CN107074937B - 人源抗亨廷顿蛋白(htt)抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了优选地能够结合突变的和/或聚集的HTT物质和/或其片段的新的人源抗亨廷顿蛋白(HTT)抗体及其生物技术衍生物，以及与它们相关的方法。所述人源抗HTT抗体和生物技术衍生物可以用于亨廷顿病的HTT定向免疫疗法以及亨廷顿病的诊断的药物和诊断组合物中。

Description

人源抗亨廷顿蛋白(HTT)抗体及其用途
技术领域
本发明总的来说涉及与亨廷顿蛋白(HTT)相关的亨廷顿病(HD)的基于抗体的疗法。具体来说，本发明涉及特异性结合于人类HTT和/或其抗原的新分子，特别是人源抗体及其HTT结合片段、合成和生物技术衍生物，可用于治疗由这些病原性HTT同工型引起的疾病和病症。
此外，本发明涉及包含这些HTT结合分子、抗体及其模拟物的药物和诊断组合物，其作为鉴定与HTT聚集相关的疾病和/或病症的诊断工具和作为治疗与HTT淀粉样变性相关疾病相关的病症的被动疫苗接种策略两者来说是有价值的。
背景技术
亨廷顿病(HD)是一种常染色体显性神经学成淀粉样蛋白疾病。每100,000个体中有5至10个个体患有这种常染色体疾病。然而，在美国的流行性高得多，研究显示不到200,000个美国个体中50％具有发生HD的风险，特别是在美国登记有30,000位患者，尽管在全世界仅登记有100,000位患者。
正如在几项研究中所示，HD由位于4号染色体上的亨廷顿蛋白(HTT)基因中、特别是HTT基因的外显子1中的三核苷酸CAG重复扩展序列引起(MacDonald等，Cell 72,(1993),971–983)，所述序列被翻译成HTT蛋白中的多谷氨酰胺(polyQ)区段。当所述polyQ区段的长度超过35-40个谷氨酰胺残基的阈值时发生HD，并且在重复序列的长度与发病年龄之间存在强烈的反相关。该polyQ区段导致HTT在几个区域例如神经元和神经胶质细胞中的的错误折叠和聚集。随着年龄增加，发生HTT聚集体的积累，导致纹状体GABA能神经元和皮质锥体神经元的变性。HTT错误折叠和聚集的症状包括不自主运动、缺乏运动协调、抑郁、认知降低例如失忆和/或痴呆。
自从1993年HD突变被鉴定以来，对所述疾病的病理生理学和分子生物学的理解已显著提高。已设计了药物例如
Figure BDA0001218242340000021
(四苯喹嗪，Lundbeck)这种六氢-二甲氧基-苯并喹嗪衍生物VMAT2抑制剂用于靶向不自主肌肉运动的症状治疗。
此外，已建议基因沉默方法例如RNA干扰(RNAi)作为潜在疗法。具体来说，在HD小鼠模型(R6/2)中使用针对HTT基因的siRNA显示出抑制突变HTT基因的表达，参见例如Warby等，Am.J.Hum Genet.84(2009),351-366和Olshina等，Biological Chemistry 285(2010),21807-21816。然而，这种方法的一个限制在于难以将足够量的siRNA引入到靶细胞或组织中，正如由例如Boudreau等(Brain Research 1338(2010),112-121)所示。此外，这种方法可能面临安全性障碍，因为动物模型和培养细胞中的基因缺失研究建议需要连续的亨廷顿蛋白表达(Dragatsis等，Nat.Genet.26(2000),300–306；Gauthier等，Cell.118(2004),127–138；Zuccato等，Nat.Genet.35(2003),76–83)。
因此，对于与HTT聚集相关的疾病的新的治疗策略和高效且安全的疗法存在着需求，所述疗法优选地直接干扰由突变的HTT引起的淀粉样蛋白形成。
这一技术难题通过在权利要求书中表征并在下面进一步描述且在实施例和附图中说明的实施方式得以解决。
发明概述
本发明提供了抗亨廷顿蛋白(HTT)抗体和等效的HTT结合分子，其用于与HTT淀粉样变性相关的疾病和病症的预防性或治疗性治疗。更具体来说，提供了识别HTT的突变的和/或聚集的形式的治疗上有用的人源抗体及其HTT结合片段、合成和生物技术衍生物。
具体来说，按照本发明进行的实验，在特异性针对突变的和/或聚集的HTT物质和/或其片段的人源单克隆HTT特异性抗体的重组克隆和生产中获得成功。作为从其相应地分离编码人源单克隆抗HTT抗体的可变结构域的cDNA的B细胞的来源的人类对象是健康的供体。然而，在本发明的另一个实施方式中，可以从其相应地分离人源单克隆抗HTT抗体和编码它们的可变结构域的cDNA的B细胞的来源，是在HTT基因中带有三核苷酸CAG重复扩展序列并且无症状或表现出异常缓慢进展或稳定的病程或表现出亨廷顿病的典型临床特点的HD患者。此外，正如在实施例中证实的，本发明的抗体能够在HD的小鼠模型中减弱树突棘丧失，改善在任务特异性训练期间的行为表现并提高感觉运动能力。因此，可以谨慎地预期本发明的人类单克隆抗HTT抗体及其衍生物，除了是非免疫原性的之外，还在人类中表现出治疗上有益的效果。
正如在背景部分中所描述的，迄今为止，已尝试了通过细胞内方法例如RNA干扰(RNAi)阻断HD的发病机制；对于通过腺相关病毒介导的RNA干扰来沉默突变的亨廷顿蛋白，也参见例如Stanek等，Human Gene Therapy 25(2014),461-474。对于免疫治疗方法而言，在最近十年中已探索了单链抗体片段(scFv)的细胞内表达，即不含免疫球蛋白例如IgG类型的恒定区的胞内抗体；对于消减突变的亨廷顿蛋白和相关的有毒细胞内蛋白的工程化的细胞内scFv和单结构域(dAb；纳米抗体)抗体疗法，参见例如同上和Butler等，ProgNeurobiol.97(2012)。
例如，Lecerf等，Proc.Nat.Acad.Sci.98(2001),4764-4769描述了一种从大型人类噬菌体展示筛选的单链可变区片段(scFv)抗体，其特异性针对亨廷顿蛋白的与HD外显子1中的多谷氨酰胺相邻的17个N末端残基。相应的scFv抗体、即包含λ可变轻连(VL)的scFv-C4(Kvam等，PLoS One 4(2009),e5727；GenBank登记号ACA53373)，被描述为在B6.CgHDR6/1转基因小鼠这种HD小鼠模型中具有一定的神经保护效果，然而所述效果随着注射时疾病的严重性而减弱。为了提高胞内抗体的稳态水平并将被scFv-C4结合的N-末端htt外显子1(httexl)蛋白片段导向蛋白酶体进行降解以便防止它们聚集，已将小鼠鸟氨酸脱羧酶(mODC)的PEST信号序列融合到所述scFv-C4抗体；参见Butler和Messer，PLoS One 6(2011),e29199。体内实验尚未见报道。
Khoshnan等人的研究组还正在瞄准用于HD的基于胞内抗体的治疗剂的开发，尤其是描述了源自于结合多谷氨酰胺(polyQ)、多脯氨酸(polyP)和抗C末端表位的小鼠单克隆抗体的抗亨廷顿蛋白scFv抗体，以及它们在细胞内表达后对突变的亨廷顿蛋白的聚集和毒性的影响；参见例如Ko等，Brain Research 56(2001),319-329，Khoshnan等，Proc.Nat.Acad.Sci 99(2002),1002-1007和Legleiter等，J.Biol.Chem.284(2009),21647-21658以及他们的专利申请US 2003/0232052Al。在所述美国申请中，也描述了被命名为“hMW9”的“人类”scFv抗体，其使用重组的突变亨廷顿蛋白从人类scFv噬菌体文库分离。然而，与小鼠单克隆来源的scFv MW1、MW2、MW7和MW8相反，没有提供hMW9的序列数据，其迄今为止也从未再次报道过。
Colby等，Proc.Nat.Acad.Sci.342(2004),901-912描述了通过非免疫人类抗体文库的酵母表面展示来开发特异性针对亨廷顿蛋白的氨基端的人类轻链可变结构域(VL)细胞内抗体。这种仅由原始scFv的λ轻链结构域构成的单结构域胞内抗体被描述为在无细胞体外测定法中以及在HD的哺乳动物细胞培养物模型中抑制亨廷顿蛋白聚集；也参见相应的国际申请WO 2005/052002。同样地，体内实验尚未见报道。
因此，显然当前的基于胞内抗体的方法既没有扩展到超出基于细胞的测定法，也尚未在HD的动物模型中被证明是成功的，至少没有在长期实验中证明。具体来说，胞内抗体显示出几种体内限制，例如它们的由胞内抗体-抗原复合体的细胞内/核内积累造成的潜在毒性，或例如在人类中病毒递送到的大的脑体积中的受限分布；参见例如Butler等，Prog.Neurobiol.97(2012),190-204和Sothwell等，J.Neurosci.29(2009),13589-13602。此外，细胞内方法的常见缺点是抗体及其相应的编码载体DNA向所需细胞寻址的问题，以及如果外源施加的话，给药方式不方便例如纹状体内注射的问题；参见例如Snyder-Keller等，Neuropathol.Exp.Neurol.69(2010),1078–1085。此外，还存在对基因疗法和病毒载体的使用的总体担忧。
相反，按照本发明进行的实验首次证实了针对亨廷顿蛋白的不同表位的全长IgG抗体在系统性给药后可以成功地递送到脑(实施例24和图18)，并且本发明的抗体能够在HD的小鼠模型中减弱树突棘丧失，改善在任务特异性训练期间的行为表现并提高感觉运动能力(实施例34和图34)。
因此，正如在实施例中说明的，抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物优选为IgG类型，其正如公知并且在本文中描述的，分别包含两个同一的可变重链(VH)多肽和两个同一的可变轻链(VL)多肽以及恒定区和结构域，即至少一个或所有的轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)恒定结构域。换句话说，在本发明的一种情况中，提供了适合用于亨廷顿蛋白和与其相关的障碍的治疗或体内诊断的特异性针对亨廷顿蛋白及其聚集的形式、片段、肽和衍生物的重组表达的二价抗体，其特征在于存在免疫球蛋白恒定区。正如在下文中进一步描述的，所述免疫球蛋白可以是任何类型例如IgG、IgM、IgA、IgG或IgE和相应的免疫球蛋白亚型(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1。然而，优选地，所述抗体是人类IgG亚型。
此外，也正如在本文中进一步解释的，本发明的人源抗体的特征在于包含至少一个或多个人类来源、即由源自于人类记忆B细胞的cDNA编码的CDR，并且优选地其中VH和/或VL链也是人类记忆B细胞来源的。如果是人类的，恒定区或其任何结构域可以是与CDR和VH和/或VL链分别相同或不同来源的。
在这种背景中，除非另有陈述或从上下文清楚地看出，否则本文中对本发明的抗体的指称包括在实施例中说明的人源抗体及其HTT结合片段、合成和生物技术衍生物。
正如可以从提供源自于人类scFv噬菌体文库的胞内抗体的现有技术方法进一步注意到的，scFcv几乎总是使用Vλ来源的可变轻连获得的；参见Kvam等和Colby等，同上。相反，超过90％的本发明的人源抗体使用Vκ轻链，这也适用于实施例24中说明的能够在系统性给药后穿透到脑的抗体NI-302.31F11和NI-302.35C1以及在实施例34(NI-302.35C1)中说明的在HD动物模型中对小鼠的行为表现和运动相关的任务具有有益效果的抗体。因此，推测具有Vκ轻链的抗体可能具有比具有Vλ来源的轻链的抗体更优越的性质。因此，在本发明的抗体的优选实施方式中，可变轻链是Vκ来源的。
正如在实施例和附图中说明的，所述抗HTT抗体、其HTT结合片段、合成和生物技术变体结合到HTT外显子1蛋白的显示出如上所述的“有毒”变化、即扩增的不稳定的三核苷酸重复序列的不同区域，正如在实施例中所示。具体来说，本发明的抗体识别HTT外显子1蛋白的polyP区、polyQ/polyP区、富P区、C-末端区或N-末端区。实施例中说明的主题抗体的表位概述在图20中。正如在背景部分中提到的，当polyQ区段的长度超过35-40个谷氨酰胺残基的阈值时，由于HTT的聚集而发生HD。因此，正如实施例3中示出的，产生了具有21、35或49个polyQ重复序列的聚集的和可溶的HTT外显子1蛋白，并试验了鉴定到的抗体的结合。在下文中，这些构建物将用HDX表示，其中X是Q的数目，例如具有21个polyQ重复序列的HTT外显子1被称为HD21。因此，除非另有特别指明，否则术语HTT意味着HTT外显子1，并且可溶性HTT是指相应的GST融合蛋白。
在本发明的优选实施方式中，抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物能够偏好性地结合HTT的聚集或错误折叠的形式。正如在例如Legleiter等，JBC 285(19)(2010),14777–14790中描述并在实施例中证实的，HDX蛋白的聚集在速度和大小方面随着Q的数目而增加。
在本发明的特别优选实施方式中，抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物证实了以图1中所提出的任一可变区VH和/或VL为特征的抗体的免疫结合特征。优选地，抗体的可变区包含所述可变区的VH和/或VL、即图1A至1AU中提出的成对VH和VL链的至少一个互补性决定区(CDR)，其中允许一个或多个氨基酸置换，只要正如实施例中说明的、例如在图20中概述的，与包含图1A至1AU中提出的相应的成对VH和VL链的主题抗体相比，得到的抗体的结合特异性在种类即表位特异性上保持不受影响，并且对于指定抗原来说EC50值在同一数量级上，优选地在至少50％、更优选地至少25％、最优选地至少10％同一性值的范围内即可。优选地，所述VH和VL链的一个、两个或所有三个CDR在相应位置中含有至少一个氨基酸，所述氨基酸在识别相同类型的HTT表位即poly-P、富P、C-末端或N-末端表位的主题抗体的VH和VL链氨基酸序列中，在至少约20％、优选地约40％、更优选地约50％、最优选地约75％的序列中是保守的(即是相同的或保守置换的氨基酸)。例如，主题抗体的序列比对揭示出在CDRH1中占优势地存在一个或两个酪氨酸(Y)，参见图36。在其他CDR中也可以鉴定到类似的保守氨基酸。
在本发明的另一个实施方式中，所述抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物是双特异性抗体。因此，本发明的抗体可能能够识别相同或不同抗原上的至少两个不同表位。例如，尽管第一抗原结合位点即可变结构域可能特异性针对HTT并优选地包含随附的实施例和附图中说明的任一主题抗体的可变区，但第二抗原结合位点可能特异性针对不同的、优选也是神经毒性的蛋白，并包含相应抗体的可变区。因此，蛋白质错误折叠和聚集是神经退行性疾病例如阿兹海默氏病(AD)、帕金森氏症(PD)和HD的主要标志。尽管直到最近，共识是每种倾向于聚集的蛋白质是每种疾病的特征[α-突触核蛋白(α-syn)/PD，突变的亨廷顿蛋白(HTT)/HD，Tau和淀粉样β肽/AD]，但越来越多的证据表明倾向于聚集的蛋白质实际上可以共聚集并改变彼此的行为和毒性，建议了这一过程可能也造成了不同疾病之间临床症状的交叠；对于α-syn和突变的HTT的共聚集，参见例如
Figure BDA0001218242340000071
等，Hum.Mol.Genet.24(2015),1898-1907。
因此，在本发明的一个实施方式中，所述抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物是双特异性抗体，其能够结合HTT和与神经退行性疾病相关的蛋白、特别是脑中的蛋白，所述蛋白优选地选自α-突触核蛋白、Tau、淀粉样β肽、SOD1、C9orf72和TDP-43；参见例如Blokhuis等，Acta Neuropathol.125(2013),777–794。针对所提到的蛋白质的人源单克隆抗体在本领域中是已知的；参见例如关于抗aβ抗体的国际申请WO2008/081008，关于抗α-突触核蛋白抗体的WO2010/069603，关于抗tau抗体的WO2012/049570，关于抗SOD1抗体的WO2012/080518，关于抗锚蛋白抗体的WO2012/113775，关于抗TDP-43抗体的WO2013/061163，以及关于C9orf72的欧洲专利申请EP14187180.6及其后续的国际申请。双特异性和多特异性抗体可以通过本领域中公知的方法产生，例如通过例如Brennan等，Science.229(1985),81-83所描述的单克隆免疫球蛋白G1片段的化学重组，或适合的重链和轻链的重组同时共表达和相应的配对；参见例如Lewis等，Nature Biotechnology 32(2014),191–198；对于综述，参见例如Kontermann，mAbs 4(2012),182-197以及Kontermann和Brinkmann，Drug Discovery Today 20(2015),838–847。
可选地或另外地，所述双特异性或多特异性抗体至少包含特异性针对HTT的两个不同表位的第一和第二抗原结合位点、即可变结构域，优选地其中一个或两个可变区源自于在随附的实施例和附图中说明的并在本文中进一步描述的任一主题抗体。因此，在优选实施方式中，本发明的双特异性抗体包含抗体的两个结合位点/结构域，其识别HTT外显子1蛋白的polyP区、polyQ/polyP区、富P区、C-末端区、N-末端区或构象表位。实施例中说明的主题抗体的表位概述在图20中。因此，在一个实施方式中，本发明的双特异性抗体识别图20中描绘的至少两个不同表位，并相应地具有同族主题抗体的组合结合特异性。
本文公开的任一主题抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2片段或任何其他抗原结合片段。然而，正如在特别优选的实施方式中提到的，所述抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物是人类IgG同种型抗体，并包含所述恒定区的至少一部分。或者，所述抗体是嵌合的人类-啮齿动物或啮齿动物源化抗体例如鼠或鼠源化、大鼠或大鼠源化抗体，对于动物中的诊断方法和研究来说，啮齿动物版本是特别有用的。
此外，本发明涉及包含本发明的抗体或其抗原结合片段、合成或生物技术衍生物的组合物，以及在与HTT淀粉样变性相关的疾病和/或病症的预防、诊断或治疗中使用这些组合物的免疫治疗和免疫诊断方法，其中将有效量的所述组合物给药到需要的患者。
本发明还涉及至少编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。优选地，所述可变区包含图1中示出的可变区的VH和/或VL的至少一个互补性决定区(CDR)。优选地，所述多核苷酸是cDNA。
因此，本发明还涵盖包含所述多核苷酸的载体和用其转化的宿主细胞，以及它们在特异性针对HTT并优选地能够结合突变和/或聚集的HTT物质或其片段的抗体和等效结合分子的生产中的用途。用于抗体及其模拟物的重组生产的手段和方法以及筛选可能是抗体也可能不是抗体的竞争性结合分子的方法，在本领域中是已知的。然而，正如在本文中描述的，特别是对于在人类中的治疗性应用来说，本发明的抗体在所述抗体的应用基本上没有在使用嵌合和甚至人源化抗体时观察到的针对这些抗体的免疫应答的意义上，是人类抗体。因此，本发明还涉及使用本文中描述的并在实施例中说明的cDNA、载体和宿主细胞来生产抗HTT抗体，特别是人源抗HTT抗体或其生物技术衍生物。
此外，本文中公开了可用于在体外例如在样品中和/或在体内鉴定HTT，特别是突变和/或聚集的HTT物质或片段的组合物和方法。所公开的抗HTT抗体及其结合片段可以例如通过使用基于ELISA或表面适应性测定法，用于筛选人类血液、血浆、血清、唾液、腹膜液、脑脊液(“CSF”)和尿液中HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质或其片段在样品中的存在。在一个实施方式中，本发明涉及一种在对象中诊断或监测与突变和/或聚集的HTT物质或其片段相关的疾病和/或障碍的进展的方法，所述方法包括使用至少一种本发明的抗体或HTT结合分子和/或对突变和/或聚集的HTT物质或片段具有与其任一者基本上相同的结合特异性的结合分子，确定来自于待诊断对象的样品中突变和/或聚集的HTT物质或片段的存在，其中所述突变和/或聚集的HTT物质或片段的存在指示了所述障碍。
因此，本发明还涉及一种制备药物组合物的方法，所述药物组合物用于与HTT聚集体相关或由HTT聚集体引起的疾病的治疗，所述方法包括：
(a)表达本发明的cDNA和/或将本发明的宿主细胞在适合于生产所述抗HTT抗体、特别是人源抗HTT抗体或其生物技术衍生物的适合培养条件下进行培养；
(b)分别从反应混合物和所述培养物将所述抗体、其生物技术衍生物或免疫球蛋白链纯化至制药级；以及
(c)将所述抗体或其生物技术衍生物与可药用载体混合。
此外，在本发明的一个实施方式中，提供了包含本发明的抗体的至少一个CDR的抗HTT抗体和HTT结合分子，其用于制备组合物，以用于人类或动物体内的HTT、特别是突变和/或聚集的HTT物质或片段的体内检测(也被称为体内成像)或将治疗和/或诊断药剂靶向到HTT。本文公开的方法和组合物可能有助于与HTT聚集或淀粉样变性相关并且例如以HTT的聚集形式的出现为特征的疾病和/或病症，并且可用于监测疾病进展和提供给对象的疗法的治疗效能，例如在体内成像相关的诊断方法中。在一个实施方式中，所述体内检测(成像)包括闪烁扫描术、正电子发射断层扫描术(PET)、单光子发射断层扫描术(SPECT)、近红外(NIR)、光学成像或磁共振成像(MRI)。
因此，本发明的具体目的是提供用于治疗、诊断或预防与HTT淀粉样变性相关的疾病和/或病症的方法。所述方法包括向所述对象给药有效浓度的优选为人类的抗体或抗体衍生物，其中所述抗体靶向HTT或其片段，优选为突变和/或聚集的或错误折叠的HTT物质或其片段。
另一方面，本发明提供了一种肽，其具有被本发明的抗体特异性识别的HTT、优选为突变和/或聚集的HTT物质或其片段的表位。所述肽包含在下面的详细描述中和实施例中指明的氨基酸序列或其一个或多个氨基酸被置换、缺失和/或添加的修饰序列，或由所述序列构成。另外，本发明提供了一种用于在对象中诊断与HTT淀粉样变性相关的疾病和/或障碍的方法，所述方法包括确定所述对象的生物样品中结合于所述肽的抗体的存在的步骤。
从后面的描述和实施例，本发明的其他实施方式将变得显而易见。
附图简述
图1：人类抗体NI-302.33C11、NI-302.63F3、NI-302.35C1、NI-302.31F11、NI-302.2A2、NI-302.6N9、NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.44D7、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.7A8、NI-302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.11H6、NI-302.3D8、NI-302.18A1、NI-302.8F1、NI-302.52C9、NI-302.46C9、NI-302.15E8、NI-302.15D3、NI-302.64E5、NI-302.7D8、NI-302.72F10、NI-302.12H2、NI-302.8M1和NI-302.4A6的可变区的氨基酸序列。注明了构架(FR)和互补性决定区(CDR)，并且CDR被下划线。使用Kabat编号方案(参考http://www.bioinf.org.uk/abs/)。
图2：亨廷顿蛋白(HTT)外显子1蛋白和聚集体的表征。(A)GST-HttEx1Q21(GST-HD21)、GST-HttEx1Q35(GST-HD35)和GST-HttEx1Q49(GST-HD49)表达构建物的克隆；(B)纯化的单独GST(第1道)、GST-HttExon1Q21(GST-HD21，第2道)、GST-HttExon1Q35(GST-HD35，第3道)和GST-HttExon1Q49(GST-HD49，第4道)蛋白在SDS-PAGE后的考马斯染料染色显示出良好的纯度，但也有一些其他条带；(C)使用多克隆HD-1抗体作为检测抗体通过斑点印迹(左)和滤膜滞留分析(右)进行的体外HD21、HD35和HD49的时间分辨体外聚集反应的表征。HD35在24小时时的聚集反应或HD49在3小时后的反应显示出聚集体大于在滤膜滞留测定分析中可以通过HD-1检测的0.2μm的孔眼尺寸；(D)通过电子显微术进行的体外HD35和HD49制备物的表征。HD35在24小时后的聚集反应[A,E]，或HD49在1小时[B,F]、3小时[C,G]或24小时后[D,H]的反应。概貌照片[A-D]使用1’000x放大倍数，详细结构[E-H]使用66'000x放大倍数。
图3：抗polyP结构域结合抗体NI-302.33C11的结合亲和性的表征。(A)通过直接ELISA确定的NI-302.33C11对不同HTT物质的结合亲和性；(B)使用直接ELISA进行的NI-302.33C11对聚集的HD49(●)、聚集的HD21(■)、可溶性GST-HD49(▲)和GST-HD21(▼)Htt外显子1蛋白的EC50测定。NI-302.33C11抗体以相近的EC50值结合于所有四种物质；以及(C)在通过斑点印迹(左)和滤膜滞留测定(右)进行的体外HD21、HD35和HD49的时间分辨体外聚集反应上，NI-302.33C11对HTT聚集体的结合分析，其中在斑点印迹测定中偏好性结合于HD35和HD49的较晚(聚集)反应，并且在滤膜滞留测定中偏好性结合于HD35和HD49的聚集体。
图4：通过交叠肽的扫描确定NI-302.33C11抗体的结合表位。顶部：NI-302.33C11抗体杂交后的肽扫描图像。底部：被NI-302.33C11抗体结合的肽序列的图形概述。在共有序列中，被NI-302.33C11抗体识别的肽之间的交叠氨基酸(推测的结合表位)用粗体突出。HRP偶联的驴抗人IgG Fcγ检测抗体单独地不结合任何线性亨廷顿蛋白肽。
图5：NI-302.33C11结合于HTT的polyP结构域。使用直接ELISA进行的GST-HD49(●)、BSA偶联的富P结构域肽(◆)、BSA偶联的C-端肽(■)或BSA偶联的polyP肽(▲)的EC50测定。
图6：NI-302.33C11抗体的纯度和完整性以及结合特异性的表征。2和10μg重组人类NI-302.33C11抗polyP结构域抗体的SDS-PAGE分析和随后的考马斯染色。
图7：抗富脯氨酸结构域抗体NI302.63F3的结合亲和性的表征。(A)通过直接ELISA确定的NI-302.63F3对不同HTT物质的结合亲和性；(B)使用直接ELISA进行的NI-302.63F3对聚集的HD49(●)、聚集的HD21(■)、可溶性GST-HD49(▲)和GST-HD21(▼)Htt外显子1蛋白的EC50测定。NI-302.63F3抗体对所有四种物质具有相近的EC50值；(C)在通过斑点印迹(左)和滤膜滞留测定(右)进行的体外HD21、HD35和HD49的时间分辨体外聚集反应上，抗体NI-302.63F3的表征，其中在斑点印迹测定中偏好性结合于具有扩展的polyQ区段的亨廷顿蛋白(HD49>HD35)，并且在滤膜滞留测定中偏好性结合于HD35和HD49的聚集体。
图8：通过交叠肽的扫描确定NI-302.63F3抗体的结合表位。顶部：NI-302.63F3抗体杂交后的肽扫描图像。底部：被NI-302.63F3抗体结合的肽序列的图形概述。在共有序列中，被NI-302.63F3抗体识别的肽之间的交叠氨基酸(推测的结合表位)用粗体突出。HRP偶联的驴抗人IgG Fcγ检测抗体单独地不结合任何线性亨廷顿蛋白肽。
图9：NI-302.63F3结合于HTT的富P结构域。使用直接ELISA进行的GST-HD49(●)、BSA偶联的富P结构域肽(◆)、BSA偶联的C-端肽(■)或BSA偶联的polyP肽(▲)的EC50测定。
图10：NI-302.63F3抗体的纯度和完整性以及结合特异性的表征。2和10μg重组人类NI-302.63F3抗富脯氨酸结构域抗体的SDS-PAGE分析和随后的考马斯染色。
图11：抗C-端结构域结合抗体NI 302.35C1的结合亲和性的表征。(A)通过直接ELISA确定的NI-302.35C1对不同HTT物质的结合亲和性；(B)使用直接ELISA进行的NI-302.35C1对聚集的HD49(●)、聚集的HD21(■)、可溶性GST-HD49(▲)和GST-HD21(▼)Htt外显子1蛋白的EC50测定；(C)在通过斑点印迹(左)和滤膜滞留测定(右)进行的体外HD21、HD35和HD49的时间分辨体外聚集反应上，抗体NI-302.35C1的表征，其中在斑点印迹测定中偏好性结合于HD35和HD49的较晚的(聚集)反应，并且在滤膜滞留测定中偏好性结合于HD35和HD49的聚集体。
图12：NI-302.35C1结合于BSA偶联的HTT的C-端结构域肽。使用直接ELISA进行的GST-HD49(●)、BSA偶联的富P结构域肽(◆)、BSA偶联的C-端肽(■)或BSA偶联的polyP肽(▲)的EC50测定。
图13：NI-302.35C1抗体的纯度和完整性以及结合特异性的表征。2和10μg重组人类NI-302抗C-端结构域抗体的SDS-PAGE分析和随后的考马斯染色。
图14：抗N-端结构域抗体NI302.15E8的结合亲和性的表征。(A)通过直接ELISA确定的NI-302.15E8对不同HTT物质的结合亲和性；(B)使用直接ELISA进行的NI-302.15E8对聚集的HD49(●)、聚集的HD21(■)、可溶性GST-HD49(▲)和GST-HD21(▼)Htt外显子1蛋白的EC50测定。NI-302.15E8抗体对非聚集的物质具有更高的结合亲和性EC50值。
图15：NI-302.15E8结合于BSA偶联的HTT的N-端结构域肽。使用直接ELISA进行的GST-HD49(●)、BSA偶联的N-端肽(▼)、BSA偶联的富P结构域肽(◆)、BSA偶联的C-端肽(■)或BSA偶联的polyP肽(▲)的EC50测定。
图16：通过直接ELISA进行的靶特异性分析。正如在通过直接ELISA的结合特异性分析中示出的，NI-302抗体(A)NI-302.33C11、(B)NI-302.63F3和(C)NI-302.35C1和(D)NI-302.15E8不结合无关的聚集蛋白靶。
图17：与非转基因同窝仔畜相比，在Tg(HDexon1)62Gpb/1J转基因小鼠的海马脑片培养物中树突棘密度显著降低。(A-D)非转基因同窝仔畜(A,C)与Tg(HDexon1)62Gpb/1J小鼠(B,D)的GFP阳性海马神经元的比较的概述，示出了在较高放大倍数下具有个体树突棘的单一树突(C,D)。(E)与野生型动物相比，在转基因动物中树突棘密度显著降低(n＝每组3-7个脑片，来自于2只野生型或3只转基因动物)。(F)在转基因小鼠的脑片中，抗体NI-302.11F11和302.63F3减弱树突棘密度的丧失(n＝每组8-13个脑片，来自于总共12只转基因动物)。数据表示平均值±SEM。*p<0.05(MWU)，#p＝0.05。
图18：NI-302抗体在R6/1动物模型的脑中的穿透。(A)在50mg/kg的单次腹膜内注射后，R6/1转基因动物中的平均NI-302.31F11(●)和NI-302.35C1(■)血浆和脑药物水平。数据表示平均值±SEM。对于每组来说n＝3；(B)在50mg/kg的单一药剂后各个小鼠的血浆和脑药物水平。
图19：使用直接ELISA进行的人源HTT抗体对聚集的HD49(●)、聚集的HD21(■)、可溶性GST-HD49(▲)和GST-HD21(▼)Htt外显子1蛋白的EC50测定。某些抗体(例如NI-302.37C12(I)、NI-302.55D8(J)、NI-302.11A4(F)或NI-302.22H9(G))似乎对未切开的GST-HTT蛋白具有优选的结合，表明这些抗体偏好性识别未切开的可溶性GST-HD构建物，而某些抗体(例如NI-302.74C11(C)或NI-302.71F6(M))对所有HTT制备物显示出高亲和性结合并具有相近的EC值，表明它们在ELISA测定法中结合到在聚集的和未切开的HTT外显子1构建物中同样暴露的表位。
图20：通过直接ELISA进行的结合亲和性的表征。对人源HTT特异性抗体的不同HTT蛋白的结合亲和性。
图21：在通过斑点印迹(左)和滤膜滞留测定(右)进行的体外HD21、HD35和HD49的时间分辨体外聚集反应上，抗体NI-302.44D7、NI-302.37C12、NI-302.15F9和NI-302.71F6的表征，其中特别是NI-302.15F9和NI-302.71F6在斑点印迹测定中偏好性结合于HD35和HD49的较晚(聚集)反应，并且在滤膜滞留测定中偏好性结合于HD35和HD49的SDS稳定的聚集体。
图22：通过直接ELISA进行的靶特异性分析。NI-302抗体(A)NI-302.31F11、(B)NI-302.6N9、(C)NI-302.46C9、(D)NI-302.8F1、(E)NI-302.2A2、(F)NI-302.74C11、(G)NI-302.15F9、(H)NI-302.39G12、(I)NI-302.11A4、(J)NI-302.22H9、(K)NI-302.44D7、(L)NI-302.55D8、(M)NI-302.7A8、(N)NI-302.78H12、(O)NI-302.71F6、(P)NI-302.11H6和(Q)NI-302.3D8不结合无关的聚集蛋白靶，正如在通过直接ELISA进行的结合特异性分析中示出的。
图23：通过交叠肽的扫描确定NI-302抗体的结合表位。顶部：NI-302抗体杂交后的肽扫描图像。底部：示出了肽序列和NI-302抗体对单个肽的结合分值的图形概述。被NI-302抗体识别的肽之间的交叠氨基酸(推测的结合表位)用灰色在共有序列中突出。HRP偶联的驴抗人IgG Fcγ检测抗体单独地不结合任何线性亨廷顿蛋白肽。(A)NI-302.31F11 1μg/ml在21个斑点膜上，(B)NI-302.74C11 1μg/ml在16个斑点膜上，(C)NI-302.15F9 1μg/ml在16个斑点膜上，(D)NI-302.39G12 1μg/ml在16个斑点膜上，(E)NI-302.11A4 1μg/ml在16个斑点膜上，(F)NI-302.22H9 1μg/ml在16个斑点膜上，(G)NI-302.44D71μg/ml在16个斑点膜上，(H)NI-302.37C12 1μg/ml在16个斑点膜上，(I)NI-302.55D8 1μg/ml在16个斑点膜上，(J)NI-302.7A8 1μg/ml在21个斑点膜上，(K)NI-302.78H12 1μg/ml在16个斑点膜上，(L)NI-302.71F6 1μg/ml在16个斑点膜上，(M)NI-302.11H6 1μg/ml在21个斑点膜上，(N)NI-302.18A11μg/ml在21个斑点膜上，(O)NI-302.3D8 1μg/ml在21个斑点膜上，(P)NI-302.46C9 1μg/ml在21个斑点膜上，(Q)NI-302.52C9 1μg/ml在21个斑点膜上，(R)NI-302.2A2 1μg/ml在21个斑点膜上，(S)NI-302.15E8 1μg/ml在21个斑点膜上，(T)NI-302.15D3 1μg/ml在21个斑点膜上。
图24：NI-302抗体的免疫组织化学分析揭示出在疾病晚期Tg(HDexon1)62Gpb/1J转基因动物的纹状体神经元中，神经元核内包涵体在5nM(74C11、39C12、11A4、22H9、78H12、37C12、7D8、72F10)或50nM(15F9、71F6、55D8、44D7、7A8、64E5)浓度下的显著染色。Mab5492是可商购的N-端HTT抗体。
图25：R6/1转基因小鼠模型Tg(HDexon1)61Gpb/J的基本表征。该动物模型的疾病进展期间的(A)存活曲线、(B)体重曲线和(C)总的脑湿重。(D-H)通过用NI-302.33C11HTT抗体染色来表征随着疾病进展，纹状体中神经元核内包涵体的出现。
图26：B6C3-Tg(HD82Gln)81Dbo/J(N171-82Q)转基因小鼠模型的基本表征。该动物模型的疾病进展期间的(A)存活曲线、(B)体重曲线和晚期的(C)总的脑湿重。(D-F)通过用Mab5492HTT抗体染色来表征随着疾病进展，纹状体中神经元核内包涵体的出现。
图27：使用50nM NI-302.33C11(polyP-表位)的免疫组织化学分析显示了在4位不同亨廷顿病患者的皮层神经元中(A-D)和270日龄的疾病晚期B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因动物的纹状体神经元中1(E)和5nM(F)浓度下神经元核内包涵体的染色。在非转基因同窝仔畜中(G)，在染色期间省略第一抗体的情况下(H)，或在将非亨廷顿病对照的组织用50nM NI-302.33C11染色的情况下，没有检测到染色。
图28：使用50nM NI-302.63F3(富P结构域表位)的免疫组织化学分析显示了4位不同亨廷顿病患者的皮层神经元(A-D)的神经元核内包涵体的染色(A-C)和某些神经突的染色(D)以及在270日龄的疾病晚期B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因动物的纹状体神经元中在1nM(E)和5nM(F)浓度下的染色。在非转基因同窝仔畜中(G)，在染色期间省略第一抗体的情况下(H)，或在将非亨廷顿病对照的组织用50nM NI-302.63F3染色的情况下，没有检测到染色。
图29：使用100nM NI-302.35C1(末端外显子1表位)的免疫组织化学分析显示了4位不同亨廷顿病患者的皮层神经元(A-D)的神经元核内包涵体的染色(A-C)和某些神经突的染色(D)以及在270日龄的疾病晚期B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因动物的纹状体神经元中在1nM(E)和5nM(F)浓度下的染色。在非转基因同窝仔畜中(G)，在染色期间省略第一抗体的情况下(H)，或在将非亨廷顿病对照的组织用100nM NI-302.35C1染色的情况下，没有检测到染色。
图30：使用可商购的抗polyQ抗体Mab1574(1:2000，Chemicon)的免疫组织化学分析显示了4位不同亨廷顿病患者的皮层神经元(A-D)的神经元核内和细胞质包涵体的染色和某些神经突的染色(A，D)以及在出现症状之前的150日龄(E)和270日龄(F)的疾病晚期B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因动物的纹状体神经元中的染色。在非转基因同窝仔畜中(G)，在染色期间省略第一抗体的情况下(H)，或在将非亨廷顿病对照的组织用Mab 1574染色的情况下，没有检测到染色。
图31：使用直接ELISA进行的人源HTT抗体对聚集的HD49(●)、聚集的HD21(■)、可溶性GST-HD49(▲)和GST-HD21(▼)Htt外显子1蛋白的EC50测定。某些抗体(例如NI-302.64E5(A)或NI-302.7D8(B))似乎对未切开的GST-HD49蛋白具有优选的结合，表明这些抗体偏好性识别含有较长polyQ重复序列的未切开的可溶性GST-HD构建物。抗体NI-302.72F10(C)显示出对HD21构建物的偏好，并且某些抗体(例如NI-302.4A6(D)、NI-302.12H2(E)或NI-302.8M1(E))对所有HTT制备物显示出高亲和性结合并具有相近的EC值，表明它们在ELISA测定法中结合到在聚集的和未切开的HTT外显子1构建物中同样暴露的表位。
图32：在通过斑点印迹(左)和滤膜滞留测定(右)进行的体外HD21、HD35和HD49的时间分辨体外聚集反应上，抗体(A)NI-302.64E5、(B)NI-302.7D8、(C)NI-302.72F10、(D)NI-302.4A6、(E)NI-30212H2、(F)NI-302.8M1和(G)NI-302.33C11(作为对照)的表征，其中特别是NI-302.64E5和NI-302.72F10在斑点印迹测定中偏好性结合于HD35和/或HD49的较晚(聚集)反应，并且在滤膜滞留测定中偏好性结合于HD35和HD49的SDS稳定的聚集体。
图33：通过直接ELISA进行的靶特异性分析。NI-302抗体(A)NI-302.64E5、(B)NI-302.7D8、(C)NI-302.72F10、(E)NI-302.12H2和(F)NI-302.8M1不结合无关的聚集蛋白靶，正如在通过直接ELISA进行的结合特异性分析中示出的，例外的是(D)NI-302.4A6显示出与p53的一定结合。
图34：在HD的小鼠模型中，C-端结构域结合抗体NI 302.35C1对任务特异性训练期间的行为表现和感觉运动能力的研究。(A)使用十字迷宫分析调查R6/1小鼠中的焦虑水平。在6月龄时，与介质处理的R6/1动物相比，NI-302.35C1处理的R6/1动物在开放臂中花费较少时间，进入开放臂的频率较低，并且在开放臂上做出较少的不受保护的浸头。因此，NI-302.35C1处理的R6/1小鼠表现出与非转基因同窝仔畜可比更焦虑的表型。(B)与介质处理的R6/1动物相比，NI-302.35C1处理的R6/1动物在爬杆实验中显示出改进的表现，达到与非转基因动物相近的水平。
图35：通过交叠肽的扫描确定NI-302抗体的结合表位。顶部：NI-302抗体杂交后的肽扫描图像。底部：示出了肽序列的图形概述。被NI-302抗体识别的肽之间的交叠氨基酸(推测的结合表位)在下方的共有序列中示出。HRP偶联的驴抗人IgG Fcγ检测抗体单独地不结合任何线性亨廷顿蛋白肽。(A)NI-302.64E5，(B)NI-302.7D8，(C)NI-302.72F10，(D)NI-302.4A6，(E)NI-302.12H2，(F)NI-302.8M1，所有抗体以1μg/ml浓度在21个斑点膜上。
图36：NI-302抗体的VH和VL或VK链中CDR的氨基酸序列比对。根据保守的氨基酸、区段或其他基序检查每个序列，揭示出酪氨酸在CDR中的积累。
发明详述
本发明总的来说涉及与亨廷顿蛋白(HTT)的病理性、通常为突变和/或聚集的形式的存在相关的疾病和/或病症以及症状的免疫疗法和非侵入性检测方法。更具体来说，本发明涉及重组人源单克隆抗体及其HTT结合片段、合成和生物技术衍生物，其在从所选人类供体群体获得的序列信息的基础上产生，并且能够结合到这些HTT同工型及其抗原。有利的是，本发明的重组人源单克隆抗体的特征在于特异性结合到突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段，允许进行靶向以用于病理学改变的HTT物质的治疗和/或诊断。由于它们源自于人类，因此可以合理地预期，得到的本发明的重组抗体作为治疗剂是有效且安全的，并且作为用于检测病理性HTT的诊断试剂是高度特异性的并且不给出假阳性。
此外，本发明涉及本文中描述的人类单克隆抗体及其任何衍生物，其单独地或与用于HTT淀粉样变性相关症状的其他药剂一起，用于患者的治疗，其中本发明的抗体及其任何衍生物被设计成与抑制副作用的药剂同时给药，或在所述药剂给药之前或之后顺序给药。在这种情形中，本发明的抗HTT抗体和HTT结合片段优选地在人类中是基本上非免疫原性的。在本发明的一个实施方式中，提供了既包含本发明的人类单克隆抗体或其任何衍生物，也包含用于HTT淀粉样变性相关症状的一种或多种药物的药物组合物。
I.定义
除非另有陈述，否则本文中使用的术语被给予在《牛津生物化学和分子生物学词典》(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Oxford UniversityPress，1997，2000年修订，2003年再次印刷，ISBN 0 19 850673 2)中所提供的定义。
应该指出，没有具体数目的实体是指一个或多个所述实体；例如，“抗体”被理解为表示一个或多个抗体。同样地，“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
亨廷顿蛋白(HTT)、也称为IT15，是与亨廷顿病(HD)这种以纹状体神经元的丧失为特征的神经退行性疾病相关的疾病基因。据认为，HD由HTT基因中扩展的不稳定的三核苷酸重复序列引起，所述重复序列在蛋白质产物中翻译成多谷氨酰胺重复序列。在正常对照中鉴定到了相当宽的三核苷酸重复数目的范围，并且超过35-40的重复数目被描述为病理性的。HTT基因座(NG_009378.1；4830至174286；NCBI RefSeqGene)较大，跨越180kb并由67个外显子构成。
就此而言，已证实突变HTT的N-端片段、即具有扩展的CAG重复序列的HTT基因的外显子1蛋白，代表了“有毒的”HTT物质，其在转基因小鼠中足以引起聚集和渐进性神经表型；参见例如Mangiarini等，Cell 87(1996),493–506和Ross等，Lancet Neurol.10(2011),83–98，DiFiglia等，Science 277(1997),1990-1993，Gutekunst等，J Neurosci 19(7)(1999),2522–2534。
除非另有陈述，否则“特异性识别HTT的抗体”、“特异性针对HTT的抗体”和“抗HTT抗体”意味着特异性、总体和全体结合于HTT，其中HTT是指不同形式的HTT，包括但不限于天然形式的HTT以及其他形式的HTT，例如病理学改变的HTT，如突变的、错误折叠的和/或聚集的HTT。本文中提供了选择性用于全长和/或片段和/或突变、错误折叠和/或聚集形式的HTT的人源抗体。
除非另有具体指明，否则术语“HTT”可互换使用，以具体指称不同形式的亨廷顿蛋白(HTT)。术语“HTT”也用于总体辨识HTT的其他构造体，例如HTT的病理学改变形式，如HTT的错误折叠和/或聚集形式。此外，除非另有具体指明，否则术语HTT特别是指HTT外显子1，并且可溶性HTT是指相应的GST融合蛋白。术语“HTT”也用于统称所有类型和形式的HTT，例如突变的HTT。在术语例如HTT之前添加的字母，被用于指示特定直系同源物所源自的生物体，例如表示人类HTT的hHTT或表示鼠类来源的mHTT。
本文公开的抗HTT抗体特异性结合HTT及其表位，并结合于HTT及其表位的各种不同构象。例如，本文中公开了特异性结合病理学改变的HTT物质或其片段，例如突变、错误折叠和/或聚集形式的HTT或其片段的抗体。术语(病理学)突变、错误折叠和/或聚集的HTT/HTT聚集体可互换使用，以具体指称前述的形式。当在本文中使用时，术语(病理学)“聚集的形式”或“聚集体”描述了由HTT相互之间的错误/病理性相互作用造成的积累或簇集形成的产物。这些聚集体、积累或簇集形式，可能基本上由HTT和/或HTT片段构成以及由非纤维状寡聚物和/或纤维状寡聚物及其纤丝构成，或由HTT和/或HTT片段构成以及由非纤维状寡聚物和/或纤维状寡聚物及其纤丝构成。当在本文中使用时，对“特异性结合”、“选择性结合”或“偏好性结合”HTT的抗体的指称，是指抗体不结合其他无关蛋白。在一个实例中，本文公开的HTT抗体可以结合HTT或其表位，并且对其他蛋白质不表现出高于约2倍背景的结合。在优选实施方式中，本发明的抗体基本上不识别选自下列的无关淀粉样肽形成蛋白：成对螺旋丝(PHF)-tau，TAU，α-突触核蛋白，反式激活响应性DNA结合蛋白43(TDP43)，胰岛淀粉样多肽(IAPP)，甲状腺素运载蛋白(TTR)，血清淀粉样肽A(SAA)；参见实施例8、13、18和31。“特异性结合”或“选择性结合”HTT构造体的抗体是指不结合HTT的所有构造，即不结合至少一种其他构造体的抗体。例如，本文公开了在体外和在从患有HTT淀粉样变性相关疾病和/或病症或有发生HTT淀粉样变性相关疾病和/或病症的风险的患者获得的组织中，均可以偏好性结合到突变和/或聚集形式的HTT的抗体。在本发明的另一个实施方式中，本发明的抗体特异性靶向HTT外显子1的不同区域；参见例如图5、9、12、14、15。由于本发明的抗HTT抗体从人类对象分离，因此它们也可以被称为“人类自体抗体”或“人源抗体”，以便强调那些抗体事实上最初由所述对象表达，并且不是例如利用表达人类免疫球蛋白的噬菌体文库产生的合成构建物或在表达一部分人类免疫球蛋白全部组分的转基因动物中产生的异种抗体，后一种方法到目前为止代表了试图提供类似人类抗体的一种常用方法。另一方面，本发明的人源抗体可以被称为是合成、重组和/或生物技术的，以便将它与可以通过蛋白A或亲和柱纯化的人类血清抗体本身区分开。
然而，本发明的治疗方法的特殊优点在于下述事实，即本发明的抗体源自于没有显示出错误折叠/聚集的HTT的出现或与错误折叠/聚集的HTT相关的疾病的征兆的健康人类对象的B细胞或B记忆细胞，因此有一定可能性能够预防与错误折叠/聚集的HTT相关的临床明显疾病，或降低所述有临床表现疾病发生的风险，或延迟所述有临床表现疾病的发作或进展。通常，本发明的抗体也已成功地经历体细胞成熟，即利用抗体可变区的体细胞可变性以高亲和力结合到靶HTT分子的选择性和有效性方面进行优化。在自体免疫或过敏反应的意义上，这些细胞在体内例如在人类中尚未利用相关或其他生理性蛋白或细胞结构进行活化这一认识，在医学上也是极为重要的，因为这意味着通过临床试验阶段成功留存的机会相当大地增加。可以说，在预防或治疗性抗体的临床前和临床开发之前，效率、可接受性和耐受性已在至少一个人类对象中得到证实。因此可以预期本发明的人类抗HTT抗体，其作为治疗剂的靶结构特异性效率及其降低的副作用概率两者，显著提高了它的临床成功概率。
相反，源自于cDNA文库或噬菌体文库的抗体是人造分子例如人源化抗体，其仍然是鼠类起源的，并因此对人体来说是外来的。因此，治疗性抗体的临床使用和效能可能受到抗药物抗体(ADA)产生的限制，所述抗药物抗体可能影响抗体的效能和药代动力学，并有时引起严重副作用，参见例如Igawa等，MAbs.3(2011),243-252。具体来说，与例如本发明的人源抗体相反，使用最近的人类抗体产生技术产生的人源化抗体易于引起抗体反应，并且这些源自于例如噬菌体展示的类似人类的抗体例如阿达木单抗已被报道诱导ADA产生，参见例如Mansour,Br.J.Ophthalmol 91(2007),274-276和Igawa等，MAbs.3(2011),243-252。因此，对于患者来说，不易于引起不想要的免疫应答的人源抗体比源自于文库或展示的人造分子更加有益。
术语“肽”被理解为在其意义内包括术语“多肽”和“蛋白质”(其有时可以在本文中互换使用)。同样地，也设想了蛋白质和多肽的片段，并且它们在本文中可以被称为“肽”。然而，术语“肽”优选地表示包含至少5个连续氨基酸、优选地至少10个连续氨基酸、更优选地至少15个连续氨基酸、更优选地至少20个连续氨基酸、特别优选地至少25个连续氨基酸的氨基酸聚合物。此外，符合本发明的肽通常具有不超过100个连续氨基酸，优选地少于80个连续氨基酸，更优选地少于50个连续氨基酸。
多肽：
当在本文中使用时，术语“多肽”打算涵盖单个“多肽”和多个“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不指称特定的产物长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指称两个或多个氨基酸的链的任何其他术语，被包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任一者使用或与其互换使用。
术语“多肽”还打算指称多肽的表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化和通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以源自于天然生物来源或通过重组技术生产，但不必定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明的多肽的大小可以是约3或更多个、5或更多个、10或更多个、20或更多个、25或更多个、50或更多个、75或更多个、100或更多个、200或更多个、500或更多个、1,000或更多个或2,000或更多个氨基酸。多肽可能具有确定的三维结构，尽管它们不必定具有这种结构。具有确定三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有确定三维结构而是可以采纳大量不同构象的多肽被称为未折叠的。当在本文中使用时，术语糖蛋白是指偶联到至少一个糖类基团的蛋白质，所述糖类基团通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链附连到所述蛋白质。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指多肽不处于其天然环境中。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其本源或天然环境中取出。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白质被认为是分离的，已通过任何适合的技术分离、分级或部分或显著纯化的本源或重组多肽也是如此。
“重组肽、多肽或蛋白”是指通过重组DNA技术生产的肽、多肽或蛋白，即从用编码包含目标肽的融合蛋白的外源重组DNA表达构建物转化的细胞、微生物或哺乳动物生产。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽通常不含聚糖。在酵母中表达的蛋白质或多肽可能具有与在哺乳动物细胞中表达的不同的糖基化模式。
作为本发明的多肽，包括了上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有与天然肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的肽和多肽。术语“足够相似”意味着第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列含有足够或最低数目的同一或等效氨基酸残基，使得所述第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的共同结构域的氨基酸序列，在本文中被定义为足够相似。优选地，变体将与本发明的优选肽的氨基酸序列，特别是与HTT、其任一者的变体、衍生物或类似物足够相似。这些变体通常保留本发明的肽的功能活性。变体包括在氨基酸序列上与相应的本源和野生型肽相差一个或多个氨基酸缺失、添加和/或置换的肽。它们可以是天然存在的变体和人工设计的变体。
此外，当指称本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括至少保留了对应的本源结合分子、抗体或多肽的一些抗原结合性质的任何多肽。除了在本文中别处讨论的特定抗体片段之外，本发明的多肽的片段还包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，并且还包括由于氨基酸置换、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或非天然存在。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可以包含保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。HTT特异性结合分子例如本发明的抗体和抗体多肽的衍生物，是已被改变以便表现出在本源多肽上不存在的其他特点的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中也可以被称为“多肽类似物”。当在本文中使用时，结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有通过功能性侧基的反应而被化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。作为“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可以替换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替换组氨酸；高丝氨酸可以替换丝氨酸；鸟氨酸可以替换赖氨酸。
分子的相似性和/或同一性的确定：
两个肽之间的“相似性”通过将一个肽的氨基酸序列与第二个肽的序列进行比较来确定；参见实施例35和图36。如果一个肽的氨基酸与第二个肽的对应氨基酸是同一的或者是保守氨基酸置换，则两者是相似的。保守置换包括在Dayhoff,M.O.主编的《蛋白质序列和结构图集5》(The Atlas of Protein Sequence and Structure 5)NationalBiomedical Research Foundation,Washington,D.C.(1978)和Argos,EMBO J.8(1989),779-785中所描述的。例如，属于下列组之一的氨基酸代表了保守的变化或置换：-Ala，Pro，Gly，Gln，Asn，Ser，Thr；-Cys，Ser，Tyr，Thr；-Val，Ile，Leu，Met，Ala，Phe；-Lys，Arg，His；-Phe，Tyr，Trp，His；和-Asp，Glu。
两个多核苷酸之间的“相似性”通过将一个多核苷酸的核酸序列与另一个多核苷酸的序列进行比较来确定。如果一个多核苷酸的核酸与第二个多核苷酸的对应核酸同一，或者如果所述核酸是编码序列的一部分，包含所述核酸的相应三联体编码相同的氨基酸或保守的氨基酸置换，则两者是相似的。
两个序列之间的百分同一性或相似性的确定，优选地使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877的数学算法来完成。这种算法被并入到Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中，所述程序可以在NCBI获得(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
百分同一性或相似性的确定使用用于BLAST多核苷酸搜索的BLASTn程序和用于BLAST蛋白质搜索的BLASTp程序的标准参数来进行，正如在NCBI网页上和“BLAST程序选择指南”中对于特定长度和组成的序列所推荐的。
BLAST多核苷酸搜索使用BLASTn程序来进行。
对于通用参数来说，可以将“最大靶序列”框设定到100，可以勾选“短查询”框，可以将“预期阈值”框设定到1000，并且可以将“字长”框设定到7，正如在NCBI网页上对短序列(小于20个碱基)所推荐的。对于较长序列来说，可以将“预期阈值”框设定到10，并且可以将“字长”框设定到11。对于评分参数来说，可以将“匹配/错配分值”设定到1、-2，并且可以将“空位罚分”框设定到线性。对于过滤和掩膜参数来说，可以不勾选“低复杂度区域”框，可以不勾选“种特异性重复序列”框，可以勾选“仅仅用于查找表的掩膜”框，可以勾选“DUST过滤设置”，并且可以不勾选“掩盖小写字母”框。一般来说，就此而言可以使用“搜索短的近乎精确的匹配”，其提供大多数上面指明的设置。关于这一方面的进一步信息，可以在NCBI网页上发表的“BLAST程序选择指南”中找到。
BLAST蛋白搜索使用BLASTp程序来进行。对于通用参数来说，可以将“最大靶序列”框设定到100，可以勾选“短查询”框，可以将“预期阈值”框设定到10，并且可以将“字长”框设定到3。对于评分参数来说，可以将“矩阵”框设定到“BLOSUM62”，可以将“空位罚分”框设定到“存在：11扩展：1”，可以将“组成调整”框设定到“条件性组成评分矩阵调整”。对于过滤和掩膜参数来说，可以不勾选“低复杂度区域”框，可以不勾选“仅仅用于查找表的掩膜”框，并且可以不勾选“掩盖小写字母”框。
两种程序的修改，例如在被搜索序列的长度方面的修改，按照NCBI网页上以HTML和PDF版本发表的“BLAST程序选择指南”中的推荐来进行。
多核苷酸：
术语“多核苷酸”打算涵盖单个核酸和多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建物，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，例如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸”是指多核苷酸中存在的任一或多个核酸区段例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指以从其本源环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，载体中包含的编码抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录本。符合本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生产的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
当在本文中使用时，“编码区”是核酸的由翻译成氨基酸的密码子构成的部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但它可以被当作编码区的一部分，而任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等，不是编码区的一部分。两个或更多个本发明的编码区可以存在于单一多核苷酸构建物中，例如在单一载体上，或存在于分开的多核苷酸构建物中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可能含有单一编码区，或者可能包含两个或更多个编码区，例如，单一载体可能分开地编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其被融合或未融合到编码结合分子、抗体或其片段、变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于特化的元件或基序例如分泌信号肽或异源功能结构域。
在某些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括启动子和/或与一个或多个编码区可操作关联的其他转录或翻译控制元件。可操作关联是指基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调控序列相关联，使得将所述基因产物的表达置于所述调控序列的影响或控制之下的情况。两个DNA片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)，如果启动子功能的诱导导致编码目标基因产物的mRNA的转录，并且如果所述两个DNA片段之间的连锁的本质不干扰表达调控序列指导所述基因产物表达的能力或者不干扰DNA模板被转录的能力，则它们是“可操作关联的”或“可操作连接的”。因此，如果启动子能够执行编码多肽的核酸的转录，则所述启动子区与所述核酸可操作关联。所述启动子可以是仅在预定细胞中指导DNA的显著转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与所述多核苷酸可操作关联以指导细胞特异性转录。适合的启动子和其他转录控制区在本文中公开。
对于本领域技术人员来说，各种不同的转录控制区是已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自于巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A相连)、猿猴病毒40(早期启动子)和反转录病毒(例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自于脊椎动物基因例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白的转录控制区，以及能够在真核细胞中控制基因表达的其他序列。其他适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如可以被干扰素或白介素诱导的启动子)。
同样地，对于本领域技术人员来说，各种不同的翻译控制元件是已知的。这些元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及源自于小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也被称为CITE序列)。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸是RNA，例如采取信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的其他编码区相关联，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，其在生长的蛋白链跨过粗面型内质网的输出已被启动后从成熟的蛋白质上切下。本领域普通技术人员认识到，由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合到所述多肽的N-端的信号肽，其从完整或“全长”多肽上切下，以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方式中，使用本源信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留了指导与其可操作关联的多肽分泌的能力的功能衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人类组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。
当在本发明的背景中使用时，“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但是也可以指称结合于HTT的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、锚蛋白、主要组织相容性复合物(MHC)分子、伴侣蛋白例如热休克蛋白(HSP)以及细胞-细胞粘附分子例如钙粘蛋白、整合蛋白、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅仅为了清楚起见而不限制本发明的范围，大多数下述实施方式针对抗体和抗体样分子进行讨论，它们代表了用于开发治疗和诊断药剂的优选结合分子。
抗体：
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白是至少包含重链的可变结构域的结合分子，并且通常至少包含重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构被相对好地理解；参见例如Harlow等，《抗体实验指南》(Antibodies:A Laboratory Manual)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，1988)。
正如将在下面更详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包含在生物化学上可区分的各种广泛类型的多肽。本领域技术人员将会认识到，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，在它们之中具有一些亚类(例如γ1-γ4)。正是这条链的本质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被良好地表征，并且已知提供了功能特殊性。专业技术人员根据本公开可以容易地分辨每种这些类型和同种型的修改的版本，因此它们在本发明的范围之内。所有免疫球蛋白类型清楚地在本发明的范围之内，并且下面的讨论一般来说针对免疫球蛋白分子的IgG类型。对于IgG来说，标准的免疫球蛋白分子包含两条同一的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽和两条同一的分子量为53,000-70,000的重链多肽。所述四条链通常被二硫键连接成“Y”构型，其中轻链在“Y”的开口处开始并继续通过可变区与重链括在一起。
轻链被分类为κ或λ。每种重链类型可以与κ或λ轻链结合。一般来说，轻链和重链彼此共价键合，并且两条重链的“尾部”通过共价二硫键彼此键合，或者当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞产生时通过非共价键彼此键合。在重链中，氨基酸序列的走向是从Y构型的分叉端处的N-端向每条链底部处的C-端。
