CN114634568A - Bcma的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种能够特异性识别BCMA的抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的框架区具有选自下列的至少一种突变：c.1E>Q,c.5Q>V,c.9P>A,c.11L>V,c.12I>K,c.38K>R,c.40K>A,c.87T>R,c.91S>T；所述重链可变区的CDR具有SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列；所述轻链可变区的框架区与SEQ ID NO：2相比，具有选自下列的至少一种突变：c.2V>I,c.7P>S,c.12L>P,c.17D>Q,c.50K>Q,c.88L>V；所述轻链可变区的CDR具有SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列。

Description

BCMA的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及BCMA抗体及其应用，更具体地，本发明涉及能够特异性识别BCMA抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、嵌合抗原受体、CART细胞、药物组合物、制药用途以及检测BCMA的试剂盒。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是常见的恶性血液病，占所有癌症死亡例的2％，据Globaldata 2019年统计，2017年全球发病人数为353890人，预计20127年将达到555243例，其主要病状是：骨髓中的浆细胞无限增殖，进而导致骨坏死。目前对于该病的治疗方案主要为对症治疗、化疗、放疗和干细胞移植，但将近100％的复发率让对该病的治疗变得极为艰难。
BCMA(B-cell maturation antigen，B细胞成熟抗原)是TNF超家族受体成员(TNFRSF17，III型跨膜蛋白，全长185个氨基酸，胞外段54个氨基酸)。BCMA特异性高表达于浆细胞和多发性骨髓瘤细胞表面；并且记忆B细胞，造血干细胞和其他正常组织细胞中均不表达。其功能与同家族受体TACI、BAFFR以及配体APRIL/BAFF一起调节B细胞的活化，分化以及转化成浆细胞和延长浆细胞寿命。B细胞分化成浆细胞过程中，细胞表面BCMA表达上调，缺乏BCMA的小鼠有正常数量的B细胞健康且外观正常，但浆细胞的生存周期缩短。
目前对于多发性骨髓瘤患者的治疗，效果差，成本高，周期长。BCMA因其特异性高表达于浆细胞和骨髓瘤细胞的表面，所以BCMA是治疗多发性骨髓瘤非常理想的靶点。现有的临床结果显示对于多发性骨髓瘤患者的免疫细胞治疗明显优于化疗和放疗，但是在使用鼠源抗体进行人体治疗时，鼠源抗体的异质性会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouseantibody reaction，HAMA)，导致抗体半衰期短，在人循环系统中被很快清除，失去疗效。而人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应，因此，抗体的人源化修饰以提高抗体的人源化程度、减弱HAMA显得至关重要。
鉴于此，本领域急需靶向BCMA的人源化抗体。
发明内容
本发明目的在于提供一种特异性针对BCMA的人源化抗体以及一种利用该抗体的单链抗体scFv序列制备的CART细胞。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种能够特异性识别BCMA的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的框架区与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.1E>Q,c.5Q>V,c.9P>A,c.11L>V,c.12I>K,c.20M>V,c.38K>R,c.40K>A,c.44G>R,c.48I>M,c.50Y>W,c.61N>S,c.62E>Q,c.65K>Q,c.67K>R,c.68A>V,c.70L>I,c.72S>R,c.74K>T,c.76S>A,c.87T>R,c.91S>T；所述重链可变区的CDR具有SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的框架区与SEQ IDNO：2相比，具有选自下列的至少一种突变：c.2V>I,c.7P>S,c.12L>P,c.15L>P,c.17D>Q,c.24R>K,c.39H>Y,c.50K>Q,c.88L>V,c.92F>Y,c.94S>M；所述轻链可变区的CDR具有SEQ IDNO:6～8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。根据本发明实施例的抗体为对BCMA的亲和力高，特异性强，阻断APRIL功能强的人源化BCMA抗体，在体内的半衰期期长，大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
GYTFTSYVVH(SEQ ID NO:3)。
IIPYNDDTK(SEQ ID NO:4)。
ARW(SEQ ID NO:5)。
SQSLLHSNGNTY(SEQ ID NO:6)。
KVSNRFSG(SEQ ID NO:7)。
QITHIPFTF(SEQ ID NO:8)。
根据本发明的实施例，上述抗体或其抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别具有SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别具有SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述重链可变区的框架区与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.1E>Q,c.5Q>V,c.9P>A,c.11L>V,c.12I>K,c.38K>R,c.40K>A,c.87T>R,c.91S>T。具有上述突变位点的重链可变区的抗体的人源化效果更优，对BCMA亲和力更强。
根据本发明的实施例，所述轻链可变区的框架区与SEQ ID NO：2相比，具有选自下列的至少一种突变：c.2V>I,c.7P>S,c.12L>P,c.17D>Q,c.50K>Q,c.88L>V。具有上述突变位点的轻链可变区的抗体的人源化效果更优，对BCMA亲和力更强。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别BCMA的胞外区。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：9～10任一项所示氨基酸序列的重链可变区。
具有上述氨基酸序列的重链可变区的抗体对BCMA亲和力更强。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：11～13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。
具有上述氨基酸序列的轻链可变区的抗体对BCMA亲和力更强。
根据本发明的实施例，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG1，2。进而所述抗体的免疫原性可以得到进一步有效降低。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体。
根据本发明的实施例，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。
根据本发明的实施例，所述单链抗体具有SEQ ID NO:14～19所示的氨基酸序列。基于该单链抗体构建的CART细胞在体外对于BCMA阳性的肿瘤细胞有非常好的特异性杀伤功能，不会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody reaction，HAMA)，并且能延长CART在人体内的半衰期，从而能提高CART细胞的在人体内的治疗效果。
huVH1VL1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQITHIPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:14)
hu VH2 VL1：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGRVTLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQITHIPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:15)
hu VH1 VL2：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQITHIPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:16)
hu VH1 VL3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQITHIPFTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:17)
hu VH2 VL2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGRVTLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQITHIPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:18)
hu VH2 VL3
VQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGRVTLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQITHIPFTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:19)
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子所编码的抗体或抗原结合片段为特异性靶向结合BCMA，亲和力高，阻断APRIL功能强的人源化抗体，在体内的半衰期期长，大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:20～24任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:25～30任一项所示核苷酸序列。
FPB-AB1-huVL1 Sequence:
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCACTGTCTCTGCCTGTGACCCTGGGACAGCCAGCCTCTATCTCCTGCAGATCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGCGTGCCTGACCGGTTTAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCCGCGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTATTTTTGTTCTCAGATCACCCACATCCCATTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:20)
FPB-AB1-huVL2 Sequence:
GACGTGGTCATGACCCAGACACCCCTGTCTCTGTCCGTGACACCCGGCCAGCCTGCTAGCATCTCTTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACCGGTTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTATTTTTGTTCTCAGATCACCCACATCCCATTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:21)
FPB-AB1-huVL3 Sequence:
GACATCGTGATGACCCAGACACCCCTGTCTCTGTCCGTGACACCAGGCCAGCCAGCTAGCATCTCTTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGAGTGCCAGACCGGTTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTATTGTTCTCAGATCACCCACATCCCTTTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGG(SEQ ID NO:22)
FPB-AB1-huVH1 Sequence:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTAGCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAAGCTATGTGGTGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAAGCGACAAGTCCAGCTCTACCGCTTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCC(SEQ ID NO:23)
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CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACATCCTATGTGGTGCACTGGGTGAGACAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCCGCGTGACCCTGACATCCGACAAGAGCACCTCTACAGCCTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCC(SEQ ID NO:24)
FPB-AB1-huVH1-VL1
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTAGCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAAGCTATGTGGTGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAAGCGACAAGTCCAGCTCTACCGCTTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACGTGGTCATGACACAGAGCCCACTGTCTCTGCCTGTGACCCTGGGACAGCCAGCCTCTATCTCCTGCAGATCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGCGTGCCTGACCGGTTTAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCCGCGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTATTTTTGTTCTCAGATCACCCACATCCCATTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:25)
