JP6952827B2 - 血液脳関門輸送分子およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
[0001]本出願と共に提出されたASCIIテキストファイルの形態の電子的に提出された配列表(BBB−100P1_Seq;サイズ:84キロバイト;および作成日:2014年12月19日)の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
周皮細胞、星状細胞およびニューロン性細胞もBBBの機能において重要な役割を果たす。BCECは、血液から脳への小さいおよび大きい(水溶性の)化合物の傍細胞輸送を防ぐ密着結合などの特定の特徴を有する(BrightmanおよびReese、J. Cell Biol. 1969; 40(3):648〜77; ReeseおよびKarnovsky、J. Cell Biol. 1967; 34(1):207〜17)。BBBは、物理的、代謝的および免疫学的なバリアとして機能する(Gaillardら、Microvasc. Res. 2003; 65(1):24〜31)。
[0007]一形態において、本開示は、免疫グロブリンポリペプチドを包含する単離された輸送体分子であって、該ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−1(H−CDR1)、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−2(H−CDR2)、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−3(H−CDR3)、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−1(L−CDR1)、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−2(L−CDR2)、および免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−3(L−CDR3)を含み;H−CDR1、H−CDR2、H−CDR3、L−CDR1、L−CDR2、およびL−CDR3はそれぞれ、(a)配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号12、配列番号13、および配列番号14;(b)配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;(c)配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;(d)配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号66、配列番号67、および配列番号68;(e)配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;(f)配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;(g)配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;(h)配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号138、配列番号139、および配列番号140;(i)配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号156、配列番号157、および配列番号158;(j)配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号174、配列番号175、および配列番号176;(k)配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号192、配列番号193、および配列番号194;または(l)配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号219、配列番号220、および配列番号220であり、該輸送体分子は、血液脳関門を通過することができる、上記輸送体分子を提供する。
ドとしては、神経刺激性のポリペプチド、例えば、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、パラクリン因子、視床下部放出因子、神経伝達物質ポリペプチド、CNS細胞によって発現される受容体に関するポリペプチドアゴニスト、リソソーム蓄積症に関与するポリペプチドまたはあらゆるそれらの組合せを挙げることができる。別の例において、ペイロードとしては、IL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)、ダラージン(dalargin)、インターフェロン−β、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−4/5、ニューロトロフィン(NT)−3、ニュールツリン、ニューレグリン、ネトリン、毛様体神経栄養因子(CNTF)、幹細胞因子(SCF)、セマフォリン、肝細胞増殖因子(HGF)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)−cx、TGF−B、血管内皮増殖因子(VEGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、ヘレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球−コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球マクロファージ−CSF、カルジオトロフィン−1、ヘッジホッグ、白血病抑制因子(LIF)、ミッドカイン、プレイオトロフィン、エリスロポイエチン(EPO)、骨形成タンパク質(BMP)、ネトリン、サポシン、あらゆるそれらのフラグメント、またはあらゆるそれらの組合せを挙げることができる。一形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、ヒトIgG重鎖定常領域またはそれらのフラグメント、およびヒト軽鎖定常領域を含んでいてもよく、ここでIL−1Raポリペプチドが重鎖定常領域のC末端に融合されている。
[0020]本開示はさらに、本明細書で提供される輸送体分子、またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをコードする核酸分子を包含する単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の形態において、核酸分子は、VH、VL、またはVHおよびVLをコードしていてもよく、核酸分子は、配列番号2、配列番号11、または配列番号2、および配列番号11;配列番号20、配列番号29、または配列番号20、および配列番号29;配列番号38、配列番号47、または配列番号38、および配列番号47;配列番号56、配列番号65、または配列番号66、および配列番号65;配列番号74、配列番号83、または配列番号74、および配列番号83;配列番号92、配列番号101、または配列番号92、および配列番号101;配列番号110、配列番号119、または配列番号110、および配列番号119;配列番号128、配列番号137、または配列番号128、および配列番号137;配列番号146、配列番号155、または配列番号146、および配列番号155;配列番号164、配列番号173、または配列番号164、および配列番号173;配列番号182、配列番号191、または配列番号182、および配列番号191;配列番号200;配列番号209、配列番号218、または配列番号209、および配列番号218;または配列番号226、配列番号227、または配列番号226、および配列番号227を含む。特定の形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチドはさらに、ペイロード、例えば上述したペイロードをコードする核酸を包含する。
またはそれより多くのプロモーターに作動可能に(operably)連結されていてもよい。