轻链和重链两者都被分成结构和功能同源的区。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。就此而言，应该认识到，轻链(VL)和重链(VH)部分两者的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予了重要的生物学性质例如分泌、跨胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，当恒定区结构域变得更远离抗原结合位点或抗体的氨基端时，其编号增加。N-端部分是可变区，C-端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。正如上面指明的，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域或互补性决定区(CDR)的子集组合，形成定义了三维抗原结合位点的可变区。这种四元抗体结构形成出现在Y的每个臂的末端处的抗原结合位点。更具体来说，抗原结合位点由每个VH和VL链上的三个CDR定义。含有足够的结构以特异性结合HTT的任何抗体或免疫球蛋白片段，在本文中可互换地被称为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包含存在于每个抗原结合结构域中的6个超变区，有时被称为“互补性决定区”或“CDR”，它们是短的、不连续的氨基酸序列，被特异性定位以便当所述抗体在水性环境中呈现其三维构型时，形成抗原结合结构域。“CDR”的侧翼具有4个相对保守的“构架”区或“FR”，其表现出较低的分子间变化性。构架区主要采取β-片层构造，并且CDR形成连接β-片层结构的环，并且在某些情况下形成β-片层结构的一部分。因此，构架区起到形成支架的作用，通过链间非共价相互作用提供CDR以正确取向的定位。由定位的CDR形成的抗原结合结构域定义了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这个互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地为任何给定的重链可变区或轻链可变区分别鉴定包含CDR和构架区的氨基酸，因为它们已被精确地定义；参见《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，Kabat,E.等，U.S.Department of Health and Human Services(1983)；以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196(1987)，901-917，所述文献整体通过参考并入本文。
在术语存在两种或更多种在本领域内使用和/或接受的定义的情况下，本文中使用的所述术语的定义打算包含所有这些定义，除非明确陈述不是如此。一个具体实例是术语“互补性决定区”(“CDR”)，其用于描述重链和轻链多肽两者的可变区内存在的不连续的抗原结合位点。该特定区域已被通过参考并入本文的Kabat等，U.S.Dept.of Health andHuman Services，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，(1983)以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196(1987)，901-917描述，其中定义包括当相互比较时交叠的氨基酸残基或其子集。然而，使用任一定义指称抗体或其变体的CDR都打算涵盖在本文中定义和使用的术语的范围之内。将涵盖了由每个上面引用的参考文献所定义的CDR的适合的氨基酸残基列在下面的表1中作为比较。涵盖特定CDR的准确的残基数目随着CDR的序列和大小而变。在提供有抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包括人类IgG亚型抗体的特定超变区或CDR。
表I：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表I中所有的CDR定义的编号方式遵照由Kabat等提出的编号惯例(参见下文)。
Kabat等还定义了适用于任何抗体的用于可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依靠序列本身之外的任何实验数据，毫不含糊地将这种“Kabat编号”系统指派给任何可变结构域序列。当在本文中使用时，“Kabat编号”是指由Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，(1983)提出的编号系统。除非另有指明，否则对本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中特定氨基酸残基位置的编号的指称，遵照所述Kabat编号系统，然而这种系统是理论上的，并且可能不同等地适用于本发明的每种抗体。例如，取决于第一CDR的位置，随后的CDR可能在任一方向上迁移。
除非指称作为本发明的特别优选的实施方式的人源单克隆抗体或其抗原结合片段、合成或生物技术衍生物，否则本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化、灵长动物源化、鼠源化或嵌合的抗体，单链抗体，表位结合片段例如Fab、Fab'和F(ab’)2，Fd，Fv，单链Fv(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fv(sdFv)，包含VL或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本文中公开的抗体的抗Id抗体)。ScFv分子在本领域中是已知的，并且描述在例如美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
在一个实施方式中，本发明的抗体不是IgM或其具有5价结构的衍生物。特别地，在本发明的特定应用、特别是治疗性应用中，IgM与IgG和其他二价抗体或相应的结合分子相比不太有用，这是因为IgM由于其5价结构和缺少亲和成熟而常常显示出非特异性交叉反应性和非常低的亲和性。
在特别优选实施方式中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即它基本上由一种特定抗体物质构成，而不是从血清免疫球蛋白样品获得的混合物。
抗体片段、包括单链抗体，可以包含单独的可变区或与全部或一部分下述区域组合的可变区：铰链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明中还包括包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合的HTT结合片段。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以来自于任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，所述抗体是人类、鼠类、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、羊驼、马或鸡抗体。在另一个实施方式中，所述可变区可以是软骨鱼类起源的(例如来自于鲨鱼)。
在一种情况下，本发明的抗体是从人类分离的人源单克隆抗体，其中表达所述抗体的B细胞从人类分离，并且进而所述抗体或优选地编码可变结构域的cDNA和任选地编码同源恒定结构域的cDNA从人类分离。任选地，按照数据库中的相关人类种系可变区序列将人类抗体的构架区对齐并采纳；参见例如主机位于MRC蛋白工程化中心(MRC Centre forProtein Engineering)(剑桥,UK)的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)(http://www.vbase2.org/)。例如，被认为可能偏离真正种系序列的氨基酸可能是由克隆过程中掺入的PCR引物序列造成的。与人工产生的类似人类的抗体例如来自于噬菌体展示的抗体文库或异种小鼠的单链抗体片段(scFv)相比，本发明的人类单克隆抗体的特征在于：(i)使用人类免疫应答而不是动物替代物的免疫应答来获得，即所述抗体在人体中在针对处于其相关构造下的天然HTT的应答中产生；(ii)已保护所述个体或HTT的存在处于最不显著的状态下；以及(iii)由于抗体是人类起源的，因此针对自身抗原的交叉反应性风险降至最低。因此，根据本发明，术语“人类单克隆抗体”、“人类单克隆自体抗体”、“人类抗体”等被用于表示人类起源的，即从人类细胞例如B细胞或其杂交瘤分离的，或者其cDNA是从人类细胞例如人类记忆性B细胞的mRNA直接克隆的HTT结合分子。所述人类抗体仍然是“人类的”，即人源的，即使在所述抗体中制造了氨基酸置换以例如提高结合特性。在这种情况下，也参见下文的讨论，与人源化抗体和其他类似人类的抗体相反，本发明的人源抗体的特征在于包含已被人体发现的CDR，因此基本上避免了具有免疫原性的风险。因此，本发明的抗体如果其可变轻链和可变重链中的一者或两者的至少一个、优选地两个并且最优选地所有三个CDR源自于本文中说明的人类抗体的话，仍然可以被称为是人源的。
在一个实施方式中，本发明的人源抗体包含与天然存在的抗体相比异源的区域，例如构架区中的氨基酸置换、外源融合到可变区的恒定区、在C-或N-末端处的不同氨基酸等。
如下文和例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598中所描述的源自于人类免疫球蛋白文库或源自于用一种或多种人类免疫球蛋白转基因但不表达内源免疫球蛋白的动物的抗体，被称为类似人类的抗体，以便将它们与本发明的真正人类抗体区分开。
例如，通常从噬菌体展示分离到的类似人类的抗体例如合成和半合成的抗体的重链和轻链的配对，不必定反映出当它在原始人类B细胞中存在时的原始配对。因此，在现有技术中常用的从重组表达文库获得的Fab和scFv片段可以被当作是人造的，具有对免疫原性和稳定性的所有可能的相关影响。
相反，本发明提供了从所选人类对象分离的亲和成熟的抗体，其特征在于它们在人类中的治疗用途和耐受性。
当在本文中使用时，术语“啮齿动物源化抗体”或“啮齿动物源化免疫球蛋白”是指包含来自于本发明的人类抗体的一个或多个CDR，以及含有基于啮齿动物抗体序列的氨基酸置换和/或缺失和/或插入的人类构架区的抗体。当提到啮齿动物时，优选地使用起源于小鼠和大鼠的序列，其中包含这些序列的抗体分别被称为“鼠源化”或“大鼠源化”。提供所述CDR的人类免疫球蛋白被称为“亲代”或“受体”，提供构架变化的啮齿动物抗体被称为“供体”。恒定区不一定存在，但是如果它们存在的话，它们通常与啮齿动物抗体的恒定区基本上同一，即至少约85％至90％、优选地约95％或更高的同一性。因此，在某些实施方式中，全长鼠源化人类重链或轻链免疫球蛋白含有小鼠恒定区、人类CDR和具有几个“鼠源化”氨基酸置换的基本上人类的构架。通常，“鼠源化抗体”是包含鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体将不涵盖典型的嵌合抗体，因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。已通过“鼠源化”过程“鼠源化”的修饰抗体与提供CDR的亲代抗体结合相同的抗原，并且与亲代抗体相比在小鼠中的免疫原性通常更低。上述关于“鼠源化”抗体的解释类似地适用于“啮齿动物源化”抗体，例如“大鼠源化抗体”，其中代替小鼠使用大鼠的序列。
当在本文中使用时，术语“重链部分”包括源自于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含下列至少一者：CH1结构域，铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可以包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链；或包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，用于本发明的结合多肽可能缺少至少一部分CH2结构域(例如全部或部分CH2结构域)。正如上文提出的，本领域普通技术人员应该理解，这些结构域(例如重链部分)可以被修饰，使得它们的氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
在本文公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与所述多聚体的第二多肽链的重链部分同一。或者，本发明的含有重链部分的单体不同一。例如，每个单体可以包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体或双功能抗体。
当在本文中使用时，术语“双特异性”或“双功能”抗体分子是具有两个不同表位/抗原结合位点，并因此对两种不同靶表位具有结合特异性的抗体分子。这两个表位可以是相同抗原或不同抗原的表位。与其相反，“二价抗体”可能具有抗原特异性一致的结合位点。制造双特异性抗体的方法在本领域中是已知的，例如实施例36中所示的两种不同单克隆抗体的化学偶联，或例如两个抗体片段如两个Fab片段的化学偶联(Brennan等，Science 229(1985),81-83；Nitta等，Eur.J.Immunol.19(1989),1437-1441；Glennie等，J.Immunol.139(1987),2367-2375；Jung等，Eur.J.Immunol.,21(1991),2431-2435)。或者，双特异性抗体可以重组制造(Gruber等，J.Immunol.152(1994),5368-5374；Kurucz等，J.Immunol.154(1995),4576-4582；Mallender和Voss，J.Biol.Chem.269(1994),199-206)。传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的结合特异性。由于重链和轻链的随机组合，产生了10种不同抗体结构的潜在混合物，其中只有一种具有所需结合特异性(Milstein和Cuello，Nature 305(1983),537-540；Lanzavecchia和Scheidegger，Eur.J.Immunol.17(1987),105–111)。一种可替选方法包括将具有所需结合特异性的可变结构域融合到包括至少一部分铰链区、CH2和CH3区的重链恒定区。在一个实施方式中，在至少一个融合体中存在含有轻链结合所必需的位点的CH1区。将编码这些融合体以及如果需要的话编码所述轻链的DNA插入到分开的表达载体中，然后共转染到适合的宿主生物体中。可以设想将两条或所有三条链的编码序列插入到一个表达载体中。
在另一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物由单一多肽链例如scFv构成，并且将在细胞内表达(胞内抗体)，用于潜在的体内治疗和诊断应用。
本文公开的在诊断和治疗方法中使用的结合多肽的重链部分可以源自于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含源自于IgG1分子的CH1结构域和源自于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分源自于IgG1分子并部分源自于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分源自于IgG1分子并部分源自于IgG4分子的嵌合铰链。
当在本文中使用时，术语“轻链部分”包括源自于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包含VL或CL结构域中的至少一者。
抗体的肽或多肽表位的最小尺寸据认为约为4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选地含有至少7个、更优选地至少9个、最优选地至少约15至约30个之间的氨基酸。由于CDR可以识别处于三级形式下的抗原性肽或多肽，因此构成表位的氨基酸不一定是连续的，并且在某些情况下，甚至可能不在同一肽链上。在本发明中，被本发明的抗体识别的肽或多肽表位含有HTT、特别是外显子1的N-末端区、polyP区、富P区或C-末端区的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或约15至约30个之间的连续或不连续氨基酸的序列。
“特异性结合”或“特异性识别”在本文中可互换使用，通常意味着结合分子例如抗体通过其抗原结合结构域结合到表位，并且所述结合需要抗原结合结构域与表位之间的一定互补性。按照这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域结合到表位比它结合到随机的无关表位更加容易时，所述抗体被称为“特异性结合到”所述表位。术语“特异性”在本文中被用于描述某个抗体结合于某个表位的相对亲和性。例如，抗体“A”可能被视为与抗体“B”相比对给定表位具有更高的特异性，或者抗体“A”被称为以比它对相关的表位“D”更高的特异性结合于表位“C”。
当存在时，术语抗体与抗原的“免疫学结合特性”或其他结合特性，在其所有语法形式下，是指抗体的特异性、亲和性、交叉反应性和其他结合特性。
“偏好性结合”意味着结合分子例如抗体与某个表位的特异性结合与它与相关、相似、同源或类似表位的结合相比更加容易。因此，“偏好性结合到”给定表位的抗体与相关表位相比更容易结合到该表位，尽管这种抗体可能与所述相关表位交叉反应。
作为非限制性实例，结合分子例如抗体如果与第一表位结合的解离常数(KD)小于所述抗体对第二表位的KD，则可以被认为偏好性结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比所述抗体对第二表位的KD低至少一个数量级，则可以被认为偏好性结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比所述抗体对第二表位的KD低至少两个数量级，则可以被认为偏好性结合所述第一表位。
在另一个非限制性实例中，结合分子例如抗体如果结合第一表位的脱离速率(k(off))小于所述抗体对第二表位的k(off)，则可以被认为偏好性结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比所述抗体对第二表位的k(off)低至少一个数量级，则可以被认为偏好性结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比所述抗体对第二表位的k(off)低至少两个数量级，则可以被认为偏好性结合所述第一表位。
本文中公开的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以被称为以小于或等于5x 10-2sec-1、10-2sec-1、5x l0-3sec-1或l0-3sec-1的脱离速率(k(off))结合HTT或其片段、变体或特定构象。更优选地，本发明的抗体可以被称为以小于或等于5x 10-4sec-1、10-4sec-1、5x 10-5sec-1或10-5sec-1、5x 10-6sec-1、10-6sec-1、5x 10-7sec-1或10-7sec-1的脱离速率(k(off))结合HTT或其片段、变体或特定构象。
本文中公开的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以被称为以大于或等于103M-1sec-1、5x 103M-1sec-1、104M-1sec-1或5x 104M-1sec-1的结合速率(k(on))结合HTT或其片段、变体或特定构象。更优选地，本发明的抗体可以被称为以大于或等于105M- 1sec-1、5x 105M-1sec-1、106M-1sec-1或5x 106M-1sec-1或107M-1sec-1的结合速率(k(on))结合HTT或其片段、变体或特定构象。
结合分子例如抗体如果偏好性结合到给定表位使其达到阻断参比抗体与所述表位的结合的程度，则被称为竞争性抑制所述参比抗体与所述表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域中已知的任何方法例如竞争ELISA测定法来确定。抗体可以被称为将所述参比抗体与给定表位的结合竞争性抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
当在本文中使用时，术语“亲和性”是指单个表位与结合分子例如免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的度量；参见例如Harlow等，《抗体实验指南》(Antibodies:A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版(1988)，第27-28页。当在本文中使用时，术语“亲和力”是指免疫球蛋白群体与抗原之间的复合体的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度；参见例如Harlow等的文献第29-34页。亲和力既涉及群体中的各个免疫球蛋白分子与特定表位的亲和性，也涉及免疫球蛋白和抗原的价数。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构的抗原之间的相互作用，将是具有高亲和力的相互作用。抗体对抗原的亲和性或亲和力可以使用任何适合的方法实验确定；参见例如Berzofsky等，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)中的“抗体-抗原相互作用”(Antibody-Antigen Interactions)，Paul,W.E.主编，Raven Press New York,N Y(1984)；Kuby，《Janis免疫学》(Janis Immunology)，W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992)；以及本文中描述的方法。用于测量抗体对抗原的亲和性的通用技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振。如果在不同条件例如盐浓度、pH下测量，特定抗体-抗原相互作用的实测亲和性可能不同。因此，亲和性和其他抗原结合参数例如KD、IC50的测量，优选地使用标准化的抗体和抗原溶液和标准化的缓冲液进行。
本发明的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，也可以根据它们的交叉反应性来描述或说明。当在本文中使用时，术语“交叉反应性”是指特异性针对一种抗原的抗体与第二种抗原反应的能力，是两种不同抗原性物质之间的相关性的度量。因此，如果抗体结合到诱导它形成的表位之外的其他表位，则所述抗体是交叉反应性的。所述交叉反应表位通常含有许多与所述诱导表位相同的互补性结构特点，并且在某些情况下可能事实上比原始表位更好地契合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合与参比表位相关但不同一的表位，例如与参比表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(正如使用本领域中已知并在本文中描述的方法所计算的)的表位。如果抗体不结合与参比抗体具有低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％和低于50％同一性(正如使用本领域中已知并在本文中描述的方法所计算的)的表位，则所述抗体可以被称为具有很低或没有交叉反应性。如果抗体不结合某个表位的任何其他类似物、直向同源物或同源物，则所述抗体可以被视为对所述表位是“高度特异的”。
本发明的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以根据它们对HTT和/或突变、错误折叠和/或聚集的HTT物质和/或其片段的结合亲和性来描述或说明。优选的结合亲和性包括具有低于5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10-4M、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x 10-12M、10-12M、5x 10-13M、10-13M、5x 10-14M、10-14M、5x 10-15M或10-15M的解离常数或Kd的结合亲和性。
正如前面指明的，各种不同免疫球蛋白类型的恒定区的亚基结构和三维构型是公知的。当在本文中使用时，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最靠氨基端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基端。
当在本文中使用时，术语“CH2结构域”包括重链分子的例如使用常规编号系统时从抗体的约244号残基延伸到360号残基(244至360号残基，Kabat编号系统；以及231-340号残基，EU编号系统；参见Kabat EA等，同上)的部分。CH2结构域的独特之处在于它不与另一个结构域紧密配对。相反，两条N-连接的分枝糖链插入在完整的本源IgG分子的两个CH2结构域之间。也十分清楚地阐明，CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C-端，并包含大约108个残基。
当在本文中使用时，术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域联结到CH2结构域的部分。该铰链区包含大约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N-端抗原结合区独立地移动。铰链区可以被细分成三个不同结构域：上、中和下铰链结构域；参见Roux等，J.Immunol.161(1998),4083-4090。
当在本文中使用时，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸含有硫醇基，其可以与第二个硫醇基形成二硫键或与其桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键相连，并且两条重链通过使用Kabat编号系统对应于239和242位置(226或229位置，EU编号系统)处的两个二硫键相连。
当在本文中使用时，术语“连接”、“融合”可互换使用。这些术语是指两个或更多个元件或组分通过包括化学偶联或重组手段的任何手段联结在一起。“框内融合”是指两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)联结形成连续的更长的ORF，其方式使得原始ORF的正确翻译阅读框得以维持。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多个区段的单一蛋白，所述区段对应于由原始ORF编码的多肽(所述区段在自然界中通常不是如此联结的)。尽管阅读框由此被制造成在整个融合的区段中是连续的，但所述区段可能在物理上或空间上被例如框内连接序列分隔开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以框内融合到编码至少一个免疫球蛋白构架区或其他CDR区的多核苷酸，但与后者分隔开，只要所述“融合的”CDR被共同翻译成连续多肽的一部分即可。
当在本文中使用时，术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如RNA或多肽的过程。所述过程包括所述基因在细胞内的功能性存在的任何表象，包括但不限于基因敲落以及瞬时表达和稳定表达两者。它包括但不限于基因转录成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及mRNA翻译成多肽。如果最终目标产物是生物化学物质，则表达包括产生该生物化学物质和任何前体。基因的表达产生“基因产物”。当在本文中使用时，基因产物可以是核酸例如由基因的转录产生的信使RNA，或者是从转录本翻译的多肽。本文中描述的基因产物还包括具有转录后修饰例如多腺苷化的核酸，或具有翻译后修饰例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白亚基缔合、蛋白水解切割等的多肽。
当在本文中使用时，术语“样品”是指从对象或患者获得的任何生物材料。在一种情况下，样品可以包含血液、腹膜液、CSF、唾液或尿液。在其他情况下，样品可以包含全血、血浆、血清、从血样富集的B细胞和培养的细胞(例如来自于对象的B细胞)。样品还可以包括活检样品或组织样品包括神经组织。在其他情况下，样品可以包含完整细胞和/或细胞的裂解物。血样可以通过本领域中已知的方法收集。在一种情况下，可以通过在4℃下在200μl缓冲液(20mM Tris，pH.7.5，0.5％Nonidet，1mM EDTA，1mM PMSF，0.1M NaCl，IX Sigma蛋白酶抑制剂，和IX Sigma磷酸酶抑制剂1和2)中涡旋振荡，将细胞沉淀重悬浮。可以将悬液在冰上保持20分钟并间歇涡旋振荡。在约4℃下以15,000x g离心5min后，可以将上清液的等分试样储存在约-70℃。
疾病：
除非另有陈述，否则术语“病症”和“疾病”在本文中可互换使用，并且包括对象、动物、分离的器官、组织或细胞/细胞培养物中的任何不想要的生理变化。
亨廷顿病(HD)是一种常染色体显性的进行性神经退行性疾病，其特征在于亨廷顿蛋白(HTT)基因内CAG三核苷酸重复序列的扩增(Huntington's Disease CollaborativeResearch Group,Cell 72(6)(1993),971–983)，其中这种扩增的病理阈值大约为37个重复序列，而低于该数目的较少重复序列不引起病理发生，参见例如Trottier等，Nature 378(6555)(1995),403–406。CAG三核苷酸重复序列的扩增在亨廷顿蛋白(HTT)的氨基端中产生扩增的多谷氨酰胺(Poly-Gln，Poly-Q)区段，其与HTT的聚集相关。然而，引起HTT积累及其相关症状的准确机制到目前为止尚未被阐明。
研究显示，多谷氨酰胺(Poly-Q)区段的两个侧翼区域，即由两亲性α-螺旋靶向结构域构成的氨基端区域和以两个脯氨酸区段(Poly-P区)和富亮氨酸-脯氨酸区段(富P区)为特征的羧基端区域，在介导突变的HTT的毒性中似乎是关键的，参见例如Caron等，PNAS110(2013),14610–14615。
造成HD的病理症状例如运动机能亢进、运动机能减退、精神和运动病症包括影响和内驱力紊乱、缺乏运动持续性、轻率和冲动行为、放弃和抑郁、视觉信息处理病症、皮层下痴呆、认知能力丧失、定向障碍和寡言、妄想、手臂、腿、面部、头部和躯干的躁动、舞蹈病运动过度、构音障碍、吞咽困难、口吃、肌张力障碍的机制，到目前为止尚未被阐明。可能的机制包括但不限于由HTT的扩增的Poly-Q区段造成的铰链区柔性降低以及蛋白酶，所述蛋白酶由于扩增的Poly-Q区段而导致形成不同的HTT片段。
由于本发明的抗体已被显示在HD小鼠模型中是治疗有效的，参见例如实施例24和图17以及实施例34和图34，此外能够结合到来自于HD患者的组织切片中的HTT淀粉样肽，参见例如实施例31和图27-30，因此所述人源抗体及其生物技术衍生物在HD和上述症状的治疗和诊断两者中都是有用的。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体、与其任一者具有基本上相同的结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞被用于制备药物或诊断组合物，用于HD、特别是HTT淀粉样变性疾病和/或病症的预防性和/或治疗性治疗，用于监测疾病进展和/或治疗反应，并用于与HTT淀粉样变性相关的疾病的诊断。
治疗：
当在本文中使用时，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或预防性措施两者，其中目的是阻止或减缓(减轻)不想要的生理变化或病症，例如心脏缺陷的发生。有益或所需的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度降低、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(不论是部分还是完全的)，不论是否可检测。“治疗”也可以意味着与如果不接受治疗的预期存活期相比存活期延长。需要治疗的对象包括已经具有症状或病症的对象以及易于患有所述症状或病症的对象或将要预防所述症状或病症的显现的对象。
如果没有另外陈述，术语“药物”、“医药”或“药品”在本文中可互换使用，并且应该包括但不限于所有下述项：(A)用于内用或外用的物品、医药和制备物，以及旨在用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类或其他动物的疾病的任何物质或物质的混合物；(B)旨在影响人类或其他动物的身体的结构或任何功能的物品、医药和制备物(食品之外)；以及(C)旨在用作条款(A)和(B)中指明的任何物品的组分的物品。术语“药物”、“医药”或“药品”应该包括旨在用于人类或其他动物的制备物的完整配方，其含有一种或多种“药剂”、“化合物”、“物质”或“(化学)组合物”，并且在某些其他情况下还含有其他无活性药物赋形剂例如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂，或确保所述“药物”、“医药”或“药品”在人类或其他动物身体内的目标靶位置处例如皮肤处、胃或肠内的易于运输、崩解、解聚、溶解和生物可利用性的物质。术语“药剂”、“化合物”或“物质”在本文中可互换使用，并且在更特定情况下应该包括但不限于所有药物活性药剂，即诱导所需生物或药理效果或通过本发明的方法被调查或试验诱导这些可能的药理效果的能力的药剂。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象例如人类患者。
药物载体：
可药用载体和给药途径可以从本领域技术人员已知的相应文献获取。本发明的药物组合物可以按照本领域中公知的方法来配制；参见例如《Remington：药物学科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(2000)，the University ofSciences in Philadelphia，ISBN 0-683-306472；《疫苗方案》(Vaccine Protocols)，第二版，Robinson等，Humana Press,Totowa,New Jersey,USA,2003；Banga，《治疗性肽和蛋白质：配制、加工和递送系统》(Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems)，第二版，Taylor和Francis.(2006),ISBN:0-8493-1630-8。适合的药物载体的实例在本领域中是公知的，并包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液例如水包油乳液、各种不同类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这些载体的组合物可以通过公知的常规方法来配制。这些药物组合物可以适合的剂量给药到对象。适合的组合物的给药可以通过不同方式来实施。实例包括通过口、鼻内、直肠、表面、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮下、透皮、鞘内和颅内方法给药含有可药用载体的组合物。气溶胶配方例如鼻喷剂配方包括含有防腐剂和等渗剂的活性药剂的纯化的水性或其他溶液。这些配方优选地被调整到与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。在本发明中也设想了用于口服给药的药物组合物，例如单结构域抗体分子(例如“nanobodiesTM”)等。这些口服配方可以采取片剂、胶囊、粉剂、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体例如明胶或辅料。用于直肠或阴道给药的配方可以呈现为具有适合载体的栓剂；也参见O'Hagan等，Nature Reviews,Drug Discovery 2(9)(2003),727-735。关于适用于各种不同给药类型的配方的进一步指导，可以在《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，Mace PublishingCompany,Philadelphia,PA，第17版(1985)和相应的更新中找到。对于药物递送方法的简单综述，参见Langer,Science 249(1990),1527-1533。
II.本发明的抗体
本发明总的来说涉及人源抗HTT抗体及其HTT结合片段，它们优选地表现出对实施例中说明的抗体所概括的免疫结合特性和/或生物学性质。根据本发明，特异性针对HTT的人类单克隆抗体从一组健康人类对象的B细胞克隆。然而，在本发明的另一个实施方式中，所述人类单克隆抗HTT抗体也可以从显示出与HTT淀粉样变性相关的疾病和/或病症的症状的患者的B细胞克隆。
在按照本发明进行的实验的过程中，评估了在培养的人类记忆性B细胞的调制培养基中存在的抗体结合到HTT和超过10种其他蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)的能力；参见实施例8、13、18、31和33。只选择在所述筛选中能够结合HTT蛋白但不结合任何其他蛋白的B细胞上清液用于进一步分析，包括抗体类型和轻链亚类的确定。然后对所选的B-细胞进行处理以备抗体克隆。
简单来说，这由下述步骤构成：从所选B-细胞提取信使RNA，通过RT-PCR进行反转录，通过PCR扩增抗体编码区，克隆到质粒载体中并测序。然后通过在HEK293或CHO细胞中重组表达并纯化来生产所选人类抗体，随后表征它们结合人类HTT蛋白的能力。各种不同试验例如抗体在HEK293或CHO细胞中的重组表达和随后它们对人类HTT蛋白的结合特异性的表征，以及它们与病理性突变和/或聚集的形式的鉴别性结合的组合，证实了首次克隆到对HTT高度特异并鉴别性识别和选择性结合HTT蛋白的病理性聚集形式的人类抗体。在某些情况下，在本发明的人类抗体的可变结构域的基础上，还产生了小鼠嵌合抗体。
因此，本发明总的来说涉及重组人源单克隆抗HTT抗体及其HTT结合片段、合成和生物技术衍生物和变体。在本发明的一个实施方式中，所述抗体能够结合人类HTT。
在本发明的一个实施方式中，所述抗体特异性结合HTT的polyP区中的表位，其包含氨基酸序列PPPPPPPP(NI-302.33C11；NI-302.44D7；NI-302.7A8；NI-302.3D8；NI-302.46C9)(SEQ ID No.139、151、154、158、161)、氨基酸序列PPPPPP(NI-302.11H6、NI-302.18A1、NI-302.52C9(SEQ ID No.157、159、160)、氨基酸序列PPPPPPPPPPP(NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.78H12、NI-302.71F6(SEQ ID No.146、147、148、149、150、152、153、155、156)，富P区中的表位，其包含氨基酸序列PQPPPQAQPL(NI-302.63F3，SEQ ID No.140；NI-302.64E5，SEQ ID No.200)、氨基酸序列PPPQLPQPPP(NI-302.31F11，SEQ ID No.141)、氨基酸序列QAQPLLPQPQPPPPP(NI-302.2A2；SEQ ID No.142)或氨基酸序列PPPQLPQPPPQAQPL(NI302.15D3；SEQ ID No.143)，C-末端区中的表位，其包含氨基酸序列PPGPAVAEEPLHRP(NI-302.35C1，SEQ ID No.145)或PPPGPAVAEEPLH(NI-302.72F10，SEQ ID No.202)，N-末端区中的表位，其包含氨基酸序列KAFESLKSFQ(NI-NI-302.15E8，SEQ ID No.144)，或富P/Q区中的表位，其包含氨基酸序列QQQQQQQQQPPP(NI-302.7D8，SEQ ID No.201)，或构象表位。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗HTT抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体相同的HTT的polyP区中的表位，所述参比抗体选自NI-302.33C11、NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.44D7、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.7A8、302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.11H6、NI-302.3D8、NI-302.18A1、NI-302.8F1、NI-302.52C9、NI-302.46C9。表位作图鉴定到人类HTT的polyP区内包括氨基酸PPPPPPPPPPP的序列(SEQ IDNo.146、147、148、149、150、152、153、155、156)作为被本发明的抗体NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.78H12、NI-302.71F6识别的独特线性表位。此外，表位作图鉴定到人类HTT的polyP区内包括氨基酸PPPPPPPP的序列(SEQ ID No.139、151、154、158、161)作为被本发明的抗体NI-302.33C11、NI-302.44D7、NI-302.7A8、NI-302.3D8、NI-302.46C9识别的独特线性表位，并且包括氨基酸PPPPPP的序列(SEQ ID No.157、159、160)作为被本发明的抗体NI-302.11H6、NI-302.18A1、NI-302.52C9识别的独特线性表位。因此，在一个实施方式中提供了本发明的抗体，其中所述抗体特异性结合到HTT的polyP区中的表位，其包含氨基酸序列PPPPPPPPPPP(SEQ ID No.146、147、148、149、150、152、153、155、156)、PPPPPPPP(SEQ ID No.139、151、154、158、161)或PPPPPP(SEQ ID No.157、159、160)。
在一个实施方式中，本发明涉及一种抗HTT抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体相同的HTT的富P区中的表位，所述参比抗体选自NI-302.63F3、NI-302.31F11、NI-302.2A2和NI-302.15D3。表位作图鉴定到人类HTT的富P区内包括氨基酸PQPPPQAQPL的序列(SEQ ID No.140)作为被本发明的抗体NI-302.63F3识别的独特线性表位，包括氨基酸PPPQLPQPPP的序列(SEQ ID No.141)作为被本发明的抗体NI-302.31F11识别的独特线性表位，包括氨基酸PPPQLPQPPP的序列(SEQ IDNo.141)作为被本发明的抗体NI-302.31F11识别的独特线性表位，包括氨基酸QAQPLLPQPQPPPPP的序列(SEQ ID No.142)作为被抗体NI-302.2A2识别的独特线性表位，包括氨基酸PPPQLPQPPPQAQPL的序列(SEQ ID No.143)作为被抗体NI302.15D3识别的独特线性表位，包括氨基酸PQPPPQAQPL的序列作为被抗体NI302.64E5识别的独特线性表位。因此，在一个实施方式中提供了本发明的抗体，其中所述抗体特异性结合到HTT的富P区中的表位，其包含氨基酸序列PQPPPQAQPL(SEQ ID No.140)、PPPQLPQPPP(SEQ ID No.141)、QAQPLLPQPQPPPPP(SEQ ID No.142)、PPPQLPQPPPQAQPL(SEQ ID No.143)。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗HTT抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体NI-302.7D8相同的HTT的polyQ/polyP区中的表位。表位作图鉴定到人类HTT的富Q/P区内包括氨基酸QQQQQQQPPP的序列(SEQ IDNo.201)作为被本发明的抗体NI-302.7D8识别的独特线性表位。因此，在一个实施方式中提供了本发明的抗体，其中所述抗体特异性结合到HTT的polyQ/polyP区中的表位，其包含氨基酸序列QQQQQQQPPP(SEQ ID No.201)。
在一个实施方式中，本发明涉及一种抗HTT抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体NI-302.35C1相同的HTT的C-末端区中的表位。表位作图鉴定到人类HTT的C-末端区内包括氨基酸PPGPAVAEEPLHRP的序列(SEQ IDNo.145)作为被本发明的抗体NI-302.35C1识别的独特线性表位。因此，在一个实施方式中提供了本发明的抗体，其中所述抗体特异性结合到HTT的C-末端区中的表位，其包含氨基酸序列PPGPAVAEEPLHRP(SEQ ID No.145)。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗HTT抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体NI-302.72F10相同的HTT的C-末端区中的表位。表位作图鉴定到人类HTT的C-末端区内包括氨基酸PPPGPAVAEEPLH的序列(SEQID No.202)作为被本发明的抗体NI-302.72F10识别的独特线性表位。因此，在一个实施方式中提供了本发明的抗体，其中所述抗体特异性结合到HTT的C-末端区中的表位，其包含氨基酸序列PPPGPAVAEEPLH(SEQ ID No.202)。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗HTT抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体NI-302.15E8相同的HTT的N-末端区中的表位。表位作图鉴定到人类HTT的N-末端区内包括氨基酸KAFESLKSFQ的序列(SEQ IDNo.144)作为被本发明的抗体NI-302.15E8识别的独特线性表位。因此，在一个实施方式中提供了本发明的抗体，其中所述抗体特异性结合到HTT的N-末端区中的表位，其包含氨基酸序列KAFESLKSFQ(SEQ ID No.144)。
在一个实施方式中，本发明涉及一种抗HTT抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体相同的HTT外显子1的表位，所述参比抗体选自NI-302.6N9、NI-302.4A6、NI-302.12H2或NI-302.8M1，它们已被显示不结合于HTT外显子1的线性肽，但以高亲和性结合于具有21或49个polyQ的聚集的HTT外显子1蛋白(HD21和HD49)，并且EC50值在亚纳摩尔范围内；对于概述，参见例如实施例25和图20。因此，在一个优选实施方式中，本发明的抗体特异性结合聚集形式的HTT，特别是源自于HTT外显子1的蛋白聚集体，其EC50值低于1nM，优选地低于0,1nM，最优选地低于0,01nM。
此外，不打算受在实施例中演示并在图中示出的初始实验观察的限制，本发明的人类单克隆NI-302.33C11、NI-302.63F3、NI-302.35C1、NI-302.31F11、NI-302.6N9、NI-302.46C9、NI-302.8F1、NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.44D7、NI-302.55D8、NI-302.7A8、NI-302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.11H6、NI-302.3D8和NI.302-64E5和NI.302-72F10抗HTT抗体优选地特征在于特异性结合到病理性的突变和/或聚集的HTT，并以明显更小的亲和性识别生理形式下的HTT，参见例如实施例7、13、18和图3、7、11、21、32。因此，本发明提供了一组人类抗HTT抗体，其具有对诊断和治疗目的特别有用的结合性质。因此，在一个实施方式中，本发明提供了能够特异性结合病理性聚集形式的HTT的抗体。然而，此外或可替选地，本发明的能够结合到HTT外显子1的polyP区或富P区的抗体也可用于其他应用中。具体来说，这些抗体不限于HTT，而是也可以结合到也表现出polyP区段或富P区的其他靶。
在一个实施方式中，本发明的抗体表现出如实施例中所描述的示例性抗体NI-302.33C11、NI-302.63F3、NI-302.35C1、NI.302-7D8和NI.302-72F10的结合性质。本发明的抗HTT抗体偏好性识别病理性改变的HTT例如突变和/或聚集的HTT物质及其片段而不是生理性HTT。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体基本上不识别生理性HTT物质。
术语“基本上不识别”当在本申请中用于描述包含抗体、其片段或结合分子的组中的分子对特异性靶分子、抗原和/或所述靶分子和/或抗原的构象的结合亲和性时，意味着上述组中的分子结合所述分子、抗原和/或构象的结合亲和性，比上述组中的分子结合另一种分子、抗原和/或构象的结合亲和性低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍。通常使用解离常数(KD)作为结合亲和性的度量。有时，将在特定测定法例如ELISA测定法上的EC50用作结合亲和性的度量。优选地，当在本申请中使用时，术语“基本上不识别”意味着上述组中的分子结合所述分子、抗原和/或构象的结合亲和性比上述组中的所述分子结合另一种分子、抗原和/或构象的结合亲和性低至少10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或10000倍。
如上所述，已提出HD中HTT的聚集的发生是由HTT外显子1内的多谷氨酰胺区段的延长造成的。具体来说，已显示HD主要发生在HTT中具有长度超过35-40个谷氨酰胺残基的阈值的患者中。因此，如实施例3中所示，产生了具有21、35或49个polyQ重复序列的HTT外显子1的聚集和可溶性构建物，以便鉴定本发明的抗HTT抗体特异性结合到病理性改变的HTT的用途。
下文中使用的术语HDX描述了按照实施例3产生的HTT构建物。具体来说，X表示谷氨酰胺重复序列(Q)的数目，例如具有21个polyQ重复序列的HTT外显子1蛋白被表示成HD21。
利用实施例中所描述的构建物，可以显示出本发明的抗HTT抗体另外或可选地结合到病理性的引起疾病和/或突变和/或聚集的形式的人类HTT。就此而言，结合亲和性可以在为图3(A)、7(A)、11(A)、14(A)、相应的图19、20和31中的示例性抗体NI-302.33C11、NI-302.63F3、NI-302.35C1、NI-302.31F11、NI-302.6N9、NI-302.46C9、NI-302.8F1、NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.44D7、NI-302.55D8、NI-302.7A8、NI-302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.11H6和NI-302.3D8所示出的范围内，即对人类聚集的HD49-HTT和聚集的重组HD49-HTT具有约1pM至250nM的半最大有效浓度(EC50)，优选地约25pM至50nM的EC50，最优选地约0.05nM至30nM的EC50，或者对人类聚集的HD21-HTT和聚集的重组HD21-HTT具有约0.05nM至5nM的EC50。
具体来说，所述抗HTT抗体、其结合片段或生物技术衍生物的结合亲和性，对结合聚集的HD49HTT来说对应于≤20nM、优选地≤10nM、最优选地≤1nM的EC50值，和/或对于结合HD21HTT来说对应于≤40nM、优选地≤10nM、最优选地≤1nM的EC50值；参见图3、7、11、19和31。
与HD的发生相关的HTT聚集最频繁地与>35个重复序列的多谷氨酰胺(polyQ)区段相关。正如在本发明中示出的，本文描述的抗HTT抗体对具有较高重复度的HD区段显示出高结合效率，参见例如实施例7、13、18、31和33。因此，在本发明的一个实施方式中，所述抗HTT抗体、HTT结合分子、其片段、合成或生物技术变体结合到具有扩展的聚谷氨酰胺(Q)区段的HTT。在优选实施方式中，它结合到具有超过35个重复序列的HTT。在本发明的特别优选实施方式中，所述抗体结合到具有由49个重复序列构成的扩展聚谷氨酰胺(Q)区段的HTT(HD49)超过具有35个重复序列(HD35)并且更超过具有21个重复序列(HD21)的对应物。
然而，根据本发明，还描述了结合到少于35个重复序列的聚谷氨酰胺(polyQ)区段的抗HTT抗体、HTT结合分子、其片段、合成或生物技术变体。因此，在本发明的一个实施方式中，所述抗体、结合分子或其变体结合到显示出“正常”polyQ区段的HTT。具体来说，所述抗体能够结合到具有<35个重复序列的polyQ区段的HTT(HD35)。
某些抗体能够结合广范围的生物分子例如蛋白质。正如专业技术人员将会认识到的，术语“特异的”在本文中用于指示除了HTT蛋白或其片段之外的其他生物分子不显著结合到所述抗原结合分子，例如本发明的抗体之一。优选地，结合HTT之外的生物分子的水平产生的结合亲和性为对HTT的相应亲和性的至多仅仅20％或更低、10％或更低、仅仅5％或更低、仅仅2％或更低或仅仅1％或更低(即低至少5、10、20、50或100倍或超过它的任何倍数)；参见例如图20。
在一个实施方式中，本发明的抗HTT抗体偏好性结合到聚集形式的HTT和/或其片段、衍生物、纤丝和/或寡聚物。在另一个实施方式中，本发明的抗HTT抗体偏好性结合到本源HTT和病理性突变和/或聚集形式的HTT两者。
在本发明的另一个实施方式中，所述抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物是双特异性抗体。因此，本发明的抗体可能能够识别相同或不同抗原上的至少两个不同表位；也参见上文。
在一个实施方式中，所述双特异性抗体的至少一个结合位点/结构域特异性识别HTT的polyP区中的表位，其包含氨基酸序列PPPPPPPP(NI-302.33C11；NI-302.44D7；NI-302.7A8；NI-302.3D8；NI-302.46C9)(SEQ ID No.139、151、154、158、161)、氨基酸序列PPPPPP(NI-302.11H6、NI-302.18A1、NI-302.52C9(SEQ ID No.157、159、160))、氨基酸序列PPPPPPPPPPP(NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.78H12、NI-302.71F6(SEQ ID No.146、147、148、149、150、152、153、155、156))，富P区中的表位，其包含氨基酸序列PQPPPQAQPL(NI-302.63F3，SEQ IDNo.140；NI-302.64E5，SEQ ID No.200)，氨基酸序列PPPQLPQPPP(NI-302.31F11，SEQ IDNo.141)、氨基酸序列QAQPLLPQPQPPPPP(NI-302.2A2，SEQ ID No.142)或氨基酸序列PPPQLPQPPPQAQPL(NI302.15D3，SEQ ID No.143)，C-末端区中的表位，其包含氨基酸序列PPGPAVAEEPLHRP(NI-302.35C1，SEQ ID No.145)或PPPGPAVAEEPLH(NI-302.72F10，SEQ IDNo.202)，N-末端区中的表位，其包含氨基酸序列KAFESLKSFQ(NI-302.15E8，SEQ IDNo.144)，富P/Q区中的表位，其包含氨基酸序列QQQQQQQQQPPP(NI-302.7D8，SEQ IDNo.201)，或被抗体NI-302.6N9、NI-302.4A6、NI-302.12H2或NI-302.8M1中的任一者识别的构象表位。
正如前面提到的，含多谷氨酰胺(poly-Gln，polyQ)的HTT蛋白聚集体在神经元核内包涵体中的积累，是进行性神经退行性疾病亨廷顿病(HD)的标志。这些聚集体的电子显微照片揭示出纤丝状结构，其显示出与阿兹海默氏病中的β-淀粉样肽纤丝密切相关的形态，参见例如Caughey等，Trends Cell Biol.7(1997),56–62和Caputo等，Arch.Biochem.Biophys.292(1992),199–205，表明其中退行性过程主要涉及中型有棘纹状体神经元和皮层神经元，引起机能障碍和随后的神经元丧失以及由兴奋毒性、线粒体损伤、自由基和可能的炎性机制包括小神经胶质细胞激活和症状的其他进行性本质造成的组织损伤的HD，是有毒的淀粉样肽纤丝生成的结果。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体可用于亨廷顿病(HD)及其症状的治疗。
到目前为止，已描述了细胞内表达的抗体(胞内抗体)并将其当作在HD中扰乱HDD功能的治疗工具，参见例如Ali等，《亨廷顿病的神经生物学：应用于药物发现》(Neurobiology of Huntington's Disease:Applications to Drug Discovery)，Lo等，第10章，CRC Press(2011)。尽管这些胞内抗体在基于细胞的测定法中对聚集和HTT诱导的细胞死亡显示出正效应，参见例如Khoshnan等，Proc Natl Acad Sci U S A.99(2002),1002–1007，但它们的治疗应用中的一个缺点是给药途径。具体来说，将治疗性胞内抗体递送到脑的优选方法是基于病毒载体的基因疗法。然而，使用这种给药的主要缺点是高的宿主免疫原性。因此，利用其它给药途径的非病毒方法被优选地用于治疗或诊断方法中。已显示本发明的抗体在添加到培养基后，即在细胞外，减弱树突棘密度的丧失。因此，与前面描述的胞内抗体相反，可以预期遵从治疗上优选的给药途径，本发明的抗体将是高效的。因此，在本发明的一个实施方式中，所述抗体通过皮下注射(s.c.)、静脉内注射(i.v.)、肌肉内注射(i.m.)、腹膜内(i.p.)、鞘内、喷射注射来给药，其中作用半径不限于所述抗体的细胞内表达。
正如上文已经提到的并且正如在实施例24和图17中示出的，本发明的抗体的治疗用途已被示出。具体来说，已显示本发明的抗HTT抗体能够减弱树突棘密度丧失。因此，在本发明的一个实施方式中，所述抗HTT抗体、HTT结合片段、其合成或生物技术衍生物引起树突棘密度丧失的减弱。
此外，在实施例34和图34中演示了本发明的抗体的治疗用途。具体来说，已显示本发明的抗HTT抗体改进任务特异性训练期间的行为恢复并增强感觉运动能力。因此，在本发明的一个实施方式中，所述抗HTT抗体、HTT结合片段、其合成或生物技术衍生物引起任务特异性训练期间行为表现的改善和感觉运动能力的增强。
本发明还涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体包含与选自下列的抗体同一的抗原结合结构域：NI-302.33C11，NI-302.63F3，NI-302.35C1，NI-302.31F11，NI-302.2A2，NI-302.6N9，NI-302.74C11，NI-302.15F9，NI-302.39G12，NI-302.11A4，NI-302.22H9，NI-302.44D7，NI-302.37C12，NI-302.55D8，NI-302.7A8，NI-302.78H12，NI-302.71F6，NI-302.11H6，NI-302.3D8，NI-302.18A1，NI-302.8F1，NI-302.52C9，NI-302.46C9，NI-302.15E8，NI-302.15D3，NI-302.64E5，NI-302.7D8，NI-302.72F10，NI-302.12H2，NI-302.8M1和NI-3024A6。
本发明还示例了几种识别HTT的polyP区的结合分子例如抗体及其结合片段，其可以被表征为在它们的可变区例如结合结构域中包含含有图1中示出的任一氨基酸序列的VH和/或VL可变区的至少一个互补性决定区(CDR)。编码上面鉴定的可变区的相应核苷酸序列显示在下面的表II中。上述VH和/或VL区的氨基酸序列的示例性的CDR组示出在图1中。然而，正如在下文中讨论的，本领域技术人员将充分意识到下述事实，即可以另外或可替选地使用氨基酸序列与图1中示出的序列相差1、2、3个氨基酸或在CDR2和CDR3的情况下甚至更多个氨基酸的CDR。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其HTT结合片段，其在可变区中包含图1中示出的至少一个互补性决定区(CDR)和/或包含一个或多个氨基酸置换的一个或多个CDR。
此外，本发明示例了几种识别HTT的富P区的结合分子例如抗体及其结合片段，其可以被表征为在它们的可变区例如结合结构域中包含含有图1中示出的任一氨基酸序列的VH和/或VL可变区的至少一个互补性决定区(CDR)。编码上面鉴定的可变区的相应核苷酸序列显示在下面的表III中。上述VH和/或VL区的氨基酸序列的示例性的CDR组示出在图1中。然而，正如在下文中讨论的，本领域技术人员将充分意识到下述事实，即可以另外或可替选地使用氨基酸序列与图1中示出的序列相差1、2、3个氨基酸或在CDR2和CDR3的情况下甚至更多个氨基酸的CDR。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其HTT结合片段，其在可变区中包含图1中示出的至少一个互补性决定区(CDR)和/或包含一个或多个氨基酸置换的一个或多个CDR。
此外，本发明示例了几种识别HTT的C-末端区的结合分子例如抗体及其结合片段，其可以被表征为在它们的可变区例如结合结构域中包含含有图1中示出的任一氨基酸序列的VH和/或VL可变区的至少一个互补性决定区(CDR)。编码上面鉴定的可变区的相应核苷酸序列显示在下面的表IV中。上述VH和/或VL区的氨基酸序列的示例性的CDR组示出在图1中。然而，正如在下文中讨论的，本领域技术人员将充分意识到下述事实，即可以另外或可替选地使用氨基酸序列与图1中示出的序列相差1、2、3个氨基酸或在CDR2和CDR3的情况下甚至更多个氨基酸的CDR。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其HTT结合片段，其在可变区中包含图1中示出的至少一个互补性决定区(CDR)和/或包含一个或多个氨基酸置换的一个或多个CDR。
另外，本发明示例了几种识别HTT的N-末端区的结合分子例如抗体及其结合片段，其可以被表征为在它们的可变区例如结合结构域中包含含有图1中示出的任一氨基酸序列的VH和/或VL可变区的至少一个互补性决定区(CDR)。编码上面鉴定的可变区的相应核苷酸序列显示在下面的表VI中。上述VH和/或VL区的氨基酸序列的示例性的CDR组示出在图1中。然而，正如在下文中讨论的，本领域技术人员将充分意识到下述事实，即可以另外或可替选地使用氨基酸序列与图1中示出的序列相差1、2、3个氨基酸或在CDR2和CDR3的情况下甚至更多个氨基酸的CDR。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其HTT结合片段，其在可变区中包含图1中示出的至少一个互补性决定区(CDR)和/或包含一个或多个氨基酸置换的一个或多个CDR。
在一个实施方式中，本发明的抗体是包含图1中所示的VH和/或VL区或含有一个或多个氨基酸置换的所述VH和/或VL区的氨基酸序列的任一抗体。优选地，本发明的抗体的特征在于保留了在人类B-细胞中存在的重链和轻链的同源配对。
在本发明的另一个实施方式中，所述抗HTT抗体、其HTT结合片段、合成或生物技术变体可以被优化，以具有适合的对靶的结合亲和性和药代动力学性质。因此，将CDR或可变区中易于发生选自糖基化、氧化、脱氨化、肽键切割、异天冬氨酸形成和/或不配对的半胱氨酸的修饰的至少一个氨基酸，用缺少这些变化的突变氨基酸替换，或者其中通过化学或酶法从所述抗体缺失至少一个糖基团或向其添加至少一个糖基团。氨基酸优化的实例可以在表VII中找到，其中示出了显示出诱导引发的改变的抗体。优化抗体性质的其他修饰描述在Gavel等，Protein Engineering 3(1990),433-442和Helenius等，Annu.Rev.Biochem.73(2004),1019-1049中。
可选地，本发明的抗体是与具有图1中示出的VH和/或VL区的至少一种抗体竞争与HTT的结合的抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体。
所述与具有图1中示出的VH和/或VL区的至少一种抗体竞争与HTT的结合的抗体，可以在斑点印迹分析和/或滤膜滞留中进一步表征，正如在实施例6、13、18、31和/或32中描述的。因此，在本发明的一个实施方式中，在斑点印迹分析和/或滤膜滞留中，所述抗体结合到HTT，优选地结合到具有由49个重复序列构成的扩展的poly-Q区段的HTT(HD49)。
图3、7、11、21、22和图32和33以及实施例6、7、13、18、26和32中提供的实验结果表明，某些本发明的抗HTT抗体偏好性结合到引起疾病的突变和/或聚集形式的人类抗HTT超过其他形成淀粉样肽的蛋白。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体偏好性识别突变和/或聚集的HTT和/或其片段和/或衍生物超过其他形成淀粉样肽的蛋白。
在本发明的一个实施方式中，所述抗HTT抗体、其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物偏好性识别突变、聚集和/或可溶形式的HTT超过生理性HTT。
本发明的抗体可以是人类的，特别是对于治疗性应用来说。或者，本发明的抗体是对于诊断方法和动物中的研究特别有用的啮齿动物、啮齿动物源化或嵌合的啮齿动物-人类抗体，优选为鼠、鼠源化或嵌合的鼠-人类抗体或大鼠、大鼠源化或嵌合的大鼠-人类抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体是嵌合的啮齿动物-人类或啮齿动物源化抗体。此外，在一个实施方式中，本发明的嵌合抗体，即包含人类抗体的可变结构域和鼠类通用的轻链和重链恒定结构域的抗体，以高亲和性结合到人类HTT。优选地，嵌合抗体的结合亲和性与它们的人类对应物相近。
在一个实施方式中，通过单克隆或寡克隆的B细胞的培养物提供本发明的抗体，将所述培养物培养，并在含有由所述B-细胞产生的抗体的培养物上清液中筛选抗HTT抗体的存在及其亲和性。所述筛选方法包括筛选与本源的单体、纤丝状或非纤丝状聚集体例如源自于合成的全长hHTT肽或例如从人类血浆或重组表达纯化的hHTT的寡聚物的结合。
正如上面提到的，由于它在人类免疫应答后产生，本发明的人类单克隆抗体将识别病理学上特别重要的表位，并且所述表位在用于产生例如小鼠单克隆抗体的免疫接种方法和噬菌体展示文库的体外筛选的情况下，分别可能是不可接近的或免疫原性较低的。因此，可以审慎地保证本发明的人类抗HTT抗体的表位是独特的，并且不存在能够结合到所述被本发明的人类单克隆抗体识别的表位的其他抗体。本发明的抗体的独特性的另一个指示是下述事实，即正如在图19、20、24和27至29中指示的，本发明的抗体结合特异性针对突变和/或聚集形式的HTT的表位，所述表位正如上面指明的，在病理学上是特别重要的，并且不能通过常用的抗体产生方法例如免疫接种或体外文库筛选来获得。
