JP6328164B2 - 血管新生誘導因子に拮抗する融合蛋白質およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は血管新生誘導因子に拮抗する融合蛋白質およびその使用に関する。具体的には、本発明は様々な血管新生因子を抑制する融合蛋白質およびその使用に関する。より具体的には、本発明はＶＥＧＦ受容体とＦＧＦ受容体との融合蛋白質、および血管新生関連疾患治療におけるその使用に関する。

血管新生（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は悪性腫瘍の増殖と転移に至る主要因子の一つである［１］。血管新生過程は数多くの因子により制御され、いくつかの因子は血管新生を誘導し、別の因子は血管新生を抑制し、この結果、血管新生の制御は血管新生の調節機構は極めて複雑的な動的平衡プロセスである［２］。抗血管新生治療法は、血管新生促進因子を遮断し、または、血管新生抑制因子を用いて腫瘍血管新生を抑えることによって、腫瘍細胞の増殖を抑制することを意図している。例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＤＤＲ１、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＥｒｂＢ３、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＴＥＫ、Ｔｉｅ−１など、数多くの血管新生促進因子がこれまでに知られており、これらの因子は血管内皮細胞の分裂および分化、ならびに血管の形態発生を刺激できる。それらの中で、今まで、ＶＥＧＦが血管新生に関して、最も特異的かつ最も効果的な成長因子であることが知られている［３，４］。

腫瘍組織の低酸素環境において、腫瘍細胞からはＶＥＧＦが大量に分泌され、血管内皮細胞の分裂と遊走を誘導し、最終的に腫瘍の血管網を構築する。多くの動物実験により、ＶＥＧＦを阻害することにより、腫瘍の増殖を抑制でき、腫瘍の成長を抑制できることが証明されている。このため、ＶＥＧＦおよびその受容体は抗血管新生医薬のための重要なターゲットである。これまでの臨床試験から、著しい効果を有することが示された抗血管新生薬としては、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，商品名Ａｖａｓｔｉｎ）があり、これは直接的にＶＥＧＦを遮断し、腫瘍の血管新生を抑えることができる。ベバシズマブは、転移性結腸直腸癌の第一選択薬として、２００４年に米国のＦＤＡにより販売承認され、抗血管新生を抑制することにより抗癌作用を発揮する新薬としては世界で最初に販売承認された医薬である。Ａｖａｓｔｉｎはヒト化抗ＶＥＧＦ遺伝子モノクローナル抗体であり、米国の有名なバイオテクノロジー企業であるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社により製造されている。大規模な第三相臨床試験において、Ａｖｓａｔｉｎと化学療法との併用療法により、直腸癌、肺癌、乳癌、腎がんなど多種の癌患者の生存期間を延長させることが示された［５，６］。Ａｖａｓｔｉｎの臨床での成功は画期的であり、腫瘍血管システムをターゲットとした抗血管新生治療が臨床的に有効な治療手段であり、多くの腫瘍の治療に新しい道を開くことを証明した。西洋国家では、Ａｖａｓｔｉｎは既に腫瘍治療のため幅広く使われており、現在、世界市場において最大のシェアを有する薬の一つである。

Ａｖａｓｔｉｎの他にも、いくつかの抗ＶＥＧＦシグナリング薬がヒト臨床試験の後期段階にあり、今後数年以内に臨床応用が期待されている。中でも、米国のバイオテクノロジー企業Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎとサノフィ・アベンティス社が共同開発したＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（別名ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）は、大規模な第三相臨床試験の実施中てある［７］。Ｉｍｃｌｏｎｅ社の抗ＶＥＧＦ受容体ＩＩ（ＶＥＧＦＲ２）モノクローナル抗体薬ＩＭＣ−１１２１Ｂも第三相臨床試験にある［８］。これらの新薬は間違いなく、癌治療の新しい選択肢を提供し、患者に新たな希望を与えるであろう。

抗ＶＥＧＦ医薬を用いた腫瘍の臨床治療において、著しい進歩がなされた。但し、臨床試験によって、抗ＶＥＧＦ療法には相当の制限があることも示された。腫瘍の治療効果の点では、Ａｖａｓｔｉｎは直腸・結腸癌患者の半数生存期間を約３〜４ヵ月延長し［９，１０］、乳癌患者の生存期間を約７〜８ヵ月延長する［１１］。このため、Ａｖａｓｔｉｎは腫瘍血管の生長を長期的には効果的に抑制できない。抗血管新生の臨床治療効果を高めることは、腫瘍研究者らが解決すべき課題であり、次世代の抗血管新生医薬の研究開発における主要点となる。

抗ＶＥＧＦ治療の失敗または耐性の出現の根本的な原因は、腫瘍血管新生が数多くの因子によって制御されていることにある。ＶＥＧＦは血管新生に重要な役割を果たしてはいるものの、唯一の血管新生促進因子というわけではない。同時に、腫瘍細胞の非均質性、癌細胞微環境の複雑さ、および生体の代償性反応機構のために、ＶＥＧＦの活性を長時間抑制すると、他の血管新生刺激因子が発現し［１２］、そして、腫瘍血管の増殖はもはやＶＥＧＦシグナリング経路に依存しなくなる。Ｈａｎａｈａｎのグループにより、膵癌に対する抗ＶＥＧＦＲ２治療において、腫瘍細胞で発現される血管成長因子の変化についての研究がなされ、抗ＶＥＧＦ治療中にいくつかの遺伝子の発現が変化し、中でも、ＦＧＦ−２の発現量が最も顕著に増加したことが示された。抗ＶＥＧＦ治療に耐性の腫瘍では、ＦＧＦ、特にＦＧＦ−２、の発現量が著しく増加し、血管新生が再び刺激され、ＦＧＦシグナリング経路を遮断した後では、腫瘍再生が抑えられる［１３］。このことから、ＦＧＦ−２の過剰発現は、腫瘍が抗ＶＥＧＦ治療を回避する能力に密接に関わりがあることが分かる。このため、同時にＶＥＧＦとＦＧＦ−２を抑制すると、腫瘍などの血管増殖性疾患をより有効に治療することができる。

現在、低分子標的治療薬による二標的／多標的拮抗において、いくつかの進歩がなされた。ＶＥＧＦとＦＧＦ−２とに同時に拮抗することによる抗腫瘍効果は単一標的腫瘍治療より優れていることが示された［１４］。しかし、低分子多標的拮抗剤は特異性の欠如のために、多くの場合、予測できない副作用が生じ、そのような副作用は、時には臨床試験後期段階になって初めて出現するので、大きいリスクを有している。高分子蛋白薬品、特にＦｃ融合蛋白およびモノクローナル抗体は、高い特異性や長い体内半減期など、低分子薬には無いメリットを有しており、医薬研究開発において重要な分野となっている。

