CN109293774B - 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用 - Google Patents

特异性结合cd19的全人源化抗体及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109293774B
CN109293774B CN201811201166.4A CN201811201166A CN109293774B CN 109293774 B CN109293774 B CN 109293774B CN 201811201166 A CN201811201166 A CN 201811201166A CN 109293774 B CN109293774 B CN 109293774B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
amino acid
fully humanized
humanized antibody
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811201166.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109293774A (zh
Inventor
高威
马素娟
孙鸾
李娜
陈璐璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Medical University
Original Assignee
Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Medical University filed Critical Nanjing Medical University
Priority to CN201811201166.4A priority Critical patent/CN109293774B/zh
Publication of CN109293774A publication Critical patent/CN109293774A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109293774B publication Critical patent/CN109293774B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及特异性结合CD19的全人源化抗体及应用。该抗体至少具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3之一。该抗体可用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物；该核酸用于制备特异性结合CD19的全人源化抗体、药物或药物组合物；该细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物；该药物或药物组合物具有针对CD19阳性肿瘤的抗肿瘤作用。本发明通过噬菌体展示技术筛选出抗CD19的全人源化抗体，该抗体特异性强，亲和力高，能与CD19阳性细胞结合，且不会与现有抗体FMC63形成竞争结合关系，具有抗肿瘤应用前景。

Description

特异性结合CD19的全人源化抗体及应用
技术领域
本发明涉及一种特异性结合CD19的全人源化抗体及应用，属于生物技术领域。
背景技术
据发明人所知，CD19是特异性表达于人正常及恶变B细胞表面的跨膜蛋白，分子量约95kd。在B细胞谱系发育的各个阶段均高表达CD19，但完全成熟的浆细胞丢失CD19的表达，是B细胞的重要标记。CD19在B细胞表面与CD21及CD81形成多分子复合体。在获得激活信号后，位于CD19细胞内结构域上的6个酪氨酸残基发生磷酸化，招募下游信号分子，放大BCR的活化信号。CD19基因敲除小鼠B细胞活化明显减弱，同时对大多数抗原的抗体应答都受到显著抑制。因此，CD19作为B细胞受体的共受体(co-receptor)发挥作用，通过降低BCR激活所需的信号阈值，调控B细胞的发育、增殖和分化[1]。
CD19在B细胞上的广泛表达使其成为B细胞恶性病变的重要治疗靶点[2]。在多种类型的B细胞白血病(包括急性B淋巴细胞白血病，慢性B淋巴细胞白血病)、B细胞淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)的治疗中，CD19抗体、双特异性抗体和抗体衍生物的抗肿瘤临床前试验和临床实验已经广泛开展；尤其是由CD19抗体衍生的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)治疗方法[3]，已经有两项获得FDA批准上市[4,5]，分别用于治疗急性B淋巴细胞白血病和B淋巴瘤；其识别CD19的抗体为FMC63，是一种基于小鼠单克隆抗体的人源化抗体[6]。故筛选新型CD19全人源化抗体，构建嵌合抗原受体T细胞用于B细胞恶性病变的治疗，具有重要的临床应用价值。
经检索发现，申请号201711157376.3，申请公布号CN107827991A的中国发明专利申请，公开一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用。以该技术方案为代表的现有技术中已经存在了一些抗CD19抗体。发明人课题组经系统地试验研究后得出了不同于现有技术的特异性结合CD19的全人源化抗体。
发明内容
本发明的主要目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种特异性结合CD19的全人源化抗体，能与CD19阳性细胞结合。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种特异性结合CD19的全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；
ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；
iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基100-103；