因此，在一个实施方式中，本发明还总体扩展到与本发明的人类单克隆抗体竞争与HTT的特异性结合的抗HTT抗体和HTT结合分子。更具体来说，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体相同的HTT的polyP区中的表位，所述参比抗体选自NI-302.33C11、NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.44D7、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.7A8、NI-302.71F6、NI-302.11H6、NI-302.3D8、NI-302.18A1、NI-302.8F1、NI-302.52C9、NI-302.78H12和NI-302.46C9。此外，在一个实施方式中，更具体来说，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体相同的HTT的富P区中的表位，所述参比抗体选自NI-302.63F3、NI-302.31F11、NI-302.2A2、NI-302.15D3和/或NI-302.64E5。在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与选自NI-302.35C1和/或NI.302-72F10的参比抗体相同的HTT的C-末端区中的表位。在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与参比抗体NI-302.15E8相同的HTT的N-末端区中的表位。在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与选自NI-302.6N9、NI-320.12H2、NI-302.8M1和/或NI-302.4A6的参比抗体相同的HTT的表位。在一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与参比抗体NI-302.7D8相同的HTT的表位。在优选实施方式中，本发明还总体扩展到与本发明的人类单克隆抗体竞争与突变和/或聚集的HTT物质或其片段的特异性结合的抗HTT抗体和HTT结合分子，正如在实施例7、13、18、31和33以及图7、13、19和31中所示。因此，更具体来说，本发明还涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体相同的突变和/或聚集的HTT物质或其片段的polyP区中的表位，所述参比抗体选自NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.33C11、NI-302.44D7、NI-302.7A8、NI-302.3D8、NI-302.46C9、NI-302.11H6、NI-302.18A1、NI-302.52C9和/或NI-302.8F1。此外，在一个实施方式中，更具体来说，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体特异性结合到与参比抗体相同的突变和/或聚集的HTT物质或其片段的富P区中的表位，所述参比抗体选自NI-302.63F3、NI-302.31F11、NI-302.2A2、NI-302.15D3和/或NI-302.64E5。在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与选自NI-302.35C1和/或NI.302-72F10的参比抗体相同的突变和/或聚集的HTT物质或其片段的C-末端区中的表位。在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与参比抗体NI-302.15E8相同的HTT的N-末端区中的表位。在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与参比抗体NI-302.15E8相同的突变和/或聚集的HTT物质或其片段的N-末端区中的表位。在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其结合到与选自NI-302.6N9、NI-320.12H2、NI-302.8M1和/或NI-302.4A6的参比抗体相同的HTT的表位。在一个实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物，其结合到与参比抗体NI-302.7D8相同的HTT的表位。
抗体之间的竞争通过测定法来确定，在所述测定法中，所试验的免疫球蛋白抑制参比抗体与共同抗原例如HTT的特异性结合。已知大量类型的竞争性结合测定法，例如：固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)；夹心竞争测定法，参见Stahli等，Methods in Enzymology9(1983),242-253；固相直接生物素-亲和素EIA，参见Kirkland等，J.Immunol.137(1986),3614-3619和Cheung等，Virology 176(1990),546-552；固相直接标记测定法；固相直接标记夹心测定法，参见Harlow和Lane，《抗体实验指南》(Antibody,A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Press(1988)；使用I125标记物的固相直接标记RIA，参见Morel等，Molec.Immunol.25(1988),7-15和Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32(1990),77-82。通常，这种测定法包括使用结合到固相表面或带有其中任一者的细胞的纯化的HTT或突变和/或聚集的HTT例如其寡聚物和/或纤丝，未标记的试验免疫球蛋白和标记的参比免疫球蛋白，即本发明的人类单克隆抗体。竞争性抑制通过确定在试验免疫球蛋白存在下结合到固相表面或细胞的标记物的量来测量。通常，所述试验免疫球蛋白过量存在。优选地，竞争性结合测定法在如随附的实施例中为ELISA测定法所描述的条件下进行。通过竞争测定法鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合到与参比抗体相同的表位的抗体和结合到与参比抗体所结合的表位足够邻近以使空间位阻发生的相邻表位的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，它将参比抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50％或75％。因此，本发明还涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体竞争性抑制选自NI-302.33C11、NI-302.63F3、NI-302.35C1、NI-302.31F11、NI-302.2A2、NI-302.6N9、NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.44D7、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.7A8、NI-302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.11H6、NI-302.3D8、NI-302.18A1、NI-302.8F1、NI-302.52C9、NI-302.46C9、NI-302.15E8、NI-302.64E5、NI-302.7D8、NI-302.72F10、NI-302.12H2、NI-302.8M1和/或NI-302.4A6的参比抗体结合到HTT。
本发明还涉及一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体竞争性抑制选自NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.33C11、NI-302.44D7、NI-302.7A8、NI-302.3D8、NI-302.46C9、NI-302.11H6、NI-302.18A1、NI-302.52C9、NI-302.8F1、NI-302.63F3、NI-302.31F11、NI-302.2A2、NI302.15D3、NI-302.35C1、NI-302.6N9、NI-302.7D8和/或NI-302.72F10的参比抗体结合到突变和/或聚集的HTT物质或其片段。
在优选实施方式中，抗体、其结合片段、合成或生物技术变体与HTT、优选地与具有由49个重复序列构成的扩展的poly-Q区段的HTT(HD49)的结合，可以在实施例、特别是实施例7、13、18、31和/或33中所描述的斑点印迹测定法和/或滤膜滞留中测量。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其构成或由其构成，其中所述重链可变区的至少一个VH-CDR或所述重链可变区的至少两个VH-CDR与来自于本文公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。或者，所述VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自于本文公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。因此，根据这个实施方式，本发明的重链可变区具有与图1中分别示出的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。尽管图1示出了由Kabat系统定义的VH-CDR，但其他CDR定义例如由Chothia系统定义的VH-CDR，也包含在本发明中，并且可以由本领域普通技术人员使用图1中提供的数据容易地鉴定。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其构成或由其构成，其中所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区分别具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组同一的多肽序列。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其构成或由其构成，其中所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区分别具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组同一的多肽序列，区别在于任一VH-CDR中的1、2、3、4、5或6个氨基酸置换。在某些实施方式中，所述氨基酸置换是保守的。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其构成或由其构成，其中所述轻链可变区的至少一个VL-CDR或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自于本文公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。或者，所述VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自于本文公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。因此，根据这个实施方式，本发明的轻链可变区具有与图1中分别示出的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。尽管图1示出了由Kabat系统定义的VL-CDR，但其他CDR定义例如由Chothia系统定义的VL-CDR，也包含在本发明中。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其构成或由其构成，其中所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区分别具有与图1中示出的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组同一的多肽序列。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其构成或由其构成，其中所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区分别具有与图1中示出的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组同一的多肽序列，区别在于任一VL-CDR中的1、2、3、4、5或6个氨基酸置换。在某些实施方式中，所述氨基酸置换是保守的。
免疫球蛋白或其编码cDNA可以被进一步修饰。因此，在另一个实施方式中，本发明的方法包括生产嵌合抗体、鼠源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记的抗体或其任一者的类似物的步骤中的任一者。相应的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并且描述在例如Harlow和Lane，《抗体实验指南》(Antibodies,A LaboratoryManual)，CSH Press,Cold Spring Harbor(1988)中。当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可以使用在BIAcore系统中利用的表面等离子体共振来提高结合到与本文中描述的任一抗体相同的表位的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibody Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。嵌合抗体的生产描述在例如国际申请WO 89/09622中。生产人源化抗体的方法描述在例如欧洲申请EP-A1 0 239400和国际申请WO 90/07861中。按照本发明使用的抗体的其他来源是所谓的异种抗体。在小鼠中生产异种抗体例如类似人类的抗体的一般性原理描述在例如国际申请WO 91/10741、WO94/02602、WO 96/34096和WO 96/33735中。正如上面讨论的，除了完整抗体之外，本发明的抗体还可以以各种不同形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2，以及单链形式；参见例如国际申请WO 88/09344。因此，在一个实施方式中提供了本发明的抗体，其选自单链Fv片段(scFv)、F(ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2片段。
本发明的抗体或它们相应的免疫球蛋白链可以使用本领域中已知的常规技术进一步修饰，例如单独或组合地使用氨基酸缺失、插入、置换、添加和/或重组和/或本领域中已知的任何其他修饰。用于在隐含在免疫球蛋白链的氨基酸序列下的DNA序列中引入这些修饰的方法对于本领域技术人员来说是公知的，参见例如Sambrook，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)。本发明的抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸处的化学和/或酶法衍生，包括侧链修饰、骨架修饰和N-端和C-端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和附连糖类或脂类基团、辅因子等。同样地，本发明涵盖了嵌合蛋白的生产，所述嵌合蛋白在氨基端处包含所描述的抗体或其某些片段，其被融合到羧基端处的异源分子例如免疫刺激性配体；对于相应的技术细节，参见例如国际申请WO00/30680。
本发明的抗体也可以包含优化它们的治疗潜力的其他修饰。这些修饰包括但不限于对抗体的氨基酸序列(例如可变区)的修饰和翻译后修饰。翻译后修饰(PTM)是在功能蛋白质组学中发挥重要作用的化学修饰，因为它们调控活性、定位和与其他细胞分子如蛋白质、核酸、脂类和辅因子的相互作用。因此，抗体的优化可以提供几个优点，例如提高储存期间的稳定性以及药代动力学和/或药效学分布概况，例如抗体的体内或体外循环时间，提高的溶解性，稳定性，提高对靶的亲和性，降低脱离速率，提高恒定区(Fc区)的效应子功能和抗体的安全性概况，例如降低免疫原性或降低对翻译后修饰的敏感性，正如在例如Igawa等，MAbs 3(2011),243-52中所示。因此，在本发明的一个实施方式中，可以对抗HTT抗体、HTT结合片段、其合成或生物技术变体进行优化，其中CDR或可变区中的至少一个易于修饰的氨基酸被缺少这种改变的突变的氨基酸替换，或者其中通过化学或酶学方法将至少一个糖基团从所述抗体缺失或添加到所述抗体，所述修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、脱氨化、黄素蛋白的共价附连、血红素基团的共价附连、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附连、脂类或脂类衍生物的共价附连、磷脂酰肌醇的共价附连、交联、环化、二硫键形成、异构化、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、水解、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、硒酰化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化(参见例如Creighton，《蛋白质：结构和分子性质》(Proteins:Structures and Molecular Properties)，第二版，Freeman and Co.,N.Y.,1992；《蛋白质的翻译后共价修饰》(Postranslational Covalent Modification ofProteins)，Johnson主编，Academic Press,New York,1983；Seifter等，Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等，Ann.NY.Acad.Sei.663(1992)，48-62)。在优选实施方式中，所述修饰选自糖基化、氧化、脱氨化、肽键切割、异天冬氨酸形成和/或未配对的半胱氨酸。优化HTT抗体或结合分子作为治疗剂的用途的其他修饰在本领域中是公知的，并描述在例如Igawa等，MAbs 3(2011),243-52中，其公开内容并入本文。添加或缺失糖基团的手段可以通过化学或酶学方法实现，并详细描述在例如Berg等，《生物化学》(Biochemistry)，第五版，WH Freeman,New York 2002；WO 87/05330；Aplin等，CRC Crit.Rev.Biochem.,22(1981),259-306；Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.,259(1987),10-52；Edge等，Anal.Biochem.,118(1981),131；Thotakura等，Meth.Enzymol.138.(1987),350中。
此外，本发明涵盖的肽包括含有如上所述的结合分子、例如含有任一提到的抗体的可变区的CDR3区、特别是重链的CDR3的肽，因为常常观察到重链CDR3(HCDR3)是具有较大可变程度并主要参与抗原-抗体相互作用的区域。这些肽可以容易地合成或通过重组手段生产，以产生符合本发明的结合药剂。这些方法对于本领域普通技术人员来说是公知的。肽可以例如使用可商购的自动肽合成仪来合成。所述肽也可以通过重组技术来生产，通过将表达所述肽的DNA并入到表达载体中并用所述表达载体转化细胞，来生产所述肽。
因此，本发明涉及任何结合分子例如抗体或其结合片段，其被定向到抗HTT抗体和/或能够结合本发明的突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段并表现出提到的性质的抗体，即其特异性识别HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段。可以如本文中所述通过ELISA和免疫组织化学来试验这些抗体和结合分子的结合特异性和亲和性，参见例如实施例。所述抗体和结合分子的这些特性也可以通过Western印迹来试验。
作为直接从B细胞或记忆性B细胞的培养物获得免疫球蛋白的可替选方法，可以将细胞用作重排的重链和轻链基因座的来源，用于随后的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可以从适合的mRNA反转录，以产生cDNA。如果需要，可以将重链恒定区进行交换以获得不同同种型的重链恒定区或全部一起消除。可以将可变区相连以编码单链Fv区。可以将多个Fv区相连以提供对超过一种靶的结合能力，或者可以使用嵌合的重链和轻链组合。在获得遗传材料后，如上所述保留了它们两者的结合目标靶的能力的类似物的设计是简单明了的。用于抗体可变区的克隆和重组抗体的产生的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并描述在例如Gilliland等，Tissue Antigens 47(1996),1-20；Doenecke等，Leukemia 11(1997),1787-1792中。
在获得适合的遗传材料并且如果需要对其进行修改以编码类似物后，可以将编码序列、包括至少编码重链和轻链的可变区的序列插入到载体上包含的表达系统中，所述载体可以被转染到标准的重组宿主细胞中。可以使用各种不同的这些宿主细胞；然而，为了进行高效加工，哺乳动物细胞是优选的。可用于此目的的典型的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO细胞、HEK 293细胞或NSO细胞。
然后通过将修饰的重组宿主在适合于宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下进行培养，开始进行所述抗体或类似物的生产。然后通过从所述培养物分离所述抗体来回收它们。所述表达系统优选被设计成包括信号肽，以便得到的抗体被分泌到培养基中；然而细胞内生产也是可能的。
根据上面的描述，本发明还涉及一种多核苷酸，其编码本发明的抗体或等效的结合分子，在抗体的情况下优选地至少编码上述抗体的免疫球蛋白链的可变区。通常，由所述多核苷酸编码的所述可变区包含所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补性决定区(CDR)。
本领域技术人员将会容易地认识到，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可用于具有所需特异性和生物功能的其他多肽或抗体的构建。因此，本发明还涵盖了包含上述可变结构域的至少一个CDR的多肽和抗体，并且它们在有利情况下具有与随附的实施例中描述的抗体基本上相同或相近的结合性质。本领域技术人员知道，可以通过在CDR内或超变环内(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)制造氨基酸置换来提高结合亲和性，所述超变环正如Kabat所定义与CDR部分交叠；参见例如Riechmann等，Nature 332(1988),323-327。因此，本发明还涉及一种抗体，其中一个或多个所述提到的CDR包含一个或多个，优选地不超过两个氨基酸置换。优选地，本发明的抗体在其一个或两个免疫球蛋白链中包含图1中示出的可变区的两个或所有三个CDR。
正如本领域普通技术人员已知的，本发明的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、合成或生物技术变体或衍生物，可以包含介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体C1组分与抗体恒定区的结合可以激活补体系统。补体的激活在调理作用和细胞病原体的裂解中是重要的。补体的激活还刺激炎性反应，并且还可能参与自体免疫超敏性。此外，抗体通过Fc区结合到各种不同细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)。存在大量Fc受体，它们特异性针对不同类型的抗体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合启动大量重要且多样化的生物响应，包括包被有抗体的粒子的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、包被有抗体的靶细胞被杀伤细胞的裂解(被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎性介导物的释放、胎盘转运和免疫球蛋白生产的控制。
因此，本发明的某些实施方式包括一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已被缺失或以其他方式改变，以便提供所需生物化学特性，例如与完整的未改变的免疫原性近似相同的抗体相比降低的效应子功能、非共价二聚化的能力、提高的定位在HTT聚集和沉积位点处的能力、降低的血清半衰期或提高的血清半衰期。例如，在本文描述的诊断和治疗方法中使用的某些抗体是结构域缺失的抗体，其包含与免疫球蛋白重链相似的多肽链，但缺少一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域被缺失，例如，整个或一部分CH2结构域被缺失。在其他实施方式中，在本文描述的诊断和治疗方法中使用的某些抗体具有被改变以消除糖基化的恒定区例如IgG重链恒定区，这在本文中别处被称为无糖基化或“agly”抗体。这种“agly”抗体可以通过酶法以及通过对恒定区中的共有糖基化位点进行工程改造来制备。尽管不受理论限制，但据信“agly”抗体在体内可能具有提高的安全性和稳定性概况。生产具有所需效应子功能的无糖基化抗体的方法，可以在例如国际申请WO2005/018572中找到，其整体通过参考并入。
在本文描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可以使用本领域中已知的技术将Fc部分突变，以降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可以降低循环的修饰抗体的Fc受体结合，由此提高HTT定位。在其他情况下，与本发明相一致的恒定区修饰可能减弱补体结合，并因此降低血清半衰期和偶联的细胞毒素的非特异性结合。还可以使用恒定区的其他修饰来修饰二硫键或寡糖基团，其由于抗原特异性或抗体灵活性的提高而允许增强定位。所述修饰产生的生理概况、生物可利用性和其他生物化学效应例如例如HTT定位、生物分布和血清半衰期，可以使用公知的免疫学技术不需过多实验容易地测量和定量。
在本文中描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可以对Fc部分进行突变或与可选的蛋白序列进行交换，通过例如增强抗体经Fcγ受体、LRP或Thy1受体的受体介导的内吞作用，或通过据称能够使抗体穿梭到活细胞内而不伤害它们的“超级抗体技术”(Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241)，来提高抗体的细胞摄取。例如，可以使用本领域中已知的技术进行工程改造，来产生抗体结合区与细胞表面受体的同源蛋白配体的融合蛋白，或具有结合到HTT以及细胞表面受体的特异性序列的双特异性或多特异性抗体。
在本文描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可以对Fc部分进行突变或与可选的蛋白序列进行交换，或者可以对抗体进行化学修饰，以提高它的血脑屏障穿透能力。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰的形式，可以使用本领域中已知的技术从完整的前体或亲代抗体制造。示例性的技术在本文中更详细讨论。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用本领域中已知的技术制造或生产。在某些实施方式中，抗体分子或其片段是“重组生产的”，即使用重组DNA技术生产。制造抗体分子或其片段的示例性技术在本文中别处更详细讨论。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价附连到所述抗体，使得共价附连不阻止所述抗体特异性结合到它的同源表位。例如但不是限制性的，所述抗体衍生物包括已被修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白等进行修饰。可以通过已知技术进行大量化学修饰中的任一种，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，所述衍生物可能含有一个或多个非经典氨基酸。
在特别优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在待治疗的动物例如人类中不引发有害的免疫应答。在某些实施方式中，本发明的结合分子例如抗体或其抗原结合片段源自于患者例如人类患者，并随后被用于与它们所源自的物种相同的物种例如人类中，缓解或最小化有害免疫应答的发生。
去免疫(De-immunization)也可用于降低抗体的免疫原性。当在本文中使用时，术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位，参见例如国际申请WO 98/52976和WO 00/34317。例如，对来自于起始抗体的VH和VL序列进行分析并获得来自于每个V区的人类T细胞表位“图谱”，其显示了表位相对于互补性决定区(CDR)和所述序列内的其他关键残基的位置。对来自于T细胞表位图谱的各个T细胞表位进行分析，以便鉴定具有改变最终抗体活性的低风险的可选的氨基酸置换。设计包含氨基酸置换的组合的大量可选的VH和VL序列，随后将这些序列并入到在本文公开的诊断和治疗方法中使用的大量结合性多肽例如HTT特异性抗体或其免疫特异性片段中，然后试验它们的功能。通常，产生并试验12至24个变体抗体。然后将包含修饰的V和人类C区的完整重链和轻链基因克隆到表达载体中，并将得到的质粒引入到细胞系中用于生产完整抗体。然后在适合的生物化学和生物学测定法中比较所述抗体并鉴定最优变体。
单克隆抗体可以使用本领域中已知的广范围的各种技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来生产，包括本领域中已知的并在例如Harlow等，《抗体实验指南》(Antibodies:A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版(1988)；Hammerling等，《单克隆抗体和T-细胞杂交瘤》(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)，Elsevier,N.Y.,563-681(1981)中教示的杂交瘤技术，所述参考文献整体通过参考并入。当在本文中使用时，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自于单一克隆、包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，与生产它的方法无关。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。在某些实施方式中，本发明的抗体源自于如本文中所述已通过Epstein-Barr病毒转化而被永生化的人类B细胞。
在公知的杂交瘤方法(Kohler等，Nature256(1975),495)中，将来自于哺乳动物的相对短寿命或非永生的淋巴细胞，例如本文中所述源自于人类对象的B细胞，与永生的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合，由此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是永生的，又能产生B细胞的遗传编码的抗体。通过选择、稀释和重新生长将得到的杂交物分离成单一遗传株系，其中每个单个株系包含用于形成单个抗体的特异性基因。它们产生针对目标抗原的均质的抗体，并且由于它们的纯的遗传亲代性，被称为“单克隆”。
将由此制备的杂交瘤细胞接种并生长在适合的培养基中，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域技术人员将会认识到，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可以从大量来源商购，并且标准化流程已被确立。一般来说，分析杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对目标抗原的单克隆抗体的产生。如本文中所述，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过体外测定法例如免疫沉淀、放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来确定。在鉴定到产生具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序将所述克隆亚克隆，并通过标准方法进行生长；参见例如Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，Academic Press(1986),59-103。还应该认识到，由所述亚克隆分泌的单克隆抗体，可以通过常规的纯化程序例如蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清分离。
在另一个实施方式中，可以通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变区基因。例如，可以从免疫接种或自然免疫的哺乳动物例如人类分离外周血单核细胞，并在体外培养约7天。可以筛选培养物以获得满足筛选判据的特定IgG。可以分离来自于阳性孔的细胞。各个产生Ig的B细胞可以通过FACS或通过在补体介导的溶血斑测定法中鉴定它们来分离。产生Ig的B细胞可以在试管中显微操作，并且可以使用例如RT-PCR来扩增VH和VL基因。可以将所述VH和VL基因克隆到抗体表达载体中，并转染到细胞(例如真核或原核细胞)中用于表达。
可选地，可以使用专业技术人员公知的技术选择并培养产生抗体的细胞系。这些技术描述在各种实验室手册和原始出版物中。就此而言，如下文中所述适用于本发明的技术描述在《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology)，Coligan等主编，GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)中，其包括附录的全文通过参考并入本文。
识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，Fab和F(ab’)2片段可以通过重组方法或通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割，使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)来产生。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。这些片段足以用于例如涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分偶联到检测试剂例如放射性同位素的免疫诊断程序中。
在一个实施方式中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自于一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自于一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自于一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自于一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自于一个或多个抗体分子的至少六个CDR。在本文中描述了包含可以包括在主题抗体中的至少一个CDR的示例性抗体分子。
本发明的抗体可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法来生产，特别是通过化学合成或优选地通过本文中所描述的重组表达技术。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含合成的恒定区，其中一个或多个结构域被部分或完全缺失(“结构域缺失的抗体”)。在某些实施方式中，相容的修饰抗体将包含结构域缺失的构建物或变体，其中整个CH2结构域已被移除(ΔCH2构建物)。对于其他实施方式来说，可以用短的连接肽替换被缺失的结构域，以便为所述可变区提供柔性和运动自由度。本领域技术人员将会认识到，由于CH2结构域对抗体的分解代谢速率的调控性质，这些构建物是特别优选的。结构域缺失的构建物可以使用编码IgG1人类恒定结构域的载体来衍生，参见例如国际申请WO 02/060955和WO02/096948A2。该载体被工程化改造以缺失CH2结构域并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是微型抗体。微型抗体可以使用本领域中描述的方法来制造，参见例如美国专利5,837,821或国际申请WO 94/09817。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含具有几个或甚至单个氨基酸的缺失或置换的免疫球蛋白重链，只要它允许单体亚基之间的结合即可。例如，CH2结构域中所选区域中的单个氨基酸的突变可能足以显著降低Fc结合并由此提高HTT定位。同样地，简单地缺失一个或多个恒定区结构域的控制待调节的效应子功能(例如补体结合)的部分，可能是合乎需要的。恒定区的这种部分缺失可以改进抗体的所选特性(血清半衰期)，并同时保持与主题恒定区结构域相关的其他所需功能完整。此外，正如上文暗指的，所公开的抗体的恒定区可以通过改进得到的构建物的概况的一个或多个氨基酸的突变或置换来合成。就此而言，可能可以破坏由保守结合位点提供的活性(例如Fc结合)，并同时基本上维持修饰的抗体的构型和免疫原性概况。其他实施方式包含向恒定区添加一个或多个氨基酸以改进所需特性例如效应子功能，或提供更多的细胞毒素或糖类附连。在这些实施方式中，插入或复制源自于所选恒定区结构域的特定序列，可能是合乎需要的。
本发明还提供了包含本文中描述的抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)、基本上由其构成或由其构成的抗体，所述抗体或其片段免疫特异性结合到HTT。可以使用本领域技术人员已知的标准技术将突变引入到编码抗体的核苷酸序列中，包括但不限于引起氨基酸置换的定点突变和PCR介导的突变。优选地，所述变体(包括衍生物)编码相对于参比VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2,或VL-CDR3少于50个氨基酸置换、少于40个氨基酸置换、少于30个氨基酸置换、少于25个氨基酸置换、少于20个氨基酸置换、少于15个氨基酸置换、少于10个氨基酸置换、少于5个氨基酸置换、少于4个氨基酸置换、少于3个氨基酸置换或少于2个氨基酸置换。“保守的氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，可以例如通过饱和突变沿着全部或部分编码序列随机引入突变，并且可以筛选得到的突变体的生物活性以鉴定保留了活性(例如结合HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的能力)的突变体。
例如，可以仅在抗体分子的构架区中或仅在CDR区中引入突变。引入的突变可能是沉默的或中性的无义突变，例如对抗体的结合抗原的能力没有或具有很少影响，事实上某些这样的突变完全不改变氨基酸序列。这些类型的突变可用于优化密码子用法或提高杂交瘤的抗体生产。编码本发明的抗体的密码子优化的编码区在本文中别处公开。或者，非中性的无义突变可能改变抗体的结合抗原的能力。大多数沉默或中性无义突变的位置可能在构架区中，而大多数非中性无义突变的位置可能在CDR中，尽管这不是绝对要求。本领域技术人员可以设计并试验具有所需性质的突变分子，例如抗原结合活性没有改变或结合活性改变(例如抗原结合活性提高或抗体特异性改变)的突变分子。在突变后，可以按惯例表达编码的蛋白，并且可以使用本文中描述的技术或通过本领域中已知的按惯例修改的技术来确定编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如免疫特异性结合HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的至少一个表位的能力)。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由单链和双链DNA、作为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链和双链区的混合物的RNA以及包含DNA和RNA的杂合分子，所述杂合分子可以是单链的，或者更通常是双链的或单链和双链区的混合物。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由三链区构成，所述三链区包含RNA或DNA或RNA与DNA两者。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可以含有一个或多个修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括例如氚化的碱基和稀有碱基例如次黄苷。可以对DNA和RNA做出各种不同修饰；因此，“多核苷酸”涵盖了化学、酶法或代谢修饰的形式。
编码源自于免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸，可以通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失引入到免疫球蛋白的核苷酸序列中，以便在编码的蛋白中引入一个或多个氨基酸置换、添加或缺失，来产生。突变可以通过标准技术例如定点突变和PCR介导的突变来引入。优选地，在一个或多个非必需氨基酸残基处制造保守的氨基酸置换。
正如公知的，可以从原始B细胞、杂交瘤细胞或其他转化的细胞，通过标准技术例如异硫氰酸胍提取和沉淀随后进行离心或层析来分离RNA。在需要时，可以通过标准技术例如在寡聚dT纤维素上的层析，从总RNA分离mRNA。适合的技术在本领域中是熟知的。在一个实施方式中，编码抗体的轻链和重量的cDNA，可以按照公知的方法使用反转录酶和DNA聚合酶同时或分开地制造。PCR可以通过共有恒定区引物或基于已发表的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更特异性的引物来启动。正如上面讨论的，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以通过共有引物或更大的同源探针例如人类恒定区探针来筛选文库。DNA、通常为质粒DNA，可以使用本领域中已知的技术从细胞分离，按照例如在前面与重组DNA技术相关的文献中详细提出的标准的公知技术进行限制性作图和测序。当然，DNA可以在分离过程或随后的分析期间的任何时间点，按照本发明来合成。
就此而言，本发明还涉及至少编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的结合结构域或可变区的多核苷酸。在一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其构成或由其构成，其中所述重链可变区的至少一个CDR或所述重链可变区的至少两个VH-CDR与来自于本文公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。或者，所述VH的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3区与来自于本文公开的抗体的参比重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。因此，根据这个实施方式，本发明的重链可变区具有与图1中示出的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其构成或由其构成，其中所述轻链可变区的至少一个VL-CDR或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自于本文公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。或者，所述VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区与来自于本文公开的抗体的参比轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一。因此，根据这个实施方式，本发明的轻链可变区具有与图1中示出的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其构成或由其构成，其中所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组同一的多肽序列。
正如在本领域中已知的，两个多肽或两个多核苷酸之间的“序列同一性”，通过将一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二个多肽或多核苷酸的序列进行比较来确定。当在本文中讨论时，任何特定多肽是否与另一个多肽至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一，可以使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件来确定，例如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith and Waterman,Advances inApplied Mathematics 2(1981),482-489的局部同源性算法来寻找两个序列之间的最佳同源性区段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与符合本发明的参比序列例如95％同一时，当然将参数设定为使得同一性百分率在参比多肽序列的全长内计算，并容许参比序列中高达5％的氨基酸总数的同源性空位。
在本发明的优选实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有抗HTT抗体和/或识别表II中示出的HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段中的polyP区的抗体的VH或VL区的多核苷酸序列。此外，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有抗HTT抗体和/或识别表III中示出的HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段中的富P区和/或还识别的表IV中示出的HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段中的C-末端区和/或还识别的表VII中示出的HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段中的富Q/P区的抗体的VH或VL区的多核苷酸序列。此外，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有抗HTT抗体和/或识别表V中示出的HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的抗体的VH或VL区的多核苷酸序列。另外，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有抗HTT抗体和/或识别表VI中示出的HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的中的N-末端区的抗体的VH或VL区的多核苷酸序列。此外，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有抗HTT抗体和/或识别表V中示出的HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的抗体的VH或VL区的多核苷酸序列。此外或可选地，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有抗HTT抗体和/或表VIII中示出的抗体的VH或VL区的多核苷酸序列。
就此而言，本领域技术人员将会容易地认识到，所述至少编码轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码两条免疫球蛋白链或仅仅一条链的可变结构域。因此，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有表II、III、IV、V、VI、VII或VIII中示出的抗HTT抗体和/或其片段的VH和VL区的多核苷酸序列。
表II：识别HTT、即采取聚集形式的外显子1的polyP区的表位的抗体的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0001218242340000771
Figure BDA0001218242340000781
Figure BDA0001218242340000791
Figure BDA0001218242340000801
Figure BDA0001218242340000811
Figure BDA0001218242340000821
Figure BDA0001218242340000831
Figure BDA0001218242340000841
Figure BDA0001218242340000851
Figure BDA0001218242340000861
Figure BDA0001218242340000871
Figure BDA0001218242340000881
表III：识别HTT、即采取聚集形式的外显子1的富P区的表位的抗体
的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0001218242340000882
Figure BDA0001218242340000891
Figure BDA0001218242340000901
Figure BDA0001218242340000911
表IV：识别HTT、即采取聚集形式的外显子1的C-末端区的表位的抗体的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0001218242340000912
Figure BDA0001218242340000921
Figure BDA0001218242340000931
表V：识别HTT物质和/或其片段的抗体的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0001218242340000932
Figure BDA0001218242340000941
Figure BDA0001218242340000951
Figure BDA0001218242340000961
表VI：识别HTT、即采取聚集形式的外显子1的N-末端区的表位的抗体的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0001218242340000962
Figure BDA0001218242340000971
表VII：识别HTT、即采取聚集形式的外显子1的富Q/P区的表位的抗体的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0001218242340000972
Figure BDA0001218242340000981
由于克隆策略，重链和轻链的N-端和C-端处的氨基酸序列可能潜在地在FR1和FR4中含有引物引起的改变，然而它基本上不影响抗体的生物活性。为了提供共有的人类抗体，可以将原始克隆的核苷酸和氨基酸序列按照数据库中的相关人类种系可变区序列进行比对和微调，参见例如如上所述的Vbase2。当N-端和C-端氨基酸被认为可能由于PCR引物而偏离共有种系序列并因此已被引物诱导的突变校正(PIMC)替换时，人类抗体的氨基酸序列用粗体指示，参见表VI。因此，在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸包含一种核酸、基本上由其构成或由其构成，所述核酸具有表VI中示出的抗HTT抗体和/或其片段的VH和VL区的多核苷酸序列。
表VIII：识别HTT物质和/或其片段的抗体的VH和VL区的核苷酸序列，示出了通过PIMC的替换(粗体)。
Figure BDA0001218242340000982
Figure BDA0001218242340000991
Figure BDA0001218242340001001
Figure BDA0001218242340001011
Figure BDA0001218242340001021
Figure BDA0001218242340001031
Figure BDA0001218242340001041
Figure BDA0001218242340001051
Figure BDA0001218242340001061
本发明还包括本文中别处所描述的本发明的多核苷酸的片段。此外，本发明还设计了编码本文中所描述的融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸。所述多核苷酸可以通过本领域中已知的任何方法来生产或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则编码所述抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸组装，例如在Kutmeier等，BioTechniques 17(1994),242中所描述的，其简单来说涉及合成含有编码所述抗体的部分的交叠的寡核苷酸，将这些寡核苷酸退火并连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以从来自于适合来源的核酸产生。如果不能得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但抗体分子的序列已知，则编码所述抗体的核酸可以化学合成，或从适合的来源(例如抗体cDNA文库或从分离自表达HTT特异性抗体的任何组织或细胞例如所选的表达抗体的杂交瘤细胞的核酸、优选为polyA+RNA产生的cDNA文库)，使用可以杂交到所述序列的3’和5’末端的合成引物通过PCR扩增，或通过使用特异性针对特定基因序列的寡核苷酸探针从例如编码所述抗体的cDNA文库鉴定cDNA克隆以进行克隆，来产生。然后可以使用本领域中公知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
在抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列被确定后，可以使用本领域中公知的用于操作核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定点突变、PCR等(参见例如在Sambrook等，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning,A LaboratoryManual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)和Ausubel等主编，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons,NY(1998)中描述的技术，两者整体通过参考并入本文)对其核苷酸序列进行操作，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
在操作分离到的遗传物质以提供本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物后，通常将编码所述抗体的多核苷酸插入到表达载体中，用于引入到可用于生产所需量的抗体的宿主细胞中。在本文中描述了结合到靶分子的抗体或其片段、衍生物或类似物例如抗体的重链或轻链的重组表达。在获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分(优选地含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸后，可以使用本领域中公知的技术通过重组DNA技术产生用于生产所述抗体分子的载体。因此，本文中描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体编码序列和适合的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了一种可复制的载体，其包含可操作连接到启动子的编码本发明的抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列。这些载体可以包括编码所述抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如国际申请WO 86/05807和WO89/01036以及美国专利号5,122,464)，并且可以将所述抗体的可变结构域克隆到这种载体中，用于表达完整的重链或轻链。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指称根据本发明作为介质用于将所需基因引入到宿主细胞中并在其中表达的载体。正如本领域技术人员已知的，这些载体可以容易地从质粒、噬菌体、病毒和反转录病毒中选择。一般来说，与本发明相容的载体将包含便于目标基因的克隆和促进其进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力的选择性标志物、适合的限制性位点。出于本发明的目的，可以使用大量的表达载体系统。例如，一类载体利用源自于动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、反转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他载体涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，在其染色体内整合有所述DNA的细胞，可以通过引入允许选择被转染的宿主细胞的一个或多个标志物进行选择。所述标志物可以提供营养缺陷宿主的原养型、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属例如铜的抗性。所述可选择标志物基因可以被直接连接到待表达的DNA序列，或者通过共转化引入到同一细胞中。为了mRNA的最优合成，可能还需要其他元件。这些元件可以包括信号序列、拼接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中，正如上面讨论的，将克隆的可变区基因与重链和轻链恒定区基因(优选为人类的)一起插入到表达载体中。在一个实施方式中，这使用BiogenIDEC,Inc.的被称为NEOSPLA的专用表达载体来实现，所述载体公开在美国专利号6,159,730中。这种载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制原点、牛生长激素多腺苷化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已发现，这种载体在并入可变区和恒定区基因，转染到CHO细胞中，随后在含有G418的培养基中选择并进行甲氨蝶呤扩增后，产生非常高水平的抗体表达。当然，在本发明中可以使用能够在真核细胞中引发表达的任何表达载体。适合的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可以从Invitrogen,San Diego,CA获得)以及质粒pCI(可以从Promega,Madison,WI获得)。一般来说，筛选大量转化的细胞以获得适合地表达高水平免疫球蛋白重链和轻链的细胞是常规实验，其可以例如通过机器人系统来进行。载体系统也教示在美国专利号5,736,137和5,658,570中，其每个整体通过参考并入本文。这种系统提供了高的表达水平，例如>30pg/细胞/天。其他示例性载体系统公开在例如美国专利号6,413,777中。
在其他优选实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用例如在美国专利申请号2003-0157641A1中公开并整体并入本文的多顺反子构建物来表达。在这些表达系统中，可以从单一多顺反子构建物生产多个目标基因产物例如抗体的重链和轻链。有利的是，这些系统使用内部核糖体进入位点(IRES)来提供相对高的抗体水平。相容的IRES序列公开在美国专利号6,193,980中，其也并入本文。本领域技术人员将会认识到，这些表达系统可用于有效地生产本申请中公开的整个范围的抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种载体，其包含至少编码抗体的免疫球蛋白链的结合结构域或可变区的多核苷酸，并任选地与编码所述结合分子的其他免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸组合。
更通常地，在已制备编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列后，可以将所述表达载体引入到适合的宿主细胞中。质粒在宿主细胞中的引入可以通过本领域技术人员公知的各种不同技术来实现。这些技术包括但不限于转染、包括使用例如
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或脂质体的脂质体转染，原生质体融合，磷酸钙沉淀，使用包封DNA的细胞融合，显微注射和用完整病毒感染。通常，质粒在宿主中的引入是通过标准的磷酸钙共沉淀方法。将带有所述表达构建物的宿主细胞在适合于生产轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白的合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或荧光活化细胞分拣器分析(FACS)、免疫组织化学等。
通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以生产在本文描述的方法中使用的抗体。因此，本发明包括宿主细胞，其包含编码本发明的抗体或其重链或轻链或至少包含其免疫球蛋白的结合结构域或可变区的多核苷酸，所述多核苷酸优选地可操作连接到异源启动子。此外或可选地，本发明还包括包含上文中所定义的载体的宿主细胞，所述载体包含至少编码所述抗体的免疫球蛋白链的结合结构域或可变区的多核苷酸，并任选地与编码所述结合分子的另一个免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸组合。在优选实施方式中，为了表达双链抗体，可以将编码重链和轻链两者的单一载体或多个载体在宿主细胞中共表达，用于表达完整的免疫球蛋白分子，正如在下文中详述的。
可以将宿主细胞用两个本发明的表达载体共转染，第一载体编码重链来源的多肽，第二载体编码轻链来源的多肽。这两个载体可以含有能够使重链和轻链多肽同等表达的同一的选择性标志物。或者，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单一载体。在这种情况下，有利的是将轻链置于重链之前，以避免过量的有毒的游离重链；参见Proudfoot,Nature322(1986),52；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),2197。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
当在本文中使用时，“宿主细胞”是指带有使用重组DNA技术构建并编码至少一个异源基因的载体的细胞。在从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以指称抗体的来源，除非明确规定不是如此。换句话说，从“细胞”回收多肽可以意味着从离心下来的全细胞或从含有培养基和悬浮的细胞两者的细胞培养物回收。
可以利用各种不同的宿主-表达载体系统来表达在本文描述的方法中使用的抗体分子。这些宿主-表达系统代表了可用于生产并随后纯化目标编码序列的介质，但是也代表了当用适合的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些系统包括但不限于用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或带有含有源自于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞)。优选地，细菌细胞例如大肠杆菌，更优选地真核细胞、特别是用于表达完整重组抗体分子的真核细胞，被用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞与载体例如来自于人类巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件相结合，是用于抗体的有效的表达系统；参见例如Foecking等，Gene 45(1986),101；Cockett等，Bio/Technology 8(1990),2。
用于蛋白质表达的宿主细胞系通常是哺乳动物起源的；相信本领域技术人员具有优先确定最适合于将要在其中表达的目标基因产生的特定宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系包括但不限于CHO(中华仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中华仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人子宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(中华仓鼠卵成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。CHO和293细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可以从商业化服务商、美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或发表的文献获得。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株系。蛋白产物的这些修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰机制。可以选择适合的细胞系或宿主系统，以确保表达的外来蛋白的正确修饰和加工。就此而言，可以使用具有正确加工基因产物的原始转录本、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。
对于重组蛋白的长期、高生产率来说，稳定的表达是优选的。例如，可以工程化改造稳定表达所述抗体分子的细胞系。不是使用含有病毒复制原点的表达系统，而是可以将宿主细胞用受到适合的表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷化位点等)控制的DNA和可选择标志物转化。在导入外来DNA后，可以允许工程化改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换到选择培养基。重组质粒中的可选择标志物赋予对所述选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长以形成灶点，其进而可以被克隆并在细胞系中扩增。这种方法可以有利地用于工程化改造稳定表达抗体分子的细胞系。
