CN109021108B - 抗gpc3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用 - Google Patents

抗gpc3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用。该抗体至少具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3之一。该抗体可用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物；该核酸用于制备抗GPC3全人源化抗体、药物或药物组合物；该细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物；该药物或药物组合物具有针对GPC3阳性肿瘤的抗肿瘤作用。本发明通过噬菌体展示技术筛选出抗GPC3的全人源化抗体，该抗体特异性强，亲和力高；采用该抗体的细胞如嵌合抗原受体T细胞对GPC3阳性的肿瘤具有有效地杀伤作用。

Description

抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用
技术领域
本发明涉及一种抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用，属于生物技术领域。
背景技术
据发明人所知，肝细胞癌发病广，致死率高，缺乏有效的治疗手段。病人晚期存活率仅有3％[1]。多数病人确诊时已经处于癌变晚期，对化疗药物不敏感，手术切除后复发率高[2,3]。glypican-3(GPC3)是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通过GPI锚定在细胞膜表面。GPC3在胚胎发育早期表达，通过调控发育过程中的关键信号通路(如Wnt信号)参与调控细胞增殖。在个体发育成熟后，GPC3表达关闭。大量的研究发现，GPC3在肝细胞癌中特异性高表达，是目前较受关注的肝细胞癌诊断标志物和治疗靶点[4,5]。
由于肝脏的器官功能特殊性，小分子化学药物极易被肝脏代谢清除。相比较而言，生物大分子药物如治疗型抗体在肝癌的治疗中具有高活性、特异性好等优势。由于GPC3是细胞膜表面蛋白，靶向GPC3的抗体除应用于裸抗治疗外，抗体衍生物以及衍生的嵌合抗原受体T细胞均可作为治疗肝细胞癌的可行性手段，具有直接的临床转化潜力。
经检索发现，专利号CN201280029201.3，授权公告号CN103596985B的中国发明专利，公开了一种对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途。以该技术方案为代表的现有技术中已经存在了一些抗GPC3抗体。发明人课题组经系统地试验研究后得出了不同于现有技术的抗GPC3全人源化抗体。
发明内容
本发明的主要目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种抗GPC3全人源化抗体、以及具有该抗体的嵌合抗原受体细胞，有抗肿瘤应用前景。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种抗GPC3全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；
ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；
iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；
iv、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；
v、所述轻链包括轻链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；
vi、所述轻链包括轻链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。
优选地，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；所述重链还包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；
ii、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；所述轻链包括轻链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；所述轻链包括轻链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。
优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述抗体为VH单域结构抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链可变区片段(scFv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsFv)、IgG分子、或双特异性抗体。
优选地，所述抗体具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。
本发明还提供：
编码前文所述抗GPC3全人源化抗体的核酸。
优选地，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供：
具有前文所述抗GPC3全人源化抗体的细胞或偶联物。
优选地，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞、以及经人工编辑的细胞；所述偶联物包括抗GPC3全人源化抗体-细菌毒素偶联物、抗GPC3全人源化抗体-细菌毒素变体偶联物、抗GPC3全人源化抗体-细胞因子偶联物、以及抗GPC3全人源化抗体-化疗药物偶联物。
本发明还提供：
前文所述抗GPC3全人源化抗体用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。
前文所述核酸用于制备抗GPC3全人源化抗体、药物或药物组合物的用途。
前文所述细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物的用途。
其中，所述药物或药物组合物具有针对GPC3阳性肿瘤的抗肿瘤作用。
本发明通过噬菌体展示技术筛选出抗GPC3的全人源化抗体，该抗体特异性强，亲和力高；具有该抗体的细胞如嵌合抗原受体T细胞对GPC3阳性的肿瘤具有有效地杀伤作用。
附图说明
图1为实施例1中ELISA检测富集噬菌体对抗原蛋白结合的示意图。
图2为实施例1中ELISA检测噬菌体单克隆对抗原结合的示意图。
图3为实施例2中SDS-PAGE检测结果图。
图4为实施例3中抗体32A9对GPC3蛋白的特异性结合ELISA检测结果图。
图5为实施例3中抗体32A9对GPC3阳性细胞的特异性结合FACS检测结果图。
图6为实施例4中亲和力分析结果图。
图7为实施例5中构建的两个CAR分子的结构图。
图8为实施例5中慢病毒感染获得两个CAR-T细胞的流式细胞术检测结果图。
图9为实施例6中32A9CAR-T细胞的激活情况结果图。
图10为实施例6中32A9CAR-T细胞特异性杀伤A431-GPC3细胞的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
实施例1、筛选抗GPC3全人源化抗体
采用噬菌体展示技术，以人源GPC3(Q25-S550)蛋白为GPC3抗原进行筛选。
其中，该GPC3抗原的制备过程如下：构建pFUSE-hGPC3(Q25-S550)-Fc真核细胞表达载体；该表达载体利用IL-2的信号肽序列置换了GPC3的信号肽序列，引导GPC3-Fc融合蛋白分泌到培养基中；利用LipofectamineTM2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将上述表达载体转染HEK293T细胞，收集上清，并通过ProteinA Argrose(GE Healthcare，Piscataway，NJ)亲和柱分离纯化GPC3-Fc融合蛋白，所得即GPC3抗原。
