CN102686609A - 修饰的可变域分子及其生产和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了包含一种抗体重链可变区(VH)的一种分离蛋白质，该可变区在根据Kabat的编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处包含一个带负电荷的氨基酸，该蛋白质能够特异性地结合到一种抗原上。

Description

修饰的可变域分子及其生产和使用方法
通过引用进行结合
本申请要求于2009年10月23日提交的名称为“修饰的可变域分子及其生产和使用方法”的USSN61/254,460、以及于2010年9月7日提交的名称为“修饰的可变域分子及其生产和使用方法2”的澳大利亚临时专利申请号2010904025的优先权，通过引用将它们的全部内容结合在此。
领域
本披露涉及包括抗聚集抗体可变域的蛋白质及其用途。
背景
目前包括抗原结合域的抗体和蛋白质广泛地用作研究试剂、诊断/预测试剂、工业试剂以及治疗剂。这种宽范围的可应用性是由于包括其抗原结合域的抗体和蛋白质以高度特异性和亲和力结合到抗原上的能力。因此，包括其抗原结合域的抗体和蛋白质能够特异性地结合到样品中的抗原上并且允许检测、定量或杀死表达该抗原的细胞或递送治疗的有效载荷。然而，尽管它们具有通用性，仅一个小组的抗体具有适合诊断/预测/工业的/治疗性应用的生物物理特性。例如，治疗性或体内诊断抗体/蛋白质需要受试者体内较长的血清半衰期以便累积到所希望的靶上，并且因此它们必须是抗聚集的(Willuda等人，1999)。工业应用通常需要具有较长半衰期或在暴露于苛刻条件(例如高温，无聚集)之后能够起作用的抗体/蛋白质(Harris，1999)。包括抗体可变域的蛋白质的聚集可能导致在表达和/或纯化、免疫原性、毒性、降解、亲和力受损、或储存之后失去活性方面的困难。
蛋白质聚集是与折叠途径竞争的一个过程或可以起于折叠途径中的中间体，并且通常涉及未折叠蛋白或部分折叠蛋白的结合。通过稳定天然状态(即，抗去折叠)或通过降低蛋白质的未折叠或部分折叠状态聚集的倾向可以实现对于聚集的抗性。稳定天然状态的一个缺点是这些蛋白质将有可能暴露于它们将去折叠的一个环境中。通常，当蛋白质变性或去折叠时，在蛋白质内部通常介导分子内接触的氨基酸残基被暴露出来。这种暴露通常使蛋白易于形成分子间接触并且聚集。与抗去折叠的蛋白质相反，在暴露于这样的环境之后，当去折叠时具有降低聚集倾向的蛋白质将简单地重新折叠成生物活性的非聚集状态。
包括其抗原结合域的抗体或蛋白质的聚集抗性或聚集倾向通常受其中包含的一个或多个最大聚集倾向结构域限制并且受它与周围结构域(如果存在的话)的相互作用的强度的限制。这是因为一旦该结构域去折叠，如果它不能再折叠，它可以与同一种蛋白质中或其他蛋白质中的其他结构域相互作用并且形成聚集体。抗体的恒定域通常不聚集并且在序列上并不显著改变(如通过它们的名字表明)。因此，抗体的最弱结构域通常被认为是从一种抗体改变到下一种抗体的那些区域，即可变区(例如，重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))(Ewert等人，2003)。在这个方面，将易于聚集的scFv分子结合到其他稳定的重组抗体产物中经常将这些通常所不希望的性状赋予该新的重组体设计中。如Ewert等人，2008说明的，为了通过合理的工程化改进任何次优的抗体构建体，必须鉴定和改善“最弱的连接”。Ewert等人还强调了可变域通常是抗体或抗体相关分子中的“最弱连接”。因此，使可变域具有聚集抗性的工程化最可能致使包括该可变域的整个蛋白质具有聚集抗性。Hoyer等人，2002还确立了VH结构域对包括抗体可变域的蛋白质的再折叠具有显著影响。诸位作者得出结论，这些VH可以是进行修饰以改善蛋白的一个主要目标。
为了降低可变域的聚集，已经提出了不同的策略，例如合理设计聚集抗性蛋白、互补决定区(CDR)接枝、或将二硫键引入到一个可变域中。
合理设计聚集抗性蛋白通常涉及使用计算机分析来预测点突变对蛋白质的聚集倾向的影响。然而，对于这种方法存在许多困难。例如，仅鉴定可能减少去折叠蛋白的聚集的突变是不够的。而是，该突变还必须不增加折叠蛋白的聚集或影响折叠蛋白的功能。此外，合理设计需要所改善特异性蛋白质的详细结构分析并且因此难以与尚未彻底表征的蛋白质一起使用并且不易应用于多种不同蛋白质。
CDR接枝涉及将来自一个可变域的CDR移植到另一个可变域的框架区(FRs)上。这个策略显示在稳定抗-EGP-2scFv中是有用的(Willuda等人，1999)。然而，这个策略通常用于产生抗去折叠的可变域，如上面讨论的，这不是最令人希望的蛋白质形式。这种方法的缺点包括在CDR接枝之后可能发生亲和力降低。可以通过将突变引入到这些FR中来克服这种亲和力损失，然而这类突变可能在蛋白质中产生免疫原性表位，由此制造从治疗观点来看所不希望的蛋白质。此外，CDR接枝通常需要晶体结构的分析或供体和受体可变区的同源性建模，用于评定接枝的适合性。清楚地，这样一种方法是费力的并且需要专门的知识。此外，因为每种可变区具有不同结构，这种方法不易贯穿多种分子进行应用。
对于涉及将二硫键引入可变区的多种方法，当该键可以帮助蛋白质正确地再折叠时，它还将刚性引入到该可变域中。这种刚性可以降低抗体对抗原的亲和力。此外，不是所有可变域都能够支持引入必要的半胱氨酸残基用于二硫键形成而不损失亲和力或不引入免疫原性表位。此外，在高蛋白浓度下形成二硫键可能导致蛋白质聚集，因此抵消了该键的任何潜在的正效应。
如从上述可以清楚的，本领域中对于包含聚集抗性可变域的蛋白质以及它们的生产方法存在着一种需要。优选地，这些方法易于应用于多种不同的可变区中。
概述
在导致本发明的工作中，诸位发明人寻求鉴定在赋予聚集(例如在暴露于热之后)抗性的抗体的可变区中的氨基酸残基。这类聚集抗性蛋白用于多种应用，例如治疗和/或诊断/预测。诸位发明人将包括VH的聚集抗性单域抗体序列与具有相同框架序列但是不具有聚集抗性的种系VH进行比较。最初，诸位发明人在聚集抗性VH的互补决定区中鉴定了大量氨基酸差异(如图1中所示)。虽然鉴定了大量的差异，诸位发明人发现单个氨基酸改变赋予VH聚集抗性并且仅少量改变的组合赋予大多数观察到的聚集抗性。这些发现促使诸位发明人进一步研究这些改变在互补决定区中的作用。诸位发明人确定根据Kabat标号系统位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的带负电荷的氨基酸足以对VH或包括它的蛋白质赋予相当的聚集抗性。
诸位发明人另外地发现，与缺乏带负电荷的残基或仅包括一个带负电荷的残基的蛋白质相比较，在上面讨论的位置处包括两个或更多个带负电荷的氨基酸显著地改善了包括VH的蛋白质的聚集抗性。如在此举例说明的，在于此说明的位置处包括多个带负电荷的氨基酸对蛋白质(例如，在溶液中或展示在噬菌体表面上)赋予聚集抗性。这种作用在可溶性蛋白中是显著的(与噬菌体表面上展示的相对)。因此，诸位发明人不但已经确定赋予聚集抗性的单个氨基酸残基，他们还另外地确定了它们可以显著地通过结合这些残基来改善该耐受性。在此方面，诸位发明人已经鉴定了与用单个带负电荷的氨基酸所观察到的相比较赋予更大程度的聚集抗性的带带负电荷的氨基酸的多种组合。诸位发明人未料想到的是，在VH中这样几个氨基酸残基的取代可能赋予这种程度的聚集抗性。除了在上述位置处的取代之外，诸位发明人还鉴定了在互补决定区中的其他变化，这些变化对VH上(例如根据Kabat编号系统在位置26和/或30和/或50和/或52和/或52a和/或53上的负电荷的氨基酸)赋予了可检出的聚集抗性。
因为诸位发明人所鉴定的突变是在抗体的互补决定区(CDRs)中，它们可以容易地在不同抗体之间转移(例如，包括不同框架区的不同类别或亚类的抗体)。这是因为已经选择了抗体可变域来适应CDR中的序列变化，而框架区通常不显著地改变，因为它们提供一种用于呈递CDR环的支架。
除了在互补决定区中的取代(该取代赋予了聚集抗性)之外，诸位发明人还鉴定了对VH(例如根据Kabat编号系统在位置39和/或40上的带负电荷的氨基酸)赋予可检出的聚集抗性的邻近框架区中的改变。
这些发现允许诸位发明人生产数种包括一个VH的聚集抗性蛋白，该VH能够特异性地结合到除了用于筛选的这类蛋白质的文库之外的抗原，以鉴定包括VH结构域的新蛋白质(例如用作治疗和/或诊断试剂)。
与缺乏一个或多个带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，诸位发明人生产的蛋白质还以较高的水平表达于重组系统中。此外，与缺乏多个带负电荷的氨基酸或包含一个单个的带负电荷的氨基酸残基的蛋白质相比较，通过结合多个带负电荷的氨基酸，诸位发明人能够获得更高水平的可溶性蛋白表达。
诸位发明人生产的蛋白质还显示了在纯化过程中降低的被色谱树脂截留的倾向，由此增加了产量。在此方面，诸位发明人再次显示与缺乏如在此鉴定的一个单个残基的蛋白质相比较，包括这种残基赋予了显著的优点，并且显示包括多个带负电荷的残基进一步改善了这个作用。
诸位发明人还发现与缺乏如上讨论的一个或多个带负电荷的氨基酸残基的蛋白质相比较，包括这类氨基酸的蛋白质能够更高程度地浓缩而不聚集，从而为储存以及为产生高浓度组合物(例如药物组合物)提供了明确的优点。
由诸位发明人生产的蛋白质的聚集抗性还提供了一个在纯化过程中的优点，因为这些蛋白能够被加热以减少二聚体/三聚体的存在量并且然后进行纯化。这不仅降低了该蛋白的所不希望的形式的存在量而且潜在地增加了产量。
诸位发明人另外生产了聚集抗性蛋白文库并且显示他们可以从中分离出特异性结合到抗原上和/或高亲和力地结合到抗原上的蛋白质。从这些文库中分离的蛋白质还显示具有聚集抗性。
因此，本披露提供了包括根据Kabat的编号系统在位置32和/或位置33处包含一个带负电荷的氨基酸的抗体VH的一种分离蛋白质，该蛋白质能够特异性地结合到除了鸡蛋溶菌酶、β半乳糖苷酶、α淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中：
(i)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
任选地，该蛋白质在选自下组的一个位置上另外地包括一个带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的位置28和/或31和/或35。在一个实例中，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置31上另外地包括一个带负电荷的氨基酸。
在一个另外的或替代的实例中，该蛋白包括一种聚集抗性VH。
在一个实例中，该蛋白质不是HEL4(即，不包括SEQ ID NO：1中列出的序列)。
本披露还提供了包括根据Kabat的编号系统在位置28、33和/或35处包含一个带负电荷的氨基酸的抗体VH的一种分离蛋白质，该蛋白质能够特异性地结合到除了鸡蛋溶菌酶、β半乳糖苷酶、α淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中：
(i)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸.
本披露还提供了一种分离蛋白质，包括在选自下组的两个或更多个位置处包含带负电荷的氨基酸的一个抗体VH，该组由以下各项组成：根据Kabat的编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35，该蛋白质能够特异性地结合到除了鸡蛋溶菌酶、β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶、B5R之外的抗原上或其中：
(i)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸.
在一个实例中，该蛋白质包括一个聚集抗性VH。
本披露还提供了包括根据Kabat的编号系统在位置28、33和/或35处包含一个带负电荷的氨基酸的抗体VH的一种分离蛋白质，该蛋白质能够以大于10μM或5μM或1μM，优选地大于100nM的亲和力特异性地结合到抗原上，其中：
(i)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸.
在一个实例中，该蛋白质包括一个聚集抗性VH。
本披露还提供了一种分离蛋白质，包括在选自下组的两个或更多个位置处包含带负电荷的氨基酸的一个抗体VH，该组由以下各项组成：根据Kabat的编号系统28和/或31和/或32和/或33和/或35，该蛋白质能够以大于10μM或5μM或1μM，优选地大于100nM的亲和力特异性地结合到抗原上，其中：
(i)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置31和33处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸.
在一个实例中，该蛋白质不结合到β半乳糖苷酶、α淀粉酶、B5R、人VEGF或人肿瘤坏死因子α上。
本披露还提供了包括能够特异性结合到抗原上的一种抗体VH的蛋白质，其中该VH包括包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8的连续氨基酸的一个序列，其中X1相应于根据Kabat编号系统的位置28，其中X1、X4、X5、X6以及X8中至少两项是带负电荷的氨基酸并且剩余的在X1-X8上的氨基酸是任何氨基酸，并且其中该蛋白质不结合到鸡蛋溶菌酶或β半乳糖苷酶或B5R上，并且其中：
(i)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置X5和X6处包括天冬氨酸，则它在位置X2与X8之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置X4和X5处包括天冬氨酸，则它在位置X1与X8之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸。
在一个实例中，与无上面讨论的带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，该蛋白质具有降低的聚集倾向。例如，与没有带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，在加热到至少打约60℃或70℃或优选地80℃之后该蛋白质具有降低的聚集倾向。
在一个实例中，在加热到至少大约60℃或70℃或优选地80℃之后该蛋白质保持特异性结合到抗原上的能力。
在一个实例中，该蛋白质能够结合到(优选地特异性地结合到)一种人蛋白上(在适当情况下，除了人VEGF或人肿瘤坏死因子α之外)。
在另一个实例中，该蛋白质能够结合到(优选地特异性地结合到)一种与人类病症相关或是其成因的蛋白质上(在适当情况下，除了VEGF或人肿瘤坏死因子α之外)。这样的蛋白质可以是一种人蛋白质、或来自例如传染性生物的一种蛋白质。优选地，该蛋白质是一种人蛋白质(在适当情况下，除了VEGF或人肿瘤坏死因子α之外)。示例性的蛋白质是可溶的和/或分泌的蛋白质或受体(例如，受体的细胞外结构域)或膜结合蛋白(例如膜结合蛋白的细胞外结构域)。
在一个实例中，该带负电荷的氨基酸是谷氨酸。在另一个实例中，该带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
在一个实例中，在位置28和/或31和/或33和/或35上的带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
在一个实例中，在位置32上的带负电荷的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
在一个示例性形式中，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置32和33上包括一个带负电荷的氨基酸。在另一个示例性的形式中，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置31和32和33上包括一个带负电荷的氨基酸。
在另一个实例中，该蛋白质在单独地或共同地选自下组的一个或多个残基上另外地包括一个带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的位置26、30、39、40、50、52、52a以及53。优选地，该带负电荷的氨基酸是在位置30处，例如这个带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
优选地，该带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
在此所述的一种示例性的蛋白质包括下面各项：
(i)在单独地或共同地选自下组的两个或更多个残基上的一个带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的28、31、32、33、以及35；以及
(ii)任选地，在单独地或共同地选自下组的一个或多个残基上的一个带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的位置26、30、39、40、50、52、52a以及53。
在此所述的另一种示例性的蛋白质包括下面各项：
(i)在根据Kabat编号系统位置32和33处的一个带负电荷的氨基酸；以及
(ii)任选地，在单独地或共同地选自下组的一个或多个残基上的一个带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的位置26、28、30、31、35、39、40、50、52、52a以及53。
在本披露的一个示例性的形式中，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置31和32和33上包括带负电荷的氨基酸。
例如，该蛋白质包括：
(i)在根据Kabat编号系统的位置32处的一个谷氨酸；以及
(ii)在根据Kabat编号系统的位置33处的一个天冬氨酸。
例如，该蛋白包括：
(i)在根据Kabat编号系统的位置31处的一个天冬氨酸；
(ii)在根据Kabat编号系统的位置32处的一个谷氨酸；以及
(iii)在根据Kabat编号系统的位置33处的一个天冬氨酸。
任选地，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置28和/或35上另外地包括一个带负电荷的氨基酸(例如天冬氨酸)。
在一个实例中，该蛋白质在位置28、32和33或位置28、31、32和33或位置32、33和35或位置31、32、33和35或位置28、31、32、33和25处包括带负电荷的氨基酸。
本披露还用于生产具有改进的聚集抗性的现有蛋白质的修饰形式。因此，本披露另外地提供了包括能够特异性地结合到抗原上的一个修饰的抗体重链可变区(VH)的蛋白质，其中VH在根据Kabat编号系统的位置31和/或位置33上包括带负电荷的氨基酸，并且其中VH的未修饰形式不包括带负电荷的氨基酸。
本披露另外地提供了包括能够特异性地结合到抗原上的一个修饰的抗体VH的蛋白质，其中VH在根据Kabat编号系统的位置28、31、33和/或35上包括带负电荷的氨基酸，并且其中VH的未修饰形式不包括一个或多个带负电荷的氨基酸。优选地，VH的未修饰形式结合到与该修饰的VH相同抗原上(例如，相同表位)。
本披露另外地提供了包括能够特异性地结合到抗原上的修饰VH的蛋白质，其中VH包括选自下组的两个或更多个位置，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35，其中未修饰的蛋白质在根据Kabat编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35上不包括两个或更多个带负电荷的氨基酸。优选地，VH的未修饰形式结合到与该修饰的VH相同的抗原上(例如，相同表位)。
本披露还提供了包括能够特异性结合到抗原上的一种修饰的VH的蛋白质，其中该VH包括包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8的连续氨基酸的一个序列，其中X1相应于根据Kabat编号系统的位置28，其中X1、X4、X5、X6以及X8中至少两项是带负电荷的氨基酸并且剩余的在X1-X8上的氨基酸是任何氨基酸，其中该未修饰的蛋白质在位置X1、X4、X5、X6和X8上不包括两个或更多个带负电荷的氨基酸。
在一个实例中，该蛋白包括一个修饰的聚集抗性VH。
在一个实例中，该蛋白质包括：
(i)在根据Kabat编号系统的位置31处的一个天冬氨酸；和/或
(ii)在根据Kabat编号系统的位置32处的一个谷氨酸；和/或
(iii)在根据Kabat编号系统的位置33处的一个天冬氨酸。
任选地，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置28和/或35上另外地包括一个带负电荷的氨基酸(例如天冬氨酸)。
这类蛋白质的示例性特征(例如，针对带负电荷的氨基酸和/或特异性带负电荷的氨基酸的另外的位点)在此进行了说明并且将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本披露的形式。
在一个实例中，该蛋白质是一种抗体。
在一个实例中，该蛋白质或抗体不结合到鸡蛋溶菌酶、β半乳糖苷酶、α淀粉酶、B5R(例如，来自痘苗病毒)上或其中：
(i)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外带负电荷的氨基酸.