可以使用大量选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell11(1977),223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992),202)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell 22(1980),817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。此外，抗代谢物抗性也可用作下列基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),357；O'Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等，Clinical Pharmacy 12(1993),488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3(1991),87-95；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596；Mulligan,Science 260(1993),926-932；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217；TIB TECH 11(1993),155-215)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30(1984),147)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述在下述文献中：Ausubel等主编，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler，《基因转移和表达实验指南》(GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual)，Stockton Press,NY(1990)；以及Dracopoli等主编，《人类遗传学现代方法》(Current Protocols in Human Genetics)，John Wiley&Sons,NY(1994)中的第12和13章；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150:1(1981)，所述文献整体通过参考并入本文。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增来提高，对于综述，参见Bebbington和Hentschel，“在DNA克隆中将基于基因扩增的载体用于被克隆基因在哺乳动物细胞中的表达”(The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning)，Academic Press,New York,Vol.3.(1987)。当表达抗体的载体系统中的标志物可扩增时，宿主细胞的培养物中存在的抑制剂水平的提高将提高标志物基因的拷贝数。由于被扩增区域与抗体基因相连，因此抗体的生产也提高；参见Crouse等，Mol.Cell.Biol.3(1983),257。
体外生产允许规模放大以提供大量的目标多肽。在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，并包括均匀悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌釜反应器中，或固定化或捕获式细胞培养，例如在中空纤维、微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷柱上。如有必要和/或需要，可以将多肽溶液通过惯常的层析方法例如凝胶过滤、离子交换层析、在DEAE-纤维素上层析或(免疫)亲和层析进行纯化，例如在合成的铰链区多肽的优先生物合成后或在本文中描述的HIC层析步骤之前或之后。
编码本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因，也可以在非哺乳动物细胞例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中表达。容易摄入核酸的细菌包括肠杆菌科的成员例如大肠杆菌或沙门氏菌(Salmonella)的菌株，芽孢杆菌科例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，肺炎球菌(Pneumococcus)，链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还应该认识到，当在细菌中表达时，异源多肽通常变成包涵体的一部分。所述异源多肽必须被分离，纯化，然后组装成有功能的分子。在需要四价形式的抗体时，随后将亚基自组装成四价抗体，参见例如国际申请WO 02/096948。
有利的是，在细菌系统中，取决于所表达的抗体分子的目标用途，可以选择大量表达载体。例如，当为了产生抗体分子的药物组合物而将要生产大量这种蛋白时，指导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体可能是理想的。这些载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2(1983),1791)，其中可以将抗体编码序列单个地连接到载体中并与lacZ编码区同框，以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,NucleicAcids Res.13(1985),3101-3109；Van Heeke和Schuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)等。也可以使用pGEX载体将外来多肽表达成与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来说，这些融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附并结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠子的基质，随后在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱，从裂解的细胞容易地纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以便可以从GST基团上释放出被克隆的靶基因产物。
除了原核生物之外，也可以使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母在真核微生物中最为常用，尽管大量其他菌株通常也可获得，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。为了在酵母菌(Saccharomyces)中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature 282(1979),39；Kingsman等，Gene 7(1979),141；Tschemper等，Gene 10(1980),157)。该质粒已经含有TRP1基因，其为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择性标志物(Jones,Genetics85(1977),12)。随后作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl损伤的存在，为通过在不存在色氨酸情况下的生长来检测转化提供了有效环境。
在昆虫系统中，通常将苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。所述病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单个地克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。
在本发明的抗体分子已被重组表达后，完整抗体、它们的二聚体、单个的轻链和重链或本发明的其他免疫球蛋白形式，可以按照本领域的标准程序进行纯化，包括例如通过层析(例如离子交换，亲和，特别是通过在蛋白A后对特定抗原的亲和性，和尺寸分级柱层析)，离心，差异溶解性例如硫酸铵沉淀，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术；参见例如Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Purification)，Springer Verlag,N.Y.(1982)。或者，用于提高本发明的抗体的亲和性的优选方法公开在美国专利出版号2002-0123057A1中。因此，在一个实施方式中，本发明还提供了一种用于制备抗HTT抗体或识别突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的抗体或其免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养上文中所定义的宿主细胞，所述细胞包含上文中所定义的多核苷酸或载体；以及
(b)从所述培养物分离所述抗体或免疫球蛋白链。
此外，在一个实施方式中，本发明还涉及一种抗体或其免疫球蛋白链，其由上文中所定义的多核苷酸编码，或者可以通过所述用于制备抗HTT抗体或识别突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的抗体或其免疫球蛋白链的方法来获得。
V.融合蛋白和偶联物
在某些实施方式中，所述抗体多肽包含通常不与抗体相伴的氨基酸序列或一个或多个基团。示例性的修饰在下文中更详细描述。例如，本发明的单链Fv抗体片段可以包含柔性连接序列，或者可以被修饰以添加有功能的基团(例如PEG、药物、毒素或标记物例如荧光、放射活性、酶、核磁、重金属等)。
本发明的抗体多肽可以包含融合蛋白、基本上由融合蛋白构成或由融合蛋白构成。融合蛋白是嵌合分子，其包含例如免疫球蛋白的具有至少一个靶结合位点的结合HTT的结构域和至少一个异源部分，即在自然界中不与其天然相连的部分。所述氨基酸序列通常可能存在于分开的蛋白质中并在所述融合多肽中被放在一起，或者它们通常可能存在于同一蛋白中但在所述融合多肽中以新的排列方式放置。融合蛋白可以例如通过化学合成或通过产生并翻译以所需关系编码肽区域的多核苷酸，来产生。
术语“异源的”当应用于多核苷酸或多肽时，意味着所述多核苷酸或多肽源自于与正在比较的实体的其余部分不同的实体。例如，当在本文中使用时，融合到抗体或其抗原结合片段、变体或类似物的“异源多肽”源自于同一物种的非免疫球蛋白多肽或不同物种的的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
正如在本文中别处更详细讨论的，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以被进一步重组融合到异源多肽的N-端或C-端，或化学偶联(包括共价和非共价偶联)到多肽或其他组合物。例如，抗体可以被重组融合或偶联到可以在检测测定法中用作标记物的分子或效应分子例如异源多肽、药物、放射性核素或毒素；参见例如国际申请WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、美国专利号5,314,995和欧洲专利申请EP 0 396 387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或修饰的肽键即肽电子等排体彼此相连的氨基酸构成，并且可以含有20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。抗体可以通过天然过程例如翻译后加工或通过本领域中公知的化学修饰技术来修饰。这些修饰在基础教科书中更详细的专著以及大量研究文献中被充分描述。修饰可以发生在抗体中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端，或在基团例如糖类上。应该认识到，相同类型的修饰可能以相同或不同的程度存在于给定抗体中的几个位点处。给定抗体也可能含有许多类型的修饰。抗体可以是支链的，例如作为遍在蛋白化的结果，并且它们可以是环状的，带有或不带有支链。环状、支链和支链环状抗体可以从翻译后的天然过程产生，或者可以通过合成方法来制造。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素蛋白的共价附连、血红素基团的共价附连、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附连、脂类或脂类衍生物的共价附连、磷脂酰肌醇的共价附连、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、硒酰化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化；参见例如《蛋白质：结构和分子性质》(Proteins-Structure And Molecular Properties)，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company,New York，第二版，(1993)；《蛋白质的翻译后共价修饰》(Postranslational Covalent Modification of Proteins)，B.C.Johnson主编，Academic Press,New York,(1983)1-12；Seifter等，Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等，Ann.NY.Acad.Sei.663(1992)，48-62。
本发明还提供了包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物和异源多肽的融合蛋白。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含具有本发明的抗体的任一个或多个VH区的氨基酸序列或本发明的抗体或其片段或变体的任一个或多个VL区的氨基酸序列以及异源多肽序列的多肽，基本上由所述多肽构成或由所述多肽构成。在另一个实施方式中，在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包含具有抗体或其片段、变体或衍生物的任一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列或抗体或其片段、变体或衍生物的任一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列以及异源多肽序列的多肽，基本上由所述多肽构成或由所述多肽构成。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含具有本发明的抗体或其片段、衍生物或变体的VH-CDR3的氨基酸序列以及异源多肽序列的多肽，所述融合蛋白特异性结合到HTT。在另一个实施方式中，融合蛋白包含具有本发明的抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明的抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个VL区的氨基酸序列以及异源多肽序列的多肽。优选地，所述融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合HTT的单一源抗体(或scFv或Fab片段)。在又一个实施方式中，在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包含具有抗体的任一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和抗体或其片段或变体的任一个、两个、三个或更多个VLCDR的氨基酸序列以及异源多肽序列的多肽。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或更多个所述VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单一源抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也被本发明涵盖。
在文献中报道的示例性融合蛋白包括与下述物质的融合体：T细胞受体(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),2936-2940)，CD4(Capon等，Nature337(1989),525-531；Traunecker等，Nature 339(1989),68-70；Zettmeissl等，DNA CellBiol.USA 9(1990),347-353；和Byrn等，Nature 344(1990),667-670)，L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等，J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等，Nature 349(1991),164-167)，CD44(Aruffo等，Cell 61(1990),1303-1313)，CD28和B7(Linsley等，J.Exp.Med.173(1991),721-730)，CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174(1991),561-569)，CD22(Stamenkovic等，Cell 66(1991),1133-1144)，TNF受体(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),10535-10539；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；和Peppel等，J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991)，以及IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.115(1991),Abstract No.1448)。
正如在本文中别处讨论的，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以融合到异源多肽，以提高所述多肽的体内半衰期或用于使用本领域中已知方法的免疫测定法中。例如，在一个实施方式中，可以将PEG偶联到本发明的抗体以提高它们的体内半衰期；参见例如Leong等，Cytokine16(2001),106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。此外，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物融合到标志物序列例如肽，以便于它们的纯化或检测。在优选实施方式中，所述标志物氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，例如在pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供的标签等，它们中的许多是可商购的。正如在例如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989),821-824中所描述的，六组氨酸提供了融合蛋白的方便的纯化。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于源自于流感血凝素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson等，Cell 37(1984),767)、GST、c-myc和“flag”标签；对于表位标签技术的综述参见例如Bill Brizzard,BioTechniques 44(2008)693-695，以及其中第694页上列出的可用于本发明的最常用表位标签的表1，所述文献的主题内容明确地通过参考并入本文。
融合蛋白可以使用本领域中公知的方法来制备；参见例如美国专利号5,116,964和5,225,538。制造融合的准确位点可以凭经验选择，以优化融合蛋白的分泌或结合特性。然后将编码融合蛋白的DNA转染到宿主细胞中进行表达，其按照上文中所述进行。
本发明的抗体可以是非偶联形式使用，或者可以偶联到各种不同分子中的至少一种，以例如提高分子的治疗性能、便于靶的检测或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在纯化之前或之后标记或偶联。具体来说，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联到治疗剂、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物应答修饰剂、药剂或PEG。
作为包括常规抗体的免疫毒素的偶联物在本领域中已被广泛描述。可以通过常规的偶联技术将毒素偶联到抗体，或者含有蛋白质毒素部分的免疫毒素可以作为融合蛋白产生。本发明的抗体可以以相应的方式使用以获得这些免疫毒素。这些免疫毒素的实例是由Byers,Seminars Cell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54所描述的那些。
本领域技术人员将会认识到，取决于待偶联的所选试剂，偶联物也可以使用各种不同技术来组装。例如，与生物素的偶联物通过将结合HTT的多肽与生物素的活化的酯例如生物素N-羟基马来酰亚胺酯进行反应来制备。同样地，与荧光标志物的偶联物可以在例如本文中列出的偶联剂存在下，或通过与异硫氰酸酯、优选为荧光素异硫氰酸酯反应，来制备。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的偶联物以类似的方式制备。
本发明还涵盖了偶联到诊断或治疗剂的本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。所述抗体可以在诊断上用于例如证实HTT淀粉样变性的存在以指示获得与突变和/或聚集的HTT相关的疾病或病症的风险，监测这种疾病、即显示出聚集HTT的存在或与聚集的HTT相关的疾病的发生或发展，或作为临床测试程序的一部分以例如确定给定的治疗和/或预防方案的效能。因此，在一个实施方式中，本发明涉及被可检测标记的抗体。此外，在一个实施方式中，本发明涉及附连到药物的抗体。可以通过将抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联到可检测物质以便于检测。所述可检测物质或标记物通常可以是酶，重金属、优选为金，染料、优选为荧光或发光染料，或放射活性标记物。可检测物质的实例包括各种不同的酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射活性材料、使用各种正电子发射断层扫描术的正电子发射金属和非放射活性顺磁性金属离子；对于可以按照本发明偶联到抗体用作诊断剂的金属离子，参见例如美国专利号4,741,900。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；适合的放射活性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。因此，在一个实施方式中，本发明提供了可检测标记的抗体，其中所述可检测标记物选自酶、放射性同位素、荧光团和重金属。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以通过将它偶联到化学发光化合物进行可检测标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在，来测定带有化学发光标签的抗体。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
可以对抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行可检测标记的一种方式，是将其连接到酶并在酶免疫测定法(EIA)中使用所述连接的产物(Voller,A.，“酶联免疫吸附测定法(ELISA)”(The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA))，MicrobiologicalAssociates Quarterly Publication,Walkersville,Md.,Diagnostic Horizons 2(1978),1-7；Voller等，J.Clin.Pathol.31(1978),507-520；Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523；Maggio,主编，《酶免疫测定法》(Enzyme Immunoassay)，CRC Press,BocaRaton,Fla.,(1980)；Ishikawa等主编，《酶免疫测定法》(Enzyme Immunoassay)，KgakuShoin,Tokyo(1981))。结合到抗体的酶将与适合的底物、优选为产色底物反应，以便产生可以例如通过分光光度、荧光测定或目测手段来检测的化学基团。可用于可检测标记所述抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-甾醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，检测可以通过比色法来实现，所述方法利用酶的产色底物。检测也可以通过将底物与类似制备的标准品的酶反应程度进行目测比较来实现。
检测也可以使用各种其他免疫测定法中的任一者来实现。例如，通过对抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行放射活性标记，可以通过使用放射免疫测定法(RIA)来检测抗体(参见例如Weintraub,B.，《放射免疫测定法原理》(Principles ofRadioimmunoassays)，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,(March,1986))，其通过参考并入本文)。放射活性同位素可以通过包括但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影的手段来检测。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以使用发射荧光的金属例如152Eu或其他镧系金属进行可检测标记。可以使用金属螯合基团例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)将这些金属附连到抗体。
用于将各种不同基团偶联到抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是公知的，参见例如Arnon等，“在癌症疗法中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体”(MonoclonalAntibody For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)，在《单克隆抗体和癌症疗法》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)中，Reisfeld等主编，pp.243-56，Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等，“用于药物递送的抗体”(Antibodies For DrugDelivery)，在《受控药物递送》(Controlled Drug Delivery)(第二版)中，Robinson等主编，Marcel Dekker,Inc.,(1987)623-53；Thorpe，“癌症疗法中的细胞毒性剂的抗体载体：综述”(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review)，在《单克隆抗体’84：生物和临床应用》(Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications)中，Pinchera等主编，(1985)475-506；“放射性标记的抗体在癌症疗法中的治疗性应用的分析、结果和未来展望”(Analysis,Results,And Future Prospective OfThe Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)，在《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy)，Baldwin等主编，Academic Press(1985)303-16，和Thorpe等，“抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性性质”(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)，Immunol.Rev.62(1982),119-158。
正如提到的，在某些实施方式中，可以偶联提高结合分子例如结合多肽如抗体或其免疫特异性片段的稳定性或效能的基团。例如，在一个实施方式中，可以将PEG偶联到本发明的结合分子以提高它们的体内半衰期。Leong等，Cytokine16(2001),106；Adv.in DrugDeliv.Rev.54(2002),531；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
VI.组合物和使用方法
本发明涉及包含上面提到的本发明的HTT结合分子例如抗体或其抗原结合片段或其衍生物或变体，或上文中所定义的本发明的多核苷酸、载体或细胞的组合物。在一个实施方式中，本发明的组合物是药物组合物，并且还包含可药用载体。此外，取决于药物组合物的目标用途，本发明的药物组合物可以包含其他药剂例如白介素或干扰素。为了在显示出突变和/或聚集的HTT例如HTT淀粉样变性的出现或与其相关的疾病或障碍的治疗中使用，添加的药剂可以选自小的有机分子、抗HTT抗体及其组合。因此，在特别优选的实施方式中，本发明涉及将本发明的HTT结合分子例如抗体或其抗原结合片段或与其任一者具有基本上相同的结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞用于制备药物或诊断组合物，用于亨廷顿病(HD)和/或与HTT和/或HTT淀粉样变性相关的疾病或障碍的预防或治疗性治疗，在对象中监测HD和/或与HTT和/或HTT淀粉样变性相关的疾病或障碍的进展或对HTT淀粉样变性治疗的响应，或用于确定对象发生与HTT相关的疾病或障碍的风险。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及以HTT和/或聚集和/或突变的HTT在受影响的系统和器官中的异常积累和/或沉积为特征的疾病或病症的治疗方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的本发明的上述HTT结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞中的任一者。
本发明的治疗方法的特别优点在于下述事实，即本发明的重组抗体源自于来自于没有疾病的征兆或症状例如携带一个和/或多个无症状的突变、显示出聚集的HTT的存在或与其相关的健康人类对象的B细胞或记忆性B细胞，因此有一定可能性能够阻止与突变和/或聚集的HTT相关的临床表现的疾病，或降低临床表现的疾病或障碍出现的风险，或延迟临床表现的疾病或障碍的发作或进展。通常，本发明的抗体也已经成功地经历体细胞成熟，即利用抗体可变区的体细胞变异在高亲和性结合到靶HTT分子的选择性和有效性方面进行优化。
在自体免疫或过敏反应的意义上这些细胞在体内例如在人类中尚未利用相关或其他生理性蛋白或细胞结构进行活化这一认识，在医学上也是极为重要的，因为这意味着通过临床试验阶段成功留存的机会相当大地增加。可以说，在预防或治疗性抗体的临床前和临床开发之前，效率、可接受性和耐受性已在至少一个人类对象中得到证实。因此可以预期本发明的人源抗HTT抗体，其作为治疗剂的靶结构特异性效率及其降低的副作用概率两者，显著提高了它的临床成功概率。
本发明还分别提供了药物和诊断包或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器装填有一种或多种上述成分例如本发明的抗HTT抗体、结合片段、其衍生物或变体、多核苷酸、载体或细胞。这些容器可以伴有由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，所述通知反映出被所述机构批准制造、使用或销售用于人类给药。此外或可替选的，所述试剂盒包含在适合的诊断测定法中使用的试剂和/或说明书。当然，本发明的组合物例如试剂盒特别适合于亨廷顿病和/或伴有突变和/或聚集的HTT的出现的疾病或病症的风险评估、诊断、预防和治疗，并且尤其适用于通常以HTT淀粉样变性为特征的障碍的治疗。
本发明的药物组合物可以按照本领域中公知的方法配制；参见例如《Remington：药物学科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，(2000)，theUniversity of Sciences in Philadelphia,ISBN0-683-306472。适合的药物载体的实例在本领域中是公知的，并包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液例如水包油乳液、各种不同类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这些载体的组合物可以通过公知的常规方法来配制。这些药物组合物可以以适合的剂量给药到对象。适合的组合物的给药可以通过不同方式来进行，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、表面或真皮内给药或脊柱或脑递送。气溶胶配方例如鼻喷剂配方包括活性药剂的纯化的水性或其他溶液以及防腐剂和等渗剂。这些配方优选地被调整到与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道给药的配方可以表现为具有适合载体的栓剂。
剂量方案由主治医师和临床因素决定。正如在医学领域中公知的，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身体大小、身体表面积、年龄、待给药的具体化合物、性别、给药的时间和途径、总体健康和同时给药的其他药物。典型的剂量可以例如在0.001至1000μg的范围内(或该范围内的用于表达或用于抑制表达的核酸)；然而，还设想了低于或高于这个示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。一般来说，剂量可以在例如约0.0001至100mg/kg、更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选地至少为1mg/kg。在上述范围中间的剂量也打算包含在本发明的范围之内。对象可以每日、隔日、每周或按照通过经验分析确定的任何其他日程安排给药这些剂量。示例性的治疗需要在长时间段例如至少6个月内分多个剂量给药。其他示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次给药。示例性的剂量日程安排包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg、隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在某些方法中，将具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体同时给药，在这种情况下给药的每种抗体的剂量落于所指明的范围内。可以通过定期评估来监测进展。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外介质包括氯化钠溶液、Ringer's右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸Ringer's溶液或不挥发油。静脉内介质包括流体和营养补充物、电解质补充物(例如基于Ringer's右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，取决于药物组合物的目标用途，本发明的药物组合物可以包含其他药剂例如多巴胺或精神病理药物。
此外，在本发明的优选实施方式中，例如如果本发明的药物组合物包含抗HTT抗体或HTT结合片段、其衍生物或合成或生物技术变体，则所述药物组合物可以配制成用于被动免疫的疫苗。正如在背景部分中提到的，突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段或衍生物是HTT淀粉样变性的主要触发物。因此，可以审慎地预期，使用本发明的人类抗HTT抗体和等效的HTT结合分子的被动免疫将有助于避免主动免疫疗法概念的几种不利效果，并导致HTT聚集减少。因此，本发明的抗HTT抗体和它们的等效物作为用于预防或改善显示出聚集的HTT的存在或由聚集的HTT引起的疾病或病症例如HD的疫苗，是特别有用的。
在一个实施方式中，使用本发明的抗体的重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)可能是有益的，它们可能更容易穿透细胞膜。例如先期在线出版的Robert等，ProteinEng.Des.Sel.(2008)；S1741-0134，描述了识别Aβ的N-末端区中的表位的单克隆抗体WO-2的嵌合重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)的用途。所述工程化的片段能够(i)防止淀粉样肽纤丝化，(ii)解聚预先形成的Aβ1-42纤丝，并(iii)在体外与完整IgG分子同样高效地抑制Aβ1-42寡聚物介导的神经毒性。使用缺少效应子功能的小Fab和scFv工程化抗体形式的设想的优点包括更高效地通过血脑屏障和最小化引发炎性副反应的风险。此外，scFv和单结构域抗体除了保留全长抗体的结合特异性之外，它们可以作为单个基因并在哺乳动物细胞内作为胞内抗体细胞内表达，具有改变折叠、相互作用、修饰或它们的靶的亚细胞定位的潜力；对于综述，参见例如Miller和Messer，Molecular Therapy 12(2005),394–401。
在一种不同方法中，Muller等，Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241描述了一种技术平台，即所谓的“超级抗体技术”，其据称能够使抗体穿梭到活细胞中而不伤害它们。这种穿透细胞的抗体打开了新的诊断和治疗之窗。已为这些抗体创造了术语“TransMabs”。
在另一个实施方式中，对治疗与突变和/或聚集的HTT有关的疾病、病症或症状有用的其他抗体的共同给药或顺序给药，可能是合乎需要的。在一个实施方式中，所述其他抗体被包含在本发明的药物组合物中。可用于治疗对象的抗体的实例包括但不限于靶向CD33、SGLT2、IL-6和IL-1的抗体。
在另一个实施方式中，对治疗与突变和/或聚集的HTT有关的疾病、病症或症状有用的其他药剂的共同给药或顺序给药，可能是合乎需要的。在一个实施方式中，所述其他药剂包含在本发明的药物组合物中。可用于治疗对象的药剂的实例包括但不限于：靶向不随意肌肉运动的VMAT2抑制剂例如XenazineTM，抗炎性药剂例如二氟尼柳、皮质甾醇、2-(2,6-二氯苯胺)苯乙酸(双氯芬酸)、异丁基-丙酸-酚酸(布洛芬)，利尿剂，表没食子儿茶素没食子酸酯，盐酸美法仑，地塞米松，硼替佐米，硼替佐米-美法仑，硼替佐米-地塞米松，美法仑-地塞米松，硼替佐米-美法仑-地塞米松，抗抑郁剂，抗精神病药，神经松弛剂，抗痴呆症药物(例如NMDA受体拮抗剂美金刚)，乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、HCI、利凡斯的明、加兰他敏)，谷氨酸拮抗剂和其他益智血压药物(例如双肼酞嗪、甲基多巴)，细胞抑制剂，糖皮质激素，血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂，抗炎性药剂，或其任何组合。
治疗有效剂量或量是指活性成分的足以改善症状或病症的量。这些化合物的治疗效能和毒性可以通过标准的制药程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％的群体致死的剂量)。治疗和毒性效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示成LD50/ED50的比率。
从上述内容可以明显看出，本发明涵盖了包含上述抗体的至少一个CDR的HTT结合分子和/或其片段的任何用途，特别是用于诊断和/或治疗如上所述的与突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段相关的疾病或病症，例如HD和/或HTT淀粉样变性。优选地，所述结合分子是本发明的抗体或其免疫球蛋白链。此外，本发明涉及上文中描述的任一提到的抗体的抗独特型抗体。它们是结合到位于抗体的可变区上抗原结合位点附近的独特抗原性肽序列的抗体或其他结合分子，并且可用于例如检测从对象获得的样品中的抗HTT抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了如上文和下面所定义的抗体或与其任一者具有基本上相同的结合特异性的HTT结合分子，本文中所定义的多核苷酸、载体或细胞，或包含其任一者的用于预防性治疗、治疗性治疗和/或监测与HTT相关的疾病或病症的进展或治疗响应的药物或诊断组合物，优选地其中所述病症与HTT淀粉样变性相关，例如亨廷顿病(HD)。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种诊断组合物，其包含上述本发明的HTT结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞中的任一者和任选地适合于检测的手段，例如在基于免疫或核酸的诊断方法中惯常使用的试剂。本发明的抗体适合用于例如可以在液相中使用它们或可以将它们结合到固相载体的免疫测定法中。可以利用本发明的抗体的免疫测定法的实例是采取直接或间接格式的竞争性和非竞争性免疫测定法。这些免疫测定法的实例是放射免疫测定法(RIA)、夹心法(免疫测量测定法)、流式细胞术和Western印迹测定法。可以将本发明的抗原和抗体结合到许多不同载体，并用于分离与其特异性结合的细胞。公知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。出于本发明的目的，载体的本性可以是可溶或不可溶的。本领域普通技术人员已知许多不同的标记物和标记方法。可用于本发明的标记物类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也参见上文中讨论的实施方式。
通过另一个实施方式，也可将本发明的HTT结合分子、特别是抗体用于在个体中诊断疾病或病症的方法中，所述方法包括从测试个体获得体液样品，其可以是血液样品、血浆样品、血清样品、淋巴样品或任何其他体液样品例如唾液或尿液样品，并将所述体液样品与本发明的抗体在能够形成抗体-抗原复合物的条件下进行接触。然后通过本领域中已知的方法测定这些复合物的水平，明显高于在对照样品中形成的复合物的水平指示了测试个体中的所述疾病或病症。也可以以相同的方式使用本发明的抗体结合的特定抗原。因此，本发明涉及包含本发明的结合分子例如抗体或其抗原结合片段的体外免疫测定法。
在本发明的另一个实施方式中，本发明的HTT结合分子、特别是抗体，也可用于在个体中诊断疾病或病症的方法中，所述方法包括从测试个体获得活检样品。
在这种情况下，本发明还涉及为此目的特别设计的手段。例如，可以使用基于抗体的阵列，所述阵列例如装载有特异性识别HTT的本发明的抗体或等效的抗原结合分子。微阵列免疫测定法的设计概述在Kusnezow等，Mol.Cell Proteomics 5(2006),1681-1696中。因此，本发明还涉及装载有按照本发明鉴定的HTT结合分子的微阵列。
在一个实施方式中，本发明涉及一种在对象中诊断与突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段相关的疾病或病症的方法，所述方法包括使用至少一种本发明的抗体、其HTT结合片段或具有与其任一者基本上相同的结合特异性的HTT结合分子，确定来自于待诊断对象的样品中HTT和/或突变和/或聚集的HTT的存在，其中病理性突变和/或聚集的HTT的存在指示了HD和/或HTT淀粉样变性，并且与生理性HTT的水平相比病理性突变和/或聚集的HTT的水平的提高，指示了所述对象中HD和/或HTT淀粉样变性的进展。
待诊断的对象对于所述疾病来说可能是无症状或临床前的。优选地，对照对象患有与突变和/或聚集的HTT相关的疾病例如亨廷顿病(HD)，其中病理性突变和/或聚集的HTT的水平与参比标准之间的相似性，指示了待诊断对象具有HTT淀粉样变性或处于发生HTT淀粉样变性的风险之中。可替选地或此外，作为第二对照，对照对象不具有HTT淀粉样变性，其中生理性HTT和/或突变和/或聚集的HTT的水平与参比标准之间的差异，指示了待诊断对象具有HTT淀粉样变性或处于发生HTT淀粉样变性的风险之中。优选地，待诊断对象和对照对象是年龄匹配的。待分析的样品可以是怀疑含有病理性突变和/或聚集的HTT的任何体液，例如血液、血浆、血清、尿液、腹膜液、唾液或脑脊液(CSF)。在本发明的另一种情况下，本发明的抗体可用于利用例如在Baldo等，Chem.Biol.19(2)(2012),264-275中描述的基于TR-FRET的双路免疫测定法来检测可溶性和聚集的HTT，所述文献的公开内容、特别是273-274页的实验程序，被并入本文。
此外，在例如Ren等，Nature Cell Biol.11(2)(2009),219-225中已描述了在培养物中哺乳动物细胞可以内化纤丝状聚谷氨酰胺肽聚集物，所述聚集物进入胞浆区室并与遍在蛋白-蛋白酶体系统和细胞质伴侣蛋白的组分一起变得共同固定在聚集体中。这些内化的纤丝状聚集物能够选择性召集可溶性细胞质蛋白，并在从染色体基因座表达同源淀粉样变性蛋白的细胞上提供可遗传的表型。因此，在本发明的一个实施方式中，抗HTT抗体可以减少“有毒的”HTT物质的细胞外蔓延或跨神经元传播，正如Pecho-Vriesling等，Nat.Neurosci.(2014)doi:10.1038/nn.3761为亨廷顿蛋白或参与神经变性的其他蛋白例如α-突触核蛋白所示；参见例如Guo等，Nat Med.20(2)(2014),130-138。
生理性HTT和/或病理性突变和/或聚集的HTT的水平可以通过本领域中已知的任何适合的方法来评估，包括例如通过选自下列的一种或多种技术来分析HTT：Western印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)，荧光活化细胞分拣(FACS)，二维凝胶电泳，质谱术(MS)，基质辅助激光解吸/电离-飞行时间-MS(MALDI-TOF)，表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)，高效液相色谱(HPLC)，快速蛋白液相色谱(FPLC)，多维液相色谱(LC)后随串联质谱(MS/MS)，和激光密度测定法。优选地，所述HTT的体内成像包括闪烁扫描术、正电子发射断层扫描术(PET)、单光子发射断层扫描术(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或具有与其任一者基本上相同的结合特异性的HTT结合分子、上文中所定义的多核苷酸、载体或细胞或包含其任一者的药物或诊断组合物，其用于与HTT相关的疾病或病症的预防性治疗、治疗性治疗和/或监测所述疾病或障碍的进展或治疗响应。因此，总的来说，本发明还涉及一种在对象中诊断或监测与HTT相关的疾病或病症(例如HTT淀粉样变性)的进展的方法，所述方法包括使用至少一种本发明的抗体或具有与其任一者基本上相同的结合特异性的HTT结合分子，确定来自于待诊断对象的样品中HTT的存在，其中突变、错误折叠和/或聚集的HTT物质或其片段的存在指示了所述疾病或病症。在一个实施方式中，提供了所述在对象中诊断或监测HTT淀粉样变性的进展的方法，所述方法包括使用至少一种本发明的抗体或具有与其任一者基本上相同的结合特异性的HTT结合分子，确定来自于待诊断对象的样品中突变和/或聚集的HTT和/或其片段的存在，其中突变和/或聚集的HTT和/或其片段的存在指示了症状发生前的、前驱型或临床的HTT淀粉样变性，与生理性HTT的水平相比或与源自于健康对照对象的参比样品或来自于同一对象的对照样品相比HTT聚集物的水平提高，指示了症状发生前的、前驱型或已确立的HTT淀粉样变性的发展。本领域技术人员应该认识到，在一个实施方式中，所述方法也用于诊断或监测来自于上文中所定义的与HTT相关的一组障碍中的任何其他疾病或障碍的进展。
正如上面指明的，本发明的抗体、其片段和与所述抗体及其片段具有相同结合特异性的分子，不仅可用于体外，而且可用于体内，其中除了诊断之外，也可以从事治疗性应用。因此，在一个实施方式中，本发明还涉及包含本发明的抗体的至少一个CDR的HTT结合分子，其用于制备组合物，所述组合物用于人类或动物体内的HTT的体内检测或将治疗和/或诊断剂靶向到所述HTT。潜在的治疗和/或诊断剂可以选自可用于治疗HTT淀粉样变性的治疗剂和上文中指明的潜在标记物的非穷举性列举名单。对体内成像而言，在一个优选实施方式中，本发明提供了所述包含本发明的抗体的至少一个CDR的HTT结合分子，其中所述体内成像包含闪烁扫描术、正电子发射断层扫描术(PET)、单光子发射断层扫描术(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。在另一个实施方式中，本发明还提供了所述包含本发明的抗体的至少一个CDR的HTT结合分子或所述用于制备组合物以用于上面指明的体内成像方法的分子，其用于上文中所定义的在对象中诊断与HTT相关的疾病或障碍或监测其进展的方法中。
VII.具有聚集特异性HTT表位的肽
在另一方面，本发明涉及具有被本发明的任一抗体特异性识别的HTT的polyP区的表位的肽。优选地，这种肽包含在SEQ ID No.146、147、148、149、150、152、153、155、156、139、151、154、158、161、157、159、160中所指示的氨基酸序列作为被所述抗体识别的独特线性表位或其一个或多个氨基酸被替换、缺失和/或添加的修饰序列，或由所述序列构成，其中所述肽被本发明的任一抗体识别，优选地被抗体NI-302.74C11、NI-302.15F9、NI-302.39G12、NI-302.11A4、NI-302.22H9、NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.78H12、NI-302.71F6、NI-302.33C11、NI-302.44D7、NI-302.7A8、NI-302.3D8、NI-302.46C9、NI-302.11H6、NI-302.18A1、NI-302.52C9和/或NI-302.8F1识别。
另一方面，本发明涉及具有被本发明的任一抗体特异性识别的HTT的富P区的表位的肽。优选地，这种肽包含在SEQ ID No.140、141、142、143、200中所指示的氨基酸序列作为被所述抗体识别的独特线性表位或其一个或多个氨基酸被替换、缺失和/或添加的修饰序列，或由所述序列构成，其中所述肽被本发明的任一抗体识别，优选地被抗体NI-302.63F3、NI-302.31F11、NI-302.2A2、NI302.15D3和/或NI-302.64E5识别。
此外，在一个实施方式中，本发明涉及具有被本发明的任一抗体特异性识别的HTT的C-末端区的表位的肽。优选地，这种肽包含在SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：202中所指示的氨基酸序列作为被所述抗体识别的独特线性表位或其一个或多个氨基酸被替换、缺失和/或添加的修饰序列，或由所述序列构成，其中所述肽被本发明的任一抗体识别，优选地被抗体NI-302.35C1或NI-302.72F10识别。
另一方面，本发明涉及具有被本发明的任一抗体特异性识别的HTT的N-末端区的表位的肽。优选地，这种肽包含在SEQ ID NO：144中所指示的氨基酸序列作为被所述抗体识别的独特线性表位或其一个或多个氨基酸被替换、缺失和/或添加的修饰序列，或由所述序列构成，其中所述肽被本发明的任一抗体识别，优选地被抗体NI-302.15E8识别。
此外，在一个实施方式中，本发明涉及具有被本发明的任一抗体特异性识别的HTT的富Q/P区的表位的肽。优选地，这种肽包含在SEQ ID NO：201中所指示的氨基酸序列作为被所述抗体识别的独特线性表位或其一个或多个氨基酸被替换、缺失和/或添加的修饰序列，或由所述序列构成，其中所述肽被本发明的任一抗体识别，优选地被抗体NI-302.7D8识别。
此外，在一个实施方式中，本发明涉及具有被本发明的任一抗体、优选地被抗体NI-302.6N9、NI-302.12H2、NI-302.8M1和/或NI-302.4A6特异性识别的HTT的表位的肽，其中一个或多个氨基酸被替换、缺失和/或添加，其中所述肽被本发明的任一抗体识别。
在本发明的一个实施方式中，这种肽可用于在对象中诊断或监测与突变、错误折叠和/或聚集的HTT物质和/或其片段相关的疾病或病症，例如HD和/或HTT淀粉样变性，其包括确定所述对象的生物样品中结合到肽的抗体的存在的步骤，并且通过测量识别本发明的上述肽的抗体的水平，并将测量值与具有可比的年龄和性别的健康对象中发现的水平进行比较，用于在所述对象中诊断这种疾病。因此，在一个实施方式中，本发明涉及用于在对象中诊断指示了症状出现前或临床HD的HTT淀粉样变性的方法，所述方法包括确定所述对象的生物样品中结合到如上所定义的肽的抗体的存在的步骤。按照这种方法，特异性针对本发明的所述肽的抗体的实测水平的升高，指示了在所述对象中诊断到症状出现前或临床HD，或者指示了在所述对象中诊断到来自于上文中所定义的与HTT相关的一组病症的任何其他疾病或病症。本发明的肽可以分别配制在上文中所描述的阵列、试剂盒和组合物中。在这种背景下，本发明还涉及一种可用于诊断或监测HD和/或HTT淀粉样变性的进展的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本发明的抗体或具有与其任一者基本上相同的结合特异性的HTT结合分子、上文中分别定义的多核苷酸、载体或细胞和/或肽，并任选地具有试剂和/或使用说明书。
上述公开内容一般性地描述了本发明。除非另有陈述，否则本文中使用的术语被给予在《牛津生物化学和分子生物学词典》(Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology，Oxford University Press，1997，2000年修订，2003年再次印刷，ISBN0 19 850673 2)中所提供的定义。在整个本说明书的文本中引用了几篇文献。完全的文献引文可以在所描述末尾紧接权利要求书之前找到。所有引用的参考文献(包括在整个本申请包括背景部分中引用的文献参考、出版的专利、公布的专利申请以及制造商的说明书、使用指南等)明确地通过参考并入本文；然而，并不承认任何引用的文献对于本发明来说是事实上的现有技术。
参考下面的具体实施例可以获得更完整的理解，在本文中提供这些实施例仅仅是出于说明的目的，并且不打算限制本发明的范围。
实施例
实施例1：抗HTT抗体的分离和鉴定
利用在国际申请WO 2008/081008中描述的方法并进行改良来鉴定靶向HTT和/或突变和/或聚集的HTT物质和/或其片段的人源抗体，所述申请的公开内容通过参考并入本文。具体来说，将通过重组表达获得的野生型和突变的HTT蛋白以本源和突变的聚集构造两者用于靶向HTT的抗体的鉴定。所述突变的聚集构造使用与实施例3中描述的相似的程序在体外产生。
实施例2：抗体序列的确定
上面鉴定到的抗HTT抗体的可变区的氨基酸序列在它们的mRNA序列的基础上确定，参见图1。简单来说，收获所选的非永生化记忆性B细胞培养物的活的B细胞。随后，从生产所选抗HTT抗体的细胞提取mRNA并转变成cDNA，并通过PCR扩增编码抗体的可变区的序列，克隆到质粒载体中并测序。
简单来说，将代表人类免疫球蛋白种系全部基团的所有序列家族的引物的组合用于扩增前导肽、V-段和J-段。使用在5’-末端中的前导肽特异性引物和3’-末端中的恒定区特异性引物进行第一轮扩增(Smith等，Nat Protoc.4(2009),372-384)。对于重链和κ轻链来说，使用5’-末端处的V-段特异性引物和3’-末端处的J-段特异性引物进行第二轮扩增。对于λ轻链来说，使用5’-末端处的V-段特异性引物和3’-末端处的C-区特异性引物进行第二轮扩增(Marks等，Mol.Biol.222(1991),581-597；de Haard等，J.Biol.Chem.26(1999),18218-18230)。
通过在完整抗体的重组表达后在ELISA上重新筛选，进行具有所需特异性的抗体克隆的鉴定。完整人类IgG1抗体的重组表达在将可变重链序列和可变轻链序列“以正确的阅读框”插入到表达载体中之后实现，所述表达载体在5’-末端处用编码前导肽的序列并在3’-末端处用编码适合的恒定结构域的序列补足所述可变区序列。就此而言，引物含有被设计以便于将可变重链序列和可变轻链序列克隆到抗体表达载体中的限制性位点。通过将免疫球蛋白重链RT-PCR产物同框插入到带有信号肽和人类或小鼠免疫球蛋白γ1的恒定结构域的重链表达载体中，来表达重链免疫球蛋白。通过将κ轻链RT-PCR产物同框插入到提供信号肽和人类κ轻链免疫球蛋白的恒定结构域的轻链表达载体中，来表达κ轻链免疫球蛋白。通过将λ轻链RT-PCR产物同框插入到提供信号肽和人类或小鼠λ轻链免疫球蛋白的恒定结构域的λ轻链表达载体中，来表达λ轻链免疫球蛋白。
在将Ig重链表达载体和κ或λIg轻链表达载体共转染到HEK 293或CHO细胞(或任何其他适合的人类或小鼠起源的受体细胞)中之后，获得有功能的重组单克隆抗体。随后使用标准的蛋白A柱纯化，从调制的培养基纯化重组人类单克隆抗体。重组人类单克隆抗体可以使用瞬时或稳定转染的细胞以不受限制的量生产。可以通过直接使用Ig表达载体或通过将Ig可变区重新克隆到不同表达载体中，来建立产生重组人类单克隆抗体的细胞系。衍生物例如F(ab)、F(ab)2和scFv也可以从这些Ig可变区产生。通过与可以在数据库例如Abysis(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)和http://www.imgt.org/中获得的参比抗体序列进行比较，并使用Kabat编号方案(http://www.bioinf.org.uk/abs/)进行注释，来确定构架和互补性决定区。
实施例3：HTT外显子1蛋白的表达
方法
重组亨廷顿蛋白外显子1蛋白GST-HttExon1Q21(GST-HD21)、GST-HttExon1Q35(GSTHD35)和GST-HttExon1Q49(GST-HD49)的表达和纯化：将编码polyQ长度分别为21、35或49个CAG重复序列(比较图2A)的人类亨廷顿蛋白的外显子1以及PreScission切割位点融合到N-端谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的pGEX-6P-1表达载体(GE Healthcare)，在大肠杆菌菌株BL21中表达。将细菌过夜培养物(37℃，220rpm)1:25稀释，并在600nm处的吸收值为0.5-0.6时通过添加1mM IPTG(Sigma I1284)并在36℃、220rpm下继续温育4hrs，来诱导表达。培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下生长，对于过夜培养来说添加1％葡萄糖。重组GST-HttExon1蛋白通过结合到谷胱甘肽琼脂糖(Sigma G4510)来纯化。简单来说，将重悬浮在20-40ml冷缓冲液1(50mM NaH2PO4，5mM Tris，150mM NaCl，1mM EDTApH8，终浓度为5mg/ml的溶菌酶，完全蛋白酶抑制剂(Roche))中的细菌离心沉淀物在冰上温育60min，超声处理，添加Triton-X100(终浓度0.1％)，并在冰上温育5min后以14’000g离心90min。向上清液添加谷胱甘肽琼脂糖，在4℃温育2hrs，以1000g离心10min，并在除去上清液后用冷PBS清洗两次。洗脱在1ml含有10mM还原型谷胱甘肽的pH 9的缓冲液1中进行5min。将该步骤重复5至15次，直至没有蛋白被继续洗脱。将合并的上清液针对缓冲液(50mM trispH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％甘油)透析过夜(10kD MWCO，Pierce)，并将等分试样储存在-80℃。
SDS-PAGE分析
将纯化的重组GST-HttEx1蛋白通过梯度SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris4-12％；Invitrogen,Basel,Switzerland)进行解析，然后用考马斯亮蓝染色或点转印在硝酸纤维素膜上。将印迹与第一抗体Mab 5492(Chemicon N-端aa1-82表位，富P结构域)或NI-302.37C12温育，然后与偶联有HRP的山羊抗小鼠IgG第二抗体或偶联有HRP的驴抗人IgG第二抗体温育。使用ECL将印迹显色并用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare,Switzerland)检测。
如图2B中所示，不同的重组GST-HttEx1蛋白被成功地表达和纯化，正如由SDS-PAGE后的考马斯染色所证实的。
实施例4：通过斑点印迹和滤膜滞留表征聚集状态
为了表征HD21、HD35和HD49蛋白的聚集动力学，进行了滤膜滞留和斑点印迹分析。
因此，在开始时，聚集反应如下进行：可以将重组GST-HttExon1蛋白作为融合蛋白进行表达和纯化。一旦通过PreScission蛋白酶(PP)将GST标签从融合蛋白切下后，亨廷顿蛋白外显子1蛋白的聚集反应立即开始。在反应开始之前，将GST-HttExon1蛋白以100’000g离心30分钟。将澄清的蛋白溶液在冷的聚集缓冲液(0.05M Tris/HCL pH 7，0.15M NaCl，1mM EDTA)中稀释至2μM蛋白浓度，并添加1mM DTT和PreScission蛋白酶(GE Healthcare)。将所述反应在室温下温育并以300rpm旋转，并在指定的时间间隔后通过在-80℃快速冷冻来终止反应。随后分别在1、3、5、7和24hrs的温育时间后取出HD21、HD35和HD49聚集反应的等分试样，在干冰上快速冷冻并储存在-80℃。
对于斑点印迹分析来说，将样品在冰上融化，稀释，并使用过滤装置通过在膜下方的仓室中施加真空，将样品转移到硝酸纤维素转移膜上。为此，将所述膜用PBS平衡，安装到仓室中，并且每个孔用100μl PBS清洗。将样品装入并完全吸吮通过所述膜，然后用PBS清洗三次。将装置拆开，并将膜在室温简短空气干燥15min，用阻断缓冲液(含有3％BSA、0.1％Tween 20的PBS缓冲液)在室温阻断1小时，并与HD-1多克隆抗体(1：10’000，由Prof.E.Wanker,MDC,Berlin善意提供)温育。在清洗后，将膜在室温下与偶联到HRP的抗兔IgG抗体温育1h，使用ECL将印迹显色并使用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare，Switzerland)检测。
正如从图2C左侧中示出的斑点印迹明显看到的，HD-1多克隆抗体检测HD21、HD35和HD49蛋白，不论它们的聚集状态如何。
对于滤膜滞留测定来说，将样品在冰上融化，在变性缓冲液(4％SDS，100mM DTT)中稀释，并使用真空仓室转移通过孔眼尺寸为0.2um的醋酸纤维素膜。为此，将所述膜在含有0.1％SDS的PBS中平衡，安装在真空仓室上，并将孔用0.1％SDS清洗。添加样品，利用真空通过膜进行过滤，并用0.1％SDS清洗3次。然后将膜从仓室取出，简短空气干燥，在室温下在阻断缓冲液(含有5％奶粉、0.1％Tween 20的PBS缓冲液)中阻断1h，与HD-1多克隆抗体(1：5’000，Scherzinger等，Cell 90(1997),549–558)温育，并如上所述进一步处理。
在滤膜滞留测定中，对于HD35来说，被所述膜保留的第一个聚集物是在温育24小时后检测到的。具有延长的polyQ区段的HD49蛋白早在切下GST标签后3hrs就形成不溶性聚集物，参见图2C右侧(FRA)。
实施例5：亨廷顿蛋白外显子1聚集物的表征
为了验证和表征HD35和HD49外显子1聚集物的形成，进行电子显微镜检查(EM)。简单来说，通过电子显微术分析分别在1、3和24hrs后的HD49聚集反应或来自于HD35的24hrs后的样品。将样品吸收在辉光放电镀碳的铜网上。通过在滤纸上吸干除去过量的样品。将网用2％(w/v)乙酸铀染色1min，并用蒸馏的去离子水洗去过量的乙酸铀。将网空气干燥，并使用Philips CM100透射电子显微镜使用100kV的加速电压进行成像。
HD35聚集反应的EM分析揭示出在温育24小时后，出现可以通过EM观察到的类似原纤丝结构的较大聚集物(图2D[E])。HD49表现出更加快速的聚集动力学，在温育1小时后已经可以检测到纤丝(图2D[F])，并且尺寸和数量随着聚集时间而增大(图2D[C、D、G、H])。这些观察与滤膜滞留测定中获得的大于0.2μm的聚集物保留在醋酸纤维素膜上的结果相一致，并验证了亨廷顿蛋白外显子1聚集物的成功制备；也参见实施例4。
实施例6：利用直接ELISA检测抗polyP结构域NI-302.33C11抗体的结合亲和性和EC50
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.33C11对具有21或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的亨廷顿蛋白外显子1蛋白的半最大有效浓度(EC50)，进行了直接ELISA。简单来说，将96孔微孔板(Corning)用包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.42)中浓度为5μg/ml的GST-HD21、GST-HD49或聚集的HD2或HD49包被。用含有2％BSA(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)的PBS/0.1％
Figure BDA0001218242340001381
-20将非特异性结合位点在RT阻断1h。将第一抗体稀释到指定的浓度并在室温下温育1h。使用偶联有HRP的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体或偶联有HRP山羊抗小鼠IgG(H+L)特异性抗体，然后通过在标准的比色测定法中测量HRP活性，来确定结合。随后，使用GraphPad Prism软件(San Diego,USA)，通过非线性回归来估算EC50值。
人源HTT抗体NI-302.33C11对具有21或49个poly Q重复序列的聚集和可溶性HTT外显子1蛋白的EC50，使用浓度为5μg/ml的不同制备物的包被，通过直接ELISA来确定。如图3A和B中所示，抗体NI-302.33C11以相近的高亲和力结合到所有4种物质包括病理性聚集的HTT外显子1HD49，其中EC50约为100pM。
实施例7：利用斑点印迹和滤膜滞留测定检测抗HTT抗体的结合选择性
为了表征重组人源HTT抗体NI-302.33C11对具有21、35或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的亨廷顿蛋白外显子1蛋白的结合选择性，进行了滤膜滞留测定和斑点印迹。为此，在1、3、5、7和24hrs的温育时间后取出如实施例4中所描述的HD21、HD35和HD49聚集反应的等分试样，在干冰上快速冷冻并储存在-80℃，并如实施例4中所述进行斑点印迹。滤膜滞留测定也如实施例4中所述进行，区别在于将所述膜与NI-302.33C11(1μg/ml)温育。
可以显示，在斑点印迹(图3C，左侧)上，抗体NI-302.33C11偏好性检测具有扩增的polyQ区段的亨廷顿蛋白(HD49>>HD35>HD21)。此外，随着HD35和HD49的聚集反应的温育时间的增加，信号强度提高。
对于滤膜滞留分析中示出的结果(图3C，右侧)来说，情况也是如此，其显示NI-302.33C11检测到保留在0.2μm孔眼尺寸的膜上的HD35和HD49聚集物。这些基于点样的蛋白制备物的发现表明，抗体NI-302.33C11对于具有病原性polyQ扩增的聚集的HTT构造具有偏好性。
实施例8：利用直接ELISA确定抗HTT抗体对无关聚集蛋白靶的结合特异性和选择性
为了确定抗体NI-302.33C11重组抗体结合到HTT的polyP区并且不结合到无关聚集蛋白靶的结合特异性，在用含有浓度为1-10μg/ml的不同靶蛋白的包被缓冲液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.42)包被的96孔微孔板(Corning)上进行直接ELISA。将非特异性结合位点用含有2％BSA(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)的PBS/0.1％