噬菌体展示的具体过程为：以10μg/ml的上文所得GPC3抗原于4℃包被免疫板过夜；用含有5％脱脂奶粉，0.1％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；Tomlinson I&J噬菌体文库(Genservice Ltd.,Cambridge,UK，文库大小为1.47x108)以1012pfu与5％脱脂奶粉PBS溶液1:1混合后室温孵育2小时，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板20次；100μl pH2.0洗脱缓冲液室温洗脱30分钟；向洗脱的噬菌体中加入30μl pH8.0溶液进行中和；将中和后噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增和回收后用于下一轮淘选。淘选后ELISA分析阳性噬菌体富集情况。
ELISA检测：以5μg/ml上文所得GPC3抗原、阴性对照蛋白Frizzled-Fc、以及BSA分别于4℃包被免疫板过夜；用含有5％脱脂奶粉，0.1％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；将每一轮富集的噬菌体扩增并回收，以1:1比例与10％脱脂奶粉PBS室温孵育2小时，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将HRP/Anti-M13Monoclonal conjugate以1：4000比例与含3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将TMB显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸中止显色(100μl/孔)；用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析每轮扩增后噬菌体的亲和力。
ELISA检测结果如图1所示，以Frizzled-Fc和BSA为抗原阴性对照，在三轮富集后，噬菌体群对GPC3抗原的亲和力显著升高。
对第三轮富集的噬菌体单克隆进行抗原结合分析，具体过程为：
用第三轮富集的噬菌体库感染TG1细胞，并从中随机挑取200个单克隆，扩增并回收噬菌体。以5μg/ml上文所得GPC3抗原、阴性对照Frizzled-Fc蛋白分别于4℃包被免疫板过夜；用含有3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；将200个扩增后的单克隆噬菌体，以1:1比例与6％脱脂奶粉PBS室温孵育1小时，分别加入包被有GPC3抗原和阴性对照Frizzled-Fc蛋白并封闭好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将HRP/Anti-M13Monoclonal conjugate以1：4000比例与含3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将TMB显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸中止显色(100μl/孔)；用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析单克隆噬菌体对GPC3抗原的结合能力。检测结果如图2所示，发现9个抗原结合阳性克隆。
分析上述9个抗原结合阳性的噬菌体单克隆序列，发生富集的克隆为抗体32A9，其scFv形式的DNA序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
SEQ ID NO：1：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTGCTTATAATGGTGCTTCTACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTGCTGGTTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCTCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGATTATGCTTATCCTTATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA。
SEQ ID NO：2：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIAYNGASTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAGSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYAYPYTFGQGTKVEIK。
在氨基酸序列中，1-116为抗体重链序列，132-239为抗体轻链序列，117-131为连接肽序列。其中包含的CDR区域如下：氨基酸残基26-33(即GFTFSSYA)为重链CDR1，氨基酸残基50-59(即GIAYNGASTA)为重链CDR2，氨基酸残基98-102(即KSAGS)为重链CDR3；氨基酸残基161-165(即ISSYL)为轻链CDR1，氨基酸残基182-185(即SASS)为轻链CDR2，氨基酸残基223-228(即DYAYPY)为轻链CDR3。
此外，该抗体形式可选自VH单域结构抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链可变区片段(scFv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsFv)、IgG分子、或双特异性抗体。该抗体可选择具有标记，标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。
实施例2、抗体32A9的表达与纯化
将抗体32A9的重链序列和轻链序列分别克隆到表达载体pFUSE-CHIg-hg1和pFUSE-CLIg-hk(Invivigen,San Diego,CA)中,制备质粒。用添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM培养基在细胞培养皿中种5百万个HEK293T细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养。当细胞密度到达60-80％时，将5μg pFUSE-32A9VH质粒和5μg pFUSE-32A9VL质粒加入1ml opti-MEM培养基中，静置5分钟；将30μg PEI加入混有质粒的opti-MEM培养基中，静置20分钟，静置期间为HEK293T细胞更换新鲜的添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM培养基；静置20分钟后将混好的opti-MEM培养基加入HEK293T细胞培养皿中；每24小时回收上清液，并为HEK293T细胞更换新鲜的添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM培养基继续表达蛋白。将回收的上清液于3500rpm、4℃条件下离心20分钟，并用0.45μm的微孔滤膜抽滤，进一步去除碎片；将上清液通过Protein A Argrose(GE Healthcare，Piscataway，NJ)亲和柱分离纯化32A9IgG重组蛋白。通过BCA法测得32A9IgG重组蛋白浓度，并将5μg 32A9IgG蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到32A9IgG重组蛋白在变性和非变性的环境下的条带，如图3所示。