优选地，该蛋白质结合到一种人蛋白质(例如，与疾病相关或是其成因的人蛋白质)上。
在另一个实例中，根据任何一个实例的如在此所述的蛋白质在CDR(例如CDR3)中不包括二硫键。
在另一个实例中，根据任何一个实例在此所述的蛋白质内的可变区不具有总酸性等电点。
本披露的示例性的蛋白质是在除了根据Kabat编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35之外的氨基酸位置处人化、人源化或去免疫化的，并且融合到一种人蛋白质或其区域上(例如，是嵌合抗体)。
在一个实例中，本披露的蛋白质是处于单域抗体(dAb)或融合到另一种蛋白质(例如，Fc区域)上的dAb的形式。
在一个替代实例中，本披露的蛋白质另外地包括一个轻链可变区(VL)，其中VH和VL相结合从而形成一个Fv(例如，包括一个抗原结合位点)。在一个实例中，该Fv能够特异性地结合到一种抗原上。
在一个实例中，VH和VL是处于不同多肽链中。例如，该蛋白质是处于抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体或Fv的形式。
在另一个实例中，VH和VL是处于相同多肽链中。例如，该蛋白质是处于一种(scFv)n或包括(scFv)n的一种融合蛋白的形式，其中n是1至10之间的一个数字。
在一个替代的或另外的实例中，除了上面讨论的具有特异性亲和力的那些蛋白质之外，蛋白质以小于5μM、优选地小于1μM、优选地小于500nM、优选地小于200nM、并且更优选地小于10nM，例如小于1nM的亲和力特异性地结合到靶抗原或表位上。
在一个替代的或另外的实例中，在此讨论的任何蛋白质以大于100pM、优选地大于10pM、优选地大于1pM的亲和力特异性地结合到靶抗原或表位上。
在一个另外的或替代的实例中，本披露的任何蛋白质以300nM或更小、300nM至5pM、优选地50nM至20pM、或5nM至200pM或1nM至100pM的KD与它的一个或多个靶抗原解离。
在一个实例中，本披露的蛋白质包括包含与被修饰成在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35(和/或在此所述的任何另外的位点)处包括一个(或两个或更多个)带负电荷的氨基酸的SEQ ID NO：2中列出的序列具有至少大约80％(或90％或95％或99％或100％)一致性的序列的蛋白质的一个CDR1。在一个实例中，本披露的蛋白质包括与SEQ IDNO：5、6、7中列出的一个序列具有至少大约80％(或90％或95％或99％或100％)一致性的一个序列或包括所述蛋白质的一个CDR3(优选地，一个重链CDR3)。在本披露的一个实例中，本披露的蛋白质包括与被修饰成包括根据任一实例在此所述的带负电荷的氨基酸的SEQ ID NO：10-13的任一项列出的一个序列具有至少大约80％(或90％或95％或99％或100％)一致性的一个序列。在本披露的一个实例中，本披露的蛋白质包括与被修饰成在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35(和/或在此所述的任何另外位点)处包括一个(或两个或更多个)带负电荷的氨基酸的SEQ ID NO：10-13的任一项中列出的一个序列具有至少大约80％(或90％或95％或99％或100％)一致性的一个序列。
本披露还提供了结合到一种化合物上的本披露的蛋白质。例如，该化合物是选自下组，该组由以下各项组成：放射性同位素、可检测标记、治疗化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、增加该蛋白质在受试者体内的半衰期的化合物以及它们的混合物。
本披露还提供了包括本披露的一种蛋白质和一种药学上可接受载体的组合物。
本披露另外地提供了编码本披露的蛋白质的核酸。在一个实例中，该核酸是处于表达构建体中并且可操作地连接到一个启动子上。例如，该表达构建体是一种表达载体。
本披露还提供了表达本披露的蛋白质的一种细胞。例如，该细胞包括本披露的一种核酸或表达构建体。示例性的细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞以及原核细胞。
本披露还提供了一种用于生产本披露蛋白质的方法，该方法包括维持本披露的表达构建体持续一段时间并且在足以(或使得)产生编码蛋白的条件下。例如，该方法包括培养本披露的细胞持续一段时间并且在足以(或使得)产生本披露蛋白的条件下。
在一个实例中，该方法另外地包括分离本披露的蛋白质。在一个实例中，该方法另外地包括在分离蛋白之前、期间或之后，将该蛋白质加热至例如至少大约50℃或60℃或70℃或80℃。例如，将蛋白质加热以便由此降低在表达和纯化过程中天然发生的二聚体和/或三聚体的量。这样一种方法可以促进回收增加水平的本披露的蛋白质。
任选地，该方法另外地包括将蛋白质结合到一种化合物上或将该化合物配制成一种药物组合物。
本披露另外地提供了包括本披露的多种蛋白质的一个文库。
本披露还提供了包括含有抗体VH的蛋白质的一个文库，其中至少30％(或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％或98％或99％)的VH在选自下组的两个或更多个位置处包括带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35。
本披露还提供了包括含有抗体VH的蛋白质的一个文库，其中至少30％(或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％或98％或99％)的VH包括包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8的连续氨基酸的一个序列，其中X1相应于根据Kabat编号系统的位置28，其中X1、X4、X5、X6以及X8的至少两项是带负电荷的氨基酸并且在剩余的X1-X8上的氨基酸是任何氨基酸。
在一个实例中，包含带负电荷的氨基酸的VH在位置32和33、或31和32和33上包括这些残基。
用于带负电荷的氨基酸或可以包括的特定带负电荷的氨基酸的另外位点在此进行了说明并且并且将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本实例中。
在一个实例中，这些蛋白质展示在颗粒(例如，噬菌体或核糖体)或细胞的表面上。
在一个实例中，除了在位置32和/或33处(以及，任选地31)的那些之外的VH结构域的CDR中(例如CDR3中或CDR2和3中或CDR1、2和3中)的氨基酸是随机地或半随机地或是从人抗体衍生的。
在另一个实例中，除了在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的那些之外VH结构域的CDR中(例如CDR3中或CDR2和3中或CDR1、2和3中)的氨基酸是随机地或半随机地或是从人抗体衍生的。
清楚地是，本披露还提供了编码所述文库的核酸文库。
本披露另外地提供了一种用于分离本披露的蛋白质的方法，该方法包括使本披露的文库与一种抗原相接触持续一段时间并且在足够(或使得)蛋白质结合到该抗原上的条件下，并且分离该蛋白质。
本披露另外地提供了一种用于生产包括多种本披露蛋白质的文库的方法，该方法包括：
(i)获得或产生编码多种包括VH结构域的蛋白的核酸，其中这些VH结构域在上面讨论的位置处包括一个带负电荷的氨基酸；
(ii)产生包括以下可操作地连接核酸的表达构建体的一个文库：
a)一种启动子；
b)在(i)获得或产生的一种核酸；以及
c)编码促进这些细胞或颗粒中/上展示包含VH的蛋白质的多肽的一种核酸；以及
(iii)表达由这些表达构建体编码的蛋白质使得它们展示在这些细胞或颗粒中/上。
在一个实例中，除了在位置32和/或33处(以及，任选地31)的那些之外VH结构域的CDR中(例如CDR3中或CDR2和3中或CDR1、2和3中)的氨基酸是随机地或半随机地或是从人抗体衍生的。
在另一个实例中，除了在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的那些之外VH结构域的CDR中(例如CDR3中或CDR2和3中或CDR1、2和3中)的氨基酸是随机地或半随机地或是从人抗体衍生的。
在一个实例中，该方法另外地包括分离编码该蛋白质的核酸。可以将这样的核酸引入到表达构建体中。任选地，可以表达该蛋白质。
本披露还考虑了对分离的蛋白质进行修饰，例如亲和力成熟和/或人源化和/或去免疫化。
这样一种分离的蛋白质可以用于生产例如一种抗体。
本披露还用于降低现有抗体或包括其VH蛋白质的聚集倾向或增加其聚集抗性。例如，本披露提供了一种用于增加包含抗体重链可变区(VH)的蛋白质的聚集抗性的方法，该方法包括对该VH进行修饰使得它在选自下组的两个或更多个位置处包括带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35，其中未修饰的蛋白质在根据Kabat编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处不包括两个或更多个带负电荷的氨基酸。
另外的修饰位点和可以取代的特异性氨基酸残基在此进行了说明并且将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本实例中。
在一个实例中，该方法包括从该蛋白质中分离一种VH，根据本披露的方法修饰该VH，并且生产包含该VH的蛋白质。例如，该方法包括从抗体中分离VH，根据本披露的方法修饰该VH，并且生产包括该修饰的VH的抗体。
在一个实例中，本披露的方法另外地包括在根据本披露修饰之后使VH或包括它的蛋白质的亲和力成熟和/或将该蛋白质去免疫化和/或将该蛋白质人源化和/或将该蛋白质嵌合化。
在一个实例中，本披露的方法不涉及将任何另外的氨基酸残基插入(与取代相对)到VH中。
上述方法将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于增加蛋白质表达和/或用于生产能够在高浓度下在不显著的聚集下储存的蛋白质和/或用于用于增加从层析树脂中回收蛋白质或用于降低从层析树脂中回收蛋白质所需溶液的体积的方法中。
例如，本披露提供了一种用于增加包含抗体VH的可溶蛋白生产水平的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统位置28和/或31和/或33和/或35处的一个氨基酸来修饰该VH并且生产该蛋白，其中与缺乏带负电荷的氨基酸蛋白的生产水平相比较，所生产的可溶蛋白的水平增加了。
本披露还提供了一种用于增加包含抗体VH的可溶蛋白的生产水平的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代位于根据Kabat编号系统位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的两个或更多个氨基酸来修饰该VH并且使该蛋白质与一种层析树脂相接触，其中与缺乏带负电荷的氨基酸的蛋白质的生产水平相比较，所生产的可溶蛋白的水平增加了。
本披露还提供了一种用于增加从一种层析树脂中回收包含抗体重链VH的蛋白质的水平或用于降低从层析树脂中回收蛋白质所需的溶液的体积的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统位于位置28、31、33和/或35处的氨基酸来修饰VH，并且使该蛋白质与层析树脂接触，其中与缺乏带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，从层析树脂回收蛋白质的回收水平增加了或者从层析树脂回收蛋白质所需的溶液的体积降低了。
本披露还提供了一种用于增加从一种层析树脂中回收包含抗体VH的蛋白质的水平或用于降低从层析树脂中回收蛋白质所需的溶液的体积的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统位于位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的两个或更多个氨基酸来修饰VH，并且使该蛋白与层析树脂接触，其中与缺乏带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，从层析树脂回收蛋白质的回收水平增加了并且从层析树脂回收蛋白质所需的溶液的体积降低了。
本披露还提供了本披露的蛋白质或本披露的组合物在医药中的用途。
本披露还提供了一种治疗或预防受试者体内的病症的方法，该方法包括将本披露的一种蛋白质或组合物施用于对其有需要的受试者体内。在一个实例中，受试者患有癌症和/或炎性疾病和/或自身免疫疾病和/或神经病症。
本披露还提供了本披露的蛋白质在制造治疗或预防一种病症的药物中的用途。
本披露还提供了一种用于将化合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞与本披露的蛋白质或组合物相接触。
本披露还提供了用于诊断或预测受试者体内的病症的一种方法，该方法包括使来自受试者的样品与本披露的蛋白质或组合物相接触使得该蛋白质结合到抗原上并且形成一种复合物以及对该复合物进行检测，其中该复合物的检测对于受试者体内的病症是诊断性的或预测性的。在一个实例中，本方法包括确定该复合物的水平，其中所述复合物的增强或降低的水平对于受试者体内的病症是诊断性的或预测性的。
本披露另外提供了一种用于局部化或检测受试者体内的抗原的方法，所述方法包括：
(i)将本披露的蛋白质或组合物施用于受试者体内使得该蛋白质结合到抗原上，其中该蛋白质结合到一种可检测标记上；以及
(ii)检测或局部化该在体内的可检测标记。
本披露的每个实例将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于包括包含任选地与在此所述另一个位点结合的根据Kabat编号系统一个带负电荷的氨基酸位置30的抗体重链可变区(VH)的蛋白质上，该蛋白质能够特异性地结合到除了鸡蛋溶菌酶、β半乳糖苷酶、α淀粉酶、B5R之外的抗原上或其中：
(i)如果该蛋白质结合到人肿瘤坏死因子α上并且在位置30和31处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人肿瘤坏死因子α上并且在位置30处包括谷氨酸并且在位置32处包括天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸。
附图简要说明
图1是一个图解表示，显示了HEL4(SEQ ID NO：1)和DP47(SEQ IDNO：2)的一个氨基酸序列比对。完全相同的氨基酸标记有星号。还指出了在此提及的CDR位置。
图2是一个图形表示，显示了在DP47/HEL4CDR嵌合体上聚集抗性实验的结果。将HEL4 CDR1引入到DP47中赋予VH结构域聚集抗性，而引入CDR2和CDR3具有降低的作用。
图3是一个显示了实验结果的图形表示，这些实验用于鉴定赋予聚集抗性的HEL4VH结构域的CDR1中单个氨基酸、以及它们的组合。位于CDR1位置31、32或33处的带负电荷的氨基酸导致VH结构域的显著的聚集抗性，而其他突变具有有限的作用。在31-33处的三重的氨基酸改变(SYA31-33DED)显著增加了聚集抗性。任何取代的定位都指示在X轴上。
图4是一个图形表示，显示包括具有单个带负电荷的氨基酸改变、以及它们组合的VH结构域的scFv的聚集抗性。在CDR1位置31、32或33处的带负电荷的氨基酸导致scFv结构域显著的聚集抗性，而其他突变具有有限的作用。在31-33处的三重氨基酸改变(SYA31-33DED)显著增加了scFv的聚集抗性。任何取代的定位都指示在X轴上。
图5A是一个图形表示，显示了当进行在此举例说明的“热/冷”测定时包括HEL4的CDR1(并且因此包括在位置31、32以及33处的带负电荷的氨基酸)并且其中将多样性引入到HEL4的CDR3中的来自Garvan-IA VH文库的大多数测试的初试(未选择的)克隆显示显著水平的聚集抗性。
图5B是一个图形表示，显示了当进行在此举例说明的热/冷测定时包括HEL4的CDR1(并且因此包括在位置31、32以及33处的带负电荷的氨基酸)并且其中将多样性引入到HEL4的CDR3中的来自Garvan-IB VH文库的大多数测试的初试(未选择的)克隆显示显著水平的聚集抗性。
图6显示了克隆G07抗-hTNF结构域抗体和克隆G11抗-mIL-21结构域抗体的抗原结合特异性。使用ELISA来确定每个克隆结合到多种抗原上的能力(如图中显示的)。“hTNF”，人肿瘤坏死因子α；“mTNF”，小鼠肿瘤坏死因子α；“hIL21“，人白细胞介素21；”mIL21，小鼠白细胞介素21；“βgal”，β半乳糖苷酶；“hPRLR”，人催乳激素受体。
图7是一个图形表示，显示了在位置26至40之间暴露的残基的表面上包括带负电荷的氨基酸的DP47的不同突变体的聚集抗性。提供的结果显示了在经受在此举例说明的“热/冷”测定之后在噬菌体上展示的DP47单突变体的聚集抗性。突变位点指示在X轴上。
图8是一个图形表示，显示了在CDR2中包含带负电荷的氨基酸的DP47的不同突变体的聚集抗性。提供的结果显示了在经受在此举例说明的“热/冷”测定之后在噬菌体上展示的DP47单突变体的聚集抗性。突变位点指示在X轴上。
图9是一个图形表示，显示了在CDR1中包含多个带负电荷的氨基酸的DP47的不同突变体的聚集抗性。提供的结果显示了在经受在此举例说明的“热/冷”测定之后在噬菌体上展示的DP47单突变体的聚集抗性。突变位点指示在X轴上。
图10是一个图形表示，显示了任选地与CDR1中带负电荷的氨基酸相结合的在根据Kabat编号系统的位置28和/或35处包含带负电荷的氨基酸的DP47的不同突变体的聚集抗性。提供的结果显示了在经受在此举例说明的“热/冷”测定之后在噬菌体上展示的DP47单突变体的聚集抗性。突变位点指示在X轴上。
图11是一个图形表示，显示了在CDR1中包含单个或多个带负电荷的氨基酸的可溶性DP47突变体的表达水平。结果呈现了如使用蛋白A酶联免疫吸附测定(ELISA)所确定的显示蛋白水平(mg/升培养物)。突变位点指示在X轴上。
图12是一个图形表示，显示了在尺寸排阻层析之后VH结构域的回收百分比。将DP47的不同突变体加热到80℃持续10分钟紧接着在4℃下冷却10分钟或不进行处理然后暴露于尺寸排阻层析。结果表示为加热样品曲线下的面积，表示为在未加热样品曲线下的面积百分比。突变位点指示在X轴上。
图13A和13B是一系列图形表示，显示了DP47突变体的热去折叠的圆二色性(CD)分析结果。通过将样品加热到80℃并且以1℃/min将加热的蛋白质从80℃冷却到4℃对每种样品的聚集抗性进行测试。指出了所测试的VH结构域的个性特征。
序列表检索表
SEQ ID NO：1-HEL4 VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2-DP47 VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3-VL区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4-VH与VL区之间的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5-VHhTNF_G07(抗-hTNF VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6-VHmIL21_G11(抗-mIL-21VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7-VHPRLR_C02(抗-hPRLR VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8-VHHEL_H04(抗-HEL VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9-VHHEL_H08(抗-HEL VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10-阿达木单抗(以形式销售)VH区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11-利妥昔单抗(以
Figure BDA00001792399400192
或
Figure BDA00001792399400193
形式销售)VH区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12-曲妥珠单抗(以
Figure BDA00001792399400194
形式销售)VH区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13-贝伐单抗(以
Figure BDA00001792399400195
形式销售)VH区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14-编码HEL4 VH的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15-编码DP47 VH区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16-用于扩增VH的寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17-用于扩增VH的寡核苷酸的核苷酸序列。
优选实施方案的详细说明
概述
本说明书包含使用PatentIn Version 3.5制备的核苷酸和氨基酸序列信息，并且在权利要求书之后提供在此。
贯穿本说明书，除非另外明确地说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质构成、步骤的组或物质构成的组应当被理解成包括这些步骤、物质构成、步骤的组或物质构成的组的一个或多个(即一个或更多个)。
本领域的技术人员应当理解本披露是容易进行改变和变更的，除外确切地说明的那些。应当理解的是本披露包括所有此类改变和变更。本披露还包括在本说明书中逐个地或共同地提及或指出的所有这些步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有的组合或其中的任何两种或多种。
本披露并非局限于在此说明的特定实施方案的范围内，这些实施方案仅旨在举例说明的目的。功能上等效的产物、组合物和方法清楚地在本披露的范围内，如在此所说明。
在此所述的任何实施方案以便将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于任何其他实施方案中，除非另外明确说明。
针对包含抗体VH的蛋白的在此所述的任何实施方案或实例或它们的用途将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于包含免疫球蛋白VH的蛋白或它的用途上。
除非另外明确地定义，在此使用的所有技术的和科学的术语应当认为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、以及生物化学中)中一个普通技术人员所通常理解的相同的含义。
除非另外说明，本披露中使用的重组蛋白、细胞培养物、以及免疫技术是本领域的技术人员熟知的标准操作。贯穿文献这类技术在以下来源中进行了说明和解释，例如，J.Perbal，《分子克隆实用指南》(A PracticalGuide to Molecular Cloning)，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1989)；T.A.Brown(编辑)，《基本分子生物学实用方法》(Essential MolecularBiology：A Practical Approach)，第1和2卷(Volumes 1 and 2)，IRL出版社(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，《DNA克隆实用方法》(DNA Cloning：A Practical Approach)，第1-4卷(Volumes 1-4)，IRL出版社(1995和1996)；和F.M.Ausubel等人(编辑)，《现代分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今的所有更新)；EdHarlow和David Lane(编辑)《抗体实验手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbour Laboratory)，(1988)，以及J.E.Coligan等人(编辑)《现代免疫学实验指南》(Current Protocols inImmunology)，John Wiley & Sons(包括至今的所有更新)。
通过Kabat(1987和/或1991)、Bork等人(1994)和/或Chothia和Lesk(1987和1989)或Al-Lazikani等人(1997)中的讨论可以进一步阐明在此所述的可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的说明和定义。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应当理解为是指“X和Y”或“X或Y”并且应当理解成为两种含义或为任一含义提供明显支持。
贯穿本说明书，词语“包括”(“comprise”)或变化如“包括”(“comprises”)或“包括”(“comprising”)应当被理解成是暗指包含了一个提及的要素、整体或步骤或者多个要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤，或者多个要素、整体或步骤的组。
如在此所使用的，术语“衍生自”应当被认为是指一个特定的整体可以是从一个特定来源获得，尽管不需要直接地从该来源获得。
选择的定义
如在此使用的，术语“聚集”是指在不用将蛋白质再折叠成天然或未聚集状态的试剂对蛋白质进行处理下是不可逆的蛋白质之间的缔合或结合。这类聚集可以导致功能的丧失，天然折叠的丧失，和/或细胞毒性或免疫原性的获得。这个定义包括体内形成的有害的和无功能蛋白组装以及在生物医药研究以及生物技术中体外形成的无功能蛋白组装两者。然而，它不包括等电的或“盐析的”沉淀(其中当转移到类似天然缓冲剂条件时，组成性蛋白立即返回到它们可溶的天然形式)。
