BRPI0822556B1 - Anticorpo monoclonal anti-vegf e composição farmacêutica - Google Patents
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Abstract
anticorpo anti-vegf. a presente invenção refere-se a um anticorpo. em determinados casos, o anticorpo compreende: a) um domínio variável de cadeia pesada que compreende regiões cdr que são substancialmente idênticas ás regiões cdr e cadeia pesada de um anticorpo selecionado e ) um domínio variável de cadeia leve que compreende regiões cdr que são substancialmente idênticas às regiões cdr de cadeia leve do anticorpo selecionado, onde o anticorpo se liga a um alvo selecionado.
Description
[0001] Anticorpos são proteínas que se ligam a um antígeno específico. Em geral, anticorpos são específicos para seus alvos, têm a capacidade de mediar mecanismos efetuadores imunes e têm uma meia- vida longa no soro. Tais propriedades tornam os anticorpos produtos terapêuticos poderosos. Anticorpos monoclonais são usados terapeuticamente para o tratamento de uma variedade de condições, incluindo câncer, inflamação e doença cardiovascular. Atualmente, existem mais de dez produtos terapêuticos de anticorpo no mercado e centenas em desenvolvimento.
[0002] Há uma necessidade constante por novos anticorpos.
[0003] Um anticorpo é proporcionado. Em determinados casos, o anticorpo compreende: a) um domínio variável de cadeia pesada que compreende regiões CDR que são substancialmente idênticas às regiões CDR de cadeia pesada de um anticorpo selecionado mostrado na Figura 1 e b) um domínio variável de cadeia leve que compreende regiões CDR que são substancialmente idênticas às regiões CDR de cadeia leve do anticorpo selecionado, onde o anticorpo se liga a um alvo selecionado. Em modalidades particulares, as regiões CDR do anticorpo podem conter coletivamente, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou até 10 diferenças de aminoácido (por exemplo, substituições, deleções ou inserções de aminoácido) com relação às regiões CDR do anticorpo selecionado. Em determinados casos, as regiões CDR de um anticorpo em questão podem ter uma sequência de aminoácido que é definida por uma sequência de consenso derivada de análise de vários anticorpos relacionados. Em algumas modalidades, as regiões CDR do anticorpo podem ser idênticas às regiões CDR do anticorpo selecionado.
[0004] Em modalidades particulares, o anticorpo pode compreender: um domínio variável compreendendo: a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo: i. Uma região CDR1 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR1 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado da Figura 1; ii. uma região CDR2 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR2 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e iii. uma região CDR3 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR3 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: i. uma região CDR1 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR1 de cadeia leve do anticorpo selecionado; ii. uma região CDR2 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR2 de cadeia leve do anticorpo selecionado; e iii. Uma região CDR3 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR3 de cadeia leve do anticorpo selecionado; em que o anticorpo se liga especificamente a um alvo selecionado.
[0005] Em determinadas modalidades, um anticorpo compreendendo: a) um domínio variável compreendendo: i. uma região CDR1 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR1 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado da Figura 1; ii. uma região CDR2 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR2 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e iii. uma região CDR3 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR3 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: i. uma região CDR1 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR1 de cadeia leve do anticorpo selecionado; ii. uma região CDR2 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR2 de cadeia leve do anticorpo selecionado; e iii. Uma região CDR3 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR3 de cadeia leve do anticorpo selecionado; ou b) uma variante do domínio variável da parte a) que é, de outro modo, idêntica ao domínio variável da parte a) exceto quanto ao número (por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) de substituições de aminoácido nas regiões CDR, onde o anticorpo se liga a um alvo selecionado e, em determinadas modalidades, a atividade do alvo selecionado.
[0006] Em determinadas modalidades, o anticorpo pode compreender as CDRs de um grupo de consenso de CDR selecionado da Tabela 1. Em modalidades particulares, o anticorpo pode compreender: a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo: i. uma região CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR1 de um grupo de consenso de CDR selecionado da Tabela 1; ii. uma região CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR2 da sequência de consenso de CDR selecionada; e iii. uma região CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR3 da sequência de consenso de CDR selecionada; e b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: i. uma região CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR1 da sequência de consenso de CDR selecionada; ii. uma região CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR2 da sequência de consenso de CDR selecionada; e iii. uma região CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR3 da sequência de consenso de CDR selecionada; em que o referido anticorpo se liga especificamente a um alvo selecionado e, em determinadas modalidades, a atividade do alvo selecionado.
[0007] Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo em questão e um veículo farmaceuticamente aceitável também é proporcionada.
[0008] Um método é também proporcionado. Em determinadas modalidades, o método pode compreender contato de um anticorpo em questão com um alvo do anticorpo sob condições adequadas para ligação do anticorpo ao alvo para produzir um complexo.
[0009] T ambém proporcionado é um método para bloqueio de ligação de um ligante a seu receptor. Em determinadas modalidades, esse método pode compreender: administração de um anticorpo em questão a um indivíduo, em que o referido anticorpo se liga ao receptor ou ao ligante no referido indivíduo e bloqueia a ligação do referido ligante e seu receptor.
[00010] O alvo selecionado pode ser VEGF.
[00011 ] A figura 1 mostra as sequências de aminoácido de anticorpos para bloqueio de VEGF selecionados. A página 1 da figura 1 mostra sequências de aminoácido das cadeias pesadas. A página 2 da figura 1 mostra sequências de aminoácido das cadeias leves correspondentes. As sequências de aminoácido das CDRs de cada anticorpo estão entre retângulos. As sequências de aminoácido mostradas na figura 1 são de anticorpos que se ligam especificamente ao VEGF e neutralizam a atividade do VEGF. De cima para baixo, figura 1 (página 1 de 2) SEQ ID NO: 1-38 e figura 1 (página 2 de 2) SEQ ID NO: 39-76.
[00012] Antes que a presente invenção seja ainda descrita, deve ser entendido que a presente invenção não está limitada às modalidades particulares descritas, uma vez que as mesmas podem, naturalmente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.
[00013] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme entendido por aqueles versados no campo ao qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são citadas.
[00014] Deve ser notado que, conforme usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um(a)" e "o(a)" incluem os referentes no plural, a menos que o contexto orienta claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "um anticorpo" inclui uma pluralidade de tais anticorpos e referência a "uma região de estrutura" inclui referência a uma ou mais regiões de estrutura e equivalentes das mesmas conhecidas por aqueles versados no campo e assim por diante.
[00015] As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamente por sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser construído como uma admissão de que a presente invenção não se destina a antecipar tal publicação em virtude de invenção anterior. Ainda, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais as quais precisam ser independentemente confirmadas.
