JP2017522886A - ヒト由来抗ハンチンチン（ｈｔｔ）抗体及びその使用 - Google Patents

ヒト由来抗ハンチンチン（ｈｔｔ）抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

新規なヒト由来抗ハンチンチン（ＨＴＴ）抗体及びその生物工学誘導体、好ましくは、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種並びに／或いはそれらのフラグメントと結合することができる新規なヒト由来抗ハンチンチン（ＨＴＴ）抗体及びその生物工学誘導体、同様にまた、それらに関連づけられる方法が提供される。このヒト由来抗ＨＴＴ抗体及び生物工学誘導体は、ハンチントン病のＨＴＴ標的化免疫療法及びその診断のための医薬組成物及び診断組成物において使用することができる。

Description

本発明は一般には、ハンチンチン（ＨＴＴ）に関連するハンチントン病（ＨＤ）の、抗体に基づいた治療に関連する。具体的には、本発明は、そのような病原的ＨＴＴアイソフォームによって誘発される疾患及び状態を処置することにおいて有用である、ヒトＨＴＴ及び／又はその抗原に特異的に結合する新規な分子（特に、ヒト由来抗体、同様にまた、そのＨＴＴ結合性フラグメント、合成及び生物工学誘導体）に関連する。
加えて、本発明は、ＨＴＴ凝集に伴う疾患及び／又は障害を特定するための診断ツールとして、また、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患に関連づけられる障害を処置するための受動的ワクチン接種戦略として両方で有益であるそのようなＨＴＴ結合性分子、抗体及びそれらの模倣体を含む医薬組成物及び診断組成物に関連する。
ハンチントン病（ＨＤ）は常染色体優性の神経学的なアミロイド形成性の疾患である。１００，０００人あたり５人〜１０人がこの常染色体疾患に冒される。しかしながら、合衆国における有病率ははるかに大きく、様々な研究により、２００，０００人の米国人に基づいて、５０％が、ＨＤを発症する危険性を有し、具体的には、３０，０００人の患者が米国では登録され、その一方で、ほんの１００，０００人の患者が世界中では登録されているだけであることが示されている。
ＨＤは、いくつかの研究において示されるように、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子における、具体的には第４染色体に位置するＨＴＴ遺伝子のエクソン１におけるトリヌクレオチドＣＡＧ反復伸長（これはＨＴＴタンパク質においてポリグルタミン（ポリＱ）延伸領域に翻訳される）から生じている（非特許文献１）。このポリＱ域が長さで３５個〜４０個のグルタミン残基の閾値を超えると、ＨＤが生じており、この場合、反復長さと疾患発症年齢との間に強い逆相関がある。このポリＱ延伸領域により、ＨＴＴの誤った折り畳み及び凝集がいくつかの領域において、例えば、ニューロン及びグリア細胞において引き起こされる。加齢とともに、ＨＴＴ凝集物の蓄積が生じ、これにより、線条体のＧＡＢＡ作動性ニューロン及び皮質の錐体ニューロンの変性が引き起こされる。ＨＴＴの誤った折り畳み及び凝集の症状には、不随意運動、運動協調性の喪失、うつ病、認知低下（例えば、記憶喪失など）及び／又は認知症が含まれる。
ＨＤ変異が特定された１９９３年以降、この疾患の病態生理学及び分子生物学の理解が著しく改善されている。様々な医薬品、例えば、Ｘｅｎａｚｉｎｅ（登録商標）（テトラベナジン、Ｌｕｎｄｂｅｃｋ）、すなわち、ヘキサヒドロ−ジメトキシ−ベンゾキノリジン誘導体のＶＭＡＴ２阻害剤などが、不随意筋運動を標的とする対症療法のために設計されていた。
加えて、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などの様々な遺伝子サイレンシング取り組みが、可能性のある治療法として示唆されている。具体的には、ＨＴＴ遺伝子に対するｓｉＲＮＡがＨＤマウスモデル（Ｒ６／２）において使用された場合、変異ＨＴＴ遺伝子の発現が阻害されることが示された；例えば、非特許文献２、及び、非特許文献３を参照のこと。しかしながら、この方法の１つの制限が、例えば、非特許文献４によって示されるように、十分な量のｓｉＲＮＡを標的細胞又は標的組織に導入することが困難であることにある。そのうえ、この取り組みは安全性での責務に直面する場合がある。これは、ハンチンチンの発現のために継続して必要であることが動物モデル及び培養細胞における遺伝子欠失研究によって示唆されたからである（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
したがって、変異ＨＴＴによるアミロイド形成を好ましくは直接的に妨げる、ＨＴＴ凝集に伴う疾患の有効かつ安全な治療のための新規な治療戦略が求められている。
この技術的課題が、請求項において特徴づけられ、そして、さらには下記で記載され、また、実施例及び図面において例示される実施形態によって解決される。
ＭａｃＤｏｎａｌｄ他、Ｃｅｌｌ ７２（１９９３）、９７１〜９８３ Ｗａｒｂｙ他、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．８４（２００９）、３５１〜３６６ Ｏｌｓｈｉｎａ他、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５（２０１０）、２１８０７〜２１８１６ Ｂｏｕｄｒｅａｕ他、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３３８（２０１０）、１１２〜１２１ Ｄｒａｇａｔｓｉｓ他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６（２０００）、３００〜３０６； Ｇａｕｔｈｉｅｒ他、Ｃｅｌｌ．１１８（２００４）、１２７〜１３８ Ｚｕｃｃａｔｏ他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３５（２００３）、７６〜８３
本発明は、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び状態の予防的処置又は治療的処置において使用されるための抗ハンチンチン（ＨＴＴ）抗体及び同等なＨＴＴ結合性分子を提供する。より具体的には、ＨＴＴの変異した形態及び／又は凝集した形態を認識する治療的に有用なヒト由来抗体、同様にまた、そのＨＴＴ結合性フラグメント、合成及び生物工学誘導体が提供される。
具体的には、本発明に従って行われた実験は、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種並びに／或いはそれらのフラグメントについて特異的であるヒト由来のモノクローナルなＨＴＴ特異的抗体の組換えクローニング及び組換え産生に成功した。ヒト由来のモノクローナルな抗ＨＴＴ抗体の可変ドメインをそれぞれコードするｃＤＮＡが単離されたＢ細胞の供給源であるヒト対象は健常者ドナーであった。しかしながら、本発明の別の実施形態において、ヒト由来のモノクローナルな抗ＨＴＴ抗体と、それらの可変ドメインをコードするｃＤＮＡとがそれぞれ単離され得るＢ細胞の供給源は、トリヌクレオチドＣＡＧ反復伸長をＨＴＴ遺伝子において有し、かつ、症状を有しないＨＤ患者、或いは、異常に遅い進行若しくは安定な疾患経過を示す、又は、代替では、ハンチントン病の典型的な臨床特徴を示すＨＤ患者である。そのうえ、実施例において明らかにされるように、本発明の抗体は、ＨＤのマウスモデルにおいて、樹状突起棘の喪失を弱めることができ、課題特異的訓練の期間中における行動成績を改善し、かつ、感覚運動能を高める。したがって、本発明のヒトモノクローナル抗ＨＴＴ抗体及びその誘導体は、非免疫原性であることに加えて、ヒトにおける治療的に有益な効果もまた示すことを予想することは賢明なことである。
背景の節において記載されるように、従来、ＨＤの病理発生は、細胞内アプローチによって、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などによって阻止することが試みられてきた；例えば、変異ハンチンチンをアデノ関連ウイルス媒介のＲＮＡ干渉によってサイレンシングさせることについて、Ｓｔａｎｅｋ他、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５（２０１４）、４６１〜４７４もまた参照のこと。免疫療法アプローチに関して、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の細胞内発現、すなわち、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンなど）の定常領域を欠く細胞内抗体の細胞内発現が、この１０年の間に調べられている。例えば、変異ハンチンチン及び関連した毒性細胞内タンパク質を打ち消すための操作された細胞内ｓｃＦｖ抗体療法及び単一ドメイン（ｄＡｂ；ナノボディー）抗体療法については、上掲、及び、Ｂｕｔｌｅｒ他、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９７（２０１２）を参照のこと。
例えば、Ｌｅｃｅｒｆ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８（２００１）、４７６４〜４７６９）は、大きいヒトファージディスプレーから選択されるＨＤエクソン１内のポリグルタミンに隣接するハンチンチンの１７個のＮ末端残基に対して特異的である単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体を記載する。対応するｓｃＦｖ抗体、すなわち、ラムダ可変軽鎖（ＶＬ）を含むｓｃＦｖ−Ｃ４（Ｋｖａｍ他、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（２００９）、ｅ５７２７；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＣＡ５３３７３）が、Ｂ６．ＣｇＨＤＲ６／１遺伝子導入マウス（ＨＤマウスモデル）においていくらかの神経保護効果を有すること、しかしながら、この神経保護効果が注入時における疾患の重篤度とともに弱まったことが記載される。この細胞内抗体の定常レベルを改善するために、また、ｓｃＦｖ−Ｃ４が結合したＮ末端側のｈｔｔエクソン１（ｈｔｔｅｘ１）タンパク質フラグメントを、凝集しないようにするために分解のためのプロテアソームに導くために、マウスオルニチンデカルボキシラーゼ（ｍＯＤＣ）ｍＯＤＣのＰＥＳＴシグナル配列がｓｃＦｖ−Ｃ４抗体に融合された；Ｂｕｔｌｅｒ及びＭｅｓｓｅｒ、ＰＬｏｓ Ｏｎｅ ６（２０１１）、ｅ２９１９９を参照のこと。インビボ実験は何ら未だ報告されていない。
同様に、Ｋｈｏｓｈｎａｎ他のグループが、細胞内抗体に基づく治療剤をＨＤのために開発することを目指していた。このグループはとりわけ、エピトープであるポリグルタミン（ポリＱ）、ポリプロリン（ポリＰ）及び抗Ｃ末端と結合するマウスモノクローナル抗体に由来する抗ハンチンチンｓｃＦｖ抗体、並びに、変異ハンチンチンの凝集及び毒性に対する細胞内発現時のそれらの影響を記載する；例えば、Ｋｏ他、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６（２００１）、３１９〜３２９、Ｋｈｏｓｈｎａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９９（２００２）、１００２〜１００７、並びに、Ｌｅｇｌｅｉｔｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（２００９）、２１６４７〜２１６５８、及び、Ｌｅｇｌｅｉｔｅｒ他の特許出願（米国特許出願公開第２００３／０２３２０５２Ａ１）を参照のこと。この米国特許出願ではまた、「ｈＭＷ９」と称される「ヒト」ｓｃＦｖ抗体が、組換えによる変異ハンチンチンタンパク質を使用してヒトｓｃＦｖファージライブラリーから単離されたと記載される。しかしながら、モノクローナルなマウス由来のｓｃＦｖ ＭＷ１、ＭＷ２、ＭＷ７及びＭＷ８とは対照的に、配列データがｈＭＷ９については何ら提供されておらず、ｈＭＷ９もまた、繰り返しになるが、これまで報告されていない。
Ｃｏｌｂｙ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３４２（２００４）、９０１〜９１２）は、非免疫性ヒト抗体ライブラリーの酵母表面ディスプレイを介した、ハンチンチンのアミノ末端について特異的であるヒト軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）細胞内抗体の開発を記載する。元のｓｃＦｖのラムダ軽鎖ドメインのみからなるこの単一ドメイン細胞内抗体は、ハンチンチンの凝集を無細胞インビトロアッセイにおいて、同様にまた、ＨＤの哺乳動物細胞培養モデルにおいて阻害することが記載された；対応する国際特許出願公開ＷＯ２００５／０５２００２もまた参照のこと。繰り返しになるが、インビボ実験は何ら未だ報告されていない。
したがって、明らかに、現在の細胞内抗体に基づく取り組みは、細胞に基づくアッセイを超えて広がっていなかったか、又は、ＨＤの動物モデルにおいて成功していることを未だ証明していなかった（少なくとも長期実験において証明していなかった）かのどちらかである。具体的には、様々な細胞内抗体により、細胞内抗体−抗原複合体の細胞内／核内蓄積に起因するそれらの潜在的毒性、又は、例えば、ヒトにおける大きい脳体積へのウイルス送達の限定された分布などのインビボでのいくつかの制限が明らかにされる；例えば、Ｂｕｔｌｅｒ他、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９７（２０１２）、１９０〜２０４、及び、Ｓｏｔｈｗｅｌｌ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９（２００９）、１３５８９〜１３６０２を参照のこと。そのうえ、細胞内アプローチの一般的な難点が、抗体及び抗体をコードするベクターＤＮＡを所望の細胞にそれぞれ向けるという問題であり、そして、外部から適用されるならば、不便な投与法（例えば、線条体内注入）である；例えば、Ｓｎｙｄｅｒ−Ｋｅｌｌｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９（２０１０）、１０７８〜１０８５を参照のこと。加えて、遺伝子治療と、ウイルスベクターの使用とに関する一般的な懸念が残っている。
対照的に、本発明に従って行われた実験で初めて、ＨＤマウスモデルにおいて、ハンチンチンの種々のエピトープに対する全長型ＩｇＧ抗体が全身投与時には脳に首尾よく送達され得ることが明らかにされ（実施例２４及び図１８）、また、本発明の抗体は樹状突起棘の喪失を弱めることができ、課題特異的訓練の期間中における行動成績を改善し、かつ、感覚運動能を高めることが明らかにされる（実施例３４及び図３４）。
したがって、実施例において例示されるように、抗ＨＴＴ抗体或いはそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体は好ましくはＩｇＧクラスのものであり、一般に知られているように、また、本明細書中に記載されるように、２つの同一の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド及び２つの同一の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドと、定常領域及び定常ドメインとをそれぞれ含む（すなわち、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の少なくとも１つ又はすべてを含む）。言い換えれば、本発明の１つの態様において、ハンチンチンについて特異的である組換え発現された二価抗体並びにその凝集型形態、フラグメント、ペプチド及び誘導体であって、ハンチンチン及びハンチンチンに関連する障害の処置又はインビボ診断における使用のために好適であるもの（これは免疫グロブリンの定常領域の存在によって特徴づけられる）が提供される。本明細書中下記においてさらに記載されるように、免疫グロブリンは、どのようなクラスのものであってもよく（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥなど）、また、どのような対応する免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）のものであってもよい（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１）。しかしながら、好ましくは、抗体はヒトＩｇＧサブタイプのものである。
加えて、同様に本明細書中においてさらに説明されるように、本発明のヒト由来抗体は、ヒト起源の少なくとも１つ又は複数のＣＤＲを含むことによって、すなわち、ヒトメモリーＢ細胞に由来するｃＤＮＡによってコードされることによって特徴づけられ、そして、好ましくはこの場合、ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖もまた、ヒトメモリーＢ細胞起源のものである。定常領域又はそのドメインも、ヒト型であるならば、それぞれ、ＣＤＲ並びにＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖と同じ起源であっても又は異なる起源のものであってもよい。
この関連において、別途言及される場合を除き、又は、文脈から明らかである場合を除き、本発明の抗体に対する本明細書中における言及には、実施例において例示されるヒト由来抗体、同様にまた、そのＨＴＴ結合性フラグメント、合成及び生物工学誘導体が含まれる。
ヒトｓｃＦｖファージライブラリーに由来する細胞内抗体を提供するという先行技術の取り組みからさらに認められ得るように、ほとんど常に、Ｖラムダ起源の可変軽鎖を有するｓｃＦｃｖが得られた；Ｋｖａｍ他及びＣｏｌｂｙ他（上掲）を参照のこと。対照的に、本発明のヒト由来抗体の９０％超で、Ｖカッパ軽鎖が使用され、このことはまた、抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１及び抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１にもあてはまり、この場合、これらの抗体はＨＤ動物モデルにおいて、全身投与時には脳に浸透することができることが実施例２４において例示され、そして、行動成績及び運動関連課題に対する有益な影響を有することが実施例３４において例示される（ＮＩ−３０２．３５Ｃ１）。したがって、Ｖカッパ軽鎖を有する抗体は、Ｖラムダ起源の軽鎖を有する抗体を上回る優れた性質を有するかもしれないとの推測を促す。したがって、本発明の抗体の好ましい実施形態において、可変軽鎖はＶカッパ起源のものである。
実施例及び図において例示されるように、抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性フラグメント、それらの合成及び生物工学変異体は、実施例において示されるように、上記のような「毒性」変化を示す、すなわち、伸長した不安定なトリヌクレオチド反復を示すＨＴＴエクソン１タンパク質の種々の領域に結合する。具体的には、本発明の抗体は、ＨＴＴエクソン１タンパク質のポリＰ領域、ポリＱ／Ｐ領域、Ｐリッチ領域、Ｃ末端領域又はＮ末端領域を認識する。実施例において例示される主題抗体のエピトープが図２０にまとめられる。背景の節において述べられるように、ポリＱ域が長さで３５個〜４０個のグルタミン残基の閾値を超えるとき、ＨＴＴの凝集に起因して、ＨＤが生じる。したがって、実施例３で示されるように、２１回、３５回又は４９回のポリＱ反復を有する凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質及び可溶性のＨＴＴエクソン１タンパク質が作製され、特定された抗体の結合が調べられた。下記では、これらの構築物がＨＤＸ（ただし、ＸはＱの数である）として示される。例えば、２１回のポリＱ反復を有するＨＴＴエクソン１はＨＤ２１として示される。したがって、別途具体的に示されない限り、ＨＴＴという用語はＨＴＴエクソン１を意味し、可溶性ＨＴＴは、その対応するＧＳＴ融合タンパク質を示す。
本発明の好ましい実施形態において、抗ＨＴＴ抗体或いはそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体は、ＨＴＴの凝集した形態又はミスフォールドした形態と優先的に結合することができる。例えば、Ｌｅｇｌｅｉｔｅｒ他（ＪＢＣ ２８５（１９）（２０１０）、１４７７７〜１４７９０）に記載されるように、また、実施例において明らかにされるように、速度及びサイズに関してのＨＤＸタンパク質の凝集がＱの数とともに増大する。
本発明の特に好ましい実施形態において、抗ＨＴＴ抗体或いはそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成及び生物工学誘導体により、図１に示される可変領域ＶＨ及び／又は可変領域ＶＬのいずれか１つによって特徴づけられる抗体の免疫学的な結合特性が明らかにされる。好ましくは、抗体の可変領域は、可変領域のＶＨ及び／又はＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、図１Ａ〜図１ＡＵに示される少なくとも１対のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含み、ただし、この場合、生じる抗体の結合特異性が、実施例において例示されるように、例えば、図２０にまとめられるように図１Ａ〜図１ＡＵに示される対応する対のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む主題抗体と比較して、本質的に影響されないままである限り、すなわち、エピトープ特異性及びＥＣ５０値が、示された抗原について同じ程度の大きさであり、好ましくは少なくとも５０％の範囲で、より好ましくは２５％の範囲で、最も好ましくは少なくとも１０％の範囲で、同一の値である限り、１つ又は複数のアミノ酸置換が許される。好ましくは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の１つのＣＤＲ、２つのＣＤＲ又は３つすべてのＣＤＲが、同じタイプのＨＴＴエピトープ（すなわち、ポリＰ、Ｐリッチ、Ｃ末端又はＮ末端）を認識する主題抗体のＶＨ鎖アミノ酸配列及びＶＬ鎖アミノ酸配列におけるそれぞれ少なくとも約２０％において、好ましくは約４０％において、より好ましくは約５０％において、最も好ましくは約７５％において、対応する位置に、保存された少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、同じアミノ酸又は保存的置換アミノ酸）を含む。例えば、主題抗体の配列アラインメントにより、１つ又は２つのチロシン（Ｙ）がＣＤＲＨ１において優勢に存在することが明らかにされる；図３６を参照のこと。類似する保存されたアミノ酸を他のＣＤＲにおいて同様に特定することができる。
本発明のさらなる実施形態において、抗ＨＴＴ抗体或いはそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体は二重特異性抗体である。したがって、本発明の抗体は、同じ抗原における、又は異なる抗原における、そのどちらかで少なくとも２つの異なったエピトープを認識することができる場合がある。例えば、第１の抗原結合部位（すなわち、可変ドメイン）がＨＴＴについて特異的である場合があり、かつ、好ましくは、添付された実施例及び図において例示される主題抗体のいずれか１つの可変領域を含むが、第２の抗原結合部位が、異なるタンパク質について、好ましくは、神経毒性タンパク質についてもまた特異的である場合があり、かつ、対応する抗体の可変領域を含む場合がある。したがって、タンパク質の誤った折り畳み及び凝集が神経変性障害（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及びＨＤなど）の主要な特徴である。最近までは、一致した考えは、それぞれの凝集しやすいタンパク質がそれぞれの障害に特徴的であるというもの［α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）／ＰＤ、変異ハンチンチン（ＨＴＴ）／ＨＤ、タウ及びアミロイドベータペプチド／ＡＤ］であったにもかかわらず、増大しつつある証拠は、凝集しやすいタンパク質は実際に共凝集して、互いの挙動及び毒性を変化させ得ることを示しており、このことは、このプロセスもまた、種々の疾患にわたる臨床症状における重複の一因であるかもしれないことを示唆している；例えば、α−ｓｙｎと変異ＨＴＴとの共凝集については、Ｐｏｃａｓ他、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２４（２０１５）、１８９８〜１９０７を参照のこと。
したがって、本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体或いはそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体は、ＨＴＴ及び神経変性障害に関連するタンパク質（特に脳における神経変性障害関連タンパク質、好ましくは、α−シヌクレイン、タウ、アミロイドベータペプチド、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２及びＴＤＰ−４３からなる群から選択される神経変性障害関連タンパク質）と結合することができる二重特異性抗体である；例えば、Ｂｌｏｋｈｕｉｓ他、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２５（２０１３）、７７７〜７９４を参照のこと。述べられたタンパク質に対する様々なヒト由来モノクローナル抗体がこの技術分野では知られている；例えば、抗ａｂｅｔａ抗体については国際公開ＷＯ２００８／０８１００８を、抗α−シヌクレイン抗体については同ＷＯ２０１０／０６９６０３を、抗タウ抗体については同ＷＯ２０１２／０４９５７０を、抗ＳＯＤ１抗体については同ＷＯ２０１２／０８０５１８を、抗アンキリン抗体については同ＷＯ２０１２／１１３７７５を、抗ＴＤＰ−４３抗体については同ＷＯ２０１３／０６１１６３を、Ｃ９ｏｒｆ７２については欧州特許出願ＥＰ１４１８７１８０．６及びそのその後の国際特許出願を参照のこと。二重特異性抗体及び多重特異性抗体をこの技術分野ではよく知られている方法によって作製することができ、例えば、モノクローナルな免疫グロブリンＧ１フラグメントの化学的組換えを、例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２９（１９８５）、８１〜８３によって記載されるように行うことによって、又は、適切な重鎖及び軽鎖を組換えにより同時共発現し、対応する対を形成することによって作製することができる；例えば、Ｌｅｗｉｓ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０１４）、１９１〜１９８を参照のこと；総説については、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ｍＡｂｓ ４（２０１２）、１８２〜１９７を、また、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０（２０１５）、８３８〜８４７を参照のこと。
代替において、又は、加えて、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくとも第１及び第２の抗原結合部位、すなわち、ＨＴＴの２つの異なったエピトープについて特異的である可変ドメインを含み、ただし、好ましくはこの場合、一方又は両方の可変領域が、添付された実施例及び図において例示される主題抗体のいずれか１つに由来し、さらには本明細書中に記載される通りである。したがって、好ましい実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ＨＴＴエクソン１タンパク質のポリＰ領域、ポリＱ／ポリＰ領域、Ｐリッチ領域、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域又は立体配座エピトープを認識する抗体の２つの結合部位／ドメインを含む。実施例において例示される主題抗体のエピトープが図２０にまとめられる。したがって、１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、図２０に示される少なくとも２つの異なるエピトープを認識し、かつ、同族の主題抗体の組み合わされた結合特異性をそれぞれ有する。
本明細書中に開示される主題抗体のいずれか１つの抗原結合性フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、又は、どのような他の抗原結合性フラグメントであることも可能である。しかしながら、特に好ましい実施形態において述べられるように、抗体或いはそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体はヒトＩｇＧアイソタイプの抗体であり、定常領域の少なくとも一部を含む。代替において、抗体は、ヒト−齧歯類のキメラ抗体、又は、齧歯類化された抗体、例えば、マウス抗体又はマウス化抗体、ラット抗体又はラット化抗体などであり、齧歯類型が動物における診断方法及び研究のために特に有用である。
さらには、本発明は、本発明の抗体或いはその抗原結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体を含む組成物、並びに、ＨＴＴに関連する疾患及び／又は障害の防止、診断又は処置においてそのような組成物を使用する免疫治療方法及び免疫診断方法であって、有効量の組成物がその必要性のある患者に投与される方法に関連する。
本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記可変領域は、図１に示される可変領域のＶＨ及び／又はＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。好ましくは、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。
したがって、本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び、該ベクターにより形質転換される宿主細胞、同様にまた、ＨＴＴに対して特異的であり、かつ、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種又はそれらのフラグメントと好ましくは結合することができる抗体及び同等な結合性分子を製造するためのそれらの使用を包含する。抗体及びその模倣体を組換え産生するための様々な手段及び方法、同様にまた、競合する結合性分子（これは抗体であってもよく、又は抗体でなくてもよい）についてスクリーニングする様々な方法がこの技術分野では知られている。しかしながら、特にヒトにおける治療的適用に関して本明細書中に記載されるように、本発明の抗体は、前記抗体の適用が、キメラ抗体について、また、それどころか、ヒト化抗体について他の場合には認められるそのような抗体に対する免疫応答を実質的に有していないという意味で、ヒト抗体である。したがって、本発明はまた、抗ＨＴＴ抗体（具体的にはヒト由来抗ＨＴＴ抗体）又はその生物工学誘導体を製造するための、本明細書中に記載される、また、実施例において例示されるｃＤＮＡ、ベクター及び宿主細胞の使用に関連する。
さらに、本明細書中には、ＨＴＴ（具体的には、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種又はフラグメント）をインビトロにおいて、例えば、サンプルにおいて、及び／又はインビボにおいて特定するために使用することができる組成物及び方法が開示される。開示された抗ＨＴＴ抗体及びその結合性フラグメントは、ヒトの血液、血漿、血清、唾液、腹腔液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）及び尿を、例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ又は表面適合化アッセイを使用することによって、サンプル中のＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそれらのフラグメントの存在についてスクリーニングするために使用することができる。１つの実施形態において、本発明は、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそれらのフラグメントに関連づけられる疾患及び／又は障害を対象において診断する、又はその進行をモニターする方法であって、診断される対象から得られるサンプルにおける変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種又はフラグメントの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体又はＨＴＴ結合性分子、並びに／或いは、それらのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種又はフラグメントについての結合性分子を用いて明らかにすることを含み、ただし、この場合、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種又はフラグメントの存在が、当該障害の指標となる方法に関連する。
したがって、本発明はまた、ＨＴＴ凝集物に伴う、又はＨＴＴ凝集物によって引き起こされる障害の処置において使用するための医薬組成物を調製する方法であって、
（ａ）本発明のｃＤＮＡを発現させること、及び／又は、本発明の宿主細胞を、抗ＨＴＴ抗体（具体的にはヒト由来抗ＨＴＴ抗体）又はその生物工学誘導体の産生のために好適である適切な培養条件のもとで培養すること；
（ｂ）前記抗体、その生物工学誘導体又は免疫グロブリン鎖を反応混合物及び前記培養物から医薬品グレードにまでそれぞれ精製すること；及び
（ｃ）前記抗体又はその生物工学誘導体を薬学的に許容され得る担体と混合すること
を含む方法に関連する。
さらには、本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、及び、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＨＴＴ結合性分子が、ヒト又は動物の身体におけるＨＴＴ（具体的には、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種又はフラグメント）のインビボ検出（これはインビボ画像化とも呼ばれる）のための、或いは、治療剤及び／又は診断剤をヒト又は動物の身体においてＨＴＴ（具体的には、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種又はフラグメント）に対して標的化するための組成物を調製するために提供される。本明細書中に開示される方法及び組成物は、ＨＴＴの凝集又はアミロイドーシスが伴い、かつ、例えば、ＨＴＴの凝集した形態の出現によって特徴づけられる疾患及び／又は障害において助けとなることができ、また、疾患の進行と、対象に施される治療の治療効力とを、例えば、インビボ画像化に関連づけられる診断方法でモニターするために使用することができる。１つの実施形態において、インビボ検出（画像化）は、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
したがって、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は障害を処置するための方法、診断するための方法、又は防止するための方法を提供することが、本発明の具体的な目的の１つである。これらの方法は、有効濃度の好ましくはヒト抗体又はヒト抗体誘導体を対象に投与することを含み、ただし、この場合、抗体はＨＴＴ又はそのフラグメントを標的とし、好ましくは、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種又はミスフォールドしたＨＴＴ種或いはそれらのフラグメントを標的とする。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体によって特異的に認識されるＨＴＴのエピトープ（好ましくは、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそのフラグメントのエピトープ）を有するペプチドを提供する。前記ペプチドは、詳細な説明において、また、実施例において下記で示されるアミノ酸配列、又は、１つ若しくは複数のアミノ酸が置換され、欠失され、かつ／又は付加されるその改変された配列を含むか、或いは、そのようなアミノ酸配列又はそのような改変された配列からなる。加えて、本発明は、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は障害を対象において診断するための方法であって、前記ペプチドに結合する抗体の存在を前記対象の生物学的サンプルにおいて明らかにする工程を含む方法を提供する。
本発明のさらなる実施形態が下記の説明及び実施例から明らかであろう。
下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、ＮＩ−３０２．２Ａ２、ＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７Ａ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．３Ｄ８、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．８Ｆ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９、ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、ＮＩ−３０２．１５Ｅ８、ＮＩ−３０２．１５Ｄ３、ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、ＮＩ−３０２．７Ｄ８、ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０、ＮＩ−３０２．１２Ｈ２、ＮＩ−３０２．８Ｍ１及びＮＩ−３０２．４Ａ６。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれる。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。 ハンチンチン（ＨＴＴ）エクソン１タンパク質及び凝集物の特徴づけ。（Ａ）ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘ１Ｑ２１（ＧＳＴ−ＨＤ２１）、ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘ１Ｑ３５（ＧＳＴ−ＨＤ３５）及びＧＳＴ−ＨｔｔＥｘ１Ｑ４９（ＧＳＴ−ＨＤ４９）の各発現構築物のクローニング；（Ｂ）良好な純度を示し、しかし、いくつかのさらなるバンドもまた示す、精製されたＧＳＴタンパク質のみ（レーン１）、ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ２１タンパク質（ＧＳＴ−ＨＤ２１、レーン２）、ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ３５タンパク質（ＧＳＴ−ＨＤ３５、レーン３）タンパク質及びＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ４９タンパク質（ＧＳＴ−ＨＤ４９、レーン４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ時のクーマシー色素染色；（Ｃ）ポリクローナルＨＤ−１抗体を検出抗体として用いるドットブロット分析（左側）及びフィルター遅延分析（右側）による、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９のインビトロでの時間分解インビトロ凝集反応の特徴づけ。２４時間でのＨＤ３５の凝集反応液、又は、３時間後でのＨＤ４９反応液は、ＨＤ−１によって検出可能な０．２μｍの細孔サイズよりも大きい凝集物をフィルター遅延アッセイ分析において示す；（Ｄ）インビトロでのＨＤ３５調製物及びＨＤ４９調製物の電子顕微鏡法による特徴づけ。２４時間後でのＨＤ３５の凝集反応液［Ａ、Ｅ］、又は、ＨＤ４９反応液で、１時間後［Ｂ、Ｆ］、３時間後［Ｃ、Ｇ］若しくは２４時間後［Ｄ、Ｈ］。１０００ｘの倍率による概観写真［Ａ〜Ｄ］及び６６０００ｘの倍率による詳細構造［Ｅ〜Ｈ］。 抗ポリＰドメイン結合抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の結合親和性の特徴づけ。（Ａ）直接ＥＬＩＳＡによって決定される、種々のＨＴＴ種についてのＮＩ−３０２．３３Ｃ１１結合親和性；（Ｂ）直接ＥＬＩＳＡを使用する、凝集したＨＤ４９（●）、凝集したＨＤ２１（■）、可溶性ＧＳＴ−ＨＤ４９（▲）及び可溶性ＧＳＴ−ＨＤ２１（▼）のＨｔｔエクソン１タンパク質についてのＮＩ−３０２．３３Ｃ１１のＥＣ５０決定。ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体は、４つすべての種に対して類似するＥＣ５０値で結合する；（Ｃ）ドットブロットアッセイ（左側）及びフィルター遅延アッセイ（右側）による、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９のインビトロでの時間分解インビトロ凝集反応物でのＨＴＴ凝集物に対するＮＩ−３０２．３３Ｃ１１結合分析であり、優先的な結合が、ドットブロットアッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９のより後期の（凝集した）反応物に対して認められ、フィルター遅延アッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集物に対して認められる。 重複するペプチドのスキャンによるＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体結合エピトープの決定。上段：ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体とのハイブリダイゼーションの後におけるペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）画像。下段：ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体が結合するペプチド配列のグラフィカル概観図。ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体によって認識されているペプチドとペプチドとの間での重複するアミノ酸（推定的な結合エピトープ）がコンセンサス配列において太字で強調される。ＨＲＰコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ検出抗体は単独では、どのような線状ハンチンチンペプチドとも結合しない。 ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１はＨＴＴのポリＰドメインに結合する。直接ＥＬＩＳＡを使用する、ＧＳＴ−ＨＤ４９（●）、ＢＳＡカップリングされたＰリッチドメインペプチド（◆）、ＢＳＡカップリングされたＣ末端ペプチド（■）又はＢＳＡカップリングされたポリＰペプチド（▲）についてのＥＣ５０決定。 ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体の純度及び完全性並びに結合特異性の特徴づけ。２μｇ及び１０μｇの組換えヒトＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗ポリＰドメイン抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、その後のクーマシー染色。 抗プロリンリッチドメイン抗体ＮＩ３０２．６３Ｆ３の結合親和性の特徴づけ。（Ａ）直接ＥＬＩＳＡによって決定される、種々のＨＴＴ種についてのＮＩ−３０２．６３Ｆ３結合親和性。（Ｂ）直接ＥＬＩＳＡを使用する、凝集したＨＤ４９（●）、凝集したＨＤ２１（■）、可溶性ＧＳＴ−ＨＤ４９（▲）及び可溶性ＧＳＴ−ＨＤ２１（▼）のＨｔｔエクソン１タンパク質についてのＮＩ−３０２．６３Ｆ３のＥＣ５０決定。ＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体は、４つすべての種に対して類似するＥＣ５０値を有する；（Ｃ）ドットブロットアッセイ（左側）及びフィルター遅延アッセイ（右側）による、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９のインビトロでの時間分解インビトロ凝集反応物での抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の特徴づけであり、優先的な結合が、ドットブロットアッセイでは、伸長ポリＱ域を有するハンチンチンに対して認められ（ＨＤ４９＞ＨＤ３５）、フィルター遅延アッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集物に対して認められる。 重複するペプチドのスキャンによるＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体結合エピトープの決定。上段：ＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体とのハイブリダイゼーションの後におけるペプスキャン画像。下段：ＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体が結合するペプチド配列のグラフィカル概観図。ＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体によって認識されているペプチドとペプチドとの間での重複するアミノ酸（推定的な結合エピトープ）がコンセンサス配列において太字で強調される。ＨＲＰコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ検出抗体は単独では、どのような線状ハンチンチンペプチドとも結合しない。 ＮＩ−３０２．６３Ｆ３はＨＴＴのＰリッチドメインに結合する。直接ＥＬＩＳＡを使用する、ＧＳＴ−ＨＤ４９（●）、ＢＳＡカップリングされたＰリッチドメインペプチド（◆）、ＢＳＡカップリングされたＣ末端ペプチド（■）又はＢＳＡカップリングされたポリＰペプチド（▲）についてのＥＣ５０決定。 ＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体の純度及び完全性並びに結合特異性の特徴づけ。２μｇ及び１０μｇの組換えヒトＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗プロリンリッチドメイン抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、その後のクーマシー染色。 抗Ｃ末端ドメイン結合抗体ＮＩ３０２．３５Ｃ１の結合親和性の特徴づけ。（Ａ）直接ＥＬＩＳＡによって決定される、種々のＨＴＴ種についてのＮＩ−３０２．３５Ｃ１結合親和性；（Ｂ）直接ＥＬＩＳＡを使用する、凝集したＨＤ４９（●）、凝集したＨＤ２１（■）、可溶性ＧＳＴ−ＨＤ４９（▲）及び可溶性ＧＳＴ−ＨＤ２１（▼）のＨｔｔエクソン１タンパク質についてのＮＩ−３０２．３５Ｃ１のＥＣ５０決定；（Ｃ）ドットブロットアッセイ（左側）及びフィルター遅延アッセイ（右側）による、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９のインビトロでの時間分解インビトロ凝集反応物での抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の特徴づけであり、優先的な結合が、ドットブロットアッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９のより後期の（凝集した）反応物に対して認められ、フィルター遅延アッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集物に対して認められる。 ＮＩ−３０２．３５Ｃ１はＨＴＴのＢＳＡカップリングされたＣ末端ドメインペプチドに結合する。直接ＥＬＩＳＡを使用する、ＧＳＴ−ＨＤ４９（●）、ＢＳＡカップリングされたＰリッチドメインペプチド（◆）、ＢＳＡカップリングされたＣ末端ペプチド（◆）又はＢＳＡカップリングされたポリＰペプチド（▲）についてのＥＣ５０決定。 ＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗体の純度及び完全性並びに結合特異性の特徴づけ。２μｇ及び１０μｇの組換えヒトＮＩ−３０２抗Ｃ末端ドメイン抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、その後のクーマシー染色。 抗Ｎ末端ドメイン抗体ＮＩ３０２．１５Ｅ８の結合親和性の特徴づけ。（Ａ）直接ＥＬＩＳＡによって決定される、種々のＨＴＴ種についてのＮＩ−３０２．１５Ｅ８結合親和性；（Ｂ）直接ＥＬＩＳＡを使用する、凝集したＨＤ４９（●）、凝集したＨＤ２１（■）、可溶性ＧＳＴ−ＨＤ４９（▲）及び可溶性ＧＳＴ−ＨＤ２１（▼）のＨｔｔエクソン１タンパク質についてのＮＩ−３０２．１５Ｅ８のＥＣ５０決定。ＮＩ−３０２．１５Ｅ８抗体は、より大きい親和性結合ＥＣ５０値を凝集しなかった種に対して有する。 ＮＩ−３０２．１５Ｅ８はＨＴＴのＢＳＡ結合Ｎ末端ドメインペプチドに結合する。直接ＥＬＩＳＡを使用する、ＧＳＴ−ＨＤ４９（●）、ＢＳＡカップリングされたＮ末端ペプチド（▼）、ＢＳＡカップリングされたＰリッチドメインペプチド（◆）、ＢＳＡカップリングされたＣ末端ペプチド（■）又はＢＳＡカップリングされたポリＰペプチド（▲）についてのＥＣ５０決定。 直接ＥＬＩＳＡによる標的特異性分析。ＮＩ−３０２抗体の（Ａ）ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、（Ｂ）ＮＩ−３０２．６３Ｆ３並びに（Ｃ）ＮＩ−３０２．３５Ｃ１及び（Ｄ）ＮＩ−３０２．１５Ｅ８は、直接ＥＬＩＳＡによる結合特異性分析において示されるように、無関係な凝集性タンパク質標的とは結合しない。 棘密度が、遺伝子非導入の同腹子と比較して、Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６２Ｇｐｂ／１Ｊ遺伝子導入マウスの海馬薄片培養物において有意に低下する。（Ａ〜Ｄ）Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６２Ｇｐｂ／１Ｊマウス（Ｂ、Ｄ）に対する遺伝子非導入同腹子のＧＦＰ陽性海馬ニューロン（Ａ、Ｃ）の概観であり、１つだけの樹状突起が示され、個々の棘がより大きい倍率で示される（Ｃ、Ｄ）。（Ｅ）野生型動物に対する遺伝子導入動物における樹状突起棘密度の有意な低下（ｎ＝３個〜７個の薄片／群、２匹の野生型動物又は３匹の遺伝子導入動物に由来する）。（Ｆ）遺伝子導入マウスの薄片における抗体ＮＩ−３０２．１１Ｆ１１及び抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３による樹状突起棘密度喪失の減弱（ｎ＝８個〜１３個の薄片／群、合計で１２匹の遺伝子導入動物に由来する）。データは平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５（ＭＷＵ）、＃ ｐ＝０．０５。 Ｒ６／１動物モデルの脳におけるＮＩ−３０２抗体の浸透。（Ａ）５０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内注入の後でのＲ６／１遺伝子導入動物における平均でのＮＩ−３０２．３１Ｆ１１（●）及びＮＩ−３０２．３５Ｃ１（■）の血漿中薬物レベル及び脳内薬物レベル。データは平均±ＳＥＭを表す。ｎ＝３（それぞれの群について）。（Ｂ）５０ｍｇ／ｋｇの単回用量の後における個々のマウスの血漿中薬物レベル及び脳内薬物レベル。 直接ＥＬＩＳＡを使用する、凝集したＨＤ４９（●）、凝集したＨＤ２１（■）、可溶性ＧＳＴ−ＨＤ４９（▲）及び可溶性ＧＳＴ−ＨＤ２１（▼）のＨｔｔエクソン１タンパク質についてのヒト由来ＨＴＴ抗体のＥＣ５０決定。いくつかの抗体（例えば、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２（Ｉ）、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８（Ｊ）、ＮＩ−３０２．１１Ａ４（Ｆ）又はＮＩ−３０２．２２Ｈ９（Ｇ））は、切断されなかったＧＳＴ−ＨＴＴタンパク質に対する優先した結合を有するようであり（このことは、これらの抗体が、切断されなかった可溶性ＧＳＴ−ＨＤ構築物を優先的に認識することを示唆する）、これに対して、いくつかの抗体（例えば、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１（Ｃ）又はＮＩ−３０２．７１Ｆ６（Ｍ））は、すべてのＨＴＴ調製物に対する類似したＥＣ値による大きい親和性結合を示した（このことは、これらの抗体がＥＬＩＳＡアッセイでは、凝集したＨＴＴエクソン１構築物及び切断されなかったＨＴＴエクソン１構築物において露出する類似しているエピトープに結合することを示唆する）。 直接ＥＬＩＳＡによる結合親和性の特徴づけ。ヒト由来ＨＴＴ特異的抗体の、種々のＨＴＴタンパク質に対する結合親和性。 ドットブロットアッセイ（左側）及びフィルター遅延アッセイ（右側）による、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９のインビトロでの時間分解インビトロ凝集反応物での抗体ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９及びＮＩ−３０２．７１Ｆ６の特徴づけであり、特にＮＩ−３０２．１５Ｆ９及びＮＩ−３０２．７１Ｆ６の優先的な結合が、ドットブロットアッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９のより後期の（凝集した）反応物に対して認められ、フィルター遅延アッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９のＳＤＳ安定な凝集物に対して認められる。 直接ＥＬＩＳＡによる標的特異性分析。ＮＩ−３０２抗体の（Ａ）ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、（Ｂ）ＮＩ−３０２．６Ｎ９、（Ｃ）ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、（Ｄ）ＮＩ−３０２．８Ｆ１、（Ｅ）ＮＩ−３０２．２Ａ２、（Ｆ）ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、（Ｇ）ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、（Ｈ）ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、（Ｉ）ＮＩ−３０２．１１Ａ４、（Ｊ）ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、（Ｋ）ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、（Ｌ）ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、（Ｍ）ＮＩ−３０２．７Ａ８、（Ｎ）ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、（Ｏ）ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、（Ｐ）ＮＩ−３０２．１１Ｈ６及び（Ｑ）ＮＩ−３０２．３Ｄ８は、直接ＥＬＩＳＡによる結合特異性分析において示されるように、無関係な凝集性タンパク質標的とは結合しない。 重複するペプチドのスキャンによるＮＩ−３０２抗体結合エピトープの決定。上段：ＮＩ−３０２抗体とのハイブリダイゼーションの後におけるペプスキャン画像。下段：ペプチド配列のグラフィカル概観図及びただ１つのペプチドに対するＮＩ−３０２抗体結合スコアが示される。ＮＩ−３０２抗体によって認識されているペプチドとペプチドとの間での重複するアミノ酸（推定的な結合エピトープ）がコンセンサス配列において灰色で強調される。ＨＲＰコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ検出抗体は単独では、どのような線状ハンチンチンペプチドとも結合しない。（Ａ）ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｂ）ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｃ）ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｄ）ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｅ）ＮＩ−３０２．１１Ａ４、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｆ）ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｇ）ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｈ）ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｉ）ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｊ）ＮＩ−３０２．７Ａ８、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｋ）ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｌ）ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、１６スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｍ）ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｎ）ＮＩ−３０２．１８Ａ１、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｏ）ＮＩ−３０２．３Ｄ８、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｐ）ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；及び（Ｑ）ＮＩ−３０２．５２Ｃ９、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｒ）ＮＩ−３０２．２Ａ２、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；（Ｓ）ＮＩ−３０２．１５Ｅ８、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ；及び（Ｔ）ＮＩ−３０２．１５Ｄ３、２１スポットメンブランで１μｇ／ｍｌ。 ＮＩ−３０２抗体の免疫組織化学分析により、後期疾患段階のＴｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６２Ｇｐｂ／１Ｊ遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおけるニューロン核内封入体の顕著な染色が５ｎＭの濃度で明らかにされ（７４Ｃ１１、３９Ｃ１２、１１Ａ４、２２Ｈ９、７８Ｈ１２、３７Ｃ１２、７Ｄ８、７２Ｆ１０）、又は５０ｎＭの濃度で明らかにされる（１５Ｆ９、７１Ｆ６、５５Ｄ８、４４Ｄ７、７Ａ８、６４Ｅ５）。Ｍａｂ５４９２は市販のＮ末端ＨＴＴ抗体である。 Ｒ６／１遺伝子導入マウスモデルＴｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊの基本的特徴づけ。この動物モデルの（Ａ）生存曲線、（Ｂ）疾患進行の期間中における体重曲線及び（Ｃ）総脳湿重量。（Ｄ〜Ｈ）ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１のＨＴＴ抗体を用いた染色による、線条体における疾患進行に伴うニューロン核内封入体の出現の特徴づけ。 Ｂ６Ｃ３−Ｔｇ（ＨＤ８２Ｇｌｎ）８１Ｄｂｏ／Ｊ（Ｎ１７１−８２Ｑ）遺伝子導入マウスモデルの基本的特徴づけ。この動物モデルの（Ａ）生存曲線、（Ｂ）疾患進行の期間中における体重曲線、及び（Ｃ）末期における総脳湿重量。（Ｄ〜Ｆ）Ｍａｂ５４９２ ＨＴＴ抗体を用いた染色による、線条体における疾患進行に伴うニューロン核内封入体の出現の特徴づけ。 ５０ｎＭのＮＩ−３０２．３３Ｃ１１（ポリＰエピトープ）を用いた免疫組織化学分析では、ニューロン核内封入体の染色が、１ｎＭの濃度（Ｅ）及び５ｎＭの濃度（Ｆ）で、４名の異なるハンチントン病患者（Ａ〜Ｄ）の皮質ニューロンにおいて、また、２７０日齢の後期疾患段階のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ）遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおいて示される。染色が遺伝子非導入の同腹子では検出されず（Ｇ）、また、一次抗体が染色時に省かれる場合（Ｈ）、又は、非ハンチントン病コントロールの組織が５０ｎＭのＮＩ−３０２．３３Ｃ１１により染色される場合には検出されない。 ５０ｎＭのＮＩ−３０２．６３Ｆ３（Ｐリッチドメインエピトープ）を用いた免疫組織化学分析では、ニューロン核内封入体の染色（Ａ〜Ｃ）、並びに、４名の異なるハンチントン病患者（Ａ〜Ｄ）の皮質ニューロンのいくつかの神経突起の染色（Ｄ）及び２７０日齢の後期疾患段階のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ）遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおける染色が１ｎＭの濃度（Ｅ）及び５０ｎＭの濃度（Ｆ）で示される。染色が遺伝子非導入の同腹子では検出されず（Ｇ）、また、一次抗体が染色時に省かれる場合（Ｈ）、又は、非ハンチントン病コントロールの組織が５０ｎＭのＮＩ−３０２．６３Ｆ３により染色される場合には検出されない。 １００ｎＭのＮＩ−３０２．３５Ｃ１（末端のエクソン１エピトープ）を用いた免疫組織化学分析では、ニューロン核内封入体の染色（Ａ〜Ｃ）、並びに、４名の異なるハンチントン病患者（Ａ〜Ｄ）の皮質ニューロンのいくつかの神経突起の染色（Ｄ）及び２７０日齢の後期疾患段階のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ）遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおける染色が１ｎＭの濃度（Ｅ）及び５０ｎＭの濃度（Ｆ）で示される。染色が遺伝子非導入の同腹子では検出されず（Ｇ）、また、一次抗体が染色時に省かれる場合（Ｈ）、又は、非ハンチントン病コントロールの組織が１００ｎＭのＮＩ−３０２．３５Ｃ１により染色される場合には検出されない。 市販の抗ポリＱ抗体Ｍａｂ１５７４（１：２０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いた免疫組織化学分析では、ニューロン核内封入体及び細胞質封入体の染色、並びに、４名の異なるハンチントン病患者（Ａ〜Ｄ）の皮質ニューロンのいくつかの神経突起の染色（Ａ、Ｄ）が示され、また、染色が、前駆症状状態の１５０日齢（Ｅ）及び２７０日齢（Ｆ）の後期疾患段階のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ）遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおいて示される。染色が遺伝子非導入の同腹子では検出されず（Ｇ）、また、一次抗体が染色時に省かれる場合（Ｈ）、又は、非ハンチントン病コントロールの組織がＭａｂ１５７４により染色される場合には検出されない。 直接ＥＬＩＳＡを使用する、凝集したＨＤ４９（●）、凝集したＨＤ２１（■）、可溶性ＧＳＴ−ＨＤ４９（▲）及び可溶性ＧＳＴ−ＨＤ２１（▲）のＨｔｔエクソン１タンパク質についてのヒト由来ＨＴＴ抗体のＥＣ５０決定。いくつかの抗体（例えば、ＮＩ−３０２．６４Ｅ５（Ａ）又はＮＩ−３０２．７Ｄ８（Ｂ））は、切断されなかったＧＳＴ−ＨＤ４９タンパク質に対する優先した結合を有するようであり、このことは、これらの抗体が、より長いポリＱ反復を含有する切断されなかった可溶性ＧＳＴ−ＨＤ構築物を優先的に認識することを示唆する。抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０（Ｃ）は、ＨＤ２１構築物に対して優先的であることを示し、いくつかの抗体（例えば、ＮＩ−３０２．４Ａ６（Ｄ）、ＮＩ−３０２．１２Ｈ２（Ｅ）又はＮＩ−３０２．８Ｍ１（Ｅ））は、すべてのＨＴＴ調製物に対する類似したＥＣ値による大きい親和性結合を示した（このことは、これらの抗体がＥＬＩＳＡアッセイでは、凝集したＨＴＴエクソン１構築物及び切断されなかったＨＴＴエクソン１構築物において露出する類似しているエピトープに結合することを示唆する）。 ドットブロットアッセイ（左側）及びフィルター遅延アッセイ（右側）による、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９のインビトロでの時間分解インビトロ凝集反応物での抗体（Ａ）ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、（Ｂ）ＮＩ−３０２．７Ｄ８、（Ｃ）ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０、（Ｄ）ＮＩ−３０２．４Ａ６、（Ｅ）ＮＩ−３０２１２Ｈ２、（Ｆ）ＮＩ−３０２．８Ｍ１及び（Ｇ）ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１（コントロールとして）の特徴づけであり、特にＮＩ−３０２．６４Ｅ５及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０が、ドットブロットアッセイではＨＤ３５及び／又はＨＤ４９のより後期の（凝集した）反応物に対して優先的に結合することが認められ、フィルター遅延アッセイではＨＤ３５及びＨＤ４９のＳＤＳ安定な凝集物に対して優先的に結合することが認められる。 直接ＥＬＩＳＡによる標的特異性分析。ＮＩ−３０２抗体の（Ａ）ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、（Ｂ）ＮＩ−３０２．７Ｄ８、（Ｃ）ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０、（Ｅ）ＮＩ−３０２．１２Ｈ２及び（Ｆ）ＮＩ−３０２．８Ｍ１は、ｐ５３へのいくらかの結合を示す（Ｄ）ＮＩ−３０２．４Ａ６を除いて、直接ＥＬＩＳＡによる結合特異性分析において示されるように、無関係な凝集性タンパク質標的とは結合しない。 ＨＤのマウスモデルにおける課題特異的訓練期間中の行動成績と、感覚運動能とに関するＣ末端ドメイン結合抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の研究。（Ａ）十字迷路分析を使用して、Ｒ６／１マウスにおける不安のレベルを調べた。６ヶ月の月齢で、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１処置のＲ６／１動物は、ビヒクル処置のＲ６／１動物と比較して、より少ない時間を無壁路で過ごし、より少ない頻度で無壁路に進入し、かつ、無壁路での無防備な覗き込みがより少なかった。したがって、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１処置のＲ６／１マウスは、遺伝子非導入の同腹子と比較して、より不安な表現型を示した。（Ｂ）ＮＩ−３０２．３５Ｃ１処置のＲ６／１動物は、遺伝子非導入の動物と類似するレベルに達するビヒクル処置のＲ６／１動物と比較して、改善された成績をポール試験において示した。 重複するペプチドのスキャンによるＮＩ−３０２抗体結合エピトープの決定。上段：ＮＩ−３０２抗体とのハイブリダイゼーションの後におけるペプスキャン画像。下段：ペプチド配列のグラフィカル概観図が示される。ＮＩ−３０２抗体によって認識されているペプチドとペプチドとの間での重複するアミノ酸（推定的な結合エピトープ）が下側のコンセンサス配列において示される。ＨＲＰコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ検出抗体は単独では、どのような線状ハンチンチンペプチドとも結合しない。（Ａ）ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、（Ｂ）ＮＩ−３０２．７Ｄ８、（Ｃ）ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０、（Ｄ）ＮＩ−３０２．４Ａ６、（Ｅ）ＮＩ−３０２．１２Ｈ２、（Ｆ）ＮＩ−３０２．８Ｍ１、すべての抗体が２１スポットメンブランにおいて１μｇ／ｍｌである。 様々なＮＩ−３０２抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖又はＶκ鎖におけるＣＤＲのアミノ酸配列アラインメント。それぞれの配列を、保存されたアミノ酸、セグメント又は他のモチーフに関して調べ、これにより、ＣＤＲにおけるチロシンの蓄積が明らかにされた。
