CN102065888B - 抗-vegf抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体。在某些情况下，该抗体包含：a)重链可变结构域，其包括与选定抗体的重链CDR区基本上相同的CDR区和b)轻链可变结构域，其包括与选定抗体的轻链CDR区基本上相同的CDR区，其中该抗体结合选定的靶。
Description
背景
抗体是结合特异性抗原的蛋白质。通常，抗体对于其靶是特异性的，具有介导免疫效应物机制的能力，并且在血清中具有长半衰期。这样的特性使得抗体成为有力的治疗剂。在治疗上使用单克隆抗体，用于治疗各种病症，包括癌症、炎症和心血管疾病。目前在市场上存在十种以上的治疗性抗体产品，并且有上百种在研发中。
对新的抗体存在持续的需求。
发明概述
提供了一种抗体。在某些情况下，该抗体包含：a)包括与图1中所示的选定抗体的重链CDR区基本上相同的CDR区的重链可变结构域和b)包括与选定抗体的轻链CDR区基本上相同的CDR区的轻链可变结构域，其中该抗体结合选定的靶。在某些实施方案中，抗体的CDR区相对于选定抗体的CDR区，总地可以含有，例如，一个、两个、三个、四个、五个或至多10个氨基酸差异(例如，氨基酸置换、缺失或插入)。在某些情况下，本发明抗体的CDR区可以具有由源自几个相关抗体分析的共有序列限定的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体的CDR区可以与选定抗体的CDR区相同。
提供了一种抗体。在某些情况下，该抗体包含：a)包括与图1中所示的选定抗体的重链CDR区基本上相同的CDR区的重链可变结构域和b)包括与选定抗体的轻链CDR区基本上相同的CDR区的轻链可变结构域，其中该抗体结合选定的靶。在某些实施方案中，抗体的CDR区相对于选定抗体的CDR区，总地可以含有，例如，一个、两个、三个、四个、五个或至多10个氨基酸差异(例如，氨基酸置换、缺失或插入)。在某些情况下，本发明抗体的CDR区可以具有由源自几个相关抗体分析的共有序列限定的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体的CDR区可以与选定抗体的CDR区相同的CDR3区；其中抗体特异性地结合选定的靶。
在某些实施方案中，抗体包含：a)可变结构域，其包括：i.氨基酸序列与图1选定抗体的重链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR2区相同的CDR2区，和iii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR3区相同的CDR3区；和b)轻链可变结构域，其包括：i.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR1区域相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；或b)部分a)的可变结构域的变体，该变体除了在CDR区中有一定数量(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)的氨基酸置换，其他与部分a)的可变区相同，其中该抗体结合选定的靶，并且在某些实施方案中，结合选定靶的活性。
在某些实施方案中，抗体可以包含选自表1的CDR共有组的CDR。在某些实施方案中，抗体可以包含：a)重链可变结构域，其包括：i.包括选自表1的CDR共有组的CDR1氨基酸序列的CDR1区；ii.包括选定CDR共有序列的CDR2氨基酸序列的CDR2区；和iii.包括选定CDR共有序列的CDR3氨基酸序列的CDR3区；和b)轻链可变结构域，其包括：i.包括选定CDR共有序列的CDR1氨基酸序列的CDR1区；ii.包括选定CDR共有序列的CDR2氨基酸序列的CDR2区；和iii.包括选定CDR共有序列的CDR3氨基酸序列的CDR3区；其中所述抗体特异性地结合选定的靶，在某些实施方案中，结合选定靶的活性。
还提供了包括本发明抗体和药物学上可接受载体的药物组合物。
还提供了一种方法。在某些实施方案中，该方法可以包括在适于抗体与靶结合以产生复合物的条件下，使本发明抗体与抗体的靶接触。
还提供了阻断配体结合其受体的方法。在特定的实施方案中，该方法可以包括：将本发明抗体给予受治疗者，其中所述抗体结合所述患者体内的受体或配体并且阻断所述配体及其受体的结合。
选定的靶可以是VEGF。
附图简述
图1显示了选定的VEGF-阻断抗体的氨基酸序列。图1的第1页显示了重链的氨基酸序列。图1的第2页显示了相应轻链的氨基酸序列。每个抗体的CDR的氨基酸序列是框起来的。图1中显示的氨基酸序列是特异性结合VEGF并中和VEGF活性的抗体。从上至下，图1(第1/2页)SEQ ID NO：1-38和图1(第2/2页)SEQ ID NO：39-76。
定义
在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的特定实施方案，因为这些当然可以改变。还应当理解在此所用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围将只由所附权利要求来限制。
除非另外限定，在此所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意思。尽管与在此所述那些相似或相等的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但现在将描述优选的方法和材料。在此提及的所有出版物引入文中作为参考，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