对于“聚集抗性”，是指在暴露于使蛋白或其结构域变性的条件之后(例如，加热)，本披露的蛋白质能够再折叠并且以构象特异方式结合到结合配偶体上，例如，该蛋白质能够再折叠成允许特异性结合到抗原和/或超级抗原(例如，蛋白A)上的构象。优选地，在部分地或完全变性(或去折叠)之后该蛋白质能够再折叠成允许特异性结合到抗原或超级抗原上的构象。在暴露于通常使蛋白质或其结构域变性的条件(例如加热)之后，优选的蛋白质并不显著地聚集。例如，包含多种所述蛋白质的组合物中大于约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％的本披露的蛋白质在暴露于热之后(例如，60℃或70℃或80℃)不聚集。因此，优选的蛋白质还可以被考虑为可热再折叠的。
如在此使用的，术语“抗体”应当理解成表示包括由多个多肽链组成的可变区(例如轻链可变区(VL)和重链可变区(VH))的一种蛋白质。抗体还通常包括恒定域，这些恒定域可以安排到一个恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)中。这些抗体可以特异性地结合到一种或少数的紧密相关的抗原上。通常，这些抗体包括一个四链结构作为它们的基础单元。全长抗体包括共价连接的两个重链(大约50-70kD)和两个轻链(每个大约23kD)。轻链通常包括一个可变区以及一个恒定域并且在哺乳动物中是一个κ轻链或一个λ轻链。重链通常包括一个可变区和通过铰链区连接到一个或多个另外的恒定域上的一个或两个恒定域。哺乳动物的重链是以下类型之一：α、δ、ε、γ、或μ。每个轻链还共价地连接到这些重链之一上。例如，通过链间二硫键并且通过非共价相互作用将两个重链以及重链和轻链保持在一起。在不同类型抗体中的链间二硫键的数量可以改变。每个链具有一个N端可变区(VH或VL，其中它们各自具有大约110个氨基酸长度)并且在C端具有一个或多个恒定域。轻链的恒定域(CL，它具有大约110个氨基酸长度)与重链的第一恒定域(CH，它具有大约330-440个氨基酸长度)对齐并且二硫键键连到其上。该轻链可变区与该重链可变区对齐。抗体重链可以包括2个或更多个另外的CH结构域(例如，CH2、CH3等)并且可以包括可以在CH1与Cm恒定域之间进行鉴定的一个铰链区。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)或亚类。优选地，该抗体是IgG，例如IgG3。优选地，该抗体是一种鼠类(小鼠或大鼠)抗体或一种灵长类(优选人类)抗体。术语“抗体”还包括人源化抗体、灵长类化抗体、去免疫化抗体、人类抗体以及嵌合抗体。这个术语不包括抗体样分子，例如T细胞受体，这类分子由术语“免疫球蛋白”涵盖。
如在此使用的，“可变区”是指包括CDR(即CDRl、CDR2、和CDR3、以及FR)的氨基酸序列的如在此定义的抗体或免疫球蛋白(它)的轻链和重链的部分。VH是指重链的可变区。VL是指轻链的可变区。根据本披露中使用的方法，分配到CDR和FR上的氨基酸位置是根据Kabat(1987和1991)或Chothia(1989)定义的并且根据Kabat编号系统进行编号。熟练的业内人士将能够容易地将其他编号系统用于本披露的性能中，例如Clothia和Lesk(1987)和/或Chothia(1989)和/或Al-Lazikani等人(1997)的高变区环编号系统(hypervariable loop numbering system)。
如在此使用的，术语“重链可变区”或“VH”应当理解成表示能够结合到一种或多种抗原上，优选地特异性地结合到一种或多种抗原上，并且至少包含CDR1的一种蛋白质。优选地，该重链连同三个CDR一起包括三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3以及任选地FR4)。在一个实例中，重链包括根据Kabat编号系统编号的以下残基1-25或1-30(FRl)，26-35或31-35(或35b)(CDR1)，36-49(FR2)，50-65(CDR2)，66-94(FR3)，95-102(CDR3)和103-113(FR4)定位的FR和CDR。在一个实例中，该重链是从包括所述重链和多个(优选地3个或4个)恒定域的免疫球蛋白衍生的或连接到恒定片段(Fc)上。
如在此使用的，术语“轻链可变区”或“VL”应当理解成表示能够结合到一种或多种抗原上，优选地特异性地结合到一种或多种抗原上，并且至少包含CDR1的一种蛋白质。优选地，该轻链连同三个CDR一起包括三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3以及任选地FR4)。优选地，轻链包括根据Kabat编号系统编号的以下残基1-23(FRl)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)以及98-107(FR4)定位的FR以及CDR。在一个实例中，该轻链是从包括连接到恒定域上和/或不连接到恒定片段(Fc)上的所述轻链的免疫球蛋白衍生的。
在本披露的一些实例中，术语“框架区”应当理解为表示除了CDR残基之外的那些可变区残基。天然发生抗体的每个可变区典型地具有鉴定为FRl、FR2、FR3和FR4的4个FR。如果CDR是根据Kabat来定义的，示例性的轻链FR(LCFR)残基定位在残基1-23(LCFRl)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、以及98-107(LCFR4)的附近。注意的是λLCFR1不包括残基10(该残基包括在κLCFR1中)。示例性的重链FR(HCFR)残基定位在残基1-25或1-30(HCFRl)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、以及103-113(HCFR4)的附近。
如在此使用的，术语“互补决定区”(同义词CDR；即CDRl、CDR2、和CDR3或高变区)是指其存在对于抗原结合是必需的抗体可变区的氨基酸残基。每个可变区典型地具有鉴定为CDRl、CDR2和CDR3的三个区域。每个互补决定区可以包括来自如Kabat(1987或1991或1992)或Chotia(1989)定义的“互补决定区”的氨基酸残基。在本披露的一个优选实例中，在重链可变区中，CDRH1是在残基26至35(或35b)之间，CDRH2是在残基50至65之间，并且CDRH3是在残基95至102之间(根据Kabat编号系统进行编号)。在轻链中，CDRL1是在残基24至34之间，CDRL2是在残基50至56之间并且CDRL3是在残基89至97之间(根据Kabat编号系统进行编号)。这些CDR还可以包括多个插入，例如在如Kabat(1987和/或1991和/或1992)中说明的。
如在此使用的，术语“Fv”应当理解为表示任何蛋白质，无论包括多个多肽或一个单个多肽，其中VL和VH结合并且形成具有抗原结合位点(即能够特异性地结合到抗原上)的一种复合物。形成抗原结合位点的VH和VL抗原是在一个单个多肽链中或在不同多肽链中。此外，本披露的Fv(以及本披露的任何蛋白)抗原具有可以或不可以结合相同抗原的多个抗原结合位点。这个术语应当理解成包括从抗体直接衍生的片段以及相应于使用重组手段生产的这种片段的蛋白质。在一些实例中，VH不连接到重链恒定域(CH)1上和/或VL不连接到轻链恒定域(CL)上。示例性的包含Fv的多肽或蛋白质包括一种Fab片段、一种Fab’片段、一种F(ab’)片段、一种scFv、一种双链抗体、一种三链抗体、一种四链抗体、或更高等级的复合物、一种结构域抗体(例如，一种VH)或连接到一个恒定区或其结构域上的上述中的任何一项，例如，CH2或CH3结构域。“Fab片段”由抗体的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜酶消化整个免疫球蛋白来生产，从而产生由完整的轻链和重链的一部分组成的一个片段或可以使用重组手段生产。通过用胃蛋白酶处理全抗体可以获得抗体的“Fab’片段”，紧接着还原，从而产生由一个完整的轻链和一个重链的一部分组成的分子。以这种方式处理的每个抗体得到两个Fab’片段。还可以通过重组手段生产Fab’片段。抗体的“F(ab’)2片段”由通过两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体组成，并且通过用胃蛋白酶处理整个抗体而获得，而没有随后的还原。“Fab2”片段是包括使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab片段的一种重组片段。“单链Fv”或“scFv”是包含其中VL和VH是通过适当的柔性多肽接头共价连接的抗体的可变区片段(Fv)的重组分子。落在本术语范围内的示例性的包含Fv的蛋白质的详细讨论在此在下面进行提供。
如在此使用的，术语“抗原结合位点”应当理解成表示由能够特异性地结合到抗原上的蛋白质形成的结构。抗原结合位点不需要是一系列的连续氨基酸，或甚至是在一个单个多肽链中的氨基酸。例如，在从两个不同多肽链产生的Fv中，抗原结合位点是由VL和VH的一系列区域组成的，这些区域与抗原相互作用并且然而它们通常不总是在每个可变区中一个或多个CDR中。
“恒定域”是抗体中的一种结构域，其序列在相同类型的抗体(例如，IgG或IgM或IgE)中是高度类似的。抗体的恒定区通常包括多个恒定域，例如γ、α和δ重链的恒定区包括三个恒定域并且γ、α和δ重链的Fc包括两个恒定域。μ和ε重链的恒定区包括4个恒定域并且Fc区包括2个恒定域。
如在此使用的术语“可结晶的片段”或“Fc”是指包括至少一个恒定域的抗体的一部分，并且它通常(尽管不是必然的)是糖基化的并且它结合到一个或多个Fc受体和/或补体级联的组分(例如，赋予效应子功能)上。可以从五种同种型(α、δ、ε、γ、或μ)的任何一项中选择重链恒定区。此外，不同亚类的重链(例如重链的IgG亚类)负责不同效应子功能并且因此通过选择所希望的重链恒定区，可以生产具有所希望的效应子功能的蛋白质。优选的重链恒定区是γ1(IgG1)、2(IgG2)以及γ3(IgG3)。
对于“Kabat编号系统”，表示用于以与Kabat(1987和/或1991和/或1992)中提出的系统一致的形式对免疫球蛋白的可变区中的残基进行编号的系统。
术语“蛋白质”应当理解成包括一种单个多肽，即，通过肽键连接的一系列连续氨基酸或共价地或非共价地连接到彼此上的一系列多肽(即，多肽复合物)。例如，该系列的多肽可以是使用适当的化学或二硫键共价地连接的。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力、以及疏水性相互作用。本披露考虑的非共价键是VH与VL之间的相互作用，例如处于双链抗体、三链抗体或四链抗体或抗体的一些形式。
术语“多肽”应当理解成是指来自上述段落，表示通过肽键连接的一系列连续氨基酸。
如在此使用的，术语“抗原”应当理解成表示可以针对它而产生免疫球蛋白反应(例如，抗体反应)的物质的任何组合物。示例性的抗原包括蛋白质类、肽类、多肽类、碳水化合物类、磷酸盐基团类、磷酸肽类或多肽类、糖基化的肽类或肽类等。
如在此使用的，术语“特异性的结合”或“以特异性方式结合”应当理解成表示与本披露的蛋白质与替代的抗原或细胞反应或结合相比较，它以更多的持续时间和/或以更大的亲和力更频繁地、更迅速地与一种特定抗原或多种抗原或表达它们的细胞反应或结合。例如，与特异性地结合到抗原上的蛋白质结合到其他抗原上相比较，它以更大的亲和力、亲和度、更容易地、和/或以更长的持续时间结合该抗原。通过阅读本定义还理解的是例如特异性地结合到一种第一抗原上的蛋白质可以或不可以特异性地结合到一种第二抗原上。这样，“特异性结合”不必要求专一地结合或不可检出地结合另一种抗原，这是通过术语“选择性结合”来表示的。通常地，但不是必需地，提及结合表示特异性结合，并且每个术语应当理解成为其他术语提供明确支持。
如在此使用的，在VH的背景下术语“修饰的”表示与亲本(或未修饰的)VH相比较VH的序列被改变。例如，在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处包括除了带负电荷的氨基酸之外氨基酸的VH被修饰成用带负电荷的氨基酸取代这些氨基酸的一个或多个。例如，在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处对VH进行修饰用来增加在这些位置处的带负电荷的氨基酸的数量，例如总计1或2或3或4或5或更多。在一个示例性的形式中，在列举的位置处带负电荷的氨基酸的数量增加为至少2个。
对于“逐个地”表示本披露分开地涵盖了所述的残基或多个残基的组，并且是指尽管单独的一个或多个残基或多个残基的组可能并未在此分开地列出，随附的权利要求可以分开地定义此类一种或多种残基或多个残基的组并且可以彼此分开。
对于“共同地”，表示本披露涵盖了任何数目或组合的所述的残基或多个残基的组，并且是指尽管此类数目的或组合的一个或多个残基或多个残基的组未能在此确切地列出，随附的权利要求可以分开地定义此类组合或亚组合，并且可以与一个或多个残基或残基的组的任何其他组合分开。
包含可变区的蛋白质
本披露考虑了包括特异性地或选择性地结合到一种或多种抗原上并且如根据任何一个实施方案在此所述进行修饰的免疫球蛋白重链变区的任何蛋白质。熟练的业内人士应当理解术语“免疫球蛋白”包括符合Kabat编号系统的免疫球蛋白超家族的任何蛋白质。免疫球蛋白超家族成员的实例包括T细胞受体。
本披露优选地考虑了包括特异性地或选择性地结合到一种或多种抗原上(例如通过抗原结合位点)并且如根据任何一个实施方案在此所述进行修饰的抗体VH的任何蛋白质。
抗体可变区
如熟练的业内人士基于在此的说明应当清楚的，本披露的蛋白质可以包括来自被修饰成在于此说明的位置处包括带负电荷的氨基酸的抗体的一个或多个VH。这样的蛋白质包括多种抗体(例如，整个抗体或全长抗体)。可以通过首先生产针对感兴趣抗原的一种抗体并且对该抗体进行修饰(例如使用重组手段)或通过对前面生产的抗体进行修饰来生产这类抗体。可替代地，生产了包括本披露VH的蛋白质，并且然后将该蛋白质被修饰或用来生产抗体。
用于生产抗体的方法是本领域已知的。例如，用于生产单克隆抗体的方法(例如杂交瘤技术)由Kohler和Milstein，(1975)进行了说明。在杂交瘤方法中，典型地用免疫原或抗原或表达它们的细胞来免疫小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物，用于引发淋巴细胞产生或能够产生可以特异性地结合到该免疫原或抗原上的抗体。然后使用适当的融合剂(例如聚乙二醇)使来自免疫动物的淋巴细胞或脾细胞与永生化细胞系融合从而形成一种杂交瘤细胞(Goding，1986)。可以将得到的杂交瘤细胞培养在适当的培养基中，该培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本蛋白缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基典型地可以包括次黄嘌呤、氨蝶呤、以及胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止了HGPRT缺陷型细胞的生长。本披露还考虑了用于生产抗体的其他方法，例如使用在Largaespada(1990)或Weissinger等人(1991)中以属类方式详细说明的ABL-MYC技术。
可替代地，抗体、或其编码序列是从前面生产的表达感兴趣抗体的细胞产生的(例如杂交瘤或转染瘤)。这类杂交瘤和/或转染瘤的不同来源对于熟练的业内人士而言应当是清楚的并且包括在例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和/或欧洲细胞培养物保存中心(ECACC)中。用于分离和/或修饰编码来自抗体的VH的序列的方法对于熟练的业内人士应当是清楚的和/或在此进行说明。根据本披露可以修饰的示例性的抗体包括但不限于
Figure BDA00001792399400281
(帕利珠单抗；MedImmune)，它是一种人源化的抗呼吸道合胞体病毒(RSV)单克隆抗体；
Figure BDA00001792399400282
(曲妥珠单抗；Genentech)，它是一种人源化的抗HER2单克隆抗体；
Figure BDA00001792399400283
(英利昔单抗；Centocor)，它是一种嵌合的抗TNFα单克隆抗体；
Figure BDA00001792399400284
(阿昔单抗；Centocor)，它是一种抗糖蛋白Iib/IIIa受体抗体；
Figure BDA00001792399400285
(达利珠单抗；Roche Pharmaceuticals)，它是一种人源化的抗CD25单克隆抗体；RITUXANTM/MABTHERATM(利妥昔单抗)，它是一种嵌合的抗CD20 IgG1抗体(IDEC Pharm/Genentech，Roche)；STIMULECTTM(巴利昔单抗；Novartis)，它是一种嵌合的抗IL-2Rα抗体；ERBITUX(西妥昔单抗；ImClone)，它是一种嵌合的抗EGFR抗体；MYLOTARGTM(吉姆单抗；Celltech/Wyeth)，它是一种人源化的抗CD33抗体)；Campath 1H/LDP-03(阿仑单抗；ILEX/Schering/Millenium)，它是一种人源化的抗CD52 IgG1抗体；XOLAIRTM(奥马佐单抗；Tanox/Genentech/Novartis)，一种人源化的抗IgE Fc抗体；
Figure BDA00001792399400286
(贝伐单抗；Genentech)，人源化的抗VEGF抗体；RAPTIVATM(依法珠单抗；Genentech/Merck Serono)，它是一种人源化的抗CD11a抗体；LUCENTIS(兰尼单抗；Genentech/Novartis)，它是一种人源化的抗VEGF-A抗体；TYSABRITM(那他珠单抗；Biogen
Figure BDA00001792399400287
Pharmaceuticals)，它是一种人源化的抗整联蛋白α4抗体；SOLIRISTM(依库珠单抗；Alexion Pharmaceuticals)，它是一种人源化的抗补体蛋白C5抗体；
Figure BDA00001792399400288
(帕尼单抗；Amgen)，全人的抗EGFR单克隆抗体；或
Figure BDA00001792399400289
(阿达木单抗；Abbott/MedImmune Cambridge)全人的抗TNFα。包括抗体VH的其他抗体和蛋白质是本领域已知的并且不排除在外。
本领域的技术人员可以容易地获得已知抗体VH的序列。示例性的序列包括阿达木单抗的VH(SEQ ID NO：10)或利妥昔单抗的VH(SEQ IDNO：11)或曲妥珠单抗的VH(SEQ ID NO：12)或贝伐单抗的VH(SEQ IDNO：13)。根据本披露可以容易地修饰这些序列。
在抗体生产和/或将其编码序列分离之后，将抗体或它的VH修饰成在必要的位置中包括带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)用来赋予聚集抗性(例如，如根据任何一个实施方案在此说明的)。通常，这包括分离编码VH或抗体的核酸并且将它的序列修饰成在必要位点处包括编码天冬氨酸(即，GAA或GAG)或谷氨酸(即GAT或GAC)的一个或多个密码子。
嵌合的人源化的以及人化抗体
本披露的蛋白质可以衍生自或可以是一种人源化的抗体或人化抗体或从中衍生的VH。术语“人源化的抗体”应当理解成是指一种嵌合分子，该嵌合分子通常是使用重组技术制备的，具有从来自非人类物种的抗体衍生的抗原结合位点并且该分子的剩余抗体结构是基于人类抗体的结构和/或序列。抗原结合位点优选地包括接枝到人类抗体可变区中适当的FR(即，VH中除了CDR之外的区域)上的来自非人类抗体的CDR并且剩余区域是来自人类抗体。抗原结合位点可以是野生型或被一个或多个氨基酸取代所修饰。在一些实例中，人类抗体的框架残基被相应的非人类残基替换。人源化抗体还可以包括在受体抗体或输入的CDR或框架序列中不能找到的残基。通常，人源化的抗体可以包括基本上所有至少一个，并且典型地两个可变区，其中所有或基本上所有CDR区相应于非人类抗体的那些并且所有或基本上所有FR区是人类抗体一致序列的那些。用于人源化非人类抗体的方法是本领域已知的。基本上可以按照US5225539、US6054297或US5585089的方法来进行人源化。不排除用于人源化抗体的其他方法。
如结合抗体或结合蛋白质的在此使用的术语“人类抗体”是指具有可变的以及任选地恒定的衍生自或相应于在人类中(例如在人种系或体细胞中)发现的序列的抗体区的抗体。“人”抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基，例如，通过随机或体外定点突变引入的突变(具体地是在抗体的少量残基中涉及保守取代或突变的突变，例如在抗体的1、2、3、4或5个残基中，优选地例如在组成抗体的一个或多个CDR的1、2、3、4或5个残基中)和/或在此说明的位置处的带负电荷的氨基酸。示例性的人类抗体或蛋白包括人框架区(例如，来自人种系)并且在除了带负电荷的氨基酸包括于其上的一个或多个位置之外的CDR中的任意氨基酸。这些“人类抗体”实际上并不必须由人来生产，而是它们可以使用重组手段来生产和/或从包含编码人类抗体恒定和/或可变区的核酸的转基因动物中(例如小鼠)分离。可以使用本领域已知的多种技术(包括噬菌体展示文库(例如，如在Hoogenboom和Winter 1991；US5,885,793中说明的和/或在下面说明的)或使用表达人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，如WO2002/066630；Lonberg等人(1994)或Jakobovits等人(2007)说明的)来生产人类抗体或其片段。
在一个实例中，本发明的蛋白质包括人VH(即在除了根据Kabat编号系统28和/或31和/或32和/或33和/或35之外的位置处)。例如，该蛋白质包括全部人框架区。
在一个实例中，该蛋白质不包括人源化VH或不包括从人源化抗体衍生的VH。例如，该蛋白质在一个或多个框架区中不包括鼠类氨基酸。在一个实例中，该蛋白质不包括从人源化的Fab4D5衍生的VH(例如，如US6407213中说明的)。
在一个实例中，本披露的蛋白质是一种嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与从具体物种(例如，鼠类，例如小鼠)中得到的抗体中相应的序列完全相同或同源的抗体或属于特定抗体类别或亚类，而该一个或多个链的剩余部分与从另一个物种(例如，灵长类，例如人类)得到的抗体中相应序列完全相同或同源或属于另一个抗体类别或亚类，以及这类抗体的片段，只要它们显示出所希望的生物活性即可(US4,816,567)。典型地，嵌合抗体使用啮齿动物或兔可变区以及人恒定区，以便生产主要具有人结构域的抗体。例如，嵌合抗体包括来自根据本披露的任何实施方案修饰的融合到人恒定区上的小鼠抗体的可变区。这类嵌合抗体的生产是本领域已知的，并且可以通过标准手段实现(如，例如在US5,807,715、US4,816,567以及US4,816,397中说明的)。
包含V H 的蛋白质
单域抗体
在一些实施方案中，本披露的蛋白是一种单域抗体(它与术语“结构域抗体”或“dAb”可互换地使用)。单域抗体是包括抗体的重链可变域的全部或一部分的一种单个多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是一种人单域抗体(Domantis公司，沃尔瑟姆市，马萨诸塞州；参见例如US6,248,516、WO90/05144、WO2003/002609和/或WO2004/058820)。在一个实例中，单域抗体由能够特异性地结合到抗原上以及能够根据本披露进行修饰的抗体重链可变域的全部或一部分组成。本披露还包括融合到另一种分子(例如，另一种结构域抗体或Fc区)上的结构域抗体。
示例性的结构域抗体包括在SEQ ID NO：5-9中的任一项中列出的序列。
双链抗体、三链抗体、四链抗体
包括VH的示例性的蛋白质是双链抗体、三链抗体、四链抗体以及更高等级的蛋白复合物例如在WO98/044001和WO94/007921中说明的那些。
如在此使用的，术语“双链抗体”应当理解成表示包括两个相关多肽链的一种蛋白质，每个多肽链包括结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中VL是一个抗体轻链可变区，VH是一个抗体重链可变区，X是包括不足以允许一个单个多肽链中的VH和VL相结合(或形成Fv)的残基的一个接头或不存在，并且其中一个多肽链的VH结合到另一个多肽链的VL上以形成一个抗原结合位点，即用来形成能够特异性地结合到一种或多种抗原上的一个Fv分子。在每个多肽链中的VL和VH可以是相同的或在每个多肽链中VL和VH可以是不同的从而形成一种双特异性双链抗体(即，包括具有不同特异性的两个Fv)。
如在此使用的，术语“三链抗体”应当理解成表示包括三个结合的多肽链的一种蛋白质，每个多肽链包括如上关于双链抗体所提出的结构，其中一个多肽链的VH与另一个多肽链的VL相结合从而由此形成一个三聚体蛋白(三链抗体)。
如在此使用的，术语“四链抗体”应当理解成表示包括四个结合的多肽链的一种蛋白质，每个多肽链包括如关于双链抗体所提出的结构，并且其中一个多肽链的VH与另一个多肽链的VL相结合从而由此形成一个四聚体蛋白(四链抗体)。
熟练的业内人士应当知道双链抗体、三链抗体和/或四链抗体以及它们的生产方法。VH和VL能够以任何顺序定位，即VL-VH或VH-VL。通常，这些蛋白质包括一种多肽链，其中一个VH和一个VL直接地或使用接头连接，该接头具有不足以允许VH和VL结合的长度。包括VH和VL的蛋白质相结合从而形成双链抗体、三链抗体和/或四链抗体，这取决于接头(如果存在的话)的长度和/或VH和VL结构域的顺序。优选地，该接头包括12个或更少的氨基酸。例如，在多肽链具有以下以N到C顺序VH-X-VL安排的结构的情况下，当X是一个接头时，具有3-12个残基的接头通常导致形成双链抗体，当接头具有1或2个残基或当接头不存在时通常导致形成三链抗体。在多肽链具有以下以N到C顺序VL-X-VH安排的结构的情况下，当X是一个接头时，具有3-12个残基的接头通常导致形成双链抗体，具有1或2个残基的接头通常导致形成双链抗体、三链抗体和四链抗体并且缺乏接头的多肽通常形成三链抗体或四链抗体。
说明双链抗体、三链抗体和/或四链抗体的示例性出版物包括WO94/07921、WO98/44001、Holliger等人(1993)、Hudson和Kortt(1999)、Hollinger和Hudson(2005)、以及其中引用的参考文件。
单链Fv(scFv)
熟练的业内人士应当知道的是scFv包括在一个单个多肽链中的VH和VL区。优选地，多肽链进一步包括VH与VL之间的一个多肽接头，它使scFv能够形成用于抗原结合的所希望的结构(即，用于单个多肽链的VH和VL彼此结合从而形成一个Fv)。这与双链抗体或更高等级的多聚体不同，其中来自不同多肽链的可变区彼此缔合或结合。例如，接头包括超过12个氨基酸残基，其中(Gly4Ser)3是针对scFv更偏爱的接头之一。