線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はヘパリン結合性成長因子ファミリーであり、哺乳類動物では２２種類のファミリーメンバー（ＦＧＦ１〜１４，１６〜２３）がある。ＦＧＦは、例えば、細胞の増殖や分化、遊走、血管新生と腫瘍発生などの様々な生物学的機能を果たす。ＦＧＦは、細胞表面にあるＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）への結合および該受容体の活性化によって、さまざまな生物機能を発揮する（例えば、Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． １６： １３９−１４９， ２００５を参照）。線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は線維芽細胞増殖因子の構成員に結合する受容体である。線維芽細胞増殖因子受容体の一部は疾患プロセスに関与する。哺乳動物には四種類のＦＧＦＲ遺伝子：ｆｇｆＲ１〜ｆｇｆＲ４がある。線維芽細胞増殖因子受容体は細胞外ドメイン，膜貫通ドメイン，および細胞内ドメインからなる。ＦＧＦＲの構成員は、それぞれリガンド結合性とキナーゼドメインは異なるものの、同様の細胞外ドメインを有している。細胞外ドメインには三つの免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ様）、つまり第一Ｉｇ様ドメイン、第二Ｉｇ様ドメイン、および第三Ｉｇ様ドメイン、が含まれ、第一と第二のＩｇ様ドメインの間にはある配列が存在する。第一Ｉｇ様ドメインと第二Ｉｇ様ドメインの間の前記配列はＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域と称する。前記中間機能性配列領域は、酸性ボックス（ａｃｉｄｉｃ ｂｏｘ、ＡＢ）と呼ばれる一つの酸性アミノ酸クラスターを有している。

ＶＥＧＦとＦＧＦ（特に、ＦＧＦ−２）が腫瘍血管新生において果たす重要な働きから、我々はＶＥＧＦとＦＧＦ（特に、ＦＧＦ−２）の双方に拮抗する高分子蛋白医薬が腫瘍血管新生をより強く抑制し、臨床応用においてより良好な治療効果が得られると信じている。しかし、ＶＥＧＦとＦＧＦの双方を遮断する高分子融合蛋白質の構築に成功したとの報告は今まで無かった。このため、本研究はＶＥＧＦとＦＧＦ（特にＦＧＦ−２）を同時に遮断するＦｃ融合蛋白質の構築を探索することを目的とし、当該融合蛋白質は受容体の特異性と高親合性によりＶＥＧＦおよびＦＧＦの信号伝達を同時に遮断できる。本研究の前記ＶＥＧＦおよびＦＧＦの双拮抗融合蛋白質は、完全にヒト由来の蛋白質配列を用い、またＦｃ融合蛋白質の優れる薬物動態を取り込むことにより、良好な薬学的条件とおよび良好な臨床応用潜在力を有することになる。一方、双拮抗融合蛋白質においては、融合蛋白質のそれぞれの標的に対する親合力は正しい蛋白質構造に依存し、融合蛋白質中の受容体フラグメントはリガンド結合能を失い易い。このため、高効率且つ特異的なＶＥＧＦおよびＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−２）二重拮抗融合蛋白質医薬の構築は困難である。本研究の前段階として、異なるＶＥＧＦＲフラグメント、ＦＧＦＲフラグメントおよびＩｇＧ１のＦｃを含む融合蛋白質を２０個超構築し、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ（特にＦＧＦ−２）の双方に高親合力を有する融合蛋白質を得た。

例えば、ＦＧＦＲ系融合蛋白質（ＷＯ／２００８／０６５５４３）、Ｎｏｔｃｈ３系融合蛋白質（ＷＯ／２０１０／０２１７２９）、ＶＥＧＦＲ系融合蛋白質（ＷＯ／２０１０／１０５５７３）、ＬＫ８系融合蛋白質（ＷＯ／２００８／０７５８３３）などの、多くの抗血管新生融合蛋白質が既に報告されてきたが、これらの融合蛋白質は単一標的を目標としたもので、単一の血管新生抑制部分と免疫グロブリンのＦｃフラグメントとの融合により血管新生の抑制を達成している。これまでの技術では、二つの血管抑制ユニットを融合させて双標的拮抗により血管新生の抑制を達成した融合蛋白質は未だ報告されていなかった。本発明者は、初めて、二種類以上の血管新生抑制剤に由来する少なくとも二つの血管新生抑制ユニットを成功裏に融合させて、双方の標的を抑制し、さらに血管新生を抑制する融合蛋白質を形成した。驚くべきことに、これにより特別優れた効果が得られた。このため、本発明は血管新生抑制医薬の開発のための新たなアイデアを提供する。

一つの観点では、本発明は、２種類以上の血管新生抑制剤由来の少なくとも２つの血管新生抑制ユニットを含む融合蛋白質に関する。一つの実施方案においては、前記融合蛋白質は血管新生を抑制する。別の実施方案においては、前記融合蛋白質は体内および／または体外で、ＦＧＦとＶＥＧＦに結合する。

一つの実行方案においては、本発明の融合蛋白質は二種類以上の血管新生抑制剤由来の少なくとも二つの血管新生抑制ユニットを含む。前記二種類以上の血管新生抑制剤は：例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３などのＶＥＧＦＲ、および例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４などのＦＧＦＲから選択される。好ましくは、本発明の融合蛋白質はＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＦＧＦＲ１に由来する少なくとも二つの血管新生抑制ユニットを有している、より好ましくは、本発明の融合蛋白質はＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＦＧＦＲ１に由来する二つの血管新生抑制ユニットを含み、ここで一方の血管新生抑制ユニットはＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２から由来し、もう一方はＦＧＦＲ１から由来する。

別の実施方案において、本発明の融合蛋白質は二種類以上の血管新生抑制剤に由来する少なくとも二つの血管新生抑制ユニットを有しており、前記二種類以上の血管新生抑制剤は血管新生を抑制する可溶性受容体フラグメントであり、前記可溶性受容体フラグメントは、例えば：ＤＤＲ１、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＥｒｂＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＴＥＫ、Ｔｉｅ−１、ＨＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３およびそれらの対立遺伝子変異型から選択される。一つの具体的な実施方案において、前記血管新生抑制剤は抗血管新生受容体のＶＥＧＦＲとＦＧＦＲである。

いくつかの実施方案において、本発明の融合蛋白質は二種類以上（好ましくは二種類もしくは三種類）の血管新生抑制剤の少なくとも二つの血管新生抑制ユニットを含み、ここで前記二つ以上の血管新生抑制ユニットは、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の血管新生抑制ユニットを少なくとも一つと、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の血管新生抑制ユニットとを少なくとも一つ含む。好ましくは、前記ＶＥＧＦＲの細胞外ドメインはＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３細胞外ドメインであり、前記ＦＧＦＲの細胞外ドメインはＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦＲ２細胞外ドメインである。

いくつかの実施方案において、本発明の融合蛋白質は二種類以上（好ましくは、二種類もしくは三種類）の血管新生抑制剤の少なくとも二つの血管新生抑制ユニットを含み、ここで前記二つ以上の血管新生抑制ユニットは、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２細胞外ドメイン由来の血管新生抑制ユニットを一つと、ＦＧＦＲ１細胞外ドメイン由来の血管新生抑制ユニットを一つ、含む。

いくつかの実施方案において、前記ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２）細胞外ドメイン由来の部分は下記のうち一つもしくは複数を含むかまたはそれらからなる：
ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２）の第一Ｉｇ様ドメインまたはその一部、
ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２）の第二Ｉｇ様ドメインまたはその一部、
ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２）の第三Ｉｇ様ドメインまたはその一部、
ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２）の第四Ｉｇ様ドメインまたはその一部、
ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２）の第五Ｉｇ様ドメインまたはその一部、
ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２）の第六Ｉｇ様ドメインまたはその一部、および
ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２）の第七Ｉｇ様ドメインまたはその一部。