FPB-AB1-huVH1-VL2
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTAGCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAAGCTATGTGGTGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAAGCGACAAGTCCAGCTCTACCGCTTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACGTGGTCATGACCCAGACACCCCTGTCTCTGTCCGTGACACCCGGCCAGCCTGCTAGCATCTCTTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACCGGTTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTATTTTTGTTCTCAGATCACCCACATCCCATTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:26)
FPB-AB1-huVH1-VL3
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTAGCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAAGCTATGTGGTGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAAGCGACAAGTCCAGCTCTACCGCTTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACACCCCTGTCTCTGTCCGTGACACCAGGCCAGCCAGCTAGCATCTCTTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGAGTGCCAGACCGGTTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTATTGTTCTCAGATCACCCACATCCCTTTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGG(SEQ ID NO:27)
FPB-AB1-huVH2-VL1
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACATCCTATGTGGTGCACTGGGTGAGACAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCCGCGTGACCCTGACATCCGACAAGAGCACCTCTACAGCCTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACGTGGTCATGACACAGAGCCCACTGTCTCTGCCTGTGACCCTGGGACAGCCAGCCTCTATCTCCTGCAGATCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGCGTGCCTGACCGGTTTAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCCGCGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTATTTTTGTTCTCAGATCACCCACATCCCATTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:28)
FPB-AB1-huVH2-VL2
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACATCCTATGTGGTGCACTGGGTGAGACAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCCGCGTGACCCTGACATCCGACAAGAGCACCTCTACAGCCTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACGTGGTCATGACCCAGACACCCCTGTCTCTGTCCGTGACACCCGGCCAGCCTGCTAGCATCTCTTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACCGGTTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTATTTTTGTTCTCAGATCACCCACATCCCATTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:29)
FPB-AB1-huVH2-VL3
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACATCCTATGTGGTGCACTGGGTGAGACAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATCATCCCTTATAACGACGATACCAAGTACAATGAGAAGTTTAAGGGCCGCGTGACCCTGACATCCGACAAGAGCACCTCTACAGCCTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTCGGTGGGACTACGACGATGGCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACACCCCTGTCTCTGTCCGTGACACCAGGCCAGCCAGCTAGCATCTCTTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCATTGGTATCTGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCTCCGGAGTGCCAGACCGGTTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTATTGTTCTCAGATCACCCACATCCCTTTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGG(SEQ ID NO:30)
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性识别BCMA的抗体或其抗原结合片段表达，进而实现所述抗体或抗原结合片段的体外大量获得。
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，或者表达前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别BCMA的抗体或其抗原结合片段体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种嵌合抗原受体。根据本发明的实施例，所述所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区以及CD8铰链区，所述单链抗体特异性识别BCMA；跨膜区，所述跨膜区包括免疫共刺激因子跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激因子胞内段以及CD3ζ链；其中，所述单链抗体的重链可变区和轻链可变区如前面所限定。发明人发现，表达根据本发明实施例的嵌合抗原受体的CART细胞可以特异的杀伤BCMA阳性的肿瘤细胞，并且不会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody reaction，HAMA)，能延长CART在人体内的半衰期，从而提高CART细胞的在人体内的治疗效果。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种CART细胞。根据本发明的实施例，所述CART细胞表达前面所述的嵌合抗原受体。根据本发明实施例的CART细胞可以特异的杀伤BCMA阳性的肿瘤细胞，并且不会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibodyreaction，HAMA)，能延长CART在人体内的半衰期，从而提高CART细胞的在人体内的治疗效果。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述的抗体，前面所述的核酸分子，前面所述的表达载体、前面所述的重组细胞或前面所述的CART细胞。根据本发明实施例的药物组合物中所包含的抗体或表达的抗体人源化高，能够特异性的靶向结合BCMA，所包含的CART细胞对BCMA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果优，所包含的抗体偶联药物特异性靶向结合BCMA阳性肿瘤细胞，更好地发挥对肿瘤细胞的杀伤效果。
在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的CART细胞或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症为多发性骨髓瘤。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种检测BCMA的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的抗体。前面所述的BCMA抗体能够特异性靶向结合BCMA，根据本发明实施例的试剂盒可以实现BCMA特异性检测，如当抗体结合有荧光基团时，可以采用荧光检测装置实现对BCMA的定位或实时检测。
在本发明的第十方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体、前面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测BCMA或者诊断BCMA相关的疾病。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的ELISA检测BCMA人源化抗体针对BCMA抗原的亲和力结果；
图2是根据本发明实施例的Fortebio检测BCMA人源化抗体针对BCMA抗原的亲和力结果；
图3是根据本发明实施例的FACs检测抗体与肿瘤细胞系的结合结果；
图4是根据本发明实施例的人源化BCMA抗体与BCMA配体APRIL竞争性结合结果；
图5是根据本发明实施例的流式细胞仪进行检测人源化BCMA抗体能够特异性地结合BCMA表达阳性的细胞的结果；
图6是根据本发明实施例的PCDHF-42结构示意图；
图7是根据本发明实施例的PCDHF-73结构示意图；
图8是根据本发明实施例的PCDHF-74结构示意图；
图9是根据本发明实施例的CART细胞CAR阳性率CAR+；
图10是根据本发明实施例的CART与靶细胞共培养6h后靶细胞凋亡检测结果；
图11是根据本发明实施例的CART细胞与靶细胞共培养6h后IL-2检测结果；以及
图12是根据本发明实施例的CART细胞与靶细胞共培养6h后IFNγ检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
抗体
本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。
在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。重链可变区和轻链可变区的除CDR之外的区域被称为框架区。
本发明利用BCMA胞外段，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗BCMA的Fab(antigen-binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与BCMA抗原特异性结合，从而可以靶向性治疗肿瘤等疾病。同时，发明人对所获得的抗体片段进行人源化筛选，发现在重链可变区和轻链可变的框架区的某些位点进行突变后，获得抗体的人源化程度大幅提高，且不影响抗体与抗原的特异性结合。
在一些实施方案中，本发明提供了一种能够特异性识别BCMA的抗体或者抗原结合片段，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的框架区与SEQ IDNO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.1E>Q,c.5Q>V,c.9P>A,c.11L>V,c.12I>K,c.20M>V,c.38K>R,c.40K>A,c.44G>R,c.48I>M,c.50Y>W,c.61N>S,c.62E>Q,c.65K>Q,c.67K>R,c.68A>V,c.70L>I,c.72S>R,c.74K>T,c.76S>A,c.87T>R,c.91S>T；所述重链可变区的CDR具有SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的框架区与SEQ ID NO：2相比，具有选自下列的至少一种突变：c.2V>I,c.7P>S,c.12L>P,c.15L>P,c.17D>Q,c.24R>K,c.39H>Y,c.50K>Q,c.88L>V,c.92F>Y,c.94S>M；所述轻链可变区的CDR具有SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。其中，“c.1”代表在序列中的位置，例如“c.1E>Q”是指所述序列的第一个氨基酸由“E”突变为“Q”,“c.2V>I”是指所述序列的第2个氨基酸由“V”突变为“I”。
另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述重链可变区的CDR和轻链可变区的CDR相比，具有保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏BCMA抗体或者与BCMA抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者极性氨基酸相互取代，例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO：9～10任一项所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：11～13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。发明人通过抗体序列比对数据库(NCBI、IMGT)可得到上述抗重链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:3～5所示)和轻链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:6～8所示)。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:9～10所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:11～13任一项所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。
