进行稀释至终浓度为1μg/ml。使用Opti-Plex^TMComplexationbuffer对ExpiFectamine ^TM 293regent进行稀释，轻柔颠倒混匀，之后于室温孵育5min。将稀释后的ExpiFectamine ^TM 293regent加入到稀释好的质粒DNA中，轻柔混匀，室温孵育10-20min。将上述混合物缓慢地加入到细胞中，在加的过程中不断轻轻晃动培养瓶，之后将细胞置于37℃培养箱中、8％CO₂、110rpm进行培养。在转染18-22小时后，将ExpiFectamin ^TM 293Transfection Enhancer1和ExpiFectamin ^TM 293TransfectionEnhancer 2加入到培养瓶中，在加的过程中不断的轻柔晃动培养瓶，之后迅速将培养瓶放回培养箱中按原来条件继续培养。转染4-6天后，取出细胞培养物，离心收集培养液上清。

实施例5

双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc的分离纯化

取转染后5天的细胞培养液离心，收集上清，用0.22μm的滤器进行过滤，在4℃条件下用PBS透析12h，透析结束后再进行亲和层析纯化。由于融合蛋白带有六聚组氨酸标签，因此其纯化方法主要采用Ni²⁺亲和层析技术，亲和层析柱HisTrap HP购于GE公司。HisTrap亲和层析柱先用蒸馏水冲洗5个柱体积，再用1×结合缓冲液(20mmol/L磷酸缓冲液，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑)平衡5个柱体积；将上述蛋白溶液上柱，控制流速为1ml/min，收集流出液以备分析；洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸缓冲液，0.5mol/LNaCl，50mmol/L咪唑)冲洗柱子5体积，控制流速为1ml/min，收集流出液以备分析；洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸缓冲液，0.5mol/LNaCl，500mmol/L咪唑)洗脱蛋白，洗5-8个柱体积，流速控制为1ml/min，分管收集流出液以备分析；将各部分的流出液各取50μl进行SDS-PAGE电泳分析，图5为SDS-PAGE分析VEGFR-EGFR/Fc蛋白纯化情况，图6为SDS-PAGE分析scFv-EGFR/Fc蛋白纯化情况，目的蛋白主要存在于洗脱组分Lane 5-6中，收集上述目的蛋白，将其用1×PBS透析24h，透析结束后用用0.22μm的滤器进行过滤，并采用Bradford法测定蛋白的浓度。

实施例6

VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc蛋白质量检测

6.1VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc蛋白稳定性检测

采用冻融实验检测EGFR-VEGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白的稳定性。取出冻存于-80℃的EGFR-VEGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白，放置于冰水浴中5-10min使其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内30min，结果显示无异常现象，表明冻融实验结果正常。

6.2VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc蛋白纯度测定及Westernblot实验鉴定

取出40μl的VEGFR-EGFR/Fc蛋白，加入5×SDS上样缓冲液10μl，沸水浴中变性5min，之后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后采用考马斯亮蓝R250进行染色，染色结束后用脱色液进行多次脱色，直至蛋白条带清晰。采用上述同样的方法对scFv-EGFR/Fc蛋白进行纯度测定。结果如图7所示，VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白纯度均>80％，可见，VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白的纯度均很高。采用Western blot技术对VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白进行鉴定，蛋白样品先进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白条带电转至PVDF膜上，将膜首先用5％脱脂奶粉进行封闭，之后依次与一抗(1:1000稀释的小鼠抗His-tag单抗)和二抗(1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG)孵育，每次孵育结束后均用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min。最后在膜上滴加Westernblot化学发光检测底物，并用凝胶成像系统拍照保存。结果如图8所示，VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白可被抗His-tag单抗识别，且分子量大小与预期相符，可见通过实施例1至5获得的目的蛋白就是VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白。

实施例7

双特异性融合蛋白VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc与配体亲和活性检测：

采用ELISA法检测了VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白与配体EGF、TGF-α、VEGF的亲和活性。