iv、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；
v、所述轻链包括轻链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基183-186；
vi、所述轻链包括轻链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基224-229。
优选地，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；所述重链还包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；
ii、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；所述轻链包括轻链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基183-186；所述轻链包括轻链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基224-229。
优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述抗体为VH单域结构抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链可变区片段(scFv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsFv)、IgG分子、或双特异性抗体。
优选地，所述抗体具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。
本发明还提供：
编码前文所述特异性结合CD19的全人源化抗体的核酸。
优选地，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供：
具有前文所述特异性结合CD19的全人源化抗体的细胞或偶联物。
优选地，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞、以及经人工编辑的细胞；所述偶联物包括特异性结合CD19的全人源化抗体-细菌毒素偶联物、特异性结合CD19的全人源化抗体-细菌毒素变体偶联物、特异性结合CD19的全人源化抗体-细胞因子偶联物、以及特异性结合CD19的全人源化抗体-化疗药物偶联物。
本发明还提供：
前文所述特异性结合CD19的全人源化抗体用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。
前文所述核酸用于制备特异性结合CD19的全人源化抗体、药物或药物组合物的用途。
前文所述细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物的用途。
其中，所述药物或药物组合物具有针对CD19阳性肿瘤的抗肿瘤作用。
本发明通过噬菌体展示技术筛选出特异性结合CD19的全人源化抗体，该抗体特异性强，亲和力高，能与CD19阳性细胞结合，且不会与现有抗体FMC63形成竞争结合关系，抗体5G9及其衍生物、CAR-T细胞、偶联物均具备与抗体FMC63及其衍生物、CAR-T细胞产生协同作用的潜在可能，具有抗肿瘤应用前景。
附图说明
图1为实施例1中ELISA检测富集噬菌体对抗原蛋白结合的示意图。
图2为实施例1中ELISA检测噬菌体单克隆对抗原结合的示意图。
图3为实施例1中SDS-PAGE检测结果图。
图4为实施例1中抗体5G9与CHO-CD19细胞特异性结合的结果图。
图5为实施例2中亲和力分析结果图。
图6为实施例3中抗体5G9与B细胞系特异性结合的结果图。
图7为实施例4的荧光检测结果图，图中，“CD19 Antibody-”表示阴性对照组，“CD19 Antibody+”表示各抗体组。
图8为实施例4的数据处理结果图，图中，“CD19 Antibody-”表示阴性对照组，“CD19 Antibody+”表示各抗体组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
实施例1、筛选特异性结合CD19的全人源化抗体
采用噬菌体展示技术，以人CD19(P20-K291)蛋白为CD19抗原进行筛选。
其中，该CD19抗原的制备过程如下：构建pFUSE-hCD19(P20-K291)-Fc真核细胞表达载体；该表达载体利用IL-2的信号肽序列置换了CD19的信号肽序列，引导CD19-Fc融合蛋白分泌到培养基中；利用LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将上述表达载体转染HEK293T细胞，收集上清，并通过Protein A Argrose(GE Healthcare，Piscataway，NJ)亲和柱分离纯化CD19-Fc融合蛋白，所得即CD19抗原。
噬菌体展示的具体过程为：使用100μg/ml的上文所得CD19抗原于4℃包被免疫板过夜；用含有5％脱脂奶粉，0.1％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；Tomlinson I&J噬菌体文库(Genservice Ltd.,Cambridge,UK，文库大小为1.47x108)以1012pfu与3％脱脂奶粉PBS溶液1:1混合后室温孵育2小时，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板20次；100μl 100mM Triethylamine室温洗脱30分钟；洗脱的噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增和回收后用于下一轮淘选。淘选后ELISA分析阳性噬菌体富集情况。