实施例3、抗体32A9的特异性分析
(1)抗原蛋白结合特异性
以5μg/ml的GPC3-his蛋白、对照GPC5-his蛋白分别于4℃包被免疫板过夜(GPC3-his蛋白、GPC5-his融合蛋白分别购于R&D)；用含有3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；将32A9IgG重组蛋白用含有3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液稀释至5μg/ml，加入封闭好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板3次(340μl/孔)；将goat anti-human FcγHRP(IacksonImmunoResearch)以1：2000比例与3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板3次；将TMB显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸中止显色(100μl/孔)；使用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析32A9IgG重组蛋白对GPC3蛋白的特异性。
如图4所示，结果表明抗体32A9特异性识别GPC3，但是不识别GPC3的同源蛋白GPC5。
(2)细胞结合特异性
采用的A431细胞(人上皮癌细胞系)购于美国ATCC(ATCC,Manassas,VA)。在添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM培养基中，置于5％CO2，37℃培养箱中培养；利用LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将GPC3cDNA转染A431细胞，Zeocin筛选获得GPC3过表达细胞系A431-GPC3细胞。
收集A431和A431-GPC3细胞，2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS buffer重悬，再次离心，弃掉PBS溶液，用含5μg/ml实施例2纯化的32A9IgG重组蛋白，含5％BSA的PBS溶液重悬细胞，并放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBSbuffer重悬，并再次离心，弃掉PBS溶液，将Gt F(ab)′2anti-human IgG(γ)R-PEconjugate(Invitrogen)以1：200比例与含5％BSA的PBS溶液混合并重悬细胞，并放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS buffer重悬，并再次离心，弃掉PBS溶液，用0.3ml PBS溶液重悬细胞，并用流式细胞仪检测PE荧光标记信号,分析32A9IgG重组蛋白对GPC3阳性细胞的特异性。
如图5所示，结果表明抗体32A9特异性识别A431-GPC3细胞，而不识别A431细胞。
实施例4、抗体32A9的亲和力分析
采用ELISA实验和流式细胞术实验，分别测定抗体32A9与GPC3-his蛋白以及GPC3阳性细胞的亲和力。
(1)抗原蛋白结合亲和力
使用5μg/ml的GPC3-his蛋白于4℃包被免疫板过夜；用含有3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；将实施例2所得32A9IgG蛋白用含有3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液以20μg/ml起始，1:2梯度稀释，加入封闭好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板3次(340μl/孔)；将goatanti-human FcγHRP以1：2000比例与3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板3次；将TMB显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸中止显色(100μl/孔)；使用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并拟合亲和力曲线分析32A9IgG重组蛋白亲和力。
(2)细胞结合亲和力
收集A431和A431-GPC3细胞，2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS buffer重悬，再次离心，弃掉PBS溶液，用5％BSA的PBS溶液稀释实施例2所得32A9IgG，以60μg/ml为起始，1:2梯度稀释，与细胞混匀后放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS buffer重悬，并再次离心，弃掉PBS溶液，将Gt F(ab)′2anti-human IgG(γ)R-PEconjugate(life)以1：200比例与含5％BSA的PBS溶液混合并重悬细胞，并放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS buffer重悬，并再次离心，弃掉PBS溶液，用0.3ml PBS溶液重悬细胞，并用流式细胞仪检测PE荧光标记信号,拟合32A9IgG重组蛋白亲和力曲线并计算亲和力。
结果如图6所示，抗体32A9与GPC3-his蛋白的亲和力为1.93nM，抗体32A9与A431-GPC3细胞的亲和力为6.25nM。
实施例5、基于抗体32A9构建嵌合抗原受体T细胞
基于抗体32A9的序列，构建第二代4-1BB型CAR分子，同时构建FDA批准的靶向CD19的CAR分子FMC63[6]作为对照，两者的结构如图7所示。
分离人PBMC细胞，用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28和IL-2定向诱导T细胞活化，利用慢病毒系统构建32A9CAR-T细胞，具体过程为：
合成32A9二代4-1BB CAR分子，并克隆入慢病毒表达载体pLVX-EF1A-puro中，制备质粒，转染HEK293T细胞，收集病毒上清，超速离心2小时(20000rpm，4℃)；分装病毒颗粒并测定病毒滴度。用添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、50U/ml IL-2的RPMI培养基复苏PBMC细胞到24孔板中。将Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)以2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用1ml PBS buffer重悬，并再次离心，弃掉PBS溶液，用50μl添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的RPMI培养基重悬Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，并加入PBMC细胞悬液中混匀；DynabeadsHuman T-Activator CD3/CD28激活PBMC细胞24小时后，将32A9CAR lentil virus以MOI＝15的浓度混合10μg/ml polybrene加入细胞悬液中，1000g，20℃离心1小时，并放入37℃细胞培养箱培养过夜。将细胞悬液1000rpm，室温离心5分钟，弃上清并更换为添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、100U/ml IL-2的RPMI培养基。更换培养基后每天检查细胞状态，当细胞密度达到2million/ml或者培养基变黄时为细胞更换新鲜的添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、100U/ml IL-2的RPMI培养基；感染病毒后第九天通过流式细胞术检测GFP荧光信号，检测结果如图8所示。