Figure BDA0001218242340001391
-20在室温下阻断1h。将NI-302.33C11抗体稀释到指定浓度，并在室温温浴1h。使用偶联有HRP的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体，然后在标准比色测定法中测量HRP活性，来确定结合。将靶蛋白的信号计算成中值以上的倍数增加。
可以显示，人源NI-302.33C11特异性结合到HTT即聚集的HD49，并且不结合到其他无关蛋白靶，包括显著的形成淀粉样肽的蛋白，参见图16A。
实施例9：HTT抗体NI-302.33C11的结合表位的评估
为了对NI-302.33C11人源抗体所识别的亨廷顿蛋白(HTT)表位进行作图，使用合成的肽通过肽扫描分析进行了表位作图。
简单来说，将交叠肽的扫描用于表位作图。将人类HTT外显子1的序列合成为总共16个线性的15个单体的肽，在各个肽之间存在10个氨基酸的交叠(JPT PeptideTechnologies,Berlin,Germany)，并点样在硝酸纤维素膜上。将所述膜在甲醇中活化5min，然后在室温下在TBS中清洗10min。将非特异性结合位点用
Figure BDA0001218242340001392
-Block(Carl Roth GmbH+Co.KG,Karlsruhe,Germany)在室温下阻断2小时。将人类NI-302.33C11抗体(1μg/ml)在
Figure BDA0001218242340001393
-Block中在RT下温浴3hrs。第一抗体的结合使用HRP偶联的驴抗人IgGγ第二抗体来确定。使用ECL将印迹显色，并使用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare,Switzerland)进行检测。
如图4中所示，观察到NI-302.33C11与编号为7、8、9、13和14的肽的明显结合，表明被该抗体识别的表位位于亨廷顿蛋白的polyP重复序列结构域中。因此，预测NI-302.33C11结合表位位于HTT的氨基酸35-PPPPPPPP-42(SEQ ID No.:139)和氨基酸63-PPPPPPPPPPP-72(SEQ ID No.:162)内。
实施例10：通过结合到HTT抗体NI-302.33C11的不同外显子1肽的直接ELISA进行的表位作图
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.33C11对BSA偶联的亨廷顿蛋白外显子1的肽片段的半最大有效浓度(EC50)，使用BSA偶联的Htt外显子1结构域肽进行直接ELISA。
简单来说，将96孔微孔板(Corning)用含有浓度为5μg/ml的BSA偶联的合成肽(Schafer-N，Denmark)或全长GST-HD49外显子1蛋白的包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，pH 9.42)包被，所述合成肽具有N-端1-19位氨基酸(MATLEKLMKAFESLKSFQQ，SEQ IDNo.:93)、富P结构域序列(PPQLPQPPPQAQPLLPQPQPP，SEQ ID No.:94)、polyP重复序列(PPPPPPPPPPP，SEQ ID No.:95)或14个C-端氨基酸(PPGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.:96)。将非特异性结合位点用含有2％BSA(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)的PBS/0.1％
Figure BDA0001218242340001401
-20在室温下阻断1h。将第一抗体稀释到指定浓度，并在室温下温浴1h。使用偶联有HRP的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体，然后在标准比色测定法中测量HRP活性，来确定结合，并使用GraphPad Prism软件(San Diego,USA)通过非线性回归来估算EC50值。
如图5中所示，NI-302.33C11以高亲和性结合到BSA偶联的polyP肽以及全长GST-HD49，具有30pM的等同的EC50。这确认了如实施例9中所示，所述表位作图到polyP序列。
实施例11：重组人类NI-302.33C11抗polyP结构域抗体的纯度和完整性的评估
为了评估重组人类NI-302.33C11抗polyP结构域前导抗体的纯度和完整性，通过CHO-S细胞的瞬时转染表达人类NI-302.33C11抗polyP结构域抗体，并在
Figure BDA0001218242340001402
系统上通过蛋白A亲和纯化进行纯化。PD-10柱脱盐后，将抗体配制在PBS中。随后进行SDS-PAGE分析，其中将两个10μg的纯化的重组人类NI-302.33C11抗polyP结构域抗体通过梯度在还原条件下解析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶；Invitrogen)，然后进行考马斯染色(SimplyBlueSafeStain,Invitrogen)。
如图6中所示，重组人类NI-302抗polyP结构域前导抗体在还原条件下的SDS-PAGE分析揭示出预期大小处的对应于抗体重链和轻链的两个主要条带，而没有检测到显著的污染或蛋白水解降解产物。
实施例12：HTT抗体NI-302.33C11在人类HTT转基因小鼠中的表征
为了评估在人类HTT转基因小鼠脑组织中NI-302.33C11抗体与亨廷顿蛋白病理形态的结合，进行了免疫组织化学分析。B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因小鼠株系(Mangiarini等，Cell 87(1996),493-506)是已确立的用于亨廷顿病(HD)的小鼠模型。在9周龄左右时开始，该动物模型发生以联想到人类亨廷顿病的亨廷顿蛋白的核内包含为特征的进行性疾病(Naver等，Neuroscience 122(2003)，1049-1057)。将处在疾病进展阶段(270天)的这些B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因小鼠的半脑固定在磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，并制备5-μm切片。在甲酸和柠檬酸缓冲液预处理后，将切片与1、5或50nM人NI-302.33C11抗HTT抗体温浴，然后与生物素标记的驴抗人第二抗体(JacksonImmunoresearch；1:250)温浴。使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories)将抗体信号放大，并使用二氨基联苯胺(Pierce)检测。
如图27中所示，人源polyP结构域抗体NI-302.33C11在最低的1nM浓度下已经表现出非常明显的神经元核内包涵体病理染色(图27[E-H])，这与通过ELISA和斑点印迹分析确定的高亲和性结合到亨廷顿蛋白聚集物相符。在5nM或更高浓度下，所述抗体另外染色完整的中型多棘神经元，并产生更普遍的弥漫性着色，这在非转基因脑切片上也可检测到。一定程度的交叉反应性不能被排除，因为被NI-302.33C11靶向的polyp表位也存在于大量无关蛋白中(图27[F-H])。
实施例13：利用直接ELISA和EC50表征抗富P结构域NI-302.63F3抗体的结合亲和性和选择性
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.63F3对具有21或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的半最大有效浓度(EC50)，如上文实施例6中所述进行了直接ELISA和EC50确定。
可以显示，NI-302.63F3以相近的结合高亲和性结合到所有4种物质，包括聚集的HTT外显子1HD49，其中EC50约为200至400pM，图7A和B。因此，所述人源HTT抗富P结构域抗体NI-302.63F3以低于纳摩尔范围内的高亲和性靶向在HTT外显子1蛋白的聚集的以及未切开的更加线性的结构中暴露的表位。
另外，为了表征重组人源HTT抗体NI-302.63F3与具有21、35或49个polyQ重组序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的结合，使用了上文实施例7中所描述的滤膜滞留测定和斑点印迹，并进行了少量修改，即温浴使用1μg/ml NI-302.63F3抗体来进行。
在斑点印迹上，抗体NI-302.63F3最明显地检测具有扩增的polyQ区段的HD49蛋白(图7C，左侧)。在滤膜滞留分析中，NI-302.63F3检测保留在孔眼尺寸为0.2μm的膜上的HD35和HD49聚集物(图7C，右侧)。这些基于点样的蛋白制备物的发现证实了抗体NI-302.63F3识别具有病原性polyQ扩增的聚集的HTT构造。
此外，为了确定NI-302.63F3重组抗体与无关聚集蛋白靶的结合，如上文实施例8中所述进行了直接ELISA。如图16B中所示，人源NI-302.63F3特异性结合到HTT，而未能显示出与无关蛋白的结合。
实施例14：HTT抗体NI-302.63F3的结合表位的评估
为了对被NI-302.63F3人源抗体识别的亨廷顿蛋白表位进行作图，如上面实施例9中所述进行了使用合成肽的表位作图。
如图8中所示，观察到NI-302.63F3与10和11号肽的明显结合以及在8和9号肽上的微弱信号，表明被该抗体识别的表位位于HTT的富P结构域中(在polyP重复序列区之间)。因此，预测NI-302.63F3结合的表位位于HTT的氨基酸序列43-(PPPQL)PQPPPQAQPL-57(SEQ IDNo.:161和140)内。
实施例15：通过结合到不同外显子1肽的直接ELISA进行的HTT抗体NI-302.63F3的表位作图
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.63F3对BSA偶联的亨廷顿蛋白外显子1的肽片段的半最大有效浓度(EC50)，如实施例10中所述进行了使用BSA偶联的Htt外显子1结构域肽的直接ELISA和EC50确定。
如图9中所示，NI-302.63F3以高亲和性结合到BSA偶联的富P结构域肽以及全长GST-HD49，并具有200至300pM的相近EC50。这确认了所述表位如实施例14中所示作图到富P结构域序列。
实施例16：重组人类NI-302.63F3抗富P结构域抗体的纯度和完整性的评估
为了评估重组人类NI-302.63F3抗富脯氨酸结构域抗体的纯度和完整性，如上文实施例11中所述进行了SDS-PAGE分析。
重组人类NI-302.63F3抗富P结构域抗体在还原条件下的SDS-PAGE分析揭示出预期大小处的对应于抗体重链和轻链的两个主要条带。如图10中所示，没有检测到显著的污染或蛋白水解降解产物。
实施例17：人类HTT转基因小鼠中HTT抗体NI-302.63F3的表征
NI-302.63F3抗富P结构域抗体与人类HTT转基因小鼠脑组织中HTT病理形态的结合的评估，如上文实施例12中所述进行评估，区别在于使用1或50nM的抗富P结构域抗体进行所述切片的温育。
如图28[E-F]中所示，人源NI-302.63F3抗富P结构域抗体在1和50nM浓度下，揭示出R6/1转基因动物的纹状体和皮层中神经元核内包涵体病理结构的明显和高度特异性染色，与通过ELISA和斑点印迹分析所确定的与HTT聚集物的高亲和性结合相符。然而，如图28[F]中所示，在50nM的浓度下，抗体NI-302.63F3另外微弱地染色中型有棘神经元的整个核。
实施例18：利用ELISA和EC50的抗C-端结构域抗体NI-302.35C1和NI-302.72F10的结合亲和性和选择性的表征
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.35C1和NI-302.72F10对具有21和49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的半最大有效浓度(EC50)，如上文实施例6中所述进行了直接ELISA和EC50确定。
可以显示，NI-302.35C1以高亲和性结合到所有4种物质，包括聚集的HTT外显子1HD49，其EC50约为2.7nM；参见图11A和B。同样地，NI-302.72F10结合到所有4种物质，尽管亲和性与NI-302.35C1不同(聚集的HD21>>GST-HD21>>聚集的HD49>>GST-HD49)(图31C)，其可以用两种抗体所识别的表位不同来解释(图20)。
因此，人源HTT抗C-端结构域抗体NI-302.35C1和NI-302.72F10以纳摩尔级别的低亲和性靶向在HTT的聚集以及可溶形式中暴露的表位。
另外，为了表征重组人源HTT抗体NI-302.35C1和NI-302.72F10与具有21、35或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的结合，进行了如上文实施例7中所描述的滤膜滞留测定和斑点印迹。
在斑点印迹上，抗体NI-302.35C1偏好性检测具有扩增的polyQ区段的HTT构建物(HD49>HD35>>HD21，图11C，左侧)。此外，信号强度随着HD35和HD49的聚集反应的温育时间增加而提高。同样地，抗体NI-302.72F10检测具有扩增的polyQ区段的HTT构建物，尽管偏好性不同(HD35>>HD49>HD21)，然而信号强度仅随着HD35的聚集反应的温育时间增加而提高(图32C)。
在滤膜滞留分析中，NI-302.35C1检测保留在孔眼尺寸为0.2μm的膜上的HD35和HD49聚集物(图11C，右侧)，然而NI-302.72F10仅检测HD35聚集物(图32C，右侧)。这些基于结合有蛋白制备物的膜的发现表明抗体NI-302.35C1和NI-302.72F10偏好性地靶向具有病原性polyQ扩增的聚集的HTT构造。
此外，为了确定NI-302.35C1和NI-302.72F10重组抗体与无关聚集蛋白靶的结合，如上文实施例8中所描述的进行直接ELISA。如图16C中所示的人源NI-302.35C1以及图33C中所示的人源NI-302.72F10特异性结合到HTT，而未能显示与无关蛋白的结合。
实施例19：HTT抗体NI-302.35C1的结合表位的评估
为了对被NI-302.35C1人源抗体所识别的亨廷顿蛋白表位进行作图，如上文实施例9中所述使用合成肽进行表位作图。
通过交叠肽的扫描确定NI-302.35C1抗体结合的表位，不产生特异性信号。因此，由于未知原因，以对另一种HTT NI-302抗体进行处理的方式处理这种抗体，在各个肽上不产生任何特异性信号。通过偶联到BSA，表位被成功地作图到C-端肽，也参见实施例20。
实施例20：通过结合到不同外显子1肽的直接ELISA进行的C-端结构域HTT抗体NI-302.35C1的表位作图
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.35C1与BSA偶联的HTT外显子1的肽片段的半最大有效浓度(EC50)，如实施例10中所述使用BSA偶联的Htt外显子1结构域肽进行直接ELISA和EC50确定。
如图12中所示，NI-302.35C1以高亲和性结合到BSA偶联的C-端肽以及全长的GST-HD49，EC50值分别为约0.7nM和3.2nM。这将所述表位定位到HTT外显子1序列的C-末端区(71-PPGPAVAEEPLHRP-85，SEQ ID NO：96)。如果将同样的C-端肽直接包被到所述板，仅仅观察到微弱的结合(EC50>100nM，数据未示出)，表明偶联到BSA的肽的呈递增加了与所述表位的结合，并且可能是为何如实施例20中所示的通过肽扫描分析进行的表位作图不起作用的一种解释。
实施例21：重组人类NI-302.35C1抗富P结构域抗体的纯度和完整性的评估
为了评估重组人类NI-302.35C1抗C-端结构域抗体的纯度和完整性，如上文实施例11中所述进行了SDS-PAGE分析。
重组人类NI-302.35C1抗C-端结构域抗体在还原条件下的SDS-PAGE分析揭示出预期大小处的对应于抗体重链和轻链的两个主要条带，同时没有检测到显著的污染或蛋白水解降解产物(图13)。
实施例22：HTT抗体NI-302.35C1在人类HTT转基因小鼠中的表征
NI-302.35C1抗C-端结构域抗体与人类HTT转基因小鼠脑组织中HTT病理形态的结合的评估，如上文实施例12中所述进行评估，区别在于使用5或50nM的抗C-端结构域抗体进行所述切片的温育。
如图29[E-F]中所示，人源NI-302.35C1抗C-端结构域抗体在5和50nM浓度下，揭示出R6/1转基因动物的纹状体中神经元核内包涵体病理结构的明显染色，与通过ELISA和斑点印迹分析所确定的与HTT聚集物的高亲和性结合相符。
实施例23：在海马脑片培养物中靶向HTT的人源抗体对树突棘密度的影响的评估
抗体表达和纯化
通过CHO-S细胞的瞬时转染表达靶向HTT外显子1中的不同结构域的人源抗体，并在
Figure BDA0001218242340001471
系统上通过蛋白A亲和纯化进行纯化。在PD-10柱脱盐后，将所述抗体配制在PBS中。确认内毒素水平<10EU/ml。
海马脑片培养物
按照Stoppini等，J Neurosci Methods.(1991)37(2):173-82制备和培养器官型海马脑片培养物。简单来说，将6至8日龄B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J转基因和非转基因同窝仔畜斩首，取出脑，分离两个海马并切成400-μm厚的脑片。这种方法产生了保持厚度为1-4个细胞层并以保存良好的器官型组织方式为特征的脑片。将脑片在含有1ml培养基(46％的用HEPES改良的Eagle最低必需培养基，25％的具有Earle's改良的基础培养基，25％的热失活的马血清，2mM谷氨酰胺，0.6％葡萄糖，pH 7.2)的6孔板中的Millicell培养板插片(0.4μm，Millipore)上培养。将培养板保持在37℃下和含有5％CO2的加湿气氛中。在实验之前将脑片在培养物中保持7d。每日或每隔一日更换培养基。在第7天，以10μg/ml的浓度添加抗体。在第10天，使用小滴方法(Shahani等，J Neurosci.31(2006),6103–6114)将体外脑片培养物用辛德毕斯病毒感染。对于树突棘分析来说，在感染后第4天(体外14天)将培养物固定。脑片留下来附连到培养板的膜以保留海马结构，并用PBS漂洗。然后将脑片用含有4％蔗糖和4％多聚甲醛的PBS在4℃下固定2h。对每个树突获取照片并在30-45μm的长度上分析树突棘。对于每种抗体处理，对来自于总共12只转基因动物的每组8至13个脑片进行定量。术语表示平均值±SEM。*p<0.05(MWU)，#p＝0.05。
Tg(HDexon1)62Gpb/1J转基因小鼠的海马脑片培养物中树突棘密度的定量(图17B、D)揭示出，使用新生第6天的动物在使用上述实验设计体外14天后的海马脑片，与非转基因同窝仔畜(图17A、C、E)相比显著降低53％。在以10μg/ml的浓度添加人源NI-302抗体7天后，对于抗体NI-302.31F11(图17F，p<0.05，t-检验)和NI-302.63F3(p＝0.05，t-检验)来说观察到树突棘密度丧失的显著减弱，而抗体NI-302.33C11和NI-302.35C1在所试验的条件下不显示出明显效果。
在Tg(HDexon1)62Gpb/1J转基因小鼠的海马脑片培养物中表现出的与非转基因同窝仔畜相比树突棘密度的显著降低，建议这是用于体外试验HTT候选抗体干扰HTT毒性的活性的适合的模型。在这种模型中，都靶向HTT外显子1内的富P结构域的抗体NI-302.63F3和NI-302.11F11与同种型对照抗体相比能够提高树突棘密度。这表明这些抗体可以减弱由病理性polyQ扩增的HTT的表达所驱动的对树突棘密度的有毒影响。
实施例24：NI-302抗体在R6/1动物模型的脑中的穿透
为了试验本发明的抗HTT抗体的穿透，利用了转基因小鼠模型。具体来说，Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因小鼠带有1.9kb的转入基因，所述转入基因从源自于亨廷顿病(HD)患者的噬菌体基因组克隆分离，并含有人类亨廷顿蛋白(HTT)基因的5’末端。它由大约1kb的5'UTR序列、外显子1(带有～130个单元的扩增的CAG重复序列)和内含子1的前262bp构成。将这种构建物显微注射到单细胞CBAxC57BL/6胚胎中。将雄性创立者R6与CBAxC57BL/6雌性繁育，产生几种创立者株系。来自于创立者株系R6/1的小鼠具有泛表达的作为单一完整拷贝整合的转入基因。将混合的CBAxC57BL/6遗传背景上的转基因小鼠与C57BL/6J回交超过12次，以产生同类品系B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J。
R6/1转基因小鼠表现出进行性神经表型，其模拟HD的许多特点，包括舞蹈病样动作、不自主刻板运动、震颤和癫痫发作，以及非运动病症成分包括异常发声。它们频繁排尿并在整个疾病过程中表现出体重和肌肉量减少。在神经学上，它们发展出神经元核内包涵体(NII)，其包含HTT和遍在蛋白两者。这些NII也已在人类HD患者中鉴定到。对于这种6/1株系来说，HD症状的发作年龄据报道发生在15至21周之间。
研究动物表现出下述特性并且通过经典的耳标法鉴别：
株系：半合子B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J(Mangiarini等，Cell,87(1996),493-506)
来源：Jackson Laboratory,Maine,USA
性别：雄性和雌性
初始年龄：230至260天
组群：NI-302.31F11总计：3只雄性
NI-302.35C1总计：3只雄性
介质总计：3只雄性
对于脊髓匀浆来说，将B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因小鼠深度麻醉，并利用蠕动泵通过左心室用冷的磷酸盐缓冲盐水进行心脏灌注。将脑剖下并在干冰上快速冷冻。使用手持超声仪(Sartorius,Labsonic M)将组织样品在1:10w/v DEA和缓冲液(50mMNaCl，0.2％DEA，完全蛋白酶抑制剂，Roche Diagnostics)中匀浆。将样品在4℃下以100’000x g离心30分钟，并在分析前将上清液的等分试样储存在-80℃下。
在下述人类IgG药物水平夹心ELISA中，使用已知浓度的相应重组抗体作为标准品，确定人类NI-302.35C1、NI-302.11F11抗体的血浆水平。将96孔微孔板(Corning)用含有1μg/ml驴抗人IgG抗体(709-005-149，Jackson Immunoresearch)的pH 9.6的50mM碳酸盐包被缓冲液包被。用含有2％BSA(Sigma,Buchs,Switzerland)的PBS/0.1％
Figure BDA0001218242340001491
-20将非特异性结合位点在RT下阻断1hr。将血浆样品1:20’000和1:100’000稀释，将脑匀浆物1:5和1:50稀释，并使用标准的稀释曲线将两者一起在RT温育1hr。使用抗人类检测抗体-HRP(709-036-098，Jackson Immunoresearch)，然后在标准的比色测定法中测量HRP活性，来确定结合。在各个标准曲线的基础上计算血浆和脊髓样品的浓度。表6-1中示出的值是2个独立ELISA实验的平均值。
在R6/1转基因小鼠中，在单次腹膜内注射50mg/kg抗体NI-302.31F11、NI-302.35C1后2天获得血浆和脑样品。通过人夹心IgG ELISA确定血浆和脑匀浆物中的抗体水平(图18A和B)。对于人源抗体NI-302.31F11和NI-302.35C1来说，脑与血浆的药物水平的比率被确定分别为0.13±0.02％和0.21±0.06％。这些结果表明在HTT转基因小鼠中，试验的NI-302抗体的48h脑穿透在预期范围内。
实施例25：按照本发明鉴定的其他抗体的结合亲和性和特异性的表征
为了确定另外鉴定的重组人源HTT抗体对具有21或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的半最大有效浓度(EC50)，如上文实施例6中所述使用5μg/ml浓度的不同制备物包被进行了直接ELISA和EC50确定。
为不同HTT物质确定的EC50示出在图19以及图31(A、D-F)中，并概述在图20中。大多数人源抗体以亚纳摩尔或低纳摩尔的EC50结合。一些候选物例如NI-302.37C12、NI-302.55D8、NI-302.11A4、NI-302.22H9或NI-302.64E5似乎对未切开的GST-HTT蛋白具有优选的结合，其他抗体例如NI-302.74C11、NI-302.71F6、NI-302.4A6、NI-302.12H2或NI-302-8M1在ELISA测定法中对所有HTT制备物显示出高亲和性结合，具有相近的EC50值。NI-302.15F9对HD49相比于HD21显示出约5倍的偏好性，并且EC50值在5至35nM的范围内。抗体33C11在这个实验中用作对照(图32G)。
因此，从源自于健康老年人类供体组群的记忆性B-细胞克隆了一组高亲和性重组HTT特异性人类抗体，并进行了重组表达和表征。此外，在所选的患有亨廷顿病(HD)的带有不同长度的CAG重复序列扩增的症状出现前的患者组群中，启动了对其他候补抗体的筛选行动。
为了进一步表征鉴定到的重组人源HTT NI-302抗体对具有21、35或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的结合，如上文实施例7中所述进行了使用0.2μg/ml第一抗体的滤膜滞留测定和使用1μg/ml第一抗体的斑点印迹分析。
如图21和图32(A、G)中所示，在斑点印迹(图左侧，DotBlot)上，大多数表征的抗体显示出检测具有扩增的polyQ区段的HTT蛋白的偏好性(HD49>>HD35>HD21)。此外，信号强度随着HD35和HD49的聚集反应的温浴时间的增加而提高，特别是对于抗体NI-302.15F9、NI-302.71F6(图21，第一行印迹)和NI-302-64E5(图32A，左侧)来说。在滤膜滞留分析中，NI-302.15F9、NI-302.71F6(图21，右侧，FRA)和NI-302-64E5(图32A，右侧)检测保留在孔眼尺寸为0.2μm的膜上的SDS稳定的HD35和HD49聚集物，而其他抗体例如NI-302.44D7和NI-302.37C12(图21，第二行印迹)或NI-302.4A6、NI-302.12H2和NI-302.8M1(图32D，E、F)不结合到滤膜上的聚集物。抗体33C11在这个实验中用作对照(图32G)。这些基于点样的蛋白制备物的发现表明几种克隆的NI-302抗体对具有病原性polyQ扩增的聚集的HTT构造显示出偏好性。
此外，如上文实施例8中已经描述过的，通过直接ELISA评估了鉴定到的抗体对无关蛋白、特别是对形成聚集物的蛋白的结合特异性(图22和图33A、D-F)。结果显示，试验的大多数人源NI-302抗体特异性结合到HTT并且不结合到试验的其他无关蛋白。
实施例26：人源HTT抗体的结合和表位作图的评估
为了对新鉴定到的人源抗体所识别的HTT表位进行作图，如上面实施例9中所述使用合成的肽进行表位作图(图23和图35A，D-F)。此外，如实施例10中所述，通过使用BSA偶联的Htt外显子1结构域肽的直接ELISA确定HTT抗体对BSA偶联的HTT外显子1的肽片段的半最大有效浓度(EC50)，并进行EC50确定。
实施例27：HTT抗体在人类HTT转基因小鼠中的结合的评估
如上文实施例12中所述评估在人类HTT转基因小鼠脑组织中鉴定到的抗体对HTT病理结构的结合特性，区别在于切片的温浴使用浓度为5nM(图3M(74C11、39C12、11A4、22H9、78H12、37C12、7D8、72F10))或50nM(15F9、71F6、55D8、44D7、7A8、64E5)的抗HTT抗体来进行。如图24中所示，鉴定到的人源抗HTT抗体揭示出在R6/1转基因动物的纹状体和皮层中神经元核内包涵体病理结构的明显和高特异性染色，正如也对上述抗体NI-302.33C11、NI-302.63F3和NI-302.35C1所显示的。这些发现与实施例26中通过ELISA和斑点印迹所确定的与HTT聚集物的高亲和性结合相一致。
实施例28：亨廷顿病(HD)的转基因小鼠模型R6/1的基本性质研究
Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因小鼠带有1.9kb转入基因，其从源自于HD患者的噬菌体基因组克隆分离，并含有人类亨廷顿蛋白(HTT)基因的5’末端。它由大约1kb的5’UTR序列、外显子1(带有～130个单元的扩增的CAG重复序列)和内含子1的前262bp构成。将这种构建物显微注射到单细胞CBAxC57BL/6胚胎中。将雄性创立者R6与CBAxC57BL/6雌性繁育，产生几种创立者株系(Mangiarini等，Cell 87(1996),493–506)。来自于创立者株系R6/1的小鼠具有泛表达的作为单一完整拷贝整合的转入基因。将混合的CBAxC57BL/6遗传背景上的转基因小鼠与C57BL/6J回交超过12次，以产生同类品系B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J。R6/1转基因小鼠表现出进行性神经表型，其模拟HD的许多特点，包括舞蹈病样动作、不自主刻板运动、震颤和癫痫发作，以及非运动病症成分包括异常发声。它们频繁排尿并在整个疾病过程中表现出体重和肌肉量减少。在神经学上，它们发展出神经元核内包涵体(NII)，其包含HTT和遍在蛋白两者。这些NII也已在人类HD患者中鉴定到。对于这种6/1株系来说，HD症状的发作年龄据报道发生在15至21周之间(Naver等，Neuroscience 122(2003),1049-1057；Hodges等，Genes Brain Behav.7(3)(2008),288-299)。
将从Jackson Laboratories获得的R6/1转基因小鼠扩增，并在行为表型、体重的纵向发展、脑总重量、组织病理学分析和存活率方面进行纵向表征，如图25中所示。获得的发现大体上与已发表的数据相符，并将这种小鼠株系鉴定为用于靶向聚集的HTT的人源NI-302抗体的效能研究的适合的临床前模型。
实施例29：HD的转基因小鼠模型N171-82Q的基本性质研究
B6C3-Tg(HD82Gln)81Dbo/J(N171-82Q)转基因小鼠株系(Schilling等，Hum MolGenet.8(3)(1999),397-407)是用于HD的充分表征的小鼠模型。B6C3-Tg(HD82Gln)81Dbo/J(N171-82Q)转基因小鼠表达N-端截短的人类HTT cDNA，其编码82个谷氨酰胺并涵盖前171个氨基酸。所述改变的HTT cDNA在小鼠朊病毒蛋白启动子的控制之下。在中枢神经系统的神经元中观察到表达。表达这个转入基因的小鼠在出生后1-2个月中显得正常。然而，所述小鼠不能增加体重，发生震颤、运动功能减退，并缺乏协调。它们表现出异常步态和频繁的后肢抱握。它们的预期寿命为5-6个月。使用HTT抗体的研究指示了弥散的核标记和多种神经元群体中的大量免疫反应性核包涵体。此外，神经炎损伤明显。
将从Jackson Laboratories获得的N171-82Q转基因小鼠扩增，并在行为表型、体重的纵向发展、末期时的脑总重量、组织病理学分析和存活率方面进行纵向表征(图26)。这些发现大体上与已发表的数据相符，并且除了在实施例29中描述的小鼠株系之外，将这种小鼠株系也鉴定为用于靶向聚集的HTT的人源NI-302抗体的效能研究的适合的临床前模型。
实施例30：亨廷顿病(HD)患者中神经元包涵体染色的评估
为了评估患者中神经元包涵体被本发明鉴定的抗体的染色，进行了免疫组织化学分析。如上文实施例12中所述进行了鉴定到的抗体与人脑组织中的HTT病理结构的结合的评估，区别在于切片的温育使用50nM的NI-302.33C11、50nM的NI-302.63F3或100nM的NI-302.35C1抗体来进行。
如图27中所示，使用结合polyP区的抗体NI-302.33C11的免疫组织化学分析显示，在50nM浓度下亨廷顿病患者的皮层神经元中(图27A-D)的神经元核内包涵体被染色，并且在1(E)和5nM(F)浓度下270日龄的疾病晚期的B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因动物的纹状体神经元中的神经元核内包涵体被染色，而在非转基因同窝仔畜中(G)、在染色期间省略第一抗体时(H)或者在将非亨廷顿病对照的组织用50nM的NI-302.33C11染色时，没有检测到染色。在使用50nM的NI-302.63F3或100nM的NI-302.35C1的免疫组织化学分析中，富P结构域抗体NI-302.63F3(图28)和抗C-端结构域抗体NI-302.35C1(图29)显示出四位不同亨廷顿病患者(A-D)的皮层神经元的神经元核内包涵体的染色(A-C)和一些神经突的染色(D)。在1(E)和5nM(F)浓度下，在270日龄的疾病晚期的B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因动物的纹状体神经元中也观察到染色。在非转基因同窝仔畜中(G)、在染色期间省略第一抗体时(H)或者在将非亨廷顿病对照的组织用50nM的NI-302.63F3或100nM的NI-302.35C1分别染色时，没有检测到染色。
与本发明的特异性抗HTT抗体相反，使用可商购的抗polyQ抗体Mab1574(1:2000，Chemicon)的免疫组织化学分析显示出组织的附加染色，即更普遍的核和细胞质染色和四位不同亨廷顿病患者的皮层神经元的一些神经突的染色(图30A、D)以及症状出现之前的150日龄(图30E)和270日龄(图30F)的疾病晚期的B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因动物的纹状体神经元中的染色。
实施例31：利用直接ELISA和EC50进行的抗poly Q/P结构域NI-302.7D8抗体的结合亲和性和选择性的表征
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.7D8对具有21或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的半最大有效浓度(EC50)，如上文实施例6中所述进行了直接ELISA和EC50确定。
可以显示，NI-302.7D8以相似的高亲和性结合到可溶性GST-HD21和聚集的HD21，其EC50为大约50至100nM，尽管对更加延长的病原形式的聚集的HD49和可溶性GST-HD49显示出偏好性，并且EC50分别为17和6nM(图31B)。
因此，人源HTT抗poly Q/P结构域抗体NI-302.7D8以低纳摩尔范围内的高亲和性靶向在HTT外显子1蛋白的聚集的以及未切开的更加线性的结构中暴露的表位。
此外，为了表征重组人源HTT抗体NI-302.7D8与具有21、35或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的结合，如上文实施例7中所述在1ug/ml的浓度下使用了滤膜滞留测定和斑点印迹。
可以显示，在斑点印迹(图32B，左侧)上，抗体NI-302.7D8同等良好地检测具有扩增的polyQ区段的亨廷顿蛋白(HD49＝HD35＝HD21)。在滤膜滞留分析(图32B，右侧，FRA)中，NI-302.7D8不结合到滤膜上的SDS稳定的HD21、HD35或HD49聚集物。
此外，为了确定NI-302.7D8重组抗体与无关聚集蛋白靶的结合，如上文实施例8中所述进行了直接ELISA。如图33B中所示，人源NI-302.7D8特异性结合到HTT，同时未能显示出与无关蛋白的结合。
实施例32：HTT抗体NI-302-64E5、NI-302.7D8和NI-302.72F10的结合表位的评估
为了对被NI-302-64E5、NI-302.7D8和NI-302.72F10人源抗体识别的亨廷顿蛋白表位进行作图，如上文实施例9中所述使用合成的肽进行了表位作图。
图35A显示了NI-302-64E5与10至12号肽的明显结合，表明被该抗体识别的表位位于亨廷顿蛋白的富P重复序列结构域中。因此，推测NI-302.64E5结合表位位于HTT的氨基酸48-PQPPPQAQPL-58(SEQ ID No.:200)内。如图35B中所示，观察到NI-302.7D8与6至8号肽的明显结合，表明被该抗体识别的表位位于亨廷顿蛋白的polyQ/polyP重复序列结构域中。因此，预测NI-302.7D8结合表位位于HTT的氨基酸28-QQQQQQQPPP-37(SEQ ID No.:201)内。相反，观察到NI-302.72F10与15和16号肽的明显结合，表明被该抗体识别的表位位于HTT的抗N-端结构域中。(图35C)。因此，预测NI-302.72F10结合表位位于HTT的氨基酸70-PPPGPAVAEEPLH-82(SEQ ID No.:202)内。
实施例32：利用直接ELISA和EC50进行抗N-端结构域抗体NI-302.15E8的结合亲和性和选择性的表征
为了确定人源HTT抗体NI-302.15E8对具有21或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的半最大有效浓度(EC50)，如上文实施例6中所述进行了直接ELISA和EC50确定。
可以显示，NI-302.15E8以较高亲和性结合到非聚集的GST-HD49和GST-HD21并以较低亲和性结合到聚集的HD49和HD21，参见图14A和B。因此，人源HTT抗N-端结构域抗体NI-302.15E8靶向在聚集的以及可溶形式的HTT两者中暴露的表位，尽管对可溶形式的HTT的亲和性更高。
实施例33：通过结合到不同外显子1肽的直接ELISA进行的HTT抗体NI-302.15E8的表位作图
为了确定重组人源HTT抗体NI-302.15E8对BSA偶联的亨廷顿蛋白外显子1的肽片段的半最大有效浓度(EC50)，如实施例10中所述进行了使用BSA偶联的Htt外显子1结构域肽的直接ELISA和EC50确定。
如图15中所示，NI-302.15E8以高亲和性结合到N-端处的前19个BSA偶联的氨基酸以及全长GST-HD49，EC50分别为约0.1或15。
实施例34：HTT抗体NI-302.35C1对人类HTT转基因小鼠中的行为缺陷的影响
在人类HTT小鼠中进行了度量焦虑样行为的高架十字迷宫试验和度量运动能力和协调的爬杆实验，以在体内研究抗HTT抗体NI-302.35C1。
组和处理
对于行为分析来说，使用了具有n＝24只(12/12雄性/雌性)实施例12中所描述的B6.Cg-Tg(HDexon1)61Gpb/J转基因(tg)小鼠的两个小鼠组和一个野生型(wt)小鼠组。在6-7周龄开始，转基因小鼠组接受30mg/kg小鼠嵌合NI-302.35C1或介质的腹膜内处理，直至7至9月龄之间小鼠的末期表型为止，野生型小鼠用同样体积的介质注射。高架十字迷宫和爬杆实验行为测试分别在16和18周龄时进行。
高架十字迷宫试验
高架十字迷宫试验按照Naver等，Neursoscience 122(2003),1049-1057来进行。将迷宫高架在地板上方50cm。源自于中央平台的四个迷宫臂(30cm x 5cm)形成十字。彼此相对放置的两个臂被15cm高的墙封闭(封闭臂)，而其他臂不具有任何类型的筛网(开放臂)。所述试验在动物的暗期开始时进行，并且开放臂上的光照在40lux的范围内。将每只小鼠面朝开放臂置于十字迷宫的中心。实验持续5min，并使用视频跟踪系统(VideoMot软件，TSE Systems)进行记录。在各个试验时段之间，将迷宫用水清洗并用纸巾干燥。随后评估在开放和封闭臂中进入的次数以及在开放和封闭区室中花费的时间。进入被定义为所有四只爪在一个臂中。进入开放臂中的次数和在开放臂中花费的时间被用作小鼠中开放空间诱导的焦虑的指标。
爬杆实验
爬杆实验被广泛用于在小鼠中评估与基底神经节相关的运动障碍；参见例如Matsuura等，J.Neurosci.73(1997),45-48；Sedelis等，Behav Brain Res.125(2001),109-125；Fernagut等，Neuroscience 116(2003),1123-1130。简单来说，将动物头朝上置于50cm长的竖直木杆(直径1cm)顶上。将杆的底部置于家笼中。当放置在杆上时，动物自己向下取向并沿着杆的长度向下回到它们的家笼中。在测试当天，动物接受三次实验，并测量爬下的总时间(t-总)。当天的第三次实验的结果示出在图24B中。
如图34A中所示，NI-302.35C1处理的R6/1动物与介质处理的R6/1动物相比在开放臂中花费较少时间，进入开放臂的频率较低，并且在开放臂上做出较少的不受保护的浸头。因此，NI-302.35C1处理的R6/1小鼠表现出与非转基因同窝仔畜可比的更焦虑的表型。此外，如图24B中所示，与介质处理的R6/1动物相比，NI-302.35C1处理的R6/1动物在爬杆实验中显示出改进的表现，达到与非转基因动物相近的水平。概括来说，本发明的抗体NI-302.35C1在人类HTT转基因小鼠中对行为表现和运动相关任务具有有益影响。
实施例35：HTT抗体的序列比对
同一性或相似性百分数的确定，使用在本发明的“定义”节中所描述的BLASTn程序的标准参数来进行。如图36中所示，本发明的所有抗体在CDR中富含酪氨酸。
实施例36：双特异性抗HTT抗体的产生
双特异性抗体的产生可以如Brennan的文献中一般性描述的来进行；参见上文。用于生产双特异性抗体的起始原料是本发明的完整的IgG抗HTT抗体，其如实施例中所述并且如图20中所概述的，识别HTT外显子1蛋白的polyP区、polyQ/polyP区、富P区、C-末端区或N-末端区。将所述抗体在pH 4.0的乙酸盐缓冲液中用胃蛋白酶在37℃下处理3小时，以切开抗体的Fc部分。通过用Tris缓冲液将pH升高到8来终止反应。随后向所述溶液装入等体积的5,5'-二硫双-2-硝基苯甲酸(DTNB)与硫代硝基苯甲酸酯(TNB)的混合物，并在室温下温育20小时。所述DTNB-TNB混合物的摩尔比为20:30，通过将40mM DTNB溶液与10mM DTT溶液温育几分钟来建立。在用0.1mM DTT将两种修饰的F(ab’)片段在25℃下进一步还原1小时后，将由此获得的F(ab’)-TNB和F(ab’)-SH片段在25℃下杂交到双特异性F(ab’)2片段1h。双特异性F(ab’)2片段通过凝胶过滤(Superdex 200柱)进行纯化。
实施例37：利用直接ELISA和EC50进行的双特异性抗HTT抗体的结合亲和性和选择性的表征
为了确定双特异性HTT抗体对具有21或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的半最大有效浓度(EC50)，如上文实施例6中所述进行直接ELISA和EC50确定。所述双特异性HTT抗体以高亲和性结合到所有4种物质，包括聚集的HTT外显子1HD49，以低纳摩尔亲和性同等地靶向在聚集的以及可溶形式的HTT中暴露的它们的相应表位。此外，为了表征双特异性HTT抗体与具有21、35或49个polyQ重复序列的可溶性和聚集的HTT外显子1蛋白的结合，如上文实施例7中所述进行了滤膜滞留测定和斑点印迹。在斑点印迹上，双特异性HTT抗体偏好性检测具有扩增的polyQ区段的HTT构建物。此外，信号强度随着HD35和HD49的聚集反应的温育时间的增加而提高。在滤膜滞留分析中，双特异性HTT抗体检测保留在孔眼尺寸为0.2μm的膜上的HD35和HD49聚集物。基于它们对HTT的双重特异性和以前发现的单个抗体在结合有蛋白制备物的膜上的结合，预期双特异性HTT抗体偏好性靶向具有病原性polyQ扩增的聚集的HTT构造。此外，为了确定双特异性抗HTT抗体与无关聚集蛋白靶的结合，如上文实施例8中所述进行了直接ELISA。在这种背景中，双特异性抗HTT抗体特异性结合到HTT，同时未能显示出与无关蛋白的结合。
序列表
<110> 神经免疫控股公司
<120> 人源抗亨廷顿蛋白（HTT）抗体及其用途
<130> NE30A51/P-WO
<150> EP 14179004.8
<151> 2014-07-29
<160> 202
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
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tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc agg ttc agt gac ttt 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Asp Phe
20 25 30
ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag gga ctg gag tgg ctg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
gca ctt ata tgg tat gat gga ggg tat aag tac tat gca gac tcc gtg 192
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aat acg atg ttt 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Phe
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cta caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtt tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg acc cac cta gaa tat tgc agt aga acc acc tgc tat ctc ggc cac 336
Ala Thr His Leu Glu Tyr Cys Ser Arg Thr Thr Cys Tyr Leu Gly His
100 105 110
tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 369
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Asp Phe
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gac aca gtc acc ttc act tgc cgg gcc agt cag ggc att agc gat tat 96
Asp Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asp Tyr
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tta gcc tgg ttt cag cag aaa cca ggg att gcc cct aag ctc ctg atc 144
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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tat gct gcg tcc act ttg caa acc ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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agt gga tct ggg aca gaa ttc act ctc aca atc cgc agc ctg cag tct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Ser
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gaa gat ttt gga act tat tac tgt cag cag ctt aaa act tac ccg tac 288
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Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Arg Thr Tyr Val Gln Ala Phe
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<213> Homo sapiens
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<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 9
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga aac ttg gta cag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt act gcc tct gga ttc acc ttt agt ata acg 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Thr
20 25 30
gcc ctg agt tgg gtc cgc cag gct cca gaa aag ggg ccg cag tgg gtc 144
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Pro Gln Trp Val
35 40 45
tca gca atc act gga aat gct tat ggg aca tac tac gca gac tcc gtg 192
Ser Ala Ile Thr Gly Asn Ala Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgg ttc acc att tcc aga gac aac gcc aag aac aca ctg tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ttg caa atg aac ggc ctg aga gcc gag gac acg gcc atc tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gtg aaa gga att gcc tcc gat agt agt ggt tat tct gcc ttc tgg ggc 336
Val Lys Gly Ile Ala Ser Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Ala Phe Trp Gly
100 105 110
ccg ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Thr
20 25 30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Pro Gln Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Gly Asn Ala Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Gly Ile Ala Ser Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Ala Phe Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.35C1 VK variable light -kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(102)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(168)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (265)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 11
gaa att gtg ctg act cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt caa agt gtt gac aac cag 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Gln
20 25 30
ttt gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc att 144
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc agg agg gcc cct ggc atc cca gac agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Arg Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc att agc agc cta gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttc gca att tat tac tgt cag cat cgt tac acc tgg ctc tac 288
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln His Arg Tyr Thr Trp Leu Tyr
85 90 95
act ttt ggc cag ggg aca cga ctg gag att aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Gln
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Arg Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln His Arg Tyr Thr Trp Leu Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.31F11 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(195)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (292)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 13
gag gtg cag ctg gtg gag tcc gga gga ggc ttg atc cag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct ggg ttc acc gtc agc agc acc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Thr
20 25 30
tac atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctt gag tgc gtc 144
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Val
35 40 45
tca gtt att ttt agt ggc gct gac aca tat tac gca gac tcc gtg aag 192
Ser Val Ile Phe Ser Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aat tcc aag aac aca ctg ttt ctt 240
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
cag atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gcc aca tat tac tgt gtg 288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
aga cat tat tat ggt tca gac ctt cca tct gac ttc tgg ggc cag ggc 336
Arg His Tyr Tyr Gly Ser Asp Leu Pro Ser Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Val
35 40 45
Ser Val Ile Phe Ser Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg His Tyr Tyr Gly Ser Asp Leu Pro Ser Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-302.31F11 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(306)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 15
gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc gcc cct gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc cta tac agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg aag cct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Pro
35 40 45
cca cag ctc ctg gtc tat ttg ggt tct gat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Val Tyr Leu Gly Ser Asp Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aaa gat ttt aca ctg aac atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa ggt 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
cta caa agt ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag ctg gag atc aaa 336
Leu Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Val Tyr Leu Gly Ser Asp Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 354
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<223> NI-302.2A2 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(321)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 17
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agt acc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
tgg atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aac ata aaa cca gat gga agt gac aaa tac tat gtg gac tct gtg 192
Ala Asn Ile Lys Pro Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gac gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga ggg gac ggc agt ggc tgg aac gtc tac tgg ggc cag gga acc 336
Ala Arg Gly Asp Gly Ser Gly Trp Asn Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tcg 354
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Pro Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Gly Ser Gly Trp Asn Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<223> NI-302.2A2 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(129)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (175)..(195)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (292)..(315)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 19
gac atc cag atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt ctt tta tac acc 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
tcc aaa aat aag gac agt aag aac tac tta ggt tgg tac cag cag aaa 144
Ser Lys Asn Lys Asp Ser Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
35 40 45
cca gga cag cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa 192
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
50 55 60
tcc ggg gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc 240
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75 80
act ctc acc atc agc agc ctg cag gct gag gat gtg gca gtt tat tac 288
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt cag cag tat tat act act cct cag ttc ggc gga ggg acc aag gtg 336
Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
gag atc aaa 345
Glu Ile Lys
115
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Ser Lys Asn Lys Asp Ser Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
35 40 45
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Glu Ile Lys
115
<210> 21
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<223> NI-302.6N9 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(336)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 21
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac ttg gtg cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gtc tct gga ttc acc ttt agt agt tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gcc atg acc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gcc tgg gtc 144
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Val
35 40 45
tca aca att agt gct act ggt ggt agt aca ttc tac aca gac tcc gtg 192
Ser Thr Ile Ser Ala Thr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
agg ggc cgg ttc acc atc tcc cga gac aat tcc aag aac aca ctg tat 240
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aat agc ctg aga acc gac gac acg gcc ata tat tat tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gtg aaa gat cta ttt gga gtg gac acc tcc tac tac ggt atg gac gtc 336
Val Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Thr Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 369
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ala Thr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Thr Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> NI-302.6N9 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (151)..(171)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (268)..(294)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 23
gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg ccc agt cag agt gtc agc ggc agg 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Pro Ser Gln Ser Val Ser Gly Arg
20 25 30
tat gtg gcc tgg tat cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
ttc tat gct gca tcc aac agg gcc att ggc atc cca gac agg ttc agt 192