[0024]特定の形態において、本開示は、本明細書で提供されるベクター、または2つまたはそれより多くの本明細書で提供されるベクターの組成物を包含する、単離された宿主細胞を提供する。本開示はさらに、本明細書で提供される輸送体分子の作製方法であって、(a)提供された宿主細胞を培養すること;および(b)輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットを単離することを包含する、上記方法を提供する。特定の形態において、本方法はさらに、(c)輸送体分子またはそれらのフラグメントもしくはサブユニットをペイロードにコンジュゲートすることを包含する。
[0040]単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文章中に明らかな別段の指示がない限り、複数形の指示対象を包含する。用語「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、加えて用語「1つまたはそれより多くの」、および「少なくとも1つの」は、本明細書において同義的に使用することができる。
[0049]用語「抗体」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組合せなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を介して認識してそれに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す場合がある。用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント(例えばFab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメント)、単鎖Fv(scFv)突然変異体、多重特異性抗体、例えば少なくとも2つの無傷の抗体から生成した二重特異性抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が特定の生物活性を提示する限り抗原認識部位を含む他のあらゆる改変免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそれらのサブクラス(アイソタイプ)(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)のいずれかに属する可能性がある。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造および3次元立体配置を有する。抗体は、ネイキッドであってもよいし、または例えば毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートしていてもよい。
ら、1988、Science、239:1534〜1536)。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FW)残基は、目的の特異性、親和性、および/または能力を有する非ヒト種からの抗体における対応する残基で置き換えられている。
基(およそ軽鎖の残基1〜107および重鎖の残基1〜113)(例えば、Kabatら、Sequences of Immunological Interest、第5版、公衆衛生局(Public Health Service)、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991))を指す場合に使用される。
生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991)において、カバットでなされるようなアミノ酸位置のナンバリングは、抗体のコンパイルにおける重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。以下の表1を参照されたい。このナンバリングシステムを使用する場合、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFWまたはCDRの短縮またはそれらへの挿入に相当するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有する可能性がある。例えば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後に、単一のアミノ酸の挿入(カバットに従って、残基52a)、および重鎖FWの残基82の後に、挿入された残基(例えば、カバットに従って残基82a、82b、および82cなど)を包含し得る。
の末端は、カバットのナンバリングの慣例を使用してナンバリングした場合、ループの長さに応じてH32とH34とで異なる(これはなぜなら、カバットのナンバリングスキームはH35AおよびH35Bに挿入を置くためであり、35Aも35Bも存在しない場合、ループの末端は32であり、35Aのみ存在する場合、ループの末端は33であり、35Aおよび35Bの両方が存在する場合、ループの末端は34である)。AbMの高度可変領域は、カバットのCDRとコチアの構造的なループとの組合せにより示され、オックスフォードモレキュラー(Oxford Molecular)のAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用される。
2つの定常ドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常ドメイン、ならびに任意選択でこれらのドメインへのフレキシブルなヒンジ領域のN末端を指す。IgAおよびIgMの場合、Fc領域は、J鎖を包含する場合もある。IgGの場合、Fcは、免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3(Cγ2およびCγ3)、ならびに任意選択でCガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)との間にヒンジ領域を含む。
合パートナー(例えば、抗原)との間における総計の非共有結合による相互作用の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原との)間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般的に解離定数(KD)によって表すことができる。親和性は、本明細書で説明される方法などの当業界において公知の一般的な方法によって測定することができる。低い親和性の抗体は、一般的に、抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、それに対して高親和性の抗体は、一般的に、抗原とより速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当業界において公知であり、そのうちいずれかを本発明の開示の目的のために使用することができる。
[0074]言葉「標識」は、本明細書で使用される場合、「標識された」抗体が生成されるように抗体に直接的または間接的にコンジュゲートした検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自身検出可能であってもよいし(例えば、放射線同位体標識または蛍光標識)、または酵素標識のケースでは、検出することができる基質化合物または組成物の化学的変更を触媒してもよい。
NAまたはRNA発現ベクター、および特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞が挙げられる。
Natl. Acad. Sci.、90:5873-5877に記載されるアルゴリズムであり、NBLASTおよびXBLASTプログラム(Altschulら、1991, Nucleic Acids Res.、25:3389〜3402)に取り入れられている。特定の実施態様において、ギャップ有りBLASTは、Altschulら、1997, Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402で説明されるようにして使用することが
できる。配列を並べるのに使用することができる追加の公共的に利用可能なソフトウェアプログラムは、BLAST−2、WU−BLAST−2(Altschulら、1996、Methods in