在一些优选方案中，本发明提供了一种抗BCMA单链抗体，该抗体通过连接肽将前面所述的重链可变区和轻链可变区连接，获得特异性靶向结合BCMA的单链抗体，所述连接肽为常规制备单链抗体常用连接肽或经过改造后性能更优的连接肽。
核酸分子、表达载体、重组细胞
在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。
为此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述所述的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述分离核酸分子具有如SEQ ID NO:20～24任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:25～30任一项所示核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的核酸分子与上述SEQ ID NO:20～24所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:25～30所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。这些与SEQ ID NO:20～24或者SEQ ID NO:25～30具有同源性的序列，能够表达与SEQ ID NO:9～13和SEQ ID NO:14～19相似的氨基酸序列，从而能够与BCMA抗原特异性结合，实现抗体的靶向性功能。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X质粒。
本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。
嵌合抗原受体、CAR T细胞
本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，CAR是结合基于抗体的针对期望的抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性与T细胞受体-激活细胞内结构域以产生展示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
表达CAR的T细胞被称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的胞外区、跨膜区和胞内区。
本发明的实施方案的CAR(包括其功能部分和功能变体)可通过本领域已知的方法获得。CAR可以通过制备多肽或蛋白质的任何合适的方法制备。从头合成多肽和蛋白质的合适的方法描述在参考文献，如Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,OxfordUniversity Press,Oxford,United Kingdom,2000；Peptide and Protein DrugAnalysis,Reid,R.编辑,Marcel Dekker Inc.,2000；Epitope Mapping,Westwood等编辑,OxfordUniversity Press,Oxford,United Kingdom,2001；和美国专利5,449,752中。另外，多肽和蛋白质可利用标准的重组方法使用本文描述的核酸重组产生。参见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborPress,ColdSpring Harbor,NY 2001；和Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates以及John Wiley&Sons,NY,1994。此外，本发明的一些CAR(包括其功能部分和功能变体)可分离自和/或纯化自诸如植物，细菌，昆虫，哺乳动物如大鼠、人等的来源。分离和纯化方法为本领域熟知的。可选地，本文描述的CAR(包括其功能部分和功能变体)可通过诸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide TechnologiesCorp.(Gaithersburg,MD)和Multiple Peptide Systems(San Diego,CA)的公司商业合成。在这方面，可合成、重组、分离和/或纯化本发明的CAR。
测试抗原结合至本发明CAR的任何功能部分的能力的方法为本领域已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如，放射性免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见，如Janeway等,下文和美国专利申请第2002/0197266 A1号)。
本发明还包括在本发明范围内的是本文描述的本发明CAR的功能变体。本文使用的术语“功能变体”是指具有与亲本CAR大量的或显著的序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，所述功能变体保留了CAR变体的生物活性。功能变体涵盖，例如，本文描述的CAR(亲本CAR)的那些变体，其保留了能够以与亲本CAR类似的程度、以与亲本CAR相同的程度或以比亲本CAR更高的程度识别靶细胞。关于亲本CAR，功能变体的氨基酸序列与亲本CAR的氨基酸序列可，例如，具有至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约98％、约99％或更高的同一性。
功能变体可，例如，包含具有至少一个保守性氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。替代地或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守性氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选的是不会干扰或抑制功能变体的生物活性的非保守性氨基酸置换。非保守性氨基酸置换可以增强功能变体的生物活性，使得功能变体的生物活性与亲本CAR相比有所增加。
本发明CAR的氨基酸置换优选为保守性氨基酸置换。保守性氨基酸置换为本领域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被交换为具有相同或类似化学或物理性质的另一氨基酸的氨基酸置换。例如，保守性氨基酸置换可为将酸性/带负电荷的极性氨基酸置换为另一酸性/带负电荷的极性氨基酸(如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸置换为具有非极性侧链的另一氨基酸(如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Tip、Cys、Val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸置换为另一碱性/带正电荷的极性氨基酸(如Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷的氨基酸置换为具有极性侧链的另一不带电荷的氨基酸(如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β分支侧链的氨基酸置换为具有β分支侧链的另一氨基酸(如，Ile、Thr和Val)、具有芳族侧链的氨基酸置换为具有芳族侧链的另一氨基酸(如，His、Phe、Trp和Tyr)等。
本发明的实施方案的CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸为本领域已知的，并且包括例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、Ν',Ν'-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸、以及α-叔丁基甘氨酸。
药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段、前面所述的CART细胞或前面所述的抗体偶联药物和药学可接受的载体。
本文提供的抗BCMA抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗BCMA抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。
例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
当然，本文中的抗BCMA抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述BCMA抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用BCMA抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗BCMA抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗BCMA抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括BCMA相关疾病，例如多发性骨髓瘤等等。当然本文提供的抗体也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。
这些癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。具体地，B淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
在利用本发明所提供的抗BCMA抗体、CART或抗体偶联药物治疗上述疾病时，可以将本发明提供的抗BCMA抗体或CART细胞提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗上述疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的抗体或其抗原结合片段CART细胞。
本发明的优势：
本发明获得了全新的人源化BCMA抗体，该抗体亲和力高，特异性强，阻断功能强，并且基于该抗体序列构建的CART细胞在体外对于BCMA阳性的肿瘤细胞有非常好的特异性杀伤功能。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。本申请是对CN201911298620.7专利中的5E2抗体进行人源化改造，该专利中的全文引入本申请。
实施例1靶向BCMA人源化抗体的获得
将鼠源BCMA抗体(CN201911298620.7专利中5E2 BCMA抗体,重链可变区如SEQ IDNO.1,轻链可变区如SEQ ID NO.2,)进行人源化后获得4个抗体序列，包括2条重链可变区和3条轻链可变区，其氨基酸序列分别如下：
mVH
EVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVKQKPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTT LTVSS(SEQ ID NO:1)
mVL
DVVMTQTPLSLPVTLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQITHIPFTFGSGTKLEIKR(SEQ ID NO:2)
VH1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:9)。
VH2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVVHWVRQAPGQGLEWIGYIIPYNDDTKYNEKFKGRVTLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDYDDGYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:10)。
VL1
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQITHIPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:11)。
VL2
DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQITHIPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:12)。
VL3
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQITHIPFTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:13)。
实施例2 BCMA人源化抗体评价
1)人源化BCMA抗体亲和力检测
通过ELISA、Fortebio和FACs三种方式检测4个BCMA人源化抗体(hu VH1-VL1；huVH2-VL1；hu VH1-VL2；huVH1-VL3)针对BCMA抗原的亲和力，具体方法如下：
抗体亲和力ELISA检测：将hu(人)BCMA ECD His，ACRO，BCA-H522y包被在96孔酶联包被板中，浓度为2μg/mL，100μL/孔，将4个人源化抗体分别用1％BSA配制成起始浓度20μg/mL，1％BSA 3倍梯度稀释(前一梯度抗体浓度为后一梯度抗体浓度的3倍)，抗体与抗原结合，检测4个抗体的EC50值(具体操作步骤为一般ELISA操作步骤)。其中mVH-mVL为鼠源BCMA抗体，是人源化之前的鼠源抗体，结果如下图1所示，结果显示4个人源化BCMA抗体与鼠源BCMA抗体mVH-mVL具有处于同一水平的EC50，并且huVH1-VL2亲和力最高。
抗体亲和力Fortebio检测，利用带AMC biosensor(Pall,lot:1907292)先Loadingh BCMA ECD mFc3ug/mL,然后分别结合4种人源化抗体，分别检测4种抗体的KD，Kon和Kdis。具体操作步骤为使用Fortebio仪器(forteBio，Serial NO:FB-40476)的常规操作。检测结果如下图2所示，说明4个BCMA人源化抗体与抗原的亲和力较强并且和鼠源BCMA抗体mVH-mVL处于同一水平，huVH1-VL2亲和力最高。
FACs检测抗体与肿瘤细胞系的结合：
K562细胞(
Figure BDA0003412689980000122
CCL-243TM)为人慢性髓系白血病细胞，CHO细胞(
Figure BDA0003412689980000123