必须注意到如在此和所附权利要求中所用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物，除非文中另外清楚地指出。因此，例如，对“抗体”的提及包括多个这样的抗体，对“构架区”的提及包括一个或多个构架区及其本领域技术人员已知的等价物，诸如此类。
在此所讨论的出版物仅仅是为了在本申请提交日之前的公开内容而提供的。在此没有构成承认由于现有技术的发明而本发明有权先于这些出版物。此外，所提供出版物的日期可以不同于实际出版日期，这可能需要单独证实。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换使用。这些术语是本领域技术人员充分理解的，并且指的是由一个或多个特异性结合抗原的多肽组成的蛋白质。一种形式的抗体组成抗体的基础结构单位。这种形式是四聚物，由两个相同对的抗体链组成，每对具有一个轻链和 一个重链。在每对中，轻链和重链可变区一起负责与抗原的结合，并且恒定区负责抗体效应物功能。
所识别的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链以及α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重链，或其他物种中的等价物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包括NH2-末端的约110个氨基酸的可变区和COOH-末端的κ和λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)，相似地包括可变区(约116个氨基酸)和上述之一的重链可变区，例如γ(约330个氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保持特异性结合抗原的抗体片段，包括，但不限于，Fab、Fv、scFv和Fd片段，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以是可检测标记的，例如，使用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等。可以进一步将抗体缀合其他部分，如特异性结合对的成员，例如，生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等。还可以将抗体结合固体支持物，支持物包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等。术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)2和或保持特异性结合抗原的其他抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以是单价的或双价的。
抗体可以以各种其他形式存在，包括，例如，Fv，Fab和(Fab’)2，以及双功能(即，双特异性)杂交抗体(例如，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17，105(1987))和单链形式(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883，(1988)和Bird等，Science，242，423-426(1988)，在此将其引入作为参考)。(参见，总地，Hood等，“Immunology”，Benjamin，N.Y.，第2版，(1984)，和Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)。
免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个超变量区隔断的“构架”区(FR)组成，这三个超变量区也称为“互补决定区”或“CDR”。之前已经限定了构架区和CDR的范围(参见，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，E.Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services，(1991))。在此讨论了所有抗体氨基酸序列的编号遵照Kabat系统进行。不同轻链或重链的构架区的序列在物种内相对保守。抗体的构架区，是组成的轻链和重链的组合构架区，用于定位和比对CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。
嵌合抗体是其轻链和重链基因通常是通过遗传工程从属于不同物种的抗体可变区和恒定区构建的抗体。例如，可以将来自非人单克隆抗体的基因的可变片段结合人的恒定片段，如γ1和γ3。治疗性嵌合抗体的一个实例是由来自兔抗体的可变区或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定区或效应物结构域组成的杂交蛋白(例如，由A.T.C.C.保藏号CRL 9688的细胞制得的抗-Tac嵌合抗体)，尽管可以使用其他哺乳动物物种。
如在此所用的，术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”指的是含有一个或多个氨基酸已经由来自人抗体的相应位置的氨基酸置换的非人(例如，小鼠或大鼠)抗体。在一些情况中，与相同抗体的非人源化形式相比，人源化抗体在人宿主中产生降低的免疫响应。
将理解通过本发明方法设计和产生的人源化抗体具有对抗原结合或其他抗体功能基本上没有影响的氨基酸置换。