発明の詳細な説明
本発明は一般には、ハンチンチン（ＨＴＴ）の病原的形態（多くの場合には変異した形態及び／又は凝集した形態）の存在に伴う疾患及び／又は障害並びに状態を検出するための免疫療法方法及び非侵襲的方法に関連する。より具体的には、本発明は、選択されたヒトドナー集団から得られる配列情報に基づいて作製され、かつ、そのようなＨＴＴアイソフォーム及びその抗原に結合することができる組換えヒト由来モノクローナル抗体並びにそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成及び生物工学誘導体に関連する。本発明の組換えヒト由来モノクローナル抗体は好都合には、病理学的な変化したＨＴＴ種の処置及び／又は診断のための標的化を可能にする変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種並びに／或いはそれらのフラグメントに特異的に結合することによって特徴づけられる。ヒト由来であるために、本発明の得られた組換え抗体は、治療剤として有効かつ安全であり、かつ、病理学的ＨＴＴを、偽陽性を与えることなく検出するための診断試薬として非常に特異的であることが無理なく期待され得る。
加えて、本発明は、患者の処置において単独で、或いは、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う症状のために利用される他の薬剤と一緒でのどちらでも使用されるための本明細書中に記載されるヒトモノクローナル抗体及びそのどのような誘導体にも関連し、ただし、この場合、本発明の抗体及びその様々な誘導体のどれもが、副作用を抑制する薬剤と同時に投与されるために、或いは、副作用を抑制する薬剤の投与の前又は後において連続して投与されるために設計される。これに関連して、本発明の抗ＨＴＴ抗体及びＨＴＴ結合性フラグメントは好ましくは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。本発明の１つの実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体、又は、どのような誘導体であれ、その誘導体と、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う症状のために利用される１つ又は複数の薬物との両方を含む医薬組成物が提供される。
Ｉ．定義
別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂及び２００３年再版、ＩＳＢＮ ０ １９ ８５０６７３ ２）において提供されるような定義が与えられる。
用語「ａ」又は「ａｎ」を伴う実体はそのような実体の１つ又は複数を示すことに留意しなければならない；例えば、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ」（抗体）は１つ又は複数の抗体を表すことが理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、 「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ」（１つ又は複数）及び 「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」（少なくとも１つ）は、本明細書中では交換可能に使用され得る。
ハンチンチン（ＨＴＴ）は、ＩＴ１５としてもまた知られており、ハンチントン病（ＨＤ）、すなわち、線条体ニューロンの喪失によって特徴づけられる神経変性障害に結びつけられる疾患遺伝子である。ＨＤは、タンパク質産物におけるポリグルタミン反復として翻訳されるＨＴＴ遺伝子内の伸長した不安定なトリヌクレオチド反復によって引き起こされると考えられている。トリヌクレオチド反復の数におけるかなり広い範囲が、正常なコントロールにおいて特定されており、３５〜４０を越える反復の数が病的であるとして記載されている。ＨＴＴ遺伝子座（ＮＧ＿００９３７８．１；４８３０〜１７４２８６；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ）は大きく、１８０ｋｂに及んでおり、６７個のエクソンからなる。
これに関連して、変異ＨＴＴのＮ末端フラグメント、すなわち、ＨＴＴ遺伝子のエクソン１タンパク質が、伸長したＣＡＧ反復を伴う場合、凝集及び進行性の神経学的表現型を遺伝子導入マウスにおいて引き起こすために十分であるＨＴＴの「毒性」種を表すことが明らかにされている；例えば、Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ他、Ｃｅｌｌ ８７（１９９６）、４９３〜５０６、及び、Ｒｏｓｓ他、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２０１１）、８３〜９８、ＤｉＦｉｇｌｉａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（１９９７）、１９９０〜１９９３、Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９（７）（１９９９）、２５２２〜２５３４を参照のこと。
別途言及される場合を除き、「ＨＴＴを特異的に認識する」、「ＨＴＴに対して／について特異的である抗体」、及び、「抗ＨＴＴ抗体」によって、特異的にＨＴＴに結合する抗体、広くＨＴＴに結合する抗体、及び、集団的にＨＴＴに結合する抗体が意味され、この場合、ＨＴＴは、ＨＴＴの生来型形態、同様にまた、ＨＴＴの他の形態、例えば、病理学的に変化したＨＴＴ（例えば、変異したＨＴＴ、ミスフォールドしたＨＴＴ及び／又は凝集したＨＴＴなど）（これらに限定されない）を含めてＨＴＴの種々の形態を示す。本明細書中には、ＨＴＴの全長型形態及び／又はフラグメント並びに／或いは変異した形態、ミスフォールドした形態及び／又は凝集した形態について選択的であるヒト由来抗体が提供される。
別途具体的に示されない場合、用語「ＨＴＴ」は、ハンチンチン（ＨＴＴ）の種々の形態を具体的に示すために交換可能に使用される。用語「ＨＴＴ」はまた、ＨＴＴの他の配座異性体、例えば、ＨＴＴの病理学的に変化した形態（例えば、ＨＴＴのミスフォールドした形態及び／又は凝集した形態など）を一般に特定するために使用される。そのうえ、別途具体的に示される場合を除き、ＨＴＴという用語は特に、ＨＴＴエクソン１を意味し、可溶性ＨＴＴは、その対応するＧＳＴ融合タンパク質を示す。用語「ＨＴＴ」はまた、ＨＴＴのすべてのタイプ及び形態（例えば、変異したＨＴＴなど）を総称的に示すために使用される。上記用語（例えば、ＨＴＴ）の前における加えられた文字は、その具体的なオルソログが由来する生物を示すために使用され、例えば、ｈＨＴＴがヒトＨＴＴに代わって使用され、又は、ｍＨＴＴがマウス起源に代わって使用される。
本明細書中に開示される抗ＨＴＴ抗体はＨＴＴ及びそのエピトープと特異的に結合し、また、ＨＴＴの様々な立体配座体及びそれらのエピトープに特異的に結合する。例えば、本明細書中には、病理学的に変化したＨＴＴ種又はそのフラグメント（例えば、ＨＴＴの変異した形態、ミスフォールドした形態及び／又は凝集した形態或いはそれらのフラグメントなど）と特異的に結合する抗体が開示される。ＨＴＴの（病理学的な）変異した、ミスフォールドした、及び／又は凝集した／凝集物という用語は、上記形態を具体的に示すために交換可能に使用される。（病理学的に）「凝集した形態」又は「凝集物」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＨＴＴの相互の誤った／病理学的な相互作用に起因する蓄積又はクラスター形成の産物を記述する。これらの凝集物、蓄積物又はクラスター形態は、ＨＴＴ及び／又はＨＴＴフラグメントと、それらの非原線維性オリゴマー及び／又は原線維性オリゴマー並びに原線維との両方である場合があり、或いは、それらの両方から実質的になる場合があり、或いは、それらの両方からなる場合がある。本明細書中で使用される場合、ＨＴＴと「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、又は「優先的に結合する」抗体に対する言及は、無関係な他のタンパク質と結合しない抗体を示す。一例において、本明細書中に開示されるＨＴＴ抗体はＨＴＴ又はそのエピトープと結合することができ、かつ、他のタンパク質についてはバックグランドの約２倍を超える結合を示さない。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、対らせん状細線維（ＰＨＦ）−タウ、ＴＡＵ、アルファ−シヌクレイン、トランス活性応答ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）からなる群から選択される無関係なアミロイド形成タンパク質を実質的に認識しない；実施例８、実施例１３、実施例１８及び実施例３１を参照のこと。所与のＨＴＴ配座異性体と「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」抗体は、ＨＴＴのすべての立体配座とは結合しない抗体、すなわち、少なくとも１つの他のＨＴＴ配座異性体とは結合しない抗体を示す。例えば、本明細書中には、ＨＴＴの変異した形態及び／又は凝集した形態にインビトロにおいて、また、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は障害を有する患者、或いは、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は障害を発症する危険性がある患者から得られる組織においてその両方で優先的に結合することができる抗体が開示される。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体はＨＴＴエクソン１の種々の領域を特異的に標的とする；例えば、図５、図９、図１２、図１４、図１５を参照のこと。本発明の抗ＨＴＴ抗体はヒト対象から単離されているので、そのような抗体が、実際に対象によって最初に発現されたものであって、例えば、ヒト免疫グロブリンを発現するファージライブラリーによって生じる合成構築物、又は、ヒト免疫グロブリンレパートリーの一部を発現する遺伝子導入動物において生じる異種抗体でないことを強調するために（なお、それらはこれまで、ヒト様抗体を提供しようと試みるための１つの一般的な方法を表していた）、本発明の抗ＨＴＴ抗体はまた、「ヒト自己抗体」又は「ヒト由来抗体」と呼ばれる場合がある。他方で、本発明のヒト由来抗体は、プロテインＡカラム又は親和性カラムによって精製されることがあるヒト血清抗体そのものから区別するために、合成（的）、組換え（型）及び／又は生物工学（的）であると示される場合がある。
しかしながら、本発明の治療的取り組みの特定の利点が、本発明の抗体は、ミスフォールドした／凝集したＨＴＴの出現を示す疾患、又は、ミスフォールドした／凝集したＨＴＴに関連づけられる疾患の徴候を何ら有しない健康なヒト対象から得られるＢ細胞又はＢメモリー細胞に由来し、したがって、ある一定の確率で、ミスフォールドした／凝集したＨＴＴに関連づけられる臨床的に明白な疾患を防止することができる、或いは、そのような臨床的に明白な疾患の出現の危険性を減らすことができる、或いは、そのような臨床的に明白な疾患の発症又は進行を遅らせることができるという事実にある。典型的には、本発明の抗体はまた、体細胞変異、すなわち、抗体の可変領域の体細胞変化による標的ＨＴＴ分子に対する高親和性結合における選択性及び有効性に関しての最適化を既に首尾良く経ている。生体内におけるそのような細胞、例えば、ヒト体内におけるそのような細胞は、自己免疫学的反応又はアレルギー反応の意味において、関連した、又は他の生理学的なタンパク質又は細胞構造によって活性化されていないという認識もまた、非常に医学的に重要である。なぜならば、これにより、臨床試験段階を首尾よく生き残るという相当に増大した可能性が意味されるからである。いわば、効率、許容性及び耐容性が、少なくとも１名のヒト対象において予防的抗体又は治療的抗体の前臨床開発及び臨床開発の前に既に実証されている。したがって、本発明のヒト抗ＨＴＴ抗体は、治療剤としてのその標的構造特異的な効率と、副作用のその低下した可能性との両方で、成功のその臨床的可能性を著しく増大させることが予想され得る。
対照的に、ｃＤＮＡライブラリー又はファージディスプレーに由来する抗体は、人為的な分子であり、例えば、依然としてマウス起源であり、したがって、ヒト身体に対しては外来であるヒト化抗体などである。したがって、治療抗体の臨床上の有用性及び効力が、抗体の効力及び薬物動態学に影響を及ぼし得る、また、ときには重大な副作用を引き起こし得る抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生によって制限される可能性がある；例えば、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ．３（２０１１）、２４３〜２５２を参照のこと。具体的には、ヒト化抗体、すなわち、近年のヒト抗体作製技術により作製される抗体は、ヒト由来抗体（例えば、本発明のヒト由来抗体など）とは対照的に、抗体応答を誘発しやすく、また、例えば、ファージディスプレーに由来するこれらのヒト様抗体、例えば、アダリムマブなどは、ＡＤＡ産生を誘発することが報告されている；例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ９１（２００７）、２７４〜２７６、及び、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ．３（２０１１）、２４３〜２５２を参照のこと。したがって、望まれない免疫応答を生じさせやすくないヒト由来抗体が、患者のためには、ライブラリー又はディスプレイに由来する人為的な分子よりも有益である。
用語「ペプチド」は、その意味の範囲内において、（時には本明細書中では交換可能に使用されることがある）用語「ポリペプチド」及び用語「タンパク質」を包含することが理解される。同様に、タンパク質及びポリペプチドのフラグメントもまた包含され、タンパク質及びポリペプチドのフラグメントは本明細書中では「ペプチド」と称される場合がある。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は好ましくは、少なくとも５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、より好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、特に好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。加えて、本発明によるペプチドは典型的には、最大でも１００個の連続するアミノ酸、好ましくは８０個未満の連続するアミノ酸、より好ましくは５０個未満の連続するアミノ酸を有する。
ポリペプチド：
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、１つだけの「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に連結されるモノマー（アミノ酸）から構成される分子を示す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（１つ又は複数）を示し、生成物の特定の長さを示さない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は、２個以上のアミノ酸の鎖（１つ又は複数）を示すために使用される任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、又は、これらの用語のどれとも交換可能に使用される場合がある。
用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び、知られている保護基／ブロック基、タンパク質分解的切断による誘導体化、又は、天然に存在しないアミノ酸による修飾を含めて、当該ポリペプチドの発現後修飾の産物を示すことが意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来してもよく、又は、組換え技術によって産生されてもよいが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成による様式を含めて、どのような様式において作製されてもよい。
本発明のポリペプチドは、約３個以上のアミノ酸のサイズ、５個以上のアミノ酸のサイズ、１０個以上のアミノ酸のサイズ、２０個以上のアミノ酸のサイズ、２５個以上のアミノ酸のサイズ、５０個以上のアミノ酸のサイズ、７５個以上のアミノ酸のサイズ、１００個以上のアミノ酸のサイズ、２００個以上のアミノ酸のサイズ、５００個以上のアミノ酸のサイズ、１，０００個以上のアミノ酸、又は、２，０００個以上のアミノ酸のサイズである場合がある。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有する場合があるが、ポリペプチドはそのような構造を必ずしも有さない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたとして示される。規定された三次元構造を有するのではなく、むしろ、非常に多数の異なる立体配座を取ることができるポリペプチドは、折り畳まれていないとして示される。本明細書中で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基又はアスパラギン残基）の酸素含有側鎖又は窒素含有側鎖を介して当該タンパク質に結合する少なくとも１つの炭水化物成分に連結されるタンパク質を示す。
「単離された」ポリペプチドあるいはそのフラグメント、変異体又は誘導体によって、その天然の環境に存在していないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルは何ら要求されない。例えば、単離されたポリペプチドはそのネイティブ環境又は天然の環境から取り出され得る。宿主細胞において発現される組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離されているか、分画されているか、あるいは、部分的又は実質的に精製されているネイティブポリペプチド又は組換えポリペプチドのように、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。
「組換え（の）ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって産生される、すなわち、所望されるペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換される細胞（微生物細胞又は哺乳動物細胞）から産生される、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を示す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質又はペプチドは典型的にはグリカンを含まないであろう。酵母において発現されるタンパク質又はペプチドは、哺乳動物細胞において発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有する場合がある。
本発明のポリペプチドとして、前記ポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ又は変異体、及び、それらの任意の組合せも含まれる。用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「アナログ」には、天然ペプチドのアミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列を有するペプチド及びポリペプチドが含まれる。用語「十分に類似する」は、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列が共通の構造的ドメイン及び／又は共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列に対する十分な数又は最小数の同一アミノ酸残基又は等価なアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列で、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％が同一であるアミノ酸配列は、十分に類似するとして本明細書中では定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましいペプチドのアミノ酸配列に、特に、ＨＴＴ、あるいは、それらのどちらかの変異体、誘導体又はアナログのアミノ酸配列に十分に類似しているであろう。そのような変異体は一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。変異体には、１つ又は複数のアミノ酸欠失、アミノ酸付加及び／又はアミノ酸置換によって生来型ペプチド及びｗｔ型ペプチドとはアミノ酸配列においてそれぞれ異なるペプチドが含まれる。これらは、天然に存在する変異体、ならびに、人為的に設計された変異体である場合がある。
さらに、用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「アナログ」は、本発明の抗体又は抗体ポリペプチドに言及するときには、対応する生来型の結合性分子、抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持するどのようなポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書中の他のところで議論される具体的な抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解的フラグメント、ならびに、欠失フラグメントが含まれる。本発明の抗体及び抗体ポリペプチドの変異体には、上記で記載されるようなフラグメント、及び、アミノ酸の置換、欠失又は挿入に起因する変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は天然に存在している場合があり、又は、天然に存在していない場合がある。天然に存在していない変異体は、この技術分野において知られている変異誘発技術を使用して作製される場合がある。変異体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加を含む場合がある。ＨＴＴ特異的な結合性分子の誘導体、例えば、本発明の抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体は、生来型ポリペプチドに対して見出されないさらなる特徴を示すように変化させられているポリペプチドである。例には、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書中では「ポリペプチドアナログ」として示される場合もある。本明細書中で使用される場合、結合性分子もしくはそのフラグメント、抗体又は抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導体化される１つ又は複数の残基を有する当該ポリペプチドを示す。また、「誘導体」として、２０個の標準的アミノ酸の１つ又は複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシｐｒｏリンがｐｒｏリンの代わりに使用されてもよい；５−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用されてもよい；３−メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに使用されてもよい；ホモセリンがセリンの代わりに使用されてもよい；また、オルニチンがリシンの代わりに使用されてもよい。
分子の類似性及び／又は同一性の決定：
２つのペプチドの間における「類似性」が、一方のペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列に対して比較することによって求められる。実施例３５及び図３６を参照のこと。一方のペプチドのアミノ酸が同一であるか、又は、保存的なアミノ酸置換であるならば、一方のペプチドのアミノ酸は第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的な置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８））に記載される置換、及び、Ａｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．８（１９８９）、７７９〜７８５に記載される置換が含まれる。例えば、下記の群の１つに属するアミノ酸は、保存的な変化又は置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び、−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
２つのポリヌクレオチドの間における「類似性」が、一方のポリヌクレオチドの核酸配列を所与のポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。一方の核酸が同一であるならば、又は、核酸がコード配列の一部である場合、当該核酸を含むそれぞれのトリプレットが、同じアミノ酸又は保存的なアミノ酸置換をコードするならば、一方のポリヌクレオチドの核酸は第２のポリヌクレオチドの対応する核酸と類似している。
２つの配列の間におけるパーセント同一性又はパーセント類似性の決定が好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３〜５８７７）の数学的アルゴリズムを使用して達成される。そのようなアルゴリズムが、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）のＢＬＡＳＴｎプログラム及びＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれる。
パーセント同一性又はパーセント類似性の決定が、ＮＣＢＩのウエブページで推奨されるような、また、特定の長さ及び組成の配列に関しての「ＢＬＡＳＴ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」に記載されるような、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索についてはＢＬＡＳＴｎプログラムの標準的なパラメーター、ＢＬＡＳＴタンパク質検索についてはＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的なパラメーターを用いて行われる。
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索が、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて行われる。
一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０００に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ」ボックスが７に設定される場合があり、これらはＮＣＢＩのウエブページにおいて短い配列（２０塩基未満）について推奨される通りである。より長い配列については、「Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ」ボックスが１１に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ」が、１、−２に設定される場合があり、「Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ」ボックスが直線に設定される場合がある。フィルター及びマスキングパラメーターについては、「Ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ ｆｏｒ ｌｏｏｋｕｐ ｔａｂｌｅ ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「ＤＵＳＴ Ｆｉｌｔｅｒ Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」にチェックが入れられる場合があり、「Ｍａｓｋ ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。一般に、「Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｎｅａｒｌｙ ｅｘａｃｔ ｍａｔｃｈｅｓ」がこの点に関して使用される場合があり、これにより、上記で示された設定のほとんどが提供される。この点に関してのさらなる情報は、ＮＣＢＩのウエブページで公開される「ＢＬＡＳＴ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」に見出される場合がある。
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて行われる。一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ」ボックスが「３」に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｒｉｘ」ボックスが「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定される場合があり、「Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ」ボックスが「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定される場合があり、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ”ボックスが“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ”に設定される場合がある。フィルター及びマスキングパラメーターについては、“Ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ ｆｏｒ ｌｏｏｋｕｐ ｔａｂｌｅ ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。
両方のプログラムの改変、例えば、検索された配列の長さに関しての改変は、ＮＣＢＩのウエブページにおいてＨＴＭＬ版及びＰＤＦ版で公開される「ＢＬＡＳＴ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」における推奨に従って行われる。
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、１つだけの核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子又は核酸構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を示す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合又は非従来型の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるアミド結合など）を含む場合がある。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドに存在するいずれかの１つ又は複数の核酸セグメント（例えば、ＤＮＡフラグメント又はＲＮＡフラグメント）を示す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドによって、そのネイティブ環境から取り出されている核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクターに含有される、抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、又は、溶液における（部分的又は実質的に）精製されたポリペプチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボＲＮＡ転写物又はインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸にはさらに、合成的に作製されるそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどである場合があり、あるいは、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどを包含する場合がある。
本明細書中で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、コード領域の一部であると見なされる場合があるが、近接配列はどれも、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域を、１つのポリヌクレオチド構築物において、例えば、１つのベクターに存在させることができ、又は、別個のポリヌクレオチド構築物において、例えば、別個の（異なる）ベクターに存在させることができる。さらには、ベクターはどれも、１つだけのコード領域を含有する場合があり、又は、２つ以上のコード領域を含む場合があり、例えば、１つのベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードする場合がある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、結合性分子、抗体、あるいは、そのフラグメント、変異体又は誘導体をコードする核酸に融合されて、又は融合されずに、異種のコード領域をコードする場合がある。異種のコード領域には、限定されないが、特殊化されたエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種の機能的ドメインなどが含まれる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つ又は複数のコード領域と操作可能に連係させられるプロモーターならびに／あるいは他の転写制御エレメント又は翻訳制御エレメントを含む場合がある。操作可能連係は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のためのコード領域が、当該遺伝子産物の発現を当該調節配列の影響下又は制御下に置くような様式で１つ又は複数の調節配列と連係させられるときにおいてである。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれと連係させられるプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導により、所望される遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が生じるならば、また、これら２つのＤＮＡフラグメントの間における連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか、又は、転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げないならば、「操作可能に連係させられる」又は「操作可能に連結される」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を達成することができたならば、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連係させられているであろう。プロモーターは、ＤＮＡの実質的な転写を所定の細胞においてのみ導く細胞特異的なプロモーターである場合がある。プロモーターのほかに、他の転写制御エレメントを、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルを、細胞特異的な転写を導くためにポリヌクレオチドと操作可能に連係させることができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書中に開示される。
様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（前初期プロモーター、イントロンＡとの併用で）、シミアンウイルス４０由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、ならびに、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメントなど（これらに限定されない）が含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子（例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなど）に由来する転写制御領域ならびに遺伝子発現を真核生物細胞において制御することができる他の配列が含まれる。さらなる好適な転写制御領域には、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、ならびに、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンによって誘導可能であるプロモーター）が含まれる。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終結コドン、ならびに、ピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわち、ＩＲＥＳ、これはまたＣＩＴＥ配列とも称する）が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードし、これにより、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導くさらなるコード領域と連係させられる場合がある。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横断する成長途中のタンパク質鎖の移行が開始されると、成熟型タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは一般に、当該ポリペプチドのＮ末端に融合されるシグナルペプチドで、当該ポリペプチドの分泌型形態又は「成熟型」形態をもたらすために、完全なポリペプチド又は「全長」のポリペプチドから切断されるシグナルペプチドを有することを承知している。特定の実施形態において、生来型のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖のシグナルペプチドが使用されるか、又は、操作可能に連係させられるポリペプチドの分泌を導く能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替では、異種の哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型のリーダー配列がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置き換えられる場合がある。
「結合性分子」は、本発明に関連して使用される場合、主として抗体及びそのフラグメントに関し、しかし、ＨＴＴに結合する他の非抗体分子を示す場合もあり、これらには、ホルモン、受容体、リガンド、アンキリン、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、ならびに、細胞・細胞接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリー及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤及び診断剤を開発するための好ましい結合性分子を代表する抗体及び抗体様分子に関して議論される。
抗体：
用語「抗体」及び用語「免疫グロブリン」は本明細書中では交換可能に使用される。抗体又は免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、かつ、通常の場合には重鎖及び軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む結合性分子である。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）を参照のこと）。
より詳しく下記で議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別することができる様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、それらの中のいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を伴って分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥとしてそれぞれ決定するのが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などが十分に特徴づけられており、また、機能的な特殊化を与えることが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変された型が、本開示を考慮して当業者には容易に認識可能であり、従って、本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが明らかに本発明の範囲内であり、下記の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。これら４つの鎖は典型的には、軽鎖が、「Ｙ」字型の口部から始まり、可変領域の終わりまで続く腕木として重鎖を支える「Ｙ」字型の立体配置でジスルフィド結合によって結合される。
軽鎖はカッパ又はラムダ（κ、λ）のどちらかとして分類される。それぞれの重鎖クラスがカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のどちらかと結合し得る。一般には、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、又は、遺伝子操作された宿主細胞のどれかによって生じるとき、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合により結合し、２つの重鎖の「テール」部分が共有結合性のジスルフィド連結又は非共有結合性の連結によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列が、Ｙ字型の立体配置の二叉末端におけるＮ末端から、それぞれの鎖の底部におけるＣ末端にまで延びる。
軽鎖及び重鎖はともに、構造的及び機能的に相同的である領域に分けられる。用語「定常」及び「可変」が機能的に使用される。これに関連して、軽鎖部分及び重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）により、抗原認識及び特異性が決定されることが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）により、様々な重要な生物学的性質、例えば、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合及び補体結合などが与えられる。慣例によって、定常領域ドメインの番号づけは、これらのドメインが抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠位になるにつれて大きくなる。Ｎ末端部分が可変領域であり、Ｃ末端部分が定常領域である；ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメインが実際に、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。上記で示されるように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、かつ、このエピトープと特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四元抗体構造が、Ｙ字型のそれぞれのアームの端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位がＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにおける３つのＣＤＲによって規定される。ＨＴＴに特異的に結合するための十分な構造を含有する抗体又は免疫グロブリンフラグメントはどれも、本明細書中では交換可能に、「結合性フラグメント」又は「免疫特異性フラグメント」として示される。
天然に存在する抗体において、抗体は、抗体がその三次元立体配置を水性環境において取るような抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置されるアミノ酸の短い不連続な配列である６つの超可変領域（これらは時には、それぞれの抗原結合ドメインに存在する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含む。「ＣＤＲ」には、分子間の変動性をそれほど示さない４つの比較的保存された「フレームワーク」領域又は「ＦＲ」が近接する。これらのフレームワーク領域は主としてβ−シートの立体配座を取り、ＣＤＲにより、このβ−シート構造をつなぐ、また、時にはこのβ−シート構造の一部を形成するループが形成される。したがって、フレームワーク領域は、ＣＤＲを鎖間の非共有結合性の相互作用によって正しい配向で配置することを提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインにより、免疫反応性抗原におけるエピトープに対して相補的な表面が規定される。この相補的な表面は、抗体がその同種エピトープに非共有結合的に結合することを促進させる。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸が、それらは正確に規定されているので、当業者によっていずれかの所与の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域についてそれぞれ容易に特定され得る；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．他編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）、及び、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７を参照のこと。これらの全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。
この技術分野において使用される、及び／又は受け入れられる用語の２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書中で使用されるような当該用語の定義は、反するようなことが明示的に言及される場合を除き、すべてのそのような意味を包含することが意図される。具体的な一例が、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域の中に見出される不連続な抗原結合部位を記述するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域が、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって、また、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７によって記載されており（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）、この場合、それらの定義は、互いに比較されたときにはアミノ酸残基の重複又はサブセットを包含する。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを示すためのどちらかの定義の適用は、本明細書中で定義され、かつ使用されるようなこの用語の範囲内であることが意図される。上記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として下記において表Ｉに示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変わる。当業者は、どの残基が、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられる抗体のヒトＩｇＧサブタイプの特定の超可変領域又はＣＤＲを含むかを常法により決定することができる。
表Ｉ：ＣＤＲの定義１
Figure 2017522886
 １表ＩにおけるすべてのＣＤＲ定義の番号表記は、Ｋａｂａｔ他によって示される番号表記慣例に従う（下記を参照のこと）。
Ｋａｂａｔ他はまた、どのような抗体に対しても適用可能である可変ドメイン配列のための番号表記システムを定義した。当業者は、「Ｋａｂａｔ番号表記」のこのシステムを、配列そのものを超える実験的データに何ら頼ることなく、どのような可変ドメイン配列に対してでも一義的に割り当てることができる。本明細書中で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号表記」は、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号表記システムを示す。別途指定される場合を除き、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体における具体的なアミノ酸残基位置の番号表記に対する言及は、Ｋａｂａｔ番号表記システムに従っており、しかしながら、Ｋａｂａｔ番号表記システムは理論的であり、本発明のどの抗体にも等しく適用されない場合がある。例えば、最初のＣＤＲの位置に依存して、その後のＣＤＲはどちらかの方向でずれる場合がある。
本発明の特に好ましい態様として、ヒト由来モノクローナル抗体ならびにその結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体が言及されない限り、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、免疫特異性フラグメント、変異体又は誘導体には、ポリクローナル性、モノクローナル性、多特異性、ヒト型、ヒト化型、霊長類化型、マウス化型又はキメラ型の抗体、単鎖抗体、エピトープ結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメイン又はＶＨドメインのどちらかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメント、ならびに、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ｓｃＦＶ分子がこの技術分野では知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。本発明の免疫グロブリン分子又は抗体分子は、免疫グロブリン分子のどのようなタイプのものも（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、どのようなクラスのものも（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はどのようなサブクラスのものも可能である。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、五価構造を有するＩｇＭ又はその誘導体ではない。特に、本発明の具体的な適用において、とりわけ治療的使用において、ＩｇＭはＩｇＧ及び他の二価抗体又は対応する結合性分子よりも有用でない。これは、ＩｇＭは、その五価構造のために、また、親和性成熟化の欠如のために、非特異的な交差反応性及び非常に低い親和性を示すことが多いからである。
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体はポリクローナル抗体でない。すなわち、本発明の抗体は、血漿の免疫グロブリンサンプルから得られる混合物ではなく、むしろ、１つの特定の抗体種から実質的になる。
単鎖抗体を含めて、抗体フラグメントは、可変領域（１つ又は複数）を単独で、あるいは、下記の全体又は一部分との組合せで含む場合がある：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン。また、本発明には、可変領域（１つ又は複数）と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとのどのような組合せをも含むＨＴＴ結合性フラグメントが含まれる。本発明の抗体又はその免疫特異性フラグメントは、鳥類及び哺乳動物を含めて、どのような動物起源に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域が起源において（例えば、サメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）である場合がある。
１つの態様において、本発明の抗体は、ヒトから単離されるヒトモノクローナル抗体である。ここで、前記抗体を発現するＢ細胞はヒトから単離され、次いで前記抗体又は、好ましくは可変ドメインをコードするｃＤＮＡ（場合により、同起源の定常ドメインをコードするｃＤＮＡについても）が単離される。場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列に従ってアライメントされ、それらと一致させられる；例えば、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／）を参照のこと。例えば、真の生殖系列配列から潜在的に逸脱すると見なされるアミノ酸は、クローニング過程の期間中に組み込まれるＰＣＲプライマー配列に起因し得ると思われる。人為的に作製されたヒト様抗体、例えば、ファージディスプレーされた抗体ライブラリー又は異種マウスに由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦＶ）などと比較した場合、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代理動物の免疫応答ではなく、ヒトの免疫応答を使用して得られること、すなわち、抗体が、ヒト体内におけるその関連する立体配座における天然のＨＴＴに対する応答で作製されていること、（ｉｉ）個体を保護しているか、あるいは、ＨＴＴの存在について少なくとも有意であること、そして、（ｉｉｉ）抗体がヒト起源であるので、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最小限に抑えられることによって特徴づけられる。したがって、本発明によれば、用語「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」及び「ヒト抗体」などは、ヒト起源である、すなわち、ヒト細胞（例えば、Ｂ細胞又はそのハイブリドーマなど）から単離されているか、あるいは、ｃＤＮＡがヒト細胞（例えば、ヒトメモリーＢ細胞）のｍＲＮＡから直接クローン化されているＨＴＴ結合性分子を示すために使用される。ヒト抗体は、アミノ酸置換が、例えば、結合特性を改善するために、当該抗体においてたとえ行われるにしても、依然として「ヒト」である。この点において、ヒト化抗体あるいはヒト様抗体と異なり（上記の説明も参照のこと）、本発明のヒト由来抗体はヒト体内でみられるＣＤＲ（ｓ）を含むことによって特徴付けられ、それ故に免疫原性であるリスクを実質的に有しない。従って、本発明の抗体は、可変軽鎖及び重鎖の片方又は両方の少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つ全てのＣＤＲが、ここで説明されるヒト抗体由来であれば、依然としてヒト由来であるとされる。
