CN111662385B - 全人源抗人gpc3单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种全人源抗人GPC3单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链包括一个或多个选自下组的重链序列：SEQ ID NO:1、11、21、31、41；所述轻链包括一个或多个选自下组的轻链序列：SEQ ID NO:6、16、26、36、46。本发明全人源抗人GPC3单克隆抗体是利用全人源抗体小鼠平台
Figure DDA0002442974150000011
一次性获得的全人源治疗性抗体(IgG)，省略了人源化过程中的技术步骤、避免了抗体药效的减弱，降低了临床使用中的副作用、减少了时间和经济投入。

Description

全人源抗人GPC3单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明属于抗体药物领域，具体涉及全人源抗人GPC3单克隆抗体及其用途。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是一个由580个氨基酸组成(65kD大小)的膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白。主要在胎儿的肝脏和肾脏组织中表达，在健康成年人组织中几乎没有表达。但在成年人的癌细胞中有表达，且在不同的恶性肿瘤中表达差异很大，可能是肿瘤发生的重要原因之一。GPC3在肝癌中高表达，在黑素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、成神经细胞瘤、肝母细胞瘤和Wilm肉瘤细胞等肿瘤中少量表达，而在乳腺癌、间皮瘤、卵巢上皮癌和肺癌中则表现为表达沉默。
GPC3是由蛋白质、脂质和糖三者共价连接的复杂糖复合物，通过糖基磷脂肌醇锚定于细胞膜表面。GPC3基因定位于人染色体Xq26，基因组结构全长大约900kb,具有中央球状结构空间、C’端糖胺聚糖侧链连接位点等结构特点。其HS基与生长因子及其受体、细胞外基质蛋白和粘附分子等相互作用，参与调节细胞增殖、分化、粘附和迁移等。研究发现GPC3参与Wnt与C-myc等信号通路，诱导肿瘤的发生和发展。它主要通过Wnts信号途径发挥作用，通过自分泌和旁分泌的方式来激活经典Wnt信号途径使Wnt基因高表达，而Wnt基因的表达产物能够促进多种肿瘤组织生长。GPC3表达特点是在肝癌组织中过表达，而在正常肝组织不表达或低表达，基于GPC3特有的结构和功能特点，将其作为肝癌的治疗靶点，有可能成为治疗肝癌的一把利剑。
目前已有GPC3多肽疫苗和GPC3抗体治疗已经进入临床I或II期。如果将GPC3单克隆抗体与双(多)特异性抗体，CAR-T，抗体欧联等结合起来，GPC3抗体的应用前景是无量的。因而GPC3蛋白是一个具有巨大潜力的免疫治疗靶点。(Yasuhiro Shimizu，ToshihiroSuzuki1,Toshiaki Yoshikawa,Itaru Endo and Tetsuya Nakatsura；FrontierOncology,10April 2019)。
随着抗体被用来开发成药物，它的一些特征也被严格考量，如免疫原性、亲和力、稳定性、效应功能、半衰期、组织渗透性及其分布等。在抗体药物发展初期，鼠源单克隆抗体为人类疾病的研究起到了重大的推动作用，但这些鼠蛋白的免疫反应削弱了它的效能。随着抗体人源化技术的发展，多种人源化抗体成为可能。然而人源化过程繁复且费用昂贵，从而出现全人mAb取代人源化mAb的趋势。与噬菌体显示技术相比，转基因小鼠是生产全人mAb的主要方法。
人源化抗体(humanized antibody)又称互补决定区移植抗体，是指抗体的可变区部分(即Vh和VI区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。而全人源抗体是指将人体抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。
在全球单抗市场中，全人源单抗是其未来的发展方向，已在欧美上市的32个单抗中，有9个是全人源单抗，随着转基因小鼠和噬菌体展示技术的成功应用，全人源化克隆单抗的比重将逐步增大。
日本中外制药(Chugai Pharmaceutical)和罗氏(Roche)合作研发的抗人GPC3的治疗性抗体hGC33(Codrituzumab)是一个人源化的治疗性抗体(来源于鼠源抗体GC33、CDR嫁接，其中轻链的CDR-L1中-Asn-Gly-氨基酸有脱酰胺作用，Asn与抗原结合有关，因而把Gly改为Arg)，是目前处于前列的肝癌治疗性抗体(临床II期)(专利：US 2015/02594.17A1，CN102702353A)。
然而人源化过程繁复且费用昂贵，技术难度较大。人源化过程也使抗体的药效一定程度减弱，并在临床使用中产生一定的副作用，如产生抗-抗体药物的抗体(ADAs)。
发明内容
有鉴于此，为了避免抗人GPC3的治疗性抗体人源化过程中的技术难度、大量的时间和经济投入及抗体药效的减弱，减少临床使用中的副作用,本发明提供一种全人源抗人GPC3单克隆抗体。
本发明提供的全人源抗人GPC3单克隆抗体，所述抗体包含重链和轻链，其特征在于，所述单克隆抗体的重链包括一个或多个选自下组的重链序列：SEQ ID NO:1、11、21、31、41。
进一步，所述轻链包括一个或多个选自下组的轻链序列：SEQ ID NO:6、16、26、36、46。
进一步，所述重链和轻链均包括可变区，也称互补决定区(CDR)，所述重链可变区包括1、2或3个选自CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的CDR序列，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列为下组其中之一：
a.所述CDR-H1为SEQ ID NO:3、CDR-H2为SEQ ID NO:4、CDR-H3为SEQ ID NO:5；
b.所述CDR-H1为SEQ ID NO:13、CDR-H2为SEQ ID NO:14、CDR-H3为SEQ ID NO:15；
c.所述CDR-H1为SEQ ID NO:23、CDR-H2为SEQ ID NO:24、CDR-H3为SEQ ID NO:25；
d.所述CDR-H1为SEQ ID NO:33、CDR-H2为SEQ ID NO:34、CDR-H3为SEQ ID NO:35；
e.所述CDR-H1为SEQ ID NO:43、所述CDR-H2为SEQ ID NO:44、所述CDR-H3为SEQID NO:45。