“相似的氨基酸”如下定义：gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；和phe，tyr。换句话说，gly和ala是相似的氨基酸；val，ile和leu是相似的氨基酸；asp和glu是相似的氨基酸；asn和gln是相似的氨基酸；ser和thr是相似的氨基酸；lys和arg是相似的氨基酸；phe和tyr是相似的氨基酸。用相似氨基酸的氨基酸取代在此称为“保守性氨基酸置换”。不存在上述相同组中的氨基酸是“不相似”的氨基酸。
术语“特异性结合”指的是抗体优先结合不同分析物的均质混合物中存在的特定分析物的能力。在某些实施方案中，特异性结合的相互作用将区分出样品中所需的和不需要的分析物，在一些实施方案中，相互作用超过约10至100倍，或更高(例如，超过约1000或10,000倍)。
在某些实施方案中，当抗体及其靶在捕获剂/分析物复合物中特异性结合时，它们之间的亲和性特征在于低于10-6M的KD(解离常数)，低于10-7M，低于10-8M，低于10-9M，低于10-9M，低于10-11M，或低于约10-12M或更低。
重链或轻链抗体链的“可变区”是链的N-末端成熟区。基于序列比对和结构知识来指定所有结构域、CDR和残基编号。按照Kabat，Chothia(Chothia，Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain.J Mol Biol 1998；278：457-79)等所述的来进行构架区和CDR残基的鉴定和编码。
VH是抗体重链的可变结构域。VL是抗体轻链的可变结构域，其可能是κ(K)或λ同种型。K-1抗体具有κ-1同种型，而K-2抗体具有κ-2同种型，并且Vλ是可变λ轻链。
如在此所用的，术语“测定”、“测量”和“测试”和“试验”可以互换使用，并包括定量和定性测定。
术语“多肽”和“蛋白质”，在此可互换使用，指的是任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码的和非编码的氨基酸，化学或生化上修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。术语包括融合蛋白，包括，但不限于，具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合体，具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基；免疫学标记的蛋白质；具有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如，包括作为融合伴侣的荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等；等等。多肽可以是任何大小的，并且术语“肽”指的是8-50个残基(例如，8-20个残基)长的多肽。
如在此所用的，术语“分离的”，在分离的抗体内容中使用时，指的是至少60％，至少75％，至少90％，至少95％，至少98％，甚至至少99％的本发明抗体从纯化之前与其相连的其他成分中游离出来。
在此所用的术语“治疗”、“治疗中”等指的是哺乳动物(例如，特别是人或小鼠)中任何疾病或病症的任何治疗，并包括：a)防止疾病、病症，或疾病或病症的症状在易患病但尚未诊断出患病的患者中的发生；b)抑制疾病、病症，或疾病或病症的症状，例如，阻止其在患者中的发展和/或延迟其发作或呈现；和/或c)缓解疾病、病症，或疾病或病症的症状，例如，引起病症或疾病和/或其症状的消退。
术语“受治疗者”、“宿主”、“患者”和“个体”在此可互换使用，指的是需要诊断或治疗的任何哺乳动物患者，特别是人。其他患者可以包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。
“相应的氨基酸”是两个或多个氨基酸序列比对时，相同位置(即，它们彼此相对排列的位置)的氨基酸残基。将抗体序列比对和编码的方法更详细地列于上文的Kabat中以及其他的文献中。如本领域所知的(参见，例如，Kabat 1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，DHHS，Washington，DC)，有时候，为了完成比对，可以形成一个、两个或三个缺口和/或至多一个、两个、三个或四个残基，或至多约15个残基的插入(特别是在L3和H3 CDR中)。
“天然”抗体是其中抗体的重链和轻链免疫球蛋白是通过多细胞生物体的免疫系统自然选择的抗体，与通过例如噬菌体展示制得的非天然配对抗体或人源化抗体相对。因此，特定的抗体不含有任何病毒(例如，噬菌体M13)-衍生的序列。脾脏、淋巴结和骨髓是产生天然抗体的组织的实例。
“亲本”抗体是氨基酸置换目标的抗体。在某些实施方案中，氨基酸可以由“供体”抗体“捐赠”给亲本抗体，以产生改变了的抗体。
“相关抗体”是具有相似序列并由具有通用B细胞祖先的细胞产生的抗体。这样的B细胞祖先含有具有重排轻链VJC区和重排重链VDJC区的基因组，并产生尚未经受亲和性成熟的抗体。脾脏组织中存在的“天然”或“原始”B细胞是示例性的B细胞通用祖先。相关抗体结合抗原的相同表位，并且序列通常是非常相似的，特别是在其L3和H3 CDR中。相关抗体的H3和L3 CDR具有相同的长度和接近相同的序列(例如，有0-4个残基不同)。相关抗体通过通用抗体祖先来互相关联，通用抗体祖先是天然B细胞祖先中产生的抗体。术语“相关抗体”不是用于描述一组不具有由B-细胞产生的通用抗体祖先的抗体。在某些情况下，相关抗体：i.结合相同的抗原；ii.各自包括相对彼此具有至少90％整体氨基酸序列同一性的重链可变结构域；iii.各自包括相对彼此具有至少90％整体氨基酸序列同一性的轻链可变结构域；iv.具有相对彼此长度相同和序列相同(除了0、1或2个氨基酸置换)的H3 CDR；和v.具有相对彼此长度相同和序列相同(除了0、1或2个氨基酸置换)的L3 CDR。