[00016] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados permutavelmente aqui. Esses termos são bem entendidos por aqueles versados no campo e referem-se a uma proteína consistindo em um ou mais polipeptídeos que se ligam especificamente a um antígeno. Uma forma de anticorpo constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Essa forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de anticorpo, cada par tendo uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeias pesada e leve são, juntas, responsáveis pela ligação a um antígeno e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetuadoras do anticorpo.
[00017] Os polipeptídeos de imunoglobulina reconhecidos incluem as cadeias leve kappa e lambda e cadeias pesadas alfa, gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon e mu ou equivalentes em outras espécies. "Cadeias leves" de imunoglobulina de comprimento total (de cerca de 25 kDa ou cerca de 214 aminoácidos) compreendem uma região variável de cerca de 110 aminoácidos no NH2-término e uma região constante kappa ou lambda no COOH-término. "Cadeias pesadas" de imunoglobulina de comprimento total (de cerca de 50 kDa ou cerca de 446 aminoácidos) compreendem, similarmente, uma região variável (de cerca de 116 aminoácidos) e uma das regiões constantes de cadeia pesada antes mencionadas, por exemplo, gama (de cerca de 330 aminoácidos).
[00018] Os termos "anticorpos" e "imunoglobulina" incluem anticorpos ou imunoglobulinas de qualquer isotipo, fragmentos de anticorpos os quais retêm a ligação específica a um antígeno incluindo, mas não limitado a, fragmentos Fab, Fv, scFv e Fd, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos com uma única cadeia e proteínas de fusão compreendendo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo e uma proteína de não-anticorpo. Os anticorpos podem ser detectavelmente rotulados, por exemplo, com um radioisótopo, uma enzima a qual gera um produto detectável, uma proteína fluorescente e semelhantes. Os anticorpos podem ainda ser conjugados às outras porções, tais como membros de pares de ligação específicos, por exemplo, biotina (membro do par de ligação específico biotina-avidina) e semelhantes. Os anticorpos podem também ser ligados a um suporte sólido incluindo, mas não limitado a, placas ou glóbulos de poliestireno e semelhantes. Também abrangidos pelo termo são fragmentos Fab', Fv, F(ab')2 e outros fragmentos de anticorpo que retêm a ligação específica a um antígeno e anticorpos monoclonais. Um anticorpo pode ser monovalente ou bivalente.
[00019] Anticorpos podem existir em uma variedade de outras formas incluindo, por exemplo, Fv, Fab, e (Fab')2, bem como anticorpos híbridos bifuncionais (isto é, biespecíficos) (por exemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) e em cadeias únicas (por exemplo, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) e Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988), os quais são incorporados aqui por referência). (Veja, de modo geral, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2a ed. (1984) e Hunkapiller e Hood, Nature, 323, 15-16 (1986).
[00020] Uma região variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina consiste em uma região de "estrutura" (FR) interrompida por três regiões hipervariáveis, também denominadas "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs". A extensão da região de estrutura e CDRs foi precisamente definida (veja "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services (1991)). A numeração de todas as sequências de aminoácido de anticorpo discutidas aqui se conforma ao sistema de Kabat. As sequências das regiões de estrutura de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de estrutura de um anticorpo, isto é, as regiões de estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, servem para posicionar e alinhar as CDRs. As CDRs são primariamente responsáveis pela ligação a um epitopo de um antígeno.
[00021] Anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes de cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente através de engenharia genética, a partir de genes de regiões variáveis e constantes de anticorpo pertencendo a uma espécie diferente. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal não-humano podem ser unidos a segmentos constantes humanos, tais como gama 1 e gama 3. Um exemplo de um anticorpo quimérico terapêutico é uma proteína híbrida composta do domínio variável ou de ligação a antígeno de um anticorpo de coelho e o domínio constante ou efetuador de um anticorpo humano (por exemplo, o anticorpo quimérico anti-Tac feito pelas células do No. de Acesso de depósito à A.T.C.C. CRL 9688), embora outras espécies de mamífero possam ser usadas.
[00022] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo humanizado" ou "imunoglobulina humanizada" refere-se a um anticorpo não-humano (por exemplo, de coelho ou camundongo) contendo um ou mais aminoácidos que tenham sido substituídos por um aminoácido correspondentemente posicionado a partir de um anticorpo humano. Em alguns casos, anticorpos humanizados produzem uma resposta imune reduzida em um hospedeiro humano quando comparado com uma versão não humanizada do mesmo anticorpo. Deve ser entendido que os anticorpos humanizados criados e produzidos através do presente método podem ter substituições de aminoácido as quais não têm substancialmente efeito sobre a ligação ao antígeno ou outras funções do anticorpo.
[00023] "Aminoácidos similares" são definidos como segue: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; e phe, tyr. Em outras palavras, gly e ala são aminoácidos similares; val, ile e leu são aminoácidos similares; asp e glu são aminoácidos similares; asn e gln são aminoácidos similares; ser e thr são aminoácidos similares; lys e arg são aminoácidos similares; e phe e tyr são aminoácidos similares. A substituição de um aminoácido por um aminoácido similar é denominada uma "substituição de aminoácido conservativa" aqui. Aminoácidos que não estão presentes no mesmo grupo conforme apresentado acima são aminoácidos "dissimilares".
[00024] O termo "ligação específica" refere-se à capacidade de um anticorpo de se ligar preferencialmente a um analito em particular que está presente em uma mistura homogênea de diferentes analitos. Em determinadas modalidades, uma interação de ligação específica discriminará entre analitos desejáveis e indesejáveis em uma amostra, em algumas modalidades, mais de cerca de 10 a 100 vezes ou mais (por exemplo, mais de cerca de 1000 ou 10.000 vezes).
[00025] Em determinadas modalidades, a afinidade entre um anticorpo e seu alvo, quando eles estão especificamente ligados em um complexo de agente de captura/analito, é caracterizada por uma KD (constante de dissociação) de menos de 10-6 M, menos de 10-7 M, menos de 10-8 M, menos de 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 10-11 M, ou menos de cerca de 10-12 M ou menos.
[00026] Uma "região variável" de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo é um domínio maduro N-terminal das cadeias. Todos os domínios, CDRs e números de resíduo são atribuídos com base em alinhamentos de sequência e conhecimento estrutural. A identificação e numeração de resíduos de estrutura e CDR são conforme descrito em Kabat, Chothia (Chothia, Structural Determinants in the Sequences of Immunoglobulin Variable Domain. J Mol Biol 1998; 278: 457-79) e outros.
[00027] VH é o domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo. VL é o domínio variável da cadeia leve de um anticorpo, a qual pode ser do isotipo kappa (K) ou lambda. Anticorpos K-1 têm o isotipo kappa-1, enquanto que anticorpos K-2 têm o isotipo kappa-2 e VÀ é a cadeia leve variável lambda.
