CN110627905A - 靶向vegf与egfr的双功能融合蛋白及其应用 - Google Patents

靶向vegf与egfr的双功能融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用。本发明提供的融合蛋白可特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)。本发明提供一种疗效确切、稳定性高的靶向且协同抑制EGFR/VEGF(R)通路的融合蛋白，该融合蛋白通过阻断Akt/Stat3信号通路磷酸化，从而抑制血管新生或细胞生长。具有显著的靶向成像效果和抗PDAC肿瘤的显著疗效。本发明提供的融合蛋白具有很强的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡作用，可用于恶性肿瘤的治疗。

Description

靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和生物医药领域，具体地说，涉及一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用。
背景技术
胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高恶性、侵袭性的实体肿瘤，由于其复杂的遗传异质性，早期难以发现，预后较差。迄今为止，无论是化疗、靶向药物还是免疫治疗，均未发现有效的PDAC治疗药物。尽管近年来针对PDAC的大量治疗方法得到了迅速发展，但5年生存率仍然保持在5％以下。PDAC由相当复杂的组织元素组成，其特点是组织背景致密、高压、间质血管化不良。这些内源性的特性也导致了一系列的死锁治疗，如渗透性差、令人尴尬的耐药性、快速复发和复杂的肿瘤异质性使得单一靶点难以取得良好的疗效。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，抑制肿瘤的生长和远处转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键因素。
随着对胰腺癌生物学行为的深入研究及其细胞分子学机制的掌握，应用分子靶向药物治疗胰腺癌目前已逐渐成为晚期胰腺癌治疗的研究重点。在胰腺癌中EGFR、HER2、VEGF、PDGFR、c-Kit等多种分子标志物过度表达或激活，在细胞间信号转导和调控分化、增殖、存活、迁移、血管生成等关键过程中发挥重要作用。胰腺癌细胞常伴表皮生长因子受体(EGFR)的高表达，在胰腺癌的形成、进展及转移中具有重要作用。EGFR的几个下游信号通路发挥着重要作用，包括通过MAPK通路介导增殖和通过PI3K/AKT通路存活。同时EGFR在胰腺癌中也高度保守，这些结果为靶向治疗的可行性提供了研究基础。因此，抑制EGFR的表达和下游信号通路可以诱导具有本构性磷酸化的胰腺癌细胞凋亡，从而实现包括PADC在内的抗癌策略。目前，EGFR抑制剂包括针对EGFR胞外结构域的西妥昔单抗等单抗体，以及针对EGFR胞内结构域的小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，如厄洛替尼、吉非替尼等。但与其他肿瘤一样，针对EGFR的多种靶向药物在胰腺癌患者中的总体应答率仍不高，其机制仍不清楚。如何加强针对EGFR的靶向药物的疗效，成为亟待解决的问题。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)是控制血管新生最重要的因子，是诱导和促进血管形成作用最强、最专一的血管生长因子，在几乎所有的人体肿瘤中都过量表达，是抗癌研究的一个重要分子靶标。多项研究表明VEGF在胰腺癌血管生成中起关键作用，在64％的胰腺癌细胞中过表达。VEGF与VEGFR特异性结合，可激活内皮细胞增殖、迁移和转移，增加血管通透性。VEGF通过自分泌和旁分泌途径间接激活EGFR表达上调，与肿瘤细胞侵袭性增强有EGFR和VEGF(R)通路在许多肿瘤细胞的存活和血管生成中具有交叉作用。阻断肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的生长和引发肿瘤细胞的死亡，从而达到对肿瘤的治疗作用。因此，抑制血管新生是目前抗肿瘤新药研究的重要方向之一。如FDA已经批准上市的Avastin同时还有更多的药物处于不同的临床前和临床研究阶段。因此，联合靶向和协同抑制EGFR/VEGF(R)通路对PDAC治疗是一种很有前途的策略。
现有的抗体或抗体-药物结合物在PDAC治疗的临床试验中疗效不佳，迫切需要探索更有效和个性化的策略来处理复杂的遗传异质性和独特的组织特征，实现更好的PDAC分子成像和治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白，所述融合蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)、SEQ ID NO:1(可特异性结合表皮生长因子受体)和SEQ ID NO:2(可特异性结合血管内皮生长因子)所示的氨基酸序列；或
ii)、在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)、i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的融合蛋白。
可选地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列之间通过柔性Linker连接。所述柔性Linker优选为GGSSRSS。