Enzymology、266:460〜480)、ALIGN、ALIGN−2(ジェネンテック(Genentech)、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)またはメガライン(Megalign)(DNASTAR)である。特定の実施態様において、2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを使用して(例えば、NWSgapdna.CMPマトリックス、および40、50、60、70、または90のギャップウェイト、および1、2、3、4、5、または6のレングスウェイトを使用して)決定される。特定の代替の実施態様において、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(J. Mol. Biol. (48):444〜453(1970))を取り込んだGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを使用して、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定することができる(例えば、BLOSUM62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および16、14、12、10、8、6、または4のギャップウェイト、および1、2、3、4、5のレングスウェイトを使用して)。代替として、特定の実施態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、MyersおよびMyersのアルゴリズム(CABIOS、4:11〜17(1989))を使用して決定される。例えば、パーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)を使用して、およびPAM120を残基表、12のギャップの伸長ペナルティーおよび4のギャップペナルティーで使用して決定することができる。当業者は、特定のアライメントソフトウェアによって、最大のアライメントにとって適切なパラメーターを決定することができる。特定の実施態様において、アライメントソフトウェアのデフォルトパラメーターが使用される。
[0087]本開示は、ペイロードと連結したままで、例えば、ペイロードに融合またはコンジュゲートしたままで脳内皮細胞を通過することができる輸送体分子を使用して、目的の物質、例えば治療剤または診断剤または「ペイロード」を血液脳関門(BBB)を通過して送達するための組成物を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、本明細書で提供される輸送体分子によってBBBを通過する輸送を促進することができるあらゆる物質の省略表現として使用される。ペイロードは、例えば融合ポリペプチドとして輸送体分子の一部であってもよいし、またはジスルフィド結合または他の共有結合を介してポリペプチドに合体していてもよい。代替として、ペイロードは、さらに後述されるように、輸送体分子をBBBを通過したその輸送が容易になるような状態にすることができるあらゆる方法で輸送体分子と連結していてもよい。特定の形態において、ペイロードは、BBB輸送後も輸送体分子の一部のままであり、その形態で中枢神経系(CNS)活性を保持する。代替として、ペイロードは、BBB輸送中に輸送体分子と連結しているが、BBB輸送後に輸送体分子から解離できるようになっていてもよい。ペイロード部分の例示的な非限定的な例は、本明細書の他所に提供されている。本開示はさらに、このような輸送体分子の使用を含む、CNSの疾患または障害を処置または診断するための方法を提供する。
ブリン重鎖相補性決定領域(CDR)を含む。例えば免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−1(H−CDR1)、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−2(H−CDR2)、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−3(H−CDR3)を包含していてもよい。特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖CDRを追加で含んでいてもよいし、または代替として含んでいてもよい。例えば、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、相補性決定領域−1(L−CDR1)、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−2(L−CDR2)、および免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−3(L−CDR3)を包含していてもよい。特定の形態において、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドは、それぞれ以下のアミノ酸配列を有するH−CDR1、H−CDR2、H−CDR3、L−CDR1、L−CDR2、およびL−CDR3を含有していてもよい:
(a)Bbbt0241のCDRである、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号12、配列番号13、および配列番号14;
(b)Bbbt0626のCDRに類似したCDRである、配列番号21、配列番号22、配列番号23、QGDSLX2X3YYX4X5(式中X2=TまたはRであり;X3=S、R、またはTであり;X4=AまたはTであり;X5=NまたはSである)(配列番号229)、GX8X9NRPS(式中X8=KまたはEであり、X9=NまたはDである)(配列番号230)、およびNSRDX13X14GX15X16X17V(式中X13=SまたはNであり;X14=SまたはTであり;X15=N、K、またはHであり;X16=HまたはPであり;X17=VまたはWである)(配列番号231);
(c)Bbbt0632のCDRに類似したCDRである、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;
(d)Bbbt0654のCDRである、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号66、配列番号67、および配列番号68;
(e)Bbbt0726のCDRに類似したCDRである、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;
(f)Bbbt0727のCDRに類似したCDRである、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;
(g)Bbbt0732のCDRに類似したCDRである、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号229、配列番号230、および配列番号231;
(h)Bbbt0754のCDRである、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号138、配列番号139、および配列番号140;
(i)Bbbt0674のCDRである、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号156、配列番号157、および配列番号158;
(j)Bbbt0755のCDRである、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号174、配列番号175、および配列番号176;
(k)Bbbt0643のCDRである、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号192、配列番号193、および配列番号194;または
(l)Bbbt0579のCDRである、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号219、配列番号220、配列番号221。
以下のアミノ酸配列を有するH−CDR1、H−CDR2、H−CDR3、L−CDR1、L−CDR2、およびL−CDR3を含有していてもよい:
(b)Bbbt0626のCDRである、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号30、配列番号31、および配列番号32;
(c)Bbbt0632のCDRである、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号48、配列番号49、および配列番号50;
(e)Bbbt0726のCDRである、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号84、配列番号85、および配列番号86;
(f)Bbbt0727のCDRである、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号102、配列番号103、および配列番号104;または
(g)Bbbt0732のCDRである、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号120、配列番号121、および配列番号122。
(a)配列番号2に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号11に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号2および配列番号11は、Bbbt0241のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(b)配列番号20に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号29に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号20および配列番号29は、Bbbt0626のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(c)配列番号38に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号47に少なくと
も80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号38および配列番号47は、Bbbt0632のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(d)配列番号56に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号65に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号56および配列番号65は、Bbbt0654のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(e)配列番号74に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号83に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号74および配列番号83は、Bbbt0726のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(f)配列番号92に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号101に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号92および配列番号101は、Bbbt0727のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(g)配列番号110に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号119に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号110および配列番号119は、Bbbt0732のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(h)配列番号128に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号137に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号128および配列番号137は、Bbbt0754のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(i)配列番号146に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号155に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号146および配列番号155は、Bbbt0674のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(j)配列番号164に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号173に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号164および配列番号173は、Bbbt0755のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(k)配列番号182に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号191に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号182および配列番号191は、Bbbt0643のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;
(l)配列番号209に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号218に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号209および配列番号218は、Bbbt0579のVHおよびVL領域をコードする、上記配列;または
(m)配列番号226に少なくとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVHアミノ酸配列、および配列番号227に少な
くとも80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なVLアミノ酸配列であって、配列番号226および配列番号227は、Bbbt0671のVHおよびVL領域をコードする、上記配列。
(a)VHは配列番号2を含み、VLは配列番号11を含み;
(b)VHは配列番号20を含み、VLは、SSELTQDPAVSVALX1QTVRITCQGDSLX2X3YYX4X5WYQX6KPGQAPVLVX7YGX8X9NRPSGX10PDRFSGSX11SGX12TASLTITGAQAEDEADYYCNSRDX13X14GX15X16X17VFGGGTKLTVL(式中X1=RまたはGであり;X2=TまたはRであり;X3=S、R、またはTであり;X4=AまたはTであり;X5=NまたはSであり;X6=HまたはQであり;X7=MまたはIであり;X8=KまたはEであり;X9=NまたはDであり;X10=VまたはIであり;X11=SまたはRであり;X12=NまたはTであり;X13=SまたはNであり;X14=SまたはTであり;X15=N、K、またはHであり;X16=HまたはPであり;X17=VまたはWである)(配列番号228)または配列番号29を含み;
(c)VHは配列番号38を含み、VLは配列番号228または配列番号47を含み;
(d)VHは配列番号56を含み、VLは配列番号65を含み;
(e)VHは配列番号74を含み、VLは配列番号228または配列番号83を含み;
(f)VHは配列番号92を含み、VLは配列番号228または配列番号101を含み;
(g)VHは配列番号110を含み、VLは配列番号228または配列番号119を含み;
(h)VHは配列番号128を含み、VLは配列番号137を含み;
(i)VHは配列番号146を含み、VLは配列番号155を含み;
(j)VHは配列番号164を含み、VLは配列番号173を含み;または
(k)VHは配列番号182を含み、VLは配列番号191を含む、輸送体分子を提供する。
たはインビボのアッセイによって試験することができる。例えば、輸送体分子は、本明細書の他所で説明されるインビトロのトランスサイトーシスアッセイで、または本明細書の他所で説明される利尿アッセイなどのインビボのアッセイで試験することができる。インビボにおけるBBBを通過するペイロードの送達を測定するのに使用することができる他のアッセイとしては、これらに限定されないが、慢性絞扼損傷(CCI);神経部分損傷モデル(SNI)または脊髄神経結紮(SNL)が挙げられ、これらは全て、ポーフリック(paw flick)、またはハーグリーブス方法(Hargreaves Kら、Pain; 1988; 32; 77〜88)により測定することができる。
は、低減したエフェクター機能を有し(Walkerら、1989、Biochem. J. 259:347〜353)
、例えば細菌の宿主細胞使用して生成できることが示されている(例えば、Simmonsら、
2002、J. Immunol. Methods、263:133〜147を参照)。
ab’)2フラグメント、Fab’フラグメント、dsFvフラグメント、scFvフラグメント、またはsc(Fv)2フラグメントを含むかまたはからなる。
ドと非共有結合を介して連結される。
[0111]CNSに輸送する必要があるあらゆるタイプのペイロードが、本明細書で提供される輸送体分子と連結されていてもよい。例えば、ペイロードは、ペプチドまたはポリペプチド、例えば、ペプチドタグ、ホルモンまたはそれらの誘導体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、または異種抗体もしくはそれらのフラグメント;ポリヌクレオチド、例えば、マイクロRNA、マイクロRNA阻害剤、アンチセンス分子、およびRNAi分子、cDNA、または遺伝子治療剤;炭水化物、ポリエチレングリコールなどのポリマー、化学療法剤などの小分子薬物、または抗微生物剤もしくは抗ウイルス剤、プロドラッグ、脂質、生体応答調整物質、検出可能な標識、または薬剤の2種もしくはそれより多くの組合せであってもよい。
Exp. Ther. 339:618〜23;TobinckおよびGross(2008)J.NeuroInflam 5:2)。TNF
−α阻害剤のBBB輸送体へのカップリングは、BBBを通過するこのような阻害剤の送達を容易にする方法の一つである。したがって、本開示は、TNF−α阻害剤に融合した、またはその他の方法で連結された、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを含む輸送体分子を提供する。TNF−α阻害剤は、あらゆる好適な手段によって本明細書で提供される輸送体分子に接続させることができ、例えばポリペプチドのTNF−α阻害剤は、本明細書で提供される免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに、重鎖または軽鎖のいずれかのN末端またはC末端で融合させることができる。多数の好適なTNF−α阻害剤が当業界において説明されており、そのようなものとしては、これらに限定されないが、TNF受容体のリガンド結合部分(TNFR)、例えば、エタネルセプト(ENBREL(登録商標));およびTNF−αと結合する抗体、例えば、アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))、インフリキシマブ(レミケード(登録商標))、ゴリムマブ(SIMPONI(登録商標))が挙げられる。
[0116]本明細書で提供される特定の輸送体分子は、異種ペイロード分子を単独で、またはそれと連結させてのいずれかでBBBを通過して輸送する能力を有する。活性は、多数のアッセイによって実証することができる。例えば、特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、1つまたはそれより多くの種からのBMVEC、例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、またはウシBMVECに結合することができる。結合は、当業界における通常の技術を有する者に公知の様々な方法で、例えば、本明細書の他所で説明されるFMATアッセイで実証することができる。特定の形態において、BMVECは、脳毛細血管内皮細胞(BCEC)である。特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいて、BCECの単分子層を通過することができる。さらに、特定の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、本明細書の他所で詳細に説明される競合FMATアッセイにおいて、BMVECへの結合に関して、単一ドメイン抗体であるFC5(例えば、PCT公報WO02/057445を参照)またはBbbt0241と競合することができる。BMVECへの結合に関してFC5またはBbbt0241と競合する輸送体分子の例としては、Bbbt0626、Bbbt0727、Bbbt0632、Bbbt0654、Bbbt0726、Bbbt0732、またはBbbt0754のVHおよびVLドメインを含む輸送体分子が挙げられる。特定の代替の形態において、本明細書で提供される輸送体分子は、BMVECに結合するが、競合FMATアッセイにおいて、BMVECへの結合に関して、単一ドメイン抗体FC5またはBbbt0241と競合しない。BMVECへの結合に関してFC5またはBbbt0241と競合しない輸送体分子の例としては、Bbbt0643、Bbbt0674、Bbbt0755、Bbbt0579またはBbbt0671のVHおよびVLドメインを含む輸送体分子が挙げられる。
[0120]本開示は、本明細書で提供されるいずれかの輸送体分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の形態において、単離されたポリヌクレオチド、または2つもしくはそれより多くのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物であって、該ポリヌクレオチドは、単独で、または集合的に輸送体分子をコードし、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド、加えてBBBを通過して輸送しようとするペイロードをコードしていてもよい、上記ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の形態において、単離されたポリヌクレオチド、または2つまたはそれより多くの単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物であって、該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(複数)は、Bbbt0241、Bbbt0351、Bbbt0626、Bbbt0632、Bbbt0654、Bbbt0726、Bbbt0727、Bbbt0732、Bbbt0754、Bbbt0674、Bbbt0755、Bbbt0643、Bbbt0579、またはBbbt0671の1つまたはそれより多くを含む免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを単独で、または集合的にコードする、1つまたはそれより多くの核酸分子を含む、上記組成物が提供される。
82、および配列番号191;配列番号200;配列番号209、配列番号218、または配列番号209、および配列番号218;または配列番号226、配列番号227、または配列番号226、および配列番号227をコードする、上記ポリヌクレオチドが提供される。
するDNAは、シグナルペプチドがポリペプチドの分泌に参加する前駆体として発現される場合、ポリペプチドに関するDNAと作動可能に連結されており;プロモーターは、プロモーターが配列の転写を制御する場合、コード配列と作動可能に連結されており;またはリボソーム結合部位は、リボソーム結合部位が翻訳を許容するように配置される場合、コード配列と作動可能に連結されている。酵母発現系での使用を意図した構造的なエレメントとしては、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が挙げられる。代替として、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、タンパク質は、N末端のメチオニン残基を包含していてもよい。この残基は、任意選択で、最終産物が提供されるように、それに続き発現された組換えタンパク質から切断されてもよい。
[0137]別の形態において、本開示は、本明細書で提供される輸送体分子の1つまたは組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物であって、1つまたはそれより多くの輸送体分子は、医薬的に許容される担体と共に製剤化された、BBBを通過する輸送のための1つまたはそれより多くのペイロード部分を含む、上記組成物を提供する。このような組成物は、本明細書で提供される1つまたは2つまたはそれより多くの異なる輸送体分子を包含していてもよい。