１つの実施形態において、本発明のヒト由来抗体は、天然の存在する抗体と比較して異種の領域を含み、例えば、フレームワーク領域におけるアミノ酸置換、可変領域に外因的に融合される定常領域、及び、Ｃ末端又はＮ末端における異なるアミノ酸などを含む。
ヒト免疫グロブリンライブラリーに由来する抗体、あるいは、１つ又は複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えであり、かつ、内因性免疫グロブリンを発現しない動物に由来する抗体（下記において、また、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他）に記載されるような抗体）は、本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体として示される。
例えば、ヒト様抗体の重鎖及び軽鎖の対形成、例えば、ファージディスプレーから典型的には単離される合成抗体及び半合成抗体などは、その対形成が元々のヒトＢ細胞において生じていたような元の対形成を必ずしも反映していない。したがって、先行技術において一般に使用されるような組換え発現ライブラリーから得られるＦａｂフラグメント及びｓｃＦｖフラグメントは、免疫原性及び安定性に対するすべての可能な関連した影響に関して人為的であると見なされる。
対照的には、本発明は、その治療的有用性及びヒトにおけるその寛容性によって特徴づけられる、選択されたヒト対象から得られる単離された親和性成熟している抗体を提供する。
本明細書中で使用される場合、用語「齧歯類化（された）抗体」又は「齧歯類化（された）免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体に由来する１つ又は複数のＣＤＲと、齧歯類抗体配列に基づくアミノ酸の置換及び／又は欠失及び／又は挿入を含有するヒトフレームワーク領域とを含む抗体を示す。齧歯類を示すとき、好ましくは、マウス及びラットに起源を有する配列が使用され、この場合、そのような配列を含む抗体は、「マウス化された」又は「ラット化された」としてそれぞれ示される。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは「親」又は「アクセプター」と呼ばれ、フレームワークの変化を提供する齧歯類抗体は「ドナー」と呼ばれる。定常領域は存在している必要はないが、定常領域が存在するならば、定常領域は通常、齧歯類抗体の定常領域と実質的に同一であり、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％が同一であり、好ましくは約９５％以上が同一である。したがって、いくつかの実施形態において、全長のマウス化されたヒト重鎖免疫グロブリン又は軽鎖免疫グロブリンは、マウスの定常領域、ヒトのＣＤＲ、及び、いくつかの「マウス化する」アミノ酸置換を有する実質的にはヒトのフレームワークを含有する。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化された可変軽鎖及び／又はマウス化された可変重鎖を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非マウス性であるので、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」のプロセスによって「マウス化」されている改変された抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、かつ、通常の場合、マウスにおける免疫原性が、親抗体と比較してより低い。「マウス化」抗体に関しての上記説明は、他の「齧歯類化」抗体について、例えば、ラットの配列がマウスの代わりに使用される「ラット化抗体」などについて同様に当てはまる。
本明細書中で使用される場合、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央及び／又は下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインあるいはそれらの変異体又はフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及び、ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及び、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；又は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む場合がある。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部）を欠く場合がある。上記で示されるように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、天然に存在する免疫グロブリン分子からアミノ酸配列において異なるように改変され得ることが、当業者によって理解されるであろう。
本明細書中に開示されるある特定の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体において、マルチマーの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分が、当該マルチマーの第２のポリペプチド鎖における重鎖部分と同一である。代替では、本発明の重鎖部分を含有するモノマーは同一でない。例えば、それぞれのモノマーが、異なる標的結合部位を含む場合があり、これにより、例えば、二重特異性抗体又はディアボディを形成する。
本明細書中で使用される場合、用語「二重特異性（の）」抗体分子又は用語「二機能性（の）」抗体分子は、２つの異なるエピトープ／抗原結合部位を有する抗体分子であり、そのため、２つの異なる標的エピトープについての結合特異性を有する。これら２つのエピトープは、同じ抗原のエピトープであってもよく、又は、異なる抗原のエピトープであってもよい。それらとは対照的に、「二価抗体」は、同一の抗原特異性の結合部位を有する場合がある。二重特異性抗体を作製する様々な方法がこの技術分野では知られている；例えば、実施例３６において例示されるような２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に結合すること、又は、例えば、同様に、２つの抗体フラグメントを化学的に結合すること、例えば、２つのＦａｂフラグメントを化学的に結合すること（Ｂｒｅｎｎａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）、８１〜８３；Ｎｉｔｔａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９（１９８９）、１４３７〜１４４１；Ｇｌｅｎｎｉｅ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９（１９８７）、２３６７〜２３７５；Ｊｕｎｇ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（１９９１）、２４３１〜２４３５）。代替において、二重特異性抗体が組換えにより作製される（Ｇｒｕｂｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１９９４）、５３６８〜５３７４；Ｋｕｒｕｃｚ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（１９９５）、４５７６〜４５８２；Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ及びＶｏｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１９９４）、１９９〜２０６）。従来、二重特異性抗体の組換え製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を共発現させることに基づいており、この場合、２つの重鎖は結合特異性が異なる。重鎖及び軽鎖がランダムに組み合わされるために、１０種の異なる抗体構造の潜在的な混合物がもたらされ、しかし、それらのうちの１つのみが所望の結合特異性を有するだけである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）、５３７〜５４０；Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ及びＳｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７（１９８７）、１０５〜１１１）。代替となる取り組みでは、所望の結合特異性を有する可変ドメインを、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域に融合することが伴う。１つの実施形態において、軽鎖結合のために必要である部位を含有するＣＨ１領域が融合体の少なくとも１つに存在する。これらの融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望されるならば、軽鎖が、別個の発現ベクターに挿入され、その後、好適な宿主生物に共トランスフェクションされる。だが、２つ又は３つすべての鎖のためのコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
別の実施形態において、本明細書中に開示される抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、ただ１つのポリペプチド鎖から構成され（例えば、ｓｃＦｖ）、潜在的なインビボ治療適用及び診断適用のために細胞内で発現させられることになる（細胞内抗体）。
本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための結合性ポリペプチドの重鎖部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分が、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含む場合がある。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラなヒンジを含むことができる。
本明細書中で使用される場合、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分はＶＬドメイン又はＣＬドメインの少なくとも一方を含む。
抗体のためのペプチド又はポリペプチドのエピトープの最小サイズは約４個〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチド又はポリペプチドのエピトープは好ましくは、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲが抗原性のペプチド又はポリペプチドをその三次形態で認識できるので、エピトープを構成するアミノ酸は連続している必要はなく、場合によっては、同じペプチド鎖に存在していなくてもよい。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチド又はポリペプチドのエピトープは、ＨＴＴ、特にエクソン１のＮ末端、ポリＰ領域、Ｐリッチ領域又はＣ末端領域、の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は、約１５個〜約３０個の連続するアミノ酸又は非連続なアミノ酸の配列を含有する。
「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」によって、これらは本明細書中では交換可能に使用されており、結合性分子、例えば、抗体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び、この結合は、抗原結合ドメインとエピトープとの間における何らかの相補性を伴うことが一般に意味される。この定義によれば、抗体は、抗体がランダムな無関係なエピトープに結合するであろうよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的な親和性を限定するために本明細書中では使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープについて、抗体「Ｂ」よりも大きい親和性を有すると見なされる場合があり、又は、抗体「Ａ」は、関連したエピトープ「Ｄ」について有するよりも大きい特異性によりエピトープ「Ｃ」に結合すると言われる場合がある。
存在する場合、抗原との抗体の用語「免疫学的結合特性」又は他の結合特性はその文法的形態のすべてで、抗体の特異性、親和性、交差反応性及び他の結合特性を示す。
「優先的に結合する」によって、結合性分子、例えば、抗体が、関連したエピトープ、類似したエピトープ、相同的なエピトープ又は類似的なエピトープに結合するであろうよりも容易にエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連のエピトープと交差反応することがあるとしても、関連のエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が大きいであろう。
非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも小さい解離定数（ＫＤ）により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１の抗原と優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
別の非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも小さいオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、５×１０−２ｓｅｃ−１以下、１０−２ｓｅｃ−１以下、５×１０−３ｓｅｃ−１以下又は１０−３ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＨＴＴあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４ｓｅｃ−１以下、１０−４ｓｅｃ−１以下、５×１０−５ｓｅｃ−１以下又は１０−５ｓｅｃ−１以下、５×１０−６ｓｅｃ−１以下、１０−６ｓｅｃ−１以下、５×１０−７ｓｅｃ−１以下又は１０−７ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＨＴＴあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＨＴＴあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＨＴＴあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。
結合性分子、例えば、抗体は、所与のエピトープに対する参照抗体の結合をある程度阻止する程度にそのエピトープに優先的に結合するならば、そのエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害が、この技術分野において知られているいずれかの方法によって、例えば、競合的ＥＬＩＳＡアッセイによって求められてもよい。抗体は、所与のエピトープに対する参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％又は少なくとも５０％競合的に阻害すると言われる場合がある。
本明細書中で使用される場合、用語「親和性」は、結合性分子（例えば、免疫グロブリン分子）のＣＤＲとの個々のエピトープの結合の強さの尺度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）、２７頁〜２８頁を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「アビディティー」は、免疫グロブリンの集合と抗原との複合体の全般的な安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的結合強度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ、２９頁〜３４頁を参照のこと）。アビディティーは、特異的なエピトープとの集団内の個々の免疫グロブリン分子の親和性に、及びまた、免疫グロブリン及び抗原の結合価の両方に関連づけられる。例えば、二価のモノクローナル抗体と、高度に反復するエピトープ構造を有する抗原（例えば、ポリマーなど）との間における相互作用が、高いアビディティーの１つであろう。抗原についての抗体の親和性又はアビディティーを、いずれかの好適な方法（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）を参照のこと）及び本明細書中に記載される方法を使用して実験的に求めることができる。抗原についての抗体の親和性を測定するための一般的な技術には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び表面プラズモン共鳴が含まれる。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）のもとで測定されるならば異なる可能性がある。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、ＩＣ５０）の測定は好ましくは、抗体及び抗原の標準化された溶液ならびに標準化された緩衝液を用いて行われる。
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載又は指定される場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「交差反応性」は、抗体（これは１つの抗原について特異的である）が第２の抗原と反応する能力、すなわち、２つの異なる抗原性物質の間における関連度の度合いを示す。したがって、抗体は、その形成を誘導したエピトープとは異なるエピトープに結合するならば、交差反応性である。交差反応性エピトープは一般に、誘導用エピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含有しており、また、場合により、実際には元のエピトープよりも良好にはまる場合がある。
例えば、ある種の抗体は、関連しているが、同一でないエピトープと結合するという点で、例えば、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法及び本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％及び少なくとも５０％の同一性を有するエピトープと結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法及び本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満及び５０％未満の同一性を有するエピトープと結合しないならば、交差反応性をほとんど有していないか、又は全く有していないと言われる場合がある。抗体は、ある特定のエピトープのどのような他のアナログ、オルソログ又はホモログとも結合しないならば、そのエピトープについて「非常に特異的」であると見なされる場合がある。
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体はまた、ＨＴＴ及び／又は、変異した、ミスフォールドした、及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそのフラグメントに対するそれらの結合親和性に関して記載又は指定される場合がある。好ましい結合親和性には、解離定数つまりＫｄが５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満又は１０−１５Ｍ未満である結合親和性が含まれる。
上記で示されたように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元立体配置が広く知られている。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれ、用語「ＣＨ１ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側である。
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」には、従来の番号表記スキームを使用して、例えば、抗体のおよそ残基２４４から残基３６０にまで広がる重鎖分子の一部分が含まれる（残基２４４〜残基３６０、Ｋａｂａｔ番号表記システム；残基２３１〜残基３４０、ＥＵ番号表記システム；Ｋａｂａｔ ＥＡ他（前掲書中）を参照のこと）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対形成しないという点で独特である。むしろ、２つのＮ−連結している分岐した炭水化物鎖が、無傷の生来型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に置かれる。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端にまで広がり、およそ１０８残基を含むこともまた広く記録されている。
本明細書中で使用される場合、用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインにつなぐ重鎖分子の一部分が含まれる。このヒンジ領域はおよそ２５残基を含み、かつ、柔軟であり、したがって、２つのＮ末端の抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は３つの異なったドメイン（上部、中央及び下部のヒンジドメイン）に細分化することができる（Ｒｏｕｘ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）、４０８３〜４０９０を参照のこと）。
本明細書中で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」には、２つのイオウ原子の間に形成される共有結合性の結合が含まれる。アミノ酸のシステインは、ジスルフィド結合を形成することができるか、又は、第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域及びＣＬ領域がジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖が、Ｋａｂａｔ番号表記システムを使用して２３９位及び２４２位（２２６位又は２２９位、ＥＵ番号表記システム）に対応する位置での２つのスルフィド結合によって連結される。
本明細書中で使用される場合、用語「連結される」、「融合される」又は「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲート化又は組換え手段を含むどのような手段によってでも、２つ以上の要素又は成分を一緒につなぐことを示す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチド・オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、これらの元々のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するためにつなぐことを示す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（そのようなセグメントは通常、自然界ではそのようにつながれない）。したがって、読み枠が、融合されたセグメントの全体にわたって連続にされるにもかかわらず、これらのセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的又は空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、インフレーム融合される場合があり、しかし、「融合された」ＣＤＲが、連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又はさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって隔てられる場合がある。
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子が生化学物質（例えば、ＲＮＡ又はポリペプチド）をもたらすプロセスを示す。このプロセスには、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現及び安定的発現の両方を含めて、細胞内における遺伝子の機能的な存在のどのような顕在化も含まれる。このプロセスには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は何らかの他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、及び、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。最終的な所望される産物が生化学物質であるならば、発現には、そのような生化学物質及び何らかの前駆体を生じさせることが含まれる。遺伝子の発現により、「遺伝子産物」がもたらされる。本明細書中で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、又は、転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらもが可能である。本明細書中に記載される遺伝子産物にはさらに、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を伴う核酸、又は、翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、及び、タンパク質分解的切断など）を伴うポリペプチドが含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、対象又は患者から得られる任意の生物学的材料を示す。１つの態様において、サンプルは、血液、腹腔液、ＣＳＦ、唾液又は尿を含むことができる。別の態様において、サンプルは、全血、血漿、血清、血液サンプルから富化されるＢ細胞、及び、培養された細胞（例えば、対象からのＢ細胞）を含むことができる。サンプルにはまた、神経組織を含む生検サンプル又は組織サンプルが含まれ得る。さらに他の態様において、サンプルは、細胞全体及び／又は細胞の溶解物を含むことができる。血液サンプルをこの技術分野において知られている方法によって集めることができる。１つの態様において、ペレットを、２００μｌの緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ．７．５）、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．１ＭのＮａＣｌ、ＩＸのＳｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤、ならびに、ＩＸのＳｉｇｍａホスファターゼ阻害剤１及び２）において４℃でボルテックス処理することによって再懸濁することができる。懸濁物は、断続的なボルテックス処理を行いながら２０分間、氷上に保つことができる。１５，０００×ｇにおいて５分間、約４℃で遠心分離した後、上清のアリコートを約−７０℃で貯蔵することができる。
疾患：
別途言及される場合を除き、用語「障害」及び「疾患」は本明細書中では交換可能に使用され、対象、動物、単離された器官、組織又は細胞／細胞培養物における望まれない任意の生理学的変化を含む。
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子内のＣＡＧトリヌクレオチド反復の伸長によって特徴づけられる常染色体優性かつ進行性の神経変性障害であり（ハンチントン病共同研究グループ、Ｃｅｌｌ ７２（６）（１９９３）、９７１〜９８３）、この場合、この伸長の病原的な閾値がおよそ３７回の反復であり、これに対して、この数未満のより少ない反復は病理発生をもたらさない；例えば、Ｔｒｏｔｔｉｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ ３７８（６５５５）（１９９５）、４０３〜４０６を参照のこと。ＣＡＧトリヌクレオチド反復の伸長により、ハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）のアミノ末端における伸長したポリグルタミン（ポリＧｌｎ、ポリＱ）域が生じている（このことがＨＴＴの凝集に関連する）。しかしながら、ＨＴＴの蓄積及びその関連した症状を引き起こす正確な機構は今までのところ解明されていない。
様々な研究により、ポリグルタミン（ポリＱ）域の両方の隣接領域、すなわち、両親媒性のアルファ−らせん標的化ドメインからなるアミノ末端領域と、２つのプロリン域（ポリＰ領域）及びロイシン−プロリンリッチ域（Ｐリッチ領域）によって特徴づけられるカルボキシ末端領域とが、変異したＨＴＴの毒性を媒介することにおいて非常に重要なようであることが示されている；例えば、Ｃａｒｏｎ他、ＰＮＡＳ １１０（２０１３）、１４６１０〜１４６１５を参照のこと。
ＨＤの病理学的症状（例えば、運動亢進、運動低下、精神障害及び運動障害（情動障害及び衝動を含む）、運動持続性の欠如、無分別な行動及び衝動的な行動、あきらめ及びうつ病、視覚情報処理障害、皮質下認知症、認知能力の喪失、見当識障害及び会話の低下、妄想、腕、足、顔面、頭部及び体幹の不穏状態、舞踏病性運動亢進、構音障害、嚥下障害、構語障害、ジストニアなど）の一因となる機構は今までのところ解明されていない。可能性のある機構には、ＨＴＴの伸長したポリＱ域に起因するヒンジ領域の低下した柔軟性、同様にまた、伸長したポリＱ域に起因する種々のＨＴＴフラグメントの形成を引き起こすプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、ＨＤマウスモデルにおいて治療効果的であることが示されており（例えば、実施例２４及び図１７、同様にまた、実施例３４及び図３４を参照のこと）、加えて、ＨＤ患者から得られる組織切片においてＨＴＴアミロイドに結合することができるので（例えば、実施例３１及び図２７〜図３０を参照のこと）、本発明のヒト由来抗体及びその生物工学誘導体は、ＨＤ及び上記症状の処置及び診断の両方において有用である。したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の様々な抗体、これらの抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞は、ＨＤ（具体的にはＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は障害）の予防的処置及び／又は治療的処置のための医薬組成物又は診断組成物を調製するために、疾患の進行及び／又は処置応答をモニターするために、並びに、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患を診断するために使用される。
処置：
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」又は「処置」は治療的処置及び予防的又は防止的な対策の両方を示し、この場合、その目的が、望まれない生理学的変化又は障害（例えば、糖尿病の発症など）を防止すること又は抑制すること（緩和すること）である。有益な臨床結果又は所望される臨床結果には、検出可能であるか、又は検出不能であるかにかかわりなく、症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は緩速化、疾患状態の改善又は緩和、及び、寛解（部分的又は全体的を問わず）が含まれるが、これに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合の予想された生存と比較して、生存を延ばすことを意味することができる。処置を必要としている人々には、状態又は障害を既に有する人々ならびに状態又は障害を有する傾向がある人々、あるいは、状態又は障害の発現が防止されなければならない人々が含まれる。
別途言及される場合を除き、用語「薬物」、「医薬」又は「医薬品」は本明細書中では交換可能に使用され、下記のすべてを包含するものとするが、それに限定されない：（Ａ）体内使用又は体外使用のための物品、医薬及び調製物、ならびに、ヒト又は他の動物のどちらかの疾患の診断、治療、緩和、処置又は防止のために使用されることが意図されるあらゆる物質又は物質の混合物；ならびに、（Ｂ）ヒト又は他の動物の身体の構造又はどのような機能に対してでも影響を及ぼすことが意図される（食物以外）の物品、医薬及び調製物；ならびに（Ｃ）条項（Ａ）及び条項（Ｂ）において指定されるあらゆる物品の成分としての使用のために意図される物品。用語「薬物」、「医薬」又は「医薬品」は、１つ又は複数の「薬剤」、「化合物」、「物質」又は「（化学的）組成物」をフィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして、また、何らかの他の関連では、他の医薬的に不活性な賦形剤もまた、フィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして含有するか、あるいは、「薬物」、「医薬」又は「医薬品」の容易な輸送、崩壊、解離、溶解及び生物学的利用性を、ヒト又は他の動物の体内の意図された標的場所（例えば、皮膚、胃内又は腸内）において保証する、ヒト又は他の動物のどちらかでの使用のために意図される調製物の完全な処方を包含するものとする。用語「薬剤」、「化合物」又は「物質」は本明細書中では交換可能に使用され、より具体的な関連では、すべての薬理学的に活性な薬剤、すなわち、本発明の方法によって所望の生物学的又は薬理学的な効果を誘発するか、あるいは、そのような可能な薬理学的効果を誘発することができることについて研究又は試験される薬剤を包含するものとするが、これらに限定されない。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」によって、診断、予後、防止又は治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳動物対象、例えば、ヒト患者が意味される。
医薬用キャリア：
医薬的に許容されるキャリア及び投与経路を、当業者に知られている対応する文献から選ぶことができる。本発明の医薬組成物は、この技術分野において広く知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）；Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、米国、２００３）；Ｂａｎｇａ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ（２００６）、ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野では広く知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、広く知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与を種々の方式によって行うことができる。例には、医薬的に許容されるキャリアを含有する組成物を、経口方法、鼻腔内方法、直腸方法、局所的方法、腹腔内方法、静脈内方法、筋肉内方法、皮下方法、真皮下方法、経皮的方法、クモ膜下腔内方法及び頭蓋内方法を介して投与することが含まれる。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤及び等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液又は他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨ及び等張性状態に調節される。経口投与用の医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ナノボディー（商標）」）などもまた、本発明において想定される。そのような経口配合物は、錠剤、カプセル、粉末、液体又は半固体の形態である場合がある。錠剤は、固体のキャリア、例えば、ゼラチン又はアジュバントなどを含む場合がある。直腸投与又は膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある（Ｏ’Ｈａｇａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２（９）（２００３）、７２７〜７３５もまた参照のこと）。様々なタイプの投与のために好適である配合物に関するさらなる指針を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５）及び対応する更新版）において見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（１９９０）、１５２７〜１５３３を参照のこと。
ＩＩ．本発明の抗体
本発明は一般には、ヒト由来抗ＨＴＴ抗体及びＨＴＴ結合性フラグメントに関連し、この場合、これらは好ましくは、実施例において例示される抗体について概略されるような免疫学的結合特性及び／又は生物学的性質を明らかにする。本発明によれば、ＨＴＴについて特異的であるヒトモノクローナル抗体が、健康なヒト対象のプールのＢ細胞からクローン化された。しかしながら、本発明の別の態様では、ヒト抗ＨＴＴモノクローナル抗体はＨＴＴアミロイドーシスに関連する疾患及び／又は障害の症状を示す患者からもクローン化され得る。
本発明に従って行われた実験の過程において、培養されたヒトメモリーＢ細胞の馴化培地に存在する様々な抗体が、ＨＴＴに対する、また、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含めて１０を超える他のタンパク質に対するそれらの結合能について評価された。実施例８、１３、１８、３１及び３３を参照のこと。このスクリーニングにおいてＨＴＴタンパク質に結合することができ、しかし、他のタンパク質のどれにも結合することができないＢ細胞上清のみが、抗体クラス及び軽鎖サブクラスの決定を含めて、さらなる分析のために選択された。選択されたＢ細胞はその後、抗体クローニングのために処理された。
簡単に記載すると、これは、選択されたＢ細胞からのメッセンジャーＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲによる逆転写、ＰＣＲによる抗体コード領域の増幅、プラスミドベクターへのクローニング及び配列決定を行うことにある。選択されたヒト抗体がその後、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞における組換え発現及び精製によって産生され、続いて、ヒトＨＴＴタンパク質と結合するそれらの能力について特徴づけられた。様々な試験の組合せにより、例えば、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞における抗体の組換え発現、そして、ヒトＨＴＴタンパク質に対するそれらの結合特異性の引き続いた特徴づけ、ならびに、その病理学的に変異した形態、及び／又は凝集した形態に対するそれらの弁別的な結合により、ＨＴＴについて非常に特異的であり、かつ、ＨＴＴタンパク質の病理学的に凝集した形態を弁別的に認識し、それらと選択的に結合するヒト抗体が今回初めてクローン化されたことが確認された。場合により、マウスキメラ抗体もまた、本発明のヒト抗体の可変ドメインに基づいて作製された。
したがって、本発明は一般には、組換えのヒト由来モノクローナル抗ＨＴＴ抗体ならびにＨＴＴ結合性フラグメント、合成及び生物工学誘導体及び変異体に関連する。本発明の１つの実施形態において、抗体はヒトＨＴＴと結合することができる。
本発明の１つの実施形態において、抗体はＨＴＴの下記のエピトープと特異的に結合する：アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰを含むポリＰ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１；ＮＩ−３０２．４４Ｄ７；ＮＩ−３０２．７Ａ８；ＮＩ−３０２．３Ｄ８；ＮＩ−３０２．４６Ｃ９）（配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６１）、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰを含むポリＰ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９）（配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０）、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰを含むポリＰ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６）（配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６）、アミノ酸配列ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、配列番号１４０；ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、配列番号２００）、アミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、配列番号１４１）、アミノ酸配列ＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＰＰＰＰを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．２Ａ２、配列番号１４２）、又は、アミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ３０２．１５Ｄ３、配列番号１４３）、アミノ酸配列ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰを含むＣ末端領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、配列番号１４５）、又は、アミノ酸配列ＰＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨを含むＣ末端領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０、配列番号２０２）、アミノ酸配列ＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱを含むＮ末端領域内のエピトープ（ＮＩ−ＮＩ−３０２．１５Ｅ８、配列番号１４４）、又は、アミノ酸配列ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＰＰＰを含むＰ／Ｑリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．７Ｄ８、配列番号２０１）、或いは、立体配座エピトープ。
別の実施形態において、本発明は、下記のような抗ＨＴＴ抗体、或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関し、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７Ａ８、３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．３Ｄ８、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．８Ｆ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９、ＮＩ−３０２．４６Ｃ９からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのポリＰ領域内のエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングでは、アミノ酸ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６）を含むヒトＨＴＴのポリＰ領域内部の配列が、本発明の抗体であるＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６によって認識される特有の線状エピトープとして特定された。加えて、エピトープマッピングでは、アミノ酸ＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６１）を含むヒトＨＴＴのポリＰ領域内部の配列が、本発明の抗体であるＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．７Ａ８、ＮＩ−３０２．３Ｄ８、ＮＩ−３０２．４６Ｃ９によって認識される特有の線状エピトープとして特定され、アミノ酸ＰＰＰＰＰＰ（配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０）を含むヒトＨＴＴのポリＰ領域内部の配列が、本発明の抗体であるＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９によって認識される特有の線状エピトープとして特定された。したがって、１つの実施形態において、ＨＴＴのポリＰ領域におけるエピトープで、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６）を含むエピトープ、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６１）を含むエピトープ、又は、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰ（配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０）を含むエピトープに特異的に結合する本発明の抗体が提供される。
１つの実施形態において、本発明は、下記のような抗ＨＴＴ抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関し、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、ＮＩ−３０２．２Ａ２及びＮＩ−３０２．１５Ｄ３からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのＰリッチ領域内のエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングでは、アミノ酸ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号１４０）を含むヒトＨＴＴのＰリッチ領域内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３によって認識される特有な線状エピトープとして特定され、アミノ酸ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰ（配列番号１４１）を含むヒトＨＴＴのＰリッチ領域内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１によって認識される特有な線状エピトープとして特定され、アミノ酸ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰ（配列番号１４１）を含むヒトＨＴＴのＰリッチ領域内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１によって認識される特有な線状エピトープとして特定され、アミノ酸ＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＰＰＰＰ（配列番号１４２）を含むヒトＨＴＴのＰリッチ領域内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．２Ａ２によって認識される特有な線状エピトープとして特定され、アミノ酸ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号１４３）を含むヒトＨＴＴのＰリッチ領域内の配列が、本発明の抗体ＮＩ３０２．１５Ｄ３によって認識される特有な線状エピトープとして特定され、アミノ酸ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬを含むヒトＨＴＴのＰリッチ領域内の配列が、本発明の抗体ＮＩ３０２．６４Ｅ５によって認識される特有な線状エピトープとして特定された。したがって、１つの実施形態において、ＨＴＴのＰリッチ領域におけるエピトープで、アミノ酸配列ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号１４０）を含むエピトープ、アミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰ（配列番号１４１）を含むエピトープ、アミノ酸配列ＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＰＰＰＰ（配列番号１４２）を含むエピトープ、アミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号１４３）を含むエピトープに特異的に結合する本発明の抗体が提供される。
別の実施形態において、本発明は、下記のような抗ＨＴＴ抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関し、この場合、抗体は、参照抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８と同じＨＴＴのポリＱ／ポリＰ領域内のエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングでは、アミノ酸ＱＱＱＱＱＱＱＰＰＰ（配列番号２０１）を含むヒトＨＴＴのＱ／Ｐリッチ領域内部の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８によって認識される特有な線状エピトープとして特定された。したがって、１つの実施形態において、ＨＴＴのポリＱ／ポリＰ領域におけるエピトープで、アミノ酸配列ＱＱＱＱＱＱＱＰＰＰ（配列番号２０１）を含むエピトープに特異的に結合する本発明の抗体が提供される。
１つの実施形態において、本発明は、下記のような抗ＨＴＴ抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関し、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのＣ末端領域内のエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングでは、アミノ酸ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ（配列番号１４５）を含むヒトＨＴＴのＣ末端領域内部の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１によって認識される特有な線状エピトープとして特定された。したがって、１つの実施形態において、ＨＴＴのＣ末端領域におけるエピトープで、アミノ酸配列ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ（配列番号１４５）を含むエピトープに特異的に結合する本発明の抗体が提供される。
さらなる実施形態において、本発明は、下記のような抗ＨＴＴ抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関し、この場合、抗体は、参照抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０と同じＨＴＴのＣ末端領域内のエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングでは、アミノ酸ＰＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨ（配列番号２０２）を含むヒトＨＴＴのＣ末端領域内部の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０によって認識される特有な線状エピトープとして特定された。したがって、１つの実施形態において、ＨＴＴのＣ末端領域におけるエピトープで、アミノ酸配列ＰＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨ（配列番号２０２）を含むエピトープに特異的に結合する本発明の抗体が提供される。
別の実施形態において、本発明は、下記のような抗ＨＴＴ抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関し、この場合、抗体は、参照抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８と同じＨＴＴのＮ末端領域内のエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングでは、アミノ酸ＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ（配列番号１４４）を含むヒトＨＴＴのＮ末端領域内部の配列が、本発明の抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８によって認識される特有な線状エピトープとして特定された。したがって、１つの実施形態において、ＨＴＴのＮ末端領域におけるエピトープで、アミノ酸配列ＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ（配列番号１４４）を含むエピトープに特異的に結合する本発明の抗体が提供される。
１つの実施形態において、本発明は、下記のような抗ＨＴＴ抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関し、この場合、抗体は、ＨＴＴエクソン１の線状エピトープに結合するのではなく、２１個又は４９個のポリＱを有する凝集したＨＴＴエクソン１タンパク質（ＨＤ２１及びＨＤ４９）に大きい親和性及びサブナノモル濃度範囲でのＥＣ５０値により結合することが示されているＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３０２．４Ａ６、ＮＩ−３０２．１２Ｈ２又はＮＩ−３０２．８Ｍ１からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴエクソン１のエピトープに特異的に結合する；例えば、概略については実施例２５及び図２０を参照のこと。したがって、１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＨＴＴの凝集した形態（具体的にはＨＴＴエクソン１に由来するタンパク質凝集物）と、１ｎＭ未満のＥＣ５０値で、好ましくは０．１ｎＭ未満のＥＣ５０値で、最も好ましくは０．０１ｎＭ未満のＥＣ５０値で特異的に結合する。
そのうえ、実施例において明らかにされるような、また、図に示されるような初期の実験観測結果によってとらわれることが意図されないが、本発明のヒトモノクローナル抗ＨＴＴ抗体であるＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、ＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、ＮＩ−３０２．８Ｆ１、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７Ａ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．３Ｄ８並びにＮＩ．３０２−６４Ｅ５及びＮＩ．３０２−７２Ｆ１０は好ましくは、病理学的な変異したＨＴＴ及び／又は凝集したＨＴＴに特異的に結合し、かつ、実質的により小さい親和性にではあるが、生理学的形態でのＨＴＴを認識することにおいて特徴づけられる；例えば、実施例７、実施例１３、実施例１８、及び、図３、図７、図１１、図２１、図３２を参照のこと。したがって、本発明は、診断目的及び治療目的のために特に有用である結合特性を有する一組のヒト抗ＨＴＴ抗体を提供する。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＨＴＴの病理学的に凝集した形態と特異的に結合することができる抗体を提供する。しかしながら、加えて、又は代替において、ＨＴＴエクソン１のポリＰ領域又はＰリッチ領域に結合することができる本発明の抗体はまた、他の用途で利用される場合がある。具体的には、これらの抗体はＨＴＴに限定されるのではなく、ポリＰ域又はＰリッチ領域もまた示す他の標的にも結合することができる。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、実施例で記載されるような例示的抗体のＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、ＮＩ．３０２−７Ｄ８及びＮＩ．３０２−７２Ｆ１０の結合特性を示す。本発明の抗ＨＴＴ抗体は、生理学的なＨＴＴではなく、むしろ、病理学的に変化したＨＴＴ（例えば、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種並びにそれらのフラグメントなど）を優先的に認識する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、生理学的なＨＴＴ種を実質的に認識しない。
用語「実質的に認識しない」は、抗体、そのフラグメント、あるいは、特定の標的分子、特定の抗原、ならびに／又は、前記標的分子及び／もしくは抗原の特定の立体配座についての結合性分子を含む一群の分子の結合親和性を記述するために本出願において使用されるときには、前述の群の分子が、別の分子、抗原及び／又は立体配座と結合することについての前述の群の分子の結合親和性の２分の１未満である、３分の１未満である、４分の１未満である、５分の１未満である、６分の１未満である、７分の１未満である、８分の１未満である、又は９分の１未満である結合親和性により、前記の分子、抗原及び／又は立体配座と結合することを意味する。非常に多くの場合、解離定数（ＫＤ）が、結合親和性の尺度として使用される。ときには、結合親和性の尺度として使用されるのが、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイのような特異的アッセイでのＥＣ５０である。好ましくは、用語「実質的に認識しない」は、本出願において使用されるときには、前述の群の分子が、別の分子、抗原及び／又は立体配座に対する結合についての前述の群の前記分子の結合親和性の１０分の１未満である、２０分の１未満である、５０分の１未満である、１００分の１未満である、１０００分の１未満である、又は１００００分の１未満である結合親和性により、前記の分子、抗原及び／又は立体配座と結合することを意味する。
上記で記載されるように、ＨＤにおけるＨＴＴの凝集は、ＨＴＴエクソン１の内部におけるポリグルタミン域の伸長に起因して生じることが示唆される。具体的には、ＨＤが、ＨＴＴにおける長さで３５個〜４０個のグルタミン残基を越える閾値を有する患者において主に生じることが示されている。したがって、実施例３において示されるように、２１回、３５回または４９回のポリＱ反復を有するＨＴＴエクソン１の凝集型構築物および可溶性構築物が、病理学的な変化したＨＴＴに特異的に結合する本発明の抗ＨＴＴ抗体の有用性を確認するために作製された。
下記で使用されるような用語ＨＤＸにより、実施例３に従って作製されたＨＴＴ構築物が表される。具体的には、Ｘはグルタミン反復（Ｑ）の数を示す；例えば、２１回のポリＱ反復を有するＨＴＴエクソン１タンパク質がＨＤ２１として示されることになる。
実施例で記載されるような構築物を利用して、本発明の抗ＨＴＴ抗体はさらに、又は代わりに、病理学的に疾患原因となる形態及び／又は変異した形態及び／又は凝集した形態のヒトＨＴＴに結合することが示され得るかもしれない。この関連において、結合親和性が、例示的抗体のＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、ＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、ＮＩ−３０２．８Ｆ１、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７Ａ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．１１Ｈ６及びＮＩ−３０２．３Ｄ８について、図３（Ａ）、図７（Ａ）、図１１（Ａ）、図１４（Ａ）、それぞれの図１９、図２０及び図３１に示されるような範囲、すなわち、ヒト凝集型ＨＤ４９−ＨＴＴ及び凝集型組換えＨＤ４９−ＨＴＴについては最大半有効濃度（ＥＣ５０）が約１ｐＭ〜２５０ｎＭであり、好ましくはＥＣ５０が約２５ｐＭ〜５０ｎＭであり、最も好ましくはＥＣ５０が約０．０５ｎＭ〜３０ｎＭであり、又は、ヒト凝集型ＨＤ２１−ＨＴＴ及び凝集型組換えＨＤ２１−ＨＴＴについてはＥＣ５０が約０．０５ｐＭ〜５ｎＭである範囲にある場合がある。
具体的には、抗ＨＴＴ抗体、その結合性フラグメント又は生物工学誘導体は、凝集したＨＤ４９−ＨＴＴと結合することについては２０ｎＭ以下（好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下）のＥＣ５０値に対応する結合親和性、及び／又は、ＨＤ２１ ＨＴＴと結合することについては４０ｎＭ以下（好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下）のＥＣ５０値に対応する結合親和性を有する；図３、図７、図１１、図１９及び図３１を参照のこと。