本发明提供一种靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白Bi50，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
第二方面，本发明提供编码所述融合蛋白的核酸分子。
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系等。
优选地，所述表达载体是真核表达载体或病毒表达载体。
第四方面，本发明提供一种组合物，其包含所述融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
第五方面，本发明提供Akt和/或Stat3信号通路抑制剂，有效成分为所述融合蛋白。
第六方面，本发明提供胰腺癌治疗药物或组合物，有效成分为所述融合蛋白。
优选地，所述药物或组合物的制剂形式可以是注射剂、注射用冻干粉针或眼用凝胶。
第七方面，本发明提供所述融合蛋白的以下任一应用：
1)用于制备抗肿瘤药物或组合物；
2)用于制备肿瘤诊断试剂和/或肿瘤显像剂；
3)用于肿瘤治疗和检测；
4)用于肿瘤靶向载药和成像。
本发明中，所述肿瘤包括但不限于胰腺导管腺癌。
前述的应用，还包括将所述融合蛋白与其他抗肿瘤药物联合使用。
第八方面，本发明提供一种诊断试剂盒，其包含所述融合蛋白以及任选标记物或用于偶联的试剂。优选地，所述标记物可以是荧光分子，核素或Gd-DOTA。
本发明还提供所述融合蛋白的制备方法，所述方法包括：人工合成编码所述融合蛋白的DNA序列，将DNA序列连入表达载体，转染细胞，表达、分离纯化目的蛋白。
本发明提供的融合蛋白的可特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)，进而抑制血管新生或细胞生长。融合蛋白Bi50可与肿瘤细胞发生特异性结合，穿入细胞膜进入胞浆并特异性诱导肿瘤细胞凋亡，以达到靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，可用于恶性肿瘤的治疗。
本发明提供一种疗效确切、稳定性高的靶向且协同抑制EGFR/VEGF(R)通路的融合蛋白，该融合蛋白通过阻断Akt/Stat3信号通路磷酸化，从而抑制血管新生或细胞生长。具有显著的靶向成像效果和抗PDAC肿瘤的显著疗效。本发明提供一种集靶向治疗和检测于一体的PDAC诊疗方法。
本发明提供的全人源抗EGFR和VEGF双特异性抗体融合蛋白(靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白)，与药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效。在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。
将本发明的双靶向融合蛋白直接或间接地用标记合适的可检测物质，包括多种生物学活性酶、荧光分子、顺磁(如钆等磁共振活性)物质和放射性核素，用于体内和体外肿瘤检测和成像。
在Bxpc3原位移植小鼠中，二维和三维MSOT图像显示了融合蛋白Bi50具有良好的瘤内积累和良好的组织穿透能力。Western blot结果显示Bi50同时抑制Akt和Stat3信号通路的磷酸化。在耐受剂量下，Bi50具有一定的抗肿瘤作用，肿瘤抑制率达35.14％。以上结果表明，双特异性融合蛋白Bi50通过多靶点联合对PDAC具有良好的靶向渗透作用和抗肿瘤抑制作用，有望成为PDAC分子成像和治疗的一种有前景的手段。
附图说明
图1为本发明实施例1中Bi50双融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。
图2为本发明实施例2中Bi50与EGFR和VEGF的亲和力测定。
图3为本发明实施例3中Bi50对胰腺癌双阳性细胞Bxpc3的靶向识别。
图4为本发明实施例4中Bi50同时抑制Akt和Stat3信号通路的磷酸化水平。
图5和图6为本发明实施例4中Bi50融合蛋白活体抗肿瘤治疗效果评价。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1融合蛋白构建和表达
采用健康供体外周血单核细胞构建的人非免疫ScFv(可变域单链片段：VH-linker-VL)抗体文库(库容：2×1011)，对VEGF165和EGFR进行筛选。然后与文库制备的2×1013个噬菌体-scfv粒子孵育。洗涤后，进行三轮淘洗。随后随机选择2000个单克隆，筛选与VEGF165或EGFR特异性结合的特异性克隆。最后选择光学密度高的克隆进行抗体基因测序。这两个scfv的VH CDR3结构域分别位于序列的两端。从N端到C端，串联cdr分别为抗vegf VHCDR3、CDR2、CDR1、连接剂、VL CDR3、CDR2、CDR1、连接剂、抗egfr VL CDR1、CDR2、CDR3、连接剂VH CDR1、CDR2、CDR3。合成双特异性ScFv基因被克隆到表达载体pET30a和转换成大肠杆菌菌株BL21(λDE3)。用Ni-NTA纯化融合蛋白，产物经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。采用ELISAs分析重建的双特异性融合蛋白
Bi50是由编码抗egfr和抗vegf165抗体ScFv基因片段的片段融合而成，暴露其CDR3结构域。pelB leader序列将表达的Bi50导入细菌的周质中进行分离纯化。采用柔性连接剂GGGGS维持Bi50的最佳功能活性。将His标签添加到VH片段的C端进行纯化和表征，利用SDS-PAGE对15％凝胶上的Bi50及相应的ScFvs进行检测(图1)。融合蛋白Bi50的生化纯度分析显示，其分子量约为50kDa。融合蛋白Bi50的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例2融合蛋白的亲和力评价