[00028] Conforme usado aqui, os termos "determinação", "medição" e "avaliação" e "ensaio" são usados permutavelmente e incluem determinações quantitativas e qualitativas.
[00029] Os termos "polipeptídeo" e "proteína", usados permutávelmente aqui, referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, a qual pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos química ou bioquimicamente modificados ou derivatizados e polipeptídeos tendo partes principais peptídicas modificadas. O termo inclui proteínas de fusão incluindo, mas não limitado a, proteínas de fusão com uma sequência de aminoácido heteróloga, fusões com sequências líderes heterólogas e homólogas, com ou sem resíduos de metionina N-terminais; proteínas imunologicamente rotuladas; proteínas de fusão com parceiros de fusão detectáveis, por exemplo, proteínas de fusão incluindo, como um parceiro de fusão, uma proteína fluorescente, β-galactosidase, luciferase, etc.; e semelhantes. Polipeptídeos podem ser de qualquer tamanho e o termo "peptídeo" refere-se a polipeptídeos que têm 8-50 resíduos (por exemplo, 8-20 resíduos) de comprimento.
[00030] Conforme usado aqui, o termo "isolado", quando usado no contexto de um anticorpo isolado, refere-se a um anticorpo de interesse que é pelo menos 60% isento, pelo menos 75% isento, pelo menos 90% isento, pelo menos 95% isento, pelo menos 98% isento e mesmo pelo menos 99% isento de outros componentes com os quais o anticorpo está associado antes de purificação.
[00031] Os termos "tratamento", "tratar" e semelhantes são usados aqui para referir-se a qualquer tratamento de qualquer doença ou condição em um mamífero, por exemplo, particularmente um ser humano ou um conforme e incluem: a) prevenção da ocorrência de uma doença, condição ou sintoma de uma doença ou condição em um indivíduo o qual possa estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma; b) inibição de uma doença, condição ou sintoma de uma doença ou condição, por exemplo, interrupção de seu desenvolvimento e/ou retardo de seu início ou manifestação no paciente; e/ou c) alívio de uma doença, condição ou sintoma de uma doença ou condição, por exemplo, causar regressão da condição ou doença e/ou seus sintomas.
[00032] Os termos "indivíduo", "hospedeiro" e "paciente" são usados permutavelmente aqui para referir-se a qualquer mamífero para o qual diagnóstico ou terapia é desejada, particularmente seres humanos. Outros indivíduos podem incluir gado, cães, gatos, porcos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos e assim por diante.
[00033] "Aminoácidos correspondentes" são resíduos de aminoácido que estão em uma posição idêntica (isto é, eles se sobrepõem uns aos outros) quando duas ou mais sequências são alinhadas. Métodos para alinhamento e numeração de sequências de anticorpo são apresentados em maiores detalhes em Kabat, supra e outros. Conforme é conhecido no campo (veja, por exemplo, Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, DHHS, Washington, DC), algumas vezes, uma, duas ou três folgas e/ou inserções de até um, dois, três ou quatro resíduos ou até cerca de 15 resíduos (particularmente nas CDRs de L3 e H3) podem ser feitas em um ou ambos os aminoácidos de um anticorpo de forma a realizar um alinhamento.
[00034] Um "anticorpo natural" é um anticorpo no qual as imunoglobulinas pesada e leve do anticorpo foram naturalmente selecionadas pelo sistema imune de um organismo multicelular, em oposição a anticorpos não naturalmente emparelhados feitos, por exemplo, mediante exibição de fago ou anticorpos humanizados. Como tal, determinados anticorpos não contêm quaisquer sequências derivadas de vírus (por exemplo, bacteriófago M13). Baço, nódulos linfáticos e medula óssea são exemplos de tecidos que produzem anticorpos naturais.
[00035] Um anticorpo "parental" é um anticorpo que é o alvo de substituições de aminoácido. Em determinadas modalidades, aminoácidos podem ser "doados" por um anticorpo "doador" ao anticorpo parental para produzir um anticorpo alterado.
[00036] "Anticorpos relacionados" são anticorpos que têm uma sequência similar e são produzidos por células que têm um ancestral de célula B em comum. Tal ancestral de célula B contém um genoma tendo uma região VJC de cadeia leve rearranjada e uma região VDJC de cadeia pesada rearranjada e produz um anticorpo que ainda não sofreu maturação por afinidade. Células B "naive" ou "virgens" presentes em tecido de baço são ancestrais em comum de células B. Anticorpos relacionados se ligam ao mesmo epitopo de um antígeno e são, tipicamente, de sequência muito similar, particularmente em suas CDRs de L3 e H3. As CDRs de H3 e L3 de anticorpos relacionados têm um comprimento idêntico e uma sequência quase idêntica (por exemplo, diferem por 0-4 resíduos). Anticorpos relacionados são relacionados via um ancestral de anticorpo em comum, o anticorpo produzido no ancestral de célula B "naive". O termo "anticorpos relacionados" não se destina a descrever um grupo de anticorpos que não tem um ancestral de anticorpo em comum produzido por uma célula B. Em determinados casos, anticorpos relacionados: i. se ligam ao mesmo antígeno; ii. compreendem, cada um, domínios variáveis de cadeia pesada que têm uma identidade global de sequência de aminoácido de pelo menos 90% uns com relação aos outros; iii. compreendem, cada um, domínios variáveis de cadeia leve que têm uma identidade global de sequência de aminoácido de pelo menos 90% uns com relação aos outros; iv. têm CDRs de H3 que são de comprimento idêntico e idênticas quanto à sequência, exceto quanto a 0, 1 ou 2 substituições de aminoácido uns com relação aos outros; e v. têm CDRs de L3 que são de comprimento idêntico e idênticas quanto à sequência de aminoácido, exceto quanto a 0, 1 ou 2 substituições de aminoácido uns com relação aos outros.
[00037] Um "anticorpo de bloqueio", "anticorpo de neutralização" ou "anticorpo que neutraliza" ou qualquer equivalente gramatical dos mesmos referem-se a um anticorpo cuja ligação a um alvo resulta em inibição de ligação a um alvo ou de uma atividade biológica do alvo, por exemplo, em pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 95% ou 99%. Essa inibição da atividade biológica de um alvo pode ser avaliada por meio de medição de um ou mais indicadores da atividade biológica do alvo, tal como ativação de uma via de transdução de sinal, ligação ou alterações celulares realizadas pelo alvo. A atividade biológica dos alvos descritos aqui pode ser avaliada através de um ou mais de diversos ensaios padrões in vitro ou in vivo conhecidos no campo.
[00038] O termo "VEGF" ou sua forma não abreviada "fator de crescimento endotelial vascular", conforme usado aqui, refere-se aos produtos de proteína codificados pelo gene de VEGF. O VEGF está envolvido em vasculogênese (a formação de novo do sistema circulatório embriônico) e angiogênese (o crescimento de vasos sanguíneos a partir da vasculatura preexistente). Todos os membros da família VEGF estimulam respostas celulares através de ligação a receptores de tirosina quinase (os VEGFRs) sobre a superfície celular, fazendo com que os mesmos dimerizem e se tornem ativados através de transfosforilação. Os receptores de VEGF têm uma porção extracelular contendo 7 domínios semelhantes à imunoglobulina, uma única região abrangendo a transmembrana e uma porção intracelular contendo um domínio de tirosina quinase dividido. O VEGF-A se liga ao VEGFR-1 (Fit-1) e VEGFR-2 (KDR/Flk-1). VEGFR-2 parece mediar quase todas as respostas celulares conhecidas ao VEGF. O VEGF, suas atividades biológicas e seus receptores são bem estudados e são descritos em Matsumoto et al. (VEGF Receptor Signal Transduction Sci STKE. 2001: RE21 e Marti et al. (Angiogenesis in Ischemic Disease. Thromb Haemost. 1999 Supl 1: 44-52). O termo VEGF se destina a incluir moléculas de VEGF recombinantes, as quais podem ser preparadas por meio de métodos de expressão recombinante padrões ou adquiridas comercialmente (R&D Systems, Catálogo No. 210-TA, Minneapolis, Minn.), bem como proteínas de fusão contendo uma molécula de VEGF. Sequências de aminoácido de VEGFs exemplificativos que podem ser empregadas aqui são encontradas no banco de dados Genbank do NCBI e uma descrição completa do VEGF humano e seu papel em várias doenças e condições é encontrada no banco de dados Online Mendelian Inheritance in Man do NCBI.
[00039] Um anticorpo é proporcionado. Em determinados casos, o anticorpo compreende: a) um domínio variável de cadeia pesada que compreende regiões CDR que são substancialmente idênticas às regiões CDR de cadeia pesada de um anticorpo selecionado mostrado na Figura 1 e b) um domínio variável de cadeia leve que compreende regiões CDR que são substancialmente idênticas às regiões CDR de cadeia leve do anticorpo selecionado, onde o anticorpo se liga a um alvo selecionado. Em modalidades particulares, as regiões CDR do anticorpo podem conter coletivamente, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco até 10 diferenças de aminoácido (por exemplo, substituições, deleções ou inserções de aminoácido) com relação às regiões CDR do anticorpo selecionado. Em algumas modalidades, as regiões CDR do anticorpo podem ser idênticas às regiões CDR do anticorpo selecionado. Conforme será prontamente evidente, um anticorpo ainda contém sequências de estrutura nessa posição das CDRs.
[00040] Em modalidades particulares, o presente anticorpo pode ter: a) um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% ou 99% idêntica) ao domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado mostrado na Figura 1 e b) um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% ou 99% idêntica) ao domínio variável de cadeia leve do anticorpo selecionado.
[00041] Em modalidades particulares, o anticorpo pode compreender: a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo: i. uma região CDR1 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR1 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado da figura 1; ii. uma região CDR2 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR2 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e iii. uma região CDR3 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR3 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: i. uma região CDR1 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR1 de cadeia leve do anticorpo selecionado; ii. uma região CDR2 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR2 de cadeia leve do anticorpo selecionado; e iii. uma região CDR3 que é idêntica, quanto à sequência de aminoácido, à região CDR3 de cadeia leve do anticorpo selecionado; em que o anticorpo se liga especificamente a um alvo selecionado.
[00042] Imunização de um coelho com um único antígeno proporciona múltiplos anticorpos que podem ser agrupados pela relação de sua sequência. Os anticorpos dentro de cada grupo são relacionados uns aos outros pelo fato de que eles são produzidos por células que têm um ancestral de célula B "naive" em comum. O anticorpo produzido pela célula B ancestral ainda não sofreu maturação por afinidade, enquanto que os anticorpos relacionados sofreram maturação por afinidade e o estágio final de desenvolvimento de células B e "evoluíram" a partir do anticorpo ancestral de célula B em comum pelo fato de que eles contêm substituições de aminoácido causadas por hipermutação somática, conversão gênica e outros eventos de mutação celular que ocorrem durante maturação por afinidade.
[00043] A sequência de aminoácido de anticorpos relacionados pode ser comparada (por exemplo, mediante alinhamento dessas sequências) e os anticorpos são classificados de acordo com sua similaridade uns aos outros para identificar grupos relacionados de anticorpos. Os anticorpos de um grupo de anticorpos selecionados geralmente contêm uma sequência quase idêntica, tendo regiões CDR que são de comprimento idêntico e têm diferenças na sequência de aminoácido nas regiões de estrutura e/ou CDR. Essas diferenças indicam aminoácidos que podem ser substituídos em qualquer um dos anticorpos relacionados. Em determinados casos, os aminoácidos em uma posição podem ser aminoácidos dissimilares, caso no qual um aminoácido nessa posição pode ser substituído por qualquer outro aminoácido, por exemplo. Em outros casos, os aminoácidos em uma posição podem ser aminoácidos similares, caso no qual um aminoácido nessa posição pode ser substituído por um aminoácido similar, onde um aminoácido similar é definido acima. Em determinados casos, o aminoácido pode ser substituído de um anticorpo relacionado para outro, se o aminoácido é diferente.
[00044] Uma vez que cada uma das CDRs de um grupo de consenso particular foi originalmente produzida e eficazmente testada pelo sistema imune do animal imunizado, substituição de um aminoácido por outro aminoácido de consenso deverá ser bem-tolerada pelo anticorpo. Os anticorpos da figura 1 foram alinhados, grupos de anticorpos relacionados foram identificados e sequências de consenso foram identificadas. Em determinados casos, um anticorpo pode compreender as CDRs de um grupo de consenso de CDR, onde os grupos de consenso de CDR são derivados de alinhamentos de sequência de anticorpos relacionados. As sequências de consenso dos anticorpos da figura 1 são mostradas na Tabela 1. A Tabela 1 indica posições passíveis de substituição no presente anticorpo, onde uma substituição pode ser por qualquer outro aminoácido, um aminoácido similar (isto é, uma substituição de aminoácido conservativa) ou de um anticorpo para outro, por exemplo. Tais métodos são ainda descritos no pedido de patente U.S. 10/984.473 (publicado como US-2006-0099204), o qual é incorporado por referência para divulgação desses métodos.
[00045] Em determinadas modalidades, o anticorpo pode compreender as CDRs de um grupo de consenso de CDR selecionado da Tabela 1. Em modalidades particulares, o anticorpo pode compreender: a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo: i. Uma região CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR1 de um grupo de consenso de CDR selecionado da Tabela 1; ii. uma região CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR2 da sequência de consenso de CDR selecionada; e iii. uma região CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR3 da sequência de consenso de CDR selecionada; e b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: i. uma região CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR1 da sequência de consenso de CDR selecionada; ii. uma região CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR2 da sequência de consenso de CDR selecionada; e iii. uma região CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de CDR3 da sequência de consenso de CDR selecionada; em que o referido anticorpo se liga especificamente a um alvo selecionado.
[00046] Por exemplo, tal anticorpo pode compreender: a) um domínio variável de cadeia pesada tendo: i. uma CDR1 da fórmula: NNA/DVMC (SEQ ID NO: 77), uma CDR2 da fórmula: CIMTTDWTE/AYANWAKS (SEQ ID NO: 78) e uma CDR3 da fórmula: DSVGSPLMSFDL (SEQ ID NO: 79) e; b) um domínio variável de cadeia leve tendo: uma CDR1 da fórmula: QASQN/SL/VYN/GNNELS (SEQ ID NO: 80), uma CDR2 da fórmula: W/RASTLAS (SEQ ID NO: 81) e uma CDR3 da fórmula: A/S/GGYKSYS/YND/GGN/SG (SEQ ID NO: 82), onde o anticorpo bloqueia o VEGF. TABELA 1 CADEIA PESADA
TABELA 1 - Continuação CADEIA LEVE 
[00047] Em uma modalidade particular, o anticorpo pode compreender: a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo CDRs compreendendo uma sequência de aminoácido das fórmulas: CDR1: (S/N)(N/S/-) YXM(C/N/S/I); CDR2: (C/F/Y/I)I(M/Y/D/S)(T/-)(G/- )XXXX(T/A)(Y/E/D/V) YA(N/S/T)WAK(G/S) (SEQ ID NO: 131); CDR3: (G/D/S)(S/D/G/A)XXXX(L/W/Y/-)(X/-)(X/-)(X/-)(X/-) (Y/G/S/-)(F/A/Y/- )(A/N/D)(L/I); e b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo CDRs compreendendo uma sequência de aminoácido das fórmulas: CDR1: Q(A/S)S(E/Q)(S/N)(L/V/I)X(S/N/G/-)(N/D/-)(N/T/S/D/G)XL(S/T/A); CRD2: XAS(T/K/Y)L(A/E)S (SEQ ID NO: 132); CDR3: (A/Q)(G/N/S)X(Y/K)XXXX(X/-) (G/D/-)(X/-)(X/-)X(G/T/A/P/V), em que X é qualquer aminoácido, - denota nenhum resíduo,/denota um aminoácido alternativo presente em uma posição e () denota uma posição de aminoácido. Esse anticorpo bloqueia o VEGF. ANTICORPOS MODIFICADOS
[00048] Os anticorpos descritos acima podem ser modificados por meio de substituição, adição ou deleção de pelo menos um aminoácido. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido descrita acima de um anticorpo em questão é modificada para proporcionar um anticorpo humanizado para uso terapêutico em seres humanos ou outro tipo de anticorpo modificado. Em geral, esses anticorpos modificados têm as características gerais dos anticorpos de coelho descritos acima e contêm pelo menos as CDRs de um anticorpo de coelho descrito acima ou, em determinadas modalidades, CDRs que são muitos similares às CDRs de um anticorpo de coelho descrito acima. Anticorpos Humanizados
[00049] Em uma modalidade, portanto, a invenção proporciona versões humanizadas dos anticorpos descritos acima. Em geral, anticorpos humanizados são feitos por meio de substituição de aminoácidos nas regiões de estrutura de um anticorpo não-humano parental para produzir um anticorpo modificado que é menos imunogênico em um ser humano do que o anticorpo não-humano parental.
[00050] Anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas no campo incluindo, por exemplo, enxertagem de CDR (EP 239.400; publicação PCT WO 91/09967; patentes U.S. Nos. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), folheamento ou recobrimento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91: 969-973 (1994)) e embaralhamento de cadeia (patente U.S. No. 5.565.332). Em determinadas modalidades, substituições de estrutura são identificadas por meio de modelamento das interações dos resíduos de CDR e estrutura a fim de identificar resíduos de estrutura importantes para ligação a antígeno e comparação de sequência para identificar resíduos de estrutura incomuns em posições particulares (veja, por exemplo, patente U.S. No. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)). Métodos adicionais para humanização de anticorpos considerados para uso na presente invenção são descritos nas patentes U.S. Nos. 5.750.078; 5.502.167; 5.705.154; 5.770.403; 5.698.417; 5.693.493; 5.558.864; 4.935.496; e 4.816.567 e publicações PCT WO 98/45331 e WO 98/45332. Em modalidades particulares, o presente anticorpo de coelho pode ser humanizado de acordo com os métodos apresentados nos pedidos de patente U.S. publicados 20040086979 e 20050033031. Consequentemente, os anticorpos descritos acima podem ser humanizados usando métodos que são bem-conhecidos no campo.
[00051] Em uma modalidade de interesse particular, o presente anticorpo pode ser humanizado de acordo com os métodos apresentados em maiores detalhes no pedido de patente U.S. 10/984.473, depositado em 8 de novembro de 2004 e intitulado "Methods for Antibody Engineering", pedido o qual é incorporado por referência na íntegra. Em geral, esse método de humanização envolve identificação de uma posição passível de substituição de um anticorpo mediante comparação de sequências de anticorpos que se ligam ao mesmo antígeno e substituição do aminoácido nessa posição por um aminoácido diferente que está presente na mesma posição de um anticorpo humano similar. Nesses métodos, a sequência de aminoácido de um anticorpo de coelho parental é comparada (isto é, alinhada com) com as sequências de aminoácido de outros anticorpos de coelho relacionados para identificar posições tolerantes à variação. A sequência de aminoácido do domínio variável do anticorpo de coelho parental é usualmente comparada com um banco de dados de sequências de anticorpo humano e um anticorpo humano que tem uma sequência de aminoácido que é similar àquela do anticorpo parental é selecionado. As sequências de aminoácido do anticorpo parental e do anticorpo humano são comparadas (por exemplo, alinhadas) e aminoácidos em uma ou mais das posições tolerantes à variação do anticorpo parental são substituídos por aminoácidos correspondentemente posicionados no anticorpo humano. Nesse método de humanização, as regiões CDR do anticorpo podem ser humanizadas, além das regiões de estrutura.