ELISA检测：以10μg/ml上文所得CD19抗原和阴性对照蛋白Frizzled-Fc分别于4℃包被免疫板过夜；用含有3％脱脂奶粉，0.1％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；将每一轮富集的噬菌体扩增并回收，以1:1比例与6％脱脂奶粉PBS室温孵育2小时，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将HRP/Anti-M13 Monoclonal conjugate以1：4000比例与含3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将TMB显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸终止显色(100μl/孔)；用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析每轮扩增后噬菌体的亲和力。
ELISA检测结果如图1所示，以Frizzled为抗原阴性对照，在四轮富集后，噬菌体群对CD19抗原的亲和力显著升高。
对第四轮富集的噬菌体单克隆进行抗原结合分析，具体过程为：
用第四轮富集的噬菌体库感染TG1细胞，并从中随机挑取200个单克隆，扩增并回收噬菌体。以10μg/ml的上文所得CD19抗原和阴性对照Frizzled-Fc蛋白分别于4℃包被免疫板过夜；用含有3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液室温封闭免疫板1小时；将200个扩增后的单克隆噬菌体，以1:1比例与6％脱脂奶粉PBS室温孵育1小时，分别加入包被有CD19抗原和阴性对照Frizzled-Fc蛋白并封闭好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将HRP/Anti-M13 Monoclonal conjugate以1：4000比例与含3％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的PBS溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤免疫板5次；将TMB显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸中止显色(100μl/孔)；用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析单克隆噬菌体对CD19蛋白的结合能力。检测结果如图2所示，发现13个抗原结合阳性克隆。
将上述13个阳性克隆分别构建scFv-Fc抗体形式的表达载体，并各自转染HEK293T细胞，然后收集上清，并用protein A Agrose分离柱进行纯化。具体过程以5G9为例：
将5G9的scFv序列克隆到表达载体pFUSE-CHIg-hg1中(Invivigen,San Diego,CA)中,制备质粒。用添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM培养基在细胞培养皿中种5百万个HEK293T细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养。当细胞密度到达60-80％时，利用PEI将10μg pFUSE-5G9scFv-Fc质粒转染入HEK293T细胞；收集上清。将收集的上清液在3500rpm、4℃条件下离心20分钟，并用0.45μm的微孔滤膜抽滤，进一步去除碎片；将上清液通过Protein A Argrose(GE Healthcare，Piscataway，NJ)亲和柱分离纯化5G9scFv-Fc重组蛋白。通过BCA法测定蛋白浓度，并将5μg 5G9scFv-Fc重组蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3所示。
之后，将13个阳性克隆的scFv-Fc纯化蛋白分别在CHO-CD19细胞上验证结合情况，以CHO-K1细胞等作为阴性对照。具体过程以5G9为例：
采用的CHO-K1、Nalm6、SU-DHL6、Raji细胞均购自美国ATCC(ATCC,Manassas,VA)。利用LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将CD19cDNA转染CHO-K1细胞，puromycin筛选获得CD19过表达细胞系CHO-CD19。CHO-K1、CHO-CD19分别在添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的F12K完全培养基中培养；Nalm6、SU-DHL6、Raji在添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的RPMI完全培养基中培养。
分别取0.5×106CHO-CD19、CHO-K1、Nalm6、SU-DHL6、以及Raji细胞，2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS洗涤一次，将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中，加10μg/ml5G9scFv-Fc冰上染色1小时。2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，PBS洗涤细胞一次，再次以200μl FACS缓冲液重悬细胞，以1：200比例加入PE标记的羊抗人IgG二抗，冰上孵育1小时。PBS洗涤一次，最终以300μl PBS重悬细胞，BD Calibur检测PE荧光标记信号，FlowJo软件分析5G9scFv-Fc蛋白对CD19阳性细胞的特异性结合。
结果显示，在13个待选序列中，抗体5G9能够特异性结合CD19阳性细胞(即CHO-CD19细胞)，其结合情况如图4所示，以CHO-K1细胞作为阴性对照。
抗体5G9的scFv形式的DNA序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
SEQ ID NO：1：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGATATTGCTAATGATGGTTCTTCTACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTACTACTTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATTAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTGATACTGCTCCTTCTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA。