ＨＤの発症に伴うＨＴＴ凝集が最も頻繁には、３５回の反復を越えるポリグルタミン（ポリＱ）域と関連している。本発明において示されるように、本明細書中に記載される抗ＨＴＴ抗体は、より多くの反復を有するＨＤ域に対する大きい結合効率を示した；例えば、実施例７、実施例１３、実施例１８、実施例３１及び実施例３３を参照のこと。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性の分子、フラグメント、合成又は生物工学変異体は、伸長したポリグルタミン（Ｑ）域を有するＨＴＴに結合する。好ましい実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性の分子、フラグメント、合成又は生物工学変異体は、３５回を越える反復を有するＨＴＴに結合する。本発明の特に好ましい実施形態において、抗体は、４９（ＨＤ４９）反復からなる伸長したポリグルタミン（Ｑ）域を有するＨＴＴに対して、３５回の反復（ＨＤ３５）の場合よりも結合し、２１回の反復（ＨＤ２１）の場合よりも一層結合する。
しかしながら、本発明によれば、３５（ＨＤ３５）未満のポリグルタミン（ポリＱ）域に結合する抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性の分子、フラグメント、合成又は生物工学変異体もまた記載される。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗体、その結合性の分子又は変異体は、「正常な」ポリＱ域を示すＨＴＴに結合する。具体的には、抗体は、３５（ＨＤ３５）未満のポリＱ域を有するＨＴＴに結合することができる。
いくつかの抗体は広範囲の数々の生体分子（例えば、タンパク質）に結合することができる。当業者は理解するであろうように、特異的（な）という用語は、ＨＴＴタンパク質又はそのフラグメントでない他の生体分子が抗原結合性分子（例えば、本発明の抗体の１つ）に有意に結合しないことを示すために本明細書中では使用される。好ましくは、ＨＴＴ以外の生体分子に対する結合のレベルにより、ＨＴＴに対する親和性の最大でもほんの２０％以下、１０％以下、ほんの５％以下、ほんの２％以下、又は、ほんの１％以下（すなわち、５分の１未満、１０分の１未満、２０分の１未満、５０分の１未満又は１００分の１未満、或いは、それよりも小さいどのような程度でも）である結合親和性がそれぞれもたらされる；例えば、図２０を参照のこと。
１つの実施形態において、本発明の抗ＨＴＴ抗体は、ＨＴＴ並びに／或いはそのフラグメント、誘導体、原線維及び／又はオリゴマーの凝集した形態に優先的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗ＨＴＴ抗体は、生来型ＨＴＴと、ＨＴＴの病理学的に変異した形態及び／又は凝集した形態との両方に優先的に結合する。
本発明のさらなる実施形態において、抗ＨＴＴ抗体或いはそのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体は二重特異性抗体である。したがって、本発明の抗体は、同じ抗原における、又は異なる抗原における、そのどちらであって少なくとも２つの異なったエピトープを認識することができる場合がある（上掲もまた参照のこと）。
１つの実施形態において、二重特異性抗体の少なくとも１つの結合部位／ドメインはＨＴＴの下記のエピトープを特異的に認識する：アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰを含むポリＰ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１；ＮＩ−３０２．４４Ｄ７；ＮＩ−３０２．７Ａ８；ＮＩ−３０２．３Ｄ８；ＮＩ−３０２．４６Ｃ９）（配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６１）、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰを含むポリＰ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９）（配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０）、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰを含むポリＰ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６）（配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６）、アミノ酸配列ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、配列番号１４０；ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、配列番号２００）、アミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、配列番号１４１）、アミノ酸配列ＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＰＰＰＰを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．２Ａ２、配列番号１４２）、又は、アミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬを含むＰリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ３０２．１５Ｄ３、配列番号１４３）、アミノ酸配列ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰを含むＣ末端領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、配列番号１４５）、又は、アミノ酸配列ＰＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨを含むＣ末端領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０、配列番号２０２）、アミノ酸配列ＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱを含むＮ末端領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．１５Ｅ８、配列番号１４４）、アミノ酸配列ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＰＰＰを含むＰ／Ｑリッチ領域内のエピトープ（ＮＩ−３０２．７Ｄ８、配列番号２０１）、或いは、下記抗体のいずれか１つによって認識される立体配座エピトープ：ＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３０２．４Ａ６、ＮＩ−３０２．１２Ｈ２又はＮＩ−３０２．８Ｍ１。
前記で述べられたように、ニューロン核内封入体におけるポリグルタミン（ポリＧｌｎ、ポリＱ）含有ＨＴＴタンパク質凝集物の蓄積が、進行性の神経変性障害であるハンチントン病（ＨＤ）の主要な特徴である。これらの凝集物の電子顕微鏡写真により、アルツハイマー病におけるＢ−アミロイド原線維の場合のような密接に関連した形態学を示す原線維構造物が明らかにされた；例えば、Ｃａｕｇｈｅｙ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７（１９９７）、５６〜６２、及び、Ｃａｐｕｔｏ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９２（１９９２）、１９９〜２０５を参照のこと。このことは、ＨＤ（ＨＤでは、変性プロセスには主として、機能不全及びその後にはニューロンの喪失に至る中間の棘状線条体ニューロン及び皮質ニューロンが伴う）、興奮毒性に起因する組織損傷、ミトコンドリア損傷、フリーラジカル、そして、おそらくは同様に、ミクログリア活性化を含む炎症性機構、及び、さらには症状の進行的性質が、毒性アミロイド原線維形成の結果であることを示唆している。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、ハンチントン病（ＨＤ）及びその症状を処置するために有用である。
今までのところ、様々な細胞内発現された抗体（細胞内抗体）が、ＨＴＴの機能を乱すＨＤにおける治療ツールとして記載されており、また、ＨＴＴの機能を乱すＨＤにおける治療ツールであると見なされている；例えば、Ａｌｉ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｌｏ他、第１０章、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２０１１）を参照のこと。これらの細胞内抗体は、ＨＴＴによって誘発される凝集及び細胞死に対する明確な効果を細胞に基づくアッセイにおいて示した（例えば、Ｋｈｏｓｈｎａｎ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９９（２００２）、１００２〜１００７を参照のこと）にもかかわらず、それらの治療的有用性における１つの不都合な点が投与経路である。具体的には、治療用の細胞内抗体を脳に送達するための好ましい方法は、ウイルスベクターに基づく遺伝子治療である。しかしながら、この種の投与を使用することの大きな不都合がとりわけ、宿主免疫原性が大きいことである。したがって、他の投与経路を利用する非ウイルス法が、治療的又は診断的な取り組みにおいて好ましくは使用される。本発明の抗体は、培養培地に加えたとき、すなわち、細胞外に加えたとき、樹状突起棘密度喪失を弱めることが示されている。したがって、前記で記載された細胞内抗体とは対照的に、本発明の抗体は、治療的に好ましい投与経路に従って有効であると予想することができる。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗体が、皮下注入（ｓ．ｃ．）、静脈内注入（ｉ．ｖ．）、筋肉内注入（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、クモ膜下腔内、ジェット式注入によって投与され、ただし、この場合、作用半径は当該抗体の細胞内発現に限定されない。
前記で既に述べられたように、また、実施例２４及び図１７において示されるように、本発明の抗体の治療的有用性が示されている。具体的には、本発明の抗ＨＴＴ抗体は樹状突起棘密度喪失を弱めることができることが示されている。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体は、棘密度喪失を弱めることをもたらす。
そのうえ、本発明の抗体の治療的有用性が実施例３４及び図３４において明らかにされている。具体的には、本発明の抗ＨＴＴ抗体は、課題特異的訓練の期間中における行動回復を改善し、かつ、運動能力を高めることが示されている。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体は、課題特異的訓練の期間中における行動成績の改善と、感覚運動能の強化とをもたらす。
本発明はまた、下記のような抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に向けられ、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、ＮＩ−３０２．２Ａ２、ＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７Ａ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．３Ｄ８、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．８Ｆ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９、ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、ＮＩ−３０２．１５Ｅ８、ＮＩ−３０２．１５Ｄ３、ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、ＮＩ−３０２．７Ｄ８、ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０、ＮＩ−３０２．１２Ｈ２、ＮＩ−３０２．８Ｍ１及びＮＩ−３０２４Ａ６からなる群から選択される抗体の抗原結合ドメインと同一である抗原結合ドメインを含む。
本発明ではさらに、その可変領域において、例えば、結合ドメインにおいて、図１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ可変領域及び／又はＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴づけられることがある、ＨＴＴのポリＰ領域を認識するいくつかの結合性分子（例えば、抗体及びその結合性フラグメント）が例示される。上で特定された可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列が下記の表ＩＩに示される。ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットが図１に示される。しかしながら、下記で議論されるように、当業者は、加えて、又は代替において、様々なＣＤＲが使用されることがあり、この場合、これらのＣＤＲは、それらのアミノ酸配列において、図１に示されるアミノ酸配列から、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、又は、それどころか、それ以上のアミノ酸によって異なるという事実を十分に承知している。したがって、１つの実施形態において、図１に示されるような少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに／或いは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むその１つ又は複数のＣＤＲをその可変領域に含む本発明の抗体又はそのＨＴＴ結合性フラグメントが提供される。
さらに、本発明では、その可変領域において、例えば、結合ドメインにおいて、図１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ可変領域及び／又はＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴づけられることがある、ＨＴＴのＰリッチ領域を認識するいくつかの結合性分子（例えば、抗体及びその結合性フラグメント）が例示される。上で特定された可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列が下記の表ＩＩＩに示される。ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットが図１に示される。しかしながら、下記で議論されるように、当業者は、加えて、又は代替において、様々なＣＤＲが使用されることがあり、この場合、これらのＣＤＲは、それらのアミノ酸配列において、図１に示されるアミノ酸配列から、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、又は、それどころか、それ以上のアミノ酸によって異なるという事実を十分に承知している。したがって、１つの実施形態において、図１に示されるような少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに／或いは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むその１つ又は複数のＣＤＲをその可変領域に含む本発明の抗体又はそのＨＴＴ結合性フラグメントが提供される。
加えて、本発明では、その可変領域において、例えば、結合ドメインにおいて、図１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ可変領域及び／又はＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴づけられることがある、ＨＴＴのＣ末端領域を認識するいくつかの結合性分子（例えば、抗体及びその結合性フラグメント）が例示される。上で特定された可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列が下記の表ＩＶに示される。ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットが図１に示される。しかしながら、下記で議論されるように、当業者は、加えて、又は代替において、様々なＣＤＲが使用されることがあり、この場合、これらのＣＤＲは、それらのアミノ酸配列において、図１に示されるアミノ酸配列から、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、又は、それどころか、それ以上のアミノ酸によって異なるという事実を十分に承知している。したがって、１つの実施形態において、図１に示されるような少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに／或いは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むその１つ又は複数のＣＤＲをその可変領域に含む本発明の抗体又はそのＨＴＴ結合性フラグメントが提供される。
本発明ではさらに、その可変領域において、例えば、結合ドメインにおいて、図１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ可変領域及び／又はＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴づけられることがある、いくつかのそのような結合性分子、例えば、ＨＴＴのＮ末端領域を認識する抗体及びその結合性フラグメントが例示される。上記の可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列が、下記において表ＩＶにそれぞれ示される。ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットが図１に示される。しかしながら、下記において議論されるように、当業者は、加えて、又は、代替において、様々なＣＤＲが使用されてもよく、この場合、これらのＣＤＲは、それらのアミノ酸配列において、図１にそれぞれ示されるアミノ酸配列から、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、又は、それ以上のアミノ酸が異なるという事実を十分に承知している。したがって、１つの実施形態において、図１に示される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び／又は、図１に示されるＣＤＲに１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでなるＣＤＲの１つ又は複数をその可変領域に含む本発明の抗体あるいはＨＴＴ結合性フラグメントが提供される。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、図１に示されるＶＨ領域及び／又はＶＬ領域、あるいは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むそのＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のいずれか１つである。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＢ細胞に存在したような重鎖及び軽鎖の同族性の対形成の保存によって特徴づけられる。
本発明のさらなる実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、ＨＴＴ結合性フラグメント、それらの合成又は生物工学変異体は、標的に対する適切な結合親和性、及び、適切な薬物動態学的特性を有するように最適化することができる。したがって、グリコシル化、酸化、脱アミノ化、ペプチド結合切断、イソアスパラギン酸形成及び／又は不対システインからなる群から選択される修飾を受けやすいＣＤＲ領域内又は可変領域内の少なくとも１つのアミノ酸が、そのような変化を欠く変異アミノ酸によって置換され、あるいは、少なくとも１つの炭水化物成分が化学的又は酵素的に除かれ、又は抗体に付加される。アミノ酸最適化のための様々な例を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１２１１４０及び同ＷＯ２０１２／０４９５７０に見出すことができる。抗体特性を最適化するさらなる修飾が、Ｇａｖｅｌ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（１９９０）、４３３〜４４２、及び、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７３（２００４）、１０１９〜１０４９に記載される。
代替では、本発明の抗体は、ＨＴＴに対する結合について、図１に示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域を有する抗体の少なくとも１つと競合する抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、誘導体又は変異体である。
図１に示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域を有する少なくとも１つの抗体がＨＴＴへの結合について競合する抗体は、実施例６、実施例１３、実施例１８、実施例３１及び／又は実施例３２に記載されるように、ドットブロットアッセイ及び／又はフィルター遅延においてさらに特徴づけられる場合がある。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗体は、ドットブロットアッセイ及び／又はフィルター遅延においてＨＴＴに対して、好ましくは、４９（ＨＤ４９）反復からなる伸長したポリＱ域を有するＨＴＴに対して結合する。
図３、図７、図１１、図２１、図２２、同様にまた、図３２及び図３３、並びに、実施例６、実施例７、実施例１３、実施例１８、実施例２６及び実施例３２において提供される実験結果から、本発明の抗ＨＴＴ抗体のいくつかは、疾患を引き起こす変異した形態及び／又は凝集した形態のヒトＨＴＴに対して、他のアミロイド形成タンパク質よりも優先的に結合することが示唆される。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、変異したＨＴＴ及び／又は凝集したＨＴＴ並びに／或いはそれらのフラグメント及び／又は誘導体を他のアミロイド形成タンパク質よりも優先的に認識する。
本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学誘導体はまさに、ＨＴＴの変異した形態、凝集した形態及び／又は可溶性の形態を生理学的なＨＴＴよりも優先的に認識する。
本発明の抗体は、治療適用のためには特に、ヒトの抗体である場合がある。代替では、本発明の抗体は、動物における診断方法及び研究のために特に有用である齧歯類抗体、齧歯類化抗体又は齧歯類−ヒトのキメラ抗体、好ましくは、マウス抗体、マウス化抗体又はマウス−ヒトのキメラ抗体、あるいは、ラット抗体、ラット化抗体又はラット−ヒトのキメラ抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗体は齧歯類−ヒトのキメラ抗体又は齧歯類化抗体である。さらには、１つの実施形態において、本発明のキメラ抗体、すなわち、ヒト抗体の可変ドメインと、マウスの一般的な軽鎖定常ドメイン及び重鎖定常ドメインとを含むキメラ抗体はヒトＨＴＴに大きい親和性で結合する。好ましくは、キメラ抗体の結合親和性はそれらのヒト対応物と類似している。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、培養される単一のＢ細胞又はオリゴクローナルなＢ細胞の培養物、及び、前記Ｂ細胞によって産生される抗体を含有する培養物の上清によって提供され、それらにおける抗ＨＴＴ抗体の存在及び親和性についてスクリーニングされる。スクリーニングプロセスは、合成された全長型ｈＨＴＴペプチドに由来する、或いは例えばヒト血漿又は組換え発現から精製されたｈＨＴＴのオリゴマーのような生来型モノマー凝集物、原線維性凝集物又は非原線維性凝集物に対する結合についてのスクリーニングを含む。
上記で述べられるように、ヒト免疫応答でのその生成のために、本発明のヒトモノクローナル抗体は、特定の病理学的関連性を有し、かつ、例えば、マウスモノクローナル抗体の作製のための免疫化プロセス、及び、ファージディスプレーライブラリーのインビトロスクリーニングの場合には接近可能でないかもしれないか、又はより低い免疫原性であるかもしれないエピトープをそれぞれ認識するであろう。したがって、本発明のヒト抗ＨＴＴ抗体のエピトープは独特であること、及び、本発明のヒトモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合することができる他の抗体が存在しないことを明記することは賢明である。本発明の抗体の独特さについてさらに示すものが、図１９、２０、２４及び２７〜２９において示されるように、本発明の抗体は、ＨＴＴの変異した形態、及び／又は凝集した形態に特異的なエピトープ（これは上記で示されるように、特定の病理学的関連性を有し、かつ、抗体作製のための通常的なプロセス（例えば、免疫化又はインビトロライブラリースクリーニングなど）によって同様に得ることができないかもしれない）と結合するという事実である。
したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、一般には、ＨＴＴに対する特異的な結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗ＨＴＴ抗体及びＨＴＴ結合性分子にまで及ぶ。本発明はより具体的には、下記のような抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７Ａ８、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．３Ｄ８、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．８Ｆ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２及びＮＩ−３０２．４６Ｃ９からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのポリＰ領域内のエピトープに特異的に結合する。さらに、１つの実施形態において、本発明はより具体的には、下記のような抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、ＮＩ−３０２．２Ａ２、ＮＩ−３０２．１５Ｄ３及び／又はＮＩ−３０２．６４Ｅ５からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのＰリッチ領域内のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、本発明は、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１及び／又はＮＩ−３０２．７２Ｆ１０からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのＣ末端領域内のエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。さらなる実施形態において、本発明は、ＮＩ−３０２．１５Ｅ８からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのＮ末端領域内のエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。別の実施形態において、本発明は、ＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３２０．１２Ｈ２、ＮＩ−３０２．８Ｍ１及び／又はＮＩ−３０２．４Ａ６からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。１つの実施形態において、本発明は、参照抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８と同じＨＴＴのエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。
好ましい実施形態において、本発明はまた、一般には、実施例７、実施例１３、実施例１８、実施例３１及び実施例３３、同様にまた、図７、図１３、図１９及び図３１において示されるように、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそれらのフラグメントに対する特異的な結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗ＨＴＴ抗体及びＨＴＴ結合性分子にまで及ぶ。したがって、本発明はより具体的には、下記のような抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体にもまた関しており、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、ＮＩ−３０２．７Ａ８、ＮＩ−３０２．３Ｄ８、ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、ＮＩ−３０２．１８Ａ１、ＮＩ−３０２．５２Ｃ９及び／又はＮＩ−３０２．８Ｆ１からなる群から選択される参照抗体と同じ、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそのフラグメントのポリＰ領域内のエピトープに特異的に結合する。さらに、１つの実施形態において、本発明はより具体的には、下記のような抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、抗体は、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、ＮＩ−３０２．２Ａ２、ＮＩ−３０２．１５Ｄ３及び／又はＮＩ−３０２．６４Ｅ５からなる群から選択される参照抗体と同じ、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそのフラグメントのＰリッチ領域内のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、本発明は、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１及び／又はＮＩ−３０２．７２Ｆ１０からなる群から選択される参照抗体と同じ、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそのフラグメントのＣ末端領域内のエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。さらなる実施形態において、本発明は、ＮＩ−３０２．１５Ｅ８からなる群から選択される参照抗体と同じ、変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種或いはそのフラグメントのＮ末端領域内のエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。別の実施形態において、本発明は、ＮＩ−３０２．６Ｎ９、ＮＩ−３２０．１２Ｈ２、ＮＩ−３０２．８Ｍ１及び／又はＮＩ−３０２．４Ａ６からなる群から選択される参照抗体と同じＨＴＴのエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。１つの実施形態において、本発明は、参照抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８と同じＨＴＴのエピトープに結合する抗体或いはその抗原結合性フラグメント、変異体又は生物工学誘導体に関する。
抗体間の競合が、試験下にある免疫グロブリンが共通の抗原（ＨＴＴなど）に対する参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって求められる。数多くのタイプの競合的結合アッセイが知られている：例えば、固相での直接的又は間接的な放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相での直接的又は間接的な酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９（１９８３）、２４２〜２５３を参照のこと）、固相での直接的なビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６）、３６１４〜３６１９、及び、Ｃｈｅｕｎｇ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６（１９９０）、５４６〜５５２を参照のこと）、固相での直接的な標識化アッセイ、固相での直接的な標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと）、Ｉ１２５標識を使用する固相での直接的な標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８）、７〜１５、及び、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９０）、７７〜８２を参照のこと）。典型的には、そのようなアッセイは、精製されたＨＴＴ又は変異した及び／又は凝集したＨＴＴ（例えば、固体表面、又は、これらのどちらかを有する細胞に結合させたオリゴマー及び／又はその原線維など）と、標識されていない試験用免疫グロブリン及び標識された参照用免疫グロブリン（すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体）とを使用することを伴う。競合的阻害が、試験用免疫グロブリンの存在下において固体表面又は細胞に結合する標識の量を求めることによって測定される。通常、試験用免疫グロブリンは過剰に存在する。好ましくは、競合的結合アッセイが、添付された実施例においてＥＬＩＳＡアッセイについて記載されるような条件のもとで行われる。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び、立体的障害が生じるために、参照抗体が結合するエピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。通常の場合、競合抗体が過剰に存在するときには、競合抗体により、共通の抗原に対する参照抗体の特異的な結合が少なくとも５０％又は７５％阻害されるであろう。したがって、本発明はさらに、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１，ＮＩ−３０２．６３Ｆ３，ＮＩ−３０２．３５Ｃ１，ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１，ＮＩ−３０２．２Ａ２，ＮＩ−３０２．６Ｎ９，ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１，ＮＩ−３０２．１５Ｆ９，ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２，ＮＩ−３０２．１１Ａ４，ＮＩ−３０２．２２Ｈ９，ＮＩ−３０２．４４Ｄ７，ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２，ＮＩ−３０２．５５Ｄ８，ＮＩ−３０２．７Ａ８，ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２，ＮＩ−３０２．７１Ｆ６，ＮＩ−３０２．１１Ｈ６，ＮＩ−３０２．３Ｄ８，ＮＩ−３０２．１８Ａ１，ＮＩ−３０２．８Ｆ１，ＮＩ−３０２．５２Ｃ９，ＮＩ−３０２．４６Ｃ９，ＮＩ−３０２．１５Ｅ８，ＮＩ−３０２．６４Ｅ５，ＮＩ−３０２．７Ｄ８，ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０，ＮＩ−３０２．１２Ｈ２，ＮＩ−３０２．８Ｍ１及び／又はＮＩ−３０２．４Ａ６からなる群から選択される参照抗体がＨＴＴに結合することを競合的に阻害する。
本発明はさらに、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１， ＮＩ−３０２．１５Ｆ９， ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２， ＮＩ−３０２．１１Ａ４， ＮＩ−３０２．２２Ｈ９， ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２， ＮＩ−３０２．５５Ｄ８， ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２， ＮＩ−３０２．７１Ｆ６， ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１， ＮＩ−３０２．４４Ｄ７， ＮＩ−３０２．７Ａ８， ＮＩ−３０２．３Ｄ８， ＮＩ−３０２．４６Ｃ９， ＮＩ−３０２．１１Ｈ６， ＮＩ−３０２．１８Ａ１， ＮＩ−３０２．５２Ｃ９， ＮＩ−３０２．８Ｆ１， ＮＩ−３０２．６３Ｆ３， ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１， ＮＩ−３０２．２Ａ２， ＮＩ３０２．１５Ｄ３， ＮＩ−３０２．３５Ｃ１， ＮＩ−３０２．６Ｎ９， ＮＩ−３０２．７Ｄ８及び／又はＮＩ−３０２．７２Ｆ１０からなる群から選択される参照抗体が、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種又はそのフラグメントに結合することを競合的に阻害する。
好ましい実施形態において、抗体、その結合性フラグメント、合成又は生物工学変異体のＨＴＴに対する結合、好ましくは、４９（ＨＤ４９）反復からなる伸長したポリＱ域を有するＨＴＴに対する結合を、実施例で記載されるような、具体的には、実施例７、実施例１３、実施例１８、実施例３１及び／又は実施例３３で記載されるようなドットブロットアッセイ及び／又はフィルター遅延において測定することができる。
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１にそれぞれ示される群に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列及びＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１は、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲもまた本発明に含まれ、これらは、図１に示されるデータを使用して当業者によって容易に特定され得る。
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１にそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＨ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を除いて、図１にそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１にそれぞれ示されるポリペプチドに関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列及びＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１は、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲもまた本発明に含まれる。
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、図１にそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＬ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を除いて、図１にそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
免疫グロブリン又はそのコードｃＤＮＡがさらに改変される場合がある。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、キメラ抗体、マウス化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識化抗体、又は、それらのいずれか１つのアナログを製造する工程のいずれか１つを含む。対応する様々な方法が当業者には知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）に記載される。前記抗体の誘導体がファージディスプレー技術によって得られるとき、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるような表面プラズモン共鳴を、本明細書中に記載される抗体のいずれか１つのエピトープと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５）、７〜１３）。キメラ抗体の製造が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ８９／０９６２２に記載される。ヒト化抗体を製造するための方法が、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ１０２３９４００及び国際特許出願公開ＷＯ９０／０７８６１に記載される。本発明に従って利用されるための抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。異種抗体（例えば、ヒト様抗体）をマウスにおいて製造するための一般的原理が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５に記載される。上記で議論されたように、本発明の抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２を含めて、完全な抗体のほかに様々な形態で、ならびに、単鎖で存在する場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８８／０９３４４を参照のこと）。したがって、１つの実施形態において、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される本発明の抗体が提供される。
本発明の様々な抗体又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖はさらに、この技術分野において知られている従来からの技術を使用して、例えば、この技術分野において知られているアミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、アミノ酸付加及び／又は組換えならびに／あるいはいずれかの他の改変を単独又は組合せでのどちらかで使用することによって改変することができる。そのような改変を免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の根底にあるＤＮＡ配列に導入するための方法が、当業者には広く知られている；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ｎ．Ｙ．、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の修飾には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び、炭水化物成分又は脂質成分及び補因子などの連結を含む側鎖修飾、骨格修飾、ならびに、Ｎ末端修飾及びＣ末端修飾を含めて、１つ又は複数の構成アミノ酸における化学的及び／又は酵素的な誘導体化が含まれる。同様に、本発明は、記載された抗体又はその何らかのフラグメントを異種分子（例えば、カルボキシル末端での免疫刺激リガンドなど）に融合されてアミノ末端において含むキメラなタンパク質の製造を包含する；対応する技術的詳細については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３０６８０を参照のこと。
本発明の抗体はまた、その治療的可能性を最適化するさらなる改変を含む場合がある。これらの改変には、抗体（例えば、可変領域）のアミノ酸配列に対する改変、及び、翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない。翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、これにより、活性、局在化、及び、他の細胞分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質及び補因子など）との相互作用が調節されるので、重要な役割を機能的プロテオミクスにおいて果たす化学的修飾である。したがって、抗体を最適化することにより、いくつかの利点がもたらされる場合があり、例えば、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ ３（２０１１）、２４３〜５２に示されるように、例えば、貯蔵期間中の改善された安定性、同様にまた、薬物動態学及び／又は薬力学での改善されたプロフィール、例えば、抗体のインビボ又はインビトロでの循環時間、増大した溶解性、安定性、標的に対する増大した親和性、低下したオフ速度、定常領域（Ｆｃ領域）の改善されたエフェクター機能及び抗体の安全性プロフィール（例えば、低下した免疫原性など）など、或いは、翻訳後修飾に対する低下した感受性がもたらされる場合がある。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体、そのＨＴＴ結合性フラグメント、合成又は生物工学変異体を最適化することができ、ただし、この場合、下記の修飾に限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、脱アミノ化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、異性化、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、加水分解、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化など）及びユビキチン化を含む様々な修飾（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、１９９２；“Ｐｏｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）、６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ他、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．６６３（１９９２）、４８〜６２を参照のこと）を受けやすい、ＣＤＲ領域又は可変領域における少なくとも１つのアミノ酸が、そのような変化を欠く変異型アミノ酸によって置換され、或いは、少なくとも１つの炭水化物成分が化学的若しくは酵素的に欠失され、又は、抗体に化学的若しくは酵素的に付加される。好ましい実施形態において、修飾が、グリコシル化、酸化、脱アミノ化、ペプチド結合切断、イソアスパラギン酸形成及び／又は不対システインからなる群から選択される。治療剤としてのＨＴＴ抗体又はＨＴＴ結合性分子の有用性を最適化するさらなる改変がこの技術分野では広く知られており、例えば、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ ３（２０１１）、２４３〜５２に記載される（その開示内容は本明細書中に組み込まれる）。炭水化物成分を付加する手段又は欠失する手段を化学的又は酵素的に達成することができ、そのような手段が、例えば、Ｂｅｒｇ他、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、第５版、Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００２；国際公開ＷＯ８７／０５３３０；Ａｐｌｉｎ他、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２（１９８１）、２５９〜３０６；Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９（１９８７）、１０〜５２；Ｅｄｇｅ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８（１９８１）、１３１；Ｔｈｏｔａｋｕｒａ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８（１９８７）、３５０において詳しく記載される。
加えて、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、より大きい度合いの可変性と、抗原−抗体相互作用における支配的な関与とを有する領域であることがしばしば認められているので、本発明は、上記で記載されるような結合性分子を含有するペプチド、例えば、述べられた抗体のいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域（特に、重鎖のＣＤＲ３）を含有するペプチドを含むペプチドを包含する。そのようなペプチドが、本発明に従って有用である結合剤を製造するために容易に合成される場合があり、又は、組換え手段によって製造される場合がある。そのような方法は当業者にはよく知られている。ペプチドを、例えば、市販されている自動化されたペプチド合成機を使用して合成することができる。ペプチドはまた、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込むこと、及び、細胞を、ペプチドを産生させるために発現ベクターにより形質転換することによる組換え技術によって製造することができる。
したがって、本発明は、上記の抗ＨＴＴ抗体及び／又は、変異した及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそのフラグメントに結合できる本発明の抗体に向けられ、かつ、述べられた性質を呈示する、すなわち、ＨＴＴ及び／又は変異した及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそのフラグメントを特異的に認識するどのような結合性分子（例えば、抗体又はその結合性フラグメント）にも関連する。そのような抗体及び結合性分子は、本明細書中に記載されるようなＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学によってそれらの結合特異性及び結合親和性について試験することができる（例えば、実施例を参照のこと）。抗体及び結合性分子のこれらの特性はウエスタンブロットによって同様に試験することができる。
免疫グロブリンをＢ細胞又はＢメモリー細胞の培養から直接に得ることの代替として、これらの細胞を、その後の発現及び／又は遺伝子操作のための、再編成された重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座の供給源として使用することができる。再編成された抗体遺伝子を、ｃＤＮＡを作製するために、適切なｍＲＮＡから逆転写することができる。所望されるならば、重鎖定常領域を異なるアイソタイプの重鎖定常領域に交換することができ、又は、完全に除くことができる。可変領域を、単鎖のＦｖ領域をコードするために連結することができる。多数のＦｖ領域を、２つ以上の標的に対する結合能を与えるために連結することができ、又は、重鎖及び軽鎖のキメラな組合せを用いることができる。遺伝物質が入手可能であると、所望の標的と結合するそれらの能力をともに保持する上記で記載されるようなアナログの設計は簡単である。抗体可変領域のクローニング及び組換え抗体の作製のための方法が当業者には知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ他、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７（１９９６）、１〜２０；Ｄｏｅｎｅｃｋｅ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１（１９９７）、１７８７〜１７９２に記載される。
適切な遺伝物質が得られ、かつ、所望されるならば、アナログをコードするために改変されると、コード配列（これは、最低でも重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする配列を含む）を、標準的な組換え宿主細胞にトランスフェクションされ得るベクターにおいて含有される発現系に挿入することができる。様々なそのような宿主細胞が使用してよい；しかしながら、効率的なプロセシングのためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的のために有用である典型的な哺乳動物細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＮＳＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
抗体又はアナログの製造はその後、改変された組換え宿主を、宿主細胞の成長及びコード配列の発現のために適切である培養条件のもとで培養することによって着手される。その後、抗体が、抗体を培養物から単離することによって回収される。発現系は好ましくは、シグナルペプチドを含み、その結果、生じた抗体が培地中に分泌されるように設計される。しかしながら、細胞内産生もまた可能である。
上記によれば、本発明はまた、本発明の抗体又は同等な結合性分子をコードするポリヌクレオチドに関連し、抗体の場合には、好ましくは、上で記載される抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記抗体の可変領域のＶＨ及び／又はＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
当業者は、上記の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが、所望される特異性及び生物学的機能の他のポリペプチド又は抗体を構築するために使用され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上で記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ、添付された実施例において記載される抗体と実質的に同じ又は類似する結合性質を好都合には有するポリペプチド及び抗体を包含する。当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲ内において、又は、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７）の内部において行うことによって強化され得ることを理解している（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）、３２３〜３２７を参照のこと）。したがって、本発明はまた、述べられたＣＤＲの１つ又は複数が１つ又は複数の、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関連する。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方又は両方において、図１に示されるような可変領域の２つのＣＤＲ又は３つすべてのＣＤＲを含む。
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、当業者によって知られているように、１つ又は複数のエフェクター機能を媒介する定常領域を含むことができる。例えば、補体のＣ１成分が抗体の定常領域に結合することにより、補体系が活性化される場合がある。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答をも刺激し、自己免疫の過敏性に関与することもある。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して、すなわち、抗体のＦｃ領域におけるＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより様々な細胞における受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含めて、異なるクラスの抗体について特異的であるいくつかのＦｃ受容体が存在する。抗体が細胞表面のＦｃ受容体に結合することにより、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解（これは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性媒介因子の放出、胎盤移行及び免疫グロブリン産生の制御を含む多数の重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。
したがって、本発明の特定の実施形態には、少なくとも定常領域ドメインの１つ又は複数の一部が欠失されているか、さもなければ変化させられており、その結果、所望される生化学的特性を提供するように、例えば、およそ同じ免疫原性の完全な未変化抗体と比較したとき、低下したエフェクター機能、ダイマーを非共有結合により形成することができること、ＨＴＴの凝集及び沈着の部位に局在化する増大した能力、低下した血清中半減期、あるいは、増大した血清中半減期などを提供するようにされている抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体が含まれる。例えば、本明細書中に記載される診断方法及び処置方法において使用されるためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが、１つ又は複数の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、改変された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失されるであろう。例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部が欠失されるであろう。他の実施形態において、本明細書中に記載される診断方法及び処置方法において使用されるためのある種の抗体は、グリコシル化を排除するために変化させられる定常領域（例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域）を有しており、これは、本明細書中の他のところでは、非グルコシル化抗体又は「ａｇｌｙ」抗体として示される。そのような「ａｇｌｙ」抗体は、酵素学的に、ならびに、定常領域におけるコンセンサスなグリコシル化部位を操作することによって調製されてもよい。理論によって拘束されることはないが、「ａｇｌｙ」抗体は生体内での安全性及び安定性の改善されたｐｒｏフィルを有する場合があると考えられる。所望されるエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を製造する方法が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００５／０１８５７２に見出される（その全体が参照によって組み込まれる）。
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、この技術分野において知られている技術を使用して、エフェクター機能を低下させるために変異させられる場合がある。例えば、定常領域ドメインの（点変異又は他の手段による）欠失又は不活性化は、循環する改変された抗体のＦｃ受容体結合を低下させ、それにより、ＨＴＴの局在化を増大させる場合がある。他の場合には、本発明と一致する定常領域改変が補体結合を和らげ、したがって、抱合された細胞毒素の血清半減期及び非特異的会合を低下させることがあるかもしれない。定常領域のさらに他の改変が、増大した抗原特異性又は抗体柔軟性に起因する高まった局在化を可能にするジスルフィド連結又はオリゴ糖成分を改変するために使用される場合がある。そのような改変の得られた生理学的プロフィール、生物学的利用能及び他の生化学的影響、例えば、ＨＴＴの局在化、生体分布及び血清半減期などが、過度な実験を行うことなく、広く知られている免疫学的技術を使用して容易に測定及び定量化され得る。
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、例として、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰ又はＴｈｙ１受容体を介する抗体の受容体媒介性エンドサイトーシスを高めることによって、あるいは、「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（これは、抗体が、生細胞を傷つけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる）（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１）によって抗体の細胞取り込みを増大させるために変異させられる場合があり、又は、代わりのタンパク質配列に交換される場合がある。例えば、抗体結合領域と、細胞表面受容体の同族タンパク質リガンドとの融合タンパク質、あるいは、ＨＴＴならびに細胞表面受容体に結合する特異的な配列を有する二重特異性抗体又は多特異性抗体の作製が、この技術分野において知られている技術を使用して設計される場合がある。