进一步，所述轻链可变区包括1、2或3个选自CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的CDR序列，所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3为下组其中之一，
a.所述CDR-L1为SEQ ID NO:8、CDR-L2为SEQ ID NO:9、CDR-L3为SEQ ID NO:10；
b.所述CDR-L1为SEQ ID NO:18、CDR-L2为SEQ ID NO:19、CDR-L3为SEQ ID NO:20；
c.所述CDR-L1为SEQ ID NO:28、CDR-L2为SEQ ID NO:29、CDR-L3即SEQ ID NO:30；
d.所述CDR-L1为SEQ ID NO:38、CDR-L2为SEQ ID NO:39、CDR-L3为SEQ ID NO:40；
e.所述CDR-L1为SEQ ID NO:48、所述CDR-L2为SEQ ID NO:49、CDR-L3为SEQ IDNO:50的CDR序列；
所述轻链可变区为κ型。
进一步，所述单克隆抗体的重链可变区序列与轻链可变区序列分别组合。
进一步，所述单克隆抗体包括仍保持与GPC3特异性结合亲和性的、一个或多个氨基酸残基被替代的单克隆抗体。
进一步，所述替代在一个或多个可变区CDR序列里，和/或在一个或多个骨架区FR序列里，和/或在恒定区Fc序列里。
进一步，所述单克隆包括与上述重链或轻链的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；或者与CDR具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述替代赋予所述单克隆抗体一种或多种需要的性质，所述需要的性质选自：
a.提高与GPC3的结合亲和性，
b.引入或移除糖基化位点，
c.引入游离的半胱氨酸残基，
d.提高或降低抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用ADCC或补体依赖的细胞毒作用CDC，
e.增加血清半衰期，
f.增加IgG以pH依赖的方式结合Fc受体FcRn。
本发明还提供上述单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包含如下步骤：步骤a：制备含有表达所述单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；步骤b：用步骤a的表达载体转染真核宿主细胞；步骤c：培养步骤b转染的真核宿主细胞；步骤d：分离纯化，获得所述单克隆抗体。
本发明还提供包含上述单克隆抗体的双特异性抗体分子或嵌和抗原受体。
本发明还提供一种多核苷酸序列，其编码上述抗体或上述抗体的抗原结合部位。
进一步，上述多核苷酸序列包括选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO::7、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:47。
本发明还提供一种表达载体，所述载体表达含有如上所述的氨基酸分子。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明还提供一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的上述的单克隆抗体。
本发明还提供一种偶联物，所述偶联物由上述的单克隆抗体，和/或上述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
本发明还提供一种药物组合物，包括上述的单克隆抗体，和/或上述的结合物，和/或上述的偶联物。
本发明还提供上述药物组合物在制备治疗由GPC3介导的病理病症的药物中的应用。
本发明还提供一种诊断试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的GPC3单克隆抗体,或如上所述的结合物,或如上所述的偶联物。
本发明的有益效果在于：
1.本发明通过拥有自主知识产权的全人源抗体小鼠平台(
Figure BDA0002442974130000041
专利：CN201510737388.8和专利申请:CN201810261091.2)产生了特异性的抗人GPC3的单克隆抗体或片段，并公开了此单克隆抗体的DNA和氨基酸序列，抗体与抗原结合部位的关键性氨基酸序列。
2.本发明利用
Figure BDA0002442974130000042
抗体研发平台，一次性获得全人源治疗性抗体(IgG)，省略了单克隆抗体人源化过程中的技术步骤、避免了抗体药效的减弱，降低了临床使用中的副作用、减少了时间和经济投入。
附图说明：
图1：4只CAMouse在6免后的血清Elisa效价分析结果：#1,#2,#3,#4是CAMouse小鼠和对照(Negative Control)；其中#1免疫效果最好，用于杂交瘤融合试验；
图2：电融合过程中的Sp20细胞和脾胀B-细胞的排列照片；
图3：融合试验后经过半固体培养基筛选后的杂交瘤单个克隆；
图4：杂交瘤克隆的上清液与肝癌细胞(HepG2)的特异结合(FACS分析)，有些杂交瘤细胞产生特异抗体，与GPC3的阳性细胞结合；
图5：杂交瘤细胞的RT-PCR分析；
图6：用人IgG定量试剂盒(Eliabscience，E-EL-H0169c)测定抗体载体，瞬时在HEK293细胞中的表达量，显示上清液中的抗体含量；
图7：单克隆抗体与肝癌细胞(HepG2)结合的FAC分析(EC50和IC50值测定)；
图8：单克隆抗体与不同种属(人、鼠和食蟹猕猴)GPC3蛋白结合测定；
图9：FACS分析重组抗体(7-8B)与肝癌细胞系(HepG2,Huh-7,MHCC97H))，以及人卵巢癌细胞系(TOV-21G)的结合,SK-Hep-1为GPC3阴性细胞；
图10：抗人GPC3抗体(7-8B)与癌细胞组织切片染色观察分类；
图11：用重组抗体(7-8B和17-4D)分别对两个献血者的淋巴细胞与HepG2肝癌细胞进行ADCC和CDC研究。
具体实施方式
本发明公开了全人源抗人GPC3单克隆抗体及其用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明以内。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本领域技术人员将知晓的是，本发明上述抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。本领域技术人员还知晓，根据上述抗体的氨基酸序列可以设计出编码其它的核苷酸序列，并且针对不同的表达宿主对该核苷酸序列进行优化。为了治疗、检测、实验或其他目的，本发明的抗体可以与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接，还可以与固体介质、半固体介质偶联，还可以使用本发明的抗体的功能性片段，这在本领域中是已知的。为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术路线做进一步说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