[0145]本明細書で提供される輸送体分子は、インビトロおよびインビボにおける診断的および治療的な有用性を有する。例えば、これらの分子は、例えばインビトロまたはエクスビボで培養物中の細胞に投与することもできるし、または例えばインビボで対象に投与して、CNSの様々な疾患または障害を処置、予防または診断することもできる。
[0151]本開示はまた、疾患を診断する方法も提供する。造影剤などの部分を有する本明細書で提供される輸送体分子は、疾患を診断するのに使用される方法で実行されてもよい。
発、処置、または改善をモニターする方法は、本明細書で提供される輸送体分子の利用を介してCNS中の化合物/標的をイメージングする、診断する、またはそれらと接触させる方法によって達成される。
[0154]本明細書で提供される組成物(例えば物質をBBBを通過して送達することが可能な輸送体分子)および使用説明書を含むキットも本開示の範囲内である。キットは、少なくとも1つの追加の試薬、または1つまたはそれより多くの追加の輸送体分子をさらに含有していてもよい。キットは、典型的には、キット内容物の意図した使用を示すラベルを包含する。ラベルという用語は、キット上もしくはキットと共に供給されるか、またはそれ以外の方法でキットに付随するあらゆる文書または記録材料を包含する。
[0155]当業者であれば、以下の慣例的な実験を使用して、本明細書で説明される具体的な実施態様の多くの均等物を認識するか、または確認することができると予想される。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
;Oxford Univ. Press)に記載されている。タンパク質工学の一般原則は、Rickwoodら編(1995)Protein Engineering, A Practical Approach(Oxford Univ. PressにおけるIRL
Press、英国オックスフォード)に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原則は、Nisonoff(1984)Molecular Immunology(第2版;Sinauer Associates、マサ
チューセッツ州サンダーランド);およびSteward(1984)Antibodies, Their Structure
and Function(Chapman and Hall、ニューヨーク州ニューヨーク)に記載されている。
加えて、当業界において公知であり具体的に説明されていない免疫学の標準的な方法は、全般的に、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、ニューヨーク;Stitesら編(1994)Basic and Clinical Immunology(第8版;Appleton & Lange、コネチカット州ノーウォーク)ならびにMishellおよびShiigi(編)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H. Freeman and Co.、ニューヨーク)の記載に従う。
Immunology、John Wiley & Sons、ニューヨーク;Klein(1982)J.、Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(John Wiley & Sons、ニューヨーク);Kennettら編(1980)Monoclonal Antibodies, Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press、ニューヨーク);Campbell(1984)、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology中の「Monoclonal Antibody Technology」、Burdenら編(Elsevier、アムステルダム);Goldsbyら編(2000)Kuby Immunology(第4版;H. Freemand & Co.);Roittら(2001)Immunology(第6版;London:Mosby);Abbasら(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版;Elsevier Health Sciences Division);KontermannおよびDubel(2001)Antibody Engineering(Springer Verlan);Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press);Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall 2003);HarlowおよびLane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press);DieffenbachおよびDveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)が挙げられる。
[0160]以下の実施例は、例証のために提供されたものであり、限定のために提供されたものではない。
[0161]この実施例は、血液脳関門を通過するラクダ単一ドメイン抗体であるFC5由来の改善されたラクダBBB輸送体分子の構築を説明する。Stanimirovicら、J. Neurochem. 95:1201(2005)。FC5は、げっ歯類細胞とヒト脳内皮細胞の両方を認識する。FC5の結合標的は、2つの膜貫通ドメインを有するグリコシル化オーファン受容体であるTMEM30aであると報告されている。TMEM30aは3つのアイソフォームを有し、ほとんどの細胞型で普遍的に発現される。
らインキュベートし、30、60および90分後に下の区画中の新鮮な緩衝液を含む別のウェルに移した。下の区画からサンプルを収集し、ナノ−LC SRM質量分析によって分析した。ラット細胞株BBBモデルを通過する分子のトランスサイトーシスを測定するための方法が説明されている(Haqqani A. S.ら、Method. Mol. Pharmaceutics. 2013;10、1542〜1556)。初代ラット脳内皮細胞または不死化ラット脳内皮細胞株を通過する大
きい分子の輸送は、ナノ−LC SRM質量分析技術によって検出することができる。
[0165]この実施例は、Bbbt0241、すなわちFC5から開始したヒト化BBB輸送体分子の構築を説明する。
[0169]ヒト化FC5−scFvバリアントの最初のスクリーニングは、可溶性scFvを発現する大腸菌細胞の未精製ペリプラズム抽出物(ペリプラズム調製物)を使用した蛍光微量測定技術アッセイ(FMAT)によるスクリーニングを介してなされた(図3A)。これらのscFvを、検出抗体、すなわちscFvのC末端で6×HISタグと結合すると予想されるマウス抗HIS抗体、続いて抗HIS抗体を検出すると予想されるアレクサフルオロ647で標識した抗マウスIgGと共にそのままインキュベートした。次いでこの三次複合体を、同質溶液中でマウス(B.End3)由来の脳微小血管内皮(BMVEC)細胞株に添加し、インキュベートした。細胞表面上で受容体と結合したScFvを、陽性結合事象をもたらす細胞周辺の蛍光シグナルの濃度として読み取った。図3Bに、Bbbt0241に関するFMATアッセイの結果を示す。
を大腸菌TG1細胞中で培養し、1mMイソプロピルβ−D−1−チオガラクトシド(IPTG)で発現を誘導して、50mMトリス−HCl、0.5mMのEDTA、500mMスクロース(TES)のpH7.4の緩衝液を使用した浸透圧性ショックによって、およびNi2_−ニトリロ三酢酸クロマトグラフィーでのC末端His−タグの捕獲によって、scFvタンパク質をペリプラズムから単離した。次いで単離されたプラスミドを再び発現させ、ニッケルカラム上での標準的なHIS精製手順によって精製した。マウスB.End3細胞株を公知の濃度の精製scFvと共に使用したFMATアッセイで、「ヒット」の結合を確認した。さらに、B.End3細胞への結合に関してヒト化FC5 hIgGのFC5 DAbと競合する能力を競合FMATアッセイで試験した。図3Cは、一定濃度のFC5 DAbおよび増加する濃度の競合物質hIgG1、例えばBbbt0241を使用した競合FMATアッセイにおけるB.End3細胞の顕微鏡写真を示す。CEA6は、陰性対照hIgG1である。図3Dは、競合を定量的に示すグラフである。次いで確認された「ヒット」を、他の種、例えばラットおよびカニクイザル由来のBMVECへの結合に関して試験した。ヒト化FC5バリアントの元のスクリーニングから、scFv Bbbt0241をリード候補として同定した。Bbbt0241の配列は、配列番号1〜18および199として提示される(表2)。