具体步骤如下：

将EGF、TGF-α、VEGF蛋白用PBS稀释至2μg/ml，以100μl/孔加入到ELISA板中，4℃包被过夜；

弃去包被液，PBS洗板3次，在吸水纸上拍干；

每孔加入封闭液(2％脱脂奶粉/PBS)300μl，37℃封闭2h；

将不同浓度梯度的VEGFR-EGFR/Fc蛋白或scFv-EGFR/Fc蛋白加入ELISA板中，每孔100μl，并设置阳性对照和阴性对照，37℃孵育2h；

PBST洗板3次，在吸水纸上拍干；

抗His-tag单抗用PBS以1：2000进行稀释，每孔100μl加入到ELISA板中，37℃孵育1h；

PBST洗板3次，在吸水纸上拍干；

HRP标记的羊抗鼠IgG用PBS以1：5000进行稀释每孔100μl加入到ELISA板中，37℃孵育1h；

PBST洗板3次，蒸馏水洗板2次，在吸水纸上拍干；

每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育15min；

每孔加入100μl 1mol/L的HCl终止反应，此时溶液的颜色变为黄色；

酶标液测定450nm处的吸光值。

图9示出了ELISA法检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白与EGF、VEGF、TGF-α的亲和活性，从图中可以看出VEGFR-EGFR/Fc蛋白与配体EGF、TGF-α、VEGF具有很强的亲和活性，经Prism 5软件计算，该蛋白与EGF、TGF-α、VEGF的亲和常数分别为：0.318μmol/L、0.372μmol/L和0.547μmol/L。图10示出了ELISA法检测scFv-EGFR/Fc蛋白与EGF、VEGF、TGF-α的亲和活性，从图中同样可以看出scFv-EGFR/Fc蛋白与配体EGF、TGF-α、VEGF具有很强的亲和活性，经Prism 5软件计算，该蛋白与配体EGF、TGF-α、VEGF的亲和常数分别为：0.588μmol/L、0.795μmol/L和0.391μmol/L。

实施例8

VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响：

取对数生长期的A549细胞，用胰酶消化后计数，以2000个细胞/孔接种于96孔板中，37℃培养24小时后吸弃培养液，加入不含血清的RPMI1640培养液，之后加入以培养液稀释的不同浓度的VEGFR-EGFR/Fc或scFv-EGFR/Fc蛋白20μl/孔，每个药物浓度设三个平行孔，37℃培养1h后加入终浓度为25ng/ml的EGF或VEGF，37℃继续孵育48小时后，每孔加入以PBS溶解的MTT(5mg/ml)20μl，37℃培养4小时后，吸弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，室温摇床振荡10分钟，酶标仪上测定570nm处的吸光值。每次实验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下面公式计算细胞的存活率及强化融合蛋白的IC₅₀值：细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％。

其中，图11示出VEGFR-EGFR/Fc蛋白对由EGF刺激的A549细胞的增殖抑制作用检测结果，图12示出VEGFR-EGFR/Fc蛋白对由VEGF刺激的A549细胞的增殖抑制作用检测结果；结果表明，VEGFR-EGFR/Fc蛋白可显著抑制由EGF或VEGF刺激的A549细胞的增殖，其对A549细胞的IC₅₀值分别为20.15μg/ml(EGF刺激)和18.79μg/ml(VEGF刺激)。scFv-EGFR/Fc蛋白也可显著抑制由EGF或VEGF刺激的A549细胞的增殖，请参阅图13和图14，scFv-EGFR/Fc蛋白对A549细胞的IC₅₀值分别为3.67μg/ml(EGF刺激)和3.925μg/ml(VEGF刺激)。