在Plexera PlexArray HT系统(Plexera LLC,Bothell,WA)上使用裸金SPRi芯片(纳米金芯片，金层厚度为47.5nm)进行表面等离子体共振成像(SPRi)分析。所有纯化的肽段均由半胱氨酸残基巯基印刷在金表面。然后将打印好的芯片在4℃的潮湿箱内孵育过夜。将SPRi芯片用5％(m/v)脱脂牛奶在PBS中冲洗并封堵过夜后使用。SPRi分析程序如下：运行缓冲(PBST，基线稳定)；样品(五种浓度的蛋白质，结合)；运行缓冲液(PBST，洗涤)；去离子水(再生)中H3PO4含量为0.5％(v/v)。Bi50蛋白用PBST稀释至浓度为10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,1.25μg/mL,0.625μg/mL。记录分析SPRi信号。
实验结果表明，Bi50不仅可以与VEGF结合，还能够与EGFR结合。如图2所示，Bi50随着VEGF/EGFR蛋白浓度的增加，其与蛋白的结合力逐渐增强，而1×PBS则不随之增加。表明Bi50对VEGF/EGFR同时具有强结合作用，Bi50与VEGF和EGFR结合的KD值分别为4.17×10- 8mol/L和5.95×10-8mol/L。
实施例3融合蛋白Bi50与胰腺癌双阳性细胞Bxpc3的靶向作用
人胰腺细胞系Bxpc3细胞培养于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，以1×105/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，加入用DMEM培养基溶解的FITC-Bi50(50μg/L)；对照组加入相同摩尔浓度的用DMEM培养基溶解的ScFv-FITC；冰浴避光孵育40min后，分别弃去溶液，并用预冷PBS洗涤3次。
用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000-IX81)检测细胞中的荧光分布。
结果如图3所示，加入Bi50的Bxpc3细胞观测到很强绿色荧光，而对照组ScFv的Bxpc3细胞则只有较弱绿色荧光信号，说明Bi50的FITC偶联物与Bxpc3上VEGF和EGFR的识别是序列专一性的。加入抗体阻断后细胞没有观测到绿色荧光，说明融合蛋白结合Bxpc3细胞是特异性结合。
实施例4融合蛋白的活体抗肿瘤效果
将Balb/c小鼠(6周龄，每只体重18g左右)随机分为治疗组和对照组(5只/组)。然后开始治疗(肿瘤植入后第3天静脉注射，每2天注射一次；所植入的Bxpc3胰腺癌原位肿瘤大小约80mm3)，裸鼠尾静脉注射Bi50(0.01nM/g)、ScFv EFGR(0.01nM/g)、ScFv VEGF(0.01nM/g)(以上均为按每克小鼠体重计，注射的总剂量)。对照组裸鼠注射生理盐水。测量肿瘤生长，计算肿瘤体积。实验于第21天结束，切除肿瘤并称重。肿瘤抑制率计算方法为：肿瘤重量(治疗组)/肿瘤重量(对照组)×100％。
如图4所示，在不同的研究组中对EGFR/VEGF的下游通路Akt、Stat3进行了Westernblot检测。结果发现Bi50处理组Akt和Stat3信号通路的磷酸化水平比ScFvEGFR和ScFvVEGF组受到更强的抑制。图5细胞毒性实验显示Bi50对胰腺癌细胞系Bxpc3和ASPC1的增殖具有明显的抑制作用。体内抗肿瘤结果表明，Bi50组和对照组小鼠治疗前后体重无明显变化。但Bi50的抗肿瘤作用明显强于ScFvEGFR和ScFvVEGF(图6)。以上结果表明，双特异性融合蛋白Bi50具有一定的抗肿瘤作用，肿瘤抑制率达35.14％，ScFvEGFR和ScFvVEGF处理组肿瘤随时间推移体积不断增大；相比对照组，Bi50处理组小鼠存活率提高了42％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> 靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白及其应用
<130> KHP191114994.9
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Pro Ser Glu Leu Ala Leu Thr Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
1 5 10 15
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser
35 40 45
Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Val Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Val Asn Ser Ile Lys Val Thr Arg Thr Leu Leu Ala Arg
85 90 95
Gly Pro Ser Trp Arg Ser Lys Val Val Pro Leu Asp Leu Pro Arg Cys
100 105 110
Ser Trp Cys Ser Leu Gly Glu Ala
115 120