いくつかの実施方案において、前記ＦＧＦＲ（例えばＦＧＦＲ１）の細胞外ドメイン由来の部分は下記のうち一つもしくは複数を含むかまたはそれらからなる：
ＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１）の第一Ｉｇ様ドメインまたはその一部、
ＦＧＦＲ（例えばＦＧＦＲ１）のＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分、
ＦＧＦＲ（例えばＦＧＦＲ１）の第二Ｉｇ様ドメインまたはその一部、および
ＦＧＦＲ（例えばＦＧＦＲ１）の第三Ｉｇ様ドメインまたはその一部。
特に、本発明の融合蛋白質においては、ドメインおよび／またはフラグメントの間は直接連結されている、および／またはリンカーで連結されている。一つの具体的な実施方案においては、本発明の融合蛋白質はＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１）Ｉｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分を含み、好ましくは、前記ＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１）Ｉｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分は酸性ボックス（ａｃｉｄｉｃ ｂｏｘ，ＡＢ）を含まない。一つの具体的な実施方案において、前記中間機能性配列領域由来の部分は、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位または１５１〜１６２位のアミノ酸から選択される配列を有する。

一つの実施方案において、ＶＥＧＦＲ１細胞外ドメイン由来の部分は、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２の第二Ｉｇ様ドメインとＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２の第三Ｉｇ様ドメインとを含み、前記ＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン由来の部分は、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分と、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインと、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインとを含む。好ましくは、前記ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分は酸性ボックスを含まない。特に、前記ＦＧＦＲは、例えば、ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ２である。

もう一つの実施方案において、前記ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分は、ＶＥＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインとＶＥＧＦＲ２の第三Ｉｇ様ドメインとを含み、前記ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分は、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分と、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインと、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインとを含む。好ましくは、前記ＦＧＦＲのＩｇ様ドメイン中間機能性配列領域由来の部分は酸性ボックスを含まない。特に、前記ＦＧＦＲは、例えば、ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ２である。

もう一つの実施方案においては、前記ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分は、Ｎ末端からＣ末端へと順番に、ＶＥＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインと、ＶＥＧＦＲ２の第三Ｉｇ様ドメインとを含み、前記ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分は、Ｎ末端からＣ末端へと順番に、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメイン中間機能性配列領域由来の部分と、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインと、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインとを含む。好ましくは、前記ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分は酸性ックスを含まない。特に、前記ＦＧＦＲは、例えば、ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ２である。

いくつかの具体的な実施方案において、前記ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分はＶＥＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメインも含む。例えば、前記ＶＥＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメインはＶＥＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインの前に存在している。好ましくは、ＶＥＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメインは、配列番号２の３２〜１２３位に対応するアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号２の３２〜１２３位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施方案において、前記ＦＧＦＲ（例えばＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン由来の部分はＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメインまたはその一部を含む。好ましくは、ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメインまたはその一部は、配列番号１の４０〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号１の４０〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいは

配列番号１の７７〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号１の７７〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する

本発明のいくつかの優れる実施方案において、ＶＥＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインは、配列番号２の１５１〜２１４位に対応するアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号２の１５１〜２１４位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明のいくつかの優れる実施方案において、ＶＥＧＦＲ２の第三Ｉｇ様ドメインは、配列番号３の２２４〜３２０位に対応するアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号３の２２４〜３２０位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有している。

本発明のいくつかの優れる実施方案において、ＦＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインは配列番号１の１６３〜２４７位に対応するアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号１の１６３〜２４７位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有している。

本発明のいくつかの優れる実施方案において、ＦＧＦＲ１の第三Ｉｇ様ドメインは配列番号１の２７０〜３５９位に対応するアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号１の２７０〜３５９位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有している。

好ましくは、本発明の融合蛋白質は融合パートナーも含む、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域（好ましくは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域、さらに好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域）、さらに好ましくは：

配列番号７に対応するアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいは

配列番号８に対応するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号８のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を有している。

いくつかの実施方案において、本発明の融合蛋白質は分泌シグナルペプチド領域、例えばＶＥＧＦＲ１のシグナルペプチド領域、を含み、好ましくは前記シグナルペプチド領域は配列番号２の１〜２６位のアミノ酸配列または配列番号２５のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を有している。

別の態様では、本発明はＦｃ融合蛋白質を提供し、該蛋白質は：

（１）配列番号９〜２４のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む；

（２）配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を含む；あるいは、

（３）配列番号９〜２４のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列、もしくは配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施方案において、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃの融合蛋白質に含まれるそれぞれの部分および／またはそれぞれのドメインの、Ｎ末端からＣ末端までにおけるその順番はランダムであるか、あるいは図１に示す順番であってもよい。

いくつかの実施方案において、本発明のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質はさらにシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ， ＳＰ）、好ましくは分泌シグナルペプチド、を含む。前記シグナルペプチドは、例えばＶＥＧＦＲ１のシグナルペプチドであり、これは配列番号２の１〜２６位のアミノ酸配列、または配列番号２５のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列、を有している。好ましくは、シグナルペプチドは前記融合蛋白質のＮ末端に存在している。

好ましくは、本発明の融合蛋白質はＮ末端からＣ末端へと、順番に、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分と、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分とを含む。

好ましくは、本発明の融合蛋白質において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧのＦｃ領域であり、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ領域であり、さらに好ましくは：

配列番号７に対応するアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいは

配列番号８に対応するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号８のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有している。

本発明の一つの実施方案において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は融合蛋白質のＣ末端に存在している。

本発明のある実施方案において、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質に含まれるそれぞれの部分および／またはそれぞれのドメインの、Ｎ末端からＣ末端までにおけるその順番は任意の順番であってよい。他のいくつかの実施方案において、前記順番は図１に示す順番である。いくつかの具体的な実施方案中、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＥＧＦＲ部分とＦＧＦＲ部分は互いの上流もしくは下流に存在可能である。その他、前記Ｆｃ領域は血管新生抑制ユニットの上流もしくは下流に存在可能である；例えば、前記Ｆｃ領域は融合蛋白質のＣ末端に存在する。

いくつかの実施方案において、本発明のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は一つもしくはいくつかの鎖内ジスルフィド結合を含み、好ましくは、Ｉｇ様ドメインに一つもしくはいくつかの鎖内ジスルフィド結合を含む。

本発明の一態様では、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は原核細胞または真核細胞、例えば細菌、真菌（酵母）もしくは哺乳類動物細胞系において本発明の融合蛋白質を発現させることによって製造できる。特に、前記哺乳類動物細胞系はＣＨＯ細胞系であってもよい。組み換え蛋白質の発現において、ＣＨＯ細胞はよく使われている細胞株であり、そして、大規模発現解析をする場合には、種々の要求に応じて、原始ＣＨＯ細胞を改造することによって、例えば、無血清培養目的などの特定の発現を目的とする組み換え蛋白質生産のために用いられる一連の派生型ＣＨＯ細胞系が得られる。これらはすべて、組み換え蛋白質発現の分野で知られている。