本披露还考虑了二硫键稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中一个单个半胱氨酸残基被引入到VH的FR以及VL的FR中，并且这些半胱氨酸残基通过二硫键连接从而产生一种稳定的Fv(参见例如Brinkmann等人，1993)。
可替代地，或另外地，本披露提供了一种二聚体scFv，即包括通过非共价键或共价键连接的两个scFv分子的一种蛋白质。这类二聚体scFv的实例包括例如连接到亮氨酸拉链结构域上的两个scFv(例如，从Fos或Jun衍生的)，由此这些亮氨酸拉链结构域相结合从而形成二聚体化合物(参见例如Kostelny 1992或Kruif和Logtenberg，1996)。可替代地，通过具有允许两个scFv形成并且允许结合到抗原上的足够长度的肽接头来连接两个scFv(例如，如在US20060263367中说明的)。
本披露还考虑了scFv的修饰形式，例如包括修饰成允许糖基化的接头的scFv(例如，如在US6,323,322中说明的)。
熟练的业内人士将能够容易地生产scFv或其包括根据基于在此披露的本披露适当修饰的VH的修饰形式。关于scFv的综述，参见Plückthun(1994)。另外的scFv的说明可以在例如Bird等人，1988中找到。
微抗体
熟练的业内人士应当知道的是微抗体包括融合到抗体的CH2和/或CH3结构域上的抗体的VH和VL结构域。任选地，微抗体包括VH和VL与CH2和/或CH3结构域之间的铰链区，有时这种构象称为柔性微抗体(Flex Minibody)(Hu等人，1996)。微抗体不包括CH1或CL。优选地，VH和VL结构域融合到抗体的铰链区以及CH3结构域上。每个区域可以是从同一个抗体衍生的。可替代地，VH和VL结构域可以是从一个抗体衍生的并且铰链和CH2/CH3来自另一个抗体，或铰链和CH2/CH3也可以是从不同抗体衍生的。本披露还考虑了包括来自一个抗体的VH和VL以及来自另一个抗体的VH和VL的多特异性微抗体。
示例性的微抗体以及它们的生产方法在例如WO94/09817中进行了说明。
包含其他可变区的蛋白质
US5,731,168说明了其中一对Fv的界面被工程化以便使异源二聚体的百分比最大化的分子，该异源二聚体是从重组细胞培养物中回收的，由此生产双特异性蛋白。优选的界面包括CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自第一蛋白的界面的一个或多个小氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或丙氨酸)替换较大氨基酸侧链在第二蛋白的界面上产生了与一个或多个较大侧链具有完全相同或类似尺寸的补偿性“空腔”。
包含可变区的双特异性蛋白包括交联的或“异共轭的”蛋白。例如，处于异共轭状态的蛋白质之一可以结合到抗生物素蛋白上并且另一个结合到生物素上。例如已经提出这类蛋白将免疫系统细胞靶向到不想要的细胞上(US4,676,980)。可以使用任何常规的交联方法制造包括可变区的异共轭蛋白。适当的交联剂是本领域已知的，并且连同多种交联技术一起披露于US4,676,980中。
还可以使用化学键来制备包括可变区的双特异性蛋白。Brennan(1985)说明了一个步骤，其中完整的抗体被蛋白质裂解地切割从而产生F(ab’)2片段。在二硫醇络合剂、亚砷酸钠的存在下将这些片段还原，以稳定邻位二硫醇并且防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将这些Fab’-TNB衍生物中的一种再转化成Fab’-硫醇并且与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合从而形成双特异性蛋白。
包含另外可变区的蛋白包括例如单链Fab(例如，Hust等人，2007)或Fab3(例如，如在EP19930302894中说明的)。
恒定域融合
本披露涵盖了包括本披露的修饰的VH以及一个恒定区(例如，Fc)或其结构域(例如CH2和/或CH3结构域)的蛋白质。例如，本披露提供了微抗体(如上面讨论的)或结构域抗体-Fc融合物或scFv-Fc融合物或双链抗体-Fc融合物或三链抗体-Fc融合物或四链抗体-Fc融合物或结构域抗体-CH2融合物、scFv-CH2融合物或双链抗体-CH2融合物或三链抗体-CH2融合物或四链抗体-CH2融合物或结构域抗体-CH3融合物或scFv-CH3融合物或双链抗体-CH3融合物或三链抗体-CH3融合物或四链抗体-CH3融合物。这些蛋白质中的任何一种可以在可变区和恒定区或恒定域之间包括一个接头，优选地一个抗体铰链区。优选地，这类Fc融合蛋白具有效应子功能。
如在此使用的，术语“CH2结构域”包括重链抗体分子的部分，该部分例如从根据Kabat EU编号系统的(如在Kabat 1991或1992中披露的)位置231-340附近之间延伸。两个N连接分支的碳水化合物链通常插入在一个完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一个实施方案中，本披露的蛋白质包括从IgG1分子(例如，人类IgG1分子)衍生的CH2结构域。在另一个实施方案中，本披露的蛋白质包括从IgG4分子(例如，人类IgG4分子)衍生的CH2结构域。
如在此使用的，术语“CH3结构域”包括重链抗体分子的部分，该部分从CH2结构域的N端延伸大约110个残基(例如从位置341-446b附近(Kabat EU编号系统))。CH3结构域典型地形成IgG抗体的C-端部分。然而，在一些抗体中，另外的结构域可以从CH3结构域延伸从而形成该分子的C端部分(例如，IgM的μ链和IgE的e链中的CH4结构域)。在一个实例中，本披露的蛋白包质括从IgG1分子(例如，人类IgG1分子)衍生的CH3结构域。在另一个实施方案中，本披露的蛋白质包括从IgG4分子(例如，人类IgG4分子)衍生的CH3结构域。
可以从多种不同来源获得用于生产本披露的蛋白质的恒定区序列。在优选的实例中，该蛋白质的恒定区或其部分是从人类抗体衍生的。然而应当理解的是恒定区或其部分可以是从另一种哺乳动物种类的免疫球蛋白或抗体衍生的，包括例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如，黑猩猩、猕猴)种类。此外，恒定区结构域或其部分可以是从任何抗体类别衍生的。
如在此使用的，术语“效应子功能”是指Fc区或其部分(例如CH2结构域)结合免疫系统的蛋白质和/细胞以及调节不同生物效应的功能性能力。效应子功能可以是抗原依赖性的或抗原非依赖性的。“抗原依赖性效应子功能”是指这样一种效应子功能，该功能通常是在抗体结合到抗原上之后诱导的。典型的抗原依赖性效应子功能包括结合补体蛋白(例如C1q)上的能力。例如，补体的C1组分结合到Fc区上抗原活化经典的补体系统，导致了调理作用和细胞病原体的溶解(称为补体依赖性细胞毒性(CDC的一种过程)。补体的活化还刺激了炎性反应并且还可以涉及自身免疫超敏反应。其他抗原依赖性效应子功能是通过抗体经由它们的Fc区结合到细胞上某些Fc受体(“FcR s”)上来介导的。存在针对不同类别的抗体(包括IgG(γ受体，或IgλR)、IgE(ε受体，或IgεR)、IgA(α受体，或IgαR)以及IgM(μ受体，或IgμR)特异性的多种Fc受体。抗体到细胞表面上的Fc受体上的结合触发了许多重要的并且多样化的生物学反应包括免疫复合物的内吞作用、抗体覆盖的颗粒或微生物的吞食和破坏(也成为抗体依赖性吞噬作用，或ADCP)、免疫复合物的清除、通过杀伤细胞溶解抗体覆盖的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎性介质的释放、免疫系统细胞活化的调节、胎盘转移以及抗体生产的控制。
如在此使用的，术语“抗原非依赖性效应子功能”是指抗原通过抗体诱导的一种效应子功能，无论它是否结合它相应的抗原。典型的抗原非依赖性效应子功能包括抗体的细胞运输、循环半衰期和清除率、以及纯化的促进。结构上独特的Fc受体，“新生的Fc受体”或“FcRn”，也称为挽救受体，在调节半衰期和细胞运输方面起重要作用。从微生物细胞纯化的其他Fc受体(例如葡萄球菌蛋白A或G)能够以高亲和力结合到Fc区上并且能够用来促进纯化包含Fc的蛋白质。
例如可以使用聚合酶链式反应以及被选择用来扩增感兴趣结构域的引物来克隆恒定区结构域。抗体序列的克隆在例如US5,658,570中进行了说明。
本披露的蛋白质可以包含任何数量的不同类型的恒定区/域。
组成蛋白质的恒定区的恒定域或它们的部分可以是从不同抗体分子衍生的。例如，蛋白质可以包括从IgG1分子衍生的CH2结构域或其部分以及从IgG3分子衍生的CH3区或其部分。
在本披露的另一个实例中，本披露的蛋白质包括足以赋予FcRn结合的Fc的至少一个区域。例如，结合到FcRn上的Fc区的部分包括根据Kabat EU编号的从IgG的从大约氨基酸282至438。
在一个实例中，本披露改变的蛋白质包括修饰的恒定区，其中一个或多个恒定区结构域是部分地或完全缺失的(“结构域缺失的恒定区”)。本披露还包括修饰的Fc区或已经改变的部分(例如，提高的或降低的效应子功能)。许多这类修饰的Fc区是本领域已知的并且例如在WO2005/035586、WO2005/063815或WO2005/047327中进行了说明。
去免疫化的蛋白质
本披露还考虑了一种去免疫化的蛋白质。去免疫化的蛋白质将一个或多个表位例如B细胞表位或T细胞表位移开(即突变)，由此降低了受试者可能产生针对该蛋白质的免疫反应的可能性。用于生产去免疫化的蛋白质的方法是本领域已知的并且例如在WO00/34317、WO2004/108158和WO2004/064724中进行了说明。例如，该方法包括执行一个计算机分析来预测蛋白质中的表位并且使预测的表位中一个或多个残基突变，由此降低它的免疫原性。然后对该蛋白质进行分析(例如，计算机方式或体外地或体内地)用于确保它保持它的结合到抗原上的能力。优选的出现在CDR内的表位不被突变，除非该突变不可能降低抗原结合。用于预测表位的方法是本领域已知的并且例如在Saha(2004)中进行了说明。
基于在此的说明用于引入适当的突变以及表达和分析得到蛋白质的方法对于熟练的业内人士应当是清楚的。
文库和筛选的方法
本披露还包括了包含多种根据本披露修饰的VH的蛋白质的一个文库，例如该文库包括具有不同结合特征的多种蛋白质。
本披露的实例包括天然文库、免疫文库或合成文库。天然文库是从适当宿主的B淋巴细胞得到的，该宿主尚未用任何免疫原激发，它也未展示感染或炎症的症状。免疫文库是从由适当地“免疫的”宿主体内(即，已经用免疫原激发的宿主)获得的B细胞和浆细胞的混合物制造的。在一个实例中，使用本领域已知的方法(例如，寡dT引物和逆转录酶)将来自这些细胞的mRNA翻译成cDNA。在一个替代实例中，用适当的引物通过PCR扩增编码来自宿主细胞的抗体的核酸(mRNA或基因组DNA)。用于这类抗体基因扩增的引物是本领域已知的(例如，US6,096,551和WO00/70023)。在一个另外的实例中，来自宿主细胞的mRNA被合成为cDNA并且然后在一个PCR反应中用抗体特异性引物对这些cDNA进行扩增(例如，US6,319,690)。可替代地，可以通过常规cDNA克隆技术(Sambrook和Russell，编辑，《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版(3rdEd)，第1-3卷(vols.1-3)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2001)来克隆所有组成部分，而不使用PCR。在克隆过程中或之后将DNA修饰成在必要位点处包括一个或多个带负电荷的氨基酸。
在另一个实例中，建立了公开的人源抗体序列数据库，其中抗体序列彼此比对。该数据库用来定义抗体序列的亚群，这些序列在CDR环的序列和经典折叠两个方面显示高度的相似性(如通过抗体结构分析而确定的)。对于每个亚群而言，推导出一个一致序列，该序列代表该亚群的多个成员；因此一致序列的全部集合表示人类抗体的全部结构清单。
然后例如通过全基因分析或通过使用合成的遗传亚基来构建这些人工基因。这些遗传亚基相应于处于多肽水平的结构亚元件。在DNA水平上，这些遗传亚基是通过在这些亚元件的每一个的起点和终点处的切割位点来定义的，在该载体系统中这些切割位点是唯一的。作为一致序列集合的成员的所有基因是这样构建的，使得它们包含相应的遗传亚序列的类似模式。例如，所述多肽是或衍生于HuCAL一致基因：VKI、VK2、VK3、VK4、Vλ1、Vλ2、Vλ3、VHlA、VHlB、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、CK、Cλ、CHl或所述HuCAL一致基因的任何组合。然后可以使用DNA分子的这个集合来产生抗体的“合成文库”，优选地Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、Fab片段、或Fab’片段，它们可以用作特异性地结合到抗原上的蛋白质的来源。US6,300,064披露了用于制造合成文库的方法。这类合成文库被修饰成包括根据本披露的带负电荷的氨基酸。在另一个实例中，通过合成从定义的V基因元件制造合成的人类抗体。Winter(EP0368684)提供了一种用于扩增(例如通过PCR)、克隆、以及表达抗体可变区基因的方法。用这些基因开始，他能够通过对重链和/或轻链的CDR3进行随机化处理来产生功能性抗体片段的文库。这个过程在功能上等效于在免疫系统中B细胞发育过程中发生的VJ和VDJ重组的天然过程。例如，可以在体外通过连接到5个随机氨基酸残基的合成的“D片段”和一个J片段上来重排人种系VH基因片段的所有组成部分，以产生具有八个残基的一个合成的第三互补决定区(CDR)。US5,885,793披露了制造例如这些的这类抗体文库的方法。如熟练的业内人士应当清楚的，包括本披露蛋白质的文库是这样生产的，使得扩增的V区包括编码在此所述的位置处的带负电荷的氨基酸的密码子。
根据本披露的蛋白质可以是可溶的分泌蛋白或能够以融合蛋白形式递呈在细胞或颗粒(例如，噬菌体或其他病毒、核糖体或孢子)的表面上。
各种展示文库形式是本领域已知的，并且综述见于例如Levin和Weiss(2006)中。例如，该文库是一种体外展示文库(即，使用体外展示来展示蛋白质，其中表达的结构域连接到从中它被表达使得所述结构域在缺乏宿主细胞下而呈现的核酸上)。因此，通过体外展示技术生产的文库不限于转化或转染效率。体外展示方法的实例包括核糖体展示、共价展示以及mRNA展示。
在一个实例中，该体外展示文库是一种核糖体展示文库。熟练的业内人士应当知道的是，核糖体展示文库直接地将由表达文库编码的mRNA连接到它编码的蛋白质上。用于生产核糖体展示文库的方法包括以可操作地与适当的启动子序列和核糖体结合序列相连接的方式布置编码包括VH的蛋白质的核酸。优选的启动子序列是噬菌体T3和T7启动子。优选地，以可操作地与间隔区序列以及终止密码子被去除的一个修饰的终止序列相连接的方式布置核酸。如本发明上下文中使用的，术语“间隔区序列”应当理解成表示编码融合到一种肽上的该肽的一系列核酸。将间隔区序列结合到基因构建体中，因为在翻译之后由该间隔区序列编码的肽保留在核糖体通道中，同时允许包括VH的蛋白质自由地折叠并且与另一种蛋白质或一种核酸相互作用。一个优选的间隔区序列是例如编码丝状噬菌体M13mp19的基因III的氨基酸211-299的一种核酸。
使用本领域已知的和/或例如在Ausubel等人(1987)以及Sambrook等人(2001)中说明的方法在体外将展示文库转录和翻译。用于体外转录和翻译的可商购系统的实例包括例如来自Promega的体外转录和翻译系统中的TNT。在冰上将表达反应冷却通常使翻译终止。通过添加多种试剂(像例如乙酸镁或氯霉素)对抗与该肽和/或它的编码mRNA解离来稳定核糖体复合物。通过如在此说明的多种方法来筛选这类体外展示文库。
在另一个实例中，本披露的展示文库是核糖体失活展示文库。根据这个实例，将一个核酸可操作地连接到编码一个第一间隔区序列的一个核酸上。优选的是这种间隔区序列是一种富含甘氨酸/甘氨酸的序列，该序列允许含有由其编码的VH的蛋白质自由地折叠并且与目标抗原相互作用。该第一间隔区序列连接到编码失活核糖体的一种毒素的核酸上。优选的是该毒素包括蓖麻毒蛋白A链，该蓖麻毒蛋白A链失活真核核糖体并且使核糖体停滞在翻译复合物上而不释放mRNA或编码的肽。将编码该毒素的核酸连接到编码一个第二间隔区序列的另一个核酸上。该第二间隔区是用于占据核糖体通道的一个锚，并且允许该蛋白质和毒素两者都正确地折叠并且变得有活性。这类间隔区序列的实例是从M13噬菌体的基因III衍生的序列。通常使用一种系统(例如可从Promega得到的兔网织红细胞裂解物系统)体外转录和翻译核糖体失活展示文库。当翻译编码毒素的mRNA以及正确折叠这种蛋白质时，核糖体被失活同时仍然结合到编码的多肽和从中将它翻译的mRNA两者上。
在另一个实例中，该展示文库是一个mRNA展示文库。根据这个实施方案，一种核酸可操作地连接到编码一种间隔区序列的一种核酸上，例如富含甘氨酸/丝氨酸的序列，该序列允许包括由本披露的表达文库编码的VH的蛋白质自由地折叠并且与靶抗原相互作用。将编码间隔区序列的核酸可操作地连接到一个转录终止子上。通常使用本领域已知方法体外地转录mRNA展示文库，像例如可从Promega得到的HeLaScrib核提取体外转录系统(HeLaScribe Nuclear Extract In Vitro Transcription System)。随后使用本领域已知技术将编码的mRNA共价连接到一种DNA寡核苷酸上，该DNA寡核苷酸共价连接到结合到核糖体上的一个分子上，像例如嘌呤霉素，并且在例如Roberts和Szostak(1997)中进行了说明。优选地，将该寡核苷酸共价连接到补骨脂素部分上，由此该寡核苷酸光交联到由本披露的表达文库编码的mRNA上。然后使用本领域已知的方法翻译从表达文库转录的mRNA。当核糖体到达该mRNA与该寡核苷酸的接点时，核糖体停滞并且嘌呤霉素部分进入核糖体的磷酸转移酶位点并且因此将编码的多肽共价连接到它从中表达的mRNA上。
仍然在另一个实例中，该展示文库是一个共价展示文库。根据这个实例，将编码包括VH的蛋白质的核酸可操作地连接到一个第二核酸上，该第二核酸编码与它从其编码的DNA相互作用的一种蛋白质。与它从其相互作用的DNA相互作用的蛋白质的实例包括但不限于大肠杆菌噬菌体P2病毒A蛋白(P2A)以及从噬菌体186、HP1以及PSP3中分离的等效蛋白。使用一种系统(例如可从Promega得到的兔网织红细胞裂解物系统)体外地转录和翻译共价展示基因构建体。当翻译包括VH的蛋白质与P2A蛋白的融合物时，P2A蛋白切口它结合到其上的核酸并且与其形成一个共价键。因此，一个核酸片段共价地连接到它编码的多肽上。
仍然在另一个实例中，该展示文库是一种噬菌体展示文库，其中包括VH的表达蛋白展示在噬菌体表面上(如例如US5,821,047、US6,248,516以及US6,190,908中所述)。所述的基本原理涉及包括编码包含VH的蛋白质的序列的一个第一核酸融合到包括编码噬菌体外壳蛋白的序列的一个第二核酸上，像例如选自下组的噬菌体外壳蛋白：M13蛋白-3、M13蛋白-7、或M13蛋白-8。然后将这些序列插入到适当的载体中，即能够在细菌细胞中进行复制的载体。然后，用重组载体转化适当的宿主细胞(像例如大肠杆菌)。还用编码核酸片段可操作地连接到其上的衣壳蛋白的未修饰形式的辅助噬菌体颗粒来感染所述宿主细胞。在适合在颗粒表面上形成包括大于融合蛋白的一个拷贝的重组噬菌粒颗粒的条件下培养转化的、感染的宿主细胞。在产生病毒颗粒(例如，λ噬菌体、T4噬菌体、M13噬菌体、T7噬菌体以及杆状病毒)方面这种系统显示是有效的。然后对这类噬菌体展示颗粒进行筛选用来鉴定具有足以结合到靶抗原上的构象的展示结构域。
其他病毒展示文库包括逆转录病毒展示文库，其中表达的肽或蛋白结构域展示在逆转录病毒颗粒的表面上(例如，如在US6,297,004中说明的)。
本披露还考虑了细菌展示文库(例如，如在US5,516,637中说明的)；酵母展示文库(例如，如在US6,423,538中说明的)或哺乳动物展示文库(例如，如在Strenglin等人1988中说明的)。
用于筛选展示文库的方法是本领域已知的。在一个实例中，使用亲和纯化来筛选本披露的展示文库。亲和纯化技术是本领域已知的，并且在例如Scopes(1994)中进行了说明。亲和纯化的方法典型地涉及使包括由该文库展示的VH的蛋白质与已知靶抗原和/或已知超级抗原(例如，蛋白A)接触，并且在洗涤之后，对仍然结合到抗原上的这些结构域进行洗脱。抗原优选地结合到另一个分子上从而允许易于纯化，像例如选自下组的一种分子，该组由以下各项组成：蛋白G、琼脂糖凝胶、琼脂糖、生物素、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、以及FLAG表位。因此，通过离心或通过结合到另一种分子上(例如链霉亲和素)或结合特异性抗体(例如抗-FLAG抗体，或抗-GST抗体)而简单地分离靶蛋白或核酸。
在另一个实例中，本披露的展示文库被表达从而允许使用FACS分析来鉴定结合的肽。使用FACS分析筛选文库在US6,455,63中进行了说明。优选地，通过FACS分级来筛选体外展示文库。体外展示蛋白共价连接到适合于FACS分选的颗粒或珠粒上，像例如玻璃、聚合物类，像例如聚苯乙烯、胶乳或交联葡聚糖例如琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、特氟纶等。将结合到颗粒或珠粒上的展示文库添加到抗原或超级抗原上，该抗原或超级抗原标记有可检测标记，像例如荧光分子、或可通过一种第二荧光分子检出的分子。然后这些珠粒被洗涤并且经受FACS分选，这允许具有结合的荧光抗原或超级抗原的珠粒与未结合到荧光靶蛋白或核酸上的珠粒分离。
可替代地，使用基于生物传感器的测定法来筛选文库，像例如Biacore传感器芯片技术(Biacore AB，英国)。Biacore传感器芯片是涂覆有一个薄层的用羧甲基化葡聚糖修饰的金的一种玻璃表面，该靶蛋白或核酸共价附连到其上。然后使本披露的文库暴露于包括该抗原的Biacore传感器芯片。
蛋白质生产
诱变
使用本领域的标准方法来分离编码包括可变区的蛋白质的DNA。例如，引物设计成退火到位于感兴趣区域侧翼的可变区内的保守区上，并且然后使用这些引物来扩增插入的核酸，例如通过PCR。适合的方法和/或引物是本领域已知的和/或例如在Borrebaeck(编辑)，1995和/或Froyen等人，1995中进行了说明。用于这类扩增方法的模板DNA的适当来源是源于例如杂交瘤、转染瘤、和/或表达包括可变区蛋白的细胞(例如，如在此所述)。
在分离之后，将DNA修饰成包括通过本领域已知的多种方法中任何一种编码必要位置处带负电荷的氨基酸的密码子。这些方法包括但不限于通过前面制备的编码蛋白质的DNA进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变、以及盒式诱变来制备。还可以通过限制性片段操作或通过用合成的寡核苷酸进行重叠延伸PCR来构建重组蛋白的变异体。诱变引物编码这些带负电荷的氨基酸，例如包括组成编码带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸(即GAA或GAG)或谷氨酸(即，GAT或GAC))的密码子的残基。可以使用标准诱变技术来产生对这种突变体DNA进行编码的DNA。一般指导可以在Sambrook等人1989；和/或Ausubel等人1993中找到。
定点诱变是一种用于制备取代变异体(即，突变体蛋白)的方法。这种技术是本领域已知的(参见例如Carter等人1985；或Ho等人1989)。简言之，在进行DNA的定点诱变中，通过首先将编码所希望的突变的寡核苷酸(例如，插入一个或多个编码带负电荷的氨基酸的密码子)杂交到这种起始DNA的单链上来改变起始DNA。在杂交之后，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并且使用起始DNA的单链作为模板，使用DNA聚合酶来合成一个完整的第二链。因此，编码所希望的突变的寡核苷酸被结合在得到的双链DNA中。可以在表达该蛋白质的基因内进行定点诱变从而在表达质粒中进行诱变并且可以对得到的质粒测序，以证实所希望的带负电荷的氨基酸置换突变的引入。定点实施方案和方式包括可商购的试剂盒，例如多位点定向诱变试剂盒(Multi Site-DirectedMutagenesis Kit)(Stratagene，拉荷雅，加利福尼亚州)。
PCR诱变还适合于制造起始蛋白的氨基酸序列变异体。参见，Higuchi，1990；Ito等人1991。简言之，当少量的模板DNA用作PCR中的起始材料时，可以使用在序列上与模板DNA中相应区域略有不同的引物来产生相对大量的特异性DNA片段，该特异性DNA片段仅在引物与模板不同的位置处与模板序列不同。
用于制备变异体、盒式诱变的另一种方法是基于Wells等人，1985所述的技术。起始材料是包括有待突变的起始蛋白DNA的质粒(或其他载体)。鉴定有待突变的起始DNA中的一种或多种密码子。在所鉴定的一个或多个突变位点的每一侧上必须存在独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在这类限制位点，可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法来产生它们用来将它们引入到起始DNA中的适当位置。在这些位点处对质粒DNA进行切割从而将它线性化。使用标准步骤来合成编码位于限制位点之间但是包含所希望的一个或多个突变的DNA序列的双链寡核苷酸，其中分开地合成该寡核苷酸的两个链并且然后使用标准技术杂交到一起。这种双链寡核苷酸称为盒。这种盒被设计成具有与该线性化质粒的末端相容的5’和3’末端，这样使得它可以直接地连接到该质粒上。现在该质粒包含突变的DNA序列。可以通过DNA测序来证实包含编码的带负电荷的氨基酸置换的突变体DNA。
还通过基于PCR的诱变使用双链质粒DNA作为模板通过寡核苷酸定向诱变来产生单个突变(Sambrook等人，2001)。
重组体表达
在重组蛋白的情况下，优选地将编码它的核酸置于表达载体中，然后将它们转染到宿主细胞中，优选可以产生二硫桥或键的细胞，例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞，例如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或另外地不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，从而获得在重组宿主细胞中的蛋白质的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等人，(1993)和Plückthun，(1992)。用于实现这些目的的分子克隆技术是本领域已知的并且例如在Ausubel等人(1987)和Sambrook等人(2001)中进行了说明。广泛多样的克隆以及体外扩增方法适合于构建重组核酸。生产重组抗体的方法也是本领域已知的。参见US4,816,567。