を全脳サンプルに添加し、次いでそれらを、10mLのポッターエルベージェムモルタルタイプガラスホモジナイザーで、PTFE乳棒を用いて、2×10回の時計回りのストロークと5秒の休止時間を使用してホモジナイズした。未加工の脳ホモジネートのアリコートをパッカード(Packard)306サンプルコンバスターで燃焼させ、放射活性レベルを測定し、これを使用してサンプル加工後の放射活性の回収率を計算した。
レベル1:眼窩外の涙腺
レベル2:眼窩内の涙腺
レベル3:ハーダー腺/副腎
レベル4:甲状腺
レベル5:脳および脊髄。
[0180]マウス脳内皮(B.End3)細胞を使用して競合細胞表面選択を実行し、Bbbt0241およびFC5と競合するか、またはそれと類似の結合特性を有する追加のファージディスプレイライブラリーから、ファージディスプレイされたscFvを同定した。3つのナイーブライブラリーをスクリーニングした。洗浄剤、例えば2%ホルムアルデヒド、続いてPBS中の0.2%トリトンの添加によりB.End3細胞を室温で15分間破裂させ、室温で15分間インキュベートし、その後細胞を遠沈させ、PBSで洗浄し、これをFC5/Bbbt0241抗原のより大きいプールと接触できるようにすることによって、FC5/Bbbt0241標的抗原に結合するscFvの濃縮にとってより優れた条件をもたらした。細胞を破裂させた後、細胞を上述したファージライブラリーと共に室温で1〜2時間インキュベートした。その後細胞をPBSで最大10回洗浄して、細胞から全ての未結合のまたは弱く結合したファージ粒子を除去した。その後、洗浄した細胞にBbbt0241 hIgGを添加し、再度1〜2時間インキュベートし、このIgGを細胞に結合させ、選択から結合したscFvを競合解離させた。細胞を2000rpmで遠沈し、上清を採取し、これを使用して増殖中のTG1細胞に感染させた。競合溶出選択を複数回繰り返して実行して、Bbbt0241と同じまたは類似のエピトープに結合するscFvを濃縮した。
、J. Mol. Biol. 2009;393;672〜692。
[0188]FC5模倣剤およびFC5様非模倣剤を、追加のインビトロおよびインビボのアッセイによって特徴付けた。ヒットを、サイプロオレンジ(Sypro orange)標準方法(Ericssonら、2006 Analytical Biochemistry 357、289〜298頁)に従って熱安定性に関して試験し、さらに可能性のあるN結合型またはO結合型糖付加または脱アミド化部位などの配列の信頼性に関して試験した。実施例3で説明されるようなマウス脳内皮細胞株B.end3への結合に関するscFvヒットの試験に加えて、以下のFMAT方法により、scFvをB.end3細胞への内在化に関して試験した。これまでに述べられたような結合FMATアッセイと同様にして、ただし以下ようにプロトコールを変更して内在化FMATを実行した。FMATを37℃で実行し、抗マウス検出抗体はCypHer5Eで標識し、0.1%BSAを含有するリンゲルHEPES緩衝液で実行した。FC5模倣剤およびFC5様非模倣剤を、hIgG様式で、初代ラット脳内皮細胞(RBEC)、初代カニクイザル脳内皮細胞への結合に関して、さらにヒトD3細胞への結合に関して試験した。
ラット利尿モデル
[0191]BBBを通過して鎮痛剤を含むペイロードを輸送することにおける本開示の輸送体ポリペプチドの効能を、以下のようにラット利尿モデルを使用して実証した。
プチドは、動物において末梢で制限され、BBBを通過することができない。しかしながら、BBB標的部分にカップリングされたダイノルフィンペプチドは、BBBを通過して送達され、疼痛の緩和をもたらすことができた。
、およびBbbt0654のIgG型を投与した際に観察された、ビヒクルを超える尿排出量の有意な増加を示す。IgG化合物を体重1kg当たり4mlで投与した。図7B、図7Cおよび図7Dは、対照と比較した異なる用量のBbbt0626 hIgGの作用を示す(用量は、グラフ上においてmg/mlで示される)。結果から、ダイノルフィンにコンジュゲートしたBbbt0626の用量に伴い作用が増加することが示される。それに続くアッセイから、表3に記載のFC5模倣剤の全ておよび表4に記載のFC5非模倣剤の全てが、利尿モデルにおいて陽性であったことが実証された(データ示さず)。
[0195]神経因性疼痛は、中枢神経が介在することから、疼痛の緩和をもたらすためには、薬物をCNSに到達させなければならない。神経因性疼痛モデルはすでに説明されており(Seltzer Zら、Pain 43:205〜218(1990))、それによれば、マウスの1本の脚の坐骨神経を部分結紮し、結果として損傷した脚において脚の圧痛の閾値を低下させる。鎮痛薬は、CNSに到達することができれば、疼痛を低減すると予想され、脚の圧力比は、より等しくなると予想される。図8に、モデルの概略図を示す。
るにはクモ膜下に送達しなければならない。しかしながら、BBB標的化部分にカップリングされたIL−1Raは、i.v.投与後、BBBを通過して送達されて、疼痛の緩和をもたらすことができた。
Claims (21)
- 単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体は免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−1(H−CDR1)、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−2(H−CDR2)、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域−3(H−CDR3)、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−1(L−CDR1)、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−2(L−CDR2)、および免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域−3(L−CDR3)を含み;H−CDR1、H−CDR2、H−CDR3、L−CDR1、L−CDR2、およびL−CDR3がそれぞれ、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号30、配列番号31、および配列番号32を含み、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、血液脳関門を通過することができる輸送体分子である、上記抗体または抗原結合フラグメント。
- VHは配列番号20を含み、VLは配列番号29を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- インビトロのトランスサイトーシスアッセイにおいて、FC5より効果的に脳微小血管内皮細胞BMVECを通過することができる、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- IgG定常ドメインまたはそれらのフラグメントが、野生型IgG定常ドメインと比較して、1つまたはそれより多くのアミノ酸置換を含み、ここで改変されたIgGは、該野生型IgG定常ドメインを有するIgGの半減期と比較して、FcRnに関する増加した半減期および/または増加した結合親和性を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- IgG定常ドメインまたはそれらのフラグメントが、野生型IgG定常ドメインと比較して、1つまたはそれより多くのアミノ酸置換を含み、ここで改変されたIgGは、該野生型IgG定常ドメインを有するIgGの半減期と比較して、低減したエフェクター機能および/または少なくとも1つのエフェクター分子への低減した結合を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはそのフラグメントが、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、Fvフラグメント、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab’フラグメント、dsFvフラグメント、scFvフラグメント、sc(Fv)2フラグメント、またはそれらの任意の組合せである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 連結されたペイロードをさらに含み、ここで前記輸送体分子は、血液脳関門を通過して該ペイロードを輸送することができる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、前記ペイロードが、ペプチド結合を介して、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに融合されていてもよく、あるいは、前記ペイロードが、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドに化学的にコンジュゲートされていてもよい、上記抗体または抗原結合フラグメント。