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Ser Ser Leu Ala Gly Pro Asp Cys Pro Val Gln Pro Leu Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ser Val Ala Ile Arg Thr Gly Ser Ala Arg Leu Gln Gly Arg Gly
20 25 30
Trp Ser Gly Ser His Pro Leu Val Val Val Val Ile Thr Tyr Thr Thr
35 40 45
Gln Thr Gln Arg Ala Asp Ser Pro Ser Pro Glu Thr Thr Pro Gly Asn
50 55 60
His Cys Ile Trp Lys Gln Pro Arg Thr Arg Leu Tyr Ile Thr Val Arg
65 70 75 80
Gly Trp Leu Gly Ala Thr Leu Gly Ile Leu Thr Thr Gly Ala Arg Glu
85 90 95
Pro Trp Ser Pro Ser Pro Gln Pro Pro His Arg Ala His Pro Ser Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Pro Ser Glu Leu Ala Leu Thr Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
1 5 10 15
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser
35 40 45
Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Val Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Val Asn Ser Ile Lys Val Thr Arg Thr Leu Leu Ala Arg
85 90 95
Gly Pro Ser Trp Arg Ser Lys Val Val Pro Leu Asp Leu Pro Arg Cys
100 105 110
Ser Trp Cys Ser Leu Gly Glu Ala Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Trp
115 120 125
Ser Ser Leu Ala Gly Pro Asp Cys Pro Val Gln Pro Leu Gly Ser Pro
130 135 140
Ser Val Ala Ile Arg Thr Gly Ser Ala Arg Leu Gln Gly Arg Gly Trp
145 150 155 160
Ser Gly Ser His Pro Leu Val Val Val Val Ile Thr Tyr Thr Thr Gln
165 170 175
Thr Gln Arg Ala Asp Ser Pro Ser Pro Glu Thr Thr Pro Gly Asn His
180 185 190
Cys Ile Trp Lys Gln Pro Arg Thr Arg Leu Tyr Ile Thr Val Arg Gly
195 200 205
Trp Leu Gly Ala Thr Leu Gly Ile Leu Thr Thr Gly Ala Arg Glu Pro
210 215 220
Trp Ser Pro Ser Pro Gln Pro Pro His Arg Ala His Pro Ser Leu
225 230 235

Claims (10)

1.靶向VEGF与EGFR的双功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
ii)、在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)、i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示氨基酸序列之间通过柔性Linker连接；
优选地，所述柔性Linker为GGSSRSS。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述融合蛋白的核酸分子。
5.含有权利要求4所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
6.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1-3任一项所述融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
7.Akt和/或Stat3信号通路抑制剂，其特征在于，有效成分为权利要求1-3任一项所述融合蛋白。
8.权利要求1-3任一项所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物或组合物中的应用；
优选地，所述肿瘤是指胰腺导管腺癌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，还包括与其他抗肿瘤药物联合使用。
10.权利要求1-3任一项所述融合蛋白在制备肿瘤诊断试剂和/或肿瘤显像剂中的应用；
优选地，所述肿瘤是指胰腺导管腺癌。
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