在分离之后，优选地将编码本披露的蛋白质的核酸插入到表达构建体或可复制载体中用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于在无细胞系统中或在细胞中进行表达。优选地，将该核酸可操作地连接到一个启动子上。
如在此使用的，术语“启动子”应当在其最广义的背景下理解并且包括基因组基因的转录调节序列，包括在具有或不具有另外的调节元件(例如，上游活化序列、转录因子结合位点、增强子、以及沉默子)下对于精确转录起始所需要的TATA盒或起始子元件，这些调节元件例如响应于发育和/或外部刺激、或以组织特异性方式改变了核酸的表达。在本发明的上下文中，术语“启动子”还用来说明赋予、活化或增强它可操作地连接到其上的核酸的表达的重组核酸、合成核酸或融合核酸、或衍生物。优选的启动子可以包含一个或多个特异性调节元件的另外拷贝，以进一步增强表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
如在此使用的，术语“可操作地连接到”表示将一个启动子相对于一个核酸进行定位这样使得核酸的表达被该启动子控制。
本披露还考虑了无细胞表达系统。例如，将编码本披露的蛋白质的核酸可操作地连接到一个适当的启动子上，例如一个T7启动子，并且使得到的表达构建体暴露于足以转录和翻译的条件。用于体外表达或无细胞表达的典型的表达载体已经进行了说明并且包括但不限于TNT T7和TNTT3系统(Promega)、pEXP1-DEST和pEXP2-DEST载体(Invitrogen)。
用于在细胞中表达的许多载体是可供使用的。载体组分通常包括但不限于下面的一项或多项：信号序列、编码本披露的蛋白质的序列(例如，从在此提供的信息中得到的)、增强子元件、启动子、以及转录终止序列。熟练的业内人士应当知道适合的用于蛋白质表达的序列。例如，示例性的信号序列包括原核分泌信号(例如，pelB、碱性磷脂酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定性肠毒素II)、酵母分泌信号(例如，转化酶前导序列、α因子前导序列、或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如，单纯疱疹gD信号)。
示例性的启动子包括在原核生物中有活性的那些(例如，phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、以及杂合启动子例如tac启动子)。这些启动子用于在原核生物中进行表达，原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠细菌科，例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文菌属、克雷白菌属、变形杆菌属、沙门菌属，例如，鼠伤寒沙门菌，沙雷氏菌属，例如，粘质沙雷菌以及志贺菌属，以及杆菌，例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌例如铜绿假单胞菌以及链霉菌属。优选地，该宿主是大肠杆菌。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，虽然其他菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC 31,537)、以及大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)、DH5α或DH10B是适当的。
在哺乳动物细胞中具有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延长因子1-α启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、α肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(SV40)、劳氏肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子、包括CMV增强子/β肌动蛋白启动子的杂合调节元件或免疫球蛋白启动子或其活性片段。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(被亚克隆用于悬浮培养中生长的293或293细胞；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
适合在酵母细胞像例如选自下组的酵母细胞(该组由以下各项组成：巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母以及稷酒裂殖酵母)中表达的典型启动子包括但不限于：ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子、或TEF1启动子。
适合用于在昆虫细胞中表达的典型启动子包括但不限于OPEI2启动子，从家蚕分离的昆虫肌动蛋白启动子，果蝇Dsh启动子(Marsh等人2000)以及诱导型金属硫蛋白启动子。用于表达重组蛋白的优选的昆虫细胞包括选自下组的昆虫细胞，包括：BT1-TN-5B1-4细胞、以及草地贪夜蛾细胞(例如，sf19细胞、sf21细胞)。用于表达核酸片段的适当昆虫包括但不限于果蝇。还考虑了草地贪夜蛾的用途。
用于将这种分离的核酸分子或包括以上物质的一种基因构建体引入到细胞中用于表达的手段对于本领域的技术人员而言是已知的。用于一种给定的细胞的技术取决于已知的成功的技术。用于将重组DNA引入到细胞中的手段除了其他之外还包括微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染(例如通过使用Lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或Cellfectin(Gibco，MD，USA))、PEG-介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击(例如通过使用DNA-包被的钨或金颗粒(Agracetus Inc.，WI，USA))。
可以在多种培养基中培养用于生产本披露的蛋白质的宿主细胞，这取决于所使用的细胞类型。可商购的培养基例如Ham’s Fl0(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMl-1640(Sigma)、以及Dulbecco氏改良Eagle氏培养基((DMEM)，Sigma)适合用于培养哺乳动物细胞。用于培养在此讨论的其他细胞类型的培养基是本领域已知的。
蛋白质的分离
本披露的蛋白质优选地被分离。对于“分离的”，表示该蛋白质是基本上纯的或从它的天然发生的环境中移出，例如处于异源环境中。对于“基本上纯的”，表示该蛋白质基本上不含有污染剂，例如至少大约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％不含有污染剂。
用于纯化本披露的蛋白质的方法是本领域已知的和/或在此说明的。例如，使该蛋白质与能够结合到其上的一种试剂相接触持续一段时间并且在足以使结合发生的条件下。任选地，在洗涤以便去除未结合蛋白之后，本披露的蛋白质被分离(例如，洗脱)。
当使用重组技术时，可以细胞内地、在壁膜间隙中生产本披露的蛋白质或直接地分泌到培养基中。如果在细胞内生产该蛋白质，作为一个第一步骤，例如通过离心或超滤将微粒碎片(宿主细胞或溶解片段)去除。Carter等人(1992)说明了用于分离被分泌到大肠杆菌壁膜间隙中的抗体的步骤。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA、以及苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下将细胞糊(cell paste)融化持续大约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。当将蛋白质分泌到培养基中时，通常首先使用可商购的蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元将来自这类表达系统的上清液浓缩。可以将蛋白酶抑制剂例如PMSF包括在上述步骤的任何一项中以抑制蛋白水解，并且可以包括多种抗生素以防止偶发污染物的生长。
从这些细胞制备的蛋白质可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、以及亲和层析进行纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。作为亲和配体的蛋白A的适应性取决于蛋白质中存在的任何抗体Fc结构域的种类和同种型(如果确实存在的话)。可以使用蛋白A来纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链(Lindmark等人1983)的抗体。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型以及用于人γ3(Guss等人1986)。另外可以使用本披露的蛋白质中可变区结合到其上或升高到其上的抗原或表位决定簇来进行亲和层析。亲和配体附连到其上的基质最通常地是琼脂糖，但是其他基质是可供使用的。与使用琼脂糖可以实现的相比较，机械稳定的基质例如可控多孔玻璃或聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物允许更快的流速和更短的加工时间。用于蛋白质纯化的其他技术例如在离子交换柱上进行分级分离、乙醇沉淀法、反相高效液相层析法、在硅石上的层析法、在肝素上的层析法、在阴离子或阳离子交换树脂上的SEPHAROSETM层析法(例如，聚天冬氨酸柱)、色谱聚集法、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀也是可用的，这取决于有待回收的蛋白质。
熟练的业内人士还应当知道的是本披露的蛋白质可以修饰成包括一个标签以促进纯化或检测，例如，聚组氨酸标签，例如，六组氨酸标签，或流感病毒血凝素(HA)标签、或猿猴病毒5(V5)标签、或FLAG标签、或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。优选地，该标签是一个六his标签。然后使用本领域已知的方法将得到的蛋白质纯化，例如亲和纯化。例如，通过使包含该蛋白质的样品与固定在固体或半固体载体上特异性地结合六his标签的镍-氮川三乙酸(Ni-NTA)相接触，将包含六his标签的蛋白质纯化，将该样品洗涤以便去除未结合蛋白，并且随后将结合蛋白洗脱。可替代地，或另外地，将结合到标签上的配体或抗体用于亲和纯化方法中。
在任何一个或多个初步纯化步骤之后，可以使包括本披露的蛋白质和污染物的混合物经受低pH疏水性相互作用色谱。
蛋白质合成
使用标准技术(例如使用BOC或FMOC化学)从其确定的氨基酸序列易于合成本披露的蛋白质。合成肽可以使用固相、液相、或肽缩合、或它们任何组合的已知技术来制备，并且可以包括天然的和/或非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是具有Merrifield，1963的最初固相步骤的脱保护、中和、结合以及洗涤实验方案或由Carpino和Han，1972说明的碱不稳定的Nα氨基保护的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸的标准Boc(Nα-氨基保护的Nα-叔-丁氧羰基)氨基酸树脂。Fmoc和BocNα-氨基保护的氨基酸两者可以从不同商业来源获得，像例如Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、Bachem、或Peninsula Labs。
评估蛋白质聚集抗性的方法
可以使用本领域已知的方法来分析本披露的蛋白质或组合物的聚集抗性。可以使用本领域的技术人员可接受的聚集抗性参数。示例性的参数更详细地说明如下。在示例性的实施方案中，评估了热再折叠能力(refoldability)。在一些实例中，评估了本披露的蛋白质的表达水平(例如，如通过％产率测量的)。在其他实例中，评估了本披露的蛋白质的聚集水平。在某些实例中，将一个披露的蛋白质或组合物的聚集抗性与适当对照进行比较。
可以使用本领域已知的许多非限制性生物物理或生物化学技术来分析本披露的蛋白质的聚集抗性。这类技术的一个实例是分析光谱学，例如圆二色性(CD)光谱学。CD光谱学测量蛋白质的光学活性作为增加的温度的一个函数。圆二色(CD)光谱学测量了由于结构不对称性产生的左手偏振光对比右手偏振光的吸收差异。无序或去折叠结构导致CD光谱与有序或折叠结构非常不同。CD光谱反映蛋白质对于增加温度的变性作用的灵敏度并且因此指示蛋白质的聚集抗性(参见van Mierlo和Steemsma，2000)。
用于测量聚集抗性的另一个示例性分析光谱学方法是荧光发射光谱学(参见van Mierlo和Steemsma，同上)。用于测量聚集抗性的又另一个示例性分析光谱学方法是核磁共振(NMR)光谱学(参见例如vanMierlo和Steemsma，同上)。
在其他实施方案中，以生物化学方式测量了本披露的组合物或蛋白质的聚集抗性。用于评定聚集抗性的示例性的生物化学方法是热激发测定(thermal challenge assay)。在“热激发测定”中，使本披露的蛋白质经受升高温度的一个范围持续一组时间段。例如，使测试蛋白经受增加温度的一个范围。然后通过有关生物化学测定法来测定蛋白质的活性。例如，可以通过功能或定量ELISA来确定结合蛋白的结合活性。用于确定结合亲和力的另一种方法使用表面等离子体共振。表面等离子体共振是允许例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden andPiscataway，NJ)通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度改变对实时双特异性相互作用进行分析的一种光学现象。
在其他实例中，通过测量其聚集倾向来确定本披露的组合物或蛋白质的聚集抗性。可以通过许多非限制性生物化学或生物物理技术对聚集进行测量。例如，可以使用层析法，例如尺寸排阻层析(SEC)来评估本披露的组合物或蛋白质的聚集。SEC基于尺寸大小分离分子。柱子填充有聚合物凝胶的半固体珠粒，该凝胶可以允许离子和小分子进入它们内部但是较大的分子不能进入。当将蛋白质或组合物施加到柱子顶部时，与大的蛋白聚集体可获得的相比较，紧密折叠的蛋白(即非聚集蛋白)通过更大体积的溶剂进行分配。因此，大的聚集体更快地移动通过该柱子，并且以此方式，该混合物可以被分离或分级分离成它的组分。当每个馏分从凝胶中洗脱时，可以分开地对它进行定量(例如，通过光散射)。因此，可以通过将馏分浓度与施加到凝胶上蛋白质的总浓度进行比较来确定本披露的蛋白质或组合物的聚集百分比。聚集抗性组分作为基本上一个单个馏分从柱子中洗脱并且在洗脱谱图或层析图中显示为基本上一个单峰。
在其他实例中，在表达该蛋白质之后(例如重组表达)通过测量回收的蛋白质的量(在此是“％产率”)对本披露的组合物的聚集抗性进行评估。例如，可以通过针对每ml宿主培养基确定回收蛋白质的毫克数(例如，mg/ml蛋白)来测量产率％。在一个优选的实例中，在哺乳动物宿主细胞中(例如CHO细胞)表达之后评估产率％。
仍然在另一个实例中，在储存一定限定的时间段之后通过在一个温度范围下(例如，从约25℃至约80℃)监测蛋白质损失来评估本披露的组合物的聚集抗性。可以使用本领域已知的任何蛋白质定量方法来确定回收蛋白质的量或浓度，并且与蛋白质的初始浓度进行比较。示例性的蛋白质定量方法包括SDS-PAGE分析或Bradford测定。
仍然在其他实例中，可以通过对标记化合物结合到结合分子的变性或去折叠的部分进行定量来评估本披露的蛋白质的聚集抗性。这类分子优选地是疏水性的，因为它们优选地与通常埋在天然蛋白质内部的氨基酸(但是在变性或去折叠的结合分子中它们是暴露的)的较大疏水补丁相结合或与其相互作用。一种示例性的标记化合物是疏水性荧光染料，l-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)。
其他实例涉及检测蛋白质的结合，该蛋白质仅结合到正确折叠的可变域上(例如，蛋白A结合到正确折叠的IgG3VH上)。
偶联物
本披露还提供了偶联到另一种化合物上的本披露的蛋白质，例如，包括偶联到一个不同部分上的本披露的蛋白质的偶联物(免疫偶联物)，例如直接地或间接地结合到该蛋白质上的治疗剂。其他部分的实例包括但不限于酶、荧光团(fluorophophore)、细胞毒素、放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗新生血管形成和/或其他血管生成剂、毒素、抗增生剂、促凋亡剂、化学治疗剂、以及治疗性核酸。
细胞毒素包括对细胞有害(例如杀死)的任何试剂。为了说明这些类别的本领域已知的药物以及它们的作用机理，参见Goodman等人(1990)。与制备抗体免疫毒素相关的另外技术提供于例如US5,194,594中。示例性的毒素包括白喉A链、白喉毒素的未结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII、以及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素以及单端孢霉烯类。参见例如WO93/21232。
用于形成本披露免疫偶联物的适当治疗剂包括：紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、以及嘌罗霉素、抗代谢药类(例如，甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、门冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂类(例如，氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其他铂衍生物类，例如卡铂)、抗生素类(例如，更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、柔红霉素(以前的道诺霉素)、多柔比星、伊达比星、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(AMC))。
多种放射性核素可用于生产放射性偶联的抗体。实例包括但不限于212Bi、131I、90Y、以及186Re。
在另一个实施方案中，该蛋白质可以偶联到“受体”(例如链霉亲和素)上以用于预靶向，其中将蛋白-受体偶联物施用于病人，紧接着使用清除剂从循环中去除未结合的偶联物并且然后施用偶联到治疗剂(例如，放射性核素)上的一种“配体”(例如抗生物素蛋白)。
本披露的蛋白质可以进一步修饰成包含本领域已知的并且易于获得的另外的非蛋白质部分。优选地，适合于蛋白质衍生的部分是水溶性的聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖或聚乙烯醇。
用于将化合物偶联到本领域已知的蛋白质残基上的多种方法是本领域已知的并且对于熟练的业内人士应当是清楚的。
用途
本披露的蛋白质用于多种应用中包括研究、诊断/预测、工业和治疗应用。取决于该蛋白结合到其上的抗原，它可以用于将化合物递送到细胞，例如用来杀死该细胞或阻止生长和/或用于成像和/或用于体外测定。在一个实例中，该蛋白质用于成像以及将细胞毒剂递送到细胞中两者，即它偶联到一个可检测标记上，并且细胞毒剂或组合物包括其中一些偶联到细胞毒剂上而其中一些偶联到可检测标记上的蛋白质的混合物。
在此所述的蛋白质还可以作为拮抗剂起作用用于抑制(它可以是降低或阻止)(a)(例如，配体、抑制剂)结合到受体上，(b)受体信号传导功能，和/或(c)刺激功能。作为受体功能的拮抗剂起作用的蛋白质可以直接或间接阻断配体结合(例如，通过引起构象改变)。
本披露的蛋白质还可以是受体的激动剂，例如(a)增强或诱导(例如配体)结合到受体上，(b)增强或诱导受体信号传导功能，和/或(c)提供刺激功能。
抗原
本披露考虑了包括能够特异性地结合到除了在在此所述的任何实施方案、实例或权利要求中明确除外的那些之外的任何一种或多种抗原上的根据本披露修饰的至少一个VH的蛋白质，即与要求特异性抗原相对的本披露的一个实例是属类的。
在一个实例中，本披露的蛋白质未结合到来自微生物和/或来自鸟类的蛋白质上。
在一个实例中，该蛋白质未结合到溶菌酶(例如，鸡蛋溶菌酶)和/或β-半乳糖苷酶和/或淀粉酶(例如，α淀粉酶)和/或脱水酶(例如，碳酸酐酶)和/或B5R(例如，来自牛痘)上。在一个实例中，该蛋白质未结合到人白蛋白上。在一个实例中，该蛋白未结合到人VEGF上。
优选的蛋白质特异性地结合到人蛋白上并且是从针对人蛋白产生的抗体衍生的。
本披露的实例考虑了特异性地结合到与疾病或失调(即病症)相关联的抗原上的蛋白质，例如与癌或癌性/转化的细胞相关联或表达癌或癌性/转化的细胞和/或与自身免疫疾病相关联和/或与炎性疾病或病症相关联和/或与神经退行性疾病相关联和/或与免疫缺陷失调相关联。
针对其可以产生本披露的蛋白质的示例性抗原包括BMPRlB(骨形态生成蛋白受体类型IB；WO2004063362)、El6(LATl，SLC7A5，WO2004048938)、STEAPl(前列腺的六跨膜上皮细胞抗原，WO2004065577)、CA125(MUC16，WO2004045553)、MPF(MSLN，SMR，巨核球增强因子，间皮素，WO2003101283)、Napi3b(WO2004022778)、Sema 5b(WO2004000997)、PSCA(US2003129192)、ETBR(WO2004045516)、MSG783(WO2003104275)、STEAP2(WO2003087306)、TrpM4(US2003143557)、CRIPTO(US2003224411)、CD21(WO2004045520)、CD79b(WO2004016225)、SPAPlB(WO2004016225)、HER2(WO2004048938)、NCA(WO2004063709)、MDP(WO2003016475)、IL-20Rα(EP1394274)、短蛋白聚糖(US2003186372)、EphB2R(WO2003042661)、ASLG659(US20040101899)、PSCA(WO2004022709)、GEDA(WO2003054152)、BAFF-R(WO2004058309)、CD22(WO2003072036)、CD79a(WO2003088808)、CXCR5(WO2004040000)、HLA-DOB(WO9958658)、P2X5(WO2004047749)、CD72(WO2004042346)、LY64(US2002193567)、FcRHl(WO2003077836)、IRTA2(WO2003077836)、TENB2(WO2004074320)、CD20(WO94/11026)、VEGF-A(Presta等人，1997)、p53、EGFR、孕酮受体、组织蛋白酶D、Bcl-2、E钙粘着蛋白、CEA、Lewis X、Ki67、PCNA、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11c、CD11d、c-Myc、tau、PrPSC、TNFα、音猬因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、EPHA2、催乳素受体、催乳素、IL-2、TNF-受体、IL-21、IL-21受体、CXCR7、FGFR2、FGF2或Aβ。
在另一个实例中，本披露的蛋白质结合到可溶蛋白上，优选体内分泌的可溶蛋白。示例性的可溶蛋白包括细胞因子类。术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质或多肽的通称，它们在另一个细胞上作为细胞间介质起作用。细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子以及传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原(prorelaxin)、糖蛋白激素类例如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)、肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物质、促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子类例如NGF-B、血小板生长因子、转化生长因子类(TGF)例如TGF-α和TGF-β，胰岛素样生长因子-I或一II，促红细胞生成素(EPO)，骨诱导性因子、干扰素类例如干扰素-α、-β、或-γ；集落刺激因子类(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)，白细胞介素类(Ils)例如IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21以及LIF。优选的细胞因子是选自下组，该组由以下各项组成：白细胞介素2、13或21、TNFα、TGFβ、BAFF以及GM-CSF。
在另一个实例中，可溶蛋白是趋化因子。趋化因子通常作为化学引诱物起作用，以将免疫效应细胞募集到趋化因子表达位点。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MlPl-α或MIPl-β。熟练的业内人士应当理解的是某些细胞因子还已知具有化学引诱物作用并且还可能归类到术语趋化因子下。一种优选的趋化因子是RANTES。
在另一个实例中，可溶蛋白是肽类激素。示例性的肽类激素包括胰岛素、NPY、PYY、高血糖素和催乳素。
在一个另外的实例中，可溶蛋白是蛋白酶。示例性的蛋白酶包括因子X、因子VII、因子IX或激肽释放酶。