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、その血液脳関門透過を増大させるために変異させられる場合があり、又は、代わりのタンパク質配列に交換される場合があり、あるいは、抗体が化学的に改変される場合がある。
本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体の改変された形態を、この技術分野において知られている技術を使用して完全な前駆体又は親抗体から作製することができる。例示的な技術が本明細書中により詳しく議論される。本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、この技術分野において知られている技術を使用して作製又は製造することができる。特定の実施形態において、抗体分子又はそのフラグメントが「組換え製造され」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。抗体分子又はそのフラグメントを作製するための例示的な技術が本明細書中の他のところでより詳しく議論される。
本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体にはまた、例えば、共有結合による結合により、抗体がその同族エピトープに特異的に結合することが妨げられないように、どのようなタイプの分子でも抗体に共有結合により結合させることによって改変される誘導体が含まれる。例えば、しかし、限定としてではなく、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、知られている保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって改変されている抗体が含まれる。数多くの化学的修飾のどれもが、知られている技術によって行われる場合があり、これらには、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体は１つ又は複数の非古典的アミノ酸を含有する場合がある。
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、有害な免疫応答を処置されるべき動物において、例えば、ヒトにおいて誘発しないであろう。特定の実施形態において、結合性分子、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントは患者、例えば、ヒト患者に由来し、続いて、抗体又はその抗原結合性フラグメントが由来する同じ種、例えば、ヒトにおいて使用され、これにより、有害な免疫応答の出現を緩和するか、又は最小限に抑える。
脱免疫化もまた、抗体の免疫原性を低下させるために使用することができる。本明細書中で使用される場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変化を包含する（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／５２９７６及び同ＷＯ００／３４３１７を参照のこと）。例えば、出発抗体からのＶＨ配列及びＶＬ配列が分析され、そして、相補性決定領域（ＣＤＲ）との関連でのエピトープの所在位置、及び、配列内の他の重要な残基を示すそれぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が分析される。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープが、最終的な抗体の活性を変化させる危険性が低い代わりのアミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組合せを含む様々な代替的なＶＨ配列及びＶＬ配列が設計され、これらの配列が続いて、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法における使用のために様々な結合性ポリペプチド（例えば、ＨＴＴ特異的抗体又はその免疫特異性フラグメント）に組み込まれ、その後、これらは機能について試験される。典型的には、１２個〜２４個の間の変化型抗体が作製され、試験される。改変されたＶ領域及びヒトＣ領域を含む完全な重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子がその後、発現ベクターにクローン化され、それに続くプラスミドが、完全な抗体の産生のために細胞株に導入される。その後、抗体が、適切な生化学的アッセイ及び生物学的アッセイにおいて比較され、最適な変異体が特定される。
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレー技術又はそれらの組合せの使用を含むこの技術分野において知られている広範囲の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体を、この技術分野において知られているハイブリドーマ技術、及び、例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜６８１（１９８１）に教示されるハイブリドーマ技術を含む様々なハイブリドーマ技術を使用して製造することができる（前記参考文献はそれらの全体が参照によって組み込まれる）。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物クローン、原核生物クローン又はファージクローンのどのようなものも含めて、ただ１つのクローンに由来する抗体を示し、モノクローナル抗体が製造される方法に由来する抗体を示さない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載されるように、エプスタイン・バールウイルスによる形質転換により不死化されているヒトＢ細胞に由来する。
広く知られているハイブリドーマプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）、４９５）では、哺乳動物から得られる比較的短命の、すなわち、いつかは死滅するリンパ球、例えば、本明細書中に記載されるようなヒト対象に由来するＢ細胞が、不死性の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合され、このようにして、不死性であり、かつ、Ｂ細胞の遺伝子コードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞、すなわち、「ハイブリドーマ」がもたらされる。得られたハイブリッドは、選抜、希釈及び再成長によって単一の遺伝的形質に分離され、それぞれの個々の株が単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む。それらにより、所望の抗原に対して均質であり、そして、それらの純粋な遺伝的起源に関連して、「モノクローナル」と呼ばれる抗体が産生される。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない元の骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地において播種され、成長させられる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選抜及び成長のための試薬、細胞株及び培地がいくつかの供給源から市販されており、また、標準化されたプロトコルが十分に確立されていることを理解するであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、インビトロアッセイによって、例えば、本明細書中に記載されるような免疫沈殿、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などによって求められる。所望される特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、当該クローンは限界希釈手法によってサブクローン化され、標準的な方法によって成長させられる場合がある（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、５９頁〜１０３頁（１９８６）を参照のこと）。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体が、従来からの精製手段によって、例えば、プロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって、培養培地、腹水又は血清から分離され得ることがさらに理解されるであろう。
別の実施形態において、リンパ球を顕微操作によって選択することができ、可変性遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、免疫化された哺乳動物又は生まれつき免疫性の哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、約７日間にわたってインビトロ培養することができる。培養物を、スクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性のウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞を、ＦＡＣＳによって、又は、Ｉｇ産生Ｂ細胞を補体媒介溶血プラークアッセイで特定することによって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞をチューブの中に顕微操作することができ、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を抗体発現ベクターにクローン化し、発現のための細胞（例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞）にトランスフェクションすることができる。
代替では、抗体産生の細胞株が、当業者に広く知られている技術を使用して選択及び培養される場合がある。そのような技術が様々な実験室マニュアル及び一次刊行物に記載されている。これに関連して、下で記載されるような本発明における使用のために好適である技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ他編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載される（これは、増刊を含めて、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントが、知られている技術によって作製され得る。例えば、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが、組換えによって、あるいは、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを製造するために）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを製造するために）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって製造され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異性部分を検出用試薬（例えば、放射性同位体など）に連結することを伴う免疫診断手順における使用のために十分である。
１つの実施形態において、本発明の抗体は抗体分子の少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題となるこれらの抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子が本明細書中に記載される。
本発明の抗体は、抗体を合成するためにこの技術分野において知られているいずれかの方法によって、特に、化学合成によって、又は、好ましくは、本明細書中に記載されるような組換え発現技術によって製造することができる。
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、１つ又は複数のドメインが部分的又は完全に欠失される合成された定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態において、適合し得る改変された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除かれているドメイン欠失の構築物又は変異体（ΔＣＨ２構築物）を含むであろう。他の実施形態については、短い連結ペプチドが、動きの柔軟性及び自由を可変領域に与えるために欠失ドメインの代わりに使用される場合がある。当業者は、そのような構築物が抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節的特性のために特に好ましいことを理解するであろう。ドメイン欠失された構築物を、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを使用して得ることができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０６０９５５及び同ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失し、かつ、ドメイン欠失されたＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するために操作される。
特定の実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）である。ミニボディを、この技術分野において記載される方法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号又は国際特許出願公開ＷＯ９４／０９８１７を参照のこと）。
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、モノマーサブユニット間の会合を可能にする限り、数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、又は、１個だけのアミノ酸の欠失もしくは置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における１個だけのアミノ酸の変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させるために、そして、それにより、ＨＴＴの局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ又は複数の定常領域ドメインのその部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は抗体の選択された特性（血清半減期）を改善し、一方で、当該定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわないままにし得る。そのうえ、上記において暗に示されるように、開示された抗体の定常領域は、生じた構築物のプロフィールを高める１つ又は複数のアミノ酸の変異又は置換により合成物である場合がある。これに関連して、改変された抗体の立体配置及び免疫原性プロフィールを実質的に維持しながら、保存されている結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を妨げることが可能である場合がある。さらに他の実施形態は、１つ又は複数のアミノ酸を、望ましい特性（例えば、エフェクター機能など）を高めるために、あるいは、細胞毒素又は炭水化物のより多くの結合を提供するために定常領域に付加することを含む。そのような実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的な配列を挿入すること、又は複製することが望ましい場合がある。
本発明はまた、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む抗体、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）から本質的になる抗体、あるいは、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）からなる抗体を提供し、そのような抗体又はそのフラグメントはＨＴＴに免疫特異的に結合する。当業者に知られている様々な標準的技術を、抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために使用することができ、そのような技術には、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、基準となるＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２又はＶＬ−ＣＤＲ３に対して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換又は２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的（な）アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換である。類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーがこの技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐した側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。代替において、変異を、例えば、飽和変異誘発などによってコード配列の全体又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、活性（例えば、ＨＴＴ、及び／又は、変異した及び／又は凝集したＨＴＴＴ種及び／又はそのフラグメントと結合する能力）を保持する変異体を特定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
例えば、変異を抗体分子のフレームワーク領域においてのみに、又は、抗体分子のＣＤＲ領域においてのみに導入することが可能である。導入された変異はサイレント変異又は中立のミスセンス変異である場合があり、例えば、抗体の抗原結合能に対する影響を全く有しないか、又はほとんど有しない場合があり、実際、いくつかのそのような変異はアミノ酸配列を全く変化させない。これらのタイプの変異は、コドン使用を最適化するために、又は、ハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用である場合がある。本発明の抗体をコードするコドン最適化コード領域が本明細書中の他のところで開示される。代替において、非中立的なミスセンス変異により、抗体の抗原結合能が変化する場合がある。ほとんどのサイレント変異及び中立的ミスセンス変異の位置はフレームワーク領域内である可能性が高く、一方、ほとんどの非中立的ミスセンス変異の位置はＣＤＲ内である可能性が高く、だが、このことは絶対的要件でない。当業者であれば、所望される性質、例えば、抗原結合活性における変化がないこと又は結合活性における変化（例えば、抗原結合活性における改善又は抗体特異性における変化）などを有する変異体分子を設計し、試験することができるであろう。変異誘発後、コードされたタンパク質が常法により発現させられる場合があり、そして、コードされたタンパク質の機能的活性及び／又は生物学的活性（例えば、ＨＴＴ、及び／又は、変異した及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそのフラグメントと免疫特異的に結合する能力）を、本明細書中に記載される技術を使用して、又は、この技術分野において知られている技術を常法により改変することによって求めることができる。
ＩＩＩ．抗体をコードするポリヌクレオチド
抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、どのようなポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド（これらは非修飾のＲＮＡ又はＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡである場合がある）からでも構成され得る。例えば、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、ならびに、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖である場合がある、あるいは、より典型的には、二本鎖である場合があるか、又は、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物である場合があるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、安定性又は他の理由のために改変される１つ又は複数の修飾された塩基あるいはＤＮＡ骨格又はＲＮＡ骨格を含有してもよい。「修飾（改変）（された）」塩基には、例えば、トリチル化塩基及び非通常的塩基（例えば、イノシンなど）が含まれる。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行うことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的又は代謝的に改変された形態を包含する。
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分又は軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然型変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドを、１つ又は複数のアミノ酸置換、アミノ酸付加又はアミノ酸欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、１つ又は複数のヌクレオチド置換、ヌクレオチド付加又はヌクレオチド欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作出することができる。変異は、標準的な技術によって、例えば、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などによって導入される場合がある。好ましくは、保存的なアミノ酸置換が１つ又は複数の非必須アミノ酸残基において行われる。
よく知られているように、ＲＮＡが、標準的な技術、例えば、イソチオシアン酸グアニジウム抽出及び沈殿化、その後、遠心分離又はクロマトグラフィーなどによって、元のＢ細胞、ハイブリドーマ細胞又は他の形質転換細胞から単離される場合がある。望ましい場合、ｍＲＮＡが、標準的な技術、例えば、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーなどによって総ＲＮＡから単離される場合がある。好適な技術がこの技術分野では熟知されている。１つの実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡが、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼをよく知られている方法に従って使用して、同時又は別個に作製される場合がある。ＰＣＲが、コンセンサスな定常領域プライマーによって、又は、公開された重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始される場合がある。上記で議論されるように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用される場合がある。この場合、ライブラリーが、コンセンサスなプライマー又はより大きい相同的プローブ（例えば、ヒト定常領域プローブなど）によってスクリーニングされる場合がある。ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡが、この技術分野において知られている技術を使用して細胞から単離され、そして、例えば、組換えＤＮＡ技術に関連する前記の参考文献に詳しく示される標準的なよく知られている技術に従って制限酵素マッピング及び配列決定に供される場合がある。当然のことながら、ＤＮＡは、単離プロセス又はその後の分析の期間中のどの時点であっても、本発明に従う合成物である場合がある。
この関連において、本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域又はＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列又はＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域又はＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列又はＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１に示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。
この技術分野において知られているように、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドの間における「配列同一性」が、一方のポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸配列又は核酸配列を第２のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。本明細書中で議論されるとき、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるかどうかを、この技術分野において知られている方法及びコンピュータープログラム／ソフトウエア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、５３７１１）（これに限定されない）など）を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２（１９８１）、４８２〜４８９）の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列の間における相同性の最も良いセグメントを見出すために使用する。ＢＥＳＴＦＩＴ又はいずれかの他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するときには、当然のことながら、同一性の百分率が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、かつ、参照配列におけるアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
本発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示されるような、ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそれらのフラグメントにおけるポリＰ領域を認識する抗ＨＴＴ抗体及び／又は抗体のＶＨ領域又はＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、或いは、そのような核酸から本質的になるか、或いは、そのような核酸からなる。加えて、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＩＩＩに示されるような、ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそれらのフラグメントにおけるＰリッチ領域を認識し、かつ／或いは、表ＩＶに示されるような、ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそれらのフラグメントにおけるＣ末端領域をさらに認識し、かつ／或いは、表ＶＩＩに示されるような、ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそれらのフラグメントにおけるＱ／Ｐリッチ領域をさらに認識する抗ＨＴＴ抗体及び／又は抗体のＶＨ領域又はＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、或いは、そのような核酸から本質的になるか、或いは、そのような核酸からなる。加えて、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表Ｖに示されるような、ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそれらのフラグメントを認識する抗ＨＴＴ抗体及び／又は抗体のＶＨ領域又はＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、或いは、そのような核酸から本質的になるか、或いは、そのような核酸からなる。そのうえ、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＶＩに示されるような、ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそれらのフラグメントにおけるＮ末端領域を認識する抗ＨＴＴ抗体及び／又は抗体のＶＨ領域又はＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、或いは、そのような核酸から本質的になるか、或いは、そのような核酸からなる。加えて、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表Ｖに示されるような、ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそれらのフラグメントを認識する抗ＨＴＴ抗体及び／又は抗体のＶＨ領域又はＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、或いは、そのような核酸から本質的になるか、或いは、そのような核酸からなる。加えて、又は、代替において、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＶＩＩＩに示されるような抗ＨＴＴ抗体及び／又は抗体のＶＨ領域又はＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含み、或いは、そのような核酸から本質的になり、或いは、そのような核酸からなる。
これに関連して、当業者は、軽鎖及び／又は重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが両方の免疫グロブリン鎖又は一方の免疫グロブリン鎖のみの可変ドメインをコードし得ることを容易に理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに示されるような、抗ＨＴＴ抗体及び／又はそのフラグメントのＶＨ領域及びＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。
表ＩＩ：ＨＴＴのｐｏｌｙＰ領域のエピトープ、即ち、凝集した形態のエクソン１、を認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
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表ＩＩＩ：ＨＴＴのプロリンリッチ領域のエピトープ、即ち、凝集した形態のエクソン１、を認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
Figure 2017522886
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表ＩＶ：ＨＴＴのＣ末端領域のエピトープ、即ち、凝集した形態のエクソン１、を認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
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表Ｖ：ＨＴＴ種及び／又はそのフラグメントを認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
Figure 2017522886
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表ＶＩ：ＨＴＴのＮ末端領域のエピトープ、即ち、凝集した形態のエクソン１、を認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
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表ＶＩＩ：ＨＴＴのＱ／Ｐリッチ領域のエピトープ、即ち、凝集した形態のエクソン１、を認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
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クローニング戦略に起因して、重鎖及び軽鎖のＮ末端及びＣ末端におけるアミノ酸配列は潜在的にはプライマー誘発変化をＦＲ１及びＦＲ４に含有する場合があり、しかしながら、この変化は抗体の生物学的活性には実質的な影響を与えない。コンセンサスなヒト抗体を提供するために、最初のクローンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列とアライメントし、それらと一致させることができる；例えば、上記で記載されるようなＶｂａｓｅ２を参照のこと。ヒト抗体のアミノ酸配列は、Ｎ末端及びＣ末端のアミノ酸配列が、潜在的にはＰＣＲプライマーに起因してコンセンサスな生殖系列配列から逸脱すると見なされるとき、したがって、プライマー誘発変異補正（ＰＩＭＣ）によって置き換えられているときには太字で示される（表ＶＩを参照のこと）。したがって、本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＶＩに示されるような、抗ＨＴＴ抗体及び／又はそのフラグメントのＶＨ及びＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、又は、そのような核酸から本質的になるか、又は、そのような核酸からなる。
表ＶＩＩＩ：ＰＩＭＣ（太字）による置換を示す、ＨＴＴ種及び／又はそのフラグメントを認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列。
Figure 2017522886
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本発明にはまた、他のところで記載されるように、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントが含まれる。加えて、本明細書中に記載されるように、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント及び他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、この技術分野において知られているいずれかの方法によって作製又は製造される場合がある。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られているならば、当該抗体をコードするポリヌクレオチドが、例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７（１９９４）、２４２に記載されるように、化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられる場合があり、これには、簡単に記載すると、抗体をコードする配列の一部分を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、ならびに、連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
代替において、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドが、好適な供給源から得られる核酸から作製される場合がある。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できず、しかし、抗体分子の配列が知られているならば、当該抗体をコードする核酸が化学合成される場合があるか、あるいは、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは、ＨＴＴ特異的抗体を発現するいずれかの組織もしくは細胞（例えば、抗体を発現させるために選択されるハイブリドーマ細胞など）から作製されるｃＤＮＡライブラリー、又は、そのようなものから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイゼーション可能である合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって得られる場合があり、又は、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを特定するために特定の遺伝子配列について特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られる場合がある。ＰＣＲによって生じる増幅された核酸がその後、この技術分野において広く知られているいずれかの方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローン化される場合がある。
抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列が、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製するために、例えば、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入をもたらすために、ヌクレオチド配列の操作についてこの技術分野においてよく知られている方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどを使用して操作される場合がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９８）に記載される技術を参照のこと。これらはともに、それらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
ＩＶ．抗体ポリペプチドの発現
単離された遺伝物質が、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体を提供するために操作された後、抗体をコードするポリヌクレオチドは典型的には、所望される量の抗体を産生させるために使用されることがある宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入される。抗体あるいはそのフラグメント、誘導体又はアナログ（例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖又は軽鎖）の組換え発現が本明細書中に記載される。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖もしくは軽鎖あるいはその一部分（好ましくは重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含有するその一部分）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生させるためのベクターが、この技術分野においてよく知られている技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって作製される場合がある。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法が本明細書中に記載される。当業者によく知られている方法を、抗体コード配列ならびに適切な転写制御シグナル及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子あるいはその重鎖又は軽鎖あるいは重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列をｐｒｏモーターに機能的に連結されて含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む場合があり（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６、ならびに、米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、また、抗体の可変ドメインが、重鎖全体又は軽鎖全体を発現させるためにそのようなベクターにクローン化される場合がある。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、所望される遺伝子を宿主細胞に導入し、その遺伝子をその宿主細胞において発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために本明細書中では使用される。当業者には知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択される場合がある。一般に、本発明と適合し得るベクターは、選択マーカー、所望される遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、ならびに、真核生物細胞又は原核生物細胞における進入能及び／又は複製能を含む。本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系が用いられる場合がある。例えば、１つのクラスのベクターでは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスなどに由来するＤＮＡエレメントが利用される。他では、内部リボソーム結合部位を伴う多シストロン系の使用を伴う。加えて、ＤＮＡをその染色体に組み込んでいる細胞が、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又は複数のマーカーを導入することによって選択される場合がある。マーカーにより、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）、又は、重金属（例えば、銅など）に対する抵抗性が与えられる場合がある。選択マーカー遺伝子は、発現させられるＤＮＡ配列に直接に連結することができるか、又は、共形質転換によって同じ細胞に導入することができる。さらなるエレメントがまた、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要となる場合がある。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライス信号ならびに転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルが含まれる場合がある。
特に好ましい実施形態において、クローン化された可変領域遺伝子が、上記で議論されるような重鎖定常領域遺伝子及び軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒトの遺伝子）と一緒に発現ベクターに挿入される。1つの実施形態では、これは、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ社所有の発現ベクターＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許Ｎｏ．６，１５９，７３０に開示される）によって達成される。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、マウスのベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０の複製起点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１及びエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子及びリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域遺伝子及び定常領域遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、それに続く、Ｇ４１８含有培地における選択、及び、メトトレキサート増幅を行ったとき、抗体の非常に高いレベルの発現をもたらすことが見出されている。当然のことながら、発現を真核生物細胞において誘発することができる発現ベクターはどれも、本発明において使用される場合がある。好適なベクターの例には、プラスミドのｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１及びｐＺｅｏＳＶ２（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能である）、ならびに、プラスミドのｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能である）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、非常に多数の形質転換細胞を、好適に高レベルの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖を発現する形質転換細胞についてスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的な実験である。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号及び第５，６５８，５７０号に教示される（これらのそれぞれがその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。この系は、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える高い発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系が、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
他の好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体が、多シストロン構築物、例えば、米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１号Ａ１（その全体が本明細書中に組み込まれる）に開示される多シストロン構築物などを使用して発現させられる場合がある。これらの発現系において、目的とする多数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖など）がただ１つの多シストロン構築物からもたらされる場合がある。これらの系では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が、比較的高いレベルの抗体を提供するために都合よく使用される。適合し得るＩＲＥＳ配列が米国特許第６，１９３，９８０号（これもまた本明細書中に組み込まれる）に開示される。当業者は、そのような発現系が、本出願において開示される抗体の完全な範囲を効果的に産生するために使用されることがあることを理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、本発明は、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含むベクターを提供する。
より一般的には、抗体のモノマーサブユニットをコードするベクター又はＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターが、適切な宿主細胞に導入される場合がある。宿主細胞へのプラスミドの導入を、当業者にはよく知られている様々な技術によって達成することができる。これらには、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）又はリポフェクタミンを使用するリポトランスフェクションを含むトランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、包まれたＤＮＡを用いた細胞融合、顕微注入、及び、無傷のウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、宿主へのプラスミド導入が、標準的なリン酸カルシウム共沈殿法により行われる。発現構築物を有する宿主細胞が、軽鎖及び重鎖を産生させるために適切である条件のもとで成長させられ、重鎖及び／又は軽鎖のタンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は蛍光活性化細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）及び免疫組織化学などが含まれる。
発現ベクターが従来からの技術によって宿主細胞に移され、トランスフェクションされた細胞がその後、抗体を本明細書中に記載される方法における使用のために産生させるため従来からの技術によって培養される。したがって、本発明には、好ましくは異種プロモーターに機能的に連結される、本発明の抗体又はその重鎖もしくは軽鎖、あるいは、少なくともその免疫グロブリンの結合ドメイン又は可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。加えて、又は、代替において、本発明にはまた、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含む本明細書中上記で定義されるようなベクターを含む宿主細胞が含まれる。二重鎖抗体を発現させるための好ましい実施形態において、重鎖及び軽鎖の両方をコードする単一のベクター又は複数のベクターが、下記で詳述されるように、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞において共発現させられる場合がある。
宿主細胞が本発明の２つの発現ベクターにより共トランスフェクションされる場合があり、この場合、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする。これら２つのベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含有する場合がある。代替では、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードするただ１つのベクターが使用される場合がある。そのような状況では、軽鎖が好都合には、毒性のない重鎖の過剰を避けるために重鎖の前に置かれる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８６）、５２；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）、２１９７を参照のこと）。重鎖及び軽鎖のためのコード配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含む場合がある。
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞を示す。抗体を組換え宿主から単離するためのプロセスの記載において、用語「細胞」及び「細胞培養（物）」が、別途明確に指定される場合を除き、抗体の供給源を示すために交換可能に使用される。別の言い方をすれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離された細胞全体から、又は、培地及び懸濁された細胞の両方を含有する細胞培養物からのどちらをも意味する場合がある。
様々な宿主−発現ベクター系が、本明細書中に記載される方法において使用されるための抗体分子を発現させるために利用される場合がある。そのような宿主−発現系は、目的とするコード配列が産生され、続いて精製されることがあるビヒクルを表し、しかし、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換又はトランスフェクションされたとき、本発明の抗体分子をその場で発現する細胞もまた表す。これらには、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）が感染させられる昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）が感染させられるか、又は、抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換される植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、完全な組換え抗体分子の発現のためにはとりわけ、細菌細胞（例えば、大腸菌など）、より好ましくは真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ベクター（例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなど）と併せての哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが、抗体のための効果的な発現系である（例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ他、Ｇｅｎｅ ４５（１９８６）、１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（１９９０）、２を参照のこと）。
タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は多くの場合、哺乳動物起源である；当業者には、宿主細胞株において発現させられる所望の遺伝子産物のために最もよく適する特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると思われる。例示的な宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ欠損）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸ガン）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０のＴ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞及び２９３細胞が特に好ましい。宿主細胞株は典型的には、商用サービスから、すなわち、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、又は、発表された文献から入手可能である。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、あるいは、遺伝子産物を所望される特定の様式で修飾し、また、プロセシングする宿主細胞系統が選ばれる場合がある。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）が当該タンパク質の機能のために重要である場合がある。種々の宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系を、発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを保証するために選ぶことができる。この目的を達成するために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用される場合がある。
組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の産生のためには、安定的発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が操作される場合がある。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、むしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーによって制御されるＤＮＡにより形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞は富化培地において１日間〜２日間にわたって成長させられる場合があり、その後、選択培地に切り換えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択に対する抵抗性を与え、また、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、成長して、結果としてクローン化され、かつ、細胞株に拡大することができる増殖巣を形成することを可能にする。この方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作するために都合よく使用される場合がある。
数多くの選択システムが使用される場合があり、これらには、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ １１（１９７７）、２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８（１９９２）、２０２）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ他、Ｃｅｌｌ ２２（１９８０）、８１７）をｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞又はａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質抵抗性を下記の遺伝子のための選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する抵抗性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）、３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（１９８１）、１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する抵抗性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（１９８１）、２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を与える（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２（１９９３）、４８８〜５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３（１９９１）、８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２（１９９３）、５７３〜５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０（１９９３）、９２６〜９３２；ならびに、Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（１９９３）、１９１〜２１７；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（１９９３）、１５５〜２１５）；及び、ｈｙｇｒｏ、これはヒグロマイシンに対する抵抗性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ他、Ｇｅｎｅ ３０（１９８４）、１４７）。使用することができる、組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に知られている様々な方法が、Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載さされ、また、第１２章及び第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載される（これらはその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
抗体分子の発現レベルをベクター増幅によって増大させることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現させるベクター系におけるマーカーが増幅可能であるときには、宿主細胞の培養において存在する阻害剤のレベルにおける増大はマーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子に付随するので、抗体の産生もまた増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１９８３）、２５７を参照のこと）。
インビトロ産生では、スケールアップにより、多量の所望されるポリペプチドを与えることが可能である。組織培養条件のもとでの哺乳動物細胞培養のための様々な技術がこの技術分野において知られており、これらには、均一懸濁培養、例えば、エアーリフト型リアクター又は連続撹拌槽リアクターにおける培養、あるいは、固定化細胞又は包括化細胞の培養、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジにおける培養が含まれる。必要及び／又は所望されるならば、ポリペプチドの溶液を、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後で、あるいは、本明細書中に記載されるＨＩＣクロマトグラフィー工程の前又は後で、慣例的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー、又は、（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体をコードする遺伝子はまた、哺乳動物以外の細胞、例えば、細菌細胞又は昆虫細胞又は酵母細胞又は植物細胞において発現させることができる。核酸を容易に取り込む細菌には、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌又はサルモネラ属の菌株など；バチルス科、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が含まれる。細菌において発現させられるとき、異種ポリペプチドは典型的には封入体の一部となることがさらに理解されるであろう。異種ポリペプチドは単離され、精製され、その後、機能的な分子に組み立てられなければならない。四価形態の抗体が所望される場合、そのサブユニットは四価抗体に自己集合するであろう（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０９６９４８を参照のこと）。