“阻断抗体”、“中和抗体”或“中和......的抗体”或其任何语法等价物指的是其与靶的结合导致将与靶的结合或靶的生物活性抑制例如至少约20％、30％、40％、50％、80％、95％或99％的抗体。通过测量靶生物活性的一个或多个指标来测定这种靶生物活性的抑制，这些指标如受到靶影响的信号转导途径的激活、结合或细胞改变。可以通过本领域已知的几个标准体外或体内试验中的一个或多个来测定在此所述的靶的生物活性。
如在此所用的术语“VEGF”或其非缩写形式“血管内皮生长因子”指的是由VEGF基因编码的蛋白质产物。VEGF涉及血管发生(胚胎循环系统的重新形成)和血管生成(血管从预先存在的脉管系统开始的生长)。VEGF家族的所有成员通过结合细胞表面上的酪氨酸激酶受体(VEGFR)来刺激细胞响应，使它们二聚化并通过转磷酸作用得到激活。VEGF受体具有包含7个免疫球蛋白样结构域的胞外部分、单个跨膜横跨区和包含分裂酪氨酸-激酶结构域的胞内部分。VEGF-A结合VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR/F1k-1)。VEGFR-2看来似乎介导几乎全部已知的对VEGF的细胞响应。VEGF，其生物活性及其受体都得到了充分的研究并在Matsumoto等(VEGF receptor signal transduction(VEGF受体信号转导)，Sci STKE.2001：RE21)和Marti等(Angiogenesis in ischemic disease(缺血性疾病中的血管生成)Thromb Haemost.1999增补1：44-52)的论文中有描述。术语VEGF用于包括重组的VEGF分子，其可以通过标准重组表达方法来制备或商业购买(R&D Systems，Catalog No.210-TA，Minneapolis，Minn.)，以及含有VEGF分子的融合蛋白。在此可以使用的示例性VEGF的氨基酸序列可以在NCBI的Genbank数据库中找到，并且人VEGF的全部描述及其在各种疾病和病症中的作用可以在Man数据库的NCBI’sOnline Mendelian Inheritance中找到。
发明详述
提供了一种抗体。在某些情况下，该抗体包含：a)包括与图1中所示的选定抗体的重链CDR区基本上相同的CDR区的重量可变结构域和b)包括与选定抗体的轻链CDR区基本上相同的CDR区的轻链可变结构域，其中该抗体结合选定的靶。在某些实施方案中，抗体的CDR区相对于选定抗体的CDR区，总地可以含有，例如，一个、两个、三个、四个、五个至至多10个氨基酸差异(例如，氨基酸置换、缺失或插入)。在一些实施方案中，抗体的CDR区可以与选定抗体的CDR区相同。如显而易见的，这样的抗体进一步含有决定CDR的位置的构架序列。
在特定的实施方案中，本发明抗体可以具有：a)具有与图1中所示的选定抗体的重链可变结构域为至少80％同一性(例如，至少90％，至少95％或至少98％或99％同一性)的氨基酸序列的重链可变结构域和b)具有与选定抗体的轻链可变结构域为至少80％同一性(例如，至少90％，至少95％或至少98％或99％同一性)的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在特定的实施方案中，抗体可以包含：a)重链可变结构域，其包括：i.氨基酸序列与图1的选定抗体的重链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR3区相同的CDR3区；和b)轻链可变结构域，其包括：i.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；其中该抗体特异性地结合选定的靶。
用单个抗原使兔免疫产生多重抗体，这些抗体可以通过它们序列的关联性来分组。每组内的抗体彼此相关，因为它们是由具有共同天然B细胞祖先的细胞产生的。由祖先B细胞产生的抗体尚未经受亲和性成熟，而相关抗体已经经受亲和性成熟和B-细胞发育的最后阶段，并从通用B-细胞祖先抗体的“发展”而来，因为它们含有由亲和性成熟过程中发生的体细胞超突变、基因转变和其他细胞突变事件引起的氨基酸置换。
可以将相关抗体的氨基酸序列进行比较(例如，通过比对那些序列)，并且根据它们彼此的相似性将抗体归类，以鉴定相关组的抗体。相关抗体组的抗体通常含有接近相同的序列，具有长度相同的CDR区，并在构架和/或CDR区中具有氨基酸序列的差异。这些差异表示可以在任一相关抗体中被置换的氨基酸。在某些情况下，一个位置上的氨基酸可以是不相似的氨基酸，例如，在该情况下，在该位置的氨基酸可以由任何其他氨基酸置换。在其他情况下，一个位置上的氨基酸可以是相似的氨基酸，在该情况下，该位置上的氨基酸可以由相似的氨基酸置换，其中相似氨基酸如上所定义。在某些情况下，如果氨基酸不同，可以将来自一个相关抗体的氨基酸替换成另一个的。
因为最初通过免疫过的动物的免疫系统产生并有效测试了特定共有组的每个CDR，用一个氨基酸替换成另一个共有氨基酸应当是抗体充分耐受的。将图1的抗体进行比对，鉴定相关的抗体组，并鉴定出共有序列。在某些情况下，抗体可以包括CDR共有组的CDR，其中CDR共有组源自相关抗体的序列比对。图1抗体的共有序列显示于表1中。表1表示本发明抗体中的可置换位置，其中例如，置换可以是任何其他氨基酸、相似氨基酸(即，保守性氨基酸置换)或来自一个抗体的置换另一个的。这样的方法在美国专利申请10/984,473(作为US-2006-0099204公开)中有进一步的描述，为了那些方法的公开内容，将其引入作为参考。
在某些实施方案中，所述抗体可以包含选自表1的CDR共有组的CDR。在特定的实施方案中，所述抗体可以包含：a)重链可变结构域，其包括：i.包括选自表1的CDR共有组的CDR1氨基酸序列的CDR1 区；ii.包括选定CDR共有序列的CDR2氨基酸序列的CDR2区；和iii.包括选定CDR共有序列的CDR3氨基酸序列的CDR3区；和b)轻链可变结构域，其包括：i.包括选定CDR共有序列的CDR1氨基酸序列的CDR1区；ii.包括选定CDR共有序列的CDR2氨基酸序列的CDR2区；和iii.包括选定CDR共有序列的CDR3氨基酸序列的CDR3区；其中所述抗体特异性地结合选定的靶。