一.抗体的获得：通过杂交瘤融合技术获得特异性抗人GPC3的单克隆抗体
1.1免疫的动物：利用重庆金迈博生物科技有限公司的全人抗体开发平台(
Figure BDA0002442974130000061
该动物是含有人的重链(IgH)和轻链(IgK与IgL)的转基因小鼠，该小鼠生产小鼠的IgM和人的IgG。专利：CN201510737388.8和专利申请:CN201810261091.2)。
1.2动物免疫：根据文献资料选择人GPC3蛋白质的关键多肽序列(GDGMIKVKNQLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVH.Yen Phung,Wei Gao,Yan-Gao Man,SatoshiNagata&Mitchell H.2012.mAbs 4:5,592-599,DOI:10.4161/mabs.20933)，合成多肽【生工生物工程(上海)股份有限公司】。常规方法对CAMouse进行免疫，一般免疫5-6次。
1.3免疫效价的Elisa分析：用1ug/ml GPC3-His蛋白质PBS溶液包被酶标板，4度过夜。而后PBST洗板3次后，加入100ul/孔的2％BSA的PBST溶液置于37度封闭2小时。再次洗板，加入60ul/孔的血清稀释液，37度孵育60分钟，而后洗板3次。以50ul/孔加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG-Fab的二抗(金斯瑞，12H3C4A6)，室温孵育60分钟，而后洗板2次,拍干。添加100ul/孔的TMB显色20分钟，而后用1M的硫酸溶液终止,测定OD450各孔的吸光值。结果：3365小鼠的免疫效价最高，在稀释1：51200倍时，3365小鼠血清的ElisaOD450为0.63(参见图1：4只CAMouse在6免后的血清Elisa效价分析结果)。
1.4 CAMouse小鼠免疫效价的FACS检测：用HepG2细胞(GPC3阳性)，先与免疫小鼠的血清(1:100)在4度培育60分钟，细胞洗2次，再用抗人IgG-FITC的二抗培育30分钟，细胞洗2次，用贝克曼流式细胞仪器进行分析。
1.5电融合：综合Elisa和FACS分析的结果，选择免疫效价高的小鼠(3365)，在最后一次加强免疫后，采集脾胀的淋巴细胞，与SP20(SP2/0-Ag14,ATCC#CRL-1581)细胞融合(细胞比例1：2)。图2是电融合过程中的细胞排列照片。
1.6筛选：融合后的细胞，按比例与半固体培养基(ClonaCellTM-HY培养基D)混匀，接种在6孔培育板上培养10-14天，然后挑选细胞克隆，再培养在96孔培养板(HT培养基)上。图3是融合后经过筛选的杂交瘤克隆。
1.7 Elisa分析：用1ug/ml GPC3-His蛋白质PBS溶液包被酶标板，4度过夜。而后PBST洗板3次后，加入100μl/孔的2％BSA的PBST溶液置于37度封闭2小时。再次洗板，加入60μl/孔的杂交瘤上清,37度孵育60分钟，而后洗板3次。以50μl/孔加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG-Fab二抗，室温孵育60分钟，而后洗板2次,拍干。添加100ul/孔的TMB显色20分钟，而后用1M的硫酸溶液终止,测定OD450各孔的吸光值。表1是部分杂交瘤克隆上清液的Elisa检测结果(本实验总共获得几千个杂交瘤克隆，经过体外抗体Elisa和FACS，保留了5个抗体(编号是：2-7F，4-11G，7-5B，7-8B和17-4D，展开进一步分析)。见表1。
Figure BDA0002442974130000071
1.8杂交瘤上清液FACS分析：用HepG2细胞(GPC3阳性)，先与杂交瘤上清液在4度培育60分钟，细胞洗2次，再用羊抗鼠IgG-Fc-FITC(F2772，Sigma)的荧光二抗培育30分钟，细胞洗2次，用BD FACSVerse流式细胞仪器进行分析。图4显示杂交瘤克隆的上清液与HepG2细胞的特异结合，有些杂交瘤细胞产生特异抗体，与GPC3的阳性细胞结合。
二.杂交瘤克隆和序列分析：
2.1杂交瘤的PCR分析：将Elisa和FACS阳性的杂交瘤细胞，制备mRNA,cDNA和PCR(RT-PCR)，PCR产物克隆，DNA测序。图5是PCR图片。
2.2 DNA和抗体蛋白质序列分析：在获得DNA序列后，分析抗体的序列，见表2-11。
表2
Figure BDA0002442974130000072
Figure BDA0002442974130000081
表3
Figure BDA0002442974130000082
Figure BDA0002442974130000091
表4
Figure BDA0002442974130000092
Figure BDA0002442974130000101
表5
Figure BDA0002442974130000102
表6
Figure BDA0002442974130000111
表7
Figure BDA0002442974130000112
Figure BDA0002442974130000121
表8
Figure BDA0002442974130000122
Figure BDA0002442974130000131
表9
Figure BDA0002442974130000132
Figure BDA0002442974130000141
表10
Figure BDA0002442974130000142
表11
Figure BDA0002442974130000151
三.抗体特征分析：
3.1重组抗体的表达：合成抗体DNA序列，分别连接到pFUSE-CHIg-HG1和pFUSE2-CLIg-hk(Invivogen,USA)载体中，用PEI转染试剂将质粒DNA量(重链轻链1：1)转入HEK293F悬浮细胞(NANOGen，China)。转染后第七天收集上清，用人IgG定量试剂盒(Eliabscience，E-EL-H0169c)测定抗体检测上清液中的抗体含量。其中7-8B的表达量最高，约是其他几个单抗的10倍。(参见图6)