同时，以基本相同的过程构建FMC63CAR-T细胞，流式细胞术检测结果如图8所示。
实施例6、评估32A9CAR-T细胞的抗肿瘤效果
(1)激活检测
将扩增后的32A9CAR-T细胞(效应细胞)分别与2500个A431细胞和A431-GPC3细胞(靶细胞)，按效靶比分别为1.25:1,2.5:1,5:1混合，在添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的RPMI培养基的96孔细胞培养板中共孵育18小时后，得到上清；通过HumanIL-1ELISA Kit(联科生物)检测上清中IL-2的含量，分析32A9CAR-T细胞激活效率。
如图9所示，实验结果表明32A9CAR-T细胞与A431-GPC3细胞孵育后IL-2的分泌量显著上升，这证明32A9CAR-T细胞能够有效地被GPC3阳性靶细胞激活。
(2)杀伤实验
将扩增后的32A9CAR-T细胞(效应细胞)分别与2500个A431细胞和A431-GPC3细胞(靶细胞)，按效靶比分别为1.25:1,2.5:1,5:1混合，在添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的RPMI培养基的96孔细胞培养板中共孵育18小时后，得到上清；通过CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(promega)试剂盒检测上清液中由裂解细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)的含量，分析32A9CAR-T细胞杀伤效率。
如图10所示，32A9CAR-T细胞能够显著地杀伤A431-GPC3细胞，而FMC63CAR-T细胞对A431-GPC3细胞无显著杀伤，这证明32A9CAR-T细胞能够有效地杀伤GPC3阳性的肿瘤细胞。
除嵌合抗原受体T细胞外，抗体32A9还可用于制备嵌合抗原受体NK细胞或经人工编辑的细胞，或制备偶联物。偶联物可选自细菌毒素偶联物、细菌毒素变体偶联物、细胞因子偶联物、化疗药物偶联物。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
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序列表
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<120> 抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attgcttata atggtgcttc tacagcttac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatctgct 300
ggttcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagcgg tggaggcggt 360
tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg tcgacggaca tccagatgac ccagtctcca 420
tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480
attagcagct atttaaattg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540
tattctgcat cctctttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600
acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactattgt 660
caacaggatt atgcttatcc ttatacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaa 717
<210> 2
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ala Tyr Asn Gly Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr
210 215 220
Ala Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235

Claims (12)

1.一种抗GPC3全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体具有以下技术特征：
i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；所述重链还包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；
ii、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；所述轻链包括轻链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；所述轻链包括轻链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。
2.根据权利要求1所述的抗GPC3全人源化抗体，其特征是，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的抗GPC3全人源化抗体，其特征是，所述抗体为VH单域结构抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链可变区片段(scFv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsFv)、IgG分子、或双特异性抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗GPC3全人源化抗体，其特征是，所述抗体具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。
5.编码权利要求1至4任一项所述抗GPC3全人源化抗体的核酸。
6.根据权利要求5所述的核酸，其特征是，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
7.具有权利要求1至4任一项所述抗GPC3全人源化抗体的细胞或偶联物。
8.根据权利要求7所述的细胞或偶联物，其特征是，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞、以及经人工编辑的细胞；所述偶联物包括抗GPC3全人源化抗体-细菌毒素偶联物、抗GPC3全人源化抗体-细菌毒素变体偶联物、抗GPC3全人源化抗体-细胞因子偶联物、以及抗GPC3全人源化抗体-化疗药物偶联物。
9.权利要求1至4任一项所述抗GPC3全人源化抗体用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、靶向药物或靶向药物组合物的用途。
10.权利要求5或6所述核酸用于制备抗GPC3全人源化抗体、靶向药物或靶向药物组合物的用途。
11.权利要求7或8所述细胞或偶联物用于制备靶向药物或靶向药物组合物的用途。
12.根据权利要求9或10或11所述的用途，其特征是，所述靶向药物或靶向药物组合物具有针对GPC3阳性肿瘤的抗肿瘤作用。
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