別の態様では、本発明の融合蛋白質に含まれるドメインおよび／または領域の間は直接および／またはリンカーで連結されており、例えば、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分と、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分と、免疫グロブリンのＦｃ領域由来の部分とはリンカーを通じて、あるいは通じないで、融合されている。一つの実施方案において、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分と、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分と、免疫グロブリンＦｃ領域とは直接的に連結されている。もう一つの実施方案において、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分と、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分と、免疫グロブリンＦｃ領域とはリンカーで、例えば、（Ｇ４Ｓ）_３リンカーで連結されている。

別の態様では、本発明は前記融合蛋白質をコードする単離核酸分子に関する。好ましくは、前記核酸分子は配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、本発明は前記核酸分子を含むベクターを提供する。また、前記ベクターを用いて、形質転換／トランスフェクトされた細胞（好ましくは、ＣＨＯ細胞系）を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の融合蛋白質、核酸分子、発現ベクターもしくは細胞、および医薬的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物も提供する。

本発明は、原核細胞または真核細胞、例えば細菌、真菌（酵母）または哺乳動物細胞系、で本発明の融合蛋白質を発現させることによる、血管新生抑制性蛋白質の製造方法に関する。好ましくは、前記哺乳動物細胞系はＣＨＯ細胞系である。

別の態様では、本発明は、必要とする対象に、血管新生抑制有効量の本発明の融合蛋白質、核酸分子、ベクター、細胞または医薬組成物を投与することを含む、血管新生抑制方法を提供する。好ましくは、前記方法は哺乳類動物で行う。

別の態様では、本発明は、必要とする対象に、治療有効量または予防有効量の本発明の融合蛋白質、核酸分子、ベクター、細胞または医薬組成物を投与することを含む、哺乳類動物において腫瘍を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、前記腫瘍は固形腫瘍である。

別の態様では、本発明は、必要とする対象に、治療有効量または予防有効量の本発明の融合蛋白質、核酸分子、ベクター、細胞または医薬組成物を投与することを含む、哺乳類動物において眼内血管新生関連疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、眼内血管新生関連疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症などから選択される。

別の態様では、本発明は、ＦＧＦおよびＶＥＧＦを本発明の融合蛋白質と接触させることを含む、体外もしくは体内でＦＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲを結合させる方法を提供する。

本発明は、血管新生抑制薬の製造における、本発明の融合蛋白質、それをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ベクターで形質転換／トランスフェクトされた細胞、またはそれらを含む医薬組成物の使用にも及ぶ。その他、本発明は、血管新生関連疾患の治療薬もしくは予防薬の製造における、本発明の融合蛋白質、それをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ベクターで形質転換／トランスフェクトされた細胞、またはそれらを含む医薬組成物の使用にも及ぶ。好ましくは、前記血管新生関連疾患は腫瘍もしくは眼の血管新生関連疾患である。

国によって特許制度は保護対象について規定が異なることを考慮し、本明細書に開示された内容はさらに上記の方法に対応する製薬用途および特定用途の薬をも提供する。これら種々の製薬用途および薬物も、それらが本明細書中に具体的に記載されている場合と同様に、本発明の保護範囲に属している。

本明細書の開示は、ただ例を挙げて、保護が請求される対象の一具体的実施方案について説明しているが、その中では一つまたは複数の技術方案に記載された技術特徴は、任意に一つまたは複数の技術方案と組合せることができ、これら組合せによる技術方案も。それが本明細書中に具体的に記載されている場合と同様に、本発明の保護範囲に属する。

付属図面と下記のより詳細な説明を参照して、例を挙げながら本発明を説明する。ただし、下記の説明は、本発明で保護が請求される技術方案の例を挙げて説明したものに過ぎず、何らこれらの技術方案を制限するものではない。本発明の保護範囲は、付属の特許請求の範囲に基づく。

図１はＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質構造図であり、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ１蛋白質がそれぞれ示されている。Ｆｃ融合蛋白質は実線で表され、欠失したアミノ酸は点線で表され、抗体様ドメインは環状線で表され、種々の抗体様ドメインはアルファベットと番号で表され、その中でＶＥＧＦＲ１のドメインはａ１〜ａ７で表され、ＶＥＧＦＲ２のドメインはｂ１〜ｂ７で表され、ＦＧＦＲ１のドメインはｃ１〜ｃ３で表され、ジスルフィド結合はｓｓで表され、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは灰色ボックスで表され、ＳＰは信号ペプチドで表し、（Ｃ４Ｓ）３結合配列は三つの黒い菱形ボックスで表され、酸性ボックスはＡＢの文字のボックスで表される。 図２は種々のＦｃ融合蛋白質のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合についての比較図である。それぞれのＦｃ融合蛋白質（２０ ｎｇ／ｍＬ）とコーティングされたＶＥＧＦ１６５および／またはＦＧＦ−２（１００ｎｇ／ｍＬのヘパリンを含有する）との間の結合をＥＬＩＳＡ法を用いて検出している。 図３は、融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示す。 図４は、融合蛋白質勾配のＶＥＦＲ（Ａ）およびＦＧＦ−２（Ｂ）への結合を示す。 図５は、融合蛋白質のＶＥＧＦ（Ａ）およびＦＧＦ−２（Ｂ）への親和力を示す。 図６は、融合蛋白質がＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の分裂に及ぼす影響および相対抑制率を示す。図Ａは、融合蛋白質がＶＥＧＦにより誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖に及ぼす影響を示し、図Ｂは、ＶＥＧＦにより誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する融合蛋白質の相対抑制率を示し、図Ｃは、融合蛋白質がＦＧＦ−２により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖に及ぼす影響を示し、図Ｄは、ＦＧＦ−２により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する融合蛋白質の相対抑制率を示す。

定義
特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語は、当該技術分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。本分野の定義と用語に関して、当業者は具体的にはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照できる。アミノ酸残基の略語は、本技術分野で用いられている、２０個の常Ｌ−アミノ酸の一つを表す三文字コードおよび／または一文字コードで表される。

本発明において数値範囲とパラメーター近似値は広い範囲で記載されているが、具体的な実施例に示す全ての数値はできるだけ正確に記載してある。しかし、いかなる数値も元来、それぞれの測定における標準偏差に起因する一定の誤差を含む。また、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に含まれる全てかつ任意の部分範囲をも包含することが理解されるべきである。例えば、本明細書中に記載された場合、「１〜１０」の範囲は最小値１と最大値１０の間（端点も含む）に含まれる全てかつ任意の部分範囲をも包含する、つまり、最小値１あるいはこれを超える数値から始まる全ての部分範囲、例えば１〜６．１、および最大１０あるいはこれ未満の数値で終わる全ての部分範囲、例えば５．５〜１０などである。その他、「本明細書に取り込む」と述べられている参考文献は全て、その全体が取り込まれることが理解される。

その他注意すべきこととして、本明細書で用いられている単数の表現は、明瞭かつ明確にその表す対象が一つであると限定されている場合以外は、その表す対象が複数の場合をも含む。前後の文脈からそうでないことが明瞭に示されている場合を除き、「または」の語と「および／または」の語は互換的に使用される。

本明細書で用いられる用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」または「免疫グロブリンＦｃ領域」などは、免疫グロブリンの結晶化可能なフラグメントを示す。本発明において、前記Ｆｃ領域は好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。