SEQ ID NO：2：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDIANDGSSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTDTAPSTFGQGTKVEIK。
在氨基酸序列中，1-116为抗体重链序列，132-239为抗体轻链序列，117-131为连接肽序列。其中包含的CDR区域如下：氨基酸残基26-33(即GFTFSSYA)为重链CDR1，氨基酸残基50-59(即DIANDGSSTA)为重链CDR2，氨基酸残基100-103(即TTSF)为重链CDR3；氨基酸残基161-165(即ISSYL)为轻链CDR1，氨基酸残基183-186(即ASTL)为轻链CDR2，氨基酸残基224-229(即DTAPST)为轻链CDR3。
此外，该抗体形式可选自VH单域结构抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链可变区片段(scFv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsFv)、IgG分子、或双特异性抗体。该抗体可选择具有标记，标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。
实施例2、抗体5G9的亲和力分析
取0.5×106CHO-CD19细胞，2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS洗涤一次，将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中，加10个不同浓度梯度的实施例1纯化所得5G9scFv-Fc抗体,分别为50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78，0.39，0.195，0μg/ml，冰上染色1小时。2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，PBS洗涤细胞一次，再次以200μl FACS缓冲液重悬细胞，以1：200比例加入PE标记的羊抗人IgG二抗，冰上孵育1小时。PBS洗涤一次，最终以300μlPBS重悬细胞，BD Calibur检测PE荧光标记信号，FlowJo软件分析不同浓度5G9scFv-Fc蛋白对CHO-CD19细胞的结合。拟合5G9scFv-Fc蛋白亲和力曲线并计算亲和力。
结果如图5所示，抗体5G9与CHO-CD19细胞结合的亲和力为83.48nM。
实施例3、抗体5G9与B细胞系特异性结合的分析
采用流式细胞术检测抗体5G9对B细胞系的特异性结合情况，Nalm6为B-ALL细胞系，SU-DHL6和Raji为B淋巴瘤细胞系，均为CD19阳性表达细胞系。如图6所示，结果表明抗体5G9与Nalm6，SU-DHL6，Raji三者均有较强的特异性结合能力。
实施例4、抗体5G9、抗体FMC63与CD19阳性B细胞竞争结合分析
采用实施例1抗体5G9 scFv，以及抗体FMC63 scFv[6]；将FMC63 scFv进行生物素标记，即得FMC63-Biotin。
设立阴性对照组、阴性抗体组、抗体5G9组、抗体FMC63组，各组分别按照如下过程进行处理和分析：
取0.5×106CHO-CD19细胞，2000rpm 4℃离心5分钟，弃掉上清，并用PBS洗涤一次，将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中，加入各组的样品，并于冰上孵育1小时。其中，阴性对照组加入的样品为PBS，阴性抗体组加入的样品为10μg/ml阴性抗体scFv(Control scFv，采用不结合CD19的任意scFv抗体即可)，抗体5G9组加入的样品为10μg/ml抗体5G9scFv，抗体FMC63组加入的样品为2μg/ml抗体FMC63 scFv，各抗体组加入抗体以封闭细胞表面CD19结合表位。
之后，2000rpm 4℃离心5分钟，弃掉上清，PBS洗涤细胞一次，再次以200μl FACS缓冲液重悬细胞，加入2μg/ml FMC63-Biotin后冰上孵育1小时；2000rpm 4℃离心5分钟，弃掉上清，PBS洗涤细胞一次，再次以200μl FACS缓冲液重悬细胞，以1：200比例加入PE标记的链霉亲和素(SA-PE)，冰上孵育1小时；PBS洗涤一次，最终以300μl PBS重悬细胞，BD Calibur检测PE荧光标记信号(结果如图7所示)，FlowJo软件分析数据(结果如图8所示)。
结果表明，抗体FMC63组由于以FMC63 scFv封闭了细胞表面CD19结合表位，使得FMC63-Biotin无法与细胞结合，即FMC63scFv能够竞争FMC63 biotin与CD19阳性B细胞的结合。而抗体5G9组则与阴性抗体组类似，对于FMC63 biotin与CD19阳性B细胞的结合没有显著的竞争效应。也即，在细胞水平，抗体5G9与CD19的结合不会竞争性地干扰抗体FMC63与CD19的结合，该结果说明，抗体5G9及其衍生物、CAR-T细胞、偶联物等具备与抗体FMC63及其衍生物、CAR-T细胞产生协同作用的潜在可能，具有抗肿瘤应用前景。
本发明的抗体5G9能与CD19特异性结合，与现有的抗CD19抗体一样，可用于制备嵌合抗原受体T细胞，还可用于制备嵌合抗原受体NK细胞或经人工编辑的细胞，或制备偶联物。偶联物可选自抗体5G9-细菌毒素偶联物、抗体5G9-细菌毒素变体偶联物、抗体5G9-细胞因子偶联物、抗体5G9-化疗药物偶联物。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
参考文献
[1]Tedder TF,Inaoki M,Sato S.The CD19-CD21complex regulates signaltransduction thresholds governing humoral immunity and autoimmunity.[J].Immunity.1997,6:107-118.