在另一个实例中，本披露的蛋白质结合到受体或膜相关蛋白上。示例性的抗原包括G-蛋白偶联受体(例如，CXCR7、CXCR5、CXCR3、C5aR或β-2-肾上腺素能受体)或离子通道(例如，钠通道或钾通道或钙通道，优选地，烟碱乙酰胆碱受体)或单跨膜蛋白(例如，T-细胞受体或催乳素受体或细胞因子受体(例如，IL-21-受体)或1类MHC或2类MHC或CD4或CD8)。
在一个另外的实例中，本披露的蛋白质结合到下面的一项或多项上：干扰素α受体1(IFNARI)、血管生成素-2、IL-4Rα、IL-33、CXCL13、晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体、ICOS、IgE、干扰素α、IL-6、IL-6受体、EphB4、CD19、GM-CSF受体、CD22、IL-22、EphA2、IL-13、高迁移率族蛋白1(HMGl)、间变型淋巴瘤激酶(ALK)、整联蛋白(例如，整联蛋白αVβ3)、Eph受体、IL-9、EphA4、PC-细胞衍生的生长因子(PCDGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR例如，PDGFRα或PDGFRβ)或IL-5。
本披露的蛋白质可以从中衍生的示例性抗体对于熟练的业内人士应当是清楚的并且包括上文列出的那些。
示例性的双特异性蛋白可以结合到感兴趣抗原的两个不同表位上。其他这类蛋白可以使一个抗原结合位点与用于另一种蛋白质的一个结合位点相结合。可替代地，感兴趣区域的抗抗原可以与结合到白细胞上的触发分子上的一个区域相结合，触发分子例如T细胞受体分子(例如，CD3)或IgG(FcγR)的Fc受体，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CDl6)，从而将细胞防御机制集中和定位到表达感兴趣的抗原的细胞上。还可以使用双特异性蛋白来将细胞毒剂定位到表达感兴趣抗原的细胞上。这些蛋白质具有结合感兴趣抗原的一个区域以及结合该细胞毒剂的一个区域(例如，肥皂草素、抗-干扰素-α.、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。WO 96/16673说明了一种双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRIII抗体，并且美国专利号5,837,234披露了一种双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRI抗体。一种双特异性抗ErbB2/Fcα抗体示于WO98/02463中。US5,821,337传授了一种双特异性抗-ErbB2/抗-CD3抗体。
药物组合物和治疗方法
本披露的蛋白质(同义词活性成分)用于肠胃外、局部、口服或局部给药、气溶胶给药、或经皮给药用于预防性或用于治疗性治疗。能够以多种单位剂型施用这些药物组合物，这取决于给药的方法。例如，适合于口服给药的单位剂型包括粉末、片剂、丸剂、胶囊或锭剂或通过肠胃外给药。应当理解的是，本披露的药物组合物当口服给药时，应当保护避免消化。这典型地通过使这些蛋白质与一种组合物复合从而使它抗酸水解或酶水解，或通过将该化合物包装到适当的抗性载体例如脂质体中来实现。保护蛋白质避免消化的手段是本领域已知的。
典型地，可以将治疗有效量的蛋白质配制成组合物以便施用于受试者体内。短语“治疗有效量”是指足以在受试者体内促进、诱导、和/或增强治疗或其他疗效的一个量。如应当清楚的是，在这些配制品中本披露的蛋白质的浓度可以广泛地改变，并且可以根据选择给药的具体模式以及病人的需要主要基于流体体积、粘度、体重等进行选择。取决于疾病的类型和严重性，治疗有效量可以是大约1μg/kg至100mg/kg(例如，0.1-10mg/kg)蛋白质，例如无论是通过一次或多次分开给药还是通过连续输注。典型的每日剂量范围可以从大约1μg/kg至100mg/kg或更多。为了反复给药持续数天或更长时间，取决于条件，治疗是持续性的直至发生所希望的疾病症状的抑制。示例性的给药分案包括施用大约4mg/kg的初始负荷剂量，紧接着大约2mg/kg蛋白质的每周维持剂量。其他给药方案可以是有用的。例如，以大约375mg/m2剂量来施用抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。以5mg/kg-10mg/kg的剂量施用抗VEGF抗体，例如贝伐单抗。以4mg/kg-8mg/kg的负荷剂量以及2mg/kg-6mg/kg的每周一次/每两周一次维持剂量施用抗-Her2/neu抗体，例如曲妥珠单抗。以大约400mg/周的剂量施用抗TNFα抗体例如阿达木单抗用来治疗类风湿性关节炎，或以160mg的负荷剂量持续第一周以及40mg/周的维持剂量，或以80mg的负荷剂量以及40mg/周的维持剂量用于治疗银屑病。通过常规技术和测定法易于监测治疗过程。
本披露的蛋白质的适当剂量可以依赖于特异性蛋白、有待诊断/治疗/预防病症和/或有待治疗的受试者而改变。确定一个适合的剂量是在熟练医生的能力之内的，例如通过用次优剂量开始并且逐渐增加地改变该剂量来确定最佳或有用剂量。可替代地，为了确定用于治疗/预防的适当剂量，使用来自细胞培养测定或动物研究的数据，其中适当剂量是包括具有很小或无毒性的活性化合物的ED50的循环浓度的范围之内。该剂量可以在这个范围内改变，这取决于应用的剂型以及使用的给药途径。最初可以从细胞培养测定法来估计治疗性/预防性有效剂量。可以在动物模型中配制剂量用来实现包括如在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用这种信息来更精确地确定人类中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。
可替代地，以浓缩剂量配制本披露的蛋白质，在施用于受试者之前将该浓缩剂量稀释成一种治疗有效剂量。
本披露的组合物特别地用于肠胃外给药，例如配制成通过静脉内、肌内、皮下、经皮、或其他这类途径进行注射，包括蠕动给药以及直接滴注到肿瘤或疾病位置中(腔内给药)。用于给药的组合物通常将包括溶于一种药学上可接受的载体(优选一种水性载体)中的本披露的蛋白质的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。其他示例性的载体包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、以及5％人血清白蛋白。还可以使用非水性载体例如混合的油类和油酸乙酯。脂质体也可以用作载体。载体可以含有增强等渗性和化学稳定性的少量添加剂，例如缓冲剂以及防腐剂。这些组合物可以根据大致的生理条件的需要包含药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
用于制备药物组合物的技术通常是本领域已知的，如通过Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th Ed.Mack PublishingCompany，1980举例说明的。
WO2002/080967说明了用于施用包括用于治疗例如哮喘的蛋白质的喷雾组合物的组合物和方法，它们也适合施用本披露的蛋白质。
本披露的蛋白质可以与一种第二化合物结合在已知药物组合物、配制品、或给药方案中作为联合疗法。药用组合配制品或给药方案的第二化合物优选地具有与该组合的蛋白质互补的活性，这样使得它们没有不利地彼此影响。
该第二化合物可以是化学治疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或心脏保护剂。这类分子以组合形式以对于预期的目的有效的量而适当地存在。包含本披露蛋白质的药物组合物还可以具有治疗有效量的化学治疗剂，例如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、或DNA结合剂。
还可以使用药物“缓释”胶囊或组合物。缓释配制品通常设计成在延长的时期内给出恒定药物水平并且可以用来递送本披露的化合物。
本披露还提供了一种治疗或预防受试者体内的病症的方法，该方法包括将治疗有效量的本披露的一种蛋白质施用于对其有需要的受试者体内。
如在此使用的，在防止病症的背景中术语“防止”(“preventing”)、“防止”(“prevent”)或“防止”(“prevention”)包括施用足以停止或抑制特定疾病或病症的至少一种症状发展的一定量的在此所述的蛋白质。
如在此使用的，术语“治疗”(“treating”)、“治疗”(“treat”)或“治疗”(“treatment”)包括施用足以降低或消除特定疾病或病症的至少一种症状的治疗有效量的在此所述的一种或多种抑制剂和/或试剂。
如在此使用的，术语“受试者”应当理解成表示任何动物，包括人类，优选哺乳动物。示例性的受试者包括但不限于人类、灵长类、家畜(例如，绵羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、俘获的野生动物(例如，狐狸、鹿)。优选地，该哺乳动物是人或灵长类。更优选地该哺乳动物是人。
如在此使用的，“病症”是对正常功能的破坏或干扰，并且将不限于任何特定病症，并且可以包括疾病或失调。在一个实例中，该病症是癌症或自身免疫或炎性失调。
示例性的癌症包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、以及白血病或淋巴样恶性肿瘤。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomachcancer)的胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈部癌。优选地，癌症是乳腺癌或肺癌或卵巢癌或前列腺癌。
炎性或自身免疫病症是由免疫球蛋白或T细胞受体对抗原的反应而引起的病症。这些病症包括自身免疫疾病和超敏反应(例如，类型I：过敏反应、荨麻疹、食物过敏、哮喘；类型II：自身免疫溶血性贫血、输血反应；类型III：血清病、坏死性血管炎、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、狼疮；类型IV：接触性皮炎、移植排斥)。自身免疫疾病包括类风湿性失调(像例如类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、狼疮例如SLE和狼疮肾炎、多发性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、和银屑病关节炎)、骨性关节炎、自身免疫胃肠和肝失调(像例如炎性肠疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、和乳糜泻)、血管炎(像例如，ANCA-相关性血管炎，包括丘-施二氏血管炎、韦格纳肉芽肿病、和多动脉炎)、自身免疫性神经失调(像例如，多发性硬化，斜视性眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、和自身免疫性多神经病)、肾失调(像例如，肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、和伯格病)、自身免疫性皮肤学失调(像例如，银屑病、荨麻疹(urticaria)、荨麻疹(hives)、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮、和皮肤红斑狼疮)、血液学失调(像例如，血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、以及自身免疫性溶血性贫血)、动脉硬化、葡萄膜炎、自身免疫听力疾病(像例如，内耳疾病和听力损失)、贝切特病、雷诺综合征、器官移植、以及自身免疫性内分泌失调(像例如，糖尿病相关自身免疫疾病，例如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、阿狄森病、以及自身免疫性甲状腺病(例如，格雷夫斯病和甲状腺炎))。更优选的这类疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA-相关性血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎、以及肾小球肾炎。
在另一个实例中，炎性病症是涉及嗜中性细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞的一种病症，其中发生细胞因子释放、组胺释放、氧化爆发、吞噬作用、其他颗粒酶和趋化性的释放。超敏反应(上述)也可以认为是炎性疾病(急性或慢性)因为它们通常涉及补体激活以及各种白细胞的募集/浸润，例如嗜中性细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞等。
能够以与剂量配方相容的方式以及以具有治疗/预防有效性的量施用本披露的组合物。易于以多种方式施用配制品，例如通过摄取或注射或吸入。
其他治疗方案可以与施用本披露的蛋白质相结合。联合治疗可以作为同时的或序贯的方案来施用。当序贯地施用时，能够以两次或更多次给药的方式施用该组合。该联合给药包括同时服用(施用分开的配制品或一个单个的药物配制品)和以两者中的任一顺序的顺序给药，其中当两种(或所有)活性剂都同时产生它们的生物学活性时，优选地存在一个时间段。
在治疗用途之前，优选地在体外和/或体内对本披露的蛋白质进行测试，例如如下说明的。
体外测试
在一个实例中，本披露的蛋白质结合到一种抗原上，即使结合到一个化合物上。在蛋白质是从预先存在的蛋白质(例如抗体)衍生的情况下，本披露的蛋白质可以至少与它从中衍生的蛋白质同样好地结合到该抗原上。可替代地，本披露的蛋白质以它从中衍生蛋白质的至少大约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％的亲和力或亲和度结合到抗原或缺乏负电荷残基的蛋白质的一种形式上。
用于确定蛋白质的结合亲和力的示例性方法包括简单的免疫测定，该免疫测定显示了蛋白阻断抗体结合到靶抗原上的能力，例如竞争性结合测定。在一个测定法中确定竞争性结合，其中测试的蛋白质抑制了参考蛋白到共同抗原上的特异性结合。多种类型的竞争结合测定法是已知的，例如固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心式竞争测定(参见Stahli等人，1983)、固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人，1986)、固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心式测定(参见Harlow和Lane，1988)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人，1990)、或直接标记的RIA(Moldenhauer等人，1990)。典型地，这样的测定涉及使用结合到固体表面或具有未标记的测试蛋白和标记参考蛋白之一的细胞上的纯化抗原。在测试蛋白的存在下通过确定结合到固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。
本披露还包括了用于测试本披露的蛋白质的活性的方法。多种测定法可用于体外评定本披露的蛋白质的活性。例如，将本披露的蛋白质施用到细胞或其群体中，用于确定它是否能够结合到所述细胞上和/或被所述细胞内化。这样的测定法是通过用可检测标记来标记本披露的蛋白质来促进的(即，产生偶联物)，然而，这不是重要的，因为本披露的蛋白质也能够用标记的蛋白质检测。这样的测定法用于评定本披露的蛋白质，以将一种化合物(即有效载荷)递送到细胞中的能力和/或它在成像中的利用。优选地，该细胞表达本披露的蛋白质结合到其上的一种抗原并且更优选地是所希望被检测或处理的细胞类型的一种细胞系或原代细胞培养物。
通常，本披露的蛋白质的细胞毒性或细胞抑制活性，例如偶联到细胞毒性分子上，是通过如下测量的：将表达抗原的细胞暴露于本披露的蛋白质结合到其上的物质；将这些细胞培养一段适当的时间(例如从大约6小时至大约5天)使该蛋白质产生生物效应；然后测量细胞生存力、细胞毒性和/或细胞死亡。用于测量活力(增殖)、细胞毒性、以及细胞死亡的基于细胞的体外测定是本领域已知的。
例如，发光细胞生存力测定法(Luminescent CellViability Assay)是一种基于鞘翅目萤光素酶(美国专利号5583024、5674713和5700670)的重组表达的可商购的(Promega公司，麦迪逊市，威斯康辛州)均相测定法。这种细胞增殖测定法是基于细胞中存在的ATP定量(代谢活性细胞的一个指示物)而确定培养物中活细胞的数量。可替代地，使用无荧光刃天青测定细胞生存力，在本披露的蛋白质的存在下将它添加到培养的细胞中。活细胞将刃天青还原成红色荧光的试卤灵，可以使用例如显微术或荧光酶标仪容易地检出。用于分析细胞活力的试剂盒可以从例如Molecular Probes，Eugene，OR，USA获得。
细胞活力的其他测定法包括当DNA合成时确定3H-胸腺嘧啶核苷或14C-胸腺嘧啶核苷结合到DNA中(即，用于确定与细胞分裂相关的DNA合成)。在这样的测定中，在标记的胸腺嘧啶核苷存在下将细胞孵育足以使细胞分裂发生的一段时间。在洗涤以便去除任何未结合的胸腺嘧啶核苷之后，例如使用闪烁计数器检测标记(例如，放射性标记)。用于确定细胞增殖的替代测定法包括例如通过BrdU结合来测量DNA合成(通过ELISA或免疫组织化学，可从Amersham Pharmacia Biotech获得试剂盒)。
用于检测细胞死亡的示例性测定法包括APOPTEST(可从Immunotech获得)染色凋亡早期细胞，并且不需要将细胞样品固定(Martin等人，1994)。这种方法利用膜联蛋白V抗体来检测作为经历凋亡的细胞特征的细胞膜重配置。然后能够以荧光激活细胞分选(FACS)、ELISA或通过使用固定的膜联蛋白V抗体进行粘附和淘选(panning)，将以这种方式染色的凋亡细胞进行分选。可替代地，使用末端脱氧核苷酸基转移酶介导的生物素酰化UTP切口末端标记(TUNEL)测定来确定细胞死亡的水平。该TUNEL测定使用末端脱氧核苷酰基转移酶，用生物素酰化的核苷酸标记在凋亡期间产生的3’-OH DNA末端。然后使用结合到检测标记上的链霉亲和素来检测生物素酰化的核苷酸。用于TUNEL染色的试剂盒可以从例如纽约州帕切斯市Intergen公司获得。
还可以通过将本披露的蛋白质暴露于血清和/或细胞并且随后使用例如免疫亲和纯化来分离本披露的蛋白质来评定或预测本披露的蛋白质的体内稳定性。回收的本披露的蛋白质的减少量表明本披露的蛋白质在血清中或当暴露于细胞时被降解。
在另一个实例中，使用标准的放射免疫测定或荧光免疫测定来评定本披露的蛋白质阻断配体结合到受体上的能力。
还可以通过在该蛋白质存在或不存在下确定受体的信号传导来评定本披露的蛋白质激动或拮抗受体的能力。
体内测试
还能够针对在体内其稳定性和/或疗效对本披露的蛋白质进行测试。例如，将本披露的蛋白质施用于受试者体内并且例如使用ELISA或通过检测结合到该蛋白质上的可检测标记，以检测随着时间的蛋白质的血清水平。这允许确定本披露的蛋白质的体内稳定性。
还能够将本披露的蛋白质施用到人类疾病的动物模型中并且确定它对其症状的影响。熟练的业内人士将能够基于本披露的蛋白质结合到其上的抗原而容易地确定适合的模型。例如人类癌症的示例性模型是本领域已知的。例如，乳癌的小鼠模型包括过表达成纤维细胞生长因子3(Muller等人，1990)、TGF-α(Matsui等人，1990)、erbB2(Guy等人，1992)的小鼠；或将人类乳癌细胞移植到SCID小鼠中。卵巢癌的模型包括将卵巢癌细胞移植到小鼠(例如，如Roby等人，2000中说明的)、慢性地分泌促黄体激素的转基因小鼠(Risma等人，1995)、或Wx/Wv小鼠中。前列腺癌的小鼠模型也是本领域已知的，并且包括例如从增强表达SV40早期基因中得到的模型(例如，TRAMP模型，它利用最小限度的大鼠probasin启动子来表达SV40早期基因，或使用长probasin启动子来表达大T抗原的转基因小鼠，总称为‘LADY’模型，或表达c-myc或Bcl-2或Fgf8b或表达显性负相TGFβ的小鼠(参见，Matusik等人，2001，作为前列腺癌转基因模型的一个综述)。
本披露的蛋白质还可以施用于除了癌症之外的疾病的动物模型，例如NOD小鼠用于测试它们的抑制、预防、治疗、或延迟糖尿病的能力(例如，如Tang等人，2004中说明的)和/或用于GVHD小鼠模型(例如，如Trenado，2002中说明的)和/或用于银屑病小鼠模型(例如，Wang等人，2008)和/或用于类风湿性关节炎模型，例如SKG品系小鼠(Sakaguchi等人)，大鼠II型胶原关节炎模型，小鼠II型胶原关节炎模型或在几个物种中抗原诱导的关节炎模型(Bendele，2001))和/或多发性硬化模型(例如，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE；Bradl and Linington，1996))和/或炎性气道病(例如，OVA激发或蟑螂抗原激发(Chen等人2007)和/或炎性肠病模型(例如，葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎或结肠炎的Muc2缺陷型小鼠模型(Van der Sluis等人2006)。
诊断/预测方法
在一个实例中，本披露提供了用于诊断或预测病症的方法。
如在此使用的，术语“诊断”(“diagnosis”)，以及它的变体，例如但不限于“诊断”(“diagnose”)、“诊断”(“diagnosed”)或“诊断”(“diagnosing”)包括临床状态的任何初步诊断或复发性疾病的诊断。
如在此使用的“预测”(“prognosis”)、“预测”(“prognosing”)以及它们的变体是指疾病的可能结果或过程，包括恢复或复发的可能性。
在一个实例中，该方法包括确定样品中抗原的量。因此，本披露的蛋白质用于多种应用中，例如细胞分选(例如，流式细胞术，荧光激活细胞分选)，用于诊断或研究目的。例如，使样品与本披露的蛋白质接触一段时间并且在足以使它结合到抗原上的条件下并且形成一种复合物，然后对该复合物进行检测或确定复合物的水平。为了这些目的，这些蛋白质可以是标记的或未标记的。这些蛋白质可以被直接标记，例如使用在此所述的标记。当未标记时，可以使用适当手段例如在凝集测定中来检测这些蛋白质。未标记的抗体或片段还可以与另一种(即，一种或多种)适合的试剂相结合使用，该试剂可以用来检测蛋白质，例如与该蛋白质或其他适合的试剂(例如，标记的蛋白A)具有反应性的标记抗体(例如，第二抗体)。
优选地，本披露的蛋白质用于免疫测定中。优选地，使用选自下组的测定法，该组由以下各项组成：免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光联接免疫吸附测定(FLISA)蛋白质印迹法、RIA、生物传感器测定、蛋白芯片测定以及免疫染色测定(例如，免疫荧光)。
标准的固相ELISA或FLISA形式特别地用于从多种样品中确定蛋白质的浓度。
在一种形式中，这样的测定涉及将生物学样品固定到固体基质上，像例如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或测验片、薄膜、或玻璃载体(例如，载玻片)。使特异性地结合到感兴趣抗原上的本披露的蛋白质与固定的样品直接接触，并且形成与所述样品中存在的它的靶抗原中任何一种的直接结合。本披露的蛋白质通常标记有可检出报告分子，像例如在FLISA的情况下的荧光标记(例如，FITC或德克萨斯红)或荧光半导体纳米晶体(如US 6,306,610中说明的)，或者在ELISA的情况下的酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶))，或可替代地可以使用结合到本披露的蛋白质上的标记抗体。在洗涤以便去除任何未结合蛋白之后，直接地(在荧光标记的情况下)或通过添加底物(像例如过氧化氢、TMB、或甲苯胺、或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖酐(x-gal))(在酶标记的情况下)来检测标记。这类基于ELISA或FLISA的系统特别适合于通过针对蛋白质结合到其上的蛋白标准品(像例如分离的和/或重组蛋白或其免疫原性片段或其表位)的已知量校准检测系统来定量样品中蛋白质的量。
在另一种形式中，ELISA或FLISA包括将本披露的蛋白质或结合到感兴趣抗原上的抗体固定到一种固体基质上，像例如薄膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板、聚苯乙烯或聚碳酸酯测验片或玻璃载体。然后使样品与本披露的所述蛋白质或抗体进行物理接触，并且所述化合物结合到其上的蛋白质被结合或“捕获”。然后使用本披露的标记蛋白对结合蛋白进行检测，该标记蛋白结合到不同的蛋白质或同一抗原的不同位点上。可替代地，可以使用一个第三标记抗体，该抗体结合该第二(检测)蛋白。
成像方法
如熟练的业内人士从上述内容中应当清楚的，本披露还考虑了使用本披露的蛋白质的多种成像方法。为了成像，本披露蛋白被偶联到可检测标记上，该标记可以是能够发射可以被成像检出的信号的任何分子或试剂。例如，该可检测标记可以是蛋白质、放射性同位素、荧光团、发射可见光的荧光团、发射红外线的荧光团、金属、铁磁性物质、发射电磁波的物质、具有特异性磁共振(MR)光谱特征的物质、吸收或反射X射线的物质、或改变声音的物质。
在成像步骤之前，可以将本披露的蛋白质全身性地或局部地施用于有待成像的肿瘤、器官、或组织中。通常，以有效地实现所希望的肿瘤、组织、或器官的光学图像的剂量来施用该蛋白质。这类剂量可以依赖于所使用的具体蛋白质、经受成像操作的肿瘤、组织、或器官、所使用的成像设备等而在很大程度上变化。
在本披露的一些实施方案中，本披露的蛋白质作为组织和器官的体内光学显影剂用于多种生物医学应用中，包括但不限于肿瘤成像、断层摄影术、器官成像、器官功能的监测、冠状动脉造影术、荧光内窥镜、激光引导的手术、光声和声至荧光方法等。其中本披露的蛋白质用于成像的示例性疾病例如癌症在此进行了说明并且应当理解成将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本披露的实例中。在一个实例中，本披露的蛋白偶联物用于通过监测本披露的特定蛋白在受试者体内哪里集中来检测肿瘤和其他异常的存在。在另一个实例中，本披露的蛋白质用于激光辅助的引导手术，用于在腹腔镜检查时检测肿瘤的微小转移。仍然在另一个实例中，本披露的蛋白质用于诊断动脉粥样硬化斑块以及血块。
成像方法的实例包括磁共振成像(MRI)、MR光谱学、放射线照相术、CT、超声、平面γ射线照相机成像、单光子发射计算断层摄影术(SPECT)、正电子发射断层摄影术(PET)、其他基于核医学的成像、使用可见光的光学成像、使用荧光素酶的光学成像、使用荧光团的光学成像、其他光学成像、使用近红外线的成像、或使用红外线的成像。