用語「Ｆｃ融合蛋白質」とは、異種蛋白質の結合特異性と免疫グロブリンの定常領域のフェクター機能が結合した抗体様分子である。構造面では、Ｆｃ融合蛋白質は必要な結合特異性を有するアミノ酸配列および免疫グロブリンの定常領域配列を含む。Ｆｃ融合蛋白質は通常、受容体またはリガンド結合部位を含む。前記免疫グロブリン定常領域配列は、任意の免疫グロブリンから得られたものであってよく、その例としては、ＩｇＧ−１，ＩｇＧ−２，ＩｇＧ−３もしくはＩｇＧ−４のサブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１とＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭがある。

本明細書中で用いられる用語「可溶性」蛋白質とは、生物学的に関係する温度、ｐＨレベルおよび浸透圧下において水溶性の蛋白質である。本明細書に用いられる「可溶性融合蛋白質」は、本融合蛋白質が膜貫通ドメインや細胞内領域を含まないことを表す。

本明細書で用いられる用語「単離された」とは、下記の物質および／または実体を指す：（１）最初に製造された時（天然環境中および／または試験装置中に存在）およびそれに関連する少なくともいくつかの成分から分離されたもの、および／または（２）人工的に生産、調剤および／または製造されたもの。単離された物質および／または実体は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質１００％、または１００％の、最初に関連する他成分から分離されたものであってもよい。

用語「部分」および「フラグメント」とは、互換的に、ポリペプチド、核酸またはその他の分子構築物の一部を表す。

本明細書中で用いられる用語「ＶＥＧＦＲ」とは、血管内皮成長因子受容体を表し、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３であってもよい。好ましくは、本発明のＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２であり、好ましくはヒトＶＥＧＦＲである。

本明細書中で用いられる用語「ＦＧＦＲ」とは、線維芽細胞増殖因子受容体であり、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３および／またはＦＧＦＲ４であってもよい。好ましくは、本発明のＦＧＦＲはＦＧＦＲ１であり、さらに好ましくは、ヒトＦＧＦＲ１である。

本明細書中で用いられる用語「Ｉｇ様ドメイン」とは、免疫グロブリン蛋白様ドメインを表す。このドメインは、様々な蛋白質ファミリーに見られ、細胞−細胞認識、細胞表面受容体、免疫機能などを含む、様々な生物学機能に関与する。

本明細書中で用いられる用語「ＶＥＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメイン」とは、ＶＥＧＦＲ蛋白質のＮ末端から一つ目のＩｇ様ドメインを表し、好ましくは、ＶＥＧＦＲ１蛋白質のＮ末端から一つ目のＩｇ様ドメイン（本明細書中ではＶＥＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメインと称す）またはＶＥＧＦＲ２蛋白質のＮ末端から一つ目のＩｇ様ドメイン（本明細書中ではＶＥＧＦＲ２の第一Ｉｇ様ドメインと称す）であり、例えば、配列番号２の３２〜１２３位または配列番号３の４６〜１１０位に対応するアミノ酸配列を有する。同様に、ＶＥＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインは、例えば、配列番号２の１５１〜２１４位または配列番号３の１４１〜２０７位に対応するアミノ酸配列を有する。ＶＥＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインは、例えば、配列番号２の２３０〜３２７位または配列番号３の２２４〜３２０位に対応するアミノ酸配列を有する。ＶＥＧＦＲの第四Ｉｇ様ドメインは、例えば、配列番号２の３３５〜４２１位または配列番号３の３２８〜４１４位に対応するアミノ酸配列を有する。ＶＥＧＦＲの第五Ｉｇ様ドメインは、例えば、配列番号２の４２８〜５５３位または配列番号３の４２１〜５４８位に対応するアミノ酸配列を有する。ＶＥＧＦＲの第六Ｉｇ様ドメインは、例えば、配列番号２の５５６〜６５４位または配列番号３の５５１〜６６０位に対応するアミノ酸配列を有する。ＶＥＧＦＲの第七Ｉｇ様ドメインは、例えば、配列番号２の６６１〜７４７位または配列番号３の６６７〜７５３位に対応するアミノ酸配列を有する。好ましくは、前記ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２である。

本明細書中で用いられる用語「ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメイン」または「ＦＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメイン」とは。ＦＧＦＲもしくはＦＧＦＲ１蛋白質のＮ末端から一つ目のＩｇ様ドメインを表し、例えば、配列番号１の４０〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有する。同様に、用語「ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン」または「第二Ｉｇ様ドメイン」とはＦＧＦＲ蛋白質のＮ末端から二つ目のＩｇ様ドメインを表し、例えば、配列番号１の１６３〜２４７位に対応するアミノ酸配列を有する。用語「ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン」または「第三Ｉｇ様ドメイン」とは、ＦＧＦＲ蛋白質のＮ末端から一つ目のＩｇ様ドメインを表し、例えば、配列番号１の２７０〜３５９位に対応するアミノ酸配列を有する。好ましくは、前記ＦＧＦＲはＦＧＦＲ１であり、ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメインはＦＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメインであり、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインはＦＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインであり、ＦＧＦＲの第三ＩｇドメインはＦＧＦＲ１の第三Ｉｇ様ドメインである。

本明細書中で用いられる用語「ＦＧＦＲのＩｇ様ドメイン中間機能性配列領域」もしくは「中間機能性配列領域」とは、ＦＧＦＲ蛋白質の第一Ｉｇ様ドメインと第二Ｉｇ様ドメインとの間の配列を表し、好ましくは、ＩＦＳ配列は配列番号１の１１８〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。本発明者は、予想外に、前記中間機能性配列領域がＩｇ様ドメインの機能に対して著しい影響を有することを見いだした。前記のＦＧＦＲ蛋白質は好ましくはＦＧＦＲ１（配列番号１）であり、特にはヒトＦＧＦＲ１蛋白質である。ヒトＦＧＦＲ１蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１に見られ、そのｃＤＮＡ配列は配列番号４に見られる。

ｈＦＧＦＲ１の部分配列を以下に示す。影の部分は、各Ｉｇ様ドメインを表す。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＡＡＨ１５０３５．１を参照。

ＦＧＦＲ１のアミノ酸配列は配列番号１に見られ、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号４に見られる。

ｈＶＥＧＦＲ１の部分配列を以下に示す。影の部分は、各Ｉｇ様ドメインを順番に表す。それぞれのドメインの間には天然のリンカー配列が存在する。

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１７９４８に見られる。

ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸配列は配列番号２に見られ、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号５に見られる。

ｈＶＥＧＦＲ２の部分配列を以下に示す。影の部分は、各Ｉｇ様ドメインを順番に表す。それぞれのドメインの間には、天然のリンカー配列が存在する。

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５９６８に見られる。

ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は配列番号３に見られる、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号６に見られる。

本明細書中で用いられる用語「血管新生抑制ユニット」とは、血管新生抑制機能を有するポリペプチド、フラグメント、モチーフ、ドメインなどである。血管新生抑制ユニットは、血管新生抑制能を有する限り、本発明の融合蛋白質のアミノ酸配列におけるいかなるフラグメントを表してもよい。例えば、本発明の血管新生抑制ユニットは、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分およびＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分を含んでもよい。

本明細書中で用いられる用語「縮退変異体」とは、前記縮退変異体がアミノ酸コドンの第３番目に縮退変化を含み、この縮退変異体が同じアミノ酸をコードすることを示し、例えば、三文字コドンのウォブル位置（ｗｏｂｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は一つまたは複数の改変変異体を含み、これらは同義変異体とも呼ばれる。

本明細書中で用いられる用語「対立遺伝子変異型」とは、染色体上の特定の位置に存在する二つまたはそれ以上の数の遺伝子を表している。

本明細書中で用いられる用語「対象」は、哺乳動物を表し、例えば人類であるが、他の動物、例えば、家庭で飼育される動物（犬、猫など）、家畜（牛、羊、豚、馬など）または実験動物（猿、ラビット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含む。

本明細書中で用いられる用語「一致性」、「パーセント一致性」、「ホモロジー」または「同一性」は二つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の配列同一性を示す。二つの配列を整列させることによって、パーセント一致性を確認できる。パーセント一致性は、整列させた配列において同じ位置に同じ残基（アミノ酸またはヌクレオチド）が存在する数を指す。配列の整列および比較には、本分野の標準計算方法（例えば、Ｓｍｉｔｈ とＷａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ と Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３； Ｐｅａｒｓｏｎ と Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ， ＵＳＡ， ８５：２４４４）またはこれらの計算方法のコンピュータ化バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を使用できる。公衆に利用可能な前記コンピュータ化バージョンはＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡである。その他、アメリカ国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）を通じ利用可能なＥＮＴＲＥＺも配列の比較に使用できる。ＢＬＡＳＴとギャプＢＬＡＳＴシステムを使うときは、それぞれのシステムのデフォルトパラメーター（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、国立生物工学情報センターのウェブサイトで使用可能）を使用できる。一つの実施方案においては、それぞれのアミノ酸ギャップに対する重み付けが、各アミノ酸に与えられた重みが二つの配列間にある単一のアミノ酸ミスマッチであるかのように見えるよう、ギャップ重みが１のＧＣＧを用いて、二つの配列のパーセンテージ同一性を確認する。あるいは、ＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）配列比較プログラムパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）を用いてもよい。

本明細書中で用いられる用語「ハイブリダイゼーション」とは、二つの一本鎖ポリヌクレオチドの非共有結合により安定な二本鎖ポリヌクレオチドが形成されることを表す。用語「ハイブリダイゼーション」は三本鎖のハイブリダイゼーションをも指しうる。（普通に）産生された二本鎖のポリヌクレオチドは「ハイブリッド」または「二本鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、一般的には、約１Ｍ未満の塩濃度、より一般的には、約５００ｍＭ未満の塩濃度および約２００ｍＭ未満の塩濃度である。ハイブリダイゼーションの温度は５℃という低温でもよいが、一般的には約２２℃より高く、さらに一般的には約３０℃より高く、好ましくは約３７℃より高い。ハイブリダイゼーションは、通常は厳しい条件で（つまり、プローブがその標的配列とハイブリダイズする条件で）行う。厳しいハイブリダイゼーション条件は配列により定まり、異なる状況では差異が存在する。長いフラグメントは特異的ハイブリダイゼーションのためにより高い温度を必要としうる。他のパラメーター（相補鎖の塩基の組成と長さ、有機溶媒の存在、塩基のミスマッチの程度）もハイブリダイゼーションの厳しさに影響を与えうるため、パラメーターの組合せは、いずれか一つのパラメーターの絶対値よりも重要である。一般に、厳しい条件は特定のイオン強度およびｐＨの下での当該配列のＴｍよりも約５℃低く選択される。例示的な厳しい条件は、ｐＨ７．０〜８．３、ナトリウムイオン濃度（または他の塩イオン）０．０１Ｍ〜１Ｍ、および２５℃以上の温度である。厳しい条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ＦｒｉｔｓｃｈｅとＭａｎｉａｔｉｓ． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” 第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ “Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” 第１版， ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ （１９９９）が参照可能であり、これらはその全体が、前記のすべての目的で、参照により本明細書中に取り込まれる。

本明細書中で用いられる用語「リンカー」、「ペプチド結合」、「連結配列」または「リンカー配列」とは、本発明の融合蛋白質に含まれている各ドメインおよび／または領域を連結している短いアミノ酸配列を表し、普通は０〜２０個アミノ酸長であり、好ましくは２〜１０個アミノ酸長である。

本明細書中で用いられる用語、融合蛋白質、部分またはドメインにおける「配列番号Ｎに対応するアミノ酸配列」の語とは、前記融合蛋白質、部分またはドメインが配列番号Ｎにより実質的に表されるアミノ酸配列を有することを表し、好ましくは、その中に１、２、３、４、５、１０または２０個以下のアミノ酸置換、付加もしくは欠失を含み、更に好ましくは、前記融合蛋白質、部分またはドメインは配列番号Ｎにより表されるアミノ酸配列に対し８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有し、より好ましくは前記融合蛋白質、部分またはドメインは配列番号Ｎにより表されるアミノ酸配列を有する。

本明細書中で用いられる用語「ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質」はＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合蛋白質を表す。いくつかの実施方案においては、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメインとＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分は：（１）配列番号９の１〜４４３位、配列番号１０の１〜３６４位、配列番号１１の１〜３７９位、配列番号１２の１〜５３１位、配列番号１３の１〜６１１位、配列番号１４の１〜５３１位、配列番号１５の１〜３１２位、配列番号１６の１〜６１１位、配列番号１７の１〜２０７位、配列番号１８の１〜６６５位、配列番号１９の１〜６１０位、配列番号２０の１〜６１１位、配列番号２１の１〜５８０位、配列番号２２の１〜５４０位、配列番号２３の１〜５４２位、および配列番号２４の１〜４３５位のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列を有するか、もしくは配列番号２６の１〜１３２６位、配列番号２７の１〜１０９２位、配列番号２８の１〜１１３７位、配列番号２９の１〜１５９３位、配列番号３０の１〜１８３３位、配列番号３１の１〜１５９３位、配列番号３２の１〜９３６位、配列番号３３の１〜１８３３位、配列番号３４の１〜６２１位、配列番号３５の１〜１９９５位、配列番号３６の１〜１８３０位、配列番号３７の１〜１８３３位、配列番号３８の１〜１７４０位、配列番号３９の１〜１６２０位、配列番号４０の１〜１６２６位および配列番号４１の１〜１３０５位のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列でコードされるか；（２）配列番号９の１〜４４３位、配列番号１０の１〜３６４位、配列番号１１の１〜３７９位、配列番号１２の１〜５３１位、配列番号１３の１〜６１１位、配列番号１４の１〜５３１位、配列番号１５の１〜３１２位、配列番号１６の１〜６１１位、配列番号１７の１〜２０７位、配列番号１８の１〜６６５位、配列番号１９の１〜６１０位、配列番号２０の１〜６１１位、配列番号２１の１〜５８０位、配列番号２２の１〜５４０位、配列番号２３の１〜５４２位および配列番号２４の１〜４３５位のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくは当該アミノ酸配列からなるか；または（３）配列番号２６の１〜１３２６位、配列番号２７の１〜１０９２位、配列番号２８の１〜１１３７位、配列番号２９の１〜１５９３位と配列番号３０の１〜１８３３位、配列番号３１の１〜１５９３位、配列番号３２の１〜９３６位、配列番号３３の１〜１８３３位、配列番号３４の１〜６２１位、配列番号３５の１〜１９９５位、配列番号３６の１〜１８３０位、配列番号３７の１〜１８３３位、配列番号３８の１〜１７４０位、配列番号３９の１〜１６２０位、配列番号４０の１〜１６２６位および配列番号４１の１〜１３０５位のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含むもしくは当該アミノ酸配列からなるものであってもよい。