CRL-12023TM)为中国仓鼠卵巢细胞，分别将含有人BCMA全长序列的慢病毒(含目的基因的载体序列见SEQ ID NO:31)感染K562细胞和CHO细胞，感染后挑单克隆，获得稳定表达BCMA的K562-BCMA细胞株和CHO-BCMA细胞株，检测4人源化抗体分别与K562-BCMA和CHO-BCMA的亲和力(EC50)，具体检测方法如下：收获细胞，PBS洗涤1次，然后用PBS按照2E+5cells/200μL将细胞重悬。将4种BCMA人源化抗体用1％BSA 3倍梯度稀释，前一梯度抗体浓度为后一梯度抗体浓度的3倍，(抗体起始浓度为30μg/ml，共11个梯度)后分别与细胞4℃孵育30min。其后与APC anti-human IgG Fc Antibody(Biolegend，409306)4℃孵育30min，1×PBS洗涤2次，Beckman Coulter(型号：CytoFLEX)流式细胞仪检测。如下图3所示，3个人源化抗体与K562-BCMA细胞和CHO-BCMA细胞有浓度梯度依赖的结合并且EC50与鼠源BCMA抗体处于同一水平，huVH1VL2与K562-BCMA亲和力EC50稍弱一些，但huVH1-VL2与CHO-BCMA亲和力EC50与其它3个人源化抗体处于同一水平，4个人源化抗体和鼠源BCMA抗体与CHO-BCMA结合表达丰度上，从高到低的顺序为m VH-m VL,hu VH1-VL1，hu VH2-VL1，hu VH1-VL2，hu VH1-VL3。
2)4个人源化BCMA抗体与BCMA配体APRIL竞争性结合实验：
购买ACRO重组人APRIL Ala-Leu 250+N端His标签(Human APRIL/TNFSF13Protein,His Tag货号APL-H5244)。将hBCMA-mFc以4μg/ml包被于ELISA板中，4℃包被过夜。1×PBS洗涤1次后，用1％BSA(Sangon Biotech,A500023-0100)封闭1h，然后再用1×PBS洗涤1次。将4个人源化抗体3倍梯度稀释，前一梯度抗体浓度为后一梯度抗体浓度的3倍，起始浓度为100μg/ml，共11个梯度，稀释液用h APRIL His 0.2μg/ml，(此浓度在APRIL与hBCMA-mFc结合的EC50和饱和之间),h APRIL His用1％BSA溶解，37℃孵育30min，1×PBS洗涤5次，加入1:1500稀释的HRP标记的抗His抗体(Anti-his tag HRP,Biolegend，652504)，37℃孵育30min，洗涤5次，TMB显色，终止后多功能酶标仪读数。结果如下图4所示，4个人源化BCMA抗体阻断APRIL的IC50与鼠源BCMA抗体m VH-m VL相当，并且4个人源化BCMA抗体对APRIL与hBCMA-mFc的阻断效果明显且呈浓度梯度依赖性。
3)4个人源化BCMA抗体特异性
对4个人源化BCMA抗体进行特异性流式检测，将4个人源化BCMA抗体10ug/ml100ul分别与K562，K562-BCMA，CHO，CHO-BCMA和K562-BCMA细胞于4℃孵育30min，之后用1×PBS洗涤2次，之后加入APC anti-human IgG Fc Antibody(Biolegend，409306)于4℃孵育30min，之后用1×PBS洗涤2次。然后利用Beckman Coulter流式细胞仪进行检测。检测结果如下图5所示，4个人源化BCMA抗体能够特异性地结合BCMA表达阳性的细胞。
实施例3构建BCMA CART细胞并进行体外功能验证
1)慢病毒包装：
经过亲和力，阻断功能和特异性比较，优选将m VH-m VL,hu VH1-VL1，hu VH2-VL1抗体的scFv序列分别构建在慢病毒载体(PCDHF,含有GFP序列，该载体序列为SEQ ID NO:32)上获得CAR质粒，m VH-m VL,hu VH1-VL1，hu VH2-VL1抗体的scFv序列构建得CAR质粒分别为PCDHF-42,PCDHF-73，PCDHF-74，结构示意图如图6、7、8所示。利用293T细胞(
Figure BDA0003412689980000124
CRL-3216TM)包装慢病毒，包装体系和包装步骤如下所示：
a接种293T细胞5E6于10cm细胞培养皿中，加入10mL含10％FBS的DMEM培养基(DMEMGibco，11995040-1L；FBS Gibco，10091-148)，5％CO2，37℃条件下CO2培养箱中培养24h；
b慢病毒包装体系
Figure BDA0003412689980000121
Figure BDA0003412689980000131
c包装后48h收细胞上清，25000rpm超速离心后检测慢病毒滴度，检测方法如下：将收集的慢病毒原液梯度体积同样条件下感染293T细胞，48h后流式检测293T细胞GFP阳性率百分比，根据计算公式原液滴度(TU/mL)＝1.5×10E+05×293T细胞GFP阳性率百分比/慢病毒原液体积μl×1000来计算慢病毒原液滴度。
2)CART细胞制备
Ficoll淋巴分离液(达科为，AS1114546)从血液(志愿者献血50mL)中分离PBMC细胞，偶联CD3/CD28抗体的磁珠正选法分离获得T细胞，将慢病毒按MOI＝5:1感染T细胞以制备CART细胞，CART细胞培养7天后通过检测CART细胞的GFP阳性率来确定CART细胞CAR阳性率，如图9所示，
3)CART细胞体外功能评价
分别取4种靶细胞K562，K562-BCMA，RPMI8226各2×10E+06个细胞，先利用CytoCalceinTM Violet550对靶细胞进行染色，1×10E+05细胞/100ul/孔。将效应细胞(CAR+CART，T细胞为对照)分别与上述靶细胞按照0.25:1、1:1、5:1及10:1的比率加入96孔板中混匀，终体积200ul。培养6h后，将细胞混匀离心。上清利用Human IL-2ELISA检测试剂盒(invitrogen，REF 88-7025-88)Human IFN gamma ELISA试剂盒(invitrogen，REF 88-7316-88)检测各孔中IL-2及IFN-γ浓度，沉淀部分用100ul Annexin V Binding Buffer(Biolegend，B274722)重悬，300g离心5min，之后添加3ul APC-Annexin V(Biolegend，Cat640920)和1.5ul PI染料(Biolegend，Cat 421301)，避光孵育15min，添加100ulAnnexin V Binding Buffer重悬，之后利用Beckman Coulter流式细胞仪检测各靶细胞凋亡比例(结果如图10所示)，利用ELISA检测各孔上清IL-2及IFN-γ浓度(结果如图11和图12所示)。其中K562为BCMA阴性细胞，K562-BCMA，RPMI8226均为BCMA阳性细胞。结果显示PCDHF-73CART、PCDHF-74CART和PCDHF-42CART对BCMA阳性靶细胞有较强的特异性杀伤，并且3种CART细胞的杀伤阳性靶细胞能力基本一致，对BCMA阴性细胞几乎无杀伤作用；PCDHF-42CART,PCDHF-73CART和PCDHF-74CART杀伤BCMA阳性靶细胞时IL-2和IFN-γ分泌量处于同一水平，综合特异性杀伤和因子分泌的检测结果说明，人源化BCMA CART PCDHF-73CART和PCDHF-74CART与鼠源BCMA CART PCDHF-42CART对BCMA阳性靶细胞有同等的杀伤效果。
CGATACCGTCGACCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGATCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCAAGAGAAGGTAGAAGAAGCCAATGAAGGAGAGAACACCCGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTATTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACATGGCCCGAGAGCTGCATCCGGACTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCCGGACTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCGGCACTGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAATTAACGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGACCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTCGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGGATCCCGCCACCATGGAGACCGACACACTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGATCTACCGGATTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCCCAAAATGAATATTTTGACAGTTTGTTGCATGCTTGCATACCTTGTCAACTTCGATGTTCTTCTAATACTCCTCCTCTAACATGTCAGCGTTATTGTAATGCAAGTGTGACCAATTCAGTGAAAGGAACGAATGCGATTCTCTGGACCTGTTTGGGACTGAGCTTAATAATTTCTTTGGCAGTTTTCGTGCTAATGTTTTTGCTAAGGAAGATAAGCTCTGAACCATTAAAGGACGAGTTTAAAAACACAGGATCAGGTCTCCTGGGCATGGCTAACATTGACCTGGAAAAGAGCAGGACTGGTGATGAAATTATTCTTCCGAGAGGCCTCGAGTACACGGTGGAAGAATGCACCTGTGAAGACTGCATCAAGAGCAAACCGAAGGTCGACTCTGACCATTGCTTTCCACTCCCAGCTATGGAGGAAGGCGCAACCATTCTTGTCACCACGAAAACGAATGACTATTGCAAGAGCCTGCCAGCTGCTTTGAGTGCTACGGAGATAGAGAAATCAATTTCTGCTAGGTAATGAGGCCGGCCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAACTAAGTAAGGATCAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCAT(SEQ ID NO:31)。
CGATACCGTCGACCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGATCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCAAGAGAAGGTAGAAGAAGCCAATGAAGGAGAGAACACCCGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTATTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACATGGCCCGAGAGCTGCATCCGGACTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCCGGACTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTT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ID NO:32)。
慢病毒包装质粒PMD2.G，pMDLg/pRRE，pRSV-Rev序列，可以通过公开途径(网址http://www.miaolingbio.com/)获得。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司
<120> BCMA的抗体及其应用
<130> SI4210265
<160> 32
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Arg
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<223> 重链可变区序列的CDR区
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85 90 95
Ala Arg Trp Asp Tyr Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
210 215 220
Tyr Phe Cys Ser Gln Ile Thr His Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 16
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hu VH1 VL2
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Tyr Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
210 215 220
Tyr Phe Cys Ser Gln Ile Thr His Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 17
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hu VH1 VL3
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Tyr Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Gln Ile Thr His Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 18
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hu VH2 VL2
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Tyr Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
210 215 220
Tyr Phe Cys Ser Gln Ile Thr His Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 19
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hu VH2 VL3
<400> 19
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val
20 25 30
Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Asp Tyr Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
130 135 140
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ser Gln Ile Thr His Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 20
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVL1 Sequence
<400> 20
gacgtggtca tgacacagag cccactgtct ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60