本披露方法的某些实例进一步包括在在受试者上的手术操作期间对组织成像。
用于成像的多种技术是本领域的技术人员已知的。这些技术中的任何一种可以用于本披露成像方法的背景中，用来测量来自可检测标记的信号。例如，光学成像是在医学特定领域中已经得到广泛接受的一种成像模式。实例包括细胞组分的光学标记、以及血管造影术，例如荧光素血管造影术和吲哚氰绿因血管造影术。光学显影剂的实例包括例如荧光素、荧光素衍生物、吲哚青绿、俄勒冈绿、俄勒冈绿衍生物的衍生物、罗丹明绿、罗丹明绿的衍生物、曙红、赤藓红(erytlirosin)、德克萨斯红、德克萨斯红的衍生物、孔雀绿、磺基琥珀酰亚胺酯纳米金、级联蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶基噁唑衍生物、级联黄染料、dapoxyl染料。
考虑了γ照相机成像作为一种成像方法，该方法可以用于测量从可检测标记得到的信号。本领域普通技术人员应当熟悉γ照相机成像的应用技术。在一个实例中，测量信号可以涉及111In或99mTc偶联物的γ照相机成像的用途，具体地是111In-善得定或99mTc-促生长素抑制素类似物。
在本披露背景中考虑了计算机断层摄影术(CT)作为成像模式。通过从不同角度取得一系列X射线并且然后用计算机软件将它们组合，CT使得其有可能构建出身体任何部分的一个三维图像。计算机被编程为从任何角度并且以任何深度展示二维切片。可以将这些切片合并来建立三维画像。
在CT中，静脉注射结合到感兴趣抗原上的辐射透不过的偶联到本披露的蛋白质上的造影剂可以有助于鉴定和描绘组织块(例如，软组织块)(当初始CT扫描不是诊断性的时)。类似地，造影剂有助于评定软组织损伤的血管供应。例如，使用造影剂可以帮助描绘肿瘤和邻近的血管结构的关系。
CT造影剂包括例如碘化造影剂。这些试剂的实例包括碘酞酸盐、碘海醇、泛影葡胺、碘帕醇、乙碘醇、以及碘番酸盐。也已经报道了钆试剂能够用作CT造影剂，例如钆喷胺。
磁共振成像(MRI)是使用高强度磁体和射频信号来产生图像的一种成像模式。在MRI中，将有待成像的样品置于强静止磁场中并且用射频(RF)辐射的脉冲激发用来在样品中产生净磁化。然后不同的磁场梯度和其他RF脉冲起作用，用来将空间信息编码到记录的信号中。通过收集和分析这些信号，有可能计算出三维图像，类似于CT图像，它通常以二维切片来展示。可以将这些切片合并用来建立三维表示。
用于MRI或MR光谱学成像的造影剂与用于其他成像技术中的那些不同。MRI造影剂的实例包括钆螯合物、锰螯合物、铬螯合物、以及铁颗粒。例如，本披露蛋白偶联到包括选自下组的顺磁金属螯合物的一种化合物上，该组由以下各项组成：钪、钪、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、钼、钌、铈、铟、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、以及镱。用于本披露的显影剂的一个另外的实例是基于卤烃的纳米颗粒例如PFOB或其他基于氟的MRI试剂。CT和MRI两者提供了解剖学信息，该信息帮助区别组织边界和血管结构。
提供关于细胞水平信息例如细胞活力的信息的成像模式包括正电子发射断层摄影术(PET)和单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。在PET中，病人咽下或注射有发射正电子的放射性物质，当该物质移动通过身体时这些正电子可以被监测。
PET与SPECT之间的主要区别在于替代正电子发射物质，SPECT使用发射高能光子的放射性示踪剂。SPECT对于诊断包括冠状动脉疾病的多种疾病具有价值，并且每年在美国已经进行大约250万的SPECT心脏研究。
对于PET而言，本披露的蛋白质通常标记有正电子发射体，例如11C、13N、15O、18F、82Rb、62Cu、和68Ga。对于SPECT，本披露的蛋白质标记有正电子发射体，例如99mTc、201Tl、以及67Ga、111In。
动物和人的非侵入性荧光成像还能够提供体内诊断信息并且用于广泛多样的临床专门项目中。例如，过去多年已经开放出多种技术包括在荧光团的UV激发后的简单观察，一直到使用先进的设备进行复杂的光谱学成像(参见例如Andersson-Engels等人，1997)。本领域已知的用于体内检测荧光(例如来自荧光团或荧光蛋白)的特定设备或方法包括但不限于体内近红外荧光(参见例如Frangioni，2003)，MaestroTM体内荧光成像系统(Cambridge Research & Instrumentation公司，沃本市，马萨诸塞州)，使用飞点扫描仪进行体内荧光成像(参见，例如Ramanujam等人，2001)等。
用于检测光学响应的其他方法或设备包括但不限于视觉检查、CCD照像机、录像照相机、照相胶片、激光扫描设备、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪、或使用光电倍增管的信号放大。
在一些实例中，在用于人体中之前使用体外或体内测定法对显影剂进行测试(例如使用在此所述的模型)。
制造物品
本披露还提供了包含本披露蛋白质的制造物品或“试剂盒”。该制造物品可以包括一个容器和一个标记或插入该容器上或与其相结合的包装，例如提供说明书用来根据任何实施方案将本披露的蛋白质用于在此所述的方法中。适当的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。这些容器可以是从许多种材料(如玻璃或塑料)形成的。该容器保持本披露的蛋白质组合物并且可以具有一个无菌入口端(例如，该容器可以是一种静脉注射溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。可替代地或另外地，该制造品可以进一步包括一个第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包括一种药学上可接受的缓冲剂，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、以及葡萄糖溶液。它可以进一步包含来自一种商业的以及使用者立场的其他的所期望的材料，包括其他的缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、以及注射器。该试剂盒还可以或可替代地包括用于检测本披露的蛋白质和/或用于偶联到本披露的蛋白质上的试剂。
在下面非限制性实例中对本披露进行进一步说明。
实例1：材料与方法
基于HEL4 VH结构域(如Jespers等人，2004中说明的)，使用一种突变方法来鉴定使这种结构域具有聚集抗性的突变。该方法是基于在HEL4与DP47(从中衍生出HEL4的易于聚集的种系VH)之间产生嵌合体。
1.1突变体VH和scFv的产生
使用Zoller和Smith(1987)说明的方法(其中由Kunkel等人(1987)引入了改进)产生人可变域的突变体。为此目的，将编码这些所希望突变的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的单链模板DNA上(dU-ssDNA)，在酶作用下延伸并且连接从而形成共价闭环DNA。通过使用ApaLI和NotI位点将编码单个人重链可变VH)域(V3-23/DP-47)的DNA片段克隆到噬菌体展示载体FdMyc来产生模板。通过电穿孔将共价闭环DNA转化到ung+大肠杆菌株TG1中，引起未突变dU-ssDNA的优先破坏。通过DNA序列分析来证实构建的突变体序列。
为了产生scFv突变体，使用XhoI和NotI克隆位点将编码单个V结构域(SEQ ID NO：3)和合成接头区(SEQ ID NO：4)的DNA片段克隆到相应的FdMyc构建体中。通过DNA序列分析来证实构建的突变体序列。
1.2聚集抗性的噬菌体ELISA(“热/冷测定”)
在噬菌体ELISA形式中通过测量热孵育之后信号停留对克隆的聚集抗性进行分析(McCafferty等人，1990；Jespers等人，2004)。在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的大约5μg/ml浓度的蛋白A将Nunc Maxisorp免疫板的孔包被过夜。用PBS将孔板洗涤一次并且用稀释于在PBS中的大约4％(w/v)奶粉(MPBS)封闭。从琼脂平板中挑取单个克隆并且在补充有大约15μg/ml四环素的2xTY培养基(包含大约16g/L胰蛋白胨、大约10g/L酵母提取物、大约5g/LNaCl、pH 7.0)中生长过夜，在大约30℃下震荡。通过离心将细胞移开并且在培养物上清液中通过添加生物素-PEO4-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Pierce；大约50μM的终浓度)直接将噬菌体生物素酰化。为了热选择，首先将上清液在大约80℃下孵育大约10分钟并且然后在大约4℃持续大约10分钟。将上清液添加到封闭的ELISA孔中。在用PBS洗涤三次之后，使用Extravidin-HRP偶联物(Sigma)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物来检测结合的噬菌体颗粒。通过减去在450nm和650nm处的测量值来计算吸光度。
1.3VH文库、‘Garvan-IA’和‘IB’的产生
构建了两个VH文库，其中使用Zoller和Smith，1987说明的方法(其中由Kunkel等人，1987引入了改进)将HEL4 VH克隆的CDR3随机化。为此目的，将编码这些所希望的突变的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的单链模板DNA上(dU-ssDNA)，在酶作用下延伸并且连接从而形成共价闭环DNA。通过使用ApaLI和NotI位点将编码单个人VH结构域(HEL4)的DNA片段克隆到噬菌体展示载体FdMyc中来产生模板。通过电穿孔将共价闭环DNA转化到ung+大肠杆菌株TG1中，引起未突变dU-ssDNA的优先破坏。通过将位置96、97、98、99、100、100a、和100b处(根据Kabat等人，1992编码)的7个氨基酸残基随机化(在所有7个位置使用简并DVK密码子)来产生‘Garvan-IA’文库。同样地，在位置95、96、97、98、99、100、100a、100b、以及100c处将‘Garvan-IB’文库随机化，其中在编码核酸中使用简并的NNK密码子将95和100c随机化，其中在编码核酸中使用简并的DVK编码将剩余的位置随机化。得到的文库尺寸对于Garvan-IA是大约1.1x109个克隆，并且对于Garvan-IB是大约2.2x109个克隆。
1.4抗-hTNF和抗-mIL-21 V H 克隆的噬菌体展示选择
通过针对生物素酰化的重组hTNF(人肿瘤坏死因子；Peprotech)或mIL-21进行2轮选择将来自天然Garvan-IA和IB文库的噬菌体(在FdMyc载体中)环化(基本上如前面说明的(Lee等人，2007))。在两轮选择之后，使用引物5’-ACGCGTCGACGCAGGTGCAGCTGTTGG-3’(SEQ ID NO：16)和5’-CTGTTAGGATCCGCTCGAGACGGTGACCAG-3’(SEQ ID NO：17)从噬菌体DNA制剂中PCR扩增编码VH结构域的区域。用SalI和BamHI限制性内切酶来消化PCR产物并且克隆到编码c-Myc和His6标签的修饰的pET12a表达质粒(New England Biolabs)的相应位点中。将得到的连接反应物转化到大肠杆菌株BL21-Gold(Stratagene)中并且在大约37℃下在大约250rpm震荡下使每个抗原选择的192个克隆生长于补充有大约4％葡萄糖和氨苄西林(约100μg/mL)的2xTY肉汤中持续大约18小时。使用过夜培养物来接种补充有大约0.1％葡萄糖和氨苄西林(约100μg/mL)的新鲜的2xTY培养基并且生长至OD600nm大约0.5，在这个时间点添加异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)至终浓度大约1mM用来诱导可溶性VH表达。在30℃下在大约250rpm震荡下使培养物生长大约18小时。通过离心将细胞移开并且通过ELISA针对抗原结合对培养物上清液进行测试。
对于ELISA，用在PBS中的大约5μg/ml浓度的抗原将NuncMaxisorp免疫板的孔包被过夜。用PBS将孔板洗涤一次并且用稀释于PBS中的大约4％(w/v)奶粉进行封闭。将上清液添加到封闭的ELISA孔中。在用PBS三次洗涤之后，使用生物素酰化的鸡-抗-c-Myc抗体(Immunology Consultants Laboratory)进行hTNF或生物素酰化的小鼠抗-c-Myc(Sigma，克隆9E10)用于mIL-21选择，之后使用Extravidin-HRP偶联物(Sigma)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物来检测结合的抗体结构域。通过减去在450nm和650nm处的测量值来计算吸光度。
1.5分离的V H 克隆的特异性ELISA
通过ELISA确定分离的VH克隆，G07(抗-hTNF；SEQ ID NO：5)和G11(抗-mIL-21；SEQ ID NO：6)的特异性。用大约5μg/mL重组人TNF、小鼠TNF、人IL-21、小鼠IL-21、β-半乳糖苷酶、人催乳激素受体、链霉亲和素、以及中性链亲和素中的任一项将Nunc Maxisorp免疫板的孔包被过夜。用PBS将孔板洗涤一次并且用稀释于PBS缓冲液中的大约4％(w/v)奶粉进行封闭。将稀释于PBS中的纯化的G07和G11以大约10μg/mL添加到孔板中并且在室温下孵育大约1小时。在用PBS三次洗涤之后，使用生物素酰化的鸡-抗-c-Myc抗体(用于G07)或生物素酰化的小鼠抗-c-myc(用于G11)来检测VH，之后添加Extravidin-HRP和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物。通过减去再450nm和650nm处的测量值计算吸光度。
1.6抗-hTNF和抗-mIL-21 V H 克隆的亲和力测量
使用表面等离子体共振(使用Biacore机器；GE Healthcare)来测量VH克隆G07(抗-hTNF；SEQ ID NO：5)和G11(抗-mIL-21；SEQ ID NO：6)的亲和力。为此目的，将在PBS中稀释的生物素酰化的抗原注射在链霉亲和素(SA)传感器芯片(Biacore AB)上。将纯化的VH(具有范围从大约0.125μM至4μM的浓度)的连续稀释以大约20μl/min的流速注射到包含相应靶抗原的流动细胞上。使用BIAevaluation 4.1软件包(Biacore AB)计算出平衡解离常数。
1.7确定V H 结构域的可溶性表达水平
使用蛋白A ELISA确定每个VH结构域的可溶性表达水平，其中针对同一纯化VH的标准曲线测量VH中的可溶性VH的浓度。从BL21-GOLD大肠杆菌(Stratagene)中的pET12a(New England Biolabs)载体来表达DP47、HEL4和突变体VH。在42小时之后，通过离心将细胞移开并且通过添加生物素-PEO4-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Pierce；50μM终浓度)直接地在培养物上清液中将VH生物素酰化。在已知浓度下将培养物上清液和相同突变体的生物素酰化的纯化VH添加到用5μg/ml蛋白A(Sigma)包被过夜并且用4％MPBS封闭的Nunc 96孔Maxisorp免疫板上。在用PBST三次洗涤之后，使用Extravidin-HRP偶联物(Sigma)和TMB底物来检测结合的抗体结构域。通过减去在450nm和650nm处的测量值来计算吸光度并且从标准曲线外推每个样品的浓度。
1.8通过尺寸排阻层析法来确定聚集抗性
将处于PBS中的10μM的纯化VH加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟或者不处理。在用包含125mM NaCl的25mM磷酸钠(pH 7.4)平衡的Superdex-G75柱(Pharmacia)上对加热的和未加热的样品各500μl进行分析之前在16,000xg下将加热的和未加热的样品两者离心10分钟。以500μl的体积以0.5ml/min流速注射蛋白质。通过测量加热样品曲线下的面积来确定每种VH突变体的回收率，表达为未加热样品的百分比。
1.9使用圆二色性来确定聚集抗性
在石英杯(1mm径长)中使用J-815分光计(Jasco)通过圆二色性(CD)来测量热去折叠的VH结构域。蛋白质样品是处于PBS(pH 7.2)中20μM的终浓度并且当以1℃/min将溶液从20℃加热至80℃时通过使用1nm带宽和1秒积分时间记录在235nm处的CD信号而获得熔解曲线。通过以1℃/min将加热的蛋白质从80℃冷却到4℃测试了每种样品的聚集抗性。
1.10通过尺寸排阻柱测量V H 结构域的保留
如前面所述表达和纯化CDR1中包含突变的DP47 VH结构域。将每种蛋白样品(在PBS中，5μM)加热至80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。在用包含125mM NaCl的25mM磷酸钠(pH 7.4)平衡的Superdex-G75柱(Pharmacia)上进行分析之前(每个500μl的样品)在16,000xg下将加热的样品离心10分钟。以500μl体积以0.5ml/min流速注射蛋白质。
1.11VH文库‘Garvan-2’的产生
构建了一个VH文库，其中使用Zoller和Smith，1987说明的方法(其中由Kunkel等人，1987引入了改进)将HEL4 VH克隆的多个CDR残基随机化。为此目的，将编码这些所希望的突变的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的单链模板DNA上(dU-ssDNA)，在酶作用下延伸并且连接从而形成共价闭环DNA。通过将编码单个人VH结构域(HEL4)的DNA片段克隆到噬菌体展示载体pHEN1中来产生模板。通过电穿孔将共价闭环DNA转化到ung+大肠杆菌株TGI中，引起未突变的dU-ssDNA的优先破坏。通过将CDR1中的位置30和31处(根据Kabat等人，1992编号)的2个氨基酸残基随机化(使用简并的KMT密码子)来产生该文库。同样地，在位置50、52、55处使用简并KMT密码子，在位置52a处使用简并RRT密码子并且在位置53处使用简并SMT密码子将CDR2随机化。此外，将HEL4结构域的位置29、94、100x(其中x指示C端简并位置之后的位置)、101和102突变成相应的DP47残基。然后基本上如前面所述使用SOE-PCR诱变将位置95-100a或可替代地位置95-100c进一步随机化(Higuchi，Krummel等人，1988)。在CDR3设计中编码的氨基酸残基包括所有19个天然发生的氨基酸，但是不包括半胱氨酸和终止密码子。通过电穿孔将共价闭合环状DNA转染到大肠杆菌株TG1中。得到的文库大小包括大约4x109个克隆。Garvan-2文库编码两个或更多个负电荷(negative charge)，它们中的两个是在位置32和33处。
1.12抗-hPRLR和抗-HEL VH克隆的噬菌体展示选择
基本上如前所述通过多轮选择将来自天然Garvan-2文库的噬菌体环化((Lee等人，2007))。在选择之后，在大约37℃下，在大约250rpm的震荡下，使从每种抗原选择得到的克隆生长在补充有大约4％葡萄糖和氨苄西林(大约100μg/mL)的2xTY肉汤中持续大约18小时。使用过夜培养物来接种补充有大约0.1％葡萄糖和氨苄西林(大约100μg/mL)的新鲜的2xTY培养基并且生长至OD600nm大约0.5，在这个时间点添加异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)至终浓度大约1mM，以诱导可溶性VH表达。在30℃下在约250rpm震荡下使培养物生长大约18小时。通过离心将细胞移开并且通过ELISA针对抗原结合对培养物上清液进行测试。
为了ELISA，用在PBS中的大约5μg/ml浓度的抗原将NuncMaxisorp免疫板的孔包被过夜。用PBS将孔板洗涤一次并且用稀释于PBS中大约4％(w/v)奶粉进行封闭。将上清液添加到封闭的ELISA孔中。在用PBS三次洗涤之后，使用生物素酰化的鸡-抗-c-Myc抗体(Immunology Consultants Laboratory)或生物素酰化的小鼠抗-c-Myc(Sigma，克隆9E10)，之后使用Extravidin-HRP偶联物(Sigma)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物来检测结合的抗体结构域。通过减去在450nm和650nm处的测量值计算吸光度。
1.14抗-hPRLR和抗-HEL VH克隆的亲和力测量
使用表面等离子体共振(使用Biacore2000仪器；GE Healthcare)来测量VH克隆的亲和力。为此目的，将稀释在PBS中的生物素酰化的抗原注射在链霉亲和素(SA)传感器芯片(Biacore AB)上。将连续稀释的纯化VH注射在包含相应靶抗原的流动细胞上。使用BIAevaluation 4.1软件包(Biacore AB)计算出平衡解离常数。
实例2：HEL4/DP47 CDR嵌合体的聚集抗性
进行多次实验用来研究将单个HEL4CDR(CDR1或CDR2或CDR3)引入到DP47中的作用。如上面详述的(参见材料与方法部分)构建了HEL4/DP47 CDR嵌合体并且针对聚集抗性进行了测试。
简言之，将噬菌体展示的VH加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白A ELISA捕获正确折叠的VH并且将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
结果显示在表1和图2中。总之，引入HEL4-CDR1对DP47 VH结构域赋予了显著的聚集抗性。另一方面，将HEL4-CDR2或HEL4-CDR3引入到DP47中对VH结构域的聚集抗性具有有限影响。
表1：DP47/HEL4 CDR嵌合体的聚集抗性
 VH   DP47   HEL4   HEL4-CDR1   HEL4-CDR2   HEL4-CDR3
 保持结合到蛋白A上   2％   88％   81％   4％   3％
实例3：CDR1的作图-DP47 CDR1突变体的聚集抗性
进行了多次实验，以进一步鉴定负责为DP47 VH结构域提供聚集抗性的CDR1区域。
如上面详述(参见材料与方法部分)，构建了DP47 VH结构域的CDR1区域中的单个氨基酸改变以及它们的组合，并且针对聚集抗性进行了测试。简言之，将噬菌体展示的VH加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白A ELISA捕获正确折叠的VH并且将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
结果显示在表2和图3中。总之，在CDR1的位置31或32或33处引入带负电荷的氨基酸导致VH结构域显著的聚集抗性。此外，与针对单个氨基酸改变所观察到的相比较，在31-33处的三重氨基酸突变(SYA31-33DED)导致了更大的聚集抗性。在位置28和35处的其他突变(T28R，S35G)对聚集抗性具有很小的影响。这些前面说明的突变不引入带负电荷的氨基酸。
表2：DP47-CDR1突变体的聚集抗性
 VH   T28R   S31D   Y32E   A33D   S35G   SYA31-33DED   5X mut
 保持结合到蛋白A上   2％   31％   41％   26％   4％   67％   75％
实例4：当与共同VL链(为scFv)配对时DP47-CDR1突变体的聚集抗性以及它们的组合
上面说明的DP47-CDR1突变体通过一个接头(SEQ ID NO：4)以scFv形式(关于全部实验详情参见材料与方法部分)与共同单个可变轻链(VL；SEQ ID NO：3)进行配对。简言之，将噬菌体展示的VH加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白A ELISA捕获正确折叠的scFv并且将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
结果显示在表3和图4中。总之，处于scFv形式的DP47-CDR1突变体显示与VH形式类似的聚集抗性改进(参见表2和图3)。这些结果显示当与共同VL链(如scFv)配对时在CDR1的位置31或32或33(或它们的组合)引入带负电荷的氨基酸改善了VH的聚集抗性。此外，与针对单个氨基酸改变所观察到的相比较，在31-33处的三重氨基酸突变(SYA31-33DED)导致了更大的聚集抗性。在位置28和35处的其他突变(T28R，S35G)对聚集抗性具有很小的影响。这些前面说明的突变不引入带负电荷的氨基酸。
表3.以scFv形式通过接头偶联到单个可变轻链(VL)上的DP47-CDR1突变体(VH)的聚集抗性
Figure BDA00001792399400741
实例5：在CDR1中包含双突变的DP47 VH构建体的产生
基本上如在上述实例中对于单个和多个DP47-CDR1突变体所说明，构建了VH的CDR1区域中的双突变。例如，在VH的CDR1位置32和33位置处引入双突变。可替代地，在VH的CDR1位置31和32处引入双突变。可替代地，在VH的CDR1位置31和33处引入双突变。
在以上的VH的CDR1区中双突变的实例中，在CDR1的位置32和33、或位置31和32、或位置31和33处引入带负电荷的氨基酸例如天冬氨酸(D)和/或谷氨酸(E)。如在前面材料和方法部分中说明的，使用噬菌体“热/冷”测定来测量双重突变体DP47 VH结构域的聚集抗性。简言之，将噬菌体展示的抗体加热到大约80℃持续约10分钟，之后在大约4℃下冷却大约10分钟。通过蛋白A ELISA捕获正确折叠的VH并且将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
在一些实例中，双重突变体VH构建体与轻链(VL)配对，以确定这些突变对scFv聚集抗性的影响。使用如前面材料与方法部分中所述的噬菌体“热/冷”测定来测量突变体scFv的聚集抗性。简言之，将噬菌体展示的抗体加热到约80℃持续约10分钟，之后在打约4℃下冷却大约10分钟。通过蛋白A ELISA捕获正确折叠的scFv并且将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