本発明のいくつかの好ましい実施方案において、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は：（１）配列番号９〜２４のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列を有す、もしくは配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列にコードされるか；（２）配列番号９〜２４のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくは当該アミノ酸配列からなるか；または（３）配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含むもしくは当該アミノ酸配列からなるものであってもよい。

いくつかの好ましい実施方案において、前記ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、厳しいハイブリダイゼーション条件で配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列に相補的な配列を含むか、あるいは配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すヌクレオチド配列の縮退変異体を含む、核酸によりコードされるものであってもよい。いくつかの好ましい実施方案において、前記ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質における免疫グロブリンＦｃ領域由来の部分は、厳しいハイブリダイゼーション条件で配列番号８に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列に相補的な配列を含む、あるいは配列番号８に示すヌクレオチド配列の縮退変異体を含む核酸によりコードされる。

いくつかの優れる実施方案において、前記ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質はＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質変異型を含む。該ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質変異型は、配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列に２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下もしくは５０個個以下のアミノ酸置換、付加または欠失変異を含む変異体を包含し、前記変異型は好ましくは血管新生抑制機能を保持している。一つの実施方案において、前記置換、付加または欠失はＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分に位置している。一つの実施方案において、前記置換、付加または欠失はＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分に位置している。もう一つの実施方案において、前記置換、付加、または欠失は免疫グロブリンＦｃ領域由来の部分に位置している。もう一つの実施方案において、前記置換、付加、または欠失はリンカーおよび／または連結部分に位置している。

ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分または免疫グロブリンＦｃ領域由来の部分における天然修飾以外の、翻訳後修飾部分を含んでいてもよい。これらの修飾は、アセチル化、カルボキシル化、糖化、リン酸化、エステル化、アシル化含むが、これらに限定されない。その結果、修飾されたＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、例えば、ポリエチレングルコール、脂質、多糖もしくは単糖、またはリン酸などの非アミノ酸成分を含んでいてもよい。これらの非アミノ酸成分のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質機能に対する作用は、本明細書における他のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質変異型について説明したのと同様にテストすることができる。ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質が細胞で産生されるとき、翻訳後修飾は正しいフォールディングおよび／または蛋白質機能にとって重要でありうる。それぞれの細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）には、これらの翻訳後修飾活性のための特別な細胞機械と特有の構造が存在し、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質の正しい修飾とプロセシングを確保するために種々の細胞を選択することができる。

本明細書に記載の融合蛋白質は本分野で知られている方法で生産される。例えば、化学合成または核酸発現で生産することができる。本分野で知られた確立された標準液体、または好ましくは固相ペプチド合成法により、本発明ペプチドを簡単に調製することができる（例えば、Ｊ． Ｍ． ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ． Ｄ． Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ （１９８４） ， ｉｎ Ｍ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、ならびにＡ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）を参照）。本分野で既知の技術を用いて前記融合蛋白質を生産し、この蛋白質に含まれると予測されるポリペプチド配列内のシステイン残基の間に一つまたは複数の分子内架橋を形成させることができる（例えば，米国特許Ｎｏ．５４７８９２５参照）。その他、本明細書に記載の蛋白質に対しては、蛋白質のＣ末端またはＮ末端にシステインまたはビオチンを付加させることにより通常の修飾を行ってもよい。

本明細書中で用いられる「治療有効量」または「有効量」とは、薬物が投与対象に対し有益な効果を発揮するために十分な投与量を指す。実際に投与される量、速度および時間的過程は、治療患者の状態と病気の重篤性により定められる。治療の処方（例えば、薬剤量の決定）は最終的には総合診療医その他の医師の責任によるもので、通常は、医師にとって既知の因子である治療対象の疾病、患者個体の状況、薬物伝達部位、投与方法その他により、決定される。

一つの態様では、本発明は血管新生抑制融合蛋白質を提供させる、二種類以上の血管新生抑制剤に由来する複数の血管新生抑制ユニットを含む。好ましくは、前記二種類以上の血管新生抑制剤は血管新生抑制受容体であり、該受容体は、ＤＤＲ１、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＥｒｂＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＴＥＫ、Ｔｉｅ−１、ＨＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＬＫ８、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、プラスミノゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ， ＰＬＧ）、コラーゲンＸＶＩＩＩおよび対立遺伝子変異型から選択されたものであってもよい。一つの具体的実施方案において、前記血管新生抑制剤は血管新生抑制受容体ＶＥＧＦＲとＦＧＦＲである。

特に、本発明者は、高親和力でＶＥＧＦおよびＦＧＦに結合することによって、ＶＥＧＦおよびＦＧＦに誘導される細胞分裂を効率的に抑制する、一連のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を構築した。

いくつかの実施方案において、本発明者は、驚くべきことに、Ｎ末端からＣ末端まで順番にＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分およびＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分を含む融合蛋白質が、ＶＥＧＦおよびＦＧＦへの優れた結合特性を有することを見いだした。好ましくは、前記ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分は、ＶＥＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメイン、ＶＥＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインおよびＶＥＧＦＲ２の第三Ｉｇ様ドメインを含む。さらに好ましくは、前記ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分は、ＦＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン中間機能性配列領域、ＦＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインおよびＦＧＦＲ１の第三Ｉｇ様ドメインを含む。より好ましくは、前記ＦＧＦＲ１のＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域は酸性ボックスを含まず、さらに好ましくは配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施方案において、本発明は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質または（ｉｉ）該融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの、血管新生に媒介または関連する疾患の治療のための組成物または医薬の製造における使用をも含む。例えば、一つの実施方案においては、本発明は、血管新生抑制剤としての医薬の製造における、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質または（ｉｉ）該融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの使用を含む。

いくつかの実施方案において、本発明のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は哺乳類動物細胞系において、配列番号２６〜４１のうちいずれか一つに示す核酸を発現させることによって製造することができる。特には、前記哺乳動物細胞系はＣＨＯ細胞系である。

さらに、本発明は、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来の部分および免疫グロブリンＦｃ領域由来の部分がリンカーによってまたはリンカーによらずに連結されている、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を提供する。

いくつかの実施方案において、本発明はＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質をコードする単離核酸分子を含む。本発明は、医薬の製造におけるこれらの分子の使用をも含む。前記核酸は組み換え、合成、または本分野で利用可能な任意の方法で生産することができ、これには標準的技法を用いたクローニングも含まれる。

いくつかの実施方案において、本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクターをも包含する。前記ベクターは宿主細胞中で前記核酸の発現をさせることが可能な調節配列に前記核酸が連結させた発現ベクターであってもよい。種々のベクターが使用可能である。例えば、適切なベクターには、ウイルス（例えば、天然痘ウイルス、アデノウイルス、バクロウイルスなど）、酵母ベクター、バクテリオファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、およびコスミドが含まれる。

いくつかの実施方案において、本発明は、これらのベクターで形質転換され、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を発現する細胞も含む。本発明に適した宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。これらには、細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫細胞および哺乳類動物細胞が含まれる。使用可能な哺乳類動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、サルおよびヒトの細胞系、ならびにそれらから派生した細胞系などが含まれる。

別の態様では、本発明は、必要とする対象に本発明のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を投与することを含む血管新生を抑制する方法を提供する。好ましくは、前記方法は哺乳類動物で行う。

別の態様では、本発明は、必要とする対象に本発明のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を投与することを含む、哺乳類動物において腫瘍を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、前記腫瘍は固形腫瘍である。

別の態様では、本発明は、必要とする対象に本発明のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を投与することを含む、哺乳類動物において眼内血管新生関連疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、前記眼内血管新生関連疾患は加齢黄斑変性および糖尿病網膜症である。

本発明は、血管新生を抑制するための医薬の製造における、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質の使用に関する。その他、本発明は、血管新生関連疾患を治療または予防するための医薬の製造における、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質の使用に関する。好ましくは、前記血管新生関連疾患は腫瘍または眼内血管新生関連疾患である。

本発明における前記血管新生関連疾患は血管新生依存性腫瘍に限らず、固形腫瘍、造血組織性腫瘍（例えば、白血病）および腫瘍転移；良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｍａ）、神経線維腫（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａ）、トラコーマ（ｔｒａｃｈｏｍａ）、膿原性肉芽腫（ｐｙｏｇｅｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｍａ）、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）；乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）；ルベオーシス（ｒｕｂｅｏｓｉｓ）；遺伝性出血性毛細血管拡張症（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群），心筋血管新生（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、動脈硬化性粥腫血管新生（ｐｌａｑｕｅ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、毛細血管拡張症（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、血友病性関節 （ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ ｊｏｉｎｔ）と血管繊維腫（ａｎｇｉｏｆｉｂｒｏｍａ）を含む。

前記方法のいくつかの実施方案においては、一つまたは複数のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を一緒に（同時に）または時間をずらして（順次）、投与する。その他、前記融合蛋白質は癌治療または血管新生抑制のための医薬と一緒に投与してもよい。

いくつかの実施方案において、本開示の主題方法は単独で使用可能である。または、前記主題方法は、増殖性疾患（例えば、腫瘍）の治療または予防のための通常の抗癌治療法と組合せて使用してもよい。例えば、これらの方法は癌予防ならびに癌再発および手術後転移の予防に用いることができ、他の癌治療の補助手段として用いられてもよい。本開示によれば、標的ペプチド治療剤を使うことによって、通常の腫瘍療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、および手術）の有効性を増強できる。

眼内で、血管新生は、例えば、糖尿病網膜症、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、加齢黄斑変性、角膜移植の際の拒絶反応、血管新生緑内障、および後水晶体線維増殖症（ｒｅｔｒｏｌｅｎｔａｌ ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）に関与している。本開示のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は眼内投与またはほかの投与方法によって投与できる。角膜における血管新生に関連する他の疾患には、流行性乾性角結膜炎（ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ、ＥＫＣ）、ビタミンＡ欠乏症（Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、コンタクトレンズオーバー ウエアー（ｃｏｎｔａｃｔ ｌｅｎｓ ｏｖｅｒｗｅａｒ）、アトピー性角膜炎（Ａｔｏｐｉｃ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、 上位辺縁系角膜炎（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｌｉｍｂｉｃ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、乾燥翼状片角膜炎（ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ ｓｉｃｃａ）、シェーグレン症候群（ｓｊｏｇｒｅｎ）、酒さ性ざ瘡（ａｃｎｅ ｒｏｓａｃｅａ）、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒 （ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、マイコバクテリア感染 （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、脂肪変性（ｌｉｐｉｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、化学的熱傷 （ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｕｍ）、細菌性潰瘍（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｌｃｅｒ）、真菌性潰瘍（ｆｕｎｇａｌ ｕｌｃｅｒ）、単純ヘルペス感染 （Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、帯状疱疹感染（Ｈｅｒｐｅｓ ｚｏｓｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、原虫感染（ｐｒｏｔｏｚｏａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、カポジ肉腫（Ｋａｐｏｓｉ ｓａｒｃｏｍａ）、モーレン潰瘍（Ｍｏｏｒｅｎ ｕｌｃｅｒ）、テリエン周辺角膜変性症（Ｔｅｒｒｉｅｎ’ｓ ｍａｒｇｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、辺縁表皮剥離（ｍａｒｉｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、関節リウマチ、全身性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ）、多発性動脈炎（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、外傷（ｔｒａｕｍａ）、ウェジナーサルコイド症（Ｗｅｇｅｎｅｒｓ ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、強膜炎（Ｓｃｌｅｒｉｔｉｓ）、スティーブンス・ジョンソン症候群（Ｓｔｅｖｅｎ′ｓ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、類天疱瘡（Ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ，ＢＰ）、放射状角膜切開（ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ ｒａｄｉａｌ ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ）、もしくは、角膜移植片拒絶反応（ｃｏｍｅａｌ ｇｒａｐｈ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、鎌状赤血球症（ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｅｍｉａ）、サルコイドーシス （ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、弾力線維性仮性黄色腫（ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍａ ｅｌａｓｔｉｃｕｍ）、パジェット病（Ｐａｇｅｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、静脈閉塞症（ｖｅｉｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、動脈閉塞症（ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、頸動脈閉塞症（ｃａｒｏｔｉｄ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｕｖｅｉｔｉｓ／ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、分枝杆菌感染（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、ライム病（Ｌｙｍｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、イールズ病（Ｅａｌｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ベーチェット氏病（Ｂｅｃｈｅｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜炎（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）または脈絡膜炎（ｃｈｏｒｏｉｄｉｔｉｓ）に至る感染、推定眼ヒストプラズマ症（ｐｒｅｓｕｍｅｄ ｏｃｕｌａｒ ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、ベスト病（Ｂｅｓｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、近視（ｍｙｏｐｉａ）、乳頭小窩ピット（ｏｐｔｉｃ ｐｉｔ）、シュタルガルト病（Ｓｔａｒｇａｒｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、扁平部睫状体炎（ｐａｒｓ ｐｌａｎｉｔｉｓ）、慢性網膜剥離（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）、過粘着性症候群（ｈｙｐｅｒｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、トキソプラズマ病（ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、外傷（ｔｒａｕｍａ）およびレーザー後合併症（ｐｏｓｔ−ｌａｓｅｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が含まれるが、これらに限定されない。他の疾病としては、すべての種類の増殖性硝子体網膜症（ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）を含め、隅角血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｇｌｅ）に関与する疾病および繊維血管（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）または繊維組織（ｆｉｂｒｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ）によって誘発される異常肥厚化に誘導される疾患があるが、これらに限定されない。

投与
本発明の融合蛋白質は単独でも使用できるが、好ましくは医薬組成物として用いられ。該医薬組成物は通常、意図された投与計画方式に沿って選択された適切な医薬賦形剤、希釈剤またはキャリアを含む。融合蛋白質は、任意の適切な方法によって、必要とする患者に投与することができる。正確な投与量は、