atctcctgca gatccagcca gtccctgctg cacagcaacg gcaatacata cctgcattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtccccccag ctgctgatct acaaggtgtc taacaggttc 180
tccggcgtgc ctgaccggtt tagcggctct ggctccggca ccgatttcac actgaagatc 240
agccgcgtgg aggctgagga tgtgggcgtg tatttttgtt ctcagatcac ccacatccca 300
ttcacatttg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVL2 Sequence
<400> 21
gacgtggtca tgacccagac acccctgtct ctgtccgtga cacccggcca gcctgctagc 60
atctcttgca agtccagcca gtccctgctg cacagcaacg gcaataccta cctgcattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtccccccag ctgctgatct acaaggtgtc taacaggttc 180
tccggagtgc ctgaccggtt ttccggcagc ggctctggca ccgatttcac actgaagatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tatttttgtt ctcagatcac ccacatccca 300
ttcacatttg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 22
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVL3 Sequence
<400> 22
gacatcgtga tgacccagac acccctgtct ctgtccgtga caccaggcca gccagctagc 60
atctcttgca agtccagcca gtccctgctg cacagcaacg gcaataccta cctgcattgg 120
tatctgcaga agcctggcca gccccctcag ctgctgatct acaaggtgtc taacaggttc 180
tccggagtgc cagaccggtt ttccggcagc ggctctggca ccgatttcac actgaagatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgtt ctcagatcac ccacatccct 300
ttcacatttg gccagggcac caagctggag atcaagagg 339
<210> 23
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH1 Sequence
<400> 23
caggtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc caggcgctag cgtgaagatg 60
tcttgcaagg cctccggcta caccttcaca agctatgtgg tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggcaa ggccaccctg acaagcgaca agtccagctc taccgcttat 240
atggagctgt ccagcctgag gtctgaggat acagccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttcc 357
<210> 24
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH2 Sequence
<400> 24
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtgaagaagc caggcgcttc cgtgaagatg 60
agctgcaagg cctctggcta caccttcaca tcctatgtgg tgcactgggt gagacaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggccg cgtgaccctg acatccgaca agagcacctc tacagcctat 240
atggagctgt ccagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttcc 357
<210> 25
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH1- VL1
<400> 25
caggtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc caggcgctag cgtgaagatg 60
tcttgcaagg cctccggcta caccttcaca agctatgtgg tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggcaa ggccaccctg acaagcgaca agtccagctc taccgcttat 240
atggagctgt ccagcctgag gtctgaggat acagccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttccgga 360
ggaggaggct ccggcggagg aggctctgga ggaggaggca gcgacgtggt catgacacag 420
agcccactgt ctctgcctgt gaccctggga cagccagcct ctatctcctg cagatccagc 480
cagtccctgc tgcacagcaa cggcaataca tacctgcatt ggtatctgca gaagccaggc 540
cagtcccccc agctgctgat ctacaaggtg tctaacaggt tctccggcgt gcctgaccgg 600
tttagcggct ctggctccgg caccgatttc acactgaaga tcagccgcgt ggaggctgag 660
gatgtgggcg tgtatttttg ttctcagatc acccacatcc cattcacatt tggccagggc 720
accaagctgg agatcaag 738
<210> 26
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH1- VL2
<400> 26
caggtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc caggcgctag cgtgaagatg 60
tcttgcaagg cctccggcta caccttcaca agctatgtgg tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggcaa ggccaccctg acaagcgaca agtccagctc taccgcttat 240
atggagctgt ccagcctgag gtctgaggat acagccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttccgga 360
ggaggaggct ccggcggagg aggctctgga ggaggaggca gcgacgtggt catgacccag 420
acacccctgt ctctgtccgt gacacccggc cagcctgcta gcatctcttg caagtccagc 480
cagtccctgc tgcacagcaa cggcaatacc tacctgcatt ggtatctgca gaagccaggc 540
cagtcccccc agctgctgat ctacaaggtg tctaacaggt tctccggagt gcctgaccgg 600
ttttccggca gcggctctgg caccgatttc acactgaaga tcagcagggt ggaggctgag 660
gatgtgggcg tgtatttttg ttctcagatc acccacatcc cattcacatt tggccagggc 720
accaagctgg agatcaag 738
<210> 27
<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH1- VL3
<400> 27
caggtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc caggcgctag cgtgaagatg 60
tcttgcaagg cctccggcta caccttcaca agctatgtgg tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggcaa ggccaccctg acaagcgaca agtccagctc taccgcttat 240
atggagctgt ccagcctgag gtctgaggat acagccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttccgga 360
ggaggaggct ccggcggagg aggctctgga ggaggaggca gcgacatcgt gatgacccag 420
acacccctgt ctctgtccgt gacaccaggc cagccagcta gcatctcttg caagtccagc 480
cagtccctgc tgcacagcaa cggcaatacc tacctgcatt ggtatctgca gaagcctggc 540
cagccccctc agctgctgat ctacaaggtg tctaacaggt tctccggagt gccagaccgg 600
ttttccggca gcggctctgg caccgatttc acactgaaga tcagcagggt ggaggctgag 660
gatgtgggcg tgtactattg ttctcagatc acccacatcc ctttcacatt tggccagggc 720
accaagctgg agatcaagag g 741
<210> 28
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH2- VL1
<400> 28
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtgaagaagc caggcgcttc cgtgaagatg 60
agctgcaagg cctctggcta caccttcaca tcctatgtgg tgcactgggt gagacaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggccg cgtgaccctg acatccgaca agagcacctc tacagcctat 240
atggagctgt ccagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttccgga 360
ggaggaggct ccggcggagg aggctctgga ggaggaggca gcgacgtggt catgacacag 420
agcccactgt ctctgcctgt gaccctggga cagccagcct ctatctcctg cagatccagc 480
cagtccctgc tgcacagcaa cggcaataca tacctgcatt ggtatctgca gaagccaggc 540
cagtcccccc agctgctgat ctacaaggtg tctaacaggt tctccggcgt gcctgaccgg 600
tttagcggct ctggctccgg caccgatttc acactgaaga tcagccgcgt ggaggctgag 660
gatgtgggcg tgtatttttg ttctcagatc acccacatcc cattcacatt tggccagggc 720
accaagctgg agatcaag 738
<210> 29
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH2- VL2
<400> 29
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtgaagaagc caggcgcttc cgtgaagatg 60
agctgcaagg cctctggcta caccttcaca tcctatgtgg tgcactgggt gagacaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggccg cgtgaccctg acatccgaca agagcacctc tacagcctat 240
atggagctgt ccagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttccgga 360
ggaggaggct ccggcggagg aggctctgga ggaggaggca gcgacgtggt catgacccag 420
acacccctgt ctctgtccgt gacacccggc cagcctgcta gcatctcttg caagtccagc 480
cagtccctgc tgcacagcaa cggcaatacc tacctgcatt ggtatctgca gaagccaggc 540
cagtcccccc agctgctgat ctacaaggtg tctaacaggt tctccggagt gcctgaccgg 600
ttttccggca gcggctctgg caccgatttc acactgaaga tcagcagggt ggaggctgag 660
gatgtgggcg tgtatttttg ttctcagatc acccacatcc cattcacatt tggccagggc 720
accaagctgg agatcaag 738
<210> 30
<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPB-AB1-huVH2- VL3
<400> 30
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtgaagaagc caggcgcttc cgtgaagatg 60
agctgcaagg cctctggcta caccttcaca tcctatgtgg tgcactgggt gagacaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatcggatac atcatccctt ataacgacga taccaagtac 180
aatgagaagt ttaagggccg cgtgaccctg acatccgaca agagcacctc tacagcctat 240
atggagctgt ccagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgtgc tcggtgggac 300
tacgacgatg gctacttcga ttattggggc cagggcacca cagtgacagt gtcttccgga 360
ggaggaggct ccggcggagg aggctctgga ggaggaggca gcgacatcgt gatgacccag 420
acacccctgt ctctgtccgt gacaccaggc cagccagcta gcatctcttg caagtccagc 480
cagtccctgc tgcacagcaa cggcaatacc tacctgcatt ggtatctgca gaagcctggc 540
cagccccctc agctgctgat ctacaaggtg tctaacaggt tctccggagt gccagaccgg 600
ttttccggca gcggctctgg caccgatttc acactgaaga tcagcagggt ggaggctgag 660
gatgtgggcg tgtactattg ttctcagatc acccacatcc ctttcacatt tggccagggc 720
accaagctgg agatcaagag g 741
<210> 31
<211> 7959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 含目的基因的载体序列
<400> 31
cgataccgtc gacctcgaga cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca 60
gctaccaatg ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca 120
gtcacacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 180
tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatatc 240
cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca 300
gggccaggga tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct acaagctagt accagttgag 360
caagagaagg tagaagaagc caatgaagga gagaacaccc gcttgttaca ccctgtgagc 420
ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa gtattagagt ggaggtttga cagccgccta 480
gcatttcatc acatggcccg agagctgcat ccggactcga gataacttcg tataatgtat 540
gctatacgaa gttattccgg actgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg 600
ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt 660
gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc 720
cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga 780
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 840
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 900
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 960
gggaagacaa tagcaggcat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 1020
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 1080
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 1140
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1200
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 1260
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1320
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1380
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1440
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 1500
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1560
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1620
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1680
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 1740
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 1800
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 1860
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 1920
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 1980
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 2040
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 2100
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 2160
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 2220
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 2280
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 2340
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 2400
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 2460
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 2520
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 2580
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 2640
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 2700
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 2760
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc 2820
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc 2880
ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc 2940
aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc 3000
gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 3060
caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 3120
taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 3180
atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 3240
ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 3300
acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 3360
ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 3420
ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 3480
ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 3540
gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 3600
taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag 3660
ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt 3720
caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt 3780
tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga 3840
aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg 3900
aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag aaggagagag 3960
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc 4020
ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg 4080
agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa 4140
tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga tcattatata 4200
atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac accaaggaag 4260
ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag caagcggccg 4320
ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga attatataaa 4380
tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg 4440
gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca 4500
gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag acaattattg 4560
tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg 4620
ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga 4680
tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact catttgcacc 4740
actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat ttggaatcac 4800
acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat acactcctta 4860
attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga attagataaa 4920
tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc tgtggtatat aaaattattc 4980
ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg 5040
aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg 5100
ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag agacagatcc 5160
attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt 5220
catccacaat tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 5280
agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca 5340
aaattttcgg gtttattaca gggacagcag agatccagtt tggttaatta acgtgaggct 5400
ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 5460
gggtcggcaa ttgacccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 5520
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 5580
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt 5640
gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt 5700
ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga 5760
gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg 5820
ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg 5880
ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag 5940
atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg 6000
gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc 6060
ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctcgccg gcctgctctg gtgcctggcc 6120
tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg 6180
cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc 6240
ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct 6300
cagccgtcgc ttcatgtgac tccactgagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt 6360
tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt 6420
ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct 6480
ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg 6540
ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagggat cccgccacca tggagaccga 6600
cacactgctg ctgtgggtgc tgctgctgtg ggtgccagga tctaccggat tgcagatggc 6660
tgggcagtgc tcccaaaatg aatattttga cagtttgttg catgcttgca taccttgtca 6720
acttcgatgt tcttctaata ctcctcctct aacatgtcag cgttattgta atgcaagtgt 6780
gaccaattca gtgaaaggaa cgaatgcgat tctctggacc tgtttgggac tgagcttaat 6840
aatttctttg gcagttttcg tgctaatgtt tttgctaagg aagataagct ctgaaccatt 6900
aaaggacgag tttaaaaaca caggatcagg tctcctgggc atggctaaca ttgacctgga 6960
aaagagcagg actggtgatg aaattattct tccgagaggc ctcgagtaca cggtggaaga 7020
atgcacctgt gaagactgca tcaagagcaa accgaaggtc gactctgacc attgctttcc 7080
actcccagct atggaggaag gcgcaaccat tcttgtcacc acgaaaacga atgactattg 7140
caagagcctg ccagctgctt tgagtgctac ggagatagag aaatcaattt ctgctaggta 7200
atgaggccgg ccgacgccct tgacgatttt gacttagaca tgctcccagc cgatgccctt 7260
gacgactttg accttgatat gctgcctgct gacgctcttg acgattttga ccttgacatg 7320
ctccccgggt aactaagtaa ggatcaattc gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg 7380
gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 7440
tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 7500
ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 7560
aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 7620
gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 7680
gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 7740
aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc 7800
acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 7860
cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 7920
cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcat 7959
<210> 32
<211> 8067
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 慢病毒载体
<400> 32
cgataccgtc gacctcgaga cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca 60
gctaccaatg ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca 120
gtcacacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 180
tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatatc 240
cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca 300
gggccaggga tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct acaagctagt accagttgag 360
caagagaagg tagaagaagc caatgaagga gagaacaccc gcttgttaca ccctgtgagc 420
ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa gtattagagt ggaggtttga cagccgccta 480
gcatttcatc acatggcccg agagctgcat ccggactcga gataacttcg tataatgtat 540
gctatacgaa gttattccgg actgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg 600
ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt 660
gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc 720
cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga 780
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 840
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 900
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 960
gggaagacaa tagcaggcat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 1020
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 1080
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 1140
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1200
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 1260
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1320
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1380
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1440
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 1500
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1560
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1620
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1680
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 1740
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 1800
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 1860
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 1920
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 1980
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 2040
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 2100
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 2160
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 2220
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 2280
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 2340
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 2400
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 2460
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 2520
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 2580
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 2640
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 2700
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 2760
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc 2820
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc 2880
ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc 2940
aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc 3000
gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 3060
caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 3120
taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 3180
atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 3240
ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 3300
acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 3360
ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 3420
ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 3480
ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 3540
gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 3600
taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag 3660
ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt 3720
caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt 3780
tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga 3840
aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg 3900
aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag aaggagagag 3960
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc 4020
ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg 4080
agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa 4140
tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga tcattatata 4200
atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac accaaggaag 4260
ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag caagcggccg 4320
ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga attatataaa 4380
tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg 4440
gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca 4500
gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag acaattattg 4560
tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg 4620
ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga 4680
tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact catttgcacc 4740
actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat ttggaatcac 4800
acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat acactcctta 4860
attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga attagataaa 4920
tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc tgtggtatat aaaattattc 4980
ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg 5040
aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg 5100
ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag agacagatcc 5160
attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt 5220
catccacaat tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 5280
agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca 5340
aaattttcgg gtttattaca gggacagcag agatccagtt tggttaatta acgtgaggct 5400
ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 5460
gggtcggcaa ttgacccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 5520
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 5580
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt 5640
gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt 5700
ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga 5760
gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg 5820
ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg 5880
ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag 5940
atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg 6000
gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc 6060
ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctcgccg gcctgctctg gtgcctggcc 6120
tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg 6180
cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc 6240
ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct 6300
cagccgtcgc ttcatgtgac tccactgagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt 6360
tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt 6420
ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct 6480
ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg 6540
ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagggat cccgccacca tggtgagcaa 6600
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 6660
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 6720
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 6780
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 6840
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 6900
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 6960
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 7020
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 7080
gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 7140
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 7200
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 7260
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat gaggccggcc 7320
gacgcccttg acgattttga cttagacatg ctcccagccg atgcccttga cgactttgac 7380
cttgatatgc tgcctgctga cgctcttgac gattttgacc ttgacatgct ccccgggtaa 7440
ctaagtaagg atcaattcga tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt 7500
tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct 7560
gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg 7620
tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc 7680
gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt 7740
cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc 7800
gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg 7860
ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg 7920
cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc 7980
ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg 8040
atctcccttt gggccgcctc cccgcat 8067

Claims (15)

1.一种能够特异性识别BCMA的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，
其中，所述重链可变区的框架区与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：
c.1E>Q,c.5Q>V,c.9P>A,c.11L>V,c.12I>K,c.20M>V,c.38K>R,c.40K>A,c.44G>R,c.48I>M,c.50Y>W,c.61N>S,c.62E>Q,c.65K>Q,c.67K>R,c.68A>V,c.70L>I,c.72S>R,c.74K>T,c.76S>A,c.87T>R,c.91S>T；
所述重链可变区的CDR具有SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的框架区与SEQ ID NO：2相比，具有选自下列的至少一种突变：
c.2V>I,c.7P>S,c.12L>P,c.15L>P,c.17D>Q,c.24R>K,c.39H>Y,c.50K>Q,c.88L>V,c.92F>Y,c.94S>M；
所述轻链可变区的CDR具有SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别具有SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3～5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
任选地，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别具有SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6～8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的框架区与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：
c.1E>Q,c.5Q>V,c.9P>A,c.11L>V,c.12I>K,c.38K>R,c.40K>A,c.87T>R,c.91S>T；
任选地，所述轻链可变区的框架区与SEQ ID NO：2相比，具有选自下列的至少一种突变：
c.2V>I,c.7P>S,c.12L>P,c.17D>Q,c.50K>Q,c.88L>V。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别BCMA的胞外区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ IDNO：9～10任一项所示氨基酸序列的重链可变区；
任选地，所述抗体具有如SEQ ID NO：11～13任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一；
任选地，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体；
任选地，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG1，2；
任选地，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体；
任选地，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一；
任选地，所述单链抗体具有SEQ ID NO:14～19所示的氨基酸序列。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA。
9.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:20～24任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:25～30任一项所示核苷酸序列。
10.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区以及CD8铰链区，所述单链抗体特异性识别BCMA；
跨膜区，所述跨膜区包括免疫共刺激因子跨膜区；以及
胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激因子胞内段以及CD3ζ链；
其中，所述单链抗体的重链可变区和轻链可变区如权利要求1～5任一项所限定的或如权利要求6所限定的。
11.一种CART细胞，其特征在于，表达权利要求10所述的嵌合抗原受体。
12.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～6任一项所述的抗体，权利要求7～9任一项所述的核酸分子或权利要求11所述的CART细胞。
13.权利要求1～6任一项所述的抗体、权利要求7～9任一项所述的核酸分子、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的CART细胞或权利要求12所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症；
任选地，所述癌症为多发性骨髓瘤。
14.一种检测BCMA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求利要求1～6任一项所述的抗体。
15.权利要求1～6任一项所述的抗体、权利要求7～9任一项所述的核酸分子在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测BCMA或者诊断BCMA相关的疾病。
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