例如，这样的抗体可以包含：a)重链可变结构域，其具有：i.通式NNA/DVMC(SEQ ID NO：77)的CDR1，通式CIMTTDVVTE/AYANWAKS(SEQ ID NO：78)的CDR2和通式DSVGSPLMSFDL(SEQ ID NO：79)的CDR3，和；b)轻链可变结构域，其具有：通式QASQN/SL/VYN/GNNELS(SEQ ID NO：80)的CDR1，通式W/RASTLAS(SEQ ID NO：81)的CDR2和通式A/S/GGYKSYS/YND/GGN/SG(SEQ ID NO：82)的CDR3，其中抗体阻断VEGF。
在某些实施方案中，抗体可以包含：a)重链可变结构域，其包括包含以下通式的氨基酸序列的CDR：CDR1：(S/N)(N/S/-)YXM(C/N/S/I)；CDR2：(C/F/Y/I)I(M/Y/D/S)(T/-)(G/-)XXXX(T/A)(Y/E/D/V)YA(N/S/T)WAK(G/S)(SEQ ID NO：131)；CDR3：(G/D/S)(S/D/G/A)XXXX(L/W/Y/-)(X/-)(X/-)(X/-)(X/-)(Y/G/S/-)(F/A/Y/-)(A/N/D)(L/I)，和；b)轻链可变结构域，其包括包含以下通式的氨基酸序列的CDR：CDR1：Q(A/S)S(E/Q)(S/N)(L/V/I)X(S/N/G/-)(N/D/-)(N/T/S/D/G)XL(S/T/A)；CDR2：XAS(T/K/Y)L(A/E)S(SEQ ID NO：132)；CDR3：(A/Q)(G/N/S)X(Y/K)XXXX(X/-)(G/D/-)(X/-)(X/-)X(G/T/A/P/V)，其中X是任意氨基酸，-表示无残基，/表示该位置存在可替换的氨基酸，和()表示一个氨基酸位置。该抗体阻断VEGF。
修饰的抗体
可以通过至少一个氨基酸的置换、添加或缺失来修饰上述的抗体。在一个实施方案中，将本发明抗体的上述氨基酸序列进行修饰，以提供用于人治疗用途的人源化抗体，或另一种类型的修饰抗体。通常，这些修饰的抗体具有上述兔抗体的一般特征，并且至少含有上述兔抗体的CDR，或者，在某些实施方案中，至少含有与上述兔抗体的CDR非常相似的CDR。
人源化抗体
因此，在一个实施方案中，本发明提供了上述抗体的人源化形式。通常，通过置换亲本非人抗体的构架区中的氨基酸，以产生在人体内致免疫性低于亲本非人抗体的修饰抗体，从而制得人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术来将抗体人源化，包括，例如，CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO9I/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶嵌或表面处理(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91：969-973(1994))，和链改组(美国专利No.5,565,332)。在某些实施方案中，通过CDR和构架残基相互作用的模型化来鉴定构架置换，以鉴定出对于抗原结合重要的构架残基，并且进行序列比较，以鉴定出特定位置的不常见构架残基(参见，例如，美国专利No.5,585,089；Riechmann等，Nature 332：323(1988))。考虑可用于本发明中的将抗体人源化的其他方法描述于美国专利No.5,750,078；5,502,167；5,705,154；5,770,403；5,698,417；5,693,493；5,558,864；4,935,496；和4,816,567和PCT公开WO98/45331和WO98/45332。在某些实施方案中，可以根据公开的美国专利申请20040086979和20050033031中所列的方法将本发明兔抗体人源化。因此，可以使用本领域公知的方法将上述抗体人源化。
在特别令人感兴趣的一个实施方案中，可以根据2004年11月8日提交的发明名称为“抗体工程化方法”的美国专利申请10/984,473中更详细描述的方法将本发明抗体人源化，在此将该申请全部引入作为参考。通常，这种人源化方法涉及通过比较结合相同抗原的抗体的序列来鉴定出抗体的可置换位置，并用存在于相似人抗体的相同位置的不同氨基酸来置换该位置的氨基酸。在这些方法中，将亲本兔抗体的氨基酸序列与其他相关兔抗体的氨基酸序列相比较(即，比对)，以鉴定出耐变化的位置。通常将亲本兔抗体的可变结构域的氨基酸序列与人抗体序列的数据库相比较，并且选择具有与亲本抗体相似的氨基酸序列的人抗体。将亲本抗体和人抗体的氨基酸序列进行比较(例如，比对)，通过人抗体中相应位置的氨基酸置换亲本抗体的耐变化位置的一个或多个氨基酸。在这种人源化方法中，除了构架区以外，可以将抗体的CDR区人源化。
上述耐变化位置置换方法可以容易地结合至任何已知的人源化方法中，并且也容易用于产生包含相对于亲本抗体的CDR区改变了的CDR区的人源化抗体。因此，提供了含有改变形式的上述抗体的CDR的人源化抗体。
如上所述，可以将本发明抗体进行修饰，以提供修饰的抗体。在 某些实施方案中，该方法包括形成一个或多个氨基酸置换(例如，一个，至多两个，至多三个，至多四个或至多五个或更多，通常至多十个或更多)。氨基酸置换可以是在任何位置，并且该位置的氨基酸可以由任何特性的氨基酸来置换。在某些实施方案中，修饰的抗体可以具有上述兔抗体的相同的一般特征。在一个实施方案中，使用美国系列号10/984,473的方法鉴定可置换位置后，可以置换该位置的氨基酸。在某些实施方案中，氨基酸置换可以是人源化置换(即，使得氨基酸序列更类似于人抗体的氨基酸序列的置换)，定向置换(例如，使得抗体的氨基酸序列更类似于相同组中的相关抗体的氨基酸序列的置换)，随机置换(例如，用20个天然产生氨基酸中的任一个的置换)或保守性置换(例如，用具有与待置换的相似生化特性的氨基酸的置换)。
在某些实施方案中，本发明的修饰抗体可以含有由在高严谨条件下与兔重链或轻链编码核酸杂交的多核苷酸编码的重链或轻链。高严谨条件包括在50℃或更高温度下在0.1X SSC(15mM盐水/0.15mM柠檬酸钠)中的培养。
在某些实施方案中，本发明的修饰抗体可以含有由与兔重链或轻链编码核酸为至少80％同一性(例如，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％)的多核苷酸编码的重链或轻链。百分比同一性是基于所比较的较短的序列。使用公知的程序，如BLASTN(2.0.8)(Altschul等，(1997)，Nucl.Acids.Res.25：3389-3402)，使用缺省参数和无筛选程序，来进行序列比较。
使用方法
上述抗体可以用于各种方法中。一种这样的方法包括：在适于抗体结合靶以产生复合物的条件下，将本发明抗体接触抗体的靶。例如，可以通过ELISA或蛋白质印迹，或通过本领域已知的许多免疫检测方法中的任一种来进行这样的方法。在其他实施方案中，提供了阻断配体结合其受体的方法。在这些实施方案中，该方法包括：将本发明抗 体给予受治疗者，其中抗体结合所述患者体内的受体或配体，并阻断其结合。
本发明抗体抑制其靶的至少一种活性在约20％至100％的范围内，例如，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，通常至多约70％，至多约80％，至多约90％或更高。在某些试验中，本发明抗体抑制其靶具有1×10-7M或更低的IC50(例如，1×10-7M或更低，1×10-8M或更低，1×10-9M或更低，通常至1×10-12M或1×10-13M)。在使用小鼠的试验中，本发明抗体可以具有低于1μg/小鼠(例如，10ng/小鼠至约1μg/小鼠)的ED50。
在这些方法中可以使用的实验方案是多种多样的，并且包括但不限于无细胞试验，例如，结合试验；其中测量了细胞表型的细胞试验，例如，基因表达试验；和涉及特定动物的体内试验(其在某些实施方案中可以是用于靶相关病症的动物模型)。在某些情况下，试验可以是血管形成试验。
在某些实施方案中，可以在VEGF的存在下使本发明抗体与细胞接触，并监控细胞的VEGF响应表型。
示例性VEGF试验包括在无细胞系统中使用分离的蛋白质的试验，使用培养细胞的体外试验或体内试验。示例性VEGF试验包括，但不限于，受体酪氨酸激酶抑制试验(参见，例如，Cancer Research June15，2006；66：6025-6032)，体外HUVEC增殖试验(FASEB Journal2006；20：2027-2035)，体内实体肿瘤疾病试验(USPN 6,811,779)和体内血管生成试验(FASEB Journal 2006；20：2027-2035)。这些试验是本领域公知的。在此将这些试验的描述引入作为参考。
示例性TNF-α试验包括使用无细胞系统或使用培养细胞的体外试验或体内试验。因此，TNF-α试验包括体外人全血试验和细胞介导的细胞毒性试验(美国专利申请6,090,382)，体外肿瘤人杀灭试验(参见，例如，公开的美国专利申请20040185047)，体内肿瘤消退试验(美国专利申请20040002589)。其他的TNF-α试验在各种出版物中有描述，包括20040151722，20050037008，20040185047， 20040138427，20030187231，20030199679和Balazovich(Blood 199688：690-696)。
生产抗体的方法
在许多实施方案中，将编码本发明单克隆抗体的核酸直接引入宿主细胞中，并且在足以诱导所编码抗体表达的条件下培养细胞。使用本领域技术人员公知的标准技术并与在此提供的多肽和核酸序列结合来制备本发明的抗体。可以使用多肽序列来确定合适的编码由此公开的特定抗体的核酸序列。可以根据本领域技术人员公知的标准方法将核酸序列优化来反映对于各种表达系统的特定密码子“偏好”。
任何适于表达盒表达的细胞都可以用作宿主细胞。例如，酵母、昆虫、植物等细胞。在许多实施方案中，使用通常不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，其实例如下：猴肾细胞(COS细胞)、由SV40转化的猴肾CVI细胞(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞(HEK-293，Graham等，J.Gen Viroi.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216，(1980)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；昆白大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Ma ther等，Annals N.Y.Acad.Sci 383：44-68(1982))；NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)；和小鼠L细胞(ATCC CCL-1)。其他细胞系也是本领域普通技术人员所知的。多种细胞系可以从美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)获得。
将核酸引入细胞中的方法是本领域公知的。合适的方法包括电穿孔、颗粒枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射等。方法的选择通常取决于待转化的细胞的类型和进行转化的环境(例如，体外，先体外后体内，或体内)。这些方法的概述可以在Ausubel等，Short Protocolsin Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995中找到。在一些实施方案中，使用lipofectamine和钙介导的基因转移技术。
本发明核酸已经被引入细胞中后，通常培养细胞，通常在37℃下，有时候在选择下，持续约1-24小时的时间段，以使得抗体表达。在大部分实施方案中，抗体通常分泌至细胞生长的培养基的上清液中。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用各种基于病毒的表达系统来表达本发明抗体。在将腺病毒用作表达载体的情况中，可以将目标编码抗体的序列连接腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。病毒基因组的非必需片段中的插入(例如，E1或E3片段)将形成活的并且能够在感染宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。可以通过插入合适的转录增强元件、转录终止子等来增强表达的效率(参见，Bittner等，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。
对于重组抗体长期的、高产量的产生，可以使用稳定的表达。例如，可以将稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。胜于使用含有病毒复制起源的表达载体，可以用免疫球蛋白表达盒和选择标记来转化宿主细胞。引入外源DNA后，可以使工程化细胞在富集培养基上生长1-2天，然后转换成选择性培养基。重组质粒中的选择标记给予了对选择的抗性并使细胞将质粒稳定地整合至染色体中并生长至形成焦点，其随后可以克隆和扩大成细胞系。这样的工程化细胞系在与抗体分子直接或间接相互作用的化合物的筛选和评价中是特别有用的。
一旦产生了本发明的抗体分子，可以通过本领域已知的用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法来纯化，例如，通过色谱(例如，离子交换、亲和性，特别是通过蛋白A之后对特异性抗原的亲和性，和大小柱色谱)，离心，差异性溶解度，或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌至培养基中，并从培养基收集。
配制和给药
可以以医学上可接受的任何方式来给予本发明的抗体。这可以包括注射，通过非肠道途径，如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜内等，以及口服、鼻子、眼部、直肠或局部。持续释放给药也特别包括在本发明内，作为长效注射或可蚀性植入物通过这样的方式来给药。特别考虑了局部递送，通过导管递送至一个或多个动脉(如，肾动脉)或供应局部肿瘤的脉管来进行这样的递送。
可以将本发明抗体与药物学上可接受的载体一起配制。术语“药物学上可接受的载体”意思是一种或多种有机或无机成分，天然或合成的，抗体与其一起混合有助于其应用。合适的载体包括无菌盐水，尽管其他已知是药物学上可接受的含水和非水等渗无菌溶液和无菌悬浮液是本领域普通技术人员已知的。“有效量”指的是能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。可以以个体基础来测定有效量，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。可以通过本领域技术人员使用这些因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
在一个实施方案中，通过静脉内、肌内或皮下注射将本发明抗体给予受治疗者。可以在约0.1mg/kg至约100mg/kg；约1mg/kg至75mg/kg；或约10mg/kg至50mg/kg的剂量范围内给予抗体。例如，可以通过快速注射或通过缓慢灌注来给予抗体。可以使用在30分钟至2个时间的时间段内的缓慢灌注。
实用性
本发明抗体可用于治疗与其靶相关的障碍。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者的VEGF相关病症的方法。该方法通常涉及将治疗VEGF相关障碍的至少一种症状的有效量的 本发明抗体给予患有VEGF相关障碍的患者。VEGF相关病症的特征通常在于过度的血管内皮细胞增殖，血管渗透性，水肿或炎症，如与损伤、中风或肿瘤相关的大脑水肿；与炎性障碍(如牛皮癣或关节炎，包括类风湿性关节炎)相关的水肿；哮喘；与烧伤相关的全身性水肿；与肿瘤、炎症或外伤相关的腹水和胸腔积液；慢性气道炎症；毛细管渗漏综合症；脓毒症；与提高的蛋白渗漏相关的肾病；和眼部障碍，如年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病。这样的病症包括乳房、肺、结直肠和直肠癌。
药盒
本发明还提供了用于实施如上所述的本发明方法的药盒。本发明的药盒至少包括以下的一种或多种：本发明的抗体，编码该抗体的核酸或含有该抗体的细胞。本发明的抗体可以是人源化的。药盒的其他任选成分包括：缓冲液等，用于给药抗体或用于进行活性试验。药盒的核酸还可以具有限制位点，多个克隆位点，引物位点等，以助于连接非兔抗体核酸。按照需要，药盒的各种成分可以存在于分开的容器中或特定的相容成分可以预先混合在单个容器中。
