CN111234020A - 一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种BCMA结合蛋白及其制备方法和应用。所述BCMA结合蛋白包括重链可变区和可变区，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。所述LCDR1、LCDR2和LCDR3以及所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列详见本发明。本发明的BCMA结合蛋白具有良好特异性亲合力，其在肿瘤细胞系上比对照抗体结合更好，且其内化效应且优于对照，因此可以作为ADC候选物进一步开发。经ELISA试验，抗体都有部分阻断功能，在作为mAbs或CAR‑T治疗时可能获得额外的疗效。

Description

一种BCMA结合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物大分子领域，具体涉及一种BCMA结合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)一直以骨髓来源的浆细胞增殖失控为特征，伴有异常分泌的免疫球蛋白或游离轻链，在最常见的血液系统恶性肿瘤中居第二位，约占所有血液肿瘤的10％。在美国，每年新诊断的患者超过30000人，死亡人数超过12000人。尽管有了蛋白酶抑制剂(Bortezomb)等新的靶向疗法，但人们普遍认为它是无法治愈的，因此需要在药物开发方面做出更多的努力。
B细胞成熟抗原(BCMA)，又称TNFRSF17或CD269，是一种仅在B细胞谱系，尤其是末端分化的B细胞中表达的特异性抗原。它通常不存在于初始和记忆B细胞，并在多发性骨髓瘤细胞上高度表达。BCMA与其配体BAFF和APRIL相互作用时，可通过 NF-kB和JNK通路的信号转导，诱导B细胞成熟、增殖和存活。作为一种I型跨膜蛋白，在体液免疫中起着重要的作用，是抗体衍生免疫治疗的理想靶点。
然而现有技术中的抗BCMA的抗体存在内化作用弱以及与293T-huBCMA细胞结合弱等缺陷，因此亟需一种抗BCMA的抗体其既具有足以成药的亲和力又具有优异的内化作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的已有抗BCMA的抗体内化作用弱以及与293T-huBCMA细胞结合弱等缺陷，提供一种BCMA结合蛋白及其制备方法和应用。
为解决以上技术问题，本发明提供一种BCMA结合蛋白，其包括重链可变区(VH) 和轻链可变区(VL)，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的LCDR1 的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示或为其变体，所述的LCDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示或为其变体，所述的LCDR3的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:3所示或为其变体；所述的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的HCDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示或为其变体，所述的HCDR2 的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示或为其变体，所述的HCDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示或为其变体。其中，所述变体为分别在SEQ ID NO:1～6所示的氨基酸序列的基础上发生3、2或者1个突变后获得的氨基酸序列。
在类似“具有3、2或1个氨基酸突变”中“氨基酸突变”是指相较于原氨基酸序列而言，变体的序列存在氨基酸的突变，包括在原氨基酸序列的基础上发生氨基酸的插入、缺失或替换。示例性的解释是对CDR的突变可以包含3个、2个或1个氨基酸的突变，这些CDR之间可以任选地选择相同或不同数目的氨基酸残基进行突变，例如可以是对 CDR1进行1个氨基酸的突变，对CDR2和CDR3不进行氨基酸突变。
本发明中所述的突变可以包括目前如本领域技术人员公知的突变，例如在抗体的生产或者应用过程中，可能会对抗体进行的一些突变，例如对可能存在的，特别是CDR区的转录后修饰(Potential post-translational modifications，PTMs)的位点进行突变，包括抗体的聚集、脱酰胺基敏感(asparagine deamidation，位点(NG、NS和/或NH等)、天冬氨酸异构(DG、DP)敏感位点、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位点及氧化敏感位点等相关突变。
较佳地，本发明中所述的BCMA结合蛋白还包括抗BCMA抗体的框架区，所述框架区包括重链框架区(HFWR)和/或轻链框架区(LFWR)；
所述的重链框架区优选人源重链框架区，所述的人源重链框架区HFWR1～4优选分别包含分别如序列表中SEQ ID NO:13～16所示的氨基酸序列，或者分别为SEQ ID NO: 13～16所示的氨基酸序列的变体；
所述的轻链框架区优选人源轻链框架区，所述的人源轻链框架区LFWR1～4优选分别包含分别如序列表中SEQ ID NO:17～20所示的氨基酸序列，或者分别为SEQ ID NO: 17～20所示的氨基酸序列的变体。
在本发明一较佳实施例中，所述的重链可变区包括如序列表中SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其变体，和/或，所述的轻链可变区包括如序列表中SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体。所述的变体为基于如SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列发生一个或者多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述VH和/或VL的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述 BCMA结合蛋白与BCMA的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性，更优选为至少95％序列同一性，最优选为至少99％序列同一性。
在本发明一更佳的实施例中，所述的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:11所示，且所述的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
在本申请中，上述所列CDR的氨基酸序列均是按照Kabat定义规则所示出的(本发明的权利要求中也是按照Kabat定义规则所示出的序列)。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见JMol Biol 273:927-48,1997)。在本申请中，还可以使用包含了Kabat定义和Chothia定义的Combined定义规则确定可变结构域序列中的氨基酸残基。其中Combined定义规则即是将Kabat定义和Chothia定义的范围相结合，基于此取了一个更大的范围。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应了解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明的权利要求中请求保护的范围是基于Kabat定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
本发明中所述的BCMA结合蛋白，较佳地还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；较佳地，所述重链恒定区选自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突变，所述轻链恒定区选自κ链或者λ链或其突变；其中所述κ链或者λ链优选人源抗体轻链κ链或者λ链。
在本发明一较佳实施例中，所述的重链恒定区为hIgG1，且所述轻链恒定区为人源抗体的轻链κ链。
本发明中所述的BCMA结合蛋白可为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或单区抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
在本发明一具体实施例中，所述的BCMA结合蛋白为全长抗体，所述全长抗体包括重链和轻链，所述重链包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种分离的核酸，其编码如上所述的BCMA结合蛋白。
本发明还提供一种包含如上所述的分离的核酸的表达载体。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含如上所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述宿主细胞的制备方法可为本领域常规的制备方法，例如为：将上述表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。优选地，所述宿主细胞为E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
本发明还提供一种BCMA结合蛋白的制备方法，其包含培养如上所述的宿主细胞，从培养物中获得所述BCMA结合蛋白。
本发明还提供一种免疫偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如上所述的BCMA结合蛋白。
本发明还提供一种药物组合物，其包含如上所述的BCMA结合蛋白或如上所述的免疫偶联物。
本发明还提供如上所述的BCMA结合蛋白、如上所述的免疫偶联物和如上所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用；优选地，所述癌症为骨髓瘤、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌。
此外，为解决上述技术问题，本发明还提供一种药盒组合，其包括药盒A和药盒B；所述药盒A包含本发明所述的BCMA结合蛋白、所述的宿主细胞、所述的免疫偶联物和所述的药物组合物；所述药盒B包含其它靶向的或相同靶向的抗体、双特异性抗体、基因修饰的细胞或药物组合物。所述药盒A和药盒B的使用不分先后顺序，或先使用药盒 A再使用药盒B，或先使用药盒B再使用药盒A。
本发明所述的BCMA结合蛋白、所述的免疫偶联物和所述的药物组合物或所述的药盒组合可施用于病人，用于治疗相关肿瘤。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J.Biol.Chem, 243,p3558(1968)中所述。
如本文使用的，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根据上下文的理解，也包括“由……组成”的情况。
本发明所述的术语“抗体”包括免疫球蛋白(Ig)，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源的κ、λ链或其变体。在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源的IgG1、2、3、4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个互补决定区(CDR)和4个框架区(FWR)组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。轻链的3个 CDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
术语“突变”包括氨基酸或核苷酸的取代、添加和/或缺失，“氨基酸的取代”是其中氨基酸残基以另一种氨基酸残基置换和以具有相似侧链的氨基酸残基置换。
本文使用的术语“载体”或“表达载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
所述的免疫偶联物的制备方法可为本领域常规，较佳地采用Doronina，2006，Bioconjugate Chem.17,114-124所记载的制备方法。优选地，所述的制备方法产生具有最低限度的低偶联级分(LCF)小于10％的抗体药物偶联物。所述的免疫偶联物能够以本领域所知的任何物理形态而存在，较佳地为澄清溶液。
如本发明所用，术语“癌”、“癌症”、“肿瘤”意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明免疫筛选出1种与hBCMA具有良好特异性亲合力的全人源抗体，其在肿瘤细胞系上比对照抗体结合更好。抗体具有内化效应且优于对照，因此可以作为ADC候选物进一步开发。经ELISA试验，抗体都有部分阻断功能，在作为mAbs或CAR-T治疗时可能获得额外的疗效。
附图说明
图1为重组抗体与表达BCMA的细胞系结合强度的测试结果图；a.重组抗体与293T-huBCMA细胞系的结合b.重组抗体与293T-cynoBCMA细胞系的结合，c.重组抗体与 NCI-H929细胞系的结合。
图2为BCMA重组抗体阻断BAFF与BCMA结合的测试。
图3为重组抗体内化至BCMA细胞系的测定。a.重组抗体内化至293T-huBCMA细胞系，b.重组抗体内化至NCI-H929细胞系。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中所使用的阳性对照(亦称对照抗体)为GSK临床II期ADC药物GSK2857916(即美国专利申请US9273141B2中的CA8 J6M0人源化抗体)。对照抗体的各功能区氨基酸序列如下表所示(依据Kabat编号规则)：
Figure RE-GDA0002449521520000061
重链氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGH SDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 7)
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:8)
实施例1抗原制备、小鼠免疫及杂交瘤制备
1.抗原制备
(ACRO cat.no:BCA-C52H7)
供应商 名称 NCBI ID Cat#
Acrobio huBCMA-ECD-Fc Q02223 BCA-H522y
Acrobio BCMA-His BCA-C52H7
Acrobio CynoBCMA-Fc G7NPN8 BCA-C5253
Acrobio CynoBCMA-His BCA-C5225
Acrobio BAFF-his-avitag Q9Y275 BAF-H82Q2
2.免疫
从用BCMA-ECD-Fc蛋白免疫的H2L2小鼠(和铂医药，EP2379727B1)产生的杂交瘤中鉴定出全人源抗BCMA抗体。第一次注射50μg上述融合蛋白，以CFA为免疫佐剂进行免疫，然后在第15、29、43、57、71和86天以25μg蛋白和Ribi佐剂(Sigma-Aldrich； Sigma AdjuvantSystem；Catalog Number S6322)再加强7次。在第50、78和107天采血测试，小鼠血清的结合亲和力通过FACS使用表达人BCMA的HEK293T细胞或肿瘤细胞系(HEK293T-BCMA，购买自kyinno或Capan-2细胞，购自ATCC)进行检测，同时平行使用BCMA-His蛋白进行ELISA检测。根据免疫小鼠血清效价的检测结果，挑选小鼠进行杂交瘤融合，融合前3天，即第132天，以25μg蛋白和Ribi佐剂进行最后一次加强。
3.融合
杂交瘤用常规方法产生和克隆，即通过电融合法，提取小鼠脾脏和淋巴结，研碎提取单细胞，裂红并洗涤后与sp2/0细胞混合。细胞混悬液放入电融合槽电击融合，静置后换20％FBS的HT培养基，之后更换HAT培养基培养。
将收集的脾脏B细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0按2:1(细胞数量比)的比例混合，混合后的细胞用电融合仪(BTX ECM2001)进行细胞融合，将融合后的细胞铺在96孔细胞培养板，在二氧化碳培养箱中37℃培养10天后进行杂交瘤的初筛。过夜复原后，将融合细胞以有限稀释法接种到96孔板中，并用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷进行筛选。通过 ELISA试验和流式细胞术检测杂交瘤培养上清液中抗BCMA抗体的存在。
实施例2抗体筛选及测序
1.ELISA筛选
在96孔板(Corning 9018)中加入在PBS中1μg/ml的新制备的hBCMA ECD-Fc蛋白或hFc，在4℃下涂覆过夜，然后弃去并用PBST清洗3次。在室温下用5％的牛奶封闭平板2小时，并用PBST清洗3次。加入100μl/孔的杂交瘤上清液并在室温下孵育1小时，然后用PBST清洗3次。加入100μl/孔的第二抗体并在室温下孵育1小时，随后清洗。平板中加入100μl/孔的TMB并在室温下孵育15min，然后停止并读取。
2.FACS筛选
对于流式细胞术筛选，v用TypLE(CAT#12605010，Gibco)在37℃消化粘附细胞 3分钟后，用含10％FBS的完全培养基终止消化。用FACS缓冲液(CAT#14190250，Gibco) 清洗细胞并计数，然后稀释至3～5×106/ml密度。将细胞按100μl/孔添加到96孔板(Corning3894)。阻断3～4分钟后，加入100μl/孔杂交瘤上清液，在4℃孵育1小时。洗涤后加入二抗，在4℃孵育一个小时。然后洗涤细胞并进行FACS分析。
3.亚克隆及筛选
用有限稀释法用ELISA法进行阻断试验。
阻断筛选：
对于阻断酶联免疫吸附试验(ELISA)，用在PBS中2μg/ml的hBCMA-ECD-FC涂覆平板过夜，洗涤、封闭和孵育与上述步骤相同。然后在平板中加入6ng/ml的生物素化的 BAFF，在室温下孵育1小时。第二抗体的孵育和检测的后续步骤与以上相同。
4.测序
挑选阳性单克隆，提取总RNA。RT-PCR产生cDNA，随后重链和轻链分别用PCR 扩增(RT-PCR来自赛默飞的Super
Figure RE-GDA0002449521520000091
第一链合成系统，Cat#：11904018，具体操作见产品说明书。PCR使用的是NEB的高保真DNA聚合酶，Cat#：M0530L，具体操作见产品说明书)。然后将PCR产物构建到T载体上，并进行测序(北京擎科生物科技有限公司上海分公司)，同时进行抗体亚型测定。
5.抗体序列信息
测序结果如下所示(根据Kabat编号规则)：
轻链可变区中的LCDR1～3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1～3所示；重链可变区中的HCDR1～3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4～6所示。具体氨基酸序列见下表：
功能区 氨基酸序列
LCDR1 RASQSISSWLA
LCDR2 KASSLES
LCDR3 QQYNSYLFT
HCDR1 SYGMY
HCDR2 AIWNDGSNNYYADSVKG
HCDR3 DRLPMASLRYFDWLGVMDA
实施例3.抗体生产、纯化和验证
1.重组抗体生产和纯化
在得到编码抗体分子的轻、重链可变结构域序列以后，可以采用常规的重组DNA技术，将轻、重链可变结构域序列和相应的人的抗体轻、重链恒定结构域序列进行融合表达，得到重组抗体分子。在本实施例中，抗体重链可变结构域序列(VH)通过基因合成并克隆到编码人IgG1抗体重链恒定结构域序列的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生IgG1抗体的全长重链。抗体轻链可变结构域序列(VL)通过基因合成并克隆到编码人抗体Igκ轻链恒定结构域序列的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生抗体的全长轻链。在本实施例中，由于从免疫的Harbour H2L2小鼠得到的单克隆抗体分子可变结构域的序列是人源抗体序列，因而本实施例也得到全人源的抗BCMA重组IgG1抗体。
例如，本发明人源化抗体的重链序列为：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAAIWN DGSNNYYADSVKGRFTISRDDSKNTLNLQMNSLRAEDTAMYYCARDRLPMASLRYF DWLGVMDAWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQ ID NO:9)
本发明人源化抗体轻链序列为：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLES GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQTDDFATYYCQQYNSYLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:10)
本发明人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列为：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAAIWN DGSNNYYADSVKGRFTISRDDSKNTLNLQMNSLRAEDTAMYYCARDRLPMASLRYF DWLGVMDAWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:11)
本发明人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列为：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLES GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQTDDFATYYCQQYNSYLFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 12)
将编码抗体重链的质粒(Genscript US)和编码抗体轻链的质粒(Genscript US)同时转染哺乳动物宿主细胞(如人胚肾细胞HEK293)，利用常规的重组蛋白表达和纯化技术，可以得到具有轻重链正确配对组装的纯化的重组抗体。具体来说，将HEK293细胞在FreeStyleTM F17 Expression Medium培养基(Thermo，Cat#：A1383504)中扩充培养。瞬时转染开始之前，调节细胞浓度至6～8×105细胞/ml，于37℃ 8％CO2摇床中培养24小时，细胞浓度在1.2×106细胞/ml。准备30ml培养的细胞。将上述编码抗体重链的质粒和编码抗体轻链的质粒以2:3(质量比)的比例混合共计30μg质粒溶解于1.5ml Opti-MEM 减血清培养基(Thermo，Cat#：31985088)，并用0.22μm滤膜过滤除菌。再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/mlPEI(Polysciences，Cat#：23966-2)120μl，静置5分钟。把PEI 缓慢加入质粒中，室温孵育10分钟，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液，于 37℃ 8％CO2摇床中培养5天。5天后观测细胞活率。收集培养物，以3300g转速离心10 分钟后取上清；然后将上清高速离心去除杂质。用PBS(pH7.4)平衡含有MabSelectTM (GE Healthcare Life Science，Cat#：71-5020-91AE)的重力柱(Bio-Rad，Cat#：7311550)， 2-5倍柱体积冲洗。将上清样品过柱；用5-10倍柱体积的PBS冲洗柱子，再用pH3.5的 0.1M甘氨酸洗脱目的蛋白，后用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，最后用超滤管(Millipore， Cat#：UFC901024)浓缩换液至PBS缓冲液，得到纯化的抗体溶液。最后用NanoDrop (Thermo ScientificTM NanoDropTM One)测定浓度，分装、存储备用。
取上述纯化的样品适量分别上样至分析型SEC柱TSKgel G3000SWxl(HPLC仪器型号:安捷伦1260Infinity II)，检测样品的纯度，保证均一样品的纯度在95％以上。该方法流动相为1×PBS，pH7.4(生工，Cat#：E607016)，室温，流速1.0ml/min，样品浓度1 mg/ml，进样体积20μl，检测波长280nm。采集后用ChemStation软件对色谱图进行积分并计算相关数据。
2.重组抗体验证
FACS鉴定：重组抗体依次稀释至9种不同浓度，并在293T-huBCMA、293T- cynoBCMA和NCI-H929细胞系上进行1小时孵育，然后第二抗体进行1小时孵育后检测，验证结果如图1所示。在图1a中，PR000892结合293T-huBCMA细胞(购自康源博创生物科技(北京)有限公司；货号为：CAT#KC-0233)有显著结合，且亲和力要优于对照抗体；图1b中，PR000892结合293T-cynoBCMA(购自康源博创生物科技(北京)有限公司；货号为：CAT#KC-0979)的亲和力与对照抗体相当；在图1c中，PR000892与肿瘤细胞系NCI-H929的亲和力与对照抗体相当。
阻断：重组抗体被连续稀释至7种不同浓度，在预先涂覆2μg/ml的huBCMA-ECD- FC的Corning 9018板上检测，后续步骤与以上相同。如图2所示，PR000892可以部分阻断BAFF与BCMA在体外条件下的结合。
内化：计数293T-huBCMA细胞或NCI-H929细胞，接种5000或10000个/孔至96孔黑壁透明底的平板(PE6005225)。重组抗体连续稀释至9种不同浓度并加入，最终浓度从 100nM开始。加入a-hFc-MMAF使最终浓度为1μg/ml。平板在37℃、5％CO2条件下孵育72小时，然后用CTG试剂盒裂解，并用Enspire检测发光。如图3a中所示，在293T- huBCMA细胞系中，PR000892的内化作用与对照抗体相当；如图3b中所示，PR000892 在NCI-H929细胞系中的内化作用显著优于对照抗体。
另外：经验证，本发明抗体和对照抗体与BCMA抗原(Cat.BCA-H522y)的亲和力相当。
SEQUENCE LISTING
<110> 和铂医药(苏州)有限公司
<120> 一种BCMA结合蛋白及其制备方法和应用
<130> P19012584C
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Leu Phe Thr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Ser Tyr Gly Met Tyr
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Ala Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Asp Arg Leu Pro Met Ala Ser Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Gly Val
1 5 10 15
Met Asp Ala
<210> 7
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 对照抗体重链氨基酸序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 对照抗体轻链氨基酸序列
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 458
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 本发明人源化抗体的重链氨基酸序列
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Leu Pro Met Ala Ser Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu
100 105 110
Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
165 170 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
210 215 220
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
355 360 365
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 本发明人源化抗体的轻链的氨基酸序列
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 本发明人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Leu Pro Met Ala Ser Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu
100 105 110
Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 本发明人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr
20 25
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Asn Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Thr Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 对照抗体的重链可变区的氨基酸序列
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 22
Asn Tyr Trp Met His
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 对照抗体的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 27
Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 28
Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr
1 5

Claims (12)

1.一种BCMA结合蛋白，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的LCDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述的LCDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述的LCDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
所述的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的HCDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述的HCDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述的HCDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。
2.如权利要求1所述的BCMA结合蛋白，其特征在于，所述的BCMA结合蛋白还包括抗BCMA抗体的框架区，所述框架区包括重链框架区和/或轻链框架区；
所述的重链框架区优选人源重链框架区，所述的人源重链框架区HFWR1～4包含分别如序列表中SEQ ID NO:13～16所示的氨基酸序列；
所述的轻链框架区优选人源轻链框架区，所述的人源轻链框架区LFWR1～4包含分别如序列表中SEQ ID NO:17～20所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的BCMA结合蛋白，其特征在于，所述的重链可变区包括如序列表中SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述的轻链可变区包括如序列表中SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1～3任一项所述的BCMA结合蛋白，其特征在于，还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；较佳地，所述重链恒定区选自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突变，所述轻链恒定区选自κ链或者λ链或其突变。
5.如权利要求1～4任一项所述的BCMA结合蛋白，其特征在于，其为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或单区抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.如权利要求5所述的BCMA结合蛋白，其特征在于，所述全长抗体包括重链和轻链，所述重链包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
7.一种分离的核酸，其编码如权利要求1～6任一项所述的BCMA结合蛋白。
8.一种包含如权利要求7所述的分离的核酸的表达载体。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
10.一种BCMA结合蛋白的制备方法，其包含培养如权利要求9所述的宿主细胞，从培养物中获得所述BCMA结合蛋白。
11.一种药物组合物，其包含如权利要求1～6任一项所述的BCMA结合蛋白。
12.如权利要求1～6任一项所述的BCMA结合蛋白和如权利要求11所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用；优选地，所述癌症为骨髓瘤、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌。
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