細菌系において、多数の発現ベクターが、抗体分子が発現されるための意図される使用に依存して、都合よく選択される場合がある。例えば、多量のそのようなタンパク質が抗体分子の医薬組成物の作製のために産生させられることになるときには、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３）、１７９１）（この場合、抗体コード配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターに個々に連結され、その結果、融合タンパク質が産生されるようにされる場合がある）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）、３１０１〜３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４（１９８９）、５５０３〜５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用される場合がある。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズのマトリックスへの吸着及び結合、その後の遊離したグルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン又は第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含み、その結果、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ成分から放出され得るように設計される。
原核生物に加えて、真核生物の微生物もまた使用される場合がある。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、普通のパン酵母が、真核生物の微生物の中で最も一般に使用されるが、多くの他の菌株が一般に利用可能である（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））。サッカロミセス属における発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ他、Ｎａｔｕｒｅ ２８２（１９７９）、３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ他、Ｇｅｎｅ ７（１９７９）、１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ他、Ｇｅｎｅ １０（１９８０）、１５７）が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異菌株（例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５（１９７７）、１２））のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。その場合、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在により、形質転換をトリプトファンの不在下での成長によって検出するための効果的な環境が提供される。
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が典型的には、外来タンパク質を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において成長する。抗体コード配列がウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）の中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる場合がある。
本発明の抗体分子が組換え発現させられると、本発明の完全な抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖又は他の免疫グロブリン形態を、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡの後での特異的抗原についてのアフィニティー、及び、サイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、又は、タンパク質の精製のためのいずれかの他の標準的な技術によることを含めて、この技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。代替では、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法が米国特許出願公開第２００２−０１２３０５７号Ａ１に開示される。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、抗ＨＴＴ抗体、又は変異した、及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそのフラグメントを認識する抗体、或いはその免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチド又はベクターを含む本明細書中上記で定義されるような宿主細胞を培養すること、及び
（ｂ）前記抗体又はその免疫グロブリン鎖を培養物から単離すること
を含む方法を提供する。
さらには、１つの実施形態において、本発明はまた、本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその免疫グロブリン鎖、あるいは、抗ＨＴＴ抗体、又は変異した及び／又は凝集したＨＴＴ種及び／又はそのフラグメント又はその免疫グロブリン鎖を調製するための前記方法によって得ることができる抗体又はその免疫グロブリン鎖に関連する。
Ｖ．融合タンパク質及びコンジュゲート
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドは、通常の場合には抗体に付随しないアミノ酸配列あるいは１つ又は複数の成分を含む。例示的な改変が下記においてより詳細に記載される。例えば、本発明の単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは柔軟なリンカー配列を含む場合があり、又は、機能的成分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素又は標識（例えば、蛍光性、放射性、酵素、核磁気性及び重金属など））を付加するために改変される場合がある。
本発明の抗体ポリペプチドは融合タンパク質を含む場合があり、融合タンパク質から本質的になる場合があり、又は、融合タンパク質からなる場合がある。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を伴う免疫グロブリンのＨＴＴ結合ドメインと、少なくとも１つの異種部分、すなわち、自然界では生来的に連結されない部分とを含むキメラ分子である。これらのアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにおいて一緒にされる別個のタンパク質において正常に存在する場合があり、又は、同じタンパク質において正常に存在する場合があるが、融合ポリペプチドにおいては新しい配置で置かれる。融合タンパク質が、例えば、化学合成によって、又は、ペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出し、翻訳することによって作出される場合がある。
用語「異種（の）」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用される場合、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較されている実体の残部のものとは異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書中で使用されるように、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又はアナログに融合されるための“異種ポリペプチド”は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、あるいは、異なる種の免疫グロブリンポリペプチド又は非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
本明細書中の他のところでより詳細に議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体はさらに、Ｎ末端又はＣ末端において異種ポリペプチドに組換え融合される場合があり、あるいは、ポリペプチド又は他の組成物に化学的にコンジュゲート化される場合がある（共有結合によるコンジュゲート化及び非共有結合によるコンジュゲート化を含む）。例えば、抗体が、検出アッセイにおいて標識として有用である分子に、また、エフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種又は毒素など）に組換え融合されるか、又はコンジュゲート化される場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号及び欧州特許出願ＥＰ０３９６３８７を参照のこと）。
本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、ペプチド結合又は修飾型ペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）によって互いにつながれるアミノ酸から構成されることが可能であり、また、遺伝子によりコードされる２０個のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有する場合がある。抗体は、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシングなど）によって、又は、この技術分野ではよく知られている化学的修飾技術によって改変される場合がある。そのような修飾が、基礎的な教本において、また、より詳しいモノグラフにおいて、ならびに、膨大な数の研究文献において十分に記載されている。修飾を、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含めて、抗体においてどこにでも、あるいは、炭水化物などの成分に対して行うことができる。同じタイプの修飾が、所与の抗体において、いくつかの部位において同じ程度又は種々の程度で存在する場合があることが理解されるであろう。また、所与の抗体が多くのタイプの修飾を含有する場合がある。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐する場合があり、また、分岐を伴って、又は伴うことなく、環状である場合がある。環状の抗体、分岐した抗体、及び、分岐した環状の抗体が、翻訳後の天然のプロセスから生じる場合があり、又は、合成的方法によって作製される場合がある。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合連結、ヘム成分の共有結合連結、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合連結、脂質又は脂質誘導体の共有結合連結、ホスファチジルイノシトールの共有結合連結、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化など）、及び、ユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１頁〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）、６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ他、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２）、４８〜６２を参照のこと）。
本発明はまた、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ領域のいずれか１つ又は複数のアミノ酸配列、あるいは、本発明の抗体のＶＬ領域又はそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つ又は複数のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨ−ＣＤＲ又はそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、あるいは、抗体のＶＬ−ＣＤＲ又はそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。１つの実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ−ＣＤＲ３又はそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含み、そのような融合タンパク質はＨＴＴに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列と、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＬ領域又はそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＨＴＴと特異的に結合する単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸配列と、抗体のＶＬＣＤＲ又はそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つ、２つ、３つまたそれ以上のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＨ−ＣＤＲ又はＶＬ−ＣＤＲの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上が、本発明の単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた本発明によって包含される。
文献に報告される例示的な融合タンパク質には、下記の融合物が含まれる：Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（１９８７）、２９３６〜２９４０）；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３３７（１９８９）、５２５〜５３１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ ３３９（１９８９）、６８〜７０；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９（１９９０）、３４７〜３５３；及びＢｙｒｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３４４（１９９０）、６６７〜６７０）；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０（１９９０）、２２２１〜２２２９；及びＷａｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３４９（１９９１）、１６４〜１６７）；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ ６１（１９９０）、１３０３〜１３１３）；ＣＤ２８及びＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３（１９９１）、７２１〜７３０）；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、５６１〜５６９）；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ他、Ｃｅｌｌ ６６（１９９１）、１１３３〜１１４４）；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８（１９９１）、１０５３５〜１０５３９；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９１）、２８８３〜２８８６；及びＰｅｐｐｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、１４８３〜１４８９（１９９１））；ならびにＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５（１９９１）、アブストラクト番号：１４４８）。
本明細書中の他のところで議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、ポリペプチドのインビボ半減期を増大させるために、又は、この技術分野において知られている方法を使用する免疫アッセイにおける使用のために異種ポリペプチドに融合される場合がある。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の抗体に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる（例えば、Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６〜１１９；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又はＷｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０（２００２）、５１２を参照のこと）。
そのうえ、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、マーカー配列（例えば、それらの精製又は検出を容易にするためのペプチドなど）に融合することができる。好ましい実施形態において、マーカーのアミノ酸配列は、多くのものが市販されているが、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（ＨＩＳ）であり、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）において提供されるタグなどである。例えば、Ｇｅｎｔｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）、８２１〜８２４に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製のために有用である他のペプチドタグには、「ＨＡ」タグ（これは、インフルエンザの赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する）（Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｃｅｌｌ ３７（１９８４）、７６７）、ＧＳＴ、ｃ−ｍｙｃ及び「ｆｌａｇ」タグが含まれるが、これらに限定されない（例えば、エピトープタグ化技術の総説については、Ｂｉｌｌ Ｂｒｉｚｚａｒｄ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４４（２００８）、６９３〜６９５を、また本発明において使用可能である最も一般的なエピトープタグを列挙するその６９４頁における表１を参照のこと。これらの主題は、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる）。
融合タンパク質を、この技術分野においてよく知られている方法を使用して調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び第５，２２５，５３８号を参照のこと）。融合が行われるまさにその部位が、融合タンパク質の分泌又は結合特性を最適化するために経験的に選択される場合がある。融合タンパク質をコードするＤＮＡがその後、本明細書中上で記載されるように行われる発現のために宿主細胞にトランスフェクションされる。
本発明の抗体は非コンンジュゲート化形態で使用される場合があり、あるいは、例えば、分子の治療的性質を改善するために、標的検出を容易にするために、又は、患者の画像化もしくは治療のために様々な分子の少なくとも１つにコンジュゲート化される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、精製が行われるときには精製前又は精製後のどちらでも標識化又はコンジュゲート化することができる。特に、本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬剤又はＰＥＧにコンジュゲート化される場合がある。
従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートがこの技術分野において幅広く記載されている。毒素が従来からのカップリング技術によって抗体にカップリングされる場合があり、又は、タンパク質毒素部分を含有する免疫毒素を融合タンパク質として作製することができる。本発明の抗体は、そのような免疫毒素を得るための対応する方法で使用することができる。そのような免疫毒素を例示するものが、Ｂｙｅｒｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１）、５９〜７０、及び、Ｆａｎｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２（１９９１）、５１〜５４によって記載される免疫毒素である。
当業者は、コンジュゲートがまた、コンジュゲート化されるための選択された薬剤に依存して様々な技術を使用して組み立てられ得ることを理解するであろう。例えば、ビオチンとのコンジュゲートが、例えば、ＨＴＴ結合ポリペプチドをビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）と反応することによって調製される。同様に、蛍光性マーカーとのコンジュゲートがカップリング剤（例えば、本明細書中に列挙されるカップリング剤）の存在下で調製される場合があり、又は、イソチオシアン酸塩との反応によって、好ましくはイソチオシアン酸フルオレセインとの反応によって調製される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体のコンジュゲートが同様な様式で調製される。
本発明はさらに、診断剤又は治療剤にコンジュゲート化される本発明の抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体を包含する。抗体を、例えば、ＨＴＴアミロイドーシスの存在を明らかにして、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴに関連付づけられる疾患に罹る危険性を示すために、そのような疾患（すなわち、凝集したＨＴＴの出現を示す、あるいは、それらに関連づけられる疾患）の発症又は進行をモニターして、又は臨床検査手順の一部として、例えば、所与の処置療法及び／又は防止療法の効力を明らかにするために、診断的に使用することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能に標識される抗体に関連する。さらには、１つの実施形態において、本発明は、薬物に結合させられる抗体に関連する。検出を、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体を検出可能な物質にカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質又は標識は一般に、酵素、重金属（好ましくは金）、色素（好ましくは蛍光性色素又は発光性色素）又は放射性標識である場合がある。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出金属、及び、非放射性常磁性金属イオンが含まれる（本発明に従って診断剤として使用されるために抗体にコンジュゲート化することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと）。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；好適な蛍光性物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが挙げられる；発光性物質の一例として、ルミノールが挙げられる；生物発光性物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる；好適な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団及び重金属からなる群から選択される検出可能に標識された抗体を提供する。
抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体はまた、化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。化学発光標識された抗体の存在がその後、化学反応の経過の期間中に生じる発光の存在を検出することによって求められる。特に有用な化学発光性の標識用化合物の例が、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体が検出可能に標識され得る方法の１つは、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体を酵素に連結し、連結された生成物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）において使用することによってである（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２（１９７８）、１〜７）；Ｖｏｌｌｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１（１９７８）、５０７〜５２０；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、４８２〜５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．他（編）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。酵素は、抗体に結合しているので、例えば、分光光度法的手段、蛍光定量法的手段又は目視的手段によって検出することができる化学的成分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは発色性基質）と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。加えて、検出を、酵素のための発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出はまた、類似して調製された標準物との比較における基質の酵素反応の程度の目視比較によって達成される場合がある。
検出はまた、様々な他の免疫アッセイのいずれかを使用して達成される場合がある。例えば、抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体を放射能標識することによって、抗体を放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用により検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｍａｒｃｈ、１９８６）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。放射性同位体を、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィー（これらに限定されない）を含む手段によって検出することができる。
抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体はまた、蛍光放射金属（例えば、ランタニド系列の１５２Ｅｕなど）を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を使用して抗体に結合させることができる。
様々な成分を抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体にコンジュゲート化するための技術がよく知られている；例えば、Ａｒｎｏｎ他、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ他（編）、２４３頁〜５６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他（編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、６２３頁〜５３頁（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ他（編）、４７５頁〜５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、３０３頁〜１６頁（１９８５）、及び、Ｔｈｏｒｐｅ他、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２（１９８２）、１１９〜１５８を参照のこと。
述べられたように、特定の実施形態において、結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、抗体又はその免疫特異性フラグメントの安定性又は効力を高める成分をコンジュゲート化することができる。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の結合性分子に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる。Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又は、Ｗｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０（２００２）、５１２。
ＶＩ．組成物及び使用方法
本発明は、本明細書中前記で定義されるように、上記で述べられたＨＴＴ結合性分子（例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントあるいはそれらの誘導体又は変異体）、あるいは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は細胞を含む組成物に関連する。１つの実施形態において、本発明の組成物は医薬組成物であり、かつ、医薬的に許容される担体をさらに含む。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、インターロイキン又はインターフェロンなど）を含む場合がある。変異した及び／又は凝集したＨＴＴの出現を示すか、あるいは、関連づけられる疾患又は障害（例えば、ＨＴＴアミロイドーシスなど）を処置することにおける使用のために、さらなる薬剤が、小さい有機分子、抗ＨＴＴ抗体及びそれらの組合せからなる群から選択される場合がある。したがって、特定の好ましい実施形態において、本発明は、ハンチントン病（ＨＤ）、及び／又はＨＴＴ及び／又はＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患又は障害の予防的処置及び治療的処置、ＨＤ、及び／又はＨＴＴ及び／又はＨＴＴ及び／又はＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患又は障害の進行又はＨＴＴアミロイドーシスの処置に対する応答を対象においてモニターすること、あるいは、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患又は障害を発症することについての対象の危険性を明らかにすることのための医薬組成物又は診断組成物を調製するための、ＨＴＴ結合性分子の使用、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメント、あるいは、それらのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞の使用に関連する。
したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴの、罹患した系及び器官における異常な蓄積及び／又は沈着によって特徴づけられる疾患又は障害を処置する方法であって、その必要性のある対象に、本発明の上記で記載されたＨＴＴ結合性分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞のいずれか１つの治療有効量を投与することを含む方法に関連する。
本発明の治療的取り組みの特定の利点が、本発明の組換え抗体は、例えば、無症候性の変異を有する、凝集したＨＴＴの出現を示す、又は、凝集したＨＴＴに関連づけられる疾患の徴候又は症状を何ら有しない健康なヒト対象から得られるＢ細胞又はメモリーＢ細胞に由来しており、したがって、変異したＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴに関連づけられる臨床的に明白な疾患を防止することが、あるいは、そのような臨床的に明白な疾患又は障害の出現の危険性を減らすことが、あるいは、そのような臨床的に明白な疾患又は障害の発症又は進行を遅らせることが、ある程度の確率で可能であるという事実にある。典型的には、本発明の抗体はまた、体細胞変異、すなわち、抗体の可変領域の体細胞変化による標的ＨＴＴ分子に対する高親和性結合における選択性及び有効性に関しての最適化を既に首尾良く経ている。
そのような細胞は生体内において、例えば、ヒト体内において、自己免疫学的反応又はアレルギー反応の意味で、関連した、又は他の生理学的なタンパク質又は細胞構造によって活性化されていないという認識はまた、臨床試験段階を首尾よく生き残るという相当に増大した可能性がこれにより意味されるので、非常に医学的に重要である。いわば、効率、許容性及び耐容性が、少なくとも１名のヒト対象において予防的抗体又は治療的抗体の前臨床開発及び臨床開発の前に既に実証されている。したがって、本発明のヒト由来抗ＨＴＴ抗体は、治療剤としてのその標的構造特異的効率と、副作用のその低下した可能性との両方により、成功のその臨床的可能性を著しく増大させることが予想され得る。
本発明はまた、上記で記載された成分（例えば、本発明の抗ＨＴＴ抗体、その結合性フラグメント、誘導体もしくは変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、又は細胞）の１つ又は複数により満たされる１つ又は複数の容器を含む医薬用及び診断用のパック又はキットをそれぞれ提供する。そのような容器には、医薬品又は生物学的製造物の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって定められる形式での通知が伴い得る（ただし、そのような通知は、製造、使用又は販売の当局によるヒト投与のための承認を反映する）。加えて、又は、代替において、キットは、適切な診断アッセイにおいて使用されるための試薬及び／又は説明書を含む。本発明の組成物、例えば、キットは、当然のことながら、ハンチントン病、及び／又は変異した及び／又は凝集したＨＴＴの存在が付随する疾患又は障害のリスク評価、診断、防止及び処置のために特に適しており、具体的には、ＨＴＴアミロイドーシスによって一般には特徴づけられる障害を処置するために適用可能である。
本発明の医薬組成物はこの技術分野においてよく知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野ではよく知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、よく知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与が、種々の方法によって、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、局所的投与又は皮内投与あるいは脊髄送達又は脳送達によって行われる場合がある。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤及び等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液又は他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨ及び等張性状態に調節される。直腸投与又は膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある。
投薬計画が主治医及び臨床上の要因によって決定されるであろう。医療技術分野ではよく知られているように、どのような患者であれ、患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、ならびに、同時に投与されている他の薬物を含めて、多くの要因に依存する。典型的な用量が、例えば、０．００１μｇ〜１０００μｇの範囲（あるいは、この範囲における発現又は発現阻害のための核酸の範囲）であり得る；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ない用量又は大きい用量が、とりわけ上述の要因を考慮して想定される。一般に、投薬量は、例えば、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲が可能であり、より通常的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）が可能である。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲において中間的である用量もまた、本発明の範囲内で意図される。対象には、そのような用量を毎日、１日おきに、毎週、又は、経験的分析によって決定されるいずれかの他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な処置は、例えば、少なくとも６ヶ月の長期間にわたる多数回の投薬での投与を伴う。さらなる例示的な処置計画は、２週間毎に１回、又は、１ヶ月に１回、又は、３ヶ月毎〜６ヶ月毎に１回での投与を伴う。例示的な投薬スケジュールには、連続した毎日での１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきでの３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは、毎週での６０ｍｇ／ｋｇが含まれる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、そのような場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量が、示される範囲内である。進行を定期的な評価によってモニターすることができる。非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁物及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油など）、及び、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が挙げられる。水性キャリアには、生理的食塩水及び緩衝媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルション又は懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、流体及び栄養補充液及び電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなど）などが含まれる。保存剤及び他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスなど）。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、ドーパミン又は精神薬理学的薬物など）を含む場合がある。
さらには、本発明の好ましい実施形態において、例えば、本発明の医薬組成物が抗ＨＴＴ抗体あるいはＨＴＴ結合性フラグメント、誘導体又は合成若しくは生物工学変異体を受動免疫化のために含むならば、医薬組成物はワクチンとして配合される場合がある。背景の節で述べられたように、変異したＨＴＴ種、及び／又は凝集したＨＴＴ種ならび／あるいはそのフラグメント又は誘導体がＨＴＴアミロイドーシスの主要な誘因である。したがって、本発明のヒト抗ＨＴＴ抗体及び同等なＨＴＴ結合性分子による受動免疫化は、能動免疫化療法概念のいくつかの有害な影響を回避すること、そして、ＨＴＴの軽減された凝集をもたらすことを助けるであろうと予想することは賢明なことである。したがって、本発明の抗ＨＴＴ抗体及びその同等物は、凝集したＨＴＴの存在を示すか、又は、凝集したＨＴＴによって引き起こされる疾患又は障害、例えばＨＤの防止又は緩和のためのワクチンとして特に有用であろう。
１つの実施形態において、本発明の抗体の組換えＦａｂフラグメント（ｒＦａｂ）及び単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用することが有益である場合がある。これは、それらがより容易に細胞膜に浸透するかもしれないからである。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００８）（Ｏｃｔ １６）；Ｓ１７４１−０１３４（これはオンライで事前に発表された）は、ＡβのＮ末端領域におけるエピトープを認識するモノクローナル抗体ＷＯ−２のキメラな組換えＦａｂフラグメント（ｒＦａｂ）及び単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）の使用を記載する。操作されたフラグメントは、（ｉ）アミロイド原線維化を防止することができ、（ｉｉ）事前に形成されたＡβ１−４２原線維を解凝集することができ、かつ、（ｉｉｉ）Ａβ１−４２オリゴマー媒介の神経毒性を完全なＩｇＧ分子と同じくらい効率的にインビトロで阻害することができた。エフェクター機能を欠く小さいＦａｂ及びｓｃＦｖの操作された抗体様式を使用することの認識された利点には、血液脳関門をより効率的に通過すること、及び、炎症性の副反応を誘発する危険性を最小限に抑えることが含まれる。さらには、ｓｃＦＶ及び単鎖ドメイン抗体は全長抗体の結合特異性を保持することのほかに、それらは単一遺伝子として発現させることができ、また、折り畳み、相互作用、修飾、又は、それらの標的の細胞内局在化の変化についての潜在的可能性が伴うが、細胞内抗体として哺乳動物細胞において細胞内に発現させることができる（総説については、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１２（２００５）、３９４〜４０１を参照のこと）。
異なる取り組みにおいて、Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１は、抗体が、生細胞を傷づけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる技術基盤（いわゆる「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」）を記載する。そのような細胞浸透抗体により、新しい診断範囲及び治療範囲が開拓される。用語「ＴｒａｎｓＭａｂｓ」がこれらの抗体のために案出されている。
さらなる実施形態において、変異した、及び／又は凝集したＨＴＴの出現に関連づけられる疾患、障害又は症状を処置するために有用である他の抗体の共投与又は逐次投与が望ましい場合がある。１つの実施形態において、そのようなさらなる抗体が本発明の医薬組成物において含まれる。対象を処置するために使用することができる抗体の例には、ＣＤ３３、ＳＧＬＴ２、ＩＬ−６及びＩＬ−１を標的化する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、変異した及び／又は凝集したＨＴＴに関連づけられる疾患、障害又は症状を処置するために有用である他の薬剤の共投与又は逐次投与が望ましい場合がある。１つの実施形態において、そのようなさらなる薬剤が本発明の医薬組成物において含まれる。対象を処置するために使用することができる薬剤の例には、下記の薬剤が含まれるが、それらに限定されない：不随意筋運動を標的とするＶＭＡＴ２阻害剤、例えば、Ｘｅｎａｚｉｎｅ（商標）など；抗炎症剤、例えば、ジフルシナール（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、コルチコステロイド類、２−（２，６−ジクロルアニリノ）フェニル酢酸（ジクロフェナク）、イソ−ブチルプロパノイックフェノール酸（ｉｓｏ−ｂｕｔｙｌ−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ−ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（イブプロフェン）など；利尿剤、没食子酸エピガロカテキン、メルファラン塩酸塩、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ−メルファラン、ボルテゾミブ−デキサメタゾン、メルファラン−デキサメタゾン、ボルテゾミブ−メルファラン−デキサメタゾン；抗うつ剤、抗精神病薬、神経遮断剤、抗痴呆剤（例えば、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストのメマンチン）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジルＨＣｌ、リバスチグミン、ガランタミン）、グルタミン酸アンタゴニスト及び他の向知性剤血圧薬剤（例えば、ジヒドララジン、メチルドパ）、細胞増殖抑制剤、グルココルチコイド類、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；抗炎症剤、又は、どのような組合せであれ、それらの組合せ。
治療効果的な用量又は量は、症状又は状態を改善するために十分である有効成分のそのような量を示す。そのような化合物の治療効力及び毒性を、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療効果的な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって求めることができる。治療効果と毒性影響との間における用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。
前記から、本発明は、上記抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＨＴＴ結合性分子及び／又はそのフラグメントのどのような使用をも包含し、具体的には、上記で述べられるような、変異したＨＴＴ種、及び／又は凝集したＨＴＴ種ならびに／あるいはそのフラグメントに関連づけられる疾患又は障害（例えば、ＨＤ及び／又はＨＴＴアミロイドーシスなど）の診断及び／又は処置のためのそのような分子のどのような使用をも包含することが明らかである。好ましくは、前記結合性分子は本発明の抗体又はその免疫グロブリン鎖である。加えて、本発明は、本明細書中前記で記載される述べられた抗体のいずれかの１つの様々な抗イディオタイプ抗体に関連する。これらは、抗原結合部位の近くにおいて抗体の可変領域に位置する特有の抗原性ペプチド配列に結合する抗体又は他の結合性分子であり、例えば、対象から得られるサンプルにおける抗ＨＴＴ抗体を検出するために有用である。１つの実施形態において、本発明は、ＨＴＴに関連づけられる疾患又は障害の予防的処置、治療的処置、ならびに／あるいは、ＨＴＴに関連づけられる疾患又は障害の進行又は処置に対する応答をモニターすることにおいて使用されるための、本明細書中上記において、また下記で定義されるような抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＨＴＴ結合性分子、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチド、ベクター又は細胞、あるいは、それらのいずれか１つを含む医薬組成物又は診断組成物を提供し、好ましくは、この場合、前記障害は、ハンチントン病（ＨＤ）等の、ＨＴＴアミロイドーシスに関連する。
別の実施形態において、本発明は、本発明の上記で記載されたＨＴＴ結合性分子、抗体、抗原結合性フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターあるいは細胞のいずれか１つと、場合により、検出のための好適な手段（例えば、免疫又は核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬など）とを含む診断組成物に関連する。本発明の抗体は、例えば、抗体を液相において利用することができるか、又は、固相キャリアに結合させることができる免疫アッセイにおける使用のために適している。本発明の抗体を利用することができる免疫アッセイの例が、直接的様式又は間接的様式でのどちらであれ、競合的免疫アッセイ及び非競合的免疫アッセイである。そのような免疫アッセイの例が、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリーアッセイ及びウエスタンブロットアッセイである。本発明の抗原及び抗体は多くの異なるキャリアに結合させることができ、また、それらに特異的に結合する細胞を単離するために使用することができる。よく知られているキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロース及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネタイトが含まれる。キャリアの性質は本発明の目的のために可溶性又は不溶性のどちらでも可能である。多くの異なる標識及び標識化方法が当業者には知られている。本発明において使用することができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光性化合物、化学発光化合物及び生物発光化合物が含まれる（本明細書中上記で議論された実施形態もまた参照のこと）。
さらなる実施形態によって、ＨＴＴ結合性分子はまた、特に、本発明の抗体はまた、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、リンパサンプル又はいずれかの他の体液サンプル（例えば、唾液サンプル又は尿サンプルなど）である場合がある体液サンプルを検査された個体から得ること、及び、体液サンプルを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで本発明の抗体と接触させることによって、障害を個体において診断するための方法において使用される場合がある。そのような複合体のレベルがその後、この技術分野において知られている方法によって求められ、コントロールサンプルにおいて形成されるレベルよりも有意に大きいレベルにより、疾患が、検査された個体において示される。同じ様式で、本発明の抗体が結合する特異的抗原もまた使用される場合がある。したがって、本発明は、結合性分子、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含むインビトロ免疫アッセイに関連する。
本発明のさらなる実施形態において、本発明のＨＴＴ結合性分子（具体的には抗体）はまた、個体における疾患又は障害の診断を、生検物を試験された個体から得ることによって行うための方法において使用される場合がある。
この関連において、本発明はまた、この目的のために具体的に設計される手段に関連する。例えば、抗体に基づくアレイが使用される場合があり、アレイには、例えば、ＨＴＴを特異的に認識する本発明の抗体又はその同等な抗原結合性分子が負荷される。マイクロアレイでの免疫アッセイの設計が、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（２００６）、１６８１〜１６９６において要約される。したがって、本発明はまた、本発明に従って特定されるＨＴＴ結合性分子が負荷されるマイクロアレイに関連する。
１つの実施形態において、本発明は、変異したＨＴＴ種、及び／又は凝集したＨＴＴ種ならびに／あるいはそのフラグメントに関連づけられる疾患又は障害を対象において診断する方法であって、診断される対象から得られるサンプルにおけるＨＴＴならびに／あるいは変異したＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体、ＨＴＴ結合性フラグメント、又は、それらのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＨＴＴ結合性分子を用いて明らかにすることを含み、この場合、病理学的に変異したＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴの存在が、ＨＤ及び／又はＨＴＴアミロイドーシスについて示すものであり、また、生理学的ＨＴＴのレベルとの比較において、病理学的に変異したＨＴＴ及び／又は凝集したＨＴＴのレベルの増大が、前記対象のＨＤ及び／又はＨＴＴアミロイドーシスの進行について示すものである方法に関連する。
診断される対象は疾患について無症候性又は病状発現前である場合がある。好ましくは、コントロール対象が、変異したＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴに伴う疾患（例えば、ハンチントン病（ＨＤ））を有しており、ただし、この場合、病理学的に変異したＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴのレベルと、参照標準との間における類似性により、診断される対象はＨＴＴアミロイドーシスを有するか、又は、ＨＴＴアミロイドーシスを発症する危険性があることが示される。代替において、又は、加えて、第２のコントロールとして、コントロール対象はＨＴＴアミロイドーシスを有しておらず、ただし、この場合、生理学的ＨＴＴのレベルならびに／あるいは変異したＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴのレベルと、参照標準との間における違いにより、診断される対象はＨＴＴアミロイドーシスを有するか、又は、ＨＴＴアミロイドーシスを発症する危険性があることが示される。好ましくは、診断される対象と、コントロール対象とは、年齢が一致する。分析されるサンプルは、どのような体液であれ、病理学的に変異したＨＴＴ及び／又は凝集したＨＴＴを含有することが疑われる体液である場合があり、例えば、血液、血漿、血清、尿、腹腔液、唾液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）である場合がある。本発明の別の局面では、本発明の抗体は、可溶性ＨＴＴ及び凝集したＨＴＴを、例えば、Ｂａｌｄｏら（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９（２）（２０１２），２６４−２７５ その開示内容、特に２７３頁〜２７４頁の実験手順は本願明細書に取り込まれる。）が記載したＴＲ−ＦＲＥＴベースの二重免疫アッセイを利用して検出することに使用され得る。
そのうえ、哺乳動物細胞は線維性ポリグルタミンペプチド凝集物の内部移行を培養中に引き起こし、これにより、細胞質区画に近づけ、かつ、ユビキチン−プロテアソーム系の成分及び細胞質シャペロンと一緒にアグリソームに共隔離することができることが、例えば、Ｒｅｎ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１（２）（２００９）、２１９〜２２５に記載されている。これらの内部移行した線維性凝集物は可溶性の細胞質タンパク質を選択的に漸加させることができ、また、遺伝的な表現型を、相同的なアミロイド形成タンパク質を染色体遺伝子座から発現する細胞に与えることができた。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗ＨＴＴ抗体は、Ｐｅｃｈｏ−Ｖｒｉｅｓｌｉｎｇ他、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１４）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．３７６１によってハンチンチン又は神経変性に関与する他のタンパク質（例えば、α−シヌクレインなど）について示されるように、「毒性」ＨＴＴ種の細胞外拡大又は経ニューロン伝播を軽減させることができる；例えば、Ｇｕｏ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（２）（２０１４）、１３０〜１３８を参照のこと。
生理学的ＨＴＴのレベルならびに／あるいは変異したＨＴＴ、及び／又は凝集したＨＴＴのレベルが、例えば、ウエスタンブロット、免疫沈殿、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析法（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＳＥＬＤＩーＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）それに続くタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、及び、レーザーデンシトメトリーから選ばれる１つ又は複数の技術によってＨＴＴを分析することを含む、この技術分野において知られているいずれかの好適な方法によって評価される場合がある。好ましくは、ＨＴＴの前記インビボ画像化は、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
本発明の１つの態様において、本発明の抗体又は前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＨＴＴ結合性分子、本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチド、ベクター又は細胞、あるいは、それらのいずれか１つを含む医薬組成物又は診断組成物が、ＨＴＴに関連づけられる疾患又は障害の予防的処置、治療的処置、ならびに／あるいは、そのような疾患又は障害の進行又は処置に対する応答をモニターすることにおける使用のために提供される。したがって、一般には、本発明はまた、対象におけるＨＴＴに関連づけられる疾患又は障害（例えば、ＨＴＴアミロイドーシスなど）を診断する、又はその進行をモニターする方法であって、診断される前記対象からのサンプルにおけるＨＴＴの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体又は前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＨＴＴ結合性分子を用いて明らかにすることを含み、ただし、この場合、変異したＨＴＴ種、ミスフォールドしたＨＴＴ種、及び／又は凝集したＨＴＴ種あるいはそのフラグメントの存在が、前記疾患又は障害について示すものである方法に関連する。１つの実施形態において、対象におけるＨＴＴアミロイドーシスを診断する、又はその進行をモニターする前記方法であって、診断される対象からのサンプルにおける変異したＨＴＴ種、及び／又は凝集したＨＴＴ種ならびに／あるいはそのフラグメントの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体又は前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＨＴＴ結合性分子を用いて明らかにすることを含み、ただし、この場合、変異したＨＴＴ種、及び／又は凝集したＨＴＴ種ならびに／あるいはそのフラグメントの存在が、前駆症状的、前駆的又は臨床的なＨＴＴアミロイドーシスを示すものであり、また、生理学的ＨＴＴのレベルに対する比較において、あるいは、健康なコントロール対象に由来する参照サンプル、又は、同じ対象からのコントロールサンプルに対する比較において、ＨＴＴ凝集物のレベルの増大が、症状発現前、前駆的又は立証されたＨＴＴアミロイドーシスの進行について示すものである方法が提供される。１つの実施形態において、前記方法は、本明細書中上記で定義されるようなＨＴＴに関連づけられる障害の一群からのいずれか他の疾患又は障害を診断するために、あるいはその進行をモニターするために同様にまた使用されることが、当業者によって理解されるであろう。
上記で示されるように、本発明の抗体、そのフラグメント、及び、本発明の抗体及びそのフラグメントと同じ結合特異性の分子は、インビトロだけでなく、インビボにおいても同様に使用される場合があり、診断的適用のほかに、治療的適用が同様に実行される場合がある。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、ヒト又は動物の身体におけるＨＴＴのインビボ検出のための組成物、あるいは、治療剤及び／又は診断剤をヒト又は動物の身体においてＨＴＴに対して標的化するための組成物を調製するための、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＨＴＴ結合性分子に関連する。潜在的可能性のある治療剤及び／又は診断剤が、本明細書中上記で示されるような、ＨＴＴアミロイドーシスの処置において有用である治療剤、及び、潜在的可能性のある標識の非網羅的な列挙から選ばれる場合がある。インビボ画像化に関して、１つの好ましい実施形態において、本発明は、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＨＴＴ結合性分子を提供し、前記インビボ画像化が、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。さらなる実施形態において、本発明はまた、本明細書中上記で定義されるように、対象におけるＨＴＴに関連づけられる疾患又は障害を診断するか、又はその進行をモニターする方法において使用するための、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＨＴＴ結合性分子、あるいは、上記で指定されるインビボ画像化方法のための組成物を調製するための前記分子を提供する。