实例6：作为纯化蛋白的CDR1突变体的聚集抗性
在纯化的VH或VH-VL组合(即，不展示在噬菌体上)的背景下，评估了前面实例中说明的这组CDR1突变体的聚集抗性。对于这些实验，基本上如前面在材料与方法部分中说明，表达和纯化了突变体VH(或VH-VL)结构域。通过圆二色性(CD)和/或尺寸排阻层析和/或通过混浊度分析来研究针对热诱导聚集的抗性。通过圆二色性和/或荧光光谱学来确定热力学稳定性。
实例7：引入CDR1突变的现有突变体的突变
通过在位置28和/或30和/或31和/或32和/或33和/或35处引入带负电荷的氨基酸来修饰现有的已知单克隆抗体，像例如Humira(本领域中也称为阿达木单抗；在SEQ ID NO：10中列出的VH序列)和/或Rituxan(本领域中也称为美罗华或利妥昔单抗；SEQ ID NO：11)和/或赫赛汀(本领域中也称为曲妥珠单抗；SEQ ID NO：12)和/或阿瓦斯汀(本领域中也称为贝伐单抗；SEQ ID NO：13)。另外地，可以在位置26和/或39和/或40和/或50和/或52和/或52a和/或53处引入带负电荷的氨基酸。这些修饰抗体的表征是以VH结构域或仅scFv(非完整的IgG)形式来实现的并且包括如上面在材料与方法部分中说明的“热/冷”测定和/或实例6中所述测定的任何一项或多项。
实例8：在IgG背景下的VH突变体的分析
在完整IgG的背景下进行了VH突变体的测试。为此目的，表达并且纯化了突变体IgG。通过圆二色性和/或尺寸排阻层析和/或通过混浊度分析研究了针对聚集的抗性。
实例9：Garvan-IA和IB文库的聚集抗性
如上所述(参见材料与方法部分)构建并且分离Garvan-IA和IB文库。研究了来自Garvan-IA和IB人类VH文库的天然克隆的聚集抗性。简言之，将噬菌体展示的抗体加热到大约80℃持续大约10分钟，之后在大约4℃下冷却大约10分钟。通过蛋白A ELISA捕获正确折叠的VH并且将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
这些聚集抗性实验的结果示于图5A和5B中。总之，当经受“热/冷”测定时，Garvan-IA或-IB VH文库的天然(未选择)克隆的大多数(其中将多样性引入到HEL4的CDR3中)展示了聚集抗性的显著水平。多样性仅限于HEL4支架的CDR3，为7个或9个氨基酸残基(对应地IA和IB)。
实例10：G07和G11克隆的分离和表征
如上详述(参见材料与方法部分)针对它们结合到人肿瘤坏死因子(hTNF)或小鼠白细胞介素上21(mIL-21)选择的两种克隆是从Garvan-I文库中分离的。如通过ELISA证明的，结合是抗原特异性的。进行了抗人TNF克隆G07(SEQ ID NO：5)和抗小鼠IL-21克隆G11(SEQ ID NO：6)的Biacore亲和力测量。将连续稀释的每种纯化蛋白(以4μM开始)运行在对应地包被有生物素酰化的hTNF和mIL-21的链霉亲和素(SA)芯片上。Biacore软件分析对应地估计了针对G07和G11的1.86μM和4.07μM的亲和力。
然后针对每种VH研究抗原结合的特异性。针对结合到hTNF、mIL-21以及固定在Nunc Maxisorb ELISA孔板上的一定范围的无关抗原上来测试纯化的、c-Myc标记的抗体结构域。使用抗-c-Myc抗体来检测结合抗体结构域。这些结果如在图6中所示。总之，两种克隆都特异性地结合到它们同源抗原上。还发现G11结合到人IL-21(hIL-21)(一种mIL-21的同系物)上。
实例11：抗原结合抗-hTNF克隆G07和抗-mIL-21克隆G11的聚集抗性
在噬菌体上测试抗原结合抗-hTNF克隆G07和抗-mIL-21克隆G11的聚集抗性。而且，将这些克隆的CDR3结合到在此所述的DP47-CDR1突变体的一项或多项中，以研究点突变对抗原结合以及聚集抗性的影响。使用如前面材料与方法部分中所述的噬菌体“热/冷”测定来测量突变体、抗原结合VH的聚集抗性。此外，通过ELISA测试到抗原上的结合，以评估CDR1突变对抗原结合的影响。
实例12：赋予聚集抗性的另外突变的鉴定
为了鉴定在CDR1中的对VH赋予聚集抗性的另外的残基，将位置26至35(根据Kabat编号系统编号)之间的DP47的表面暴露残基取代为天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。还将位置39和40处的框架残基取代为天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。将这些突变体VH展示在噬菌体上并且经受“热/冷”测定，如实例12中所述。这个测定的结果显示在表4和图7中。简言之，将噬菌体展示的VH加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白A ELISA捕获正确折叠的VH并且将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
表4.VH突变体的聚集抗性。在加热到80℃持续10分钟之后，保持蛋白A结合(以％计)的DP47单突变体展示在噬菌体上，之后再4℃持续10分钟，并且被蛋白A捕获。
Figure BDA00001792399400771
这些数据显示在位置28、30、31、32、33或35处的取代显著增加了DP47的聚集抗性。在其他位置处(26、39、以及40)的取代(天冬氨酸或谷氨酸)也可检出地增加了DP47的聚集抗性。
这些数据还显示天冬氨酸取代比谷氨酸取代更多地增加了聚集抗性。在上述位置的每一项处都观察到这种效应。
实例13：在CDR2中的赋予聚集抗性的突变的鉴定
为了鉴定在CDR2中的对包含VH的蛋白质赋予聚集抗性的残基，将天冬氨酸(D)取代为表面暴露的残基(在具有天冬氨酸(位置50、52、52a、53、54)的DP47 VH的推定的CDR2内)。将这些突变体VH展示在噬菌体上并且经受“热/冷”测定(如在实例1.2中所述)。这个测定的结果显示在表5和图8中。
表5.VH突变体的聚集抗性。在加热到80℃持续10分钟之后，保持蛋白A结合(以％计)的DP47单突变体展示在噬菌体上，之后在4℃持续10分钟，并且被蛋白A捕获。
Figure BDA00001792399400781
这些数据显示在DP47 VH的位置50、52、52a或53处引入带负电荷的氨基酸可检出地增加了聚集抗性。
实例14：在位置31和/或32和/或33处带负电荷的氨基酸不同组合的作用
生产了在位置31和/或32和/或33处包括带负电荷的氨基酸的不同组合的VH结构域(如表6中列出)。使用“热/冷”测定法评定了VH结构域的聚集抗性，如实例1.2中说明的。结果显示在表6和图9中。
表6.在位置31和/或32和/或33处DP47的双重或三重负电荷突变体的聚集抗性，如在噬菌体上通过“热/冷”测定法确定的。
这些数据证明，所测试的带负电荷的氨基酸的所有组合对VH结构域赋予了相当程度的聚集抗性。这些数据还显示，与包含谷氨酸的组合相比较，仅包含天冬氨酸作为带负电荷的氨基酸的组合通常赋予更大程度的聚集抗性。此外，这些数据证明，与针对任何单个带负电荷的氨基酸所观察到的相比较，带多重负电荷的氨基酸赋予了更高程度的聚集抗性(参见图7和表4)。
实例15：在CDR1中的在位置28和/或35以及其他位点处的突变的组合对包含VH的蛋白质赋予了聚集抗性
生产了在DP47的CDR1中的在位置28和/或35以及至少一个其他位置处的包括带负电荷的氨基酸的VH结构域(如表7中列出)。使用“热/冷”测定法评定了VH结构域的聚集抗性(如在实例1.2中说明的)。结果显示在表7和图10中。
表7.至少在位置28和/或35处包括带负电荷的氨基酸的VH结构域的聚集抗性。
Figure BDA00001792399400792
Figure BDA00001792399400801
这些数据证明，与在位置28或35处对于单个带负电荷的氨基酸所观察到的相比较，将这些位置处的带负电荷的氨基酸与另外的带负电荷的氨基酸结合赋予了更高程度的聚集抗性。
实例16：在CDR1中的带负电荷的氨基酸赋予了可溶蛋白的高水平表达
使用如实例1.7中所述的方法评定了VH结构域的可溶性表达水平。所研究的VH结构域包括DP47、HEL4以及在DP47的CDR1中带负电荷的氨基酸的组合。结果显示在表8和图11中。
表8：在30℃下诱导42小时之后通过蛋白A ELISA测量的DP47-CDR1VH突变体的可溶性表达水平(mg/l)。
Figure BDA00001792399400802
对于在位置31至33处包含两个或更多个负电荷残基的DP47的突变体，表达水平显著增加了。单个突变还显示了在DP47表达水平上适度的改善，但是对于双重或三重突变则没有。
实例17.通过尺寸排阻层析法测量的作为可溶性VH蛋白的CDR1突变体的聚集抗性
使用尺寸排阻层析法研究纯化的VH结构域的聚集抗性。所研究的VH结构域包括DP47、HEL4以及在DP47的CDR1中带负电荷的氨基酸的组合。结果显示在表9和图12中。
表9.如通过在Superdex-G75尺寸排阻柱上洗脱的蛋白质所测量的，在80℃下加热10分钟之后具有CDR1突变的可溶性DP47 VH的10μM溶液的回收率。
Figure BDA00001792399400811
这些数据证明，在位置31和/或32和/或33处的一个或多个带负电荷的氨基酸增加了人VH结构域的聚集抗性，特别是对于包含两个或更多个取代的那些变异体。
实例18：通过圆二色性测量的作为可溶性蛋白的CDR1突变体的聚集抗性
使用CD研究的纯化的VH结构域的聚集抗性。所研究的VH结构域包括DP47、HEL4以及在DP47的CDR1中带负电荷的氨基酸的组合。结果显示在图13A和B中。
对于每种蛋白质，熔解曲线与双态转移一致。在加热到80℃之后HEL4显示了完全的聚集抗性，而当热变性时DP47聚集并且不能再折叠。在这些条件下单个负电荷突变(S31D、Y32E、A33D)显示可忽略的再折叠标记。因此，仅在位置31和/或32和/或33处引入双重负取代可检出地提高了这些结构域的聚集抗性，其中在位置31、32和33处的三重突变提供了最大效应。这证明多重负电荷取代在溶液中赋予了聚集抗性。
实例19：CDR1突变减少了在尺寸排阻柱中的可溶性VH的保留
分析了在尺寸排阻柱中的VH结构域的保留。所研究的VH结构域包括DP47、HEL4以及在CDR1中带负电荷的氨基酸的不同组合。结果显示于表10中。
表10：来自Superdex-G75尺寸排阻柱的具有CDR1突变的可溶性DP47VH的单体洗脱体积
Figure BDA00001792399400821
观察到的是具有多重负电荷取代的变异体的洗脱体积显著地低于DP47或单个突变体的洗脱体积。这些数据证明，在31、32和/或33处的多重负电荷取代减少了尺寸排阻柱中的人VH结构域的保留。这就它促进包括这类VH结构域的蛋白质的纯化而言提供了优点。此外，这些VH结构域的聚集抗性还表明，可以加热包含这些结构域的蛋白质来降低聚集体和/或二聚体/三聚体的发生并且然后使用尺寸排阻层析法进行分离，由此产生纯化的蛋白质。这样的方法促进更好地回收有用产物。
实例20：抗原特异性VH结构域的聚集抗性
通过针对重组蛋白抗原的噬菌体展示从Garvan-2文库中选择抗原特异性VH结构域。在选择之后，使用在实例1.2中所述的“热/冷”测定法，针对聚集抗性对结构域进行评估，并且结合到蛋白A超级抗原和/或重组抗原上，。结果显示于表11中。
表11.如在噬菌体上通过“热/冷”测定法确定的抗原特异性VH结构域的聚集抗性。
Figure BDA00001792399400831
这种分析揭示选择的抗原特异性VH结构域(VHPRLR_C02：抗-PRLR(催乳素受体；SEQ ID NO：7)；VHHEL_H04：抗鸡蛋溶菌酶，SEQ ID NO：8；VHHEL_H08：抗鸡蛋溶菌酶，SEQ ID NO：9、0在噬菌体上展示出显著的聚集抗性(表11)。所有这些选择的粘合剂在位置31和/或32和/或33处包含两个或更多个带负电荷的氨基酸。
表达和纯化了这些抗原特异性VH结构域。在Biacore 2000仪器上通过表面等离子体共振进行亲和力测量。这揭示了到靶抗原上的高亲和力结合(表12)。
表12.纯化的抗原特异性VH结构域的亲和力
Figure BDA00001792399400832
还针对聚集抗性分析了纯化的蛋白质。为了这种分析，将在PBS中的10μM的纯化的包含VH结构域的样品加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟或不处理。在用包含125mMNaCl的25mM磷酸钠(pH 7.4)平衡的Superdex-G75柱(Pharmacia)上对加热的和未加热的样品各500μl进行分析之前在16,000xg下将加热的和未加热的样品两者离心10分钟。以500μl体积以0.5ml/min流速注射蛋白质。通过测量加热样品的曲线下的面积来确定每种VH突变体的回收率，表示为未加热样品的百分比。这揭示了纯化的抗原特异性VH结构域展示了显著的聚集抗性(表13)。
所有这些抗原特异性VH结构域在位置31和/或32和/或33处包含两个或更多个带负电荷的氨基酸。
表13.纯化的抗原特异性VH结构域的聚集抗性
Figure BDA00001792399400841
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Claims (47)

1.一种分离的蛋白质，包括在选自下组的两个或更多个位置处包含一个带负电荷的氨基酸的一个抗体重链可变区(VH)，该组由以下各项组成：根据Kabat的编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35，该蛋白质能够特异性地结合到除了鸡蛋溶菌酶、β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中：
(i)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包含天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸。
2.一种包括抗体重链可变区(VH)的分离的蛋白质，该可变区在选自下组的位置处包括两个或更多个带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35，该蛋白质能够以大于10μM的亲和力特异性地结合到一种抗原上，其中：
(i)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包含天冬氨酸，则它在位置28与35之间的包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸。
3.一种包括根据Kabat的编号系统在位置28、33和/或35处包含一个带负电荷的氨基酸的抗体重链可变区(VH)的一种分离蛋白，该蛋白能够特异性地结合到除了鸡蛋溶菌酶、β半乳糖苷酶、α淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中：
(i)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包含天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸。
4.一种包括根据Kabat的编号系统在位置28、33和/或35处包含一个带负电荷的氨基酸的抗体重链可变区(VH)的分离蛋白质，该蛋白质能够以大于10μM的亲和力特异性地结合到抗原上，其中：
(i)如果该蛋白质结合到人血管内皮生长因子(VEGF)上并且在位置32和33处包括天冬氨酸，则它在位置29与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸；以及
(ii)如果该蛋白质结合到人VEGF上并且在位置31和33处包含天冬氨酸，则它在位置28与35之间包括至少一个另外的带负电荷的氨基酸。
5.如权利要求2或4所述的分离蛋白质，其中该蛋白质能够以大于100nM的亲和力特异性地结合到一种抗原上。
6.如权利要求1至5的任一项所述的蛋白质，与在根据Kabat的编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处没有一个或多个带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，它具有降低的聚集倾向。
7.如权利要求1至5的任一项所述的蛋白质，与在根据Kabat的编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处没有一个或多个带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，它在加热到至少大约60℃之后具有降低的聚集倾向。
8.根据权利要求1至7的任一项所述的蛋白质，在加热到至少大约60℃之后它具有特异性地结合到抗原上的能力。
9.如权利要求7或8所述的蛋白质，在加热到至少大约80℃之后它具有降低的聚集倾向和/或特异性地结合到抗原上的能力。
10.如权利要求1至9的任一项所述的蛋白质，能够结合到一种人蛋白上。
11.如权利要求1至10的任一项所述的蛋白质，能够结合到与人类病症相关联或其成因的一种蛋白质上。
12.如权利要求1至11的任一项所述的蛋白质，其中在位置32处的带负电荷的氨基酸是谷氨酸。
13.如权利要求1至12的任一项所述的蛋白质，其中该带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
14.如权利要求1至13的任一项所述的蛋白质，该蛋白质在单独地或共同地选自下组的一个或多个残基上另外地包括一个带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的位置26、30、39、40、50、52、52a以及53。
15.如权利要求14所述的蛋白质，其中该带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
16.如权利要求1至15的任一项所述的蛋白质，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置31和32和33上包括带负电荷的氨基酸。
17.如权利要求16所述的蛋白质，包括：
(i)在根据Kabat编号系统的位置31处的一个天冬氨酸。
(ii)在根据Kabat编号系统的位置32处的一个谷氨酸或天冬氨酸；以及
(iii)在根据Kabat编号系统的位置33处的一个天冬氨酸。
18.如权利要求1至15的任一项所述的蛋白质，该蛋白质在根据Kabat编号系统的位置32和33上包括带负电荷的氨基酸。
19.如权利要求18所述的蛋白质，包括：
(i)在根据Kabat编号系统的位置32处的一个谷氨酸或天冬氨酸；以及
(ii)在根据Kabat编号系统位置33处的一个天冬氨酸。
20.如权利要求16至19的任一项所述的蛋白质，在位置28和/或35处另外地包括一个带负电荷的氨基酸。
21.如权利要求20所述的蛋白质，其中在位置28和/或35处的带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
22.如权利要求1至21的任一项所述的蛋白质，在除了根据Kabat编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35之外的氨基酸位置上它是人的、人源化的或去免疫化的或融合到人蛋白或其区域上。
23.一种包括能够特异性地结合到抗原上的一个修饰的抗体重链可变区(VH)的蛋白质，其中VH在根据Kabat编号系统的位置28、31、33和/或35上包括带负电荷的氨基酸，并且其中VH的未修饰形式不包括一个或多个带负电荷的氨基酸。
24.一种包括能够特异性地结合到抗原上的修饰的抗体重链可变区(VH)的蛋白质，其中该VH在选自下组的两个或更多个位置包括带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat的编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35，并且其中未修饰的蛋白质在根据Kabat的编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处不包括两个或更多个带负电荷的氨基酸。
25.根据权利要求23或24所述的蛋白质，包括：
(i)在根据Kabat编号系统的位置31处的一个天冬氨酸；和/或
(ii)在根据Kabat编号系统的位置32处的一个谷氨酸；和/或
(iii)在根据Kabat编号系统的位置33处的一个天冬氨酸。
26.如权利要求25所述的蛋白质，在位置28和/或35处另外地包括一个带负电荷的氨基酸。
27.如权利要求26所述的蛋白质，其中在位置28和/或35处的带负电荷的氨基酸是天冬氨酸。
28.如权利要求1至27的任一项所述的蛋白质，其中该蛋白质是选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种抗体；
(ii)一种单域抗体
(iii)一种包含单链Fv(scFv)的蛋白质
(iv)一种双链抗体、一种三链抗体或一种四链抗体，以及
(v)一种包括(ii)-(iv)的任一项以及一种抗体的Fc结构域或其结构域的融合蛋白。
29.根据权利要求1至28的任一项所述的蛋白质，该蛋白质结合到一种化合物上。
30.根据权利要求29所述蛋白质，其中该化合物是选自下组，该组由以下各项组成：放射性同位素、可检测标记、治疗化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、增加该蛋白质在受试者体内半衰期的化合物以及它们的混合物。
31.一种组合物，该组合物包括如权利要求1至30的任一项所述的蛋白质以及一种药学上可接受的载体。
32.一种文库，包括根据权利要求1至30的任一项所述的多种蛋白质。
33.一种包括包含抗体重链可变区(VH)的蛋白质的文库，其中至少30％的VH在选自下组的两个或更多个位置处包括带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35。
34.一种用于分离如权利要求1至28的任一项所述的蛋白质的方法，该方法包括使如权利要求32或33所述的文库与抗原相接触，并且分离结合到其上的蛋白质。
35.一种用于增加包含抗体重链可变区(VH)的蛋白质的聚集抗性的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统在位置28、31、33和/或35处的一个氨基酸来修饰该VH。
36.一种用于增加包含抗体重链可变区(VH)的蛋白质的聚集抗性的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的两个或更多个氨基酸来修饰该VH，其中未修饰的蛋白质在一个或多个取代的位置处不包含带负电荷的氨基酸。
37.一种用于增加包含抗体重链可变区(VH)的蛋白质的聚集抗性的方法，该方法包括修饰该VH使得它在选自下组的两个或更多个位置处包括带负电荷的氨基酸，该组由以下各项组成：根据Kabat编号系统的28和/或31和/或32和/或33和/或35，其中未修饰的蛋白质在根据Kabat编号系统的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处不包括两个或更多个带负电荷的氨基酸。
38.一种用于增加包含抗体重链可变区(VH)的可溶蛋白的产生水平的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代位于根据Kabat编号系统位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的两个或更多个氨基酸来修饰该VH，其中与缺乏带负电荷的氨基酸的蛋白质的产生水平相比较，产生的可溶蛋白的水平增加了。
39.一种用于增加生产包含抗体重链可变区(VH)的可溶蛋白水平的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统位置28和/或31和/或33和/或35处的氨基酸来修饰该VH并且生产该蛋白，其中与缺少带负电荷的氨基酸蛋白的生产水平相比较，所生产的可溶蛋白的水平有所增加。
40.一种用于增加从一种层析树脂中回收包含抗体重链可变区(VH)的蛋白质的水平或用于降低从层析树脂中回收蛋白质所需溶液的体积的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35处的两个或更多个氨基酸来修饰VH，并且使该蛋白质与层析树脂接触，其中与缺乏带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，从层析树脂回收蛋白质的回收水平增加了或者从层析树脂回收蛋白质所需溶液的体积降低了。
41.一种用于增加从一种层析树脂中回收包含抗体重链可变区(VH)的蛋白质的水平或用于降低从层析树脂中回收蛋白质所需溶液的体积的方法，该方法包括通过用带负电荷的氨基酸取代根据Kabat编号系统的位置28、31、33和/或35处的氨基酸来修饰VH，并且使该蛋白质与层析树脂接触，其中与缺乏带负电荷的氨基酸的蛋白质相比较，从层析树脂回收蛋白质的回收水平增加了并且从层析树脂回收蛋白质所需溶液的体积降低了。
42.如权利要求1至30的任一项所述的蛋白质或权利要求31所述的组合物在医药中的用途。
43.一种治疗或预防受试者体内的病症的方法，该方法包括将如权利要求1至30的任一项所述的蛋白质或根据权利要求31所述的组合物施用到对其有需要的受试者体内。
44.一种用于将化合物递送到细胞中的方法，该方法包括使该细胞与如权利要求29或30所述的蛋白质或根据权利要求31所述的组合物相接触。
45.一种用于诊断或预测受试者体内的病症的方法，该方法包括使来自该受试者的样品与如权利要求1至30的任一项所述的蛋白质或如权利要求31所述的组合物相接触这样使得该蛋白质结合到抗原上并且形成一种复合物，然后检测该复合物，其中复合物的检测对于受试者体内的病症是诊断性的或预测性的。
46.如权利要求45所述的方法，包括确定该复合物的水平，其中所述复合物的增强或降低的水平对于受试者体内的病症是诊断性的或预测性的。
47.一种用于局部化或检测受试者体内的抗原的方法，所述方法包括：
(i)将如权利要求29或30所述的蛋白质或如权利要求31所述的组合物施用于受试者这样使得该蛋白质结合到一种抗原上，其中该蛋白偶联到一种可检测标记上；以及
(ii)体内检测或局部化该可检测标记。
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