Phe Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Ala Ile Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cac tat ggt gcc tca tcg 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ala Ser Ser
85 90 95
tac act ttt ggc ccg ggg acc aaa gtg gat atc aaa 324
Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Pro Ser Gln Ser Val Ser Gly Arg
20 25 30
Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Phe Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Ala Ile Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ala Ser Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NI-302.74C11 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(186)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(327)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 25
gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg act gag gtg cag aag cct ggg gcc 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Gln Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gta aaa gtc tcc tgc aag gct tct gga tac agt ttc acc ggc tac 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
ttt ttg cac tgg gta cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg tgg atc aac cct aac agt ggt gac aca aac tat gca gag aag ttt 192
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
cgg ggc aga atc atc atg acc agg gac acg tct gtc agc aca gcc cac 240
Arg Gly Arg Ile Ile Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala His
65 70 75 80
atg gag ttg agc agc ctg aga ttt gac gac acg gcc cta tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
acg aga gag gcc cct gac ccg ggc gct gag acg gac gtc tgg ggc caa 336
Thr Arg Glu Ala Pro Asp Pro Gly Ala Glu Thr Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 360
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Gln Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ile Ile Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Pro Asp Pro Gly Ala Glu Thr Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.74C11 VL variable light chain (VL) sequence
<220>
<221> V_region
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<220>
<221> V_region
<222> (145)..(165)
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<220>
<221> V_region
<222> (262)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 27
cag tct gtg ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag 48
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gca gtg cca aag cag tat att 96
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Val Pro Lys Gln Tyr Ile
20 25 30
tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag gcc cct att ctg gtg ata tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
aaa gac act cag agg cct tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192
Lys Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
aac tca ggg aca aca gtc acg ttg acc ata act ggc gtc cag gca gac 240
Asn Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp
65 70 75 80
gac gag ggt gac tat tac tgt caa tca gca gac agt agt gct act tgg 288
Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Ala Thr Trp
85 90 95
gtg ttc ggc gga ggg acc aaa ttg acc gtc cta 321
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Val Pro Lys Gln Tyr Ile
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp
65 70 75 80
Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Ala Thr Trp
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 29
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NI-302.15F9 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(201)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (298)..(327)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 29
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ctg gtc acg ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcg tgt gag gcc tct gga ttt ctc ttc aag aat tct 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Leu Phe Lys Asn Ser
20 25 30
agc atg aac tgg gtc cgt cag act ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tcg tcc att gac act tct gct aca aat tat aag tat tat gca gac tct 192
Ser Ser Ile Asp Thr Ser Ala Thr Asn Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
gtg aag ggc cga ttt acc atc tcc agg gat gac gcc acc aac tct ctc 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Thr Asn Ser Leu
65 70 75 80
tat ctg caa atg aat agc ctg cga gcc gac gac acg gct act tat tac 288
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg cga ggt tat tat acc ccc cgg gac ttt gac tac tgg ggc cag 336
Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Thr Pro Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Leu Phe Lys Asn Ser
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Thr Ser Ala Thr Asn Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Thr Asn Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Thr Pro Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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<220>
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<400> 31
gat gtt gtg atg act cag tct cca cag acc ctg tcc gtc agc ctt gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gln Thr Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
cag gcg gcc tcc atc tcc tgc agg tcg agt caa agc ctc ttg tat cgt 96
Gln Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
gat aac aac aca tac ttg aat tgg ttt cac cag agg cca ggc caa tct 144
Asp Asn Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca agg cgc ctc att tat agg gct tct gac cgg gac tct ggg gtc cca 192
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac aga ttc agc ggc ggt ggg tca ggc act gat ttc aca ttg aaa atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
agt gga gtg gag gct gaa gat gtt ggc act tat tac tgc atg caa gga 288
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
aca cac tgg cct cgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 336
Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gln Thr Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Asp Asn Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<220>
<221> V_region
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<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 33
gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gtc cac cct tgg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Trp Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc agc gtc tct aat tac 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
gcc ata act tgg gtc cgc cgg gct cca ggg aag ggg ctg caa tat att 144
Ala Ile Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Tyr Ile
35 40 45
tca gta att tat cgt gat ggc agg aca tac tac gga gac tcc gtg agg 192
Ser Val Ile Tyr Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Arg
50 55 60
ggc cgc ttc acc atc tct agg gac gat tcc aag aac act ctc tat ctt 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aga ttt gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg 288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aga gcg cac ggc caa tat tac tat ggt gtg gac gtc tgg ggc caa ggg 336
Arg Ala His Gly Gln Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc acg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Trp Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Tyr Ile
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala His Gly Gln Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(306)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 35
gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc agc cct gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc cta cat agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac cgg cag aaa cca ggg cag tct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca cag ctc ctg atc tat ttg agt tct aat cgg ccc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro
50 55 60
gat agg ttc agt gcc agt gga tca ggc aca gag ttc aca ctg caa atc 240
Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa tct 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
ctg caa acg ttc act ttc ggc gga ggg acc aaa gtg gat atc aaa 333
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 37
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<220>
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<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 37
gag gtg cag ctg gtg gag tct gga gga ggc ttg atc cag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct ggg ttc ccc gtc agt agc agt 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac atg agc tgg gtc cgc cag gct cca gga gag ggg ctg gag tgg gtc 144
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca gtt ctt tat aga gac ggt gac aca tac tac gca gac tcc gtg cag 192
Ser Val Leu Tyr Arg Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln
50 55 60
ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc cag aac acg ttc tat ctt 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aaa gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg 288
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
ggt gat aga agg tcg tca cac tac tat tac ggt atg gac gtc tgg ggc 336
Gly Asp Arg Arg Ser Ser His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
cag ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 363
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Arg Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Asp Arg Arg Ser Ser His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.11A4 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
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<220>
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<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<400> 39
gaa att gtg atg aca cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca gga 48
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac ttc gcc tgg tac caa caa aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat ggt acg tcc cgc agg gcc act gcc atc cca gac agg ttc agt 192
Ile Tyr Gly Thr Ser Arg Arg Ala Thr Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa cag tat ggt agc tcg tgg 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp
85 90 95
acg ttc ggc cca ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Arg Arg Ala Thr Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.22H9 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(195)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (292)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 41
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cac cct tgg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Trp Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga gtc tcc tgt gca gcc tct gga ttc agc gtc tct aat tac 96
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
gcc ata act tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa tat att 144
Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
tca gtg att tat cgt gat ggc agg aca tac tac gga gac tcc gtg agg 192
Ser Val Ile Tyr Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Arg
50 55 60
ggc cgc ttc acc atc tct agg gac gat tcc aag aac act atc tat ctt 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aga ttt gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg 288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aga gcg cac ggc caa tat tat tat ggt gtg gac gtc tgg ggc caa ggg 336
Arg Ala His Gly Gln Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc acg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Trp Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala His Gly Gln Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<223> NI-302.22H9 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(303)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 43
gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc agc cct gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc cta cat agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac cgg cag aaa cca ggg cag tct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca caa ctc ctg atc tat ttg aat tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Asn Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gat agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gag ttc aca ctg aca atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa tct 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
ctg caa acg ttc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 333
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 44
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Asn Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 45
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.44D7 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
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<220>
<221> V_region
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<220>
<221> V_region
<222> (295)..(324)
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<400> 45
gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gcc atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca ggt att ggt tat agt gat act agc aca tat tac gca gac tcc gtg 192
Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgc ttc acc gtc tcc aga gac att tcc aag aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aat agc ctg agg gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgc 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aaa ggt acc agg gac tat tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg 336
Ala Lys Gly Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
aca atg gtc acc gtc tct tcg 357
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223> NI-302.44D7 VL variable light chain (VL) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (67)..(108)
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<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
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<400> 47
cag act gtg gtg act cag gag cca tcg ttc tca gtg tcc cct gga ggg 48
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
aca gtc aca ctc act tgt ggc ttg agt tct ggc tca gtt tct act agt 96
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
tac tac ccc agc tgg tac cag cag acc cca ggc cgg gct cca cgc acg 144
Tyr Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Arg Ala Pro Arg Thr
35 40 45
ctc atc tac agc aca aac act cgc tct tct ggg gtc cct gat cgc ttc 192
Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc atc ctt ggg aac aag gct gcc ctc acc atc acg ggg gcc 240
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
cag gca gat gat gaa tct gat tat tac tgt gtg ctg ttt atg ggt agt 288
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Phe Met Gly Ser
85 90 95
ggc att ggg gtg ttc ggc gga ggg acc agg ctg acc gtc cta 330
Gly Ile Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 48
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Tyr Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Arg Ala Pro Arg Thr
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Phe Met Gly Ser
85 90 95
Gly Ile Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 49
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.37C12 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(192)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (292)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 49
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggt gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tct tgt gtt gcc tct gca ctc acc gtc act aac agc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Leu Thr Val Thr Asn Ser
20 25 30
caa atg acc tgg gtc cgc cgg gct cca ggg agg ggg ttg gag tgg gtc 144
Gln Met Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca gtt att tac acc agt ggt agt gca tac tac gca gac tcc gtg aag 192
Ser Val Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc aga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca gtg ttt ctt 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aga gtc gaa gac acg gct gtg tat tac tgt gcg 288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aaa ggc cca tca gcc tat tat tac ggt ttg gac ctt tgg ggc caa ggg 336
Lys Gly Pro Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc acg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Leu Thr Val Thr Asn Ser
20 25 30
Gln Met Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Pro Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<223> NI-302.37C12 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(303)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 51
gat att gtg atg act caa tca cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag ccg ggg cag tct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct act cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aag atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa ggt 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
cta cag acg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 333
Leu Gln Thr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<223> NI-302.55D8 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
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<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(213)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(345)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 53
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg tct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc acc gac tac 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
tat ata cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga cgg atc aac cct aac aat ggt ggc aca aac tat gca cag aac ttt 192
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
cag ggc tgg gtc acc atg acc agg gac acg tcc atc agc aca gcc tac 240
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctc agc aga ctg aga tct gac gac acg gcc gtc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gtg ggg ggc gag ctg cta cga gaa ggc ggc tat cac tac tac 336
Ala Arg Val Gly Gly Glu Leu Leu Arg Glu Gly Gly Tyr His Tyr Tyr
100 105 110
atg gac gtc tgg ggc aag ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 378
Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 54
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Glu Leu Leu Arg Glu Gly Gly Tyr His Tyr Tyr
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 55
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-302.55D8 VL variable light chain (VL) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (67)..(108)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (154)..(174)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (271)..(306)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 55
cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag 48
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
agg gtc acc atc tcc tgc act ggg aac agc tcc aac atc ggg gca ggt 96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
tat gat gta cac tgg tac cag cag ctt cca gga aca gcc ccc aaa ctc 144
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
ctc atc ttt gat aat acc aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc 192
Leu Ile Phe Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gat gag gct aat tat cac tgc cag tcc tat gac aac agc 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asn Tyr His Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
85 90 95
ctg agt ggt tct tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 336
Leu Ser Gly Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Phe Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asn Tyr His Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 57
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<223> NI-302.7A8 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(336)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 57
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tcg gtc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc ata ttt aga aac agt 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Arg Asn Ser
20 25 30
tgg atg acc tgg gtc cgc cag gat cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aac ata aag gaa gat gga agt cgg aca tac tat gtg gac tct gtg 192
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gta tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gga gat tat aat tcg ggc atc tat tac ttt ccc ggg gac tac 336
Ala Arg Gly Asp Tyr Asn Ser Gly Ile Tyr Tyr Phe Pro Gly Asp Tyr
100 105 110
tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 369
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Arg Asn Ser
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Asn Ser Gly Ile Tyr Tyr Phe Pro Gly Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-302.7A8 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(306)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 59
gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
cag ccg gcc tcc atc tcc tgt agg tct agt caa agc ctc gta tac agt 96
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
gat gga aac acc tac ttg aat tgg ttt cag cag agg cca ggc cag tct 144
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca agg cgc ctc att tat aag gtt tct aac cgg gac tct ggg gtc cca 192
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac aga ttc agc ggc agt ggg tca ggc act gat ttc aca ctg aga atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
agc agg gtg gag gct gag gat gtt ggc att tat tac tgc atg caa ggt 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
aca cac tgg cct ggg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 336
Thr His Trp Pro Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 381
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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<220>
<221> V_region
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<220>
<221> V_region
<222> (151)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(348)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 61
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgt ctt gtc tct agt tac tcc atc agc aat ggt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Asn Gly
20 25 30
tac tac tgg ggc tgg att cgg cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
att ggg agt atc tat cat aat ggg aac acc tat tac aac ccg tcc ctc 192
Ile Gly Ser Ile Tyr His Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
aag agt cga gtc atc att tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc 240
Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
ctg aag ttg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tac tac tgt 288
Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg atg cca agt gcc acc tat tat tat ggt tcg ggg act caa ttc cat 336
Ala Met Pro Ser Ala Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Gln Phe His
100 105 110
gcg ttt gat gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 381
Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 62
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Asn Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Met Pro Ser Ala Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Gln Phe His
100 105 110
Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 63
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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<221> V_region
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<400> 63
cag tct gcc ctg act cag cct cgc tca gtg tcc ggg tct cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
tca gtc acc atc tcc tgc act gga acc agc aga gat gtt ggt aat tat 96
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Arg Asp Val Gly Asn Tyr
20 25 30
aac tat gtc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc gaa gtc ccc aaa ctc 144
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Glu Val Pro Lys Leu
35 40 45
ata att tat gat gtc agt gag cgg ccc tca ggg gtc cct gat cgc ttc 192
Ile Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcg ctg acc atc tct ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gat gag gct gac tat tac tgc tgc tca tat gct ggc agt 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
tac acc ttc gag gta ttt ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 333
Tyr Thr Phe Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 64
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Arg Asp Val Gly Asn Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Glu Val Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acg tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ctc agt ggt tac 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg ata 144
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
ggg gaa gtc aat cat agt gga ggc acc aac ctc aat tcg tcc ctc aag 192
Gly Glu Val Asn His Ser Gly Gly Thr Asn Leu Asn Ser Ser Leu Lys
50 55 60
agt cga gtc atc att tca gta gac aag tcc aag aag cag ttc tcc ctg 240
Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
aaa ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct atg tac ttc tgt gcg 288
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
aga gga tac agc tat gac cca aaa tac tac ttt gac tcc tgg agc cag 336
Arg Gly Tyr Ser Tyr Asp Pro Lys Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Ser Gln
100 105 110
ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Val Asn His Ser Gly Gly Thr Asn Leu Asn Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Tyr Ser Tyr Asp Pro Lys Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Ser Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
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<221> V_region
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<400> 67
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
gcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agt agt gat att ggg agt tat 96
Ala Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
gat ttt gtc tcc tgg tac cag cag gac cca ggc aaa gcc ccc aaa gtc 144
Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Asp Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
att att tat ggg gtc aat aag cgg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc 192
Ile Ile Tyr Gly Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg aca atc tct gga ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gac gac gag gct gat tat tac tgc tgc tca tat gct ggt agt 288
Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
acc act tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aaa ctg acc gtc cta 330
Thr Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 68
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ala Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Asp Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
Ile Ile Tyr Gly Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Thr Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 69
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<220>
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<400> 69
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gct gtg atg aag aag cct gga gac 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Val Met Lys Lys Pro Gly Asp
1 5 10 15
tca gtg agg gtc tcc tgc agg gct tct act tac agc ttt tcc acc tat 96
Ser Val Arg Val Ser Cys Arg Ala Ser Thr Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
agt ttc acc tgg gtg cga cag gtc cct gga caa ggc ctt gag tgg atg 144
Ser Phe Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga tgg atc agc gct tat aat ggt cac aca aac tat gta gac agc ttc 192
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly His Thr Asn Tyr Val Asp Ser Phe
50 55 60
cag ggc aga ctc acg ttg acc aca gac aca tcc gcg agt aca gcg tac 240
Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gaa ctg agg agc ctc aga tct gac gac acg gcc atc tat tat tgt 288
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg gct gta gac acc act tac tac tat tac ggc atg gac gtc tgg ggc 336
Ala Ala Val Asp Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
caa ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Val Met Lys Lys Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Arg Ala Ser Thr Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ser Phe Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly His Thr Asn Tyr Val Asp Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Val Asp Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<222> (154)..(174)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (271)..(300)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 71
cag act gtg gtg act cag gag cca acg ttc tca gtg tcc cct gga ggg 48
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Thr Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
aca gtc aca ctc act tgt gcc ttg agg ttt ggc tca gtc tct agt agc 96
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Leu Arg Phe Gly Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac tat ccc agc tgg ttc cag cag acc cca ggc cag gct cca cgc acg 144
Tyr Tyr Pro Ser Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35 40 45
ctc atc tac agc aca aac acc cgc tct tcg ggg gtc cct gct cga ttc 192
Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
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tct ggc tcc att ctt ggg aac aaa gct gcc ctc acc atc gcg ggg gcc 240
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ala Gly Ala
65 70 75 80
cag gca aat gat gag gct gac tat tac tgt gtg ctg tat atg ggt agt 288
Gln Ala Asn Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Tyr Met Gly Ser
85 90 95
gga atc ggg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ttg acc gtc cta 330
Gly Ile Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 72
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Thr Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Leu Arg Phe Gly Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Pro Ser Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ala Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asn Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Tyr Met Gly Ser
85 90 95
Gly Ile Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 73
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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<223> NI-302.3D8 VH variable heavy chain (VH) sequence
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<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 73
gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tct tgt gaa gcc tcc gga ttc atc ttt aaa acc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ile Phe Lys Thr Tyr