ＶＩＩ．凝集特異的なＨＴＴエピトープを有するペプチド
さらなる態様において、本発明は、本発明のいずれかの抗体によって特異的に認識されるＨＴＴのｐｏｌｙＰ領域のエピトープを有するペプチドに関連する。好ましくは、そのようなペプチドは、抗体、あるいは、１つ又は複数のアミノ酸が置換され、欠失され、及び／又は付加されるその改変された配列によって認識される独特な直鎖状エピトープとして、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６１、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０に示されるようなアミノ酸配列を含むか、又は、そのようなアミノ酸配列からなり、ペプチドは本発明のいずれかの抗体によって認識され、好ましくは、抗体ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、抗体ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、抗体ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、抗体ＮＩ−３０２．１１Ａ４、抗体ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、抗体ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、抗体ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、抗体ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、抗体ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、抗体ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、抗体ＮＩ−３０２．７Ａ８、抗体ＮＩ−３０２．３Ｄ８、抗体ＮＩ−３０２．４６Ｃ９、抗体ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、抗体ＮＩ−３０２．１８Ａ１、抗体ＮＩ−３０２．５２Ｃ９又は抗体ＮＩ−３０２．８Ｆ１によって認識される。
さらなる局面において、本発明は、本発明のいずれかの抗体によって特異的に認識されるＨＴＴのプロリンリッチ領域のエピトープを有するペプチドに関連する。好ましくは、そのようなペプチドは、抗体、あるいは、１つ又は複数のアミノ酸が置換され、欠失され、及び／又は付加されるその改変された配列によって認識される独特な直鎖状エピトープとして、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号２００に示されるようなアミノ酸配列を含むか、又は、そのようなアミノ酸配列からなり、ペプチドは本発明のいずれかの抗体によって認識され、好ましくは、抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、抗体ＮＩ−３０２．２Ａ２、抗体ＮＩ３０２．１５Ｄ３又は抗体ＮＩ−３０２．６４Ｅ５によって認識される。
さらに、本発明は、本発明のいずれかの抗体によって特異的に認識されるＨＴＴのＣ末端領域のエピトープを有するペプチドに関連する。好ましくは、そのようなペプチドは、抗体、あるいは、１つ又は複数のアミノ酸が置換され、欠失され、及び／又は付加されるその改変された配列によって認識される独特な直鎖状エピトープとして、配列番号１４５又は配列番号２０２に示されるようなアミノ酸配列を含むか、又は、そのようなアミノ酸配列からなり、ペプチドは本発明のいずれかの抗体によって認識され、好ましくは、抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１又は抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０によって認識される。
さらなる態様において、本発明は、本発明のいずれかの抗体によって特異的に認識されるＨＴＴのＮ末端領域のエピトープを有するペプチドに関連する。好ましくは、そのようなペプチドは、上記抗体によって認識される特有な線状エピトープとして配列番号１４４に示されるようなアミノ酸配列、或いは、１つ又は複数のアミノ酸が置換され、欠失され、及び／又は付加されるその改変された配列を含み、或いは、そのようなアミノ酸配列又はそのような改変された配列からなり、ただし、このペプチドは本発明のいずれかの抗体によって認識され、好ましくは抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８によって認識される。
そのうえ、１つの実施形態において、本発明は、本発明のいずれかの抗体によって特異的に認識されるＨＴＴのＱ／Ｐリッチ領域のエピトープを有するペプチドに関連する。好ましくは、そのようなペプチドは、上記抗体によって認識される特有な線状エピトープとして配列番号２０１に示されるようなアミノ酸配列、或いは、１つ又は複数のアミノ酸が置換され、欠失され、及び／又は付加されるその改変された配列を含み、或いは、そのようなアミノ酸配列又はそのような改変された配列からなり、ただし、このペプチドは本発明のいずれかの抗体によって認識され、好ましくは抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８によって認識される。
加えて、１つの実施形態において、本発明は、本発明のいずれかの抗体によって、好ましくは、抗体ＮＩ−３０２．６Ｎ９、抗体ＮＩ−３０２．１２Ｈ２、抗体ＮＩ−３０２．８Ｍ１及び／又は抗体ＮＩ−３０２．４Ａ６によって特異的に認識されるＨＴＴのエピトープを有するペプチドで、１つ又は複数のアミノ酸が置換され、欠失され、及び／又は付加されるペプチドであって、本発明のいずれかの抗体によって認識されるペプチドに関連する。
本発明の１つの実施形態において、そのようなペプチドは、対象における変異したＨＴＴ種、ミスフォールドしたＨＴＴ種、及び／又は凝集したＨＴＴ種ならびに／あるいはそのフラグメントに関連づけられる疾患又は障害（例えば、ＨＤ及び／又はＨＴＴアミロイドーシスなど）を診断するために、又はモニターするために使用される場合があり、ただし、この場合、これは、前記対象の生物学的サンプルにおいてペプチドに結合する抗体の存在を明らかにする工程を含み、本発明の上記ペプチドを認識する抗体のレベルを測定すること、及び、測定結果を、同等の年齢及び性別の健康な対象において見出されるレベルに対して比較することによって前記対象におけるそのような疾患の診断のために使用される。したがって、１つの実施形態において、本発明は、対象における前駆症状的又は臨床的なＨＤを暗示するＨＴＴアミロイドーシスを診断するための方法であって、上記で定義されるようなペプチドに結合する抗体の存在を前記対象の生物学的サンプルにおいて明らかにすることを含む方法に関連する。この方法によれば、本発明の前記ペプチドについて特異的である測定された抗体の上昇したレベルが、前駆症状的又は臨床的なＨＤを前記対象において診断することについて、あるいは、本明細書中上記で定義されるようなＨＴＴに関連づけられる障害の一群からのいずれか他の疾患又は症状を前記対象において診断することについて示すものである。本発明のペプチドは、本明細書中前記で記載されるように、アレイ、キット及び組成物においてそれぞれ配合される場合がある。これに関連して、本発明はまた、ＨＤ及び／又はＨＴＴアミロイドーシスを診断すること、又はその進行をモニターすることにおいて有用なキットであって、本発明の少なくとも１つの抗体又は前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＨＴＴ結合性分子、本明細書中上記でそれぞれ定義されるようなポリヌクレオチド、ベクター又は細胞及び／又はペプチドを、必要な場合には使用のための試薬及び／又は説明書と一緒に含むキットに関連する。
上記開示は本発明を概して記載する。別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂及び２００３年再版、ＩＳＢＮ ０ １９ ８５０６７３ ２）において提供されるような定義が与えられる。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。完全な書誌的引用が請求項の直前において明細書の最後に見出される場合がある。すべての引用された参考文献（本出願明細書を通して引用されるような文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、及び、製造者の仕様書、説明書などを含む）の内容が、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる；しかしながら、どのような文書であれ、引用される文書は実際に本発明に関して先行技術であることを何ら認めるものではない。
より完全な理解を、例示のみの目的のために本明細書中に提供され、かつ、本発明の範囲を限定するために意図されない下記の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。
実施例１：抗ＨＴＴ抗体の単離及び特定
ＨＴＴ及び／又は変異したＨＴＴ種及び／又は凝集したＨＴＴ種並びに／或いはそれらのフラグメントを標的とする様々なヒト由来抗体を、国際特許出願公開ＷＯ２００８／０８１００８（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される方法を改変して利用して特定した。具体的には、組換え発現によって得られる野生型ＨＴＴタンパク質及び変異ＨＴＴタンパク質を、ＨＴＴ標的化抗体を特定するために生来型立体配座体及び変異型−凝集型の立体配座体の両方で使用した。変異型−凝集型の立体配座体を、実施例３で記載される手順に類似する手順を使用してインビトロで産生させた。
実施例２：抗体配列の決定
上記で特定された抗ＨＴＴ抗体の可変領域のアミノ酸配列をそれらのｍＲＮＡ配列に基づいて決定した（図１を参照のこと）。簡単に記載すると、選択された不死化されていないメモリーＢ細胞培養物の生存Ｂ細胞を集めた。続いて、選択された抗ＨＴＴ抗体を産生する細胞からのｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに転換し、抗体の可変領域をコードする配列をＰＣＲによって増幅し、プラスミドベクターにクローン化し、配列決定した。
簡単に記載すると、ヒト免疫グロブリン生殖系列レパートリーのすべての配列ファミリーを表すプライマーの組合せを、リーダーペプチド、Ｖセグメント及びＪセグメントの増幅のために使用した。１回目の増幅を、５’末端におけるリーダーペプチド特異的プライマーと、３’末端における定常領域特異的プライマーとを使用して行った（Ｓｍｉｔｈ他、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．４（２００９）、３７２〜３８４）。重鎖及びカッパ軽鎖のために、２回目の増幅を、５’末端におけるＶセグメント特異的プライマーと、３’末端におけるＪセグメント特異的プライマーとを使用して行った。ラムダ軽鎖のために、２回目の増幅を、５’末端におけるＶセグメント特異的プライマーと、３’末端におけるＣ領域特異的プライマーとを使用して行った（Ｍａｒｋｓ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）、５８１〜５９７；ｄｅ Ｈａａｒｄ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６（１９９９）、１８２１８〜１８２３０）。
所望の特異性を有する抗体クローンの特定を、完全な抗体を組換え発現させたときにＥＬＩＳＡでの再スクリーニングによって行った。完全なヒトＩｇＧ１抗体の組換え発現が、可変重鎖配列及び可変軽鎖配列を、可変領域配列を５’末端において、リーダーペプチドをコードする配列により補い、かつ、３’末端において、適切な定常ドメインをコードする配列により補う発現ベクターに「正しい読み枠で」挿入したときに達成された。その目的を達成するために、プライマーは、抗体発現ベクターへの可変重鎖配列及び可変軽鎖配列のクローニングを容易にするために設計される制限部位を含有した。重鎖免疫グロブリンを、シグナルペプチドとヒト又はマウスの免疫グロブリンガンマ１の定常ドメインとを有する重鎖発現ベクターに読み枠を合わせて免疫グロブリン重鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を挿入することによって発現させた。カッパ軽鎖免疫グロブリンを、シグナルペプチドとヒトカッパ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを提供する軽鎖発現ベクターに読み枠を合わせてカッパ軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を挿入することによって発現させた。ラムダ軽鎖免疫グロブリンを、シグナルペプチドとヒト又はマウスのラムダ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを提供するラムダ軽鎖発現ベクターに読み枠をラムダ軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を合わせて挿入することによって発現させた。
機能的な組換えモノクローナル抗体が、Ｉｇ重鎖発現ベクターと、カッパＩｇ軽鎖発現ベクター又はラムダＩｇ軽鎖発現ベクターとをＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞（或いはヒト起源又はマウス起源の他の適切なレシピエント細胞株のいずれか）に共トランスフェクションしたときに得られた。組換えヒトモノクローナル抗体を続いて、標準的なプロテインＡカラム精製を使用して馴化培地から精製した。組換えヒトモノクローナル抗体を、一過性にトランスフェクションされた細胞又は安定的にトランスフェクションされた細胞をそのどちらであっても使用して無限の量で産生させることができる。組換えヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株を、Ｉｇ発現ベクターをそのまま使用することによって、又は、Ｉｇ可変領域を異なる発現ベクターに再クローニングすることによってそのどちらでも樹立することができる。誘導体、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２及びｓｃＦｖなどもまた、これらのＩｇ可変領域から作製することができる。フレームワーク領域及び相補性決定領域をデータベース（例えば、Ａｂｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／など）において利用可能な参照抗体配列との比較によって決定し、これらの領域に、Ｋａｂａｔ番号表記スキーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）を使用して注釈を付けた。
実施例３：ＨＴＴエクソン１タンパク質の発現
方法
組換えハンチンチンエクソン１タンパク質のＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ２１（ＧＳＴ−ＨＤ２１）、ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ３５（ＧＳＴＨＤ３５）及びＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ４９（ＧＳＴ−ＨＤ４９）の発現及び精製
２１回、３５回又は４９回のＣＡＧ反復のポリＱ長さを有するヒトハンチンチンのエクソン１を、Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位とともにそれぞれ融合されてコードするｐＧＥＸ−６Ｐ−１発現ベクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（図２Ａを比較のこと）を大腸菌株ＢＬ２１において発現させた。一晩の細菌培養物（３７℃、２２０ｒｐｍ）を１：２５で希釈し、発現を１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ１２８４）の添加によって０．５〜０．６の吸収６００において４時間誘導し、さらなるインキュベーションを３６℃で行った（２２０ｒｐｍ）。培養物を、さらに１％のグルコースを伴う一晩培養物のために、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地において３７℃で成長させた。組換えＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１タンパク質を、グルタチオンアガロース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ４５１０）への結合によって精製した。簡単に記載すると、細菌ペレットを、２０ｍｌ〜４０ｍｌの冷たい緩衝液１（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、５ｍｇ／ｍｌの最終的リゾチーム、プロテアーゼ阻害剤コンプリート（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁し、氷上で６０分間インキュベーションし、超音波処理し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加え（０．１％の最終濃度）、氷上での５分間のインキュベーションの後、１４，０００ｇでの９０分間の遠心分離に供した。グルタチオンアガロースを上清に加え、４℃で２時間インキュベーションし、１０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除いた後で冷ＰＢＳにより２回洗浄した。溶出を、１０ｍＭの還元型グルタチオンを伴う１ｍｌの緩衝液１（ｐＨ９）において５分間行った。この工程を、さらなるタンパク質が溶出されなくなるまで５回〜１５回繰り返した。貯められた上清を緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％グリセロール）に対して一晩透析し（１０ｋＤのＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ）、小分け物を−８０℃で貯蔵した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
精製された組換えＧＳＴ−ＨｔｔＥｘ１タンパク質をグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４〜１２％；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって分離し、その後、クーマシーブリリアントブルーによる染色又はニトロセルロースメンブランでのエレクトロブロッティングを行った。ブロットを一次抗体のＭａｂ５４９２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｎ末端ａａ１−８２エピトープ、Ｐリッチドメイン）又はＮＩ−３０２．３７Ｃ１２とインキュベーションし、その後、ＨＲＰとコンジュゲート化されるヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体、又は、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベーションした。ブロットを、ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００検出（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スイス）を使用して発色させた。
図２Ｂに示されるように、上記の種々の組換えＧＳＴ−ＨｔｔＥｘ１タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシー染色によって明らかにされるように首尾よく発現し、精製された。
実施例４：ドットブロット及びフィルター遅延による凝集状態の特徴づけ
ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９のタンパク質凝集速度論を特徴づけるために、フィルター遅延分析及びドットブロット分析を行った。
したがって、初めに、凝集反応を下記のように行った：組換えＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１タンパク質を融合タンパク質として発現させ、精製することができる。ＧＳＴタグがＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＰＰ）によって融合タンパク質から切断されるとすぐに、ハンチンチンエクソン１タンパク質の凝集反応が直ちに始まる。反応開始前に、ＧＳＴ−ＨｔｔＥｘｏｎ１タンパク質を１０００００ｇで３０分間遠心分離した。清澄化されたタンパク質溶液を冷たい凝集緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ７）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２μＭのタンパク質濃度に希釈し、１ｍＭ ＤＴＴと、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とを加えた。反応液は、３００ｒｐｍでの回転を行いながら室温でインキュベーションされ、凝集反応が、示された時間間隔の後、−８０℃での瞬間凍結によって停止させられた。続いて、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９の各凝集反応液の一部を、１時間、３時間、５時間、７時間及び２４時間のインキュベーション時間の後でそれぞれ取り出し、ドライアイス上で瞬間凍結し、−８０℃で貯蔵した。
ドットブロット分析のために、サンプルを氷上で解凍し、希釈し、真空をメンブランの下側のチャンバーにおいて加えるフィルターデバイスを用いてニトロセルロース転写メンブランに転写した。その目的を達成するために、メンブランをＰＢＳにより平衡化し、チャンバーに取り付け、ウエルあたり１００μｌのＰＢＳにより洗浄した。サンプルを負荷し、メンブランを通して完全に吸引し、その後、ＰＢＳによる３回の洗浄を行った。デバイスを解体し、メンブランを室温で１５分間、簡単に風乾し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ緩衝液において３％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）により室温で１時間ブロッキング処理し、ポリクローナルなＨＤ−１抗体（１：１０，０００、Ｅ．Ｗａｎｋｅｒ教授（ＭＤＣ、Ｂｅｒｌｉｎ）からの譲渡物）とインキュベーションした。洗浄後、メンブランを、ＨＲＰにカップリングされる抗ウサギＩｇＧ抗体とＲＴで１時間インキュベーションし、ブロットを、ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００検出（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スイス）を使用して発色させた。
図２Ｃ（左側）に示されるドットブロットから明白であるように、ポリクローナルなＨＤ−１抗体により、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９の各タンパク質が、それらの凝集状態にかかわらず検出された。
フィルター遅延アッセイのために、サンプルを氷上で解凍し、変性緩衝液（４％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ）に希釈し、真空チャンバーを使用して、細孔サイズが０．２ｕｍである酢酸セルロースメンブランを通して転写した：その目的を達成するために、メンブランをＰＢＳにおける０．１％のＳＤＳにおいて平衡化し、真空チャンバーに取り付け、ウエルを０．１％のＳＤＳにより洗浄した。サンプルを加え、真空によってメンブランでろ過し、０．１％のＳＤＳにより３回洗浄した。その後、メンブランをチャンバーから取り出し、簡単に風乾し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ緩衝液において５％のミルク、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）によりＲＴで１時間ブロッキング処理し、ポリクローナルなＨＤ−１抗体（１：５，０００、Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒ他、Ｃｅｌｌ ９０（１９９７）、５４９〜５５８）とインキュベーションし、さらには上記のように処理した。
フィルター遅延アッセイにおいて、メンブランによって保持される最初の凝集物が、２４時間のインキュベーションの後、ＨＤ３５について検出された。伸長したポリＱ域を有するＨＤ４９タンパク質は、ＧＳＴタグ切断後３時間もの早期において不溶性の凝集物を形成する；図２Ｃの右側（ＦＲＡ）を参照のこと。
実施例５：ハンチンチンエクソン１凝集物の特徴づけ
ＨＤ３５及びＨＤ４９のエクソン１凝集物形成を確認し、特徴づけるために、電子顕微鏡法（ＥＭ）を行った。簡単に記載すると、１時間後、３時間後及び２４時間後でそれぞれ得られるＨＤ４９凝集反応液、又は、２４時間後にＨＤ３５から得られるサンプルを電子顕微鏡法によって分析した。サンプルをグロー放電により炭素被覆された銅グリッドに吸着させた。過剰なサンプルをろ紙でのブロッティングによって除いた。グリッドを２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルにより１分間染色し、過剰な酢酸ウラニルを蒸留脱イオン水により洗浄した。グリッドを風乾し、１００ｋＶの加速電圧を用いるＰｈｉｌｉｐｓ社のＣＭ１００透過型電子顕微鏡を使用して画像化した。
ＨＤ３５凝集反応液のＥＭ分析では、プロトフィブリル構造物に類似する、ＥＭによって視認できるより大きい凝集物が２４時間のインキュベーションの後で明らかにされた（図２Ｄ［Ｅ］）。ＨＤ４９では、より迅速な凝集速度論が示され、この場合、原線維が１時間のインキュベーションの後で既に検出可能であり（図２Ｄ［Ｆ］）、原線維はサイズ及び数が凝集時間とともに増大した（図２Ｄ［Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ］）。これらの観測結果は、０．２μｍよりも大きい凝集物が酢酸セルロースメンブランに保持されるフィルター遅延アッセイで得られる結果と一致していたものであり、これらの観測結果から、ハンチンチンエクソン１凝集物が首尾よく調製されたことが確認される；実施例４もまた参照のこと。
実施例６：直接ＥＬＩＳＡを利用する抗ポリＰドメイン抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の結合親和性及びＥＣ５０
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のハンチンチンエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、直接ＥＬＩＳＡを行った。簡単に記載すると、９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、ＧＳＴ−ＨＤ２１、ＧＳＴ−ＨＤ４９或いは凝集型ＨＤ２１又は凝集型ＨＤ４９のいずれかにより、被覆緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において５μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。非特異的結合部位を、ＲＴで１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。一次抗体を示された濃度に希釈し、ＲＴで１時間インキュベーションした。結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体、又は、ＨＲＰとコンジュゲート化されるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）特異的抗体のどちらかを使用して明らかにし、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行った。続いて、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する凝集型及び可溶性のＨＴＴエクソン１タンパク質についてのヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１のＥＣ５０を、５μｇ／ｍｌの濃度での上記異なる調製物の被覆を用いる直接ＥＬＩＳＡによって求めた。図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１は、病理学的に凝集したＨＴＴエクソン１のＨＤ４９を含む４つすべての種に対して類似する大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がおよそ１００ｐＭであった。
実施例７：ドットブロット及びフィルター遅延アッセイを利用する抗ＨＴＴ抗体の結合選択性
２１回、３５回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のハンチンチンエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１を特徴づけるために、フィルター遅延アッセイ及びドットブロットを行った。このため、実施例４で記載されるような、ＨＤ２１、ＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集反応液の一部を、１時間、３時間、５時間、７時間及び２４時間のインキュベーション時間の後で取り出し、ドライアイス上で急速凍結し、−８０℃で貯蔵し、ドットブロットを実施例４で記載されるように行った。フィルター遅延アッセイもまた、実施例４で記載されるように行った。ただし、この場合には、メンブランをＮＩ−３０２．３３Ｃ１１（１μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。
ドットブロット（図３Ｃ、左側）では、抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１により、伸長したポリＱ域を有するハンチンチンの様々なタンパク質が優先的に検出されること（ＨＤ４９＞＞ＨＤ３５＞ＨＤ２１）が示され得る。そのうえ、シグナル強度が、ＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集反応液のインキュベーション時間の増大とともに増大した。
このことがまた、フィルター遅延分析で示される結果（図３Ｃ、右側）についても当てはまる。フィルター遅延分析では、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１により、０．２μｍの細孔サイズのメンブランに保持されたＨＤ３５凝集物及びＨＤ４９凝集物が検出されることが示された。スポットされたタンパク質調製物に基づくこれらの知見により、抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１は、病原的なポリＱ伸長を有する凝集型ＨＴＴ立体配座体についての優先傾向を有することが示唆された。
実施例８：直接ＥＬＩＳＡを利用する、無関係な凝集性タンパク質標的に対する抗ＨＴＴ抗体の結合特異性及び結合選択性
ＨＴＴのポリＰ領域に結合し、無関係な凝集性タンパク質標的には結合しない抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１組換え抗体の結合特異性を明らかにするために、直接ＥＬＩＳＡを、種々の標的タンパク質が被覆緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で被覆される９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行った。非特異的結合部位を、ＲＴで１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体を示された濃度に希釈し、ＲＴで１時間インキュベーションした。結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体を使用して明らかにし、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行った。標的タンパク質についてのシグナルを、メジアンを超える増加倍数で計算した。
ヒト由来のＮＩ−３０２．３３Ｃ１１は、ＨＴＴに対して、すなわち、凝集したＨＤ４９に対して特異的に結合し、顕著なアミロイド形成タンパク質を含む他の無関係なタンパク質標的に対する結合が認められないことが示され得る（図１６Ａを参照のこと）。
実施例９：ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の結合エピトープの評価
ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１ヒト由来抗体によって認識されるハンチンチン（ＨＴＴ）エピトープをマッピングするために、合成ペプチドを用いるペプチド走査分析によるエピトープマッピングを行った。
簡単に記載すると、重複するペプチドのスキャンをエピトープマッピングのために使用した。ヒトＨＴＴエクソン１配列の配列を、１０ａａの重複が個々のペプチドの間にある合計で１６個の線状の１５量体ペプチドとして合成し（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）、ニトロセルロースメンブランにスポットした。メンブランをメタノール中で５分間活性化し、その後、ＴＢＳにおいてＲＴで１０分間洗浄した。非特異的結合部位を、室温で２時間、Ｒｏｔｉ（登録商標）−Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）によりブロッキング処理した。ヒトＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体（１μｇ／ｍｌ）をＲｏｔｉ（登録商標）−ＢｌｏｃｋにおいてＲＴで３時間インキュベーションした。一次抗体の結合を、ＨＲＰコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧγ二次抗体を使用して明らかにした。ブロットを、ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００検出（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スイス）を使用して発色させた。
図４に示されるように、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の顕著な結合が、ペプチド番号７、８、９、１３及び１４に対して認められた。このことは、この抗体によって認識されるエピトープがハンチンチンのポリＰ反復ドメインに限定されることを示している。したがって、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１結合エピトープは、ＨＴＴのアミノ酸３５−ＰＰＰＰＰＰＰＰ−４２（配列番号１３９）及びアミノ酸６３−ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ−７２（配列番号１６２）の内部に限定されることが予想される。
実施例１０：ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の、異なるエクソン１ペプチドに対する直接的ＥＬＩＳＡ結合によるエピトープマッピング
ハンチンチンエクソン１のＢＳＡカップリングされたペプチドフラグメントに対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、ＢＳＡカップリングされたＨｔｔエクソン１ドメインペプチドを用いた直接ＥＬＩＳＡを行った。
簡単に記載すると、９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、Ｎ末端アミノ酸１−１９（ＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱＱ、配列番号９３）、Ｐリッチドメイン配列（ＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＰ、配列番号９４）、ポリＰ反復配列（ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ、配列番号９５）又は１４個のＣ末端アミノ酸（ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号９６）のＢＳＡカップリングされた合成ペプチド（Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ、デンマーク）により、或いは全長型のＧＳＴ−ＨＤ４９エクソン１タンパク質により、被覆緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において５μｇ／ｍｌで被覆した。非特異的結合部位を、ＲＴで１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。一次抗体を示された濃度に希釈し、ＲＴで１時間インキュベーションした。結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体を使用して明らかにし、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行い、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。
図５に示されるように、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１は、全長型のＧＳＴ−ＨＤ４９に対するのと同様に、ＢＳＡとカップリングされたポリＰペプチドに対して大きい親和性で結合し、３０ｐＭの同等なＥＣ５０を有した。このことから、実施例９で示されるようなポリＰ配列に対するエピトープマッピングが確認される。
実施例１１：組換えヒトＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗ポリＰドメイン抗体の純度及び完全性の評価
組換えヒトＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗ポリＰドメインリード抗体の純度及び完全性を評価するために、ヒトＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗ポリＰドメイン抗体をＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、ＡｋｔａシステムでのプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＰＤ−１０カラムでの脱塩の後、抗体をＰＢＳにおいて配合した。続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を下記のように行った。２μｇ及び１０μｇの精製された組換えヒトＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗ポリＰドメイン抗体をグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって還元条件下で分離し、その後、クーマシー染色（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行った。
組換えヒトＮＩ−３０２抗ポリＰドメインリード抗体の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体の重鎖及び軽鎖に対応する２つの主要なバンドが、図６に示されるような予想されたサイズにおいて明らかにされ、その一方で、有意な混入物又はタンパク質分解生成物は何ら検出されなかった。
実施例１２：ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスにおけるＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１の特徴づけ
ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスの脳組織におけるハンチンチン病理に対するＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体の結合を評価するために、免疫組織化学を行った。Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入マウス系統（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ他、Ｃｅｌｌ ８７（１９９６）、４９３〜５０６）は、ハンチントン病（ＨＤ）についての十分に特徴づけられたマウスモデルである。９週齢頃から始まるが、この動物モデルは、ヒトのハンチントン病を思わせるハンチンチンの核内封入体によって特徴づけられる進行性の病理を発症させる（Ｎａｖｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２２（２００３）、１０４９〜１０５７）。進行した疾患段階（２７０日）にあるこれらのＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入マウスの脳半球をリン酸塩緩衝化の４％パラホルムアルデヒド溶液において固定処理し、パラフィン包埋し、５μｍの切片を調製した。ギ酸及びクエン酸塩緩衝液による前処理の後、切片を、１ｎＭ、５ｎＭ又は５０ｎＭのヒトＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗ＨＴＴ抗体とインキュベーションし、その後、ビオチン化されたロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１：２５０）とインキュベーションした。抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により増幅し、ジアミノベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出した。
図２７に示されるように、ヒト由来のポリＰドメイン抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１により、ニューロンの核内封入体病理の非常に顕著な染色が、ＥＬＩＳＡ分析及びドットブロット分析によって明らかにされるようなハンチンチン凝集物に対する大きい親和性結合と一致する最も低い１ｎＭの濃度で既に明らかにされた（図２７［Ｅ〜Ｈ］）。５ｎＭ以上の濃度では、この抗体により、中間の棘状ニューロン全体がさらに染色され、そして、遺伝子非導入体の脳切片でもまた検出可能であった一層広まった広汎な染色がもたらされた。ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１によって標的とされるポリｐエピトープが無数の無関係なタンパク質にもまた存在したので、ある程度の交差反応性を除外することができない（図２７［Ｆ〜Ｈ］）。
実施例１３：直接ＥＬＩＳＡを利用する抗ＰリッチドメインＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体の結合親和性及び結合選択性の特徴づけ並びにＥＣ５０
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、直接ＥＬＩＳＡ及びＥＣ５０決定を実施例６（上掲）で記載されるように行った。
ＮＩ−３０２．６３Ｆ３は、凝集型ＨＴＴエクソン１のＨＤ４９を含む４つすべての種に対して類似する大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がおよそ２００ｐＭ〜４００ｐＭであることが示され得る（図７Ａ及び図７Ｂ）。したがって、ヒト由来のＨＴＴ抗Ｐリッチドメイン抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３は、ＨＴＴエクソン１タンパク質の非切断のより線状の構造におけるのと同様に、ＨＴＴエクソン１タンパク質の凝集した構造において露出するエピトープをサブナノモル濃度範囲での大きい親和性により標的とする。
加えて、２１回、３５回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の結合を特徴づけることを、インキュベーションが１μｇ／ｍｌのＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体により行われたという小さい改変とともに実施例７（上掲）で記載されるようなフィルター遅延アッセイ及びドットブロットを使用して行った。
ドットブロットでは、抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３により、伸長したポリＱ域を有するＨＤ４９タンパク質が最も顕著に検出された（図７Ｃ、左側）。フィルター遅延分析では、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３により、０．２μｍの細孔サイズのメンブランに保持されるＨＤ３５凝集物及びＨＤ４９凝集物が検出された（図７Ｃ、右側）。スポットされたタンパク質調製物に基づくこれらの知見により、抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３は、病原的なポリＱ伸長を有する凝集型ＨＴＴ立体配座体を認識することが明らかにされる。
そのうえ、無関係な凝集性タンパク質標的に対するＮＩ−３０２．６３Ｆ３組換え抗体の結合を明らかにするために、直接ＥＬＩＳＡを実施例８（上掲）で記載されるように行った。図１６Ｂに示されるように、ヒト由来ＮＩ−３０２．６３Ｆ３はＨＴＴに特異的に結合し、その一方で、無関係なタンパク質に対する結合は示すことができなかった。
実施例１４：ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の結合エピトープの評価
ＮＩ−３０２．６３Ｆ３ヒト由来抗体によって認識されるハンチンチンエピトープをマッピングするために、合成ペプチドを用いるエピトープマッピングを上記において実施例９で記載されるように行った。
図８に示されるように、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の顕著な結合がペプチド番号１０及び１１に対して認められ、弱いシグナルがペプチド８及び９に関して認められた。このことは、この抗体によって認識されるエピトープがＨＴＴの（ポリＰ反復領域間の）Ｐリッチドメインに限定されることを示している。したがって、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３結合エピトープは、ＨＴＴアミノ酸配列４３−（ＰＰＰＱＬ）ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ−５７（配列番号１６１及び配列番号１４０）の内部に限定されることが予測された。
実施例１５：ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の、異なるエクソン１ペプチドに対する直接的ＥＬＩＳＡ結合によるエピトープマッピング
ハンチンチンエクソン１のＢＳＡカップリングされたペプチドフラグメントに対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、ＢＳＡカップリングされたＨｔｔエクソン１ドメインペプチドを用いた直接ＥＬＩＳＡと、ＥＣ５０決定とを実施例１０で記載されるように行った。
図９に示されるように、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３は、全長型のＧＳＴ−ＨＤ４９に対するのと同様に、ＢＳＡカップリングされたＰリッチドメインペプチドに対して大きい親和性で結合し、２００ｐＭ〜３００ｐＭの類似するＥＣ５０を有する。このことから、実施例１４で示されるようなＰリッチドメイン配列に対するエピトープマッピングが確認される。
実施例１６：組換えヒトＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗Ｐリッチドメイン抗体の純度及び完全性の評価
組換えヒトＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗プロリンリッチドメイン抗体の純度及び完全性を評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、実施例１１（上掲）で既に記載されるように行った。
組換えヒトＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗Ｐリッチドメイン抗体の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体の重鎖及び軽鎖に対応する２つの主要なバンドが、予想されたサイズにおいて明らかにされた。有意な混入物又はタンパク質分解生成物は、図１０に示されるように何ら検出されなかった。
実施例１７：ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスにおけるＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３の特徴づけ
ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスの脳組織におけるＨＴＴ病理に対するＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗Ｐリッチドメイン抗体の結合の評価を、切片のインキュベーションが１ｎＭ又は５０ｎＭの抗Ｐリッチドメイン抗体により行われたという違いを伴って実施例１２（上掲）で記載されるように評価した。
図２８［Ｅ〜Ｆ］に示されるように、ヒト由来のＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗Ｐリッチドメイン抗体により、ニューロンの核内封入体病理の顕著かつ非常に特異的な染色が、ＥＬＩＳＡ及びドットブロット分析によって明らかにされるようなＨＴＴ凝集物に対する高親和性の結合と一致してＲ６／１遺伝子導入動物の線条体及び皮質において１ｎＭ及び５０ｎＭの濃度で明らかにされた。しかしながら、図２８［Ｆ］に示されるように、５０ｎＭの濃度で、抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３によりさらに、中間の棘状ニューロンの核全体が弱く染色された。
実施例１８：直接ＥＬＩＳＡを利用する抗Ｃ末端ドメイン抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０の結合親和性及び結合選択性の特徴づけ並びにＥＣ５０
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体のＮＩ−３０２．３５Ｃ１及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、直接ＥＬＩＳＡ及びＥＣ５０決定を実施例６（上掲）で記載されるように行った。
ＮＩ−３０２．３５Ｃ１は、凝集型ＨＴＴエクソン１のＨＤ４９を含む４つすべての種に対して大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がおよそ２．７ｎＭであることが示され得る（図１１Ａ及び図１１Ｂを参照のこと）。
同様に、ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０は４つすべての種に結合し、それにもかかわらず、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１とは異なる親和性を有する（凝集型ＨＤ２１＞＞ＧＳＴ−ＨＤ２１＞＞凝集型ＨＤ４９＞＞ＧＳＴ−ＨＤ４９）（図３１Ｃ）。このことは、両方の抗体によって認識されるエピトープが異なることにより説明されるかもしれない（図２０）。
したがって、ヒト由来のＨＴＴ抗Ｃ末端ドメイン抗体であるＮＩ−３０２．３５Ｃ１及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０は、ＨＴＴの可溶性形態におけるのと同様に、ＨＴＴの凝集型形態において露出するエピトープを低いナノモル濃度の親和性により標的とする。
加えて、２１回、３５回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体のＮＩ−３０２．３５Ｃ１及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０の結合を特徴づけるために、実施例７（上掲）で記載されるようなフィルター遅延アッセイ及びドットブロットを行った。
ドットブロットでは、抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１により、伸長したポリＱ域を有するＨＴＴの様々な構築物が優先的に検出された（ＨＤ４９＞ＨＤ３５＞＞ＨＤ２１；図１１Ｃ、左側）。そのうえ、シグナル強度が、ＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集反応液のインキュベーション時間の増大とともに増大する。同様に、抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０により、伸長したポリＱ域を有するＨＴＴの様々な構築物が検出され、それにもかかわらず、異なる優先傾向を有していた（ＨＤ３５＞＞ＨＤ４９＞ＨＤ２１）。これに対して、シグナル強度が、ＨＤ３５のみの凝集反応液のインキュベーション時間の増大とともに増大する（図３２Ｃ）。
フィルター遅延分析では、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１により、０．２μｍの細孔サイズのメンブランに保持されるＨＤ３５凝集物及びＨＤ４９凝集物が検出され（図１１Ｃ、右側）、これに対して、ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０により、ＨＤ３５凝集物のみが検出された（図３２Ｃ、右側）。メンブランに結合したタンパク質調製物に基づくこれらの知見により、抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１及び抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０は、病原的なポリＱ伸長を有する凝集型ＨＴＴ立体配座体を優先的に標的とすることが示唆された。
そのうえ、無関係な凝集性タンパク質標的に対するＮＩ−３０２．３５Ｃ１及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０の組換え抗体の結合を明らかにするために、直接ＥＬＩＳＡを実施例８（上掲）で記載されるように行った。図１６Ｃに示されるように、ヒト由来ＮＩ−３０２．３５Ｃ１と、図３３Ｃに示されるように、ヒト由来ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０とはＨＴＴに特異的に結合し、その一方で、無関係なタンパク質に対する結合は示すことができなかった。
実施例１９：ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の結合エピトープの評価
ＮＩ−３０２．３５Ｃ１ヒト由来抗体によって認識されるハンチンチンエピトープをマッピングするために、合成ペプチドを用いるエピトープマッピングを上記において実施例９で記載されるように行った。
重複するペプチドのスキャンによるＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗体結合エピトープの決定では、特異的なシグナルがもたらされなかった。したがって、この抗体を、他のＨＴＴ ＮＩ−３０２抗体について行われた方法で処理した場合、理由は不明であるが、個々のペプチドに対する特異的なシグナルが何らもたらされなかった。エピトープが、ＢＳＡにカップリングすることによってＣ末端ペプチドに首尾よくマッピングされた；実施例２０もまた参照のこと。
実施例２０：Ｃ末端ドメインＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の、異なるエクソン１ペプチドに対する直接的ＥＬＩＳＡ結合によるエピトープマッピング
ＨＴＴエクソン１のＢＳＡカップリングされたペプチドフラグメントに対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、ＢＳＡカップリングされたＨｔｔエクソン１ドメインペプチドを用いた直接ＥＬＩＳＡと、ＥＣ５０決定とを実施例１０で記載されるように行った。
図１２に示されるように、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１は、ＢＳＡカップリングされたＣ末端ペプチドに対して、全長型のＧＳＴ−ＨＤ４９に対するのと同様に、大きい親和性で結合し、ＥＣ５０値がそれぞれ、およそ０．７ｎＭ及び３．２ｎＭである。このことから、エピトープがＨＴＴエクソン１配列（７１−ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ−８５、配列番号９６）のＣ末端領域に位置付けられる。同じＣ末端ペプチドがプレートに直接被覆されたならば、弱い結合のみが認められた（ＥＣ５０＞１００ｎＭ、データは示されず）。このことは、ＢＳＡにカップリングされたペプチドの提示がエピトープに対する結合を増大させ、そして、実施例２０で示されるようなペプチド走査分析によるエピトープマッピングがなぜ機能しなかったかの説明であるかもしれないことを示唆する。
実施例２１：組換えヒトＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗Ｐリッチドメイン抗体の純度及び完全性の評価
組換えヒトＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗Ｃ末端ドメイン抗体の純度及び完全性を評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、実施例１１（上掲）で既に記載されるように行った。
組換えヒトＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗Ｃ末端ドメイン抗体の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体の重鎖及び軽鎖に対応する２つの主要なバンドが、予想されたサイズにおいて明らかにされ、その一方で、有意な混入物又はタンパク質分解生成物は何ら検出されなかった（図１３）。
実施例２２：ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスにおけるＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の特徴づけ
ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスの脳組織におけるＨＴＴ病理に対するＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗Ｃ末端ドメイン抗体の結合の評価を、切片のインキュベーションが５ｎＭ又は５０ｎＭの抗Ｃ末端ドメイン抗体により行われたという違いを伴って実施例１２（上掲）で記載されるように評価した。
図２９［Ｅ〜Ｆ］に示されるように、ヒト由来のＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗Ｃ末端ドメイン抗体により、ニューロンの核内封入体病理の顕著な染色が、ＥＬＩＳＡ分析及びドットブロット分析によって明らかにされるようなＨＴＴ凝集物に対する高親和性の結合と一致してＲ６／１遺伝子導入動物の線条体において５ｎＭ及び５０ｎＭの濃度で明らかにされた。
実施例２３：海馬薄片培養物における棘密度に対する、ＨＴＴを標的とするヒト由来抗体の影響の評価
抗体の発現及び精製
ＨＴＴエクソン１における異なったドメインを標的とするヒト由来抗体をＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、ＡｋｔａシステムでのプロテインＡ親和性精製によって精製した。ＰＤ−１０カラムでの脱塩の後、抗体をＰＢＳにおいて配合した。エンドトキシンレベルが１０ＥＵ／ｍｌ未満であることが確認された。
海馬薄片培養
器官型海馬薄片培養物を、Ｓｔｏｐｐｉｎｉ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（１９９１）、３７（２）：１７３〜８２に従って調製し、培養した。要約すると、６日齢〜８日齢のＢ６ＣＢＡ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６２Ｇｐｂ／１Ｊ遺伝子導入型及び遺伝子非導入型の同腹子を断頭し、脳を取り出し、両方の海馬を単離し、４００μｍの厚さの薄片に切断した。この方法により、１層〜４層の細胞層の厚さのままであり、かつ、十分に保存された器官型構成によって特徴づけられる薄い薄片が得られる。薄片を、１ｍｌの培養培地（ＨＥＰＥＳ改変による４６％最小必須培地Ｅａｇｌｅ、Ｅａｒｌｅの改変による２５％基本培地、２５％熱不活化ウマ血清、２ｍＭグルタミン、０．６％グルコース、ｐＨ７．２）を含有する６ウエルプレートにおいてＭｉｌｌｉｃｅｌｌ培養プレート挿入物（０．４μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上で培養した。培養プレートを、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気において３７℃で保った。薄片を実験前の７日間培養で保った。培養培地を２日毎又は３日毎に交換した。７日目に、抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。１０日目に、インビトロ薄片培養物に、液滴法（Ｓｈａｈａｎｉ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３１（２００６）、６１０３〜６１１４）を使用してシンドビスウイルスを感染させた。棘分析のために、培養物を感染後４日目（インビトロでの１４日）に固定処理した。薄片を、海馬の構造を保つために培養プレートメンブランに付着させたままにし、ＰＢＳによりすすいだ。その後、薄片を、４％スクロースを含有するＰＢＳにおける４％パラホルムアルデヒドにより４℃で２時間、固定処理した。それぞれの樹状突起について、写真を撮影し、棘を３０μｍ〜４５μｍの長さにわたって分析した。合計で１２匹の遺伝子導入動物から得られる群あたり８個〜１３個の薄片をそれぞれの抗体処理について定量化した。データは平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５（ＭＷＵ）、＃ ｐ＝０．０５。
Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６２Ｇｐｂ／１Ｊ遺伝子導入マウスの海馬薄片培養物における樹状突起棘密度の定量化（図１７Ｂ、図１７Ｄ）により、５３％の有意な低下が、生後６日の動物の海馬薄片を使用する遺伝子非導入の同腹子（図１７Ａ、図１７Ｃ、図１７Ｅ）と比較して、上記の実験設計によるインビトロでの１４日後において明らかにされた。ヒト由来のＮＩ−３０２抗体を７日間、１０μｇ／ｍｌの濃度で加えたとき、棘密度喪失の有意な減弱が抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１（図１７Ｆ、ｐ＜０．０５、ｔ検定）及び抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３（ｐ＝０．０５、ｔ検定）については認められ、これに対して、抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１及び抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１は、試験された条件のもとでは明確な影響を示さなかった。
Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６２Ｇｐｂ／１Ｊ遺伝子導入マウスの海馬薄片培養物において示される、遺伝子非導入の同腹子と比較しての棘密度の有意な低下により、これは、ＨＴＴ候補抗体を、ＨＴＴ毒性を妨げることに対するその活性についてインビトロ試験するための好適なモデルであるという示唆がもたらされた。このモデルでは、ＨＴＴエクソン１の内部のＰリッチドメインをともに標的とする抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３及び抗体ＮＩ−３０２．１１Ｆ１１は、アイソタイプコントロール抗体と比較して、棘密度を改善することができた。このことは、これらの抗体は、病理学的なポリＱ伸長ＨＴＴの発現によってもたらされる棘密度に対する毒性影響を弱めることができることを示唆する。
実施例２４：Ｒ６／１動物モデルの脳におけるＮＩ−３０２抗体の浸透
本発明の抗ＨＴＴ抗体の浸透を試験するために、遺伝子導入マウスモデルを利用した。具体的には、Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入マウスは、ハンチントン病（ＨＤ）患者に由来するファージゲノムクローンから単離され、かつ、ヒトハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子の５’末端を含有する１．９ｋｂの導入遺伝子を有する。この導入遺伝子は、およそ１ｋｂの５’ＵＴＲ配列と、エクソン１（約１３０単位の伸長したＣＡＧ反復を有する）と、イントロン１の最初の２６２ｂｐとから構成された。この構築物を単一細胞ＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６胚に顕微注入した。オスの創始体Ｒ６をＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６のメスと交配し、これにより、いくつかの創始体系統を作製した。創始体系統Ｒ６／１に由来するマウスは、導入遺伝子が、遍在的に発現するただ１コピーの無傷なコピー体として組み込まれている。混合されたＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６遺伝子背景での遺伝子導入マウスを、コンジェニック系統Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊを作製するために１２回を超えてＣ５７ＢＬ／６Ｊと戻し交配した。
Ｒ６／１遺伝子導入マウスは、舞踏病様運動、不随意的な常同性運動、振戦及びてんかん発作、同様にまた、非運動障害成分（異常な発声を含む）を含めてＨＤの特徴の多くを模倣する進行性の神経学的表現型を示す。このマウスは疾患の経過を通して頻繁に排尿し、かつ、体重及び筋肉量の喪失を示す。神経学的には、このマウスは、ＨＴＴタンパク質及びユビキチンタンパク質の両方を含有するニューロンの核内封入体（ＮＩＩ）を発達させる。これらのＮＩＩはまた、ヒトＨＤ患者でも特定されている。ＨＤ症状の発症（週）齢が、この６／１系統については１５週〜２１週の間で生じることが報告される。
この研究動物は下記の性質を示し、古典的な耳標識法によって特定された：
系統：ヘミ接合性Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ他、Ｃｅｌｌ、８７（１９９６）、４９３〜５０６）
供給元：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍａｉｎｅ、米国）
性別：オス及びメス
日齢開始：２３０日〜２６０日
コホート：ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１ 合計：３匹のオス
ＮＩ−３０２．３５Ｃ１ 合計：３匹のオス
ビヒクル 合計：３匹のオス
脊髄のホモジネート化のために、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入マウスを深く麻酔し、蠕動ポンプによって左心室から冷リン酸塩緩衝化生理的食塩水により経心的に灌流した。脳を切開し、ドライアイスで急速凍結した。組織サンプルを、ハンドソニケーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｌａｂｓｏｎｉｃ Ｍ）を用いて１：１０（ｗ／ｖ）のＤＥＡ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ ＤＥＡ、プロテアーゼ阻害剤コンプリート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））においてホモジネートした。サンプルを４℃において１０００００ｘｇで３０分間遠心分離し、上清の小分け物を分析前に−８０℃で貯蔵した。
下記のヒトＩｇＧ薬物レベルサンドイッチＥＬＩＳＡでは、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１、ＮＩ−３０２．１１Ｆ１１のヒト抗体の血漿中レベルを、標準物としての既知濃度の対応する組換え抗体を使用して求めた。９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を５０ｍＭ炭酸塩被覆緩衝液（ｐＨ９．６）において１μｇ／ｍｌでのロバ抗ヒトＩｇＧ（７０９−００５−１４９、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）により被覆した。非特異的結合部位を、ＲＴで１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。血漿サンプルを１：２０，０００及び１：１００，０００で希釈し、脳ホモジネートを１：５及び１：５０で希釈し、両方を標準的な希釈曲線と一緒にＲＴで１時間インキュベーションした。結合を、検出抗体の抗ヒトＨＲＰ（７０９−０３６−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して明らかにし、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行った。血漿サンプル及び脊髄サンプルの濃度を個々の標準曲線に基づいて計算した。表６−１に示される値は２回の独立したＥＬＩＳＡ実験の平均値である。
血漿サンプル及び脳サンプルを、Ｒ６／１遺伝子導入マウスにおける５０ｍｇ／ｋｇの抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の単回腹腔内注入の２日後に得た。血漿及び脳ホモジネートにおける抗体レベルを、ヒトサンドイッチＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって求めた（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。脳対血漿の薬物レベルの比が、ヒト由来抗体のＮＩ−３０２．３１Ｆ１１及びＮＩ−３０２．３５Ｃ１について０．１３±０．０２％及び０．２１±０．０６％であるとそれぞれ求められた。これらの結果から、試験されたＮＩ−３０２抗体の４８時間脳浸透がＨＴＴ遺伝子導入マウスにおいて予想範囲にあることが示唆される。
実施例２５：本発明に従って特定されるさらなる抗体の結合親和性及び結合特異性の特徴づけ
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対するさらなる特定された組換えヒト由来ＨＴＴ抗体の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、種々の調製物が５μｇ／ｍｌの濃度で被覆される直接ＥＬＩＳＡと、ＥＣ５０決定とを実施例６（上掲）で記載されるように行った。
異なるＨＴＴ種についての決定されたＥＣ５０が、図１９、同様にまた、図３１（Ａ、Ｄ〜Ｆ）に示され、図２０にまとめられる。ほとんどのヒト由来抗体が、サブナノモル濃度又は低ナノモル濃度のＥＣ５０で大きい親和性により結合した。いくつかの候補物（例えば、ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、ＮＩ−３０２．１１Ａ４、ＮＩ−３０２．２２Ｈ９又はＮＩ−３０２．６４Ｅ５など）は、切断されなかったＧＳＴ−ＨＴＴタンパク質に対する優先した結合を有するようであり、他の抗体（例えば、ＮＩ−３０２．７４Ｃ１１、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、ＮＩ−３０２．４Ａ６、ＮＩ−３０２．１２Ｈ２又はＮＩ−３０２．８Ｍ１など）は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、すべてのＨＴＴ調製物に対する、類似するＥＣ５０値による大きい親和性結合を示した。ＮＩ−３０２．１５Ｆ９はＨＤ２１に対するＨＤ４９の約５倍の優先を示し、ＥＣ５０値が５ｎＭ〜３５ｎＭの範囲にあった。抗体３３Ｃ１１がこの実験ではコントロールとして役立った（図３２Ｇ）。
したがって、一群の高親和性の組換えＨＴＴ特異的なヒト抗体が、健康な高齢者ヒトドナーコホートに由来するメモリーＢ細胞からクローン化され、組換え発現され、特徴づけられた。加えて、さらなる予備用抗体のためのスクリーニング活動が、異なる長さのＣＡＧ反復伸長を有するハンチントン病（ＨＤ）の選択された前駆症状患者のコホートにおいて開始された。
２１回、３５回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する、特定された組換えヒト由来ＨＴＴ ＮＩ−３０２抗体の結合をさらに特徴づけるために、０．２μｇ／ｍｌの一次抗体を利用するフィルター遅延アッセイと、１μｇ／ｍｌの一次抗体を利用するドットブロット分析とを実施例７（上掲）で記載されるように行った。
図２１及び図３２（Ａ、Ｇ）に示されるように、ドットブロット（図の左側、ドットブロット）では、特徴づけられた抗体のほとんどが、伸長したポリＱ域を有するＨＴＴタンパク質の検出についての優先傾向を示した（ＨＤ４９＞＞ＨＤ３５＞ＨＤ２１）。そのうえ、シグナル強度が、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６（図２１、ブロットの第１列）及びＮＩ−３０２．６４Ｅ５（図３２Ａ、左側）の抗体については特に、ＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集反応液のインキュベーション時間の増大とともに増大した。フィルター遅延分析において、ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、ＮＩ−３０２．７１Ｆ６（図２１、右側、ＦＲＡ）及びＮＩ−３０２．６４Ｅ５（図３２Ａ、右側）により、０．２μｍの細孔サイズのメンブランに保持されるＳＤＳ安定なＨＤ３５凝集物及びＨＤ４９凝集物が検出され、これに対して、他の抗体、例えば、ＮＩ−３０２．４４Ｄ７及びＮＩ−３０２．３７Ｃ１２（図２１、ブロットの第２列）、又は、ＮＩ−３０２．４Ａ６、ＮＩ−３０２．１２Ｈ２及びＮＩ−３０２．８Ｍ１（図３２Ｄ、図３２Ｅ、図３２Ｆ）は、フィルター上の凝集物に結合しなかった。抗体３３Ｃ１１がこの実験ではコントロールとして役立った（図３２Ｇ）。スポットされたタンパク質調製物に基づくこれらの知見により、クローン化されたＮＩ−３０２抗体のいくつかは、病原的なポリＱ伸長を有する凝集型ＨＴＴ立体配座体についての優先傾向を示すことが示唆される。
加えて、特定された抗体の、無関係なタンパク質に対する結合特異性、具体的には凝集物を形成するタンパク質に対する結合特異性を、実施例８（上掲）で既に記載されるような直接ＥＬＩＳＡによって評価した（図２２及び図３３Ａ、図３３Ｄ〜図３３Ｆ）。結果は、試験されたヒト由来ＮＩ−３０２抗体のほとんどがＨＴＴに特異的に結合し、試験された他の無関係なタンパク質に対する結合は認められないことを示した。
実施例２６：ヒト由来ＨＴＴ抗体の結合及びエピトープマッピングの評価
新たに特定されたヒト由来抗体によって認識されるＨＴＴエピトープをマッピングするために、合成ペプチドを用いるエピトープマッピングを上記において実施例９で記載されるように行った（図２３及び図３５Ａ、図３５Ｄ〜図３５Ｆ）。加えて、ＨＴＴエクソン１のＢＳＡカップリングされたペプチドフラグメントに対するＨＴＴ抗体の、ＢＳＡカップリングされたＨｔｔエクソン１ドメインペプチドを用いた直接ＥＬＩＳＡによる最大半有効濃度（ＥＣ５０）を実施例１０で記載されるように求め、同様にまた、ＥＣ５０決定を行った。
実施例２７：ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスにおけるＨＴＴ抗体の結合の評価
ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスの脳組織におけるＨＴＴ病理に対する、特定された抗体の結合の特徴づけを、切片のインキュベーションが抗ＨＴＴ抗体の５ｎＭのｆｆｉｇ．３Ｍ（７４Ｃ１１、３９Ｃ１２、１１Ａ４、２２Ｈ９、７８Ｈ１２、３７Ｃ１２、７Ｄ８、７２Ｆ１０）又は５０ｎＭの濃度（１５Ｆ９、７１Ｆ６、５５Ｄ８、４４Ｄ７、７Ａ８、６４Ｅ５）により行われたという違いを伴って実施例１２（上掲）で記載されるように評価した。図２４に示されるように、これらの特定されたヒト由来抗ＨＴＴ抗体により、Ｒ６／１遺伝子導入動物の線条体及び皮質におけるニューロンの核内封入体病理の顕著かつ非常に特異的な染色が明らかにされ、このことは、上記で記載される抗体、すなわち、ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、ＮＩ−３０２．６３Ｆ３及びＮＩ−３０２．３５Ｃ１についてもまた示される通りであった。これらの発見は、実施例２６におけるＥＬＩＳＡ及びドットブロット分析によって明らかにされるようなＨＴＴ凝集物に対する高親和性の結合と一致している。
実施例２８：ハンチントン病（ＨＤ）の遺伝子導入マウスモデルＲ６／１の基本的特徴づけ
Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入マウスは、ＨＤ患者に由来するファージゲノムクローンから単離され、かつ、ヒトハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子の５’末端を含有する１．９ｋｂの導入遺伝子を有する。この導入遺伝子は、およそ１ｋｂの５’ＵＴＲ配列と、エクソン１（約１３０単位の伸長したＣＡＧ反復を有する）と、イントロン１の最初の２６２ｂｐとから構成された。この構築物を単一細胞ＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６胚に顕微注入した。オスの創始体Ｒ６をＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６のメスと交配し、これにより、いくつかの創始体系統を作製した（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ他、Ｃｅｌｌ ８７（１９９６）、４９３〜５０６）。創始体系統Ｒ６／１に由来するマウスは、導入遺伝子が、遍在的に発現するただ１コピーの無傷なコピー体として組み込まれている。混合されたＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６遺伝子背景での遺伝子導入マウスを、コンジェニック系統Ｂ６．Ｃｇ−ＴＧ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊを作製するために１２回を超えてＣ５７ＢＬ／６Ｊと戻し交配した。Ｒ６／１遺伝子導入マウスは、舞踏病様運動、不随意的な常同性運動、振戦及びてんかん発作、同様にまた、非運動障害成分（異常な発声を含む）を含めてＨＤの特徴の多くを模倣する進行性の神経学的表現型を示す。このマウスは疾患の経過を通して頻繁に排尿し、かつ、体重及び筋肉量の喪失を示す。神経学的には、このマウスは、ＨＴＴタンパク質及びユビキチンタンパク質の両方を含有するニューロンの核内封入体（ＮＩＩ）を発達させる。これらのＮＩＩはまた、ヒトＨＤ患者でも特定されている。ＨＤ症状の発症（週）齢が、この６／１系統については１５週〜２１週の間で生じることが報告されている（Ｎａｖｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２２（２００３）、１０４９〜１０５７；Ｈｏｄｇｅｓ他、Ｇｅｎｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．７（３）（２００８）、２８８〜２９９）。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるＲ６／１遺伝子導入マウスを増やし、図２５に示されるように、行動表現型、長期にわたる体重の発達、総脳重量、組織病理学分析及び生存に関して長期にわたって特徴づけした。得られた発見は全般的には、発表されたデータと一致しており、これらの発見により、このマウス系統が、凝集したＨＴＴを標的とするヒト由来ＮＩ−３０２抗体を用いる効力研究のための好適な前臨床モデルとして確認された。
実施例２９：ＨＤの遺伝子導入マウスモデルＮ１７１−８２Ｑの基本的特徴づけ
Ｂ６Ｃ３−Ｔｇ（ＨＤ８２Ｇｌｎ）８１Ｄｂｏ／Ｊ（Ｎ１７１−８２Ｑ）遺伝子導入マウス系統（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ他、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．８（３）（１９９９）、３９７〜４０７）は、ＨＤについての十分に特徴づけられているマウスモデルである。Ｂ６Ｃ３−Ｔｇ（ＨＤ８２Ｇｌｎ）８１Ｄｂｏ／Ｊ（Ｎ１７１−８２Ｑ）遺伝子導入マウスは、８２個のグルタミンをコードし、かつ、最初の１７１個のアミノ酸を含むＮ末端短縮型ヒトＨＴＴのｃＤＮＡを発現する。この変化したＨＴＴのｃＤＮＡはマウスプリオンタンパク質のプロモーターの制御下にある。発現が中枢神経系のニューロンにおいて認められる。この導入遺伝子を発現するマウスは、出生時から１〜２ヶ月までは正常であるようである。しかしながら、このマウスは体重を増やすことができず、振戦、運動低下及び協調不全を発症する。このマウスは、異常な歩行及び頻繁な後肢抱擁を示す。このマウスは平均余命が５〜６ヶ月である。ＨＴＴ抗体を使用する研究では、広汎な核標識化及び無数の免疫反応性核封入体が多数のニューロン集団において示された。加えて、神経突起損傷が明白であった。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるＮ１７１−８２Ｑ遺伝子導入マウスを増やし、行動表現型、長期にわたる体重の発達、末期での総脳重量、組織病理学分析及び生存に関して長期にわたって特徴づけした（図２６）。これらの発見は全般的には、発表されたデータと一致しており、これらの発見により、このマウス系統が、実施例２９で記載されるマウス系統に加えて、凝集したＨＴＴを標的とするヒト由来ＮＩ−３０２抗体を用いる効力研究のための好適な前臨床モデルとして確認された。
実施例３０：ハンチントン病（ＨＤ）患者におけるニューロン封入体染色の評価
本発明の特定された抗体によるニューロン封入体の染色を患者において評価するために、免疫組織化学分析を行った。ヒトの脳組織におけるＨＴＴ病理に対する、特定された抗体の結合の評価を、切片のインキュベーションが５０ｎＭのＮＩ−３０２．３３Ｃ１１抗体、５０ｎＭのＮＩ−３０２．６３Ｆ３抗体又は１００ｎＭのＮＩ−３０２．３５Ｃ１抗体により行われたという違いを伴って実施例１２（上掲）で記載されるように評価した。
図２７に示されるように、ポリＰ領域結合抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１を用いた免疫組織化学分析により、ハンチントン病患者の皮質ニューロンにおけるニューロン核内封入体の染色（図２７Ａ〜図２７Ｄ）が５０ｎＭで示され、また、２７０日齢の後期疾患段階のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおける染色が１ｎＭの濃度（Ｅ）及び５ｎＭの濃度（Ｆ）で示され、その一方で、染色が遺伝子非導入の同腹子では検出されず（Ｇ）、また、一次抗体が染色時に省かれたとき（Ｈ）、又は、非ハンチントン病コントロールの組織が５０ｎＭのＮＩ−３０２．３３Ｃ１１により染色された場合には検出されなかった。Ｐリッチドメイン抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３（図２８）及び抗Ｃ末端ドメイン抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１（図２９）は、５０ｎＭのＮＩ−３０２．６３Ｆ３又は１００ｎＭのＮＩ−３０２．３５Ｃ１による免疫組織化学分析の範囲内で、４名の異なるハンチントン病患者（Ａ〜Ｄ）のニューロン核内封入体の染色（Ａ〜Ｃ）及び皮質ニューロンのいくつかの神経突起の染色（Ｄ）を示した。染色はまた、２７０日齢の後期疾患段階のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおいて１ｎＭの濃度（Ｅ）及び５０ｎＭの濃度（Ｆ）で認められ得る。染色は、遺伝子非導入の同腹子では検出されず（Ｇ）、また、一次抗体が染色時に省かれた場合（Ｈ）、或いは、非ハンチントン病コントロールの組織が５０ｎＭのＮＩ−３０２．６３Ｆ３又は１００ｎＭのＮＩ−３０２．３５Ｃ１によりそれぞれ染色される場合には検出されなかった。
本発明の特異的な抗ＨＴＴ抗体とは対照的に、市販の抗ポリＱ抗体Ｍａｂ１５７４（１：２０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いた免疫組織化学分析では、組織のさらなる染色が示され、すなわち、４名の異なるハンチントン病患者のより全体的な核染色及び細胞質染色、並びに、皮質ニューロンのいくつかの神経突起の染色（図３０Ａ、図３０Ｄ）、そして、前駆症状の１５０日齢（図３０Ｅ）及び２７０日齢（図３０Ｆ）の後期疾患段階のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入動物の線条体ニューロンにおける染色が示された。
実施例３１：直接ＥＬＩＳＡを利用する抗ポリＱ／ＰドメインＮＩ−３０２．７Ｄ８抗体の結合親和性及び結合選択性の特徴づけ並びにＥＣ５０
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、直接ＥＬＩＳＡ及びＥＣ５０決定を実施例６（上掲）で記載されるように行った。
ＮＩ−３０２．７Ｄ８は、可溶性ＧＳＴ−ＨＤ２１及び凝集型ＨＤ２１に対して類似する大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がおよそ５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、それにもかかわらず、凝集型ＨＤ４９及び可溶性ＧＳＴ−ＨＤ４９の伸長したより病原的な形態に対する優先傾向を示し、ＥＣ５０がそれぞれ、１７ｎＭ及び６ｎＭであることが示され得る（図３１Ｂ）。
したがって、ヒト由来のＨＴＴ抗ポリＱ／Ｐドメイン抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８は、ＨＴＴエクソン１タンパク質の非切断のより線状の構造におけるのと同様に、ＨＴＴエクソン１タンパク質の凝集した構造において露出するエピトープを低いナノモル濃度範囲での大きい親和性により標的とする。
加えて、２１回、３５回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８の結合を特徴づけることを、実施例７（上掲）で記載されるように、１ｕｇ／ｍｌの濃度でのフィルター遅延アッセイ及びドットブロットを使用して行った。
ドットブロット（図３２Ｂ、左側）では、抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８により、伸長したポリＱ域を有するハンチンチンの様々なタンパク質が同等に良好に検出されること（ＨＤ４９＝ＨＤ３５＝ＨＤ２１）が示され得る。フィルター遅延分析（図３２Ｂ、右側、ＦＲＡ）では、ＮＩ−３０２．７Ｄ８は、フィルターメンブラン上のＳＤＳ安定なＨＤ２１凝集物、ＨＤ３５凝集物又はＨＤ４９凝集物に結合しなかった。
そのうえ、無関係な凝集性タンパク質標的に対するＮＩ−３０２．７Ｄ８組換え抗体の結合を明らかにするために、直接ＥＬＩＳＡを実施例８（上掲）で記載されるように行った。図３３Ｂに示されるように、ヒト由来ＮＩ−３０２．７Ｄ８はＨＴＴに特異的に結合し、その一方で、無関係なタンパク質に対する結合は示すことができなかった。
実施例３２：ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、ＮＩ−３０２．７Ｄ８及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０の各ＨＴＴ抗体の結合エピトープの評価
ＮＩ−３０２．６４Ｅ５、ＮＩ−３０２．７Ｄ８及びＮＩ−３０２．７２Ｆ１０の各ヒト由来抗体によって認識されるハンチンチンエピトープをマッピングするために、合成ペプチドを用いるエピトープマッピングを上記において実施例９で記載されるように行った。
図３５Ａは、ペプチド番号１０〜１２に対するＮＩ−３０２−６４Ｅ５の顕著な結合を示し、このことは、この抗体によって認識されるエピトープがハンチンチンのＰリッチ反復ドメインに限定されることを示している。したがって、ＮＩ−３０２．６４Ｅ５結合エピトープは、ＨＴＴアミノ酸４８−ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ−５８（配列番号２００）の内部に限定されることが予測される。図３５Ｂに示されるように、ＮＩ−３０２．７Ｄ８の顕著な結合がペプチド番号６〜８に対して認められた。このことは、この抗体によって認識されるエピトープがハンチンチンのポリＱ／ポリＰ反復ドメインに限定されることを示している。したがって、ＮＩ−３０２．７Ｄ８結合エピトープは、ＨＴＴアミノ酸２８−ＱＱＱＱＱＱＱＰＰＰ−３７（配列番号２０１）の内部に限定されることが予測される。対照的に、ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０の顕著な結合がペプチド番号１５及びペプチド番号１６に対して認められた。このことは、この抗体によって認識されるエピトープがＨＴＴのＮ末端ドメインに限定されることを示している（図３５Ｃ）。したがって、ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０結合エピトープは、ＨＴＴアミノ酸７０−ＰＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨ−８２（配列番号２０２）の内部に限定されることが予測された。
実施例３２：直接ＥＬＩＳＡを利用する抗Ｎ末端ドメイン抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８の結合親和性及び結合選択性の特徴づけ並びにＥＣ５０
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、直接ＥＬＩＳＡ及びＥＣ５０決定を実施例６（上掲）で記載されるように行った。
ＮＩ−３０２．１５Ｅ８は、より大きい親和性で、非凝集型のＧＳＴ−ＨＤ４９及びＧＳＴ−ＨＤ２１に結合し、より小さい親和性で、凝集型のＨＤ４９及びＨＤ２１に結合することが示され得る（図１４Ａ及び図１４Ｂを参照のこと）。したがって、ヒト由来のＨＴＴ抗Ｎ末端ドメイン抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８は、ＨＴＴの可溶性形態におけるのと同様に、ＨＴＴの両方の凝集型形態において露出するエピトープを標的とし、それにもかかわらず、より大きい親和性をＨＴＴの可溶性形態に対して有する。
実施例３３：ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８の、異なるエクソン１ペプチドに対する直接的ＥＬＩＳＡ結合によるエピトープマッピング
ハンチンチンエクソン１のＢＳＡカップリングされたペプチドフラグメントに対する組換えヒト由来ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、ＢＳＡカップリングされたＨｔｔエクソン１ドメインペプチドを用いた直接ＥＬＩＳＡと、ＥＣ５０決定とを実施例１０で記載されるように行った。
図１５に示されるように、ＮＩ−３０２．１５Ｅ８は、Ｎ末端における最初の１９個のＢＳＡカップリングされたアミノ酸に対して、全長型のＧＳＴ−ＨＤ４９に対するのと同様に、大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がそれぞれ、およそ０．１又は１５である。
実施例３４：ヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスにおける行動障害に対するＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１の影響
不安様行動をヒトＨＴＴマウスにおいて測定するための高架式十字迷路試験と、運動成績及び運動協調をヒトＨＴＴマウスにおいて測定するためのポール試験とを、抗ＨＴＴ抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１をインビボで調べるために行った。
群及び処置
行動分析のために、実施例１２で記載されるような、ｎ＝２４（１２／１２ オス／メス）のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＤｅｘｏｎ１）６１Ｇｐｂ／Ｊ遺伝子導入（ｔｇ）マウスによる２群のマウスと、１群の野生型（ｗｔ）マウスとを使用した。遺伝子導入マウスの群は、３０ｍｇ／ｋｇのマウスキメラＮＩ−３０２．３５Ｃ１又はビヒクルのどちらかの腹腔内処置を６週齢〜７週齢から始まって、７月齢〜９月齢の間でのマウスの末期段階の表現型まで受け、野生型マウスには、同じ体積のビヒクルが注入された。高架式十字迷路試験及びポール試験での行動試験を１６週齢及び１８週齢でそれぞれ行った。
高架式十字迷路試験
高架式十字迷路試験を、Ｎａｖｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２２（２００３）、１０４９〜１０５７に従って行った。迷路が床から５０ｃｍ上げられた。４つの迷路アーム（３０ｃｍ×５ｃｍ）が、十字路を形成する中央のプラットホームから生じていた。互いに向き合って位置するアームの２つが１５ｃｍの高さの壁によって囲まれ（有壁路）、一方、それら以外のアームはどのような種類の遮蔽もなかった（無壁路）。試験を動物の暗期の開始時に行い、無壁路での照度が４０ｌｕｘの範囲であった。それぞれのマウスを無壁路に向けて十字迷路の中心に置いた。実験を５分間にわたって継続し、ビデオ追跡システム（ＶｉｄｅｏＭｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により記録した。試験期間と試験期間との間で、迷路を水ですすぎ、ペーパータオルで乾燥させた。続いて、無壁路及び有壁路に進入した回数、同様にまた、無壁区画及び有壁区画で過ごした時間を評価した。進入を、４つの足のすべてが１つのアームにあるとして定義した。無壁路への進入回数及び無壁路で過ごした時間が、マウスにおける開放空間誘発不安の指標として使用される。
ポール試験
ポール試験が、脳幹神経節に関連した運動障害をマウスにおいて評価するために広く使用されている；例えば、Ｍａｔｓｕｕｒａ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７３（１９９７）、４５〜４８；Ｓｅｄｅｌｉｓ他、Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１２５（２００１）、１０９〜１２５；Ｆｅｒｎａｇｕｔ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１６（２００３）、１１２３〜１１３０を参照のこと。簡単に記載すると、動物を、長さが５０ｃｍの（直径が１ｃｍである）垂直な木製ポールの上部に頭を上向きにして置いた。ポールの基部がホームケージに置かれた。ポールに置かれたとき、動物は身体を下向きにし、ポールの長さを降りて、そのホームケージに戻る。試験当日に、動物は３回の試行を受け、降りるための総時間（ｔ−合計）を測定した。試験日の３回目の試行の結果が図２４Ｂに示される。
図３４Ａに示されるように、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１処置のＲ６／１動物は、ビヒクル処置のＲ６／１動物と比較して、より少ない時間を無壁路で過ごし、より少ない頻度で無壁路に進入し、かつ、無壁路での無防備な覗き込みがより少なかった。したがって、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１処置のＲ６／１マウスは、遺伝子非導入の同腹子と比較して、より不安な表現型を示した。そのうえ、図２４Ｂに示されるように、ＮＩ−３０２．３５Ｃ１処置のＲ６／１動物は、遺伝子非導入の動物と類似するレベルに達するビヒクル処置のＲ６／１動物と比較して、改善された成績をポール試験において示した。まとめると、本発明の抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１は、行動成績及び運動関連課題に対する有益な影響をヒトＨＴＴ遺伝子導入マウスにおいて有する。
実施例３５：ＨＴＴ抗体の配列アラインメント
パーセント同一性又はパーセント類似性の決定を、本発明の「定義」の節で記載されるようなＢＬＡＳＴｎプログラムの標準的なパラメーターにより行った。図３６に示されるように、本発明のすべての抗体がＣＤＲにおいてチロシンに富む。
実施例３６：二重特異性抗ＨＴＴ抗体の作製
二重特異性抗体の作製をＢｒｅｎｎａｎ（上掲を参照のこと）における一般的な記載の通りに行うことができる。二重特異性抗体を製造するための出発材料が、実施例で記載されるような、また、図２０にまとめられるようなＨＴＴエクソン１タンパク質のポリＰ領域、ポリＱ／ポリＰ領域、Ｐリッチ領域、Ｃ末端領域又はＮ末端領域のいずれかを認識する本発明の無傷なＩｇＧ抗ＨＴＴ抗体である。これらの抗体が、抗体のＦｃ部分を切断するために、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）において３７℃で３時間、ペプシンで処理される。反応が、ｐＨをＴｒｉｓ緩衝液により８に上げることによって停止させられる。続いて、溶液が５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）の混合物の等体積で増量され、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）と室温で２０時間インキュベーションされる。ＤＴＮＢ−ＴＮＢ混合物のモル比が、４０ｍＭのＤＴＮＢ溶液を１０ｍＭのＤＴＴ溶液と数分間インキュベーションすることによって確立される２０：３０である。２つの改変されたＦ（ａｂ’）フラグメントを０．１ｍＭのＤＴＴにより２５℃で１時間さらに還元した後、このようにして得られたＦ（ａｂ’）−ＴＮＢフラグメント及びＦ（ａｂ’）−ＳＨフラグメントが、二重特異性のＦ（ａｂ’）２フラグメントに対して２５℃で１時間ハイブリダイゼーションされる。二重特異性のＦ（ａｂ’）２フラグメントをゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム）により精製した。
実施例３７：直接ＥＬＩＳＡを利用する二重特異性抗ＨＴＴ抗体の結合親和性及び結合選択性の特徴づけ並びにＥＣ５０
２１回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する二重特異性ＨＴＴ抗体の最大半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、直接ＥＬＩＳＡ及びＥＣ５０決定が実施例６（上掲）で記載されるように行われる。二重特異性ＨＴＴ抗体は、凝集型のＨＴＴエクソン１ ＨＤ４９を含む４つすべての種に対して大きい親和性で結合し、低いナノモル濃度の親和性により、ＨＴＴの可溶性形態におけるのと同様に、ＨＴＴの凝集型形態において露出するそれらのそれぞれのエピトープを等しく標的とした。加えて、２１回、３５回又は４９回のポリＱ反復を有する可溶性及び凝集型のＨＴＴエクソン１タンパク質に対する二重特異性ＨＴＴ抗体の結合を特徴づけるために、実施例７（上掲）で記載されるようなフィルター遅延アッセイ及びドットブロットが行われる。ドットブロットでは、二重特異性ＨＴＴ抗体により、伸長したポリＱ域を有するＨＴＴの様々な構築物が優先的に検出される。そのうえ、シグナル強度が、ＨＤ３５及びＨＤ４９の凝集反応液のインキュベーション時間の増大とともに増大する。フィルター遅延分析では、二重特異性ＨＴＴ抗体により、０．２μｍの細孔サイズのメンブランに保持されるＨＤ３５凝集物及びＨＤ４９凝集物が検出される。ＨＴＴに対するそれらの二重特異性と、メンブランに結合したタンパク質調製物に関する個々の抗体の結合についての以前の知見とに基づいて、二重特異性ＨＴＴ抗体は、病原的なポリＱ伸長を有する凝集型ＨＴＴ立体配座体を優先的に標的とすることが予想される。そのうえ、無関係な凝集性タンパク質標的に対する二重特異性抗ＨＴＴ抗体の結合を明らかにするために、直接ＥＬＩＳＡが実施例８（上掲）で記載されるように行われる。この関連において、二重特異性抗ＨＴＴ抗体はＨＴＴに特異的に結合し、その一方で、無関係なタンパク質に対する結合は示されない場合がある。

Claims (23)

  1. 軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変ドメインと、定常ドメインとを含むヒト由来のモノクローナルな抗ハンチンチン（ＨＴＴ）抗体又はそのＨＴＴ結合性フラグメント、或いはそれらの合成又は生物工学誘導体。
  2. ＩｇＧタイプである、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記軽鎖がカッパ（κ）である、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. ＨＴＴ遺伝子のエクソン１のアミノ酸配列におけるエピトープ、好ましくは、ＨＴＴエクソン１のポリＰ領域、Ｐリッチ領域、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域、Ｑ／Ｐリッチ領域におけるエピトープ又は立体配座エピトープを認識する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 前記エピトープを含むペプチド及び／又はＨＴＴエクソン１の凝集型形態と結合することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 下記のエピトープと特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はそのＨＴＴ結合性フラグメント、或いはそれらの合成又は生物工学誘導体：
    （ｉ）アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６）、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６１）、アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰ（配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０）を含むポリＰ領域内のエピトープ；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号１４０）、アミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰ（配列番号１４１）、アミノ酸配列ＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＰＰＰＰ（配列番号１４２）又はアミノ酸配列ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号１４３）を含むＰリッチ領域内のエピトープ：
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ（配列番号１４５）又はアミノ酸ＰＰＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨ（配列番号２０２）を含む、ＨＴＴのエクソン１のＣ末端領域におけるエピトープ；
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱＱ（配列番号１４４）を含む、ＨＴＴのエクソン１のＮ末端領域におけるエピトープ；
    （ｖ）アミノ酸配列ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＰＰＰ（配列番号２０１）を含むＱ／Ｐリッチ領域内のエピトープ；或いは
    （ｖｉ）ＨＴＴエクソン１に由来する線状ペプチドには存在せず、しかし、凝集型の組換えＨＴＴエクソン１タンパク質のＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ２１（ＨＤ２１）及びＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ４９（ＨＤ４９）には存在する立体配座エピトープ。
  7. 下記の（ｉ）〜（ｖｉ）の抗体からなる群から選択される、請求項６に記載の抗体又はそのＨＴＴ結合性フラグメント、或いはそれらの合成又は生物工学誘導体：
    （ｉ）ＨＴＴのポリＰ領域を認識する抗体で、その可変領域において、
    （ａ）抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、抗体ＮＩ＿３０２．７４Ｃ１１、抗体ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、抗体ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、抗体ＮＩ−３０２．１１Ａ４、抗体ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、抗体ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、抗体ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、抗体ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、抗体ＮＩ−３０２．７Ａ８、抗体ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、抗体ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、抗体ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、抗体ＮＩ−３０２．３Ｄ８、抗体ＮＩ−３０２．１８Ａ１、抗体ＮＩ−３０２．８Ｆ１、抗体ＮＩ−３０２．５２Ｃ９、抗体ＮＩ−３０２．４６Ｃ９のいずれか１つのＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１Ａ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｈ、図１Ｌ、図１Ｍ、図１Ｎ、図１Ｏ、図１Ｐ、図１Ｑ、図１Ｒ、図１Ｓ、図１Ｔ、図１Ｕ、図１Ｖ、図１Ｗ、図１ＡＤ、図１ＡＪ、図１ＡＫ、図１ＡＬ、図１ＡＭ、図１ＡＮ又は図１ＡＯに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
    （ｉ）ＶＨ配列（配列番号１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９）、及び
    （ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１）；
    （ｂ）抗体ＮＩ−３０２．３３Ｃ１１、抗体ＮＩ＿３０２．７４Ｃ１１、抗体ＮＩ−３０２．１５Ｆ９、抗体ＮＩ−３０２．３９Ｇ１２、抗体ＮＩ−３０２．１１Ａ４、抗体ＮＩ−３０２．２２Ｈ９、抗体ＮＩ−３０２．４４Ｄ７、抗体ＮＩ−３０２．３７Ｃ１２、抗体ＮＩ−３０２．５５Ｄ８、抗体ＮＩ−３０２．７Ａ８、抗体ＮＩ−３０２．７８Ｈ１２、抗体ＮＩ−３０２．７１Ｆ６、抗体ＮＩ−３０２．１１Ｈ６、抗体ＮＩ−３０２．３Ｄ８、抗体ＮＩ−３０２．１８Ａ１、抗体ＮＩ−３０２．８Ｆ１、抗体ＮＩ−３０２．５２Ｃ９、抗体ＮＩ−３０２．４６Ｃ９のいずれか１つのＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列で、図１Ａ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｈ、図１Ｌ、図１Ｍ、図１Ｎ、図１Ｏ、図１Ｐ、図１Ｑ、図１Ｒ、図１Ｓ、図１Ｔ、図１Ｕ、図１Ｖ、図１Ｗ、図１ＡＤ、図１ＡＪ、図１ＡＫ、図１ＡＬ、図１ＡＭ、図１ＡＮ又は図１ＡＯに示されるようなアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
    （ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
    （ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含み、好ましくは、前記ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合性フラグメント
    を含む抗体；
    （ｉｉ）ＨＴＴのＰリッチ領域を認識する抗体で、その可変領域において、
    （ａ）抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ１１、抗体ＮＩ−３０２．２Ａ２、抗体ＮＩ−３０２．１５Ｄ３又は抗体ＮＩ−３０２．６４Ｅ５のいずれか１つのＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｘ、図１ＡＥ、図１ＡＧ、図１ＡＨ、図１ＡＱ、図１ＡＲ又は図１ＡＳに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
    （ｉ）ＶＨ配列（配列番号５、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１３５、配列番号１６４、配列番号１６６）、及び
    （ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号７、配列番号１５、配列番号１９、配列番号１３７、配列番号１６８）；
    （ｂ）抗体ＮＩ−３０２．６３Ｆ３、抗体ＮＩ−３０２．３１Ｆ３１、抗体ＮＩ−３０２．２Ａ２、抗体ＮＩ−３０２．１５Ｄ３又は抗体ＮＩ−３０２．６４Ｅ５のいずれか１つのＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列で、図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｘ、図１ＡＥ、図１ＡＧ、図１ＡＨ、図１ＡＱ、図１ＡＲ又は図１ＡＳに示されるようなアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
    （ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
    （ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含み、好ましくは、前記ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合性フラグメント
    を含む抗体；
    （ｉｉｉ）ＨＴＴエクソン１のＣ末端領域を認識する抗体で、その可変領域において、
    （ａ）抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１又は抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１Ｃ、図１Ｚ、図１ＡＦ又は図１ＡＴに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
    （ｉ）ＶＨ配列（配列番号９、配列番号１７６又は配列番号１７８）、及び
    （ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号１１、配列番号１８０又は配列番号１８２）；
    （ｂ）抗体ＮＩ−３０２．３５Ｃ１又は抗体ＮＩ−３０２．７２Ｆ１０のＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列で、図１Ｃ、図１Ｚ、図１ＡＦ又は図１ＡＴに示されるようなアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
    （ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
    （ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含み、好ましくは、前記ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合性フラグメント
    を含む抗体；
    （ｉｖ）ＨＴＴのＮ末端領域を認識する抗体で、その可変領域において、
    （ａ）抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１ＡＰに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
    （ｉ）ＶＨ配列（配列番号１３１）、及び
    （ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号１３３）；
    （ｂ）抗体ＮＩ−３０２．１５Ｅ８のＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列で、図１ＡＰに示されるようなアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
    （ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
    （ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含み、好ましくは、前記ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合性フラグメント
    を含む抗体；
    （ｖ）ＨＴＴのＱ／Ｐリッチ領域を認識する抗体で、その可変領域において、
    （ａ）抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１Ｙに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
    （ｉ）ＶＨ配列（配列番号１７２）、及び
    （ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号１７４）；
    （ｂ）抗体ＮＩ−３０２．７Ｄ８のＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列で、図１Ｙに示されるようなアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
    （ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
    （ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含み、好ましくは、前記ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合性フラグメント
    を含む抗体；並びに
    （ｖｉ）ＨＴＴエクソン１に由来する線状ペプチドには存在せず、しかし、凝集型の組換えＨＴＴエクソン１タンパク質のＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ２１（ＨＤ２１）及びＨｔｔＥｘｏｎ１Ｑ４９（ＨＤ４９）には存在する立体配座エピトープを認識する抗体で、その可変領域において、
    （ａ）抗体ＮＩ−３０２．６Ｎ９、抗体ＮＩ−３０２．４Ａ６、抗体ＮＩ−３０２．１２Ｈ２又は抗体ＮＩ−３０２．８Ｍ１のいずれか１つのＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１Ｆ、図１ＡＡ、図１ＡＢ、図１ＡＣ又は図１ＡＵに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
    （ｉ）ＶＨ配列（配列番号２１、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９４又は配列番号１９６）、及び
    （ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号２３、配列番号１８６、配列番号１９２又は配列番号１９８）；
    （ｂ）抗体ＮＩ−３０２．６Ｎ９、抗体ＮＩ−３０２．４Ａ６、抗体ＮＩ−３０２．１２Ｈ２又は抗体ＮＩ−３０２．８Ｍ１のいずれか１つのＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列で、図１Ｆ、図１ＡＡ、図１ＡＢ、図１ＡＣ又は図１ＡＵに示されるようなアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
    （ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
    （ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含み、好ましくは、前記ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合性フラグメント
    を含む抗体。
  8. ２０ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下のＥＣ５０（最大半有効濃度）値に対応する結合親和性を、ＨＤ４９と結合することについては有し、かつ、４０ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下のＥＣ５０値に対応する結合親和性を、ＨＤ２１と結合することについては有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 請求項１〜４のいずれか一項に記載される抗体と、ＨＴＴに対する特異的結合について競合するキメラなマウス−ヒト抗体又はマウス化抗体並びに／或いは抗体又はＨＴＴ結合性分子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載される抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドであって、好ましくはｃＤＮＡであるポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載されるポリヌクレオチドを、必要な場合には前記結合性分子の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする請求項６に記載されるポリヌクレオチドとの組合せで含むベクター。
  12. 請求項１０に記載されるポリヌクレオチド又は請求項１１に記載されるベクターを含む宿主細胞。
  13. 抗ＨＴＴ抗体、その生物工学誘導体又は免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
    （ａ）請求項１２に記載される細胞を培養すること、及び
    （ｂ）前記抗体又はその免疫グロブリン鎖を培養物から単離すること
    を含む方法。
  14. 請求項１０に記載されるポリヌクレオチド、請求項１に記載されるベクターによってコードされる、又は、請求項１３に記載される方法によって得られる抗体又はその免疫グロブリン鎖。
  15. 二重特異性抗体である、請求項１〜９又は１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. ＨＴＴ遺伝子のエクソン１によってコードされるタンパク質における２つの異なるエピトープを認識し、好ましくは、少なくとも１つのエピトープが、請求項４〜７のいずれか一項で定義されるエピトープからなる群から選択される、請求項１５に記載の抗体。
  17. 請求項１〜９又は１４〜１６のいずれか一項に記載の抗体であって、
    （ｉ）検出可能に標識され、好ましくは、前記検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団及び重金属からなる群から選択される、又は
    （ｉｉ）薬物に結合させられる、抗体。
  18. 請求項１〜９又は１４〜１７のいずれか一項に記載される抗体、請求項１０に記載されるポリヌクレオチド、請求項１１に記載されるベクター、又は請求項１２に記載される細胞を含む組成物であって、好ましくは、
    （ａ）医薬組成物であり、薬学的に許容され得る担体をさらに含み、場合により、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は症状を処置するために有用であるさらなる薬剤をさらに含む、好ましくはワクチンである組成物；
    （ｂ）診断組成物であり、好ましくは、免疫又は核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬を含む組成物。
  19. ヒト又は動物の身体におけるＨＴＴのインビボ検出において、或いは、ヒト又は動物の身体におけるＨＴＴに治療剤及び／又は診断剤を標的化することにおいて使用されるための、請求項１〜９又は１４〜１７のいずれか一項に記載される抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＨＴＴ結合性分子であって、好ましくは前記インビボ画像化が、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、ＨＴＴ結合性分子。
  20. 請求項１〜９又は１４〜１７のいずれか一項に記載される抗体によって特異的に認識されるＨＴＴのエピトープを有するペプチドであって、好ましくは、請求項２で定義されるようなアミノ酸配列、或いは、１つ又は複数のアミノ酸が置換され、欠失され、及び／又は付加されるその改変された配列を含み、請求項１〜９又は１４〜１７のいずれか一項に記載される抗体によって認識されるペプチド。
  21. ＨＴＴアミロイドーシスに伴う障害の診断又はモニタリングにおいて有用なキットであって、請求項１〜９又は１４〜１７のいずれか一項に記載される少なくとも１つの抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＨＴＴ結合性分子、請求項１０に記載されるポリヌクレオチド、請求項１１に記載されるベクター又は請求項１２に記載される細胞、並びに／或いは、請求項２２０に記載されるペプチドを、必要な場合には使用のための試薬及び／又は説明書と一緒に含むキット。
  22. ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は症状を処置する方法、或いは、ヒト若しくは動物の身体におけるＨＴＴのインビボ検出、又は、ヒト若しくは動物の身体におけるＨＴＴに治療剤及び／又は診断剤を標的化するための方法であって、その必要性のある対象に、可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）と、定常ドメインとを含む抗ＨＴＴ抗体又はそのＨＴＴ結合性フラグメント、或いはそれらの合成又は生物工学誘導体の治療有効量又は診断有効量を、ＨＴＴアミロイドーシスに伴う疾患及び／又は症状を処置することにおける使用のために、或いは、前記ヒト若しくは動物の身体におけるＨＴＴのインビボ検出、又は、前記ヒト若しくは動物の身体におけるＨＴＴに治療剤及び／又は診断剤を標的化するために投与することを含む方法。
  23. 前記抗ＨＴＴ抗体が、請求項１〜９又は１４〜１７のいずれか一項に記載される抗体である、請求項２２に記載の方法。
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