[00052] Os métodos de substituição de posição tolerante à variação discutidos acima são prontamente incorporados em qualquer método de humanização conhecido e são também prontamente empregados para produzir anticorpos humanizados contendo regiões CDR que são alteradas com relação às regiões CDR do anticorpo parental. Consequentemente, anticorpos humanizados contendo versões alteradas das CDRs dos anticorpos descritos acima são proporcionados.
[00053] Conforme mencionado acima, o presente anticorpo pode ser modificado para proporcionar um anticorpo modificado. Em modalidades particulares, esse método inclui fazer uma ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, uma, até duas, até três, até quatro ou até cinco ou mais, usualmente até 10 ou mais). Uma substituição de aminoácido pode ser em qualquer posição e o aminoácido nessa posição pode ser substituído por um aminoácido de qualquer identidade. Em determinadas modalidades, um anticorpo modificado pode ter as mesmas características gerais dos anticorpos de coelho descritos acima. Em uma modalidade, após uma posição passível de substituição ter sido identificada usando os métodos do documento U.S. No. de Série 10/984.473, os aminoácidos nessa posição podem ser substituídos. Em modalidades particulares, uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de humanização (isto é, uma substituição que torna a sequência de aminoácido mais similar àquela de um anticorpo humano), uma substituição dirigida (por exemplo, uma substituição que torna a sequência de aminoácido de um anticorpo mais similar àquela de um anticorpo relacionado no mesmo grupo), uma substituição aleatória (por exemplo, uma substituição por qualquer um dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente) ou uma substituição conservativa (por exemplo, uma substituição por um aminoácido tendo propriedades bioquímicas similares àquele que está sendo substituído).
[00054] Em determinadas modalidades, anticorpos modificados da invenção podem conter uma cadeia pesada ou leve que é codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza, sob condições de alta estringência, a um ácido nucleico de codificação de cadeia pesada ou leve de coelho. Condições de alta estringência incluem incubação a 50°C ou maior em 0,1 X SSC (solução salina a 15 mM/citrato de sódio a 0,15 mM).
[00055] Em determinadas modalidades, anticorpos modificados da invenção podem conter uma cadeia pesada ou leve que é codificada por um polinucleotídeo que é pelo menos 80% idêntico (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%) a um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada ou leve de coelho. A identidade percentual é baseada na mais curta das sequências comparadas. Programas bem-conhecidos, tal como BLASTN (2.0.8) (Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25: 3389-3402) usando parâmetros de default e nenhum filtro, podem ser empregados para fazer uma comparação de sequência. MÉTODOS DE USO
[00056] Os anticorpos descritos acima podem ser empregados em uma variedade de métodos. Um de tais métodos compreende: contato de um anticorpo em questão com um alvo do anticorpo sob condições adequadas para ligação do anticorpo ao alvo a fim de produzir um complexo. Tal método pode ser realizado através de ELISA ou Western blotting ou através de qualquer um de muitos métodos de detecção imunológica conhecidos no campo, por exemplo. Em outras modalidades, um método de bloqueio de ligação de um ligante a seu receptor é fornecido. Nessas modalidades, o método compreende: administração de um anticorpo em questão a um indivíduo, onde o anticorpo se liga ao receptor ou ao ligante no referido indivíduo e bloqueia a ligação do mesmo.
[00057] O presente anticorpo inibe pelo menos uma atividade de seu alvo na faixa de cerca de 20% a 100%, por exemplo, em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, usualmente até cerca de 70%, até cerca de 80%, até cerca de 90% ou mais. Em determinados ensaios, o presente anticorpo pode inibir seu alvo com uma IC50 de 1 x 10-7 M ou menos (por exemplo, 1 x 10-7 M ou menos, 1 x 10-8 M ou menos, 1 x 10-9 M ou menos, usualmente até 1 x 10-12 M ou 1 x 10-13 M). Em ensaios nos quais um camundongo é empregado, o presente anticorpo pode ter uma ED50 de menos de 1 μg/camundongo (por exemplo, 10 ng/camundongo a cerca de 1 ng/ camundongo).
[00058] Os protocolos que podem ser empregados nesses métodos são numerosos e incluem, mas não estão limitados a, ensaios isentos de célula, por exemplo, ensaios de ligação; ensaios celulares nos quais um fenótipo celular é medido, por exemplo, ensaios de expressão gênica; e ensaios in vivo que envolvem um animal em particular (o qual, em determinadas modalidades, pode ser um modelo animal para uma condição relacionada ao alvo). Em determinados casos, o ensaio pode ser um ensaio de vascularização.
[00059] Em determinadas modalidades, um anticorpo em questão pode ser contatado com uma célula na presença de VEGF e um fenótipo de resposta ao VEGF da célula monitorado.
[00060] Ensaios de VEGF exemplificativos incluem ensaios usando proteína isolada em sistemas isentos de célula, in vitro usando células cultivadas ou ensaios in vivo. Ensaios de VEGF exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, um ensaio de inibição de tirosina quinase de receptor (veja, por exemplo, Cancer Research 15 de junho de 2006; 66: 6025-6032), um ensaio de proliferação de HUVEC in vitro (FASEB Journal 2006; 20: 2027-2035), um ensaio de doença por tumor sólido in vivo (USPN 6.811.779) e um ensaio de angiogênese in vivo (FASEB Journal 2006; 20: 2027-2035). Esses ensaios são bem-conhecidos no campo. As descrições desses ensaios são aqui incorporadas por referência.
[00061] Ensaios de TNF-a exemplificativos incluem ensaios in vitro usando sistemas isentos de célula ou usando células cultivadas ou ensaios in vivo. Como tal, ensaios de TNF-a incluem ensaio com sangue íntegro humano in vitro e ensaio de citotoxicidade mediada por célula (USPN 6.090.382), ensaio de morte de tumor humano in vitro (veja, por exemplo, pedido de patente U.S. Publicado 20040185047), ensaio de regressão de tumor in vivo (Pedido USP 20040002589). Ensaios de TNF- a adicionais são descritos em uma variedade de publicações, incluindo 20040151722, 20050037008, 20040185047, 20040138427, 20030187231, 20030199679 e Balazovich (Blood 1996, 88: 690-696). MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
[00062] Em muitas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam o presente anticorpo monoclonal são introduzidos diretamente em uma célula hospedeira e a célula incubada sob condições suficientes para induzir à expressão do anticorpo codificado. Os anticorpos da presente invenção são preparados usando técnicas padrões bem-conhecidas por aqueles versados no campo em combinação com as sequências de polipeptídeo e ácido nucleico fornecidas aqui. As sequências polipeptídicas podem ser usadas para determinar sequências de ácido nucleico apropriadas que codificam o anticorpo particular divulgado. A sequência de ácido nucleico pode ser otimizada para refletir "preferências" de códons particulares para vários sistemas de expressão de acordo com métodos padrões bem-conhecidos por aqueles versados no campo.