[2]Katz BZ,Herishanu Y.Therapeutic targeting of CD19in hematologicalmalignancies:past,present,future and beyond.[J].Leuk lymphoma.2014,5(55):999-1006.
[3]Carl HJ,Michel S.Chimeric Antigen Receptor Therapy.[J].NEJM.2018,379:64-73.
[4]Stephen JS,Jakub S,et al.Chimeric Antigen Receptor T Cells inRefractory B-Cell Lymphomas.[J].NEJM.2017,377:2545-54.
[5]Neelapu SS,Locke FL,et al.Axicabtagene Ciloleucel CAR T-CellTherapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.[J].NEJM.2017,377:2531-44.
[6]Cooper L J N,Jena B,Maiti S.Anti-CD19scFv(FMC63)polypeptide:,US9701758[P].2017.
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 特异性结合CD19的全人源化抗体及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagat attgctaatg atggttcttc tacagcttac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatctact 300
acttcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagcgg tggaggcggt 360
tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg tcgacggaca tccagatgac ccagtctcca 420
tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480
attagcagct atttaaattg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540
tattctgcat ccactttgca aagtggggtc ccattaaggt tcagtggcag tggatctggg 600
acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt 660
caacagactg atactgctcc ttctacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaa 717
<210> 2
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ala Asn Asp Gly Ser Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Leu
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asp
210 215 220
Thr Ala Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235

Claims (12)

1.一种特异性结合CD19的全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体具有以下全部技术特征：
i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；所述重链还包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；
ii、所述轻链包括轻链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；所述轻链包括轻链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基183-186；所述轻链包括轻链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基224-229。
2.根据权利要求1所述的特异性结合CD19的全人源化抗体，其特征是，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的特异性结合CD19的全人源化抗体，其特征是，所述抗体为Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链可变区片段(scFv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsFv)、IgG分子、或双特异性抗体。
4.根据权利要求1或2所述的特异性结合CD19的全人源化抗体，其特征是，所述抗体具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。
5.编码权利要求1至4任一项所述特异性结合CD19的全人源化抗体的核酸。
6.根据权利要求5所述的核酸，其特征是，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
7.具有权利要求1至4任一项所述特异性结合CD19的全人源化抗体的细胞或偶联物。
8.根据权利要求7所述的细胞或偶联物，其特征是，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞、以及经人工编辑的细胞；所述偶联物包括特异性结合CD19的全人源化抗体-细菌毒素偶联物、特异性结合CD19的全人源化抗体-细菌毒素变体偶联物、特异性结合CD19的全人源化抗体-细胞因子偶联物、以及特异性结合CD19的全人源化抗体-化疗药物偶联物。
9.权利要求1至4任一项所述特异性结合CD19的全人源化抗体用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。
10.权利要求5或6所述核酸用于制备特异性结合CD19的全人源化抗体、药物或药物组合物的用途。
11.权利要求7或8所述细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物的用途。
12.根据权利要求9或10或11所述的用途，其特征是，所述药物或药物组合物具有针对CD19阳性肿瘤的抗肿瘤作用。