除了上述成分之外，本发明药盒通常进一步包括使用药盒的成分来实施本发明方法的说明书。用于实施本发明方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，可以将说明书打印在基质上，如纸或塑料等。因此，说明书可以作为包装内页存在于药盒中，或存在于药盒容器或其成分的标签中(即，与包装或分装相连)等。在其他实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存在，存在于合适的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM，磁盘等。在另一个实施方案中，实际的说明书不存在于药盒中，而是提供了从远程来源获得说明书的方法，例如，通过互联网。该实施方案的实例是包括网址的药盒，在该网址可以浏览说明书和/或可以下载说明书。如同说明书一样，将这种获得说明书的方法记录在合适的介质上。
本发明还提供了至少包括计算机可读介质的药盒，该可读介质包括如上所述的程序和说明书。该说明书可以包括安装或装备指导。说明书可以包括使用本发明如上所述的选项或选项组合的指导。在某些实施方案中，说明书包括两种类型的信息。
随着药盒提供软件和说明书可以用于各种目的。可以作为产生在非兔宿主中致免疫性低于亲本抗体的兔抗体或其核苷酸序列的工具来包装和购买这种组合。
说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，可以将说明书打印在基质上，如纸或塑料等。因此，说明书可以作为包装内页存在于药盒中，或存在于药盒容器或其成分的标签中(即，与包装或分装相连)等。在其他实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存在，存在于合适的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM，磁盘等，包括在其上可以呈现程序的相同介质。
尽管已经参考特定的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当理解可以进行各种改变，并且可以取代等价物，而不脱离本发明真正的精神和范围。此外，可以进行许多改变以使特定的情况、材料、物质的组成、方法、方法的一个步骤或多个步骤适于本发明的目的、精神和范围。所有这样的变化都在所附权利要求的范围内。
实施例
从产生阻断VEGF与其受体(VEGF-R2)相互作用的抗体的兔杂交瘤获得抗体。通过将免疫的兔脾细胞与兔杂交瘤融合伴侣240E-W2融合来产生杂交瘤。
用Fc融合蛋白将兔免疫。为了表达融合蛋白，将人VEGF165编码序列克隆至兔IgG Fc的C-末端，兔IgG Fc在其N-末端含有兔IgG重链的信号肽序列。在HEK293细胞中产生融合蛋白并分泌至培养基中。为了获得用于免疫的纯蛋白，收集上清液并通过蛋白A柱纯化。将洗脱的蛋白相对PBS缓冲液来渗析。
用免疫原将新西兰白兔免疫。每只兔通过皮下注射使用完全弗氏佐剂或TiterMax佐剂的0.4mg纯化蛋白来接受初次免疫。然后通过皮下注射使用不完全弗氏佐剂或TiterMax的0.2mg蛋白质来加强动物，每三周一次。在脾切除术前4天，通过静脉内给予最终的加强(盐水中0.4mg蛋白)。
按照Spieker-Polet的常规实验方案使用PEG来进行细胞融合。脾细胞与融合伴侣的比例为2∶1。将融合的细胞涂布于96-孔平板中，并在48小时后加入HAT，以选择杂交瘤。
进行了直接的ELISA来鉴定阻断VEGF与涂布于微量滴定板上的VEGF-R2融合蛋白的结合的抗体。然后对于阻断VEGF与其受体的相互作用，在配体-受体试验中筛选该试验中所鉴定的抗体。通过抑制溶液中的Fc-VEGF-R2(胞外结构域)或VEGF-Fc与涂布于平板上的Fc-VEGF或Fc-VEGF-R2的结合来鉴定阻断抗体。
将编码抗体的重链和轻链的cDNA克隆并测序。
Claims (10)
1.一种单克隆抗体，其包括：
i.重链可变结构域，其包括：
与SEQ ID NO：4的氨基酸残基30—35相同的CDR1区，与SEQ IDNO：4的氨基酸残基50-66相同的CDR2区和与SEQ ID NO：4的氨基酸残基98—109相同的CDR3区；和
ii.轻链可变结构域，其包括：
与SEQ I D NO：43的氨基酸残基23—35相同的CDR1区，与SEQ II)NO：43的氨基酸残基51-57相同的CDR2区和与SEQ I D NO：43的氨基酸残基90-101相同的CDR3区；
其中该抗体结合人VEGF。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体是单价抗体。
3.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体是二价抗体。
4.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体是单链抗体。
5.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体具有：SEQ ID NO：4所示的重链可变结构域，和SEQ ID NO：43所示的轻链可变结构域。
6.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体是Fab，Fv，scFv或Fd片段。
7.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体中和人VEGF。
8.单克隆抗体，其中所述抗体是权利要求1-7任何一项的单克隆抗体的人源化形式。
9.一种核酸，其编码权利要求1-8任何一项的单克隆抗体。
10.一种细胞，其包含权利要求9的核酸。
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