- 前記ペイロードが、抗微生物剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生体応答調整物質、医薬物質、リンホカイン、異種抗体もしくはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール(PEG)分子、または上記薬剤の2種以上の組合せを含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記ペイロードが、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、パラクリン因子、視床下部放出因子、神経伝達物質ポリペプチド、CNS細胞によって発現される受容体に関するポリペプチドアゴニスト、およびリソソーム蓄積症に関与するポリペプチドからなる群より選択される神経刺激性のポリペプチドを含む、請求項8に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、前記ペイロードは、IL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)、ダラージン、インターフェロン−β、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−4/5、ニューロトロフィン(NT)−3、ニュールツリン、ニューレグリン、ネトリン、毛様体神経栄養因子(CNTF)、幹細胞因子(SCF)、セマフォリン、肝細胞増殖因子(HGF)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)−cx、TGF−B、血管内皮増殖因子(VEGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、ヘレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球−コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球マクロファージ−CSF、カルジオトロフィン−1、ヘッジホッグ、白血病抑制因子(LIF)、ミッドカイン、プレイオトロフィン、エリスロポイエチン(EPO)、骨形成タンパク質(BMP)、ネトリン、サポシン、あらゆるそれらのフラグメント、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい、上記抗体または抗原結合フラグメント。 - 前記ペイロードが、異種抗体またはそれらのフラグメントを含む、請求項8に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、前記異種抗体またはそれらのフラグメントが、ベータ−セクレターゼ1(BACE1)、CD20、CD25、CD52、CD33、CTLA−4、テネイシン、アルファ−4(a4)インテグリン、IL−12、IL−23、IL−12/IL−23のp40サブユニット、アミロイド−13(AI3)、ハンチンチン、神経成長因子(NGF)、上皮増殖因子受容体(EGFR/HER1)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2/neu)、血管内皮増殖因子(VEGF)、TrkA、TNF−a、TNF−13、α−シヌクレインタウ、アポリポタンパク質E4(ApoE4)、プリオンタンパク質(PrP)、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)、パーキン、プレセニリン1、プレセニリン2、ガンマセクレターゼ、死受容体6(DR6)、アミロイド前駆タンパク質(APP)、p75ニューロトロフィン受容体(p75NTR)、カスパーゼ6、神経栄養因子および/または神経栄養因子受容体の1つ以上に特異的に結合するものであってもよい、上記抗体または抗原結合フラグメント。 - 脳微小血管内皮細胞(BMVEC)に結合することができる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、前記BMVECが、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、またはウシBMVECであってもよい、上記抗体または抗原結合フラグメント。
- 前記BMVECが、脳毛細血管内皮細胞(BCEC)である、請求項11に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および担体を含む組成物。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項14に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項15に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの作製方法であって、(a)請求項16に記載の宿主細胞を培養すること;および(b)前記抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することを含み、さらに、(c)前記抗体またはその抗原結合フラグメントをペイロードにコンジュゲートすることを含んでもよい、上記方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項13に記載の組成物、請求項14に記載のポリヌクレオチド、請求項15に記載のベクター、または請求項16に記載の宿主細胞を含むキット。
- 中枢神経系(CNS)の疾患、障害、または傷害を処置する方法における使用のための請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントは処置が必要な対象に投与され、
該抗体または抗原結合フラグメントは、血液脳関門を通過して輸送された後にCNSに曝露されると該疾患、障害、または傷害を処置することが可能な治療剤を含み、該疾患、障害、または傷害を処置するのに十分な該治療剤の量が血液脳関門を通過して輸送されることにより、該疾患、障害、または傷害を処置し、
ここで、CNSの前記疾患、障害、または傷害が、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、神経因性疼痛、神経変性、神経炎症、進行性多巣性白質脳病(PML)、脳脊髄炎(EPL)、橋中心髄鞘崩壊症(CPM)、副腎白質ジストロトフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス−メルツバッハー病(PMZ)、グロボイド細胞白質ジストロフィー(クラッベ病)、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、急性虚血性視神経症、ビタミンE欠乏症、ビタミンE単独欠乏症候群、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ベル麻痺、原発性腫瘍、二次転移、またはあらゆるそれらの組合せを含むことができる、上記抗体または抗原結合フラグメント。 - 前記治療剤が、CNSへの侵入後に輸送体分子から放出される、請求項19に記載の使用のための抗体または抗原結合フラグメント。
- 血液脳関門を通過して薬剤を輸送することができる医薬を製造する方法であって、輸送体分子がそれらにカップリングされた薬剤を血液脳関門を通過して輸送するように、該薬剤を、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントにカップリングすることを含む、上記方法。
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