CN201811201166.4A 2018-10-16 2018-10-16 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用 Active CN109293774B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811201166.4A CN109293774B (zh) 2018-10-16 2018-10-16 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811201166.4A CN109293774B (zh) 2018-10-16 2018-10-16 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109293774A CN109293774A (zh) 2019-02-01
CN109293774B true CN109293774B (zh) 2021-05-28

Family

ID=65162627

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811201166.4A Active CN109293774B (zh) 2018-10-16 2018-10-16 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109293774B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113840841B (zh) * 2019-05-20 2023-03-07 南京驯鹿医疗技术有限公司 靶向cd19的全人源抗体及其应用
CN112679612B (zh) * 2021-01-29 2022-07-01 武汉华美生物工程有限公司 抗cd19人源化抗体及其制备方法与应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070264687A1 (en) * 2005-12-15 2007-11-15 Min-Yuan Chou Recombinant triplex scaffold-based polypeptides
US8679492B2 (en) * 2009-02-23 2014-03-25 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Humanized antibodies that bind to CD19 and their uses
EA201391159A1 (ru) * 2011-02-11 2014-02-28 Мемориал Слоан-Кеттеринг Кэнсер Сентер Hla-рестриктированные пептидоспецифические антигенсвязывающие белки
AU2014268364A1 (en) * 2013-05-24 2015-12-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
CA2994746A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 Cellectis Cells for immunotherapy engineered for targeting cd38 antigen and for cd38 gene inactivation
CN117024588A (zh) * 2016-09-06 2023-11-10 华道(上海)生物医药有限公司 抗cd19抗体在制备白血病治疗药物中的用途
CN107827991B (zh) * 2017-11-20 2020-10-09 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN108101994B (zh) * 2018-01-04 2020-09-15 广东万海细胞生物科技有限公司 抗cd19抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109293774A (zh) 2019-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110225928B (zh) 抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用
US11555077B2 (en) 4-1BB antibody and preparation method and use thereof
CN113214398B (zh) 抗人cd137的完全人抗体及其应用
CN111690058A (zh) 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途
CN113039205B (zh) 靶向cll1的抗体及其应用
CN109021108B (zh) 抗gpc3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用
CN115768793A (zh) 新型lilrb2抗体和其用途
SA07280062B1 (ar) الاجسام المضادة لـ il -22 الآدمى و استخداماتها
KR20140033029A (ko) 에이치엘에이 에이2에 의해 제공된 더블유티1 펩타이드에 특이적인 티 세포 수용체 유사 항체
CN113508139B (zh) 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途
KR20100014690A (ko) 단일클론 인간 종양-특이적 항체
CN112830970B (zh) 一种cd22纳米抗体、分离的核酸分子、药物组合物及其应用
CN109715661A (zh) 抗干扰素-γ的抗体及其应用
CN112538115B (zh) 一种抗人bcma纳米抗体及其制备方法和应用
CN112592405B (zh) 抗人bcma纳米抗体及其制备方法和应用
CN109293774B (zh) 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用
JP6552412B2 (ja) ヒトインテグリンａ６ｂ４と特異的に反応する抗体
CN113501879B (zh) 一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法
CN112851814B (zh) 一种靶向bcma的全人源单链抗体及其制备方法与应用
CN112480250B (zh) 一种抗人骨桥蛋白的抗体及其应用
US20240150460A1 (en) Anti-nkp30 antibody and application thereof
CN111378038A (zh) 针对人细胞程序化死亡受体-1的人源单克隆抗体及其应用
CN111662385B (zh) 全人源抗人gpc3单克隆抗体及其用途
CA3205885A1 (en) Immunomodulatory antibodies and uses thereof
CN113072643B (zh) 抗Glypican-3耐酸性全人源抗体、其免疫毒素、其嵌合抗原受体细胞及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant