CN102219859A - 拮抗血管新生诱导因子的融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抑制血管新生的融合蛋白及其用途。具体地，本发明涉及抑制多种血管新生因子的融合蛋白及其用途。更具体地，本发明涉及VEGF受体和FGF受体的融合蛋白及其在治疗与血管新生调控相关的疾病中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及拮抗血管新生诱导因子的融合蛋白及其用途。具体地，本发明涉及抑制多种血管新生因子的融合蛋白及其用途。更具体地，本发明涉及VEGF受体和FGF受体的融合蛋白及其在治疗与血管新生相关的疾病中的用途。
背景技术
血管新生(Angiogenesis)是导致恶性肿瘤生长和转移的基本要素之一[1]。血管新生过程受多种因子的调节，有些因子促进血管新生，有些因子抑制血管新生，因而，血管新生的调控是一个十分复杂的动态平衡过程[2]。抗血管新生治疗旨在通过阻断血管新生刺激因子或者用血管新生抑制因子阻止肿瘤中血管的新生，从而达到控制肿瘤生长的目的。目前已经知道相当数目的血管新生刺激因子，例如血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、Tie-1等，这些因子能刺激血管内皮细胞的分裂、分化和血管的形态发生。其中，VEGF是目前所知对血管新生最特异、最有效的生长因子[3，4]。
在肿瘤组织内的缺氧环境中，肿瘤细胞分泌大量的VEGF，诱导血管内皮细胞的分裂和迁移，最终建立肿瘤血管网络。众多动物试验证明，抑制VEGF能阻止血管新生，进而抑制肿瘤的生长。正因为此，VEGF及其受体是抗血管新生药物最重要的靶标，目前在临床试验中取得显著疗效的抗血管新生药物有贝伐单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)，它能够直接阻断VEGF，抑制肿瘤血管的新生，于2004年被美国FDA批准上市作为结直肠癌的一线用药，是第一个被批准上市的通过抑制血管新生发挥抗癌作用的新药。Avastin是一种人源化的抗VEGF的单克隆抗体，由美国著名生物技术公司Genentech生产。在大规模三期临床试验中，Avastin与化疗联合用药可以显著延长多种肿瘤病人的生存时间，包括直肠癌、肺 癌、乳腺癌、肾癌等[5，6]。Avastin在临床上的成功具有划时代的意义，它证明以肿瘤血管系统为靶标的抗血管新生治疗是一个在临床上有效的治疗手段，为多种肿瘤的治疗开辟了一个全新的途径。在西方国家，Avastin已在肿瘤治疗上得到广泛应用，是目前全球销售额最大的药物之一。
除了Avastin，还有若干个抗VEGF信号的药物正处于人体临床试验的后期，有望在将来几年进入临床应用。其中，美国生物技术公司Regeneron和Sanofi-Aventis合作的Aflibercept(或称VEGF-Trap)目前正在进行大规模第三期临床试验[7]。Imclone公司的抗VEGF受体II(VEGFR2)单克隆抗体药物IMC-1121B也在第三期临床试验[8]。毫无疑问，这些新药将为癌症的治疗提供新的选择，给病人带来新的希望。
抗VEGF药物在肿瘤的临床治疗上取得了重大的进展，但是，临床试验也显示抗VEGF治疗也存在相当大的局限。从肿瘤的治疗效果看，Avastin对直肠结肠癌病人能延长半数生存时间约3-4个月[9，10]，对乳腺癌病人能延长半数生存时间约为7-8个月[11]，因此，Avastin并不能长期有效地抑制肿瘤血管的生长。因此，如何进一步提高抗血管新生的临床治疗效果是肿瘤研究者需要解决的问题，也是研究开发下一代抗血管新生药物的重点。
导致抗VEGF治疗失败或产生抗性的的根本原因可能在于肿瘤血管新生是受到多种因子控制的，尽管VEGF在血管新生中起到重要作用，但它不是唯一的血管新生刺激因子。同时，由于肿瘤细胞的非均质性和肿瘤微环境的复杂性以及机体的代偿性反应机制，当VEGF的活性被长时间抑制，其它血管新生刺激因子便会被表达[12]，从而使肿瘤血管的生长不再依赖于VEGF信号途径。Hanahan的小组研究了胰岛肿瘤在接受抗VEGFR2治疗过程中肿瘤表达血管生长因子的变化，发现在抗VEGF的治疗过程中有若干基因的表达发生了变化，其中最为突出的是FGF-2的表达显著增加，研究表明对抗VEGF治疗出现耐受的肿瘤中FGF，尤其是FGF-2的表达显著增加，从而再次激活血管新生，而阻断FGF信号途径后肿瘤再生则被抑制[13]。由此可见FGF-2的过度表达与肿瘤获得逃逸抗VEGF治疗的能力有着密切的关系。因此，同时抑制VEGF和FGF-2将可以更有效地治疗肿瘤等血管增生性疾病。
目前小分子药物在双重或多重靶标拮抗方面已经取得了一定的进展，证明同时拮抗VEGF和FGF-2的抗肿瘤效果要优于单一靶向抗肿瘤治疗 [14]。但是小分子多靶标拮抗剂由于缺乏特异性，往往造成难以预测的副作用，这种副作用有时要在临床试验后期才显现，因此具有很大的风险。而大分子蛋白药物，尤其是Fc融合蛋白和单克隆抗体，具有特异性强、体内半衰期长等优点，是药物研发的重点领域，具有小分子药物不具有的优点。
成纤维细胞生长因子(FGF)是结合肝素的生长因子家族，在哺乳动物中其具有22个家族成员(FGF 1-14，16-23)。FGF在多种生物学功能上具有重要作用，例如细胞增殖、分化、迁移、血管新生和肿瘤发生。其通过结合并活化细胞表面FGF受体(FGFR)发挥其多种生物学功能。(参见，例如Eswarakumar et al.Cytokine Growth Factor Rev.16：139-149，2005)。成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)是与成纤维细胞生长因子家族成员相结合的受体。成纤维细胞生长因子受体中的一部分参与疾病过程。哺乳动物中有四个FGFR基因：fgfR1-fgfR4。成纤维细胞生长因子受体由胞外区、跨膜结构域和胞内结构域组成。FGFR家族成员中，其配体结合性质和激酶结构域各有不同，但是都具有相似的胞外区。它们的胞外区包含三个免疫球蛋白样(Ig样)结构域：第一Ig样结构域、第二Ig样结构域和第三Ig样结构域，在第一和第二Ig样结构域之间还包含一段序列，在本文中，我们将所述第一Ig样结构域和第二Ig样结构域之间的序列称为FGFR Ig样结构域中间功能性序列区。所述中间功能性序列区包含一个酸性氨基酸区段，称为酸性盒(acidic box，AB)。
鉴于VEGF和FGF(尤其是FGF-2)在肿瘤血管新生中的重要作用，我们认为双重拮抗VEGF和FGF(尤其是FGF-2)的大分子蛋白药物将能够更好地抑制肿瘤血管的新生，在临床上得到更好的治疗效果。但到目前为止，尚未有成功构建对VEGF和FGF具有双重阻断作用的大分子融合蛋白的报道。因此，本研究旨在探索构建一种能同时拮抗VEGF和FGF(尤其是FGF-2)的Fc融合蛋白，该融合蛋白利用受体的特异性和高亲和力，将能同时阻断VEGF和FGF信号。本研究的VEGF和FGF双重拮抗融合蛋白质将采用全人源的蛋白质序列，结合Fc融合蛋白优良的药物动力学特性，将具有良好的成药条件和临床应用的潜力。另一方面，在双靶标融合蛋白中，融合蛋白对各靶标的亲和力有赖于正确的蛋白质构型，受体片段在融合蛋白中往往失去与配体结合能力，因此，构建高效、特异的双重拮抗VEGF和FGF(例如FGF-2)的融合蛋白药物具有一定的难度。在本研究的前期工作中，我们构建了二十几个包含不同的VEGFR 片段、FGFR片段和IgG1 Fc的融合蛋白，获得了对VEGF和FGF(尤其是FGF-2)具有高度亲和力的融合蛋白。
已有报道多种抑制血管新生的融合蛋白，例如基于FGFR的融合蛋白(WO/2008/065543)、基于Notch3的融合蛋白(WO/2010/021729)、基于VEGFR的融合蛋白(WO/2010/105573)、基于LK8的融合蛋白(WO/2008/075833)，等等，但是这些融合蛋白都是针对单一的靶标将来自单个血管新生抑制剂的部分与免疫球蛋白的Fc片段融合来实现抑制血管新生。现有技术中尚未有报道能够成功地将两个血管抑制单元融合在一起通过抑制双重靶标实现抑制血管新生功能的融合蛋白。本发明人首次成功地将衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元融合在一起，形成了抑制双重靶标进而抑制血管新生的融合蛋白，出人意料地获得了特别好的效果。因此，本发明为抑制血管新生的药物的开发，提供了新的思路。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及一种融合蛋白，其包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元。在一个实施方案中，所述融合蛋白抑制血管新生。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在体内和/或在体外结合FGF和VEGF。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，所述至少两种血管新生抑制剂选自：VEGFR例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，和FGFR例如FGFR1、FGFR2、FGFR4。优选地，本发明的融合蛋白包含衍生自VEGFR1、VEGFR2和FGFR1的至少两个血管新生抑制单元。更优选地，本发明的融合蛋白包含衍生自VEGFR1、VEGFR2和FGFR1的两个血管新生抑制单元，其中一个血管新生抑制单元衍生自VEGFR1和VEGFR2，另一个衍生自FGFR1。
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，所述至少两种血管新生抑制剂是抑制血管新生的可溶性受体片段，所述可溶性受体片段例如可以选自：DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、EphB4、EGFR、HER-2、ErbR3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、 PDGFR-B、TEK、Tie-1、HGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3及其等位基因变体。在一个具体实施方案中，所述血管新生抑制剂是抑制血管新生的受体VEGFR和FGFR。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种(优选两种或三种)血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，所述至少两个血管新生抑制单元包括至少一个衍生自VEGFR胞外区的血管新生抑制单元和至少一个衍生自FGFR胞外区的血管新生抑制单元，优选地所述VEGFR胞外区是VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3胞外区，所述FGFR胞外区是FGFR1和/或FGFR2胞外区。
在另一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种(优选两种或三种)血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，其中所述至少两个血管新生抑制单元包括一个衍生自VEGFR1和/或VEGFR2胞外区的血管新生抑制单元和一个衍生自FGFR1胞外区的血管新生抑制单元。
在又一些实施方案中，所述衍生自VEGFR(如VEGFR1和/或VEGFR2)胞外区的部分包含选自下列的一项或多项或者由其组成：VEGFR(如VEGFR1或VEGFR2)的第一Ig样结构域或其一部分、VEGFR(如VEGFR1或VEGFR2)第二Ig样结构域或其一部分、VEGFR(如VEGFR1或VEGFR2)第三Ig样结构域或其一部分、VEGFR(如VEGFR1或VEGFR2)第四Ig样结构域或其一部分、VEGFR(如VEGFR1或VEGFR2)第五Ig样结构域或其一部分、VEGFR(如VEGFR1或VEGFR2)第六Ig样结构域或其一部分和VEGFR(如VEGFR1或VEGFR2)第七Ig样结构域或其一部分。
在又一些实施方案中，所述衍生自FGFR(如FGFR1)胞外区的部分包含选自下列的一项或多项或者由其组成：FGFR(如FGFR1)第一Ig样结构域或其一部分、源自FGFR(如FGFR1)Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR(如FGFR1)第二Ig样结构域或其一部分和FGFR(如FGFR1)第三Ig样结构域或其一部分。特别地，本发明的融合蛋白所包含的结构域和/或区段等之间可以直接连接和/或通过接头连接。在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白包含所述源自FGFR(如FGFR1)Ig样结构域中间功能性序列区的部分；优选地，所述源自FGFR(如FGFR1)Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒(acidic box，AB)。在一个具体实施方案中，所述源自中间功能性序列区的部分具 有选自以下的序列：与SEQ ID NO：1第134至162位、145至162位或151至162位对应的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含：VEGFR1或VEGFR2的第二Ig样结构域和VEGFR1或VEGFR2的第三Ig样结构域；所述衍生自FGFR(如FGFR1)胞外区的部分包含：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。优选地，所述源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。特别地，所述FGFR例如是FGFR1或FGFR2。
在另一个实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含：VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域；所述衍生自FGFR胞外区的部分包含：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。优选地，所述源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。特别地，所述FGFR例如是FGFR1或FGFR2。
在又一个实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域；所述衍生自FGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：源自FGFRIg样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。优选地，所述源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。特别地，所述FGFR例如是FGFR1或FGFR2。
在一些具体实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分还包含VEGFR1第一Ig样结构域。例如，所述VEGFR1第一Ig样结构域是在VEGFR1第二Ig样结构域之前。优选地，VEGFR1第一Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：2第32至123位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2第32至123位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一些实施方案中，所述衍生自FGFR(如FGFR1)胞外区的部分还包含FGFR第一Ig样结构域或其一部分。优选地，FGFR第一Ig样结构域或其一部分具有：与SEQ ID NO：1第40至118位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1第40至118位的序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或者
与SEQ ID NO：1第77至118位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1第77至118位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些优选实施方案中，VEGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：2第151至214位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2第151至214位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一些优选实施方案中，VEGFR2第三Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：3第224至320位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：3第224至320位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的又一些优选实施方案中，FGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第163至247位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1第163至247位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的再一些优选实施方案中，FGFR1第三Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第270至359位相对应的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO：1第270至359位的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
优选地，本发明的融合蛋白还包含融合伴侣，例如免疫球蛋白Fc区，优选人IgG Fc区，更优选地是人IgG1 Fc区，再优选地其具有：
与SEQ ID NO：7相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：7的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或者
与SEQ ID NO：8相对应的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：8的核苷酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
在又一些实施方案中，本发明的融合蛋白还包含分泌信号肽区，例如VEGFR1信号肽区，优选地所述分泌信号肽区具有SEQ ID NO：2第1至26位的氨基酸序列或者SEQ ID NO：25的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明提供了Fc融合蛋白，所述蛋白包含：
(1)由与SEQ ID NO：9-24任一项所示氨基酸序列有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性；
(2)由与SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性；或者
(3)SEQ ID NO：9-24任一项所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白中所包含的各部分和/或各个结构域从N端到C端的顺序可以是任意的，或者也可以是图1所示的顺序。
在一些实施方案中，本发明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白还包含信号肽(signal peptide，SP)，优选分泌信号肽，例如VEGFR1的信号肽，其具有SEQ ID NO：2第1至26位的氨基酸序列或者SEQ ID NO：25的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。优选地，信号肽在所述融合蛋白的N端。
优选地，本发明的融合蛋白从N端到C端依次包含：衍生自VEGFR胞外区的部分和衍生自FGFR胞外区的部分。
优选地，在本发明的融合蛋白中，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG Fc区，例如人IgG1 Fc区，更优选地其具有：
与SEQ ID NO：7相对应的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：7的氨基酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或者
与SEQ ID NO：8相对应的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：8的核苷酸序列有至少70％同一性，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区位于融合蛋白的C端。
在本发明的一些实施方案中，VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白中所包含 的各区域和/或各个结构域从N端到C端的顺序可以是任意的。在另一些实施方案中，所述顺序可以是图1所示的顺序。在一些具体实施方案中，从N端向C端，VEGFR部分和FGFR部分可以分别位于对方的上游或下游。此外，所述Fc区可以位于血管新生抑制单元的上游或下游；例如所述Fc区位于融合蛋白的C端区。
在一些实施方案中，本发明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白还包含一个或多个链内二硫键，优选在Ig样结构域中包含一个或多个链内二硫键。
在本发明的一个方面中，VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可通过在原核细胞或真核细胞例如细菌、真菌(如酵母)或哺乳动物细胞系中表达本发明的融合蛋白来产生。特别地，所述哺乳动物细胞系可以是CHO细胞系。在重组蛋白质表达方面，CHO细胞是经常使用的细胞系。而且，还基于大规模表达中多方面的需要改造了原始CHO细胞，从而得到了一系列针对特定表达目的的用于重组蛋白生产的衍生CHO细胞系，例如用于无血清培养等。这些都是在重组蛋白质表达领域公知的。
在又一个方面，本发明的融合蛋白所包含的结构域和/或区域之间直接连接和/或通过接头连接，例如衍生自VEGFR胞外区的部分、衍生自FGFR胞外区的部分和衍生自免疫球蛋白Fc区的部分通过或不通过接头融合。在一个实施方案中，衍生自VEGFR胞外区的部分、衍生自FGFR胞外区的区域和免疫球蛋白Fc区直接连接。在另一个实施方案中，衍生自VEGFR胞外区的部分、衍生自FGFR胞外区的区域和免疫球蛋白Fc区通过接头连接，例如通过(G4S)3接头相连。
另一方面，本发明涉及编码所述融合蛋白的分离的核酸分子。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列。
又一方面，本发明提供了包含所述核酸分子的载体。还提供了用所述载体转化/转染的细胞，优选CHO细胞。
再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白、核酸分子、载体或细胞，以及可药用载体。
本发明还涉及一种生产抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通过在原核细胞或真核细胞例如细菌、真菌(如酵母)或哺乳动物细胞系中表达本发明的融合蛋白来进行。优选地，所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
在另一个方面中，本发明提供了抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的对象施用抑制血管新生有效量的本发明融合蛋白、核酸分子、载体、 细胞或药物组合物。优选地，所述方法在哺乳动物中进行。
在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防肿瘤的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗或预防有效量的本发明融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或药物组合物，优选地所述肿瘤是实体瘤。
在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防眼科血管新生相关疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗或预防有效量的本发明融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或药物组合物，优选地所述眼科血管新生相关疾病选自年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。
在另一方面，本发明提供了一种在体外或在体内结合FGF和/或VEGF的方法，其包括使FGF和VEGF与本发明的融合蛋白相接触。
本发明还涉及本发明的融合蛋白、编码其的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、用所述载体转化/转染的细胞或者包含它们的药物组合物在制备用于抑制血管新生的药物中的用途。另外，本发明还涉及本发明的融合蛋白、编码其的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、用所述载体转化/转染的细胞或者包含它们的药物组合物在制备用于治疗或预防血管新生相关疾病的药物中的用途，优选地所述血管新生相关疾病是肿瘤或者眼中血管新生相关疾病。
考虑到不同国家的专利制度对保护主题有不同规定，本公开内容还提供与以上方法相对应的制药用途以及用于预定用途的药物。这些各种制药用途和药物也在本发明保护范围内，就像它们已经具体记载在本公开内容中一样。
本公开内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本公开内容中具体记载一样。
将结合附图以及以下进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
附图说明
图1是VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白结构示意图，其中VEGFR1、VEGFR2、FGFR1蛋白分别列出。Fc融合蛋白以实线表示，缺失的氨基酸以虚线表示；抗体样结构域用环型表示；不同的抗体样结构域以字母+数字表示，其中VEGFR1的结构域以a1-a7表示，VEGFR2的结构域以b1-b7表示，FGFR1的结构域以c1-c3表示；二硫键以ss表示；人IgG1 Fc用灰色框表示；SP表示信号肽；(G4S)3连接序列以三个黑色菱形框表示；酸性盒序列以带AB字母的方框表示。
图2是不同Fc融合蛋白结合VEGF和FGF-2比较图，其中通过ELISA法检测各Fc融合蛋白(20ng/mL)与包被的VEGF165和/或FGF-2(含100ng/mL Heparin)的结合情况。
图3显示了融合蛋白的SDS-PAGE图。
图4显示了融合蛋白梯度与VEGF(A)和FGF-2(B)的结合。
图5显示了融合蛋白与VEGF(A)和FGF-2(B)的亲和力。
图6显示了融合蛋白对VEGF或FGF-2诱导的HUVEC细胞分裂的影响及其相对抑制率。其中图A为融合蛋白对VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的影响，图B为融合蛋白对VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的相对抑制率，图C为融合蛋白对FGF2诱导的HUVEC细胞增殖的影响，图D为融合蛋白对FGF2诱导的HUVEC细胞增殖的相对抑制率。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如 1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
本文使用的术语“Fc”、“Fc区”、“Fc片段”或“免疫球蛋白Fc区”等表示免疫球蛋白的可结晶片段，在本发明中，所述Fc区优选人IgG1的Fc区。
术语“Fc融合蛋白”指将异源蛋白质的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能相结合的抗体样分子。从结构上来说，Fc融合蛋白包含具有所需结合特异性的氨基酸序列以及免疫球蛋白恒定结构域序列。Fc融合蛋白分子通常包含受体或配体的结合位点。所述免疫球蛋白恒定结构域序列可以获得自任何免疫球蛋白，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。
本文使用的术语“可溶性”蛋白是指在生物学相关的温度、pH水平和渗透压下可溶于水溶液的蛋白。本文使用的“可溶性融合蛋白”表示该融合蛋白不包含跨膜区和胞内区。
如本文所用，术语“分离的”是指以下物质和/或实体，(1)与起初产生时(在天然环境中和/或在试验设置中)和其相关联的至少一些组分相分离和/或(2)通过人工生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本100％或100％的其初始相关联的其他组分相分离。
术语“部分”和“片段”可互换的指代多肽、核酸或其它分子构建物的一部分。
本文使用的术语“VEGFR”是指血管内皮生长因子受体，其可以是VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3。优选地，本发明中的VEGFR是VEGFR1和/或VEGFR2，优选人的VEGFR。
本文使用的术语“FGFR”是指成纤维细胞生长因子受体，其可以是FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4。优选地，本发明中的FGFR是FGFR1，更优选人FGFR1。
本文使用的术语“Ig样结构域”表示免疫球蛋白样结构域，其可见 于多种蛋白质家族，参与多种生物学功能，包括细胞-细胞识别、细胞表面受体、免疫功能等等。
本文使用的术语“VEGFR第一Ig样结构域”表示VEGFR蛋白中自N端起第一个Ig样结构域，优选VEGFR1蛋白自N端起第一个Ig样结构域(本文称为VEGFR1第一Ig样结构域)或VEGFR2蛋白自N端起第一个Ig样结构域(本文称为VEGFR2第一Ig样结构域)，具有例如SEQ ID NO：2第32至123或SEQ ID NO：3第46至110位的氨基酸序列。类似地，VEGFR第二Ig样结构域具有例如SEQ ID NO：2第151至214位或SEQ ID NO：3第141至207位的氨基酸序列，VEGFR第三Ig样结构域具有例如SEQ ID NO：2第230至327位或SEQ ID NO：3第224至320位的氨基酸序列，VEGFR第四Ig样结构域具有例如SEQ ID NO：2第335至421位或SEQ ID NO：3第328至414位的氨基酸序列，VEGFR第五Ig样结构域例如具有SEQ ID NO：2第428至553位或SEQ ID NO：3第421至548位的氨基酸序列，VEGFR第六Ig样结构域具有例如SEQ ID NO：2第556至654位或SEQ ID NO：3第551至660位的氨基酸序列，VEGFR第七Ig样结构域具有例如SEQ ID NO：2第661至747位或SEQ ID NO：3第667至753位的氨基酸序列。优选地，所述VEGFR可以是VEGFR1或VEGFR2。
本文使用的术语“FGFR第一Ig样结构域”或“FGFR1第一Ig样结构域”表示FGFR或FGFR1蛋白中自N端起第一个Ig样结构域，其具有例如SEQ ID NO：1第40至118位的氨基酸序列。类似地，术语“FGFR第二Ig样结构域”或“第二Ig样结构域”表示FGFR蛋白中自N端起第二个Ig样结构域，其具有例如SEQ ID NO：1第163至247位的氨基酸序列；术语“FGFR第三Ig样结构域”或“第三Ig样结构域”表示FGFR蛋白中自N端起第一个Ig样结构域，其具有例如SEQ ID NO：1第270至359位的氨基酸序列。优选地，所述FGFR是FGFR1，FGFR第一Ig样结构域是FGFR1第一Ig样结构域，FGFR第二Ig样结构域是FGFR1第二Ig样结构域，FGFR第三Ig样结构域是FGFR1第三Ig样结构域。
本文使用的术语“FGFR Ig样结构域中间功能性序列区”或“中间功能性序列区”表示FGFR蛋白中第一Ig样结构域和第二Ig样结构域之间的序列，优选地，IFS序列具有对应于SEQ ID NO：1第118至162位的氨基酸序列。本发明人出乎意料地发现，所述中间功能性序列区对于Ig样结构域的功能具有显著的影响。所述FGFR蛋白优选FGFR1(SEQ ID NO：1)，特别是人FGFR1蛋白。人FGFR1蛋白的氨基酸序列参见SEQ ID NO：1，其cDNA序列参见SEQ ID NO：4。
下面给出hFGFR1的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，可参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH15035.1
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVE 
SDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPVAPYWTSPEKMEKK 
RSPHRPILQAGLPANKTVALGS 
LEER
FGFR1的氨基酸序列参见SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列参见SEQ ID NO：4。
下面给出hVEGFR1的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，各结构域之间为天然连接序列，可参见
http://www.uniprot.org/uniprot/P17948：
SKLKD 
IYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTE 
LYKTNYLTHRQTNTI 
IYDKAFI 
LIVNVK 
DV 
IRDQEA 
VQGTSDKSNLE
VEGFR1的氨基酸序列参见SEQ ID NO：2，其编码核苷酸序列参见SEQ ID NO：5。
下面给出hVEGFR2的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，各结构域之间为天然连接序列，可参见
http://www.uniprot.org/uniprot/P35968
ASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKA 
ASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITE 
SYQSIMYIVVVVGYRI 
FVRVHEK 
LVVYVP 
RG 
VLERVA 
IEGAQEKTNLE
VEGFR2的氨基酸序列参见SEQ ID NO：3，其编码核苷酸序列参见SEQ ID NO：6。
本文使用的术语“血管新生抑制单元”是指具有血管新生抑制功能的多肽区段、部分、基序、结构域等。血管新生抑制单元可以指本发明融合蛋白中的任何一段氨基酸序列，只要其具有血管新生抑制能力。例如，本发明的血管新生抑制单元可包括衍生自VEGFR胞外区的部分、衍生自FGFR胞外区的部分等。
本文所用的术语“简并变体”表示所述简并变体包含氨基酸密码子第三位的简并变化使得所述简并变体编码相同氨基酸，例如在三联体密码的摆动位置(wobble position)包含一个或多个改变的变体，也称为同义变体。
本文所用的术语“等位基因变体”表示出现在染色体特定位置的两个或多个基因。
本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。
本文使用的术语“一致性”、“百分比一致性”、“同源性”或“同一性”指两个氨基酸序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可以通过比对两个序列来确定百分比一致性，百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基(即氨基酸或核苷酸)的数量。可使用本领域的标准算法(例如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482；Needleman和Wunsch，1970，J.MoI.Biol.48：443；Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：2444)或者通过这些算法的计算机化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，WI)进行序列比对和比较，所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院(Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各个程序(例如BLASTN，在美国国家生物技术信息中心的因特网站点上可用)的缺省参数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为1的GCG来确定两个序列的百分比同一性，使得每个氨基酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序(2.0版)，其是GCG(Accelrys，San Diego，CA)序列比对软件包的一部分。
本文使用的术语“杂交”指两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定双链多核苷酸的过程。术语“杂交”还可以指三链杂交。所产生的(通常是) 双链的多核苷酸为“杂交体”或“双链体”。“杂交条件”一般包括低于约1M、更通常低于约500mM和低于约200mM的盐浓度。杂交温度可以低至5℃，但通常高于约22℃，更通常高于约30℃，优选高于约37℃。杂交通常在严格条件(即探针会与其靶序列杂交的条件)下进行。严格杂交条件取决于序列，并在不同的情况下存在差异。较长的片段可能需要较高的杂交温度来进行特异性杂交。由于其他因素(包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配程度)可能影响杂交的严格度，因此参数的组合比任何一个单独参数的绝对值更为重要。一般而言，将严格条件选择成比确定的离子强度和pH下该特定序列的Tm低约5℃。示例性严格条件包括pH7.0至8.3下至少0.01M至不高于1M的Na离子浓度(或其他盐)和至少25℃的温度。对于严格条件，参阅如Sambrook，Fritsche和Maniatis.“Molecular Cloning A laboratory Manual”第二版Cold Spring Harbor Press(1989)以及Anderson“Nucleic Acid Hybridization”第一版，BIOS Scientific Publishers Limited(1999)，它们对于所有上述目的均通过参考整体并入本文。
本文使用的术语“接头”、“肽接头”、“连接序列”或“接头序列”表示将本发明融合蛋白所包含的各个结构域和/或区域相连接的短氨基酸序列，其一般为0-20个氨基酸长，优选2-10个氨基酸。
本文使用的术语融合蛋白或部分或结构域“与SEQ ID NO：N对应的氨基酸序列”表示，所述融合蛋白或部分或结构域具有基本上如SEQ ID NO：N所示的氨基酸序列，优选地其中含有不超过1、2、3、4、5、10或20个氨基酸替换、添加或缺失，又优选地所述融合蛋白或部分或结构域具有与SEQ ID NO：N所示氨基酸序列至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％的同一性，更优选地，所述融合蛋白或部分或结构域具有SEQ ID NO：N所示氨基酸序列。
本文使用的术语“VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白”表示包含衍生自VEGFR胞外区的部分、衍生自FGFR胞外区的部分和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白。在一些实施方案中，衍生自VEGFR胞外区和衍生自FGFR胞外区的部分可：(1)具有SEQ ID NO：9的1-443位、SEQ ID NO：10的1-364位、SEQ ID NO：11的1-379位、SEQ ID NO：12的1-531位、SEQ ID NO：13的1-611位、SEQ ID NO：14的1-531位、SEQ ID NO：15的1-312位、SEQ ID NO：16的1-611位、SEQ ID NO：17的1-207位、SEQ ID NO：18的1-665位、SEQ ID NO：19的1-610位、SEQ ID NO：20 的1-611位、SEQ ID NO：21的1-580位、SEQ ID NO：22的1-540位、SEQ ID NO：23的1-542位和SEQ ID NO：24的1-435位中任一项所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO：26的1-1326位、SEQ ID NO：27的1-1092位、SEQ ID NO：28的1-1137位、SEQ ID NO：29的1-1593位、SEQ ID NO：30的1-1833位、SEQ ID NO：31的1-1593位、SEQ ID NO：32的1-936位、SEQ ID NO：33的1-1833位、SEQ ID NO：34的1-621位、SEQ ID NO：35的1-1995位、SEQ ID NO：36的1-1830位、SEQ ID NO：37的1-1833位、SEQ ID NO：38的1-1740位、SEQ ID NO：39的1-1620位、SEQ ID NO：40的1-1626位和SEQ ID NO：41的1-1305位中任一项所示核苷酸序列编码；(2)包含与SEQ ID NO：9的1-443位、SEQ ID NO：10的1-364位、SEQ ID NO：11的1-379位、SEQ ID NO：12的1-531位、SEQ ID NO：13的1-611位、SEQ ID NO：14的1-531位、SEQ ID NO：15的1-312位、SEQ ID NO：16的1-611位、SEQ ID NO：17的1-207位、SEQ ID NO：18的1-665位、SEQ ID NO：19的1-610位、SEQ ID NO：20的1-611位、SEQ ID NO：21的1-580位、SEQ ID NO：22的1-540位、SEQ ID NO：23的1-542位和SEQ ID NO：24的1-435位中任一项所示氨基酸序列有至少70％同一性的氨基酸序列或由其组成，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性；或者(3)包含由与SEQ ID NO：26的1-1326位、SEQ ID NO：27的1-1092位、SEQ ID NO：28的1-1137位、SEQ ID NO：29的1-1593位、SEQ ID NO：30的1-1833位、SEQ ID NO：31的1-1593位、SEQ ID NO：32的1-936位、SEQ ID NO：33的1-1833位、SEQ ID NO：34的1-621位、SEQ ID NO：35的1-1995位、SEQ ID NO：36的1-1830位、SEQ ID NO：37的1-1833位、SEQ ID NO：38的1-1740位、SEQ ID NO：39的1-1620位、SEQ ID NO：40的1-1626位和SEQ ID NO：41的1-1305位中任一项所示核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列或由其组成，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性。
在本发明的一些优选实施方案中，VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可：(1)具有SEQ ID NO：9-24任一项所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列编码；(2)包含与SEQ ID NO：9-24任一项所示氨基酸序列有至少70％同一性的氨基酸序列或由其组成，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性；或者(3)包含由与SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列或由其组成，优选地至少80％、90％、93％、95％、 97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，所述VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可由核酸编码，所述核酸包含其互补物在严格杂交条件下与SEQ ID NO：26-41任一项所示的核苷酸序列杂交的序列，或者包含SEQ ID NO：26-41任一项所示的核苷酸序列的简并变体。在一些优选实施方案中，所述VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白中衍生自免疫球蛋白Fc区的部分可由核酸编码，所述核酸包含其互补物在严格杂交条件下与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列杂交的序列，或者包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的简并变体。
在又一些优选实施方案中，所述VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白包括VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白变体，其包括在对应于SEQ ID NO：26-41任一项所示的氨基酸序列中含有不超过2、3、4、5、10、20、30或50个氨基酸替换、添加或缺失的变体，所述变体优选保持抑制血管新生的能力。在一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于衍生自VEGFR胞外区的部分。在另一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于衍生自FGFR胞外区的部分。在另一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于衍生自免疫球蛋白Fc区的部分。在又一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于接头或连接部分。
VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白还可包含除了衍生自FGFR胞外区的部分中以及衍生自免疫球蛋白Fc区的部分中天然存在的修饰之外的翻译后修饰。这样的修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。结果，经修饰的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可包含非氨基酸组分，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖以及磷酸。这样的非氨基酸组分对VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白功能的作用可如本文针对其它VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白变体所述的那样进行测试。当VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白在细胞中产生时，翻译后加工对于正确折叠和/或蛋白质功能可能也是重要的。不同的细胞(例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)拥有针对这些翻译后活性的特定细胞机器和特有机制，并且可以选择不同的细胞以确保VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白的正确修饰和加工。
本文所述的融合蛋白可通过任何本领域已知的方法产生。例如化学合成或从核酸表达来产生。可根据本领域已知的完善的标准液体或优选固相肽合成方法容易地制备用于本发明的肽(参见，例如J.M.Stewart和J. D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd edition，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)，in M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York(1984))。可以使用本领域已知技术产生所述融合蛋白以在位于预期包含在所述蛋白中的多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一个或多个分子内交联(参见例如美国专利No.5478925)。另外，本文所述蛋白质可以通过在所述蛋白质的C端或N端添加半胱氨酸或生物素进行常规修饰。
本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
在一个方面，本发明提供了抑制血管新生的融合蛋白，其包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的血管新生抑制单元。优选地，所述至少两种血管新生抑制剂是抑制血管新生的受体，所述受体例如可以选自：DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、Tie-1、HGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Notch受体、LK8、血管抑制素(angiostatin)、血管内皮抑制素(endostatin)、纤溶酶原(plasminogen)、胶原XVIII及其等位基因变体。在一个具体实施方案中，所述血管新生抑制剂是抑制血管新生的受体VEGFR和FGFR。
特别地，本发明人构建了一系列VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白，其可以高亲和力结合VEGF和FGF，并有效地抑制VEGF和FGF诱导的细胞分裂。
在一些实施方案中，本发明人还出人意料地发现，从N端到C端依次包含衍生自VEGFR胞外区的部分和衍生自FGFR胞外区的部分的融合蛋白具有特别好的结合VEGF和FGF性质，优选地所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含VEGFR1第一Ig样结构域、VEGFR1第二Ig样结构域和VEGFR2第三Ig样结构域，更优选地所述衍生自FGFR胞外区的部分包含源自FGFR1 Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR1第二Ig样结构域、FGFR1第三Ig样结构域。更优选地，所述源自FGFR1 Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒，更优选地，其具有与SEQ ID NO：1第134至162位、145至162位或151至162位对应的氨基 酸序列。
在一些实施方案中，本发明包括下列项在制备用于治疗血管新生所介导或与其相关之疾病的组合物或药物中的用途，所述项即：(i)VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白；或者(ii)编码此融合蛋白的多核苷酸。例如，在一个实施方案中，本发明包括下列项在制备用作血管新生抑制剂的药物中的用途，所述项即：(i)VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白；或者(ii)编码此融合蛋白的多核苷酸。
在一些实施方案中，本发明VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可通过在哺乳动物细胞系中表达SEQ ID NO：26-41任一项的核酸来产生。特别地，所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
另外，本发明还提供了如下所述的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白，其中衍生自VEGFR胞外区的部分、衍生自FGFR胞外区的部分和衍生自免疫球蛋白Fc区的部分通过或不通过接头相连。
在另一些实施方案中，本发明包括编码VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白的分离的核酸分子，本发明还包括这些分子在制备药物中的用途。所述核酸可以是重组、合成或通过本领域任何可用的方法产生的，所述方法包括使用标准技术的克隆。
在又一些实施方案中，本发明包括含有本发明的分离核酸分子的载体。所述载体可以是表达载体，所述核酸有效连接到能够提供所述核酸在宿主细胞中表达的控制序列。可使用多种载体。例如，合适载体可包括病毒(例如痘病毒、腺病毒、杆状病毒等)；酵母载体、噬菌体、染色体、人工染色体、质粒、粘粒。
在一些实施方案中，本发明还包括转染了这些载体的细胞，使得表达VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。适用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。它们包括细菌，例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可使用的哺乳动物细胞系包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞、猴和人细胞系以及其衍生细胞系，等等。
在另一个方面中，本发明提供了抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。优选地，所述方法在哺乳动物中进行。
在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防肿瘤的方 法，其包括向有此需要的对象施用本发明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白，优选地其中所述肿瘤是实体瘤。
在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防眼中血管新生相关疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白，优选地所述眼中血管新生相关疾病是年龄相关黄斑变性和糖尿病性视网膜病变。
本发明还涉及VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白在制备用于抑制血管新生的药物中的用途。另外，本发明还涉及VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白在制备用于治疗或预防血管新生相关疾病的药物中的用途，优选地所述血管新生相关疾病是肿瘤或者眼科血管新生相关疾病。
本发明中所述血管新生相关疾病包括但不限于血管新生依赖性癌症，其包括例如实体瘤、血源性肿瘤(例如白血病)和肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤(acoustic neuroma)、神经纤维瘤(neurofibroma)、沙眼(trachoma)和化脓性肉芽肿(pyogenic granuloma)；类风湿性关节炎；银屑病；红变(rubeosis)；奥斯勒-韦伯综合征(Osler-Webber Syndrome)；心肌血管新生(myocardial angiogenesis)；动脉粥样斑块新血管形成(plaque neovascularization)；毛细血管扩张(telangiectasia)；血友病性关节(hemophiliac joint)和血管纤维瘤(angiofibroma)。
在所述方法的一些实施方案中，可一起(同时)或在不同时间(依次地)施用一种或多种VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。另外，所述融合蛋白可与另一类治疗癌症或抑制血管新生的药物一起施用。
在一些实施方案中，本公开的主题方法可单独使用。或者，可将所述主题方法与其它用于治疗或预防增殖性疾病(例如肿瘤)的常规抗癌治疗法组合使用。例如，这些方法可用于预防癌症、预防癌症复发和手术后转移，以及作为其它癌症治疗的辅助手段。本公开表明，可通过使用目标多肽治疗剂来增强常规癌症治疗(例如，化疗、放疗、光疗、免疫疗法和手术)的有效性。
在眼中，血管新生与例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)、年龄相关黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶状体后纤维增生症(retrolental fibroplasia)有关。本文公开的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可在眼内施用或通过其它途径施用。与眼中血管新生有关的其它疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎 (epidemic keratoconjunctivitis)、维生素A缺乏症(Vitamin A deficiency)、隐形眼镜过戴(contact lens overwear)、特应性角膜炎(atopic keratitis)、上边缘角膜炎(superior limbic keratitis)、干燥性翼状胬肉角膜炎(pterygium keratitis sicca)、舍格伦病(sjogren)、玫瑰痤疮(acne rosacea)、小水疱病、梅毒(syphilis)、分支杆菌感染(Mycobacteria infection)、脂质变性(lipid degeneration)、化学烧伤(chemical bum)、细菌性溃疡(bacterial ulcer)、真菌性溃疡(fungal ulcer)、单纯疱疹感染(Herpes simplex infection)、带状疱疹感染(Herpes zoster infection)、原生动物感染(protozoan infection)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、莫伦溃疡(Mooren ulcer)、Terrie角膜边缘性变性(Terrien’s marginal degeneration)、边缘性角质分离(mariginal keratolysis)、类风湿性关节炎、系统性狼疮(systemic lupus)、多动脉炎(polyarteritis)、创伤(trauma)、韦格纳结节病(Wegeners sarcoidosis)、巩膜炎(Scleritis)、史-约病(Steven′s Johnson disease)、类天疱疮放射状角膜切开术(periphigoid radial keratotomy)和角膜移植排斥(comeal graph rejection)、镰状细胞贫血(sickle cell anemia)、结节病(sarcoid)、弹性假黄瘤(pseudoxanthoma elasticum)、佩吉特病(Pagets disease)、静脉阻塞(vein occlusion)、动脉阻塞(artery occlusion)、颈动脉阻塞性疾病(carotid obstructive disease)、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎(chronic uveitis/vitritis)、分支杆菌感染(mycobacterial infections)、莱姆病(Lyme′s disease)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis)、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)、伊尔斯病(Eales disease)、白塞病(Bechets disease)、导致视网膜炎(retinitis)或脉络膜炎(choroiditis)的感染、假定的眼组织胞浆菌病(presumed ocular histoplasmosis)、贝斯特病(Bests disease)、近视(myopia)、视凹(optic pit)、斯达加特病(Stargarts disease)、睫状体平坦部炎(pars planitis)、慢性视网膜脱落(chronic retinal detachment)、高粘滞综合征(hyperviscosity syndromes)、弓形体病(toxoplasmosis)、创伤(trauma)和激光手术后并发症(post-laser complication)。其它疾病包括但不限于与红变(角新生血管(neovasculariation of the angle))有关的疾病以及由纤维血管(fibrovascular)或纤维组织(fibrous tissue)异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病(vitreoretinopathy)。
施用
本发明中的融合蛋白可以单独施用，但优选地作为药物组合物施用， 其通常包括根据施用的计划方式所选的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体。融合蛋白可以通过任何适合的方式适用于需要治疗的患者。精确的计量将取决于多个因素，包括该融合蛋白精确的性质。
一些合适的使用方式包括(但不限于)口服、直肠、鼻部、局部(包括口腔和舌下)、皮下、阴道或胃肠外的(包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内和硬脑膜外)施用。
对于静脉注射和在病痛位置的注射，活性成分将为一种胃肠外接受的水溶液形式，其不含热源并具有合适的pH值、等张性和稳定性。
本领域中相关技术人员可使用适当的溶剂或制剂配制融合蛋白，例如：等张赋形剂如氯化钠注射液、林格氏注射液，乳酸林格氏注射液。根据要求，可以加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或口服液等形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
以上所提到的技术和方案的例子以及其它一些根据本发明所使用的技术和方案可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.(ed)，1980.中找到。
融合蛋白质的克隆和表达质粒构建
VEGF受体和FGF受体片段通过PCR从相应受体的cDNA模板扩增获得，IgG1 Fc片段通过PCR方法从人源IgG1的cDNA扩增获得。在设计PCR引物时，在不同的片段间引入连接序列，使不同片段最后可以通过重叠PCR相连接，形成不同融合蛋白的阅读框，同时在cDNA的两端分别加上BspE I、Pst I内切酶的位点。不同融合蛋白的cDNA经过BspE I、Pst I酶切后可以克隆到表达质粒。克隆后的质粒经过内切酶消化、电泳鉴定，最后经过DNA测序确定。
在本发明中构建2#、4#、7#、9#、10#、11#、12#、14#、15#、16#、20#、21#、24#、25#、27#、28#重组表达质粒：
其中2#、4#、7#融合蛋白包含VEGFR1部分胞外结构域、FGFR1部分胞外结构域和IgG1 Fc；9#、10#、16#、20#、21#、24#、25#、28#由VEGFR1部分胞外结构域、VEGFR2部分包含胞外结构域、FGFR1部分胞外结构域和IgG1 Fc，以上11个重组表达质粒使用相同的FGFR1 胞外结构域下游引物(2#-FGFR1下游引物：GTTTTGTCCTCCAGGTACAGGGGCGAGGTC)、IgG1 Fc的上游引物(CTGTACCTGGAGGACAAAACTCACACATGC)和IgG1 Fc下游引物(GATATCTGCAGTCATTTACCCGGAGACAGG)。
其余使用的引物如下：
2#融合蛋白：
2#-VEGFR1上游引物：
ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG
2#-VEGFR1下游引物：
CCTGTGATGCGGGTGCGATTTTTTTCATCAGGGTAACTCC
2#-FGFR1上游引物：
CTGATGAAAAAAATCGCACCCGCATCACAG
4#融合蛋白：
4#VEGFR1上游引物同2#：2#-VEGFR1上游引物
4#-VEGFR1下游引物：
TTTTTCATCAGGGTAACTCCAGGTCATTTG
4#FGFR1上游引物：
GGAGTTACCCTGATGAAAAACCAGAAAAGATGGAAAAGAAAT
4#FGFR1下游引物同2#：2#-FGFR1下游引物
7#融合蛋白：
7#VEGFR1上游引物同2#：2#-VEGFR1上游引物
7#VEGFR1下游引物：
ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCACCACCTTTTTCATCAGGGTAACTCCAG
7#FGFR1上游引物：
AGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCCCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTG
7#FGFR1下游引物同2#：2#-FGFR1下游引物
9#融合蛋白：9#融合蛋白包含VEGFR1D1、VEGFR1D2、 VEGFR2D3、FGFR、Fc五段。
以pBLAST45-hFLT1s7cDNA扩增VEGFR1D1，引物：
9#-VEGFR1D1上游引物：
TAGTTCCGGAAGCAAATTAAAAGATCCTGAACTGAG
9#-VEGFR1D1下游引物：
ATCTCTACGAAAGGTCTACCTGTATCACTAATAAATATATAG
以pBLAST45-hFLT1s7cDNA扩增VEGFR1D2，引物：
9#-VEGFR1D2R2D3上游引物：GGTAGACCTTTCGTAGAGATGT
9#-VEGFR1D2下游引物：
CATGAGACGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGTTTG
以pBLAST45-hFLK1s7为模板扩增VEGFR2D3，引物：
9#-VEGFR2D3上游引物：
CAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG
9#-VEGFR1D2R2D3下游引物：AGGTTTTTCATGGACCCTGAC
9#FGFR1上游引物：
TCAGGGTCCATGAAAAACCTCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGC
10#融合蛋白：
10#VEGFR1段结构域序列PCR引物同9#
10#-FGFR1上游引物：
TCAGGGTCCATGAAAAACCTAAAAATCGCACCCGCATCACAGG
16#融合蛋白：
16#VEGFR1D1上游引物同9#-VEGFR1D1上游引物
16#VR1D2R2D3R下游引物同9#-VR1D2R2D3R游引物
16#FGFR1上游引物：
GTCAGGGTCCATGAAAAACCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTG
20#融合蛋白：
20#-VEGFR1D1上游引物同9#-VEGFR1D1上游引物
20#-VR1D2R2D3R下游引物同9#-VR1D2R2D3R游引物
20#-FGFR1上游引物：
CCTGTGATGCGGGTGCGATTAGGTTTTTCATGGACCCTGAC
21#融合蛋白：
21#以10#为模板，使用如下引物将10#FGFR1D1h中的一个碱基，使Cys变成Ser：
21#-mutF：
CTCCGGCCTCTATGCTTCCGTAACCAGCAGCCCCTC
21#-mutR：
GAGGGGCTGCTGGTTACGGAAGCATAGAGGCCGGAG
24#融合蛋白：
24#VEGFR1D1上游引物同9#-VEGFR1D1上游引物
24#VR1D2R2D3R下游引物同9#-VR1D2R2D3R游引物
24#FGFR1上游引物：
TCAGGGTCCATGAAAAACCTTCGGGCAGTGACACCACCTAC
25#融合蛋白：
25#VEGFR1D1上游引物同9#-VEGFR1D1上游引物
25#VR1D2R2D3R下游引物同9#-VR1D2R2D3R游引物
25#FGFR1上游引物：
TCAGGGTCCATGAAAAACCTAACCCCGTAGCTCCATATTGG
28#融合蛋白：
28#以25#为模板上游引物使用2#-VEGFR1上游引物和IgG1 Fc下游引物进行PCR。
11#、14#、27#包含FGFR1部分胞外结构域、VEGFR1部分胞外结构域、VEGFR2部分胞外结构域和IgG1 Fc。以上3个重组表达质粒使用相同的IgG1 Fc的上游引物和IgG1 Fc下游引物。
其余使用的引物如下：
11#融合蛋白：
11#-FGFR1上游引物：
CTAGCTCCGGACCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGC
11#-FGFR1下游引物：
TCAGGATCTTTTAATTTTGACTCCAGGTACAGGGGCGAGGTC
11#-VEGFR1D1上游引物：TCAAAATTAAAAGATCCTGAACTG
11#-VEGFR1D1下游引物：同9#-VEGFR1D1下游引物：
11#VEGFR1D2R2D3上游引物同9#-VR1D2R2D3上游引物
11#VEGFR1D2D3下游引物：
TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGTTTTTCATGGACCCTGAC
14#融合蛋白：
14#-FGFR1上游引物：
TAGTTCCGGAAAAAATCGCACCCGCATCACAG
14#FGFR1下游引物同11#-VEGFR1D1下游引物
14#VEGFR1D1上游引物同11#-VEGFR1D1上游引物
14#VEGFR1D1下游引物同9#-VEGFR1D1下游引物
14#VEGFR1D2R2D3上游引物同9#-VEGFR1D2R2D3上游引物
14#VEGFR1D2R2D3下游引物同11#-VEGFR1D2R2D3下游引物
27#融合蛋白：
27#以14#为模板上游引物使用27#-FGFR1上游引物(TAGTTCCGGAAAACCTAACCCCGTAGCTCCAT)和IgG1 Fc下游引物进行PCR：
12#融合蛋白包含VEGFR1部分胞外结构域、VEGFR2部分胞外结构域和IgG1 Fc。使用引物如下：
12#上游引物同9#-FGFR1上游引物
12#VEGFR2下游引物同11#VEGFR1D2D3下游引物
Fc上游引物1：FcFor1：GACAAAACTCACACATGCCCACC
Fc下游引物：同上述IgG1 Fc下游引物。
15#融合蛋白包含VEGFR1部分胞外结构域和IgG1 Fc。使用引物如下：
15#上游引物同2#-VEGFR1上游引物：
ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG
15#VEGFR2下游引物同11#VEGFR1D2D3下游引物
Fc上游引物1：FcFor1：GACAAAACTCACACATGCCCACC
Fc下游引物：同上述IgG1 Fc下游引物。
融合蛋白质的表达与纯化
本发明的融合蛋白可通过本领域常用的技术表达和纯化。用Qiagen的质粒提纯试剂盒(MAX)提纯相应融合蛋白质粒的DNA，用紫外分光光度法确定质粒DNA的浓度，用FUGENE 6脂质体(Roche)将质粒转染CHO细胞。转染的具体方法按照产品说明。根据蛋白表达量的要求不同，本研究采用两种表达方法进行蛋白表达：第一种是瞬时表达法，通常在转染48-72小时后收获含有融合蛋白的培养液上清，用人IgG ELISA确定融合蛋白的相对含量，从而快速有效得到融合蛋白；第二种方法是建立稳定细胞系，采用重组蛋白药物表达生产常用的DHFR缺陷型CHO细胞表达系统，基本过程包括细胞的转染、稳转细胞选择、克隆筛选、加压扩增、培养基和工艺优化等，最终实现CHO工程细胞株在无血清培养基中大规模悬浮培养。收集培养产物，用Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶法(SDS-PAGE)分析纯化的蛋白质，然后合并含有所需表达产物的洗脱物，用孔径0.22μm滤膜过滤后，用Lowry法等多种方法进行蛋白定量。本研究的CHO细胞培养体积将达到10升生物反应器规模，纯化获得的融合蛋白能够满足动物试验的蛋白需要，也为将来进一步工艺放大打下基础。
在蛋白水平验证融合蛋白对VEGF和FGF的中和作用
在获得CHO表达的融合蛋白质后，本研究将在蛋白水平上对融合蛋白与VEGF和FGF的结合能力进行评估。本研究使用结合实验和亲和力实验进行验证，结合实验的步骤包括：先在96孔ELISA板上分别包被VEGF和FGF-2后，用BSA封闭包被孔，加入相同浓度的各种融合蛋白，洗涤后再加入抗人IgG Fc-HRP二抗，显色、终止后于酶标板上读取450nm波长的吸光度，根据信号的强弱，筛选与VEGF和FGF-2具有结合能力的融合蛋白。亲和力实验是为了确定融合蛋白在溶液体系中与VEGF或FGF-2的亲和力，首先在96孔ELISA板上分别包被VEGF或FGF-2捕获抗体，用BSA封闭包被孔，然后加入事先配制好且孵育过的融合蛋白 与VEGF或FGF-2的混合液和梯度稀释的标准品，孵育后再加入HRP标记的检测抗体(利用能特异性地检测游离VEGF或FGF-2抗体2)，显色、终止后于酶标板上读取450nm波长的吸光度，从而检测出融合蛋白与VEGF或FGF-2的混合液中游离的VEGF或FGF-2的相对浓度确定。通过以上实验，筛选得到对VEGF和FGF-2具有双重阻断作用的融合蛋白。
在细胞水平验证融合蛋白对VEGF和FGF的中和作用
在蛋白水平确定融合蛋白对VEGF和FGF-2的结合能力后，本研究将从细胞水平进一步验证其对血管新生的抑制作用。本研究用人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)分裂试验和HUEVC细胞迁移试验检验融合蛋白抑制血管内皮细胞分裂、迁移的能力。HUVEC细胞分裂试验能检验融合蛋白抑制HUVEC细胞分裂的能力，实验时，首先在96孔板中每孔接种3000个HUVEC细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养，分别加入VEGF或FGF-2，以及不同浓度的融合蛋白和VEGF或FGF-2的混合液，继续培养3～4天后，加入10％CCK-8继续培养2小时后于酶标板上读取450nm波长的吸光度。可根据吸光度的差异评估其抑制VEGF或FGF-2诱导的血管内皮细胞分裂的能力，并可得出融合蛋白对VEGF或FGF-2抑制的半数有效浓度。HUVEC细胞迁移试验能检验融合蛋白抑制HUVEC细胞迁移的能力，实验时，首先在上室接种50000个HUVEC细胞和不同浓度的融合蛋白，在下室加入600μL含有VEGF或FGF-2的培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养20～24小时后，擦除上室膜正面细胞，固定、染色膜背面细胞，PBS洗涤后于倒置显微镜观察并计数，通过计数位于膜背面的HUVEC细胞数即可知HUVEC细胞受VEGF或FGF-2刺激而迁移的情况，而在培养液加入不同浓度的融合蛋白即可检验融合蛋白抑制血管内皮细胞迁移的能力。通过以上实验，可验证本研究构建的新型融合蛋白抑制VEGF和FGF-2诱导的血管内皮细胞分裂和迁移的能力，同时为进一步的动物试验打下基础。
肿瘤模型验证融合蛋白抑制肿瘤生长的能力
当蛋白水平和细胞水平的试验证明本研究的新型融合蛋白对VEGF和FGF-2信号具有阻断作用后，本研究将在动物肿瘤模型上检验其抗肿瘤能力。本研究将采用血管新生和肿瘤药物研究中常用的模型验证融合蛋白抗血管新生和抗肿瘤效果，例如LLC小鼠肺癌、U87胶质细胞瘤、B16黑色素瘤等。在动物试验中，除了常规的对照组外，还包括同类药物对照， 如VEGF-Trap、FP-1039，以期得到抗肿瘤能力的比较性数据。实验时，100μL适当数量的肿瘤细胞皮下注入C57小鼠的背部后方一侧，每周两次用游标卡尺测量肿瘤的体积，肿瘤长到约200立方毫米时，皮下注射不同浓度的融合蛋白，2～3周后处死小鼠，用游标卡尺测量肿瘤的体积，根据肿瘤的大小验证融合蛋白的抗肿瘤效果。此外，使用免疫组化等方法分析各种肿瘤组织，探讨血管新生的调控机理。
实施例
实施例1：双靶标融合蛋白重组表达质粒的构建
使用商业化的cDNA(PCR Ready First Strand cDNA，来源于成年人结肠癌组织，BioChain公司)作为FGFR1片段的模板。使用商业化质粒pBLAST45-hFLT1s7cDNA(InvivoGen公司)作为VEGFR1段的模板，使用商业化质粒pBLAST45-hFLK1s7(InvivoGen公司)作为VEGFR2段的模板。使用人血RNA抽提试剂盒(QIAGEN)从健康人血液中抽提总RNA。按逆转录试剂盒(Promega公司)的使用说明，用M-MLV逆转录酶(Promega公司)进行RT-PCR，将RNA逆转录为eDNA作为IgG1 Fc片段的模板。RT-PCR根据逆转录试剂盒的使用说明进行，具体步骤为：将Oligo dT、dNTP、总RNA以及DEPC H2O混匀，于70℃反应10分钟后置冰上5分钟，再加入RNA酶抑制剂、M-MLV逆转录酶和反应缓冲液，42℃反应1小时，然后于70℃反应15分钟，获得eDNA可作为模板使用。
以成年人结肠癌组织cDNA为模板通过PCR扩增各个不同的FGFR1片段(引物见下表1)，以商业化质粒为模板扩增不同的VEGFR1和VEGFR2片段(引物参见下表1)，以人血cDNA为模板通过PCR扩增IgG1 Fc片段(引物见下表1和2)。在设计PCR引物时，在VEGFR1片段、VEGFR2片段、FGFR1片段和IgG1 Fc片段间引入20个或以上的互补碱基序列作为连接序列，使各个片段随后可以通过重叠PCR相连接，形成不同融合蛋白的阅读框，同时在PCR产物两端分别加上BspE I和Pst I限制性内切酶的位点。
随后，进行重叠PCR，扩增得到各个FGFR1-Fc融合蛋白片段。PCR的反应条件是：98℃预变性5分钟，98℃变性30秒，然后于56℃退火45秒，并于72℃延伸2分钟，共进行30次循环，最后再延伸10分钟。在设计PCR引物时，在不同的片断间引入连接序列，使不同片断最后可以通过重叠PCR相连接，重叠PCR的反应分为两轮，第一轮含有需连接的 片段而不含有引物，条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性30秒，然后于56℃退火45秒，并于72℃延伸5分钟，共进行6次循环，最后再于72℃延伸10分钟后加入两端引物进行第二轮PCR，反应条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性30秒，然后于56℃退火45秒，并于72℃延伸2分钟，共进行30次循环，最后再于72℃延伸10分钟，从而拼接形成不同融合蛋白的阅读框，同时在cDNA的两端分别加上BspE I和Pst I内切酶的位点。
扩增完成后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化PCR扩增的片段，不同融合蛋白的cDNA和真核表达质粒pSV2-dhfr(ATCC)分别用BspE I、Pst I酶切，经90V电压、1％琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司)回收目的片段后使用连接酶(NEB公司)于16℃连接1小时，将连接反应混合物转化大肠杆菌Top10感受态细菌，转化条件为42℃反应90秒后再置冰上3分钟，加入无菌无抗的LB培养液于37℃、250转/分钟摇床中培养1小时后涂布于含有氨苄霉素的LB平板中，于37℃恒温培养箱中培养过夜，挑取单菌落于含有氨苄霉素的LB培养液于37℃、250转/分钟摇床中培养过夜后使用碱裂解法抽取质粒后使用限制性内切酶酶切后经90V电压、1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，取酶切鉴定正确的重组质粒经DNA测序确定。根据以上步骤，分别构建了2#、4#、7#、9#、10#、11#、12#、14#、15#、16#、20#、21#、24#、25#、27#、28#重组表达质粒。
其中2#、4#、7#融合蛋白包含VEGFR1部分胞外结构域、FGFR1部分胞外结构域和IgG1 Fc，以pBLAST45-hFLT1s7cDNA为模板通过PCR扩增VEGFR1部分胞外结构域，以人结肠癌组织cDNA为模板通过PCR扩增FGFR1部分胞外结构域，以人血cDNA为模板扩增人IgG1 Fc区。然后，通过重叠PCR得到三个片段相连的PCR产物，经过酶切、连接引入表达载体。所用引物见表1。
9#、10#、16#、20#、21#、24#、25#、28#包含VEGFR1部分胞外结构域、VEGFR2部分胞外结构域、FGFR1部分胞外结构域和IgG1 Fc。首先，构建9#构建体，以pBLAST45-hFLT1s7cDNA为模板通过PCR扩增VEGFR1D1片段和VEGFR1D2片段，以pBLAST45-hFLK1s7为模板通过PCR扩增VEGFR2D3片段，以人结肠癌组织cDNA为模板通过PCR扩增FGFR1部分胞外结构域，以人血cDNA为模板扩增人IgG1 Fc区。然后，通过重叠PCR得到五个片段相连的PCR产物，经过酶切、连接引 入表达载体。然后，以9#构建体为模板，通过PCR扩增VEGFR片段，以人结肠癌组织cDNA为模板通过PCR扩增FGFR1部分胞外结构域，以人血cDNA为模板扩增人IgG1 Fc区。然后，通过重叠PCR得到三个片段相连的PCR产物，经过酶切、连接引入表达载体，获得10#、16#、20#、24#、25#构建体。然后，以10#为模板，通过PCR使用表1所示引物突变10#FGFR1D1h中的一个碱基，按照定点突变试剂盒(QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit，STRATAGEN公司)的操作说明，使Cys变成Ser，得到21#构建体，具体构建过程为：在PCR管中加入去离子水、10#质粒、dNTP、表1所示突变引物、反应缓冲液、Pfu酶进行PCR，PCR的反应条件是：95℃预变性2分钟，95℃变性50秒，然后于60℃退火50秒，并于68℃延伸8分钟，共进行18次循环，最后再延伸10分钟，PCR结束后加入1μL Dpn I(NEB公司)于37℃反应1小时，取2μL反应产物转化大肠杆菌Top10感受态细菌，转化条件为42℃反应90秒后再置冰上3分钟，加入无菌无抗的LB培养液于37℃、250转/分钟摇床中培养1小时后涂布于含有氨苄霉素的LB平板中，于37℃恒温培养箱中培养过夜，挑取单菌落于含有氨苄霉素的LB培养液于37℃、250转/分钟摇床中培养过夜后使用碱裂解法抽取质粒后经DNA测序确定。以25#为模板，通过使用2#-VEGFR1上游引物和IgG1 Fc下游引物进行PCR，获得28#构建体。所用引物见表1。
11#、14#、27#包含FGFR1部分胞外结构域、VEGFR1部分胞外结构域、VEGFR2部分胞外结构域和IgG1 Fc。以人结肠癌组织cDNA为模板通过PCR扩增FGFR1部分胞外结构域，以9#构建体为模板，通过PCR扩增VEGFR片段，以人血cDNA为模板扩增人IgG1 Fc区。然后，通过重叠PCR得到三个片段相连的PCR产物，经过酶切、连接引入表达载体，从而构建得到11#和14#构建物。然后以14#构建物为模板，通过PCR扩增得到27#构建物。所用引物见表1。
12#融合蛋白包含VEGFR1部分胞外结构域、VEGFR2部分胞外结构域和IgG1 Fc。以9#构建体为模板，以及9#-VEGFR1D1上游引物，11#VEGFR1D2D3下游引物，以人血cDNA为模板扩增人IgG1 Fc区。然后，通过重叠PCR得到两个片段相连的PCR产物，经过酶切、连接引入表达载体，从而构建得到12#。
15#融合蛋白包含VEGFR1部分胞外结构域、VEGFR2部分胞外结构域和IgG1 Fc。以9#构建体为模板，以及2#-VEGFR1上游引物， 11#VEGFR1D2D3下游引物，以人血cDNA为模板扩增人IgG1 Fc区。然后，通过重叠PCR得到两个片段相连的PCR产物，经过酶切、连接引入表达载体，从而构建得到15#。
26#融合蛋白包含FGFR1部分胞外结构域和IgG1 Fc。以人结肠癌组织cDNA为模板通过PCR扩增FGFR1部分胞外结构域，使用SEQ ID NO：73为上游引物，SEQ ID NO：74为下游引物，以人血cDNA为模板扩增人IgG1 Fc区。然后，通过重叠PCR得到两个片段相连的PCR产物，经过酶切、连接引入表达载体，从而构建得到26#。
各个融合蛋白中VEGFR-FGFR-Fc的蛋白质序列和编码其的核苷酸序列在表2中显示。融合蛋白的结构示意图见图1。
表1：构建载体过程中扩增VEGFR和FGFR片段所用的引物
表2：本发明融合蛋白的蛋白质序列和核苷酸序列
| 融合蛋白 | 氨基酸序列 | 核苷酸序列 |
| 2# | SEQ ID NO：9 | SEQ ID NO：26 |
| 4# | SEQ ID NO：10 | SEQ ID NO：27 |
| 7# | SEQ ID NO：11 | SEQ ID NO：28 |
| 9# | SEQ ID NO：12 | SEQ ID NO：29 |
| 10# | SEQ ID NO：13 | SEQ ID NO：30 |
| 11# | SEQ ID NO：14 | SEQ ID NO：31 |
| 12# | SEQ ID NO：15 | SEQ ID NO：32 |
| 14# | SEQ ID NO：16 | SEQ ID NO：33 |
| 15# | SEQ ID NO：17 | SEQ ID NO：34 |
| 16# | SEQ ID NO：18 | SEQ ID NO：35 |
| 20# | SEQ ID NO：19 | SEQ ID NO：36 |
| 21# | SEQ ID NO：20 | SEQ ID NO：37 |
| 24# | SEQ ID NO：21 | SEQ ID NO：38 |
| 25# | SEQ ID NO：22 | SEQ ID NO：39 |
| 26# | SEQ ID NO：71 | SEQ ID NO：72 |
| 27# | SEQ ID NO：23 | SEQ ID NO：40 |
| 28# | SEQ ID NO：24 | SEQ ID NO：41 |
实施例2：融合蛋白的瞬时表达及定量
用MAX质粒提纯试剂盒(Qiagen公司)提纯相应融合蛋白质粒的DNA，用紫外分光光度法确定质粒DNA的浓度，将重组质粒1μg和6μL脂质体(FuGENE 6 Transfection Reagent，Roche公司)于100μL新鲜IMDM培养液(GIBCO公司)中混匀，静置15分钟后加入按细胞密度3×105/mL接种于6孔板过夜培养的CHO细胞(ATCC)中，细胞完全培养液含88％IMDM、10％的FBS、1％HT和1％谷氨酰胺(均为GIBCO公司产品)，于37℃，5％CO2培养箱中培养48小时后收集上清，用人IgG ELISA蛋白定量试剂盒(BETHYL公司)确定CHO分泌表达融合蛋白的相对含量。具体步骤为：将100μL亲和纯化的浓度为10μg/mL抗人IgG-Fc蛋白于96孔ELISA板(IMMULON公司)上包被过夜，用300μLPBST洗涤液洗涤五次后，用200μL新鲜配制的封闭工作液(KPL公司)(封闭存储液液∶PBS＝1∶19)封闭各包被孔，于37℃温育1h，用300μLPBST洗涤液洗涤五次后每孔加入100μL梯度稀释(起点为200ng/mL，用PBS2倍比稀释)的IgG作为标准以及100μL梯度稀释的各种融合蛋白的细胞培养上清(起点为各培养上清，用PBS 5倍比稀释)，于37℃温育2h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后再加入100μL用PBS 1∶10000稀释的抗人IgG Fc-HRP二抗(BETHYL公司)，于37℃温育1h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入100μL显色液(KPL公司)显色、最后加入100μL终止液(KPL公司)终止显示后于将ELISA板置于酶标仪上读取450nm波长的吸光度，根据标准曲线从而可知不同融合蛋白的浓度。
实施例3：融合蛋白的结合实验
使用ELISA方法检测以上构建的融合蛋白与VEGF和FGF-2的结合能力。先在96孔ELISA板(IMMULON公司)上分别包被100μL含有20ng/mL VEGF(R&D Systems公司)和50ng/mL FGF-2(R&D Systems公司)(含100ng/mL肝素(Sigma公司))的溶液，然后300μL PBST洗涤液洗涤五次，用200μL新鲜配制的封闭工作液(KPL公司)(封闭存储液∶PBS＝1∶19)封闭各包被孔，于37℃温育1h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入100μL浓度均为20ng/mL的各种融合蛋白(溶于PBS， pH＝7.2)，于37℃温育2h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后再加入100μL用PBS 1∶10000稀释的抗人IgG Fc-HRP二抗(BETHYL公司)，于37℃温育1h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入100μL显色液(KPL公司)显色、最后加入100μL终止液(KPL公司)终止显示后于将ELISA板置于酶标仪上读取450nm波长的吸光度，融合蛋白结合VEGF或FGF2的能力越强则吸光度越高、信号越强，根据信号的强弱，确定25号、28号融合蛋白具有同时高效结合VEGF和FGF-2的能力。融合蛋白的结合VEGF和FGF-2的比较见图2。
实施例4：融合蛋白的稳定表达与纯化
将具有高效结合能力的25号融合蛋白以及作为对照的12号、15号融合蛋白的重组表达质粒经脂质体(Roche公司)转染DHFR缺陷型CHO细胞(ATCC)。具体地，将重组质粒5μg和30μL脂质体(FuGENE 6Transfection Reagent，Roche公司)于100μL新鲜IMDM培养液(GIBCO公司)中混匀，静置15分钟后加入按细胞密度3×105/mL接种于10cm细胞培养皿(Corning公司)过夜培养的DHFR缺陷型CHO细胞(ATCC)中，细胞完全培养液为含有10％的FBS、1％HT和1％谷氨酰胺的IMDM培养基(均来自GIBCO公司)，于37℃，5％CO2培养箱中培养2～3天后，用胰酶(GIBCO公司)消化细胞，按照3×105/mL接种至含30mL无血清302培养基(SAFC公司)摇瓶中，于100转/分钟，37℃，5％CO2培养箱中筛选培养至细胞密度为106/mL，然后接种3000个细胞于每个10cm细胞培养皿(Corning公司)中(培养液为含有10％的FBS、1％谷氨酰胺IMDM培养基)，于37℃，5％CO2培养箱中培养至形成单克隆，挑选单克隆于96孔细胞培养板(Corning公司)中培养，使用人IgG ELISA蛋白定量试剂盒(BETHYL公司)确定各单克隆分泌表达融合蛋白的相对含量，具体条件和步骤同实施例2中测定融合蛋白的相对含量所述，筛选出表达量最高的克隆至6孔板进行培养至细胞汇合度达到70％左右，用胰酶消化细胞转移至10cm培养皿中培养，加入甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)(Sigma公司)进行逐步加压扩增(MTX浓度分别为10nM，20nM，50nM，100nM，200nM，500nM)。加压扩增结束后，用胰酶消化细胞按3×105/mL上摇瓶培养，测出单细胞表达量，从而获得表达特定融合蛋白的CHO工程细胞株，最终将CHO工程细胞株，在pH 7.0无血清302培养基(SAFC公司)中于37℃，5％CO2，40％溶氧，80转/分钟，大规模悬浮培养，培养体积达到10L。离心收集培养产物，取上清液用0.45μm滤膜(Millipore公司)过滤后，按照Protein A亲和层析柱(GE公司) 的使用手册进行亲和层析，首先使用PBS缓冲液(pH：7.0)平衡Protein A亲和层析柱，然后将上清过柱，再用PBS缓冲液平衡，最后用柠檬酸缓冲液(pH：3.0)进行洗脱，收集洗脱液用孔径0.45μm滤膜过滤，加入S/D(0.3％磷酸三丁酯/1％吐温80)于24℃放置6小时灭活病毒后，再使用分子筛层析进一步纯化目的蛋白，首先将经Protein A亲和层析的洗脱液装入透析袋(Millipore公司)中于PBS缓冲液中透析，再置于10KD超滤杯(Millipore公司)中浓缩蛋白；使用PBS缓冲液平衡分子筛层析柱Superdex 200(GE公司)，然后将超滤杯浓缩后的液体上样后再用PBS缓冲液洗脱，收集洗脱峰。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶法(SDS-PAGE)分析纯化的蛋白(见图3)，然后合并含有所需表达产物的洗脱物，用孔径0.22μm滤膜(Millipore公司)过滤后，用Lowry法等多种方法进行蛋白定量。
实施例5：融合蛋白的梯度结合实验
与实施例3类似地，使用ELISA方法检测以上构建的融合蛋白与VEGF和FGF-2的结合能力。先在96孔ELISA板上分别包被100μL20ng/mL VEGF和50ng/mL FGF-2(R&D Systems公司)后，然后用300μLPBST洗涤液洗涤五次后，用200μL新鲜配制的封闭工作液(KPL公司)(封闭存储液∶PBS＝1∶19)封闭各包被孔，于37℃温育1h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入100μL含不同蛋白量的各种融合蛋白(蛋白起始量为1000000pM，以5倍梯度稀释)，于37℃温育2h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后再加入100μL用PBS 1∶10000稀释的抗人IgG Fc-HRP二抗(BETHYL公司)，于37℃温育2h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入100μL显色液(KPL公司)显色，最后加入100μL终止液(KPL公司)终止显示后将ELISA板置于酶标仪上读取450nm波长的吸光度，根据信号的强弱，确定融合蛋白梯度结合VEGF和FGF-2的能力。12号、15号、25号融合蛋白梯度结合VEGF和FGF-2的比较见图4A。并且，将25号与一种FGFR-Fc融合蛋白(记为26号)进行比较，见图4B。其中26号FGFR-Fc融合蛋白包含FGFR第二Ig样结构域、FGFR第三Ig样结构域和Fc区，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：71，编码核苷酸序列显示于SEQ ID NO：72。所述26号融合蛋白通过如下步骤获得：与实施例1类似地，以成年人结肠癌组织cDNA为模板通过PCR扩增FGFR1片段(引物为SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74)，以人血cDNA为模板通过PCR扩增IgG1 Fc片段(引物为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44)，然后通过重叠PCR相连，克隆到表达载体。本实施例表明，随着本发明 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白摩尔浓度的增加，其结合VEGF和FGF-2的能力越强，表现为在450nm波长下的信号越强，而随着融合蛋白摩尔浓度的梯度稀释，其结合VEGF和FGF-2的能力也相应减弱。
实施例6：融合蛋白的亲和力实验
使用亲和力实验确定融合蛋白在溶液体系中与VEGF或FGF-2的亲和力，首先在96孔ELISA板上分别包被100μL浓度为1.0μg/mL VEGF或100μL浓度为2.0μg/mL FGF-2捕获抗体(R&D Systems公司)，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后，用封闭工作液(KPL公司)封闭各包被孔(参见实施例3)，于37℃温育1h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入事先配制好且孵育过的融合蛋白与FGF-2的混合液和梯度稀释的标准品，具体配制方法如下：12#、15#、25#Fc融合蛋白分别以800000pM为起点(溶于PBS)，10倍梯度稀释，分别与20pM VEGF溶液1∶1混合，即各蛋白起点终浓度为400000pM，VEGF终浓度为10pM；25#、26#Fc融合蛋白分别以200pM为起点(溶于PBS)，2倍梯度稀释，分别与20pM FGF-2溶液1∶1混合，即各蛋白起点终浓度为200pM，FGF-2终浓度为10pM。37℃温育2h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入100μL浓度为100ng/mL VEGF或100μL浓度为250ng/mL FGF-2检测抗体(R&D Systems公司)(能特异性地检测游离的VEGF或FGF-2抗体)，37℃温育2h，用300μL PBST洗涤液洗涤五次后加入HRP标记的链霉亲和素(R&D Systems公司)(用PBS按1∶200稀释)，37℃温育2h，用300μLPBST洗涤液洗涤五次后加入100μL显色液(KPL公司)显色适当时间(约15～30分钟)，最后加入100μL终止液(KPL公司)终止显示后于将ELISA板置于酶标仪上读取450nm波长的吸光度，从而检测出融合蛋白与VEGF或FGF-2的混合液中游离的VEGF或FGF-2的相对浓度确定。12号、15号、25号融合蛋白在溶液体系中与VEGF或FGF-2的亲和力比较见图5。并且，将25号与一种FGFR-Fc融合蛋白(记为26号)进行比较，见图5。其中26号FGFR-Fc融合蛋白包含FGFR第二Ig样结构域、FGFR第三Ig样结构域和Fc区。本实施例表明本发明构建的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白(例如12#、15#和25#)在溶液体系中对VEGF和FGF-2具有高亲和力，且亲和力随着浓度的增加而增加，表现为游离的VEGF和FGF-2的量随着融合蛋白浓度的增加而减少。本发明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白12#、15#和25#在溶液体系中与VEGF或FGF-2的亲和力图见图5。本实施例表明本发明构建的VEGFR-FGFR融合蛋白在溶液体系中对VEGF和FGF-2具有亲和力，且亲和力随着浓 度的增加而增加，表现为游离的VEGF和FGF-2的量越少。
实施例7：人脐带静脉血管内皮细胞分裂抑制试验
使用人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)分裂试验检验融合蛋白抑制血管内皮细胞的分裂能力。使用HUVEC完全培养基(AllCells公司)于37℃，5％CO2培养箱中培养HUVEC细胞(AllCells公司)至细胞对数生长期。用胰酶消化计数HUVEC细胞，按每孔3000个HUVEC细胞接种在96孔板中于含1％FBS的HUVEC基础培养基(AllCells公司)，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，分别加入100μL用含1％FBS的HUVEC基础培养基稀释的终浓度为20ng/mL的VEGF或终浓度为5ng/mL的FGF-2(R&D Systems公司)，以及不同量的融合蛋白和FGF-2的混合液各100μL，分别含有融合蛋白的终浓度为40pM，用含1％FBS的HUVEC基础培养基10倍比稀释，FGF-2的终浓度均为5ng/mL，继续培养3～4天后，吸取培养基，加入含有10％CCK-8试剂(DOJINDO公司)的培养基继续培养2小时后，将ELISA板置于酶标仪上读取450nm波长的吸光度。根据吸光度的差异确定融合蛋白抑制VEGF或FGF-2诱导的血管内皮细胞分裂的能力。融合蛋白对VEGF或FGF-2诱导的HUVEC细胞分裂的影响及其相对抑制率见图6。本实施例表明本发明构建的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白(例如12#、15#和25#)在细胞水平具有生物学活性和功能，可以抑制VEGF或FGF-2诱导的HUVEC细胞分裂的能力，具有结合VEGF和FGF-2的能力，且这种结合能力随着融合蛋白的摩尔浓度的增加而增加，表现为VEGF或FGF-2诱导的HUVEC细胞分裂受抑制。
本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。
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Claims (28)
1.抑制血管新生的融合蛋白，其包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元。
2.权利要求1的融合蛋白，其包含衍生自两种或两种以上血管新生抑制剂的两个血管新生抑制单元。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述血管新生抑制剂是抑制血管新生的受体，所述受体例如可以选自：DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、Tie-1、HGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3。
4.前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述至少两个血管新生抑制单元包括至少一个衍生自VEGFR胞外区的部分和至少一个衍生自FGFR胞外区的部分，优选地所述VEGFR胞外区是VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3胞外区，所述FGFR胞外区是FGFR1和/或FGFR2胞外区。
5.前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述至少两个血管新生抑制单元包括一个衍生自VEGFR1和/或VEGFR2胞外区的部分和一个衍生自FGFR1和/或FGFR2胞外区的部分。
6.权利要求4或5的融合蛋白，所述衍生自VEGFR1和/或VEGFR2胞外区的部分包含选自下列的一项或多项：VEGFR1或VEGFR2的第一Ig样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第二Ig样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第三Ig样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第四Ig样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第五Ig样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第六Ig样结构域或其一部分、和VEGFR1或VEGFR2第七Ig样结构域或其一部分。
7.权利要求4或5的融合蛋白，所述衍生自FGFR胞外区的部分包含选自下列的一项或多项：FGFR第一Ig样结构域或其一部分、源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域或其一部分和FGFR第三Ig样结构域或其一部分。
8.权利要求4或5的融合蛋白，其中所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含：VEGFR1或VEGFR2的第二Ig样结构域和VEGFR1或VEGFR2的第三Ig样结构域；所述衍生自FGFR胞外区的部分包含：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。
9.权利要求4-8任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端依次包含：衍生自VEGFR胞外区的部分和衍生自FGFR胞外区的部分。
10.权利要求9的融合蛋白，其中所述衍生自VEGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：VEGFR1或VEGFR2的第二Ig样结构域和VEGFR1或VEGFR2的第三Ig样结构域；所述衍生自FGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。
11.权利要求9或10的融合蛋白，其中所述衍生自VEGFR胞外区的部分还包含VEGFR1或VEGFR2的第一Ig样结构域；优选地，所述衍生自VEGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：VEGFR1或VEGFR2的第一Ig样结构域、VEGFR1或VEGFR2的第二Ig样结构域和VEGFR1或VEGFR2的第三Ig样结构域；所述衍生自FGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。
12.权利要求9-11任一项的融合蛋白，其中所述衍生自FGFR胞外区的部分还包含FGFR第一Ig样结构域或其一部分。
13.权利要求9或10的融合蛋白，其中：
所述VEGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：2第151至214位相对应的氨基酸序列，
所述VEGFR2第三Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：3第224至320位相对应的氨基酸序列，
所述FGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第163至247位相对应的氨基酸序列，和
所述FGFR1第三Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第270至359位相对应的氨基酸序列。
14.权利要求11的融合蛋白，其中：
VEGFR1第一Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：2第32至123位相对应的氨基酸序列。
15.权利要求12的融合蛋白，其中FGFR第一Ig样结构域或其一部分具有：
与SEQ ID NO：1第40至118位相对应的氨基酸序列，或者
与SEQ ID NO：1第77至118位相对应的氨基酸序列。
16.权利要求4-15中任一项的融合蛋白，其中所述衍生自FGFR胞外区的部分包含源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分，优选所述源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。
17.前述任一项权利要求的融合蛋白，其还包含融合伴侣，例如免疫球蛋白Fc区，优选地是人IgG Fc区，例如人IgG1 Fc区，更优选地其具有：
与SEQ ID NO：7相对应的氨基酸序列，或者
与SEQ ID NO：8相对应的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
18.前述任一项权利要求的融合蛋白，所述蛋白包含：
(1)SEQ ID NO：9-24任一项所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(2)与SEQ ID NO：9-24任一项所示氨基酸序列有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性；或者
(3)由与SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，优选地至少80％、90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性。
19.前述任一项权利要求的融合蛋白，其还包含分泌信号肽区，例如VEGFR1信号肽区，优选地所述分泌信号肽区具有SEQ ID NO：2第1至26位的氨基酸序列或者由SEQ ID NO：25所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
20.编码前述任一项权利要求的融合蛋白的分离的核酸分子。
21.权利要求20的核酸分子，其包含SEQ ID NO：26-41任一项所示核苷酸序列。
22.包含权利要求20或21的核酸分子的载体。
23.用权利要求22的载体转染的细胞，优选CHO细胞。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1-19任一项的融合蛋白、权利要求20或21的核酸分子、权利要求22的载体或权利要求23的细胞，以及可药用载体。
25.一种生产抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通过在原核细胞或真核细胞例如细菌、酵母或哺乳动物细胞系中表达权利要求1-19任一项的融合蛋白来进行。
26.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
27.权利要求1-19任一项的融合蛋白、权利要求20或21的核酸分子、权利要求22的载体、权利要求23的细胞或权利要求24的药物组合物在制备用于在哺乳动物中抑制血管新生的药物中的用途。
28.权利要求1-19任一项的融合蛋白、权利要求20或21的核酸分子、权利要求22的载体、权利要求23的细胞或权利要求24的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的药物中的用途，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。
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