3.2重组抗体的纯化：使用Protein A蛋白纯化柱(GE healthcare)分离提纯单克隆抗体。用Nano Drop和SDS-PAGE检测蛋白质浓度及纯度。
3.3 ForteBio测定抗体亲和力：待测抗体(浓度5ug/ml)固定到Anti-HIgG Fc的生物感应器上(Pall ForteBio)，在不同GPC3浓度下(62.5to 1000nM)检测抗体与抗原之间解离平衡常数(KD)、结合速率常数(Kon)及解离速率常数(Koff)等。在相同条件下，与对标抗体(hGC33)进行比较：除2-7F外(它的KD值比Codrituzumab低10倍)，其余的4个抗体的KD值以及Kon和Koff都与Codrituzumab相近。见表12。
表12
抗体编号 K<sub>D</sub>(M) K<sub>on</sub>(1/ms) Koff(1/s)
17-4D 1.52E-09 1.34E+05 2.56E-04
7-5B 1.57E-09 1.27E+05 1.68E-04
7-8B 1.70E-09 1.54E+05 1.85E-04
2-7F 2.17E-08 1E+4 1.50E-04
4-11G 1.87E-09 1.25E+5 2.65E-04
hGC33(Codrituzumab) 1.74E-09 1.41E+05 2.40E-04
3.4单克隆抗体与肝癌细胞(HepG2)结合EC50和IC50值测定：用HepG2细胞，以5×105细胞/孔的密度铺板于96孔板中。测试抗体在染色缓冲液(1×PBS/2％FBS)中连续稀释(抗体浓度：以50ug/ml(345nM)为起始浓度，5倍稀释)，并在4℃下与细胞培养60分钟。洗2次，加入二抗(life technology的Goat Anti-Human IgG(H+L)AlexaFluor 633)，并在4℃下在避光培养30分钟。将所述细胞洗涤一次，并在100uL染色缓冲液中重悬。通过流式细胞术(BD FACSVerse)测量荧光强度。用Graphpad Prism5.0处理数据计算EC50值(参见图7)。在检测抗体IC50时，加入抗体(EC50的抗体浓度)和抗原的混合液(抗原浓度：以50ug/ml(345nM)为起始浓度，5倍稀释)。人源抗体(Recombinant Anti-Fluorescein antibody,ab206508,abcam)为阴性(Isotype)抗体。结果：除2-7F外(它的EC50和IC50值比Codrituzumab都低)，其余的4个抗体的EC50值和IC50值都与Codrituzumab相近。其中17-4D、7-5B和7-8B的EC50值和IC50值都比对标抗体Codrituzumab高。(参见图7、表13)
表13
Figure BDA0002442974130000171
3.5单克隆抗体与不同种属GPC3蛋白结合测定:用人、鼠、食蟹猕猴来源的GPC3重组蛋白，分别用浓度为1ug/ml包被96孔板，测试抗体在染色缓冲液(1×PBS/2％FBS)中连续稀释，并在4℃下与细胞培养60分钟。洗2次，加入100ul 1:5000稀释的Anti-human IgG-HRP抗体(Millipore，AP113P)，并在4℃下在避光培养60分钟。将所述细胞洗涤一次，加入100ulTMB溶液，显色5min后，加入100ul 2.5M H2SO4终止；酶标仪450nm波长读数。结果如图：除2-7F抗体只与人和食蟹猕猴来源的GPC3重组蛋白结合外，7-8B、4-11G和7-5B和17-4D都与来源于人、小鼠和食蟹猴的GPC3蛋白质结合。(参见图8)
3.6抗人GPC3抗体(7-8B)与GPC3阳性细胞系的结合：FACS分析重组抗体(7-8B)与肝癌细胞系(HepG2,Huh-7,MHCC97H))和人卵巢癌细胞系(TOV-21G)的结合分析(如下图)。SK-Hep-1是GPC3-细胞(对照)。结果7-8B重组抗体与肝癌细胞系(HepG2,Huh-7,MHCC97H))和人卵巢癌细胞系(TOV-21G)都能特异地结合，不能与GPC3阴性细胞SK-Hep-1结合。(参见图9)
3.7抗人GPC3抗体(7-8B)与癌细胞组织切片染色：用重组抗体(7-8B)与癌细胞组织切片染色，观察GPC3阳性的癌细胞，并用胎盘组织，肺组织和、小肠组织和肝(炎)组织为对照。我们将各组织细胞表面的GPC3染色情况分为四类，阴性、弱阳性、阳性和强阳性(参见图10)，同一类组织，来源于不同个体(病人)，其癌中癌细胞的GPC3表达量不一样，我们观察的四个胆囊癌组织中都没有GPC3的阳性细胞(参见表14)。因此在临床研究和临床使用时，需要根据个体的GPC3表达量，采用不同的治疗方案。
表14
Figure BDA0002442974130000181
3.8重组抗体(7-8B和17-4D)的细胞毒性试验(ADCC和CDC)
我们用重组抗体(7-8B和17-4D)分别对两个献血者的淋巴细胞与HepG2肝癌细胞进行ADCC和CDC研究。结果：重组抗体具有与Codrituzumab一致的较强的ADCC和CDC功效，并且这种功效存在个体差异(参见图11)。我们可以通过改造Fc片段或构建多功能性抗体，来提高治疗效果。
综上所述，本发明通过全人源抗体小鼠平台
Figure BDA0002442974130000191
获得了特异性的抗人GPC3的单克隆抗体，并对此单克隆抗体的DNA和氨基酸进行了测序。该抗体对GPC3结合有很强的特异性，并有与Codrituzumab基本一致的较强的抗体亲和力，ADCC和CDC，可用于抗体相关药物的制备。
序列表
<110> 重庆金迈博生物科技有限公司
重庆市畜牧科学院
<120> 全人源抗人GPC3 单克隆抗体及其用途
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 342
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 2
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
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gcggactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactggat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acagctgtgt attactgtct aactgggggt 300
tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ser
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 4
Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Ile
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 5
Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
1 5
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Asn
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Thr His Trp Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens )
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gacatcgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
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tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggcgtt tattactgca tgcaacatac acactggcca 300
acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaa 333
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
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<213> 人(Homo sapiens)
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Lys Val Ser
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Asn Asn Ser Ser Ser Tyr Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ser
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 14
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
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Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> DNA
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<213> 人(Homo sapiens )
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Lys Val Ser
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<213> 人(Homo sapiens )
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Met Ser Asn Ser Ser Ser Tyr Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Asp Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
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Ser Ser
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<213> 人(Homo sapiens )
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Met Ser Asn Ser Ser Ser Tyr Ile
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 25
Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
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Thr His Trp Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人(Homo sapiens )
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gacatccaga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
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<213> 人(Homo sapiens )
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Gln Ser Leu Val Tyr Arg Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
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<211> 3
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<213> 人(Homo sapiens )
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Lys Val Ser
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<213> 人(Homo sapiens )
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Met Gln His Thr His Trp Pro Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Phe
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Met
50 55 60
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Thr Arg Glu Ala Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
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<213> 人(Homo sapiens )
<400> 32
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<213> 人(Homo sapiens )
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
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<212> DNA
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<213> 人(Homo sapiens )
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Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 39
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<210> 40
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 42
<211> 342
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
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<400> 43
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<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 44
Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 45
Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 46
<211> 111
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Asn
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Thr His Trp Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 47
<211> 333
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 47
gaaattgtgt tgacgcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacaataatg gaaacaccta cttgcattgg 120
tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggcgtt tattactgca tgcaacatac acactggtca 300
acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaa 333
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 48
Gln Ser Leu Val Tyr Asn Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 3
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 49
Lys Val Ser
1
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 50
Met Gln His Thr His Trp Ser Thr
1 5

Claims (11)

1.全人源抗人GPC3单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链和轻链，其特征在于，所述重链和轻链均包括可变区CDR，所述重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示、所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示、所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQID NO:10所示；
所述轻链可变区为κ型。
2.包含权利要求1所述单克隆抗体的双特异性抗体分子。
3.多核苷酸，其编码权利要求1所述的单克隆抗体。
4.一种表达载体，其特征在于，所述载体表达含有如权利要求1所述的单克隆抗体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的表达载体。
6.一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1所述的单克隆抗体。
7.一种偶联物，所述偶联物由权利要求1所述的单克隆抗体，和/或权利要求6所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
8.一种药物组合物，包括权利要求1所述的单克隆抗体，和/或权利要求6所述的结合物，和/或权利要求7所述的偶联物。
9.权利要求8所述的药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用。
10.一种诊断试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的单克隆抗体,或如权利要求6所述的结合物,或如权利要求7所述的偶联物。
11.根据权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤：步骤a：制备含有表达所述单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；步骤b：用步骤a的表达载体转染真核宿主细胞；步骤c：培养步骤b转染的真核宿主细胞；步骤d：分离纯化，获得所述单克隆抗体。
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