[00063] Qualquer célula adequada para expressão de cassetes de expressão pode ser usada como uma célula hospedeira. Por exemplo, células de levedo, inseto, planta, etc. Em muitas modalidades, uma linhagem de célula hospedeira de mamífero que não produz comumente anticorpos é usada, exemplos das quais são como segue: células de rim de macaco (células COS), células de rim de macaco CVI transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 1); células de rim embriônico humano (HEK-293, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de hâmster bebê (BHK, ATCC CCL); células de ovário de hâmster Chinês (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, (1980); células Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco Verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383: 44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL- 1658); e células L de camundongo (ATCC CCL-1). Linhagens de célula adicionais se tornarão evidentes para aqueles versados no campo. Uma ampla variedade de linhagens de célula estão disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209.
[00064] Métodos de introdução de ácidos nucleicos em células são bem-conhecidos no campo. Métodos adequados incluem eletroporação, tecnologia de pistola de partícula, precipitação com fosfato de cálcio, microinjeção direta e semelhantes. A escolha do método é geralmente dependente do tipo de célula que está sendo transformado e das circunstâncias sob as quais a transformação está ocorrendo (isto é, in vitro, in vivo ou ex vivo). Uma discussão geral desses métodos pode ser encontrada em Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995. Em algumas modalidades, tecnologias de transferência de gene mediada por cálcio e lipofectamina são usadas.
[00065] Após os ácidos nucleicos em questão terem sido introduzidos em uma célula, a célula é, tipicamente, incubada, normalmente a 37 °C, algumas vezes sob seleção, durante um período de cerca de 1-24 horas de forma a permitir a expressão do anticorpo. Na maioria das modalidades, o anticorpo é, tipicamente, secretado no sobrenadante do meio no qual a célula é crescida.
[00066] Em células hospedeiras de mamífero, uma série de sistemas de expressão baseados em vírus pode ser utilizada para expressar o presente anticorpo. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação do anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovirus, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Esse gene quimérico pode, então, ser inserido no genoma do adenovírus através de recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressão da molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, veja Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359 (1984)). A eficiência de expressão pode ser intensificada mediante a inclusão de elementos intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição apropriados, etc. (veja Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 51-544 (1987)).
[00067] Para produção a longo prazo em alto rendimento de anticorpos recombinantes, expressão estável pode ser usada. Por exemplo, linhagens de célula, as quais expressam estavelmente a molécula de anticorpo, podem ser manipuladas. Ao invés de usar vetores de expressão os quais contêm origens de replicação virais, células hospedeiras podem ser transformadas com cassetes de expressão de imunoglobulina e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, células manipuladas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias em um meio enriquecido e, então, são trocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo em um cromossomo e cresçam para formar focos os quais, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens de célula. Tais linhagens de célula manipuladas podem ser particularmente úteis em triagem e avaliação de compostos que interagem, direta ou indiretamente, com a molécula de anticorpo.
[00068] Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção tenha sido produzida, ela pode ser purificada por meio de qualquer método conhecido no campo para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, através de cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca de íons, afinidade, particularmente afinidade pelo antígeno específico após Proteína A e em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial ou através de qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Em muitas modalidades, os anticorpos são secretados da célula no meio de cultura e coletados do meio de cultura. FORMULAÇÕES E ADMINISTRAÇÃO
[00069] Os anticorpos da invenção podem ser administrados de qualquer maneira a qual é medicamente aceitável. Isso pode incluir injeções através de vias parenterais, tais como intravenosa, intravascular, intra-arterial, subcutânea, intramuscular, intratumor, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural ou outras, bem como oral, nasal, oftálmica, retal ou tópica. Administração com liberação sustentada também é especificamente incluída na invenção, através de meios tais como injeções de depósito ou implantes passíveis de erosão. Distribuição localizada é particularmente considerada, através de meios tal como distribuição via um cateter a uma ou mais artérias, tal como a artéria renal ou um vaso que supre um tumor localizado.
[00070] Os presentes anticorpos podem ser formulados com um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um ou mais ingredientes orgânicos ou inorgânicos, naturais ou sintéticos, com os quais o composto é combinado para facilitar sua aplicação. Um veículo adequado inclui solução salina estéril, embora outras soluções estéreis isotônicas aquosas e não aquosas e suspensões estéreis conhecidas por serem farmaceuticamente aceitáveis sejam conhecidas por aqueles versados no campo. Uma "quantidade eficaz" refere-se àquela quantidade a qual é capaz de aliviar ou retardar a progressão da doença, condição degenerativa ou lesão. Uma quantidade eficaz pode ser determinada em uma base individual e será baseada, em parte, considerando os sintomas a serem tratados e resultados pretendidos. Uma quantidade eficaz pode ser determinada por aqueles versados no campo empregando tais fatores e usando não mais do que experimentação de rotina.
[00071] Em uma modalidade, o presente anticorpo é administrado a um paciente através de injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Um anticorpo pode ser administrado dentro de uma faixa de dose entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg; entre cerca de 1 mg/kg a 75 mg/kg; ou cerca de 10 mg/kg a 50 mg/kg. O anticorpo pode ser administrado, por exemplo, através de injeção de bolo ou através de infusão lenta. Infusão lenta durante um período de 30 minutos a 2 horas pode ser usada. UTILIDADE
[00072] Um anticorpo em questão é útil para tratamento de um distúrbio referente a seu alvo. Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo com uma condição relacionada ao VEGF. O método geralmente envolve administração de um anticorpo em questão a um indivíduo tendo um distúrbio relacionado ao VEGF em uma quantidade eficaz para tratar pelo menos um sintoma do distúrbio relacionado ao VEGF. Condições relacionadas ao VEGF são, em geral, caracterizadas por proliferação de célula endotelial vascular excessiva, permeabilidade vascular, edema ou inflamação, tal como edema cerebral associado à lesão, derrame ou tumor; edema associado a distúrbios inflamatórios, tais como psoríase ou artrite, incluindo artrite reumatoide; asma; edema generalizado associado a queimaduras; ascite e efusão pleural associada a tumores, inflamação ou trauma; inflamação crônica das vias aéreas; síndrome de vazamento capilar; doença renal associada a vazamento aumentado de proteína; e distúrbios oculares, tais como degeneração macular relacionada à idade e retinopatia diabética. Tais condições incluem câncer de mama, pulmão, colorretal e renal. KITS
[00073] T ambém proporcionados pela presente invenção são kits para praticar os métodos em questão, conforme descrito acima. Os presentes kits incluem pelo menos um ou mais de: um anticorpo em questão, um ácido nucleico que codifica o mesmo ou uma célula contendo o mesmo. O presente anticorpo pode ser humanizado. Outros componentes opcionais do kit incluem: tampões, etc., para administração do anticorpo ou realização de um ensaio de atividade. Os ácidos nucleicos do kit podem também ter sítios de restrição, sítios de clonagem múltipla, sítios de iniciador, etc. para facilitar sua ligação a ácidos nucleicos de anticorpo que não de coelho. Os vários componentes do kit podem estar presentes em recipientes distintos ou determinados componentes compatíveis podem ser pré-combinados em um único recipiente, conforme desejado.