20 25 30
gcc atg agc tgg gtc cgc cag ctt ccc ggg agg ggg ctg gaa tgg gtc 144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca gct ata agt gcc act ggt gga agc acc ttc tac gca gag tcc gtg 192
Ser Ala Ile Ser Ala Thr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
aag ggc cgg ctc acc att tcc aga gac act gcc aag aat aca gtg tat 240
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac aac ctg aga gcc gaa gac acg gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aaa ggg tcg act gcg gta tat ctc ttt gac tcc tgg ggc cag gga 336
Ala Lys Gly Ser Thr Ala Val Tyr Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ile Phe Lys Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ala Thr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Thr Ala Val Tyr Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.3D8 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(102)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(168)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (265)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 75
gac atc cag atg acc cag tct ccg tcc tca ctg tct gca tct gta ggg 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc ctc act tgt cgg gcg agt cag gac atc aga aat ttc 96
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Phe
20 25 30
ttg gcc tgg att cag cag aag cca ggg aaa ccc cct aag tcc ctg atc 144
Leu Ala Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
tat gct gcg tcc act ttg caa agt ggg gtc cca tca cga ttc agc ggc 192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tcc ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cac cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gct act tat tac tgc cag cag ttt tat aat tac cct ccg 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NI-302.18A1 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (154)..(201)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (298)..(327)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 77
cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga cta gtg aag cct tcg gag 48
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
gcc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc act act gat 96
Ala Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Thr Asp
20 25 30
tat tac tat tgg ggc tgg atc cgc cag tcc cca ggc aag gga cta gag 144
Tyr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg gtt ggg aca ata tac ttt ggt ggg gcc acc tac tac aat ccg tcc 192
Trp Val Gly Thr Ile Tyr Phe Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc agg aac cgg gtc tcg ata tct gtg gac acg tcc aac act cgc ctc 240
Leu Arg Asn Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Thr Arg Leu
65 70 75 80
tcc ctg aga ctt atc tct ctg agc gcc gct gac acg gcc gtc tat tat 288
Ser Leu Arg Leu Ile Ser Leu Ser Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga gtg ggc tac ttg gat agg agt ggt ctt ctt gtg ggc cag 336
Cys Ala Arg Val Gly Tyr Leu Asp Arg Ser Gly Leu Leu Val Gly Gln
100 105 110
ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Thr Asp
20 25 30
Tyr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Gly Thr Ile Tyr Phe Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Asn Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Thr Arg Leu
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Ile Ser Leu Ser Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Gly Tyr Leu Asp Arg Ser Gly Leu Leu Val Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-302.18A1 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(306)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 79
gaa att gtg ctg acg cag tct cca ctc tcc gtg ccc gtc acc ccc gga 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat aat 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Asn
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg aag aag cct ggg cag tct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Lys Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca caa ctc ctg atc tat ttg ggc tct act cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt gcc agt gga tca ggc aca gac ttt aca ctg gaa atc 240
Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gaa gat gtt ggc gtt tac tac tgc atg caa gct 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
ctg cag act cct ccg act ttc ggc aga ggg acc aag gtg gag atc aaa 336
Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 80
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Asn
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Lys Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 81
<211> 366
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(366)
<223> NI-302.8F1 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(204)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (301)..(333)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 81
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtg aag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctt aca atc tcc tgt gca gcc tct ggt ttc acc ttc agt aat gcc 96
Ser Leu Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
tgg atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggt aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
ggc cat att aga acg caa gct gaa gga ggg aca tca gac tat gct gca 192
Gly His Ile Arg Thr Gln Ala Glu Gly Gly Thr Ser Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
ccc gtg aaa ggc aga ttc acc atc tca aga gat gac tca aaa aac acg 240
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aaa acc gag gac aca gcc gta tat 288
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
tat tgt atc ccc ccc ccc tac tac tac tat tac ggt ctg gac gtc tgg 336
Tyr Cys Ile Pro Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp
100 105 110
ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 366
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Thr Gln Ala Glu Gly Gly Thr Ser Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ile Pro Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 327
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<223> NI-302.8F1 VL variable light chain (VL) sequence
<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (154)..(174)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (271)..(297)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 83
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
tcg atc acc atc tcc tgc act gga gcc agc agt gat gtt ggg act tat 96
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ala Ser Ser Asp Val Gly Thr Tyr
20 25 30
gac ctt gtc tcc tgg tac caa caa cat cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144
Asp Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
att att tat gag gtc aat aag cgg ccc tca ggg gtt tct tat cgc ttc 192
Ile Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Tyr Arg Phe
50 55 60
tct gcc tcc aag tct gcc aac acg gcc tcc ctg aca ata tct ggg ctc 240
Ser Ala Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gac gag gct gaa tat tac tgc tgc tca tat gca ggt tat 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Tyr
85 90 95
agc acg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 327
Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 84
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ala Ser Ser Asp Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Asp Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Tyr Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Tyr
85 90 95
Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 85
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.52C9 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(195)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (292)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 85
gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gtc caa cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca ggc tct gga ttc acc gtc agt gac acc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Thr
20 25 30
tac atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca ggt att cat gcc ggt ggt gaa aca tat tac gca gac tcc gtg aag 192
Ser Gly Ile His Ala Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac tcc aag aac acg ctg tat ctt 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg aat agg ctg aca cct gag gac acg gct gtc ttt tat tgt gcg 288
Gln Met Asn Arg Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Ala
85 90 95
aga cac tac tac ggt aat gac gac gac act gat tat tgg ggc cag gga 336
Arg His Tyr Tyr Gly Asn Asp Asp Asp Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile His Ala Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Arg Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Tyr Tyr Gly Asn Asp Asp Asp Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 87
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-302.52C9 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(306)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 87
gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac gtg cag aag cca ggg cag tct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca cag ctc ctc atc tat ttg ggt tct act cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac aga ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc tta caa gct 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
caa caa att ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 336
Gln Gln Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Gln Gln Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<223> NI-302.46C9 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (154)..(201)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (298)..(336)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 89
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gta aag cct tca cag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc act gtt tct ggt gcc tcc gtc agc agt ggt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
gcc tac tac tgg agt tgg atc cgg cag ccc gcc ggg aag cga ctg gag 144
Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Arg Leu Glu
35 40 45
tgg att ggg cgt gtc tat ccc act tgg agc acc aac tac aac ccc tcc 192
Trp Ile Gly Arg Val Tyr Pro Thr Trp Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc gag agt cga gtc acc ata tcg tta gac acg tcc aac aac cag ttc 240
Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctg aag ctg acc tct ttg act gcc gca gac acg gcc gtt tat tac 288
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga gag gct cct ggt gac tac gat gct gcg ccc cta gcc tac 336
Cys Ala Arg Glu Ala Pro Gly Asp Tyr Asp Ala Ala Pro Leu Ala Tyr
100 105 110
tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 369
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Arg Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Arg Val Tyr Pro Thr Trp Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Ala Pro Gly Asp Tyr Asp Ala Ala Pro Leu Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.46C9 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(102)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(168)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (265)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 91
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gtt gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag tac att agc cac tat 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser His Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cgg cag aaa cca ggg aaa gcc cct cag ctc gta atc 144
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Val Ile
35 40 45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt gag gtc cca tca agg ttc agt ggg 192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg cca gag ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240
Ser Gly Ser Gly Pro Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag agt tac act acc cct cga 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
85 90 95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser His Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Val Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Pro Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSA-coupled synthetic peptides (Schafer-N, Denmark) of the HTT
exon 1 N-terminal amino acids 1-19
<400> 93
Met Ala Thr Leu Glu Lys Leu Met Lys Ala Phe Glu Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
Phe Gln Gln
<210> 94
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSA-coupled synthetic peptides (Schafer-N, Denmark) of the HTT
exon 1 P-rich domain
<400> 94
Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro
1 5 10 15
Gln Pro Gln Pro Pro
20
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSA-coupled synthetic peptides (Schafer-N, Denmark) of the HTT
exon 1polyP repeat
<400> 95
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSA-coupled synthetic peptides (Schafer-N, Denmark) of the HTT
exon 1 C-terminal amino acids
<400> 96
Pro Pro Gly Pro Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His Arg Pro
1 5 10
<210> 97
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<223> NI-302.33C11-PIMC VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(336)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 97
cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtt gtc cag cct ggg aac 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc agg ttc agt gac ttt 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Asp Phe
20 25 30
ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag gga ctg gag tgg ctg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
gca ctt ata tgg tat gat gga ggg tat aag tac tat gca gac tcc gtg 192
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aat acg atg ttt 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Phe
65 70 75 80
cta caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtt tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg acc cac cta gaa tat tgc agt aga acc acc tgc tat ctc ggc cac 336
Ala Thr His Leu Glu Tyr Cys Ser Arg Thr Thr Cys Tyr Leu Gly His
100 105 110
tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 369
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 98
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Leu Glu Tyr Cys Ser Arg Thr Thr Cys Tyr Leu Gly His
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.33C11-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(102)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(168)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (265)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 99
gac atc cag ttg acc cag tct ccg tcc ttc cta tct gcg tct gtg gga 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aca gtc acc ttc act tgc cgg gcc agt cag ggc att agc gat tat 96
Asp Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
tta gcc tgg ttt cag cag aaa cca ggg att gcc cct aag ctc ctg atc 144
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tat gct gcg tcc act ttg caa acc ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gaa ttc act ctc aca atc cgc agc ctg cag tct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
gaa gat ttt gga act tat tac tgt cag cag ctt aaa act tac ccg tac 288
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Lys Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 100
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Lys Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 101
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-307.63F3-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(120)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (166)..(186)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (283)..(309)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 101
gat att gtg atg act caa tca cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc aat cag agt ctt ttc tac agt 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
tcc aac aat aac aac tac tta gct tgg tac cag cac aaa tcc gga cag 144
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
cct cct aag ctg ctc gtt tac tgg gga tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cgc ttc agt ggc agc ggg tct ggg act gac ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agt agc ctg cag gct gag gat gtt gca att tat tac tgt cac caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
tat tat cat aat ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc 336
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 102
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 103
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-307.63F3-PIMC-NS VK variable kappa-light chain (VK)sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(120)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (166)..(186)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (283)..(309)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 103
gat att gtg atg act caa tca cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc tca cag agt ctt ttc tac agt 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
tcc aac aat aac aac tac tta gct tgg tac cag cac aaa tcc gga cag 144
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
cct cct aag ctg ctc gtt tac tgg gga tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cgc ttc agt ggc agc ggg tct ggg act gac ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agt agc ctg cag gct gag gat gtt gca att tat tac tgt cac caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
tat tat cat aat ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc 336
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 104
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 105
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-307.63F3-PIMC-SG VK variable kappa-light chain (VK)sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(120)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (166)..(186)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (283)..(309)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 105
gat att gtg atg act caa tca cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc aat cag ggc ctt ttc tac agt 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Gly Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
tcc aac aat aac aac tac tta gct tgg tac cag cac aaa tcc gga cag 144
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
cct cct aag ctg ctc gtt tac tgg gga tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cgc ttc agt ggc agc ggg tct ggg act gac ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agt agc ctg cag gct gag gat gtt gca att tat tac tgt cac caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
tat tat cat aat ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc 336
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 106
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Gly Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 107
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-307.63F3-PIMC-NQ VK variable kappa-light chain (VK)sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(120)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (166)..(186)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (283)..(309)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 107
gat att gtg atg act caa tca cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc caa cag agt ctt ttc tac agt 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Gln Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
tcc aac aat aac aac tac tta gct tgg tac cag cac aaa tcc gga cag 144
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
cct cct aag ctg ctc gtt tac tgg gga tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cgc ttc agt ggc agc ggg tct ggg act gac ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agt agc ctg cag gct gag gat gtt gca att tat tac tgt cac caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
tat tat cat aat ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc 336
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 108
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Gln Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr His Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 109
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.35C1-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(102)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(168)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (265)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 109
gaa att gtg ctg act cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt caa agt gtt gac aac cag 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Gln
20 25 30
ttt gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc att 144
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc agg agg gcc cct ggc atc cca gac agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Arg Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc att agc agc cta gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttc gca att tat tac tgt cag cat cgt tac acc tgg ctc tac 288
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln His Arg Tyr Thr Trp Leu Tyr
85 90 95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 110
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Gln
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Arg Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln His Arg Tyr Thr Trp Leu Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 111
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-302.31F11-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(306)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 111
gat att gtg atg act caa tca cca ctc tcc ctg ccc gtc gcc cct gga 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc cta tac agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg aag cct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Pro
35 40 45
cca cag ctc ctg gtc tat ttg ggt tct gat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Val Tyr Leu Gly Ser Asp Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aaa gat ttt aca ctg aac atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa ggt 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
cta caa agt ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 336
Leu Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Val Tyr Leu Gly Ser Asp Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 113
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<223> NI-302.2A2-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(129)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (175)..(195)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (292)..(315)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 113
gat att gtg atg act caa tca cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt ctt tta tac acc 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
tcc aaa aat aag gac agt aag aac tac tta ggt tgg tac cag cag aaa 144
Ser Lys Asn Lys Asp Ser Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
35 40 45
cca gga cag cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa 192
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
50 55 60
tcc ggg gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc 240
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75 80
act ctc acc atc agc agc ctg cag gct gag gat gtg gca gtt tat tac 288
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt cag cag tat tat act act cct cag ttc ggc gga ggg acc aag gtg 336
Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
gaa atc aaa 345
Glu Ile Lys
115
<210> 114
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Ser Lys Asn Lys Asp Ser Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
35 40 45
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Glu Ile Lys
115
<210> 115
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NI-302.74C11-PIMC VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(186)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(327)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 115
cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg act gag gtg cag aag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Gln Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gta aaa gtc tcc tgc aag gct tct gga tac agt ttc acc ggc tac 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
ttt ttg cac tgg gta cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg tgg atc aac cct aac agt ggt gac aca aac tat gca gag aag ttt 192
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
cgg ggc aga atc atc atg acc agg gac acg tct gtc agc aca gcc cac 240
Arg Gly Arg Ile Ile Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala His
65 70 75 80
atg gag ttg agc agc ctg aga ttt gac gac acg gcc cta tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
acg aga gag gcc cct gac ccg ggc gct gag acg gac gtc tgg ggc caa 336
Thr Arg Glu Ala Pro Asp Pro Gly Ala Glu Thr Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
gga acc acg gtc acc gtc tcc tcg 360
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 116
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Gln Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ile Ile Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Pro Asp Pro Gly Ala Glu Thr Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.74C11-PIMC VL variable light chain (VL) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (67)..(99)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (145)..(165)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (262)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 117
tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag 48
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gca gtg cca aag cag tat att 96
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Val Pro Lys Gln Tyr Ile
20 25 30
tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag gcc cct att ctg gtg ata tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
aaa gac act cag agg cct tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192
Lys Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
aac tca ggg aca aca gtc acg ttg acc ata act ggc gtc cag gca gac 240
Asn Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp
65 70 75 80
gac gag ggt gac tat tac tgt caa tca gca gac agt agt gct act tgg 288
Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Ala Thr Trp
85 90 95
gtg ttc ggc gga ggg acc aaa ttg acc gtc cta 321
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Val Pro Lys Gln Tyr Ile
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp
65 70 75 80
Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Ala Thr Trp
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 119
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.39G12-PIMC VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(195)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (292)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 119
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cac cct tgg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Trp Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc agc gtc tct aat tac 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
gcc ata act tgg gtc cgc cgg gct cca ggg aag ggg ctg caa tat att 144
Ala Ile Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Tyr Ile
35 40 45
tca gta att tat cgt gat ggc agg aca tac tac gga gac tcc gtg agg 192
Ser Val Ile Tyr Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Arg
50 55 60
ggc cgc ttc acc atc tct agg gac gat tcc aag aac act ctc tat ctt 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aga ttt gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg 288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aga gcg cac ggc caa tat tac tat ggt gtg gac gtc tgg ggc caa gga 336
Arg Ala His Gly Gln Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc acg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 120
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Trp Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Tyr Ile
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala His Gly Gln Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<223> NI-302.39G12-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(303)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 121
gac atc gtg atg acc cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc agc cct gga 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc cta cat agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac cgg cag aaa cca ggg cag tct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca cag ctc ctg atc tat ttg agt tct aat cgg ccc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro
50 55 60
gat agg ttc agt gcc agt gga tca ggc aca gag ttc aca ctg caa atc 240
Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa tct 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
ctg caa acg ttc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa 333
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 122
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 123
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.11A4-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (151)..(171)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (268)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 123
gaa att gtg ctg act cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca gga 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac ttc gcc tgg tac caa caa aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat ggt acg tcc cgc agg gcc act gcc atc cca gac agg ttc agt 192
Ile Tyr Gly Thr Ser Arg Arg Ala Thr Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa cag tat ggt agc tcg tgg 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp
85 90 95
acg ttc ggc cca ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 124
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Arg Arg Ala Thr Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 125
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<223> NI-302.22H9-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(117)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (163)..(183)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (280)..(303)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 125
gat att gtg atg act caa tca cca ctc tcc ctg tcc gtc agc cct gga 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc cta cat agt 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac cgg cag aaa cca ggg cag tct 144