实施例9

VEGFR-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549细胞迁移能力的影响：

VEGFR-EGFR/Fc蛋白对细胞的迁移能力的影响采用了transwell实验进行检测。A549细胞常规传代后，于37℃培养箱中培养24h，吸出培养液，加入不含血清的培养液培养24h。提前在24孔板和transwell小室中加入200μl不含血清的培养液，放入培养箱中孵育20min。之后将24孔板和transwell小室中的培养液吸弃，在24孔板中加入500μl含20％血清的培养液。将A549和HUVEC细胞消化计数，并用PBS洗涤一次，取2万个细胞接种至上层的transwell小室中，加入VEGFR-EGFR/Fc蛋白或scFv-EGFR/Fc蛋白至终浓度分别为10μg/ml和20μg/ml，并设置对照组。将含有transwell小室中的24孔板放入培养箱中孵育48h。将小室取出，用棉签轻轻擦去小室里面的细胞，之后将小室放入预先加有1ml 4％多聚甲醛的24孔板中，室温固定细胞10min。取出小室，放入预先加有1ml 0.1％结晶紫染色液中，室温染色30min，之后用PBS清洗小室3次。将小室置于倒置显微镜下观察，每组随机选择5个视野拍照并计数细胞的数目。

图15示出Transwell实验检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白对A549细胞迁移的抑制作用，图16示出Transwell实验检测scFv-EGFR/Fc蛋白对A549细胞迁移的抑制作用。结果显示，对照组细胞穿过transwell小室基底膜的细胞数目较多，每个视野的平均细胞数目为89±10个，而10μg/ml和20μg/ml的VEGFR-EGFR/Fc蛋白处理组每个视野的平均细胞数目分别为31.6±18个和15±4.3个(请参阅图15)，10μg/ml和20μg/ml的scFv-EGFR/Fc蛋白处理组每个视野的平均细胞数目分别为27.6±12.6个和13.1±6.8个(请参阅图16)，这表明VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白可显著抑制A549细胞的迁移能力。

实施例10

VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549细胞侵袭能力的影响：

提前一天将matrigel解冻，然后按照无血清培养基：matrigel＝8:1的比例将二者混匀，于每个transwell小室中加入100μl的matrigel，37℃放置30min，使matrigel凝固。吸出transwell小室中残余的液体，将小室放置于24孔板中，在24孔板和小室中各加入200μl的无血清培养基，37℃放置30min以水化基底膜。将小室和24孔板中的培养液吸出，常规消化经血清饥饿过夜的A549细胞，用PBS洗涤细胞1次，对细胞进行计数，取2万细胞接种至transwell小室中，在下层24孔板中加入500μl含20％血清的培养液。在上层小室中加入VEGFR-EGFR/Fc蛋白或scFv-EGFR/Fc蛋白至终浓度分别为10μg/ml和20μg/ml，37℃培养箱中孵育48h，并设置对照组。将小室取出，用棉签轻柔擦去里面的matrigel和细胞，将细胞置于4％多聚甲醛中固定10min，之后用0.1％结晶紫染色30min，经PBS洗涤3次后置于倒置显微镜下观察，随机挑选5个视野拍照并计数细胞数目。

其中，图17示出Transwell实验检测VEGFR-EGFR/Fc蛋白对A549细胞侵袭的抑制作用，图18示出Transwell实验检测scFv-EGFR/Fc蛋白对A549细胞侵袭的抑制作用。结果显示，对照组中降解matrigel侵袭的细胞数目较多，每个视野的平均细胞数目为27±7.1个，而10μg/ml和20μg/ml的VEGFR-EGFR/Fc蛋白处理组的平均细胞数目分别为19.2±6.5个和8±2.1个(请参阅图17)，而10μg/ml和20μg/ml的scFv-EGFR/Fc蛋白处理组的平均细胞数目分别为12.9±5.9个和7±1.8个(请参阅图18)，这表明VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白可显著抑制A549细胞的侵袭能力。

实施例11

VEGFR-EGFR/Fc、scFv-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤生长的抑制作用和对裸鼠的毒性评价：

VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白的体内抗肿瘤活性分析采用了人非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤模型。雌性BALB/c裸鼠30只饲养在SPF环境中，将A549细胞用PBS重悬后接种至裸鼠右侧腋窝皮下，每只裸鼠接种5×10⁶个细胞，待肿瘤体积长至100mm³时，将裸鼠随机分为对照组、VEGFR-EGFR/Fc蛋白30mg/kg组、VEGFR-EGFR/Fc蛋白60mg/kg组、scFv-EGFR/Fc蛋白30mg/kg组以及scFv-EGFR/Fc蛋白60mg/kg组，每组6只裸鼠。VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白用PBS稀释，通过腹腔注射给药，每周注射2次。对照组腹腔注射相同体积的无菌PBS，每周注射2次。当对照组小鼠肿瘤超过1000mm³时，将小鼠处死，剥离肿瘤在液氮中速冻后放入-80℃保存。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和裸鼠体重，根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线，计算各药物处理组的抑瘤率，并观察VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白对裸鼠体重的影响，评价其毒性大小。