[00074] Além dos componentes mencionados acima, os presentes kits ainda incluem, tipicamente, instruções para uso dos componentes do kit para praticar os presentes métodos. As instruções para praticar os presentes métodos são, em geral, registradas sobre um meio de registro adequado. Por exemplo, as instruções podem ser impressas sobre um substrato, tal como papel ou plástico, etc. Como tal, as instruções podem estar presentes nos kits como uma bula, no rótulo do recipiente do kit ou componentes do mesmo (isto é, associadas à embalagem ou subembala- gem), etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um arquivo de dados de armazenamento eletrônico presente sobre um meio de armazenamento legível em computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete, etc. Em ainda outras modalidades, as instruções reais não estão presentes no kit, mas meios para obtenção das instruções a partir de uma fonte remota, por exemplo, via a internet, são fornecidos. Um exemplo dessa modalidade é um kit que inclui um endereço da web onde as instruções podem ser vistas e/ou do qual as instruções podem ser baixadas. Conforme com as instruções, isso significa que a obtenção das instruções é registrada sobre um substrato adequado.
[00075] Também proporcionados pela presente invenção são kits incluindo pelo menos um meio legível em computador incluindo um programa conforme discutido acima e instruções. As instruções podem incluir orientações para instalação ou configuração. As instruções podem incluir orientações para uso da invenção com opções ou combinações de opções, conforme descrito acima. Em determinadas modalidades, as instruções incluem ambos os tipos de informação.
[00076] Fornecimento do software e instruções como um kit pode servir a uma série de finalidades. A combinação pode ser embalada e adquirida como um meio para produzir anticorpos de coelho que são menos imunogênicos em um hospedeiro que não um coelho do que um anticorpo parental ou sequências de nucleotídeo do mesmo.
[00077] As instruções são, em geral, registradas sobre um meio de registro adequado. Por exemplo, as instruções podem ser impressas sobre um substrato, tal como papel ou plástico, etc. Como tal, as instruções podem ser apresentadas nos kits como uma bula, no rótulo do recipiente do kit ou componentes do mesmo (isto é, associadas à embalagem ou subembalagem), etc. Em outras modalidades, as instru-ções são apresentadas como um arquivo de dados de armazenamento eletrônico apresentado sobre um meio de armazenamento legível em computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete, etc., incluindo o mesmo meio sobre o qual o programa é apresentado.
[00078] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a modalidades específicas da mesma, deverá ser entendido por aqueles versados no campo que várias alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem se desviar do verdadeiro espírito e escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de processo particulares ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todas de tais modificações se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações em anexo. EXEMPLOS
[00079] O anticorpo foi obtido a partir de hibridomas de coelho que produzem anticorpos que bloqueiam a interação de VEGF com seu receptor (VEGF-R2). Os hibridomas foram gerados mediante fusão de esplenócitos de coelho imunizados com o parceiro de fusão de hibridoma de coelho 240E-W2.
[00080] Os coelhos foram imunizados com uma proteína de fusão Fc. Para expressar a proteína de fusão, a sequência de codificação do VEGF165 humano foi clonada no C-término de Fc de IgG de coelho, a qual contém a sequência peptídica sinalizadora de cadeia pesada de IgG de coelho em seu N-término. A proteína de fusão foi produzida em células HEK 293 e secretada no meio de cultura. Para obter a proteína pura para imunização, o sobrenadante foi coletado e purificado através de uma coluna de proteína A. A proteína eluída foi submetida à diálise contra tampão de PBS.
[00081] Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados com o imunogênio. Cada coelho recebeu uma imunização primária por meio de injeção subcutânea de 0,4 mg da proteína purificada com adjuvante completo de Freund ou TiterMax. Os animais receberam, então, um reforço através de injeção subcutânea de 0,2 mg da proteína com adjuvante incompleto de Freund ou TiterMax uma vez a cada três semanas. O reforço final (0,4 mg de proteína em solução salina) foi fornecido intravenosamente 4 dias antes de esplenectomia.
[00082] Fusões de célula foram realizadas seguindo o protocolo convencional de Spieker-Polet usando PEG. A proporção de esplenócitos para o parceiro de fusão foi de 2:1. As células fundidas foram colocadas em lâminas com 96 cavidades e HAT foi adicionado após 48 horas para selecionar hibridomas.
[00083] ELISA direto foi realizado para identificar anticorpos que bloqueiam a ligação de VEGF a uma proteína de fusão VEGF-R2 revestida sobre uma lâmina de microtitulação. Os anticorpos identificados nesse ensaio, então, sofreram triagem quanto ao bloqueio da interação do VEGF com seu receptor em um ensaio de ligante-receptor. Os anticorpos de bloqueio foram identificados por sua inibição de ligação de Fc-VEGF-R2 (domínio extracelular) ou VEGF-Fc em solução ao Fc-VEGF ou Fc-VEGF-R2 revestido sobre as lâminas.
[00084] cDNAs que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos foram clonados e sequenciados.
Claims (7)
1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio variável compreendendo: i. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo: uma região CDR1 idêntica aos resíduos de aminoácido 30-35 da SEQ ID NO: 4, uma região CDR2 idêntica aos resíduos de aminoácido 50-66 da SEQ ID NO: 4 e uma região CDR3 idêntica aos resíduos de aminoácido 98-109 da SEQ ID NO: 4; e ii. um domínio variável de cadeia leve compreendendo: uma região CDR1 idêntica aos resíduos de aminoácido 23-35 da SEQ ID NO: 43, uma região CDR2 idêntica aos resíduos de aminoácido 51-57 da SEQ ID NO: 43 e uma região CDR3 idêntica aos resíduos de aminoácido 90-101 de SEQ ID NO: 43; e (b) regiões constantes de cadeia y humana, em que o anticorpo neutraliza VEGF humano.
2. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo monovalente.
3. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo bivalente.
4. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo de cadeia única.
5. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um fragmento selecionado a partir de scFv e Fab.
6. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é uma versão humanizada do mesmo.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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