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca caa ctc ctg atc tat ttg aat tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Asn Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gat agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gag ttc aca ctg aca atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa tct 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
ctg caa acg ttc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa 333
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 126
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Asn Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 127
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.44D7-PIMC VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 127
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gcc atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca ggt att ggt tat agt gat act agc aca tat tac gca gac tcc gtg 192
Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgc ttc acc gtc tcc aga gac att tcc aag aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aat agc ctg agg gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgc 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aaa ggt acc agg gac tat tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa gga 336
Ala Lys Gly Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc acg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 128
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 129
<211> 381
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> NI-302.78H12-PIMC VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(108)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (151)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(348)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 129
cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgt ctt gtc tct agt tac tcc atc agc aat ggt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Asn Gly
20 25 30
tac tac tgg ggc tgg att cgg cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
att ggg agt atc tat cat aat ggg aac acc tat tac aac ccg tcc ctc 192
Ile Gly Ser Ile Tyr His Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
aag agt cga gtc atc att tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc 240
Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
ctg aag ttg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tac tac tgt 288
Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg atg cca agt gcc acc tat tat tat ggt tcg ggg act caa ttc cat 336
Ala Met Pro Ser Ala Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Gln Phe His
100 105 110
gcg ttt gat gtc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 381
Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 130
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Asn Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Met Pro Ser Ala Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Gln Phe His
100 105 110
Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 131
<211> 384
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(384)
<223> NI-302.15E8 VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(201)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (298)..(351)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 131
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg ata cag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gtc tct gga ttc acc gtc agt agt tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca tac act agt agt agc aga agt aat acc aaa aag tac gca gac tct 192
Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Arg Ser Asn Thr Lys Lys Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tct aga gac aat gcc agg aac tca ctc 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu
65 70 75 80
tat ctg caa atg aac agc ctg aga gac gag gac acg gct gtg tat tac 288
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga gca ggg gac ttc ggg gag tta ctc act ggt gag ggg tat 336
Cys Ala Arg Ala Gly Asp Phe Gly Glu Leu Leu Thr Gly Glu Gly Tyr
100 105 110
tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 384
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 132
<211> 128
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Arg Ser Asn Thr Lys Lys Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Gly Asp Phe Gly Glu Leu Leu Thr Gly Glu Gly Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 133
<211> 318
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<223> NI-302.15E8 VL variable light chain (VL) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (67)..(99)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (262)..(288)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 133
tcc tat gag ctg act cag cca ccc tca gtg tcc gtg tcc cca gga cag 48
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
aca gcc acc atc acc tgc tcg gga gat gaa ttg ggg gat aaa tat gtt 96
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Glu Leu Gly Asp Lys Tyr Val
20 25 30
ggt tgg tat caa cag aag cca ggc cag tcc cct ctg ctg gtc atc tat 144
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
caa gat gcg aag cgg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192
Gln Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
aac tct ggg aac aca gcc act ctg acc atc agc ggg acc cag gct atg 240
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
gat gag gct gac tac tac tgt cag gcg tgg gac agc ggc acg atg gtt 288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gly Thr Met Val
85 90 95
ttc ggc gga ggg acc agg ctg acc gtc cta 318
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 134
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Glu Leu Gly Asp Lys Tyr Val
20 25 30
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gly Thr Met Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 135
<211> 372
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> NI-302.15D3 variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 135
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtt cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc cta aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tac 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
tgg atg cac tgg gtc cgc caa gct cca ggg aag ggt ctg gtg tgg gtc 144
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
tca cgt att agt aat gat ggc agt agc aaa acc tac gcg gac tcc gtg 192
Ser Arg Ile Ser Asn Asp Gly Ser Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aaa aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca ata ctt ggc gga tat tgt agt agt acc agt tgt cgt ccc ttt gac 336
Ala Ile Leu Gly Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Arg Pro Phe Asp
100 105 110
aac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 136
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Asn Asp Gly Ser Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Leu Gly Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Arg Pro Phe Asp
100 105 110
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 137
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223> NI-302.15D3 VL variable light chain (VL) sequence
<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (271)..(300)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 137
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt ggt gtt tat 96
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Val Tyr
20 25 30
aac tat gtc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
atg att ttt gat gtc agt aat cgg ccc tca ggg att tct aat cgc ttc 192
Met Ile Phe Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc tct ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat aca agc agc 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
gac act tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc atc cta 330
Asp Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Ile Leu
100 105 110
<210> 138
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Val Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Phe Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Asp Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Ile Leu
100 105 110
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.33C11 antibody
<400> 139
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.63F3 antibody
<400> 140
Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu
1 5 10
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.31F11 antibody
<400> 141
Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 142
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.2A2 antibody
<400> 142
Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10 15
<210> 143
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI302.15D3 antibody
<400> 143
Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu
1 5 10 15
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI302.15E8 antibody
<400> 144
Lys Ala Phe Glu Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln
1 5 10
<210> 145
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.35C1 antibody
<400> 145
Pro Pro Gly Pro Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His Arg Pro
1 5 10
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.74C11 antibody
<400> 146
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.15F9 antibody
<400> 147
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.39G12 antibody
<400> 148
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.11A4 antibody
<400> 149
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.22H9 antibody
<400> 150
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 151
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.44D7 antibody
<400> 151
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.37C12 antibody
<400> 152
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.55D8 antibody
<400> 153
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.7A8 antibody
<400> 154
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.78H12 antibody
<400> 155
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.71F6 antibody
<400> 156
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 157
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.11H6 antibody
<400> 157
Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.3D8 antibody
<400> 158
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 159
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.18A1antibody
<400> 159
Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 160
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.52C9 antibody
<400> 160
Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 161
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope of NI-302.46C9 antibody
<400> 161
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 162
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alternative epitope of NI-302.63F3 antibody
<400> 162
Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu
1 5 10 15
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alternative epitope of NI-302.33C11 antibody
<400> 163
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 164
<211> 366
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(366)
<223> NI-302.64E5-VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(204)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (301)..(355)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<400> 164
gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc ttg gta aag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctt aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc gac cag gcc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gln Ala
20 25 30
tgg atg agc tgg gtc cgc cag gtt cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtt 144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
ggc cgg att aaa acg aaa act gag ggt gaa gca aca gac tac gca gcg 192
Gly Arg Ile Lys Thr Lys Thr Glu Gly Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
ccc gtg aga ggc aga ttc acc atc tca aga gat gat tca gaa gac acg 240
Pro Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Glu Asp Thr
65 70 75 80
gtg ttt ctg caa atg aac agc ctg aaa acc gag gac aca gcc ctg tat 288
Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
tac tgt acg tca acg gga gtc tta gca gca gct gtc gat gtc tac tgg 336
Tyr Cys Thr Ser Thr Gly Val Leu Ala Ala Ala Val Asp Val Tyr Trp
100 105 110
ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 366
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 165
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 165
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gln Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Thr Lys Thr Glu Gly Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Glu Asp Thr
65 70 75 80
Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ser Thr Gly Val Leu Ala Ala Ala Val Asp Val Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 166
<211> 366
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(366)
<223> NI-302.64E5-PIMC VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(204)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (301)..(355)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 166
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta aag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctt aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc gac cag gcc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gln Ala
20 25 30
tgg atg agc tgg gtc cgc cag gtt cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtt 144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
ggc cgg att aaa acg aaa act gag ggt gaa gca aca gac tac gca gcg 192
Gly Arg Ile Lys Thr Lys Thr Glu Gly Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
ccc gtg aga ggc aga ttc acc atc tca aga gat gat tca gaa gac acg 240
Pro Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Glu Asp Thr
65 70 75 80
gtg ttt ctg caa atg aac agc ctg aaa acc gag gac aca gcc ctg tat 288
Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
tac tgt acg tca acg gga gtc tta gca gca gct gtc gat gtc tac tgg 336
Tyr Cys Thr Ser Thr Gly Val Leu Ala Ala Ala Val Asp Val Tyr Trp
100 105 110
ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 366
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 167
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gln Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Thr Lys Thr Glu Gly Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Glu Asp Thr
65 70 75 80
Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ser Thr Gly Val Leu Ala Ala Ala Val Asp Val Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 168
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-302.64E5 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(120)
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<220>
<221> V_region
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<220>
<221> V_region
<222> (283)..(309)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 168
gac atc cag ttg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atg acc tgc aag tcc agc cag agt ctt ttc tac agt 96
Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
tac aac aat gag aac tac tta gcc tgg tat cag cag aga cca gga cag 144
Tyr Asn Asn Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
cct cct aag ttg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
tat tat agt act cct cag acg ttc ggc caa ggg acc aaa gtg gat atc 336
Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 169
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
Tyr Asn Asn Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 170
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-302.64E5-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(120)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (166)..(186)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (283)..(309)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 170
gat att gtg atg act caa tca cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atg acc tgc aag tcc agc cag agt ctt ttc tac agt 96
Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
tac aac aat gag aac tac tta gcc tgg tat cag cag aga cca gga cag 144
Tyr Asn Asn Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
cct cct aag ttg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
tat tat agt act cct cag acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc 336
Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 171
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
Tyr Asn Asn Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 172
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
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<220>
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<222> (91)..(105)
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<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 172
cag gtg cag ctg gtg caa tct gga tct gag ttg aag aag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac aac ttc aat aac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
gcc atc aat tgg ttg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Ala Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga tgg atc aac acc atc act ggg cac cca acg tat gcc cag ggc ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Ile Thr Gly His Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
aaa gga cga ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg gca tat 240
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atc agc agc cta aag cct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga act tac agt aac tac ggc gaa ttt gac tac tgg ggc cag gga 336
Ala Arg Thr Tyr Ser Asn Tyr Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 173
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Ile Thr Gly His Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Ser Asn Tyr Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 174
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
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<220>
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<220>
<221> V_region
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<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (271)..(303)
<223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3
<400> 174
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cgt gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln
1 5 10 15
tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gat gtt gga agt tat 96
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
aac ctt gtc tcc tgg tac caa cag tac cca ggc aag gcc ccc aag ctc 144
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
ata att cat gag ggc agt gag cgg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc 192
Ile Ile His Glu Gly Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg aca att tct ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc tgc tca tat gca ggt act 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Thr
85 90 95
act act ttc gtg cta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc ctc 333
Thr Thr Phe Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 175
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile His Glu Gly Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Thr
85 90 95
Thr Thr Phe Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 176
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.72F10-VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<400> 176
gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc ttc gta cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc aac ttc ggc agt tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag gga ctg gag tgg gtg 144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca gat atc agt ggt att ggt agt aac aca tac tac gca gac tcc gtg 192
Ser Asp Ile Ser Gly Ile Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgt ttc acc att tcc aga gac aat tcc gac aat acg ttg tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg gac atg agc agc ctg aga gcc gag gac acg gcc aga tat tac tgt 288
Leu Asp Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aag gat cga aag cgc agt ggc tgg tac gaa cag tgg ggc cag ggc 336
Ala Lys Asp Arg Lys Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Gln Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 177
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Gly Ile Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Lys Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Gln Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 178
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-302.72F10-PIMC VH variable heavy chain (VH) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (91)..(105)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(198)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (295)..(324)
<223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3
<400> 178
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttc gta cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc aac ttc ggc agt tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag gga ctg gag tgg gtg 144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca gat atc agt ggt att ggt agt aac aca tac tac gca gac tcc gtg 192
Ser Asp Ile Ser Gly Ile Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgt ttc acc att tcc aga gac aat tcc gac aat acg ttg tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg gac atg agc agc ctg aga gcc gag gac acg gcc aga tat tac tgt 288
Leu Asp Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aag gat cga aag cgc agt ggc tgg tac gaa cag tgg ggc cag ggc 336
Ala Lys Asp Arg Lys Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Gln Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 179
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Gly Ile Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Lys Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Gln Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 180
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.72F10 VK variable light-kappa chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(102)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(168)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (265)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 180
gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg act ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt att agc gcc tac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ala Tyr
20 25 30
tta ggc tgg tat caa caa aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc att agg gcc act ggc att cca gac agg ttt agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat tct gca gtt tat tac tgt cac cag cgt agc aag tgg cct ctt 288
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 181
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 181
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ala Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 182
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-302.72F10-PIMC VK variable kappa-light chain (VK) sequence
<220>
<221> V_region
<222> (70)..(102)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (148)..(168)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (265)..(291)
<223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3
<400> 182
gaa att gtg ctg act cag tct cca gcc acc ctg act ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt att agc gcc tac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ala Tyr
20 25 30
tta ggc tgg tat caa caa aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc att agg gcc act ggc att cca gac agg ttt agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat tct gca gtt tat tac tgt cac cag cgt agc aag tgg cct ctt 288
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly
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20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu
85 90 95
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100 105
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc gct tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca act att agt ggt agt ggt ggt agt aca tac tac gca gac tcc gtg 192
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgg ttc tcc atc tcc aga gac aac tcc aaa aac acc ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gta tat ttc tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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115 120 125
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<222> (265)..(291)
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<400> 198
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
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65 70 75 80
gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa aac tat aac agt ggc cct ccg 288
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Asn Ser Gly Pro Pro
85 90 95
cct ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 321
Pro Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 199
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 199
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Asn Ser Gly Pro Pro
85 90 95
Pro Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 200
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope recognized by NI-302.64E5
<400> 200
Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu
1 5 10
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope recognized by NI-302.7D8
<400> 201
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 202
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope recognized by NI-302.72F10
<400> 202
Pro Pro Pro Gly Pro Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His
1 5 10

Claims (28)

1.一种人源单克隆抗亨廷顿蛋白HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物，其中所述抗体、其HTT结合片段、合成和生物技术衍生物包含轻链可变结构域VL和重链可变结构域VH两者以及恒定结构域，并识别HTT基因的外显子1的富P区中的表位，并且
在其VH区和VL区包括以下的六个互补性决定区CDR：
VH–CDR1:SEQ ID NO:6的第31-35位
VH–CDR2:SEQ ID NO:6的第50-66位
VH–CDR3:SEQ ID NO:6的第99-108位
VL–CDR1:SEQ ID NO:8的第24-40位
VL–CDR2:SEQ ID NO:8的第56-62位
VL–CDR3:SEQ ID NO:8的第95-103位，或
VH–CDR1:SEQ ID NO:14的第31-35位
VH–CDR2:SEQ ID NO:14的第50-65位
VH–CDR3:SEQ ID NO:14的第98-108位
VL–CDR1:SEQ ID NO:16的第24-39位
VL–CDR2:SEQ ID NO:16的第55-61位
VL–CDR3:SEQ ID NO:16的第94-102位，或
VH–CDR1:SEQ ID NO:18的第31-35位
VH–CDR2:SEQ ID NO:18的第50-66位
VH–CDR3:SEQ ID NO:18的第99-107位
VL–CDR1:SEQ ID NO:20的第24-43位
VL–CDR2:SEQ ID NO:20的第59-65位
VL–CDR3:SEQ ID NO:20的第98-105位，或
VH–CDR1:SEQ ID NO:136的第31-35位
VH–CDR2:SEQ ID NO:136的第50-66位
VH–CDR3:SEQ ID NO:136的第99-113位
VL–CDR1:SEQ ID NO:138的第23-36位
VL–CDR2:SEQ ID NO:138的第52-58位
VL–CDR3:SEQ ID NO:138的第91-100位，或
VH–CDR1:SEQ ID NO:165的第31-35位
VH–CDR2:SEQ ID NO:165的第50-68位
VH–CDR3:SEQ ID NO:165的第101-111位
VL–CDR1:SEQ ID NO:169的第24-40位
VL–CDR2:SEQ ID NO:169的第56-62位
VL–CDR3:SEQ ID NO:169的第95-103位。
2.权利要求1的所述抗体、其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物，在其VH区和VL区包括六个互补性决定区CDR：
VH–CDR1:SEQ ID NO:6的第31-35位
VH–CDR2:SEQ ID NO:6的第50-66位
VH–CDR3:SEQ ID NO:6的第99-108位
VL–CDR1:SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:108三者中任一个的第24-40位
VL–CDR2:SEQ ID NO:8的第56-62位
VL–CDR3:SEQ ID NO:8的第95-103位。
3.权利要求1的所述抗体、其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物，在其VH链区和VL链区包括如下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:102；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:104；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:106；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:108；
SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16；
SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:112；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:114；
SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:138；
SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:169；
SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:171；
SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:169；或
SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:171。
4.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其属于IgG类型。
5.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其中所述轻链是κ链。
6.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其能够结合包含HTT外显子1的表位和/或聚集形式的肽。
7.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其特异性结合：
富P区中的表位，其包含SEQ ID No.140所示的氨基酸序列PQPPPQAQPL、SEQ ID No.141所示的氨基酸序列PPPQLPQPPP、SEQ ID No.142所示的氨基酸序列QAQPLLPQPQPPPPP或SEQID No.143所示的氨基酸序列PPPQLPQPPPQAQPL。
8.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，
其还包含对于所述VH区和/或VL区或者一个或多个CDR来说异源的多肽序列。
9.权利要求8的抗体或其HTT结合片段，其中所述多肽序列包括IgG型的人类恒定结构域。
10.权利要求9的抗体或其HTT结合片段，其中所述人类恒定结构域为IgG1类或同种型的。
11.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其中所述抗体或其HTT结合片段对于结合HttExon1Q49来说具有对应于≤20nM的半最大有效浓度EC50值的结合亲和性，并且对于结合HD21来说具有对应于≤40nM的EC50值的结合亲和性。
12.权利要求11的抗体或其HTT结合片段，其中所述抗体或其HTT结合片段对于结合HttExon1Q49来说具有对应于≤10nM的EC50值的结合亲和性，并且对于结合HD21来说具有对应于≤10nM的EC50值的结合亲和性。
13.权利要求12的抗体或其HTT结合片段，其中所述抗体对于结合HttExon1Q49来说具有对应于≤1nM的EC50值的结合亲和性，并且对于结合HD21来说具有对应于≤1nM的EC50值的结合亲和性。
14.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其是嵌合的鼠-人抗体或鼠源化抗体和/或与权利要求1至5任一项的抗体竞争与HTT的特异性结合的抗体或HTT结合分子。
15.一种或多种多核苷酸，其编码权利要求1至14任一项的抗体或其HTT结合片段的所述VH和VL可变区。
16.一种或多种载体，其包含权利要求15的多核苷酸。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求15的多核苷酸或权利要求16的载体。
18.一种制备抗HTT抗体、其生物技术衍生物或免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养权利要求17的细胞，以及
(b)从培养物分离所述抗体或其免疫球蛋白链。
19.一种抗体或其免疫球蛋白链，其由权利要求15的多核苷酸、权利要求16的载体编码或者可以通过权利要求18的方法获得。
20.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其是双特异性抗体。
21.权利要求1的抗体或其HTT结合片段，其：
(i)被可检测地标记，或
(ii)附连到药物。
22.权利要求21的抗体或其HTT结合片段，其中可检测标记物选自酶、放射性同位素、荧光团和重金属。
23.一种组合物，其包含权利要求1至14或19至22任一项的抗体或其HTT结合片段、权利要求15的多核苷酸、权利要求16的载体、权利要求17的细胞。
24.权利要求23的组合物，其中所述组合物是：
(a)药物组合物，并且还包含可药用载体，任选地还包含可用于治疗与HTT淀粉样变性相关的疾病和/或症状的其他药剂；
(b)诊断组合物。
25.权利要求24的组合物，其中所述组合物是疫苗，并且其中所述诊断组合物包含惯常用于免疫诊断或基于核酸的诊断方法的试剂。
26.一种可用于与HTT淀粉样变性相关的疾病的诊断或监测的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种权利要求1至14或19至22任一项的抗体、权利要求15的多核苷酸、权利要求16的载体或权利要求17的细胞，并任选地具有试剂和/或使用说明书。
27.抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物在制备用于治疗与HTT淀粉样变性相关的疾病和/或症状的药剂中的用途或在制备用于人类或动物体内HTT的体内检测或体内成像或将治疗和/或诊断药剂靶向人类或动物体内HTT的药剂中的用途，其中所述抗HTT抗体或其HTT结合片段、合成或生物技术衍生物包含可变轻链VL和可变重链VH以及恒定结构域，以及其中所述抗HTT抗体是权利要求1至14或19至22任一项的抗体。
28.权利要求27的用途，其中体内成像选自正电子发射断层扫描术PET、单光子发射断层扫描术SPECT、近红外NIR、光学成像和磁共振成像MRI。
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