其中，图19示出VEGFR-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用的，图20示出scFv-EGFR/Fc蛋白对人非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用。从图中可以看出，在A549裸鼠移植瘤模型中，VEGFR-EGFR/Fc蛋白可显著的抑制肿瘤的生长，在30mg/kg和60mg/kg的剂量下，抑瘤率分别为58.9％和68.8％，与对照组相比均具有显著性差异。scFv-EGFR/Fc蛋白在30mg/kg和60mg/kg的剂量下，抑瘤率分别为51.6％和61.3％，与对照组相比均具有显著性差异，这表明VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白具有强烈的体内抗肿瘤活性。图21示出了VEGFR-EGFR/Fc蛋白对裸鼠体重的影响，图22示出了scFv-EGFR/Fc蛋白对裸鼠体重的影响。从图中可以看到，在实验期间，未观察到裸鼠死亡或出现腹水及其他异常现象，且各处理组中未见裸鼠体重的下降，这表明在30mg/kg和60mg/kg的剂量下，VEGFR-EGFR/Fc蛋白和scFv-EGFR/Fc蛋白无明显的毒性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 双特异性融合蛋白、其编码基因以及用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Lys Leu Lys Asp Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile

1 5 10 15

Met Gln Ala Gly Gln Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala

20 25 30

His Lys Trp Ser Leu Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu

35 40 45

Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser

50 55 60

Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser

85 90 95

Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met

100 105 110

Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu

115 120 125

Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys

130 135 140

Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp

145 150 155 160

Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile

165 170 175

Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr

180 185 190

Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile

195 200 205

Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu

210 215 220

Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp

225 230 235 240

Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile

245 250 255

Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile

260 265 270

Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg

275 280 285

Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp

290 295 300

Lys Ala

305

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Gly Lys Leu Ile Gly Val Trp Gly Arg Leu Gly Pro Ala Gly

1 5 10 15

Gly Val Pro Glu Thr Leu Leu Phe Ser Leu Trp Ile His Leu Gln Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Ala Leu Gly Pro Pro Gly Ser Arg Glu Gly Thr Gly Ile

35 40 45

Cys Phe Arg Tyr Tyr Cys Tyr Trp Val Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Leu

50 55 60

Ser Asp Gly Gln Ile His His Leu Gln Arg Arg Phe Pro Glu His Gly

65 70 75 80

Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys

85 90 95

Asp Arg Cys Gly Arg Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser His Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly

130 135 140

Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Asn Ile Gly Ala Gly

145 150 155 160

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val

165 170 175

Leu Ile Phe Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Leu Asp Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

195 200 205

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

210 215 220

Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Asn Lys Leu Asn Val Leu Gly

225 230 235 240

<210> 3

<211> 536

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln

1 5 10 15

Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn

20 25 30

Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg

35 40 45

Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr

50 55 60

Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu

65 70 75 80

Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala

85 90 95

Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro

100 105 110

Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn

115 120 125

Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val

130 135 140

Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu

145 150 155 160

Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp

165 170 175

Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala

180 185 190

Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys

195 200 205

His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys

210 215 220

Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys

225 230 235 240

Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn

245 250 255

Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro

260 265 270

Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly

275 280 285

Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys

290 295 300

Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu

305 310 315 320

Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys

325 330 335

Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe

340 345 350

Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu

355 360 365

Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln

370 375 380

Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu

385 390 395 400

Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val

405 410 415

Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile

420 425 430

Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala

435 440 445

Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr

450 455 460

Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln

465 470 475 480

Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro

485 490 495

Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val

500 505 510

Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn

515 520 525

Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

530 535

<210> 4

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 5

<211> 3285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaaaattaa aagatcctga actgagttta aaaggcaccc agcacatcat gcaagcaggc 60

cagacactgc atctccaatg caggggggaa gcagcccata aatggtcttt gcctgaaatg 120

gtgagtaagg aaagcgaaag gctgagcata actaaatctg cctgtggaag aaatggcaaa 180

caattctgca gtactttaac cttgaacaca gctcaagcaa accacactgg cttctacagc 240

tgcaaatatc tagctgtacc tacttcaaag aagaaggaaa cagaatctgc aatctatata 300

tttattagtg atacaggtag acctttcgta gagatgtaca gtgaaatccc cgaaattata 360

cacatgactg aaggaaggga gctcgtcatt ccctgccggg ttacgtcacc taacatcact 420

gttactttaa aaaagtttcc acttgacact ttgatcccta gtggaaaacg cataatctgg 480

gacagtagaa agggcttcat catatcaaat gcaacgtaca aagaaatagg gcttctgacc 540

tgtgaagcaa cagtcaatgg gcatttgtat aagacaaact atctcacaca tcgacaaacc 600

aatacaatca tagatgtcca aataagcaca ccacgcccag tcaaattact tagaggccat 660

actcttgtcc tcaattgtac tgctaccact cccttgaaca cgagagttca aatgacctgg 720

agttaccctg atgaaaaaaa taagagagct tccgtaaggc gacgaattga ccaaagcaat 780

tcccatgcca acatattcta cagtgttctt actattgaca aaatgcagaa caaagacaaa 840

ggactttata cttgtcgtgt aaggagtgga ccatcattca aatctgttaa cacctcagtg 900

catatatatg ataaagcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 960

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 1020

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1080

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1140

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1200

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1260

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1320

accctgcccc catctcggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1380

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1440

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag 1500

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1560

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtccccggg taaaggtgga 1620

ggcggttcag gtggaggcgg ttcaggtgga ggcggttcac tggaggaaaa gaaagtttgc 1680

caaggcacga gtaacaagct cacgcagttg ggcacttttg aagatcattt tctcagcctc 1740

cagaggatgt tcaataactg tgaggtggtc cttgggaatt tggaaattac ctatgtgcag 1800

aggaattatg atctttcctt cttaaagacc atccaggagg tggctggtta tgtcctcatt 1860

gccctcaaca cagtggagcg aattcctttg gaaaacctgc agatcatcag aggaaatatg 1920

tactacgaaa attcctatgc cttagcagtc ttatctaact atgatgcaaa taaaaccgga 1980

ctgaaggagc tgcccatgag aaatttacag gaaatcctgc atggcgccgt gcggttcagc 2040

aacaaccctg ccctgtgcaa cgtggagagc atccagtggc gggacatagt cagcagtgac 2100

tttctcagca acatgtcgat ggacttccag aaccacctgg gcagctgcca aaagtgtgat 2160

ccaagctgtc ccaatgggag ctgctggggt gcaggagagg agaactgcca gaaactgacc 2220

aaaatcatct gtgcccagca gtgctccggg cgctgccgtg gcaagtcccc cagtgactgc 2280

tgccacaacc agtgtgctgc aggctgcaca ggcccccggg agagcgactg cctggtctgc 2340

cgcaaattcc gagacgaagc cacgtgcaag gacacctgcc ccccactcat gctctacaac 2400

cccaccacgt accagatgga tgtgaacccc gagggcaaat acagctttgg tgccacctgc 2460

gtgaagaagt gtccccgtaa ttatgtggtg acagatcacg gctcgtgcgt ccgagcctgt 2520

ggggccgaca gctatgagat ggaggaagac ggcgtccgca agtgtaagaa gtgcgaaggg 2580

ccttgccgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 2640

aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 2700

ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 2760

ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 2820

gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 2880

caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 2940

tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 3000

gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 3060

agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 3120

cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 3180

ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 3240

aactctgagt gcatacagtg ccacccacac caccaccacc accac 3285

<210> 6

<211> 3087

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcgaggta aacttatagg agtctggggg aggcttggtc cagccggggg ggtccctgag 60

actctcctgt tcagcctctg gattcacctt cagtacctgt gctatgcact gggtccgcca 120

ggctccaggg aagggactgg aatatgtttc cggtattatt gttattgggt atacaacaca 180

ctactcagac tcagtgacgg gcagattcac catctccaga gacgattccc agaacacggt 240

gtaaacagtc tgagagctga ggactcagct ctatactact gtgtgaaaga tcgatgtggg 300

aggtatgctt ttgatatatg gggccaaggc accatggtca ccgtctcctc aggtggcggt 360

ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatcacact ctgtgttgac gcagccggcc 420

tcagtgtctg gggccccagg gcagagggtc accatctcct gctccaacat cggggcaggt 480

tatgatgtac actggtacca gcagcttcca ggaacagccc ccaaagtcct catctttggt 540

aacaacaatc ggccctcagg ggtccttgac cgattctctg gctccaagtc tggcacctca 600

gcctccctgg ccatcactgg gctccaggct gaggatgagg ctgattatta ctgccagtcc 660

tatgacagca gcctgagtgg ttatgtcttc ggaactggga acaagctcaa cgtcctaggt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatctcgg 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaaggtg gaggcggttc aggtggaggc 1440

ggttcaggtg gaggcggttc actggaggaa aagaaagttt gccaaggcac gagtaacaag 1500

ctcacgcagt tgggcacttt tgaagatcat tttctcagcc tccagaggat gttcaataac 1560

tgtgaggtgg tccttgggaa tttggaaatt acctatgtgc agaggaatta tgatctttcc 1620

ttcttaaaga ccatccagga ggtggctggt tatgtcctca ttgccctcaa cacagtggag 1680

cgaattcctt tggaaaacct gcagatcatc agaggaaata tgtactacga aaattcctat 1740

gccttagcag tcttatctaa ctatgatgca aataaaaccg gactgaagga gctgcccatg 1800

agaaatttac aggaaatcct gcatggcgcc gtgcggttca gcaacaaccc tgccctgtgc 1860

aacgtggaga gcatccagtg gcgggacata gtcagcagtg actttctcag caacatgtcg 1920

atggacttcc agaaccacct gggcagctgc caaaagtgtg atccaagctg tcccaatggg 1980

agctgctggg gtgcaggaga ggagaactgc cagaaactga ccaaaatcat ctgtgcccag 2040

cagtgctccg ggcgctgccg tggcaagtcc cccagtgact gctgccacaa ccagtgtgct 2100

gcaggctgca caggcccccg ggagagcgac tgcctggtct gccgcaaatt ccgagacgaa 2160

gccacgtgca aggacacctg ccccccactc atgctctaca accccaccac gtaccagatg 2220

gatgtgaacc ccgagggcaa atacagcttt ggtgccacct gcgtgaagaa gtgtccccgt 2280

aattatgtgg tgacagatca cggctcgtgc gtccgagcct gtggggccga cagctatgag 2340

atggaggaag acggcgtccg caagtgtaag aagtgcgaag ggccttgccg caaagtgtgt 2400

aacggaatag gtattggtga atttaaagac tcactctcca taaatgctac gaatattaaa 2460

cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg 2520

ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg gatccacagg aactggatat tctgaaaacc 2580

gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc 2640

catgcctttg agaacctaga aatcatacgc ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct 2700

cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc ttgggattac gctccctcaa ggagataagt 2760

gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg 2820

aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac 2880

agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc 2940

ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac 3000

aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag 3060

tgccacccac accaccacca ccaccac 3087

<210> 7

<211> 1095

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Lys Leu Lys Asp Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile

1 5 10 15

Met Gln Ala Gly Gln Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala

20 25 30

His Lys Trp Ser Leu Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu

35 40 45

Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser

50 55 60

Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser

85 90 95

Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met

100 105 110

Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu

115 120 125

Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys

130 135 140

Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp

145 150 155 160

Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile

165 170 175

Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr

180 185 190

Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile

195 200 205

Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu

210 215 220

Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp

225 230 235 240

Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile

245 250 255

Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile

260 265 270

Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg

275 280 285

Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp

290 295 300

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

305 310 315 320

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

325 330 335

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

340 345 350

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

355 360 365

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

370 375 380

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

385 390 395 400

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

405 410 415

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

420 425 430

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

435 440 445

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

450 455 460

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

465 470 475 480

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

485 490 495

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

500 505 510

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

515 520 525

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

530 535 540

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys

545 550 555 560

Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His

565 570 575

Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly

580 585 590

Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu

595 600 605

Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr

610 615 620

Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met

625 630 635 640

Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala

645 650 655

Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile

660 665 670

Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val

675 680 685

Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn

690 695 700

Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp

705 710 715 720

Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys

725 730 735

Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys

740 745 750

Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly

755 760 765

Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg

770 775 780

Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn

785 790 795 800

Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe

805 810 815

Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp

820 825 830

His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu

835 840 845

Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys

850 855 860

Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile

865 870 875 880

Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly

885 890 895

Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His

900 905 910

Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys

915 920 925

Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr

930 935 940

Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys

945 950 955 960

Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser

965 970 975

Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile

980 985 990

Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys

995 1000 1005

Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly

1010 1015 1020

Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser

1025 1030 1035 1040

Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg

1045 1050 1055

Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu

1060 1065 1070

Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His

1075 1080 1085

Pro His His His His His His

1090 1095

<210> 8

<211> 1029

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Arg Gly Lys Leu Ile Gly Val Trp Gly Arg Leu Gly Pro Ala Gly

1 5 10 15

Gly Val Pro Glu Thr Leu Leu Phe Ser Leu Trp Ile His Leu Gln Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Ala Leu Gly Pro Pro Gly Ser Arg Glu Gly Thr Gly Ile

35 40 45

Cys Phe Arg Tyr Tyr Cys Tyr Trp Val Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Leu

50 55 60

Ser Asp Gly Gln Ile His His Leu Gln Arg Arg Phe Pro Glu His Gly

65 70 75 80

Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys

85 90 95

Asp Arg Cys Gly Arg Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser His Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly

130 135 140

Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Asn Ile Gly Ala Gly

145 150 155 160

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val

165 170 175

Leu Ile Phe Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Leu Asp Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

195 200 205

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

210 215 220

Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Asn Lys Leu Asn Val Leu Gly

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly

485 490 495

Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu

500 505 510

Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu

515 520 525

Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr

530 535 540

Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu

545 550 555 560

Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr

565 570 575

Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys

580 585 590

Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His

595 600 605

Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser

610 615 620

Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser

625 630 635 640

Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser

645 650 655

Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys

660 665 670

Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly

675 680 685

Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr

690 695 700

Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu

705 710 715 720

Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr

725 730 735

Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala

740 745 750

Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly

755 760 765

Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp

770 775 780

Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys

785 790 795 800

Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala

805 810 815

Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu

820 825 830

His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro

835 840 845

Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile

850 855 860

Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu

865 870 875 880

His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His

885 890 895

Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly

900 905 910

Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly

915 920 925

Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe

930 935 940

Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn

945 950 955 960

Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu

965 970 975

Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val

980 985 990

Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu

995 1000 1005

Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro His

1010 1015 1020

His His His His His

1025

Claims

1.双特异性融合蛋白，其特征在于，从N端到C端依次包括：特异性结合血管内皮细胞生长因子的第一靶向结合域、中间桥连结构域以及特异性结合表皮生长因子和转化生长因子-α的第二靶向结合域；

2.根据权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1 Fc区。

3.根据权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述双特异性融合蛋白还包括设于所述中间桥连结构域与所述第二靶向结合域之间的连接肽，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)_n，其中，2≤n≤4。

4.根据权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述VEGFR1免疫球蛋白样结构域1-3的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述抗VEGF单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述EGFR胞外配体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

5.权利要求1至4中任一项所述的双特异性融合蛋白的编码基因。

6.根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6所示。

7.抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物以权利要求1至4中任一项所述的双特异性融合蛋白为活性成分。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的非小细胞肺癌。

9.根据权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述哺乳动物是人。

10.权利要求1至4中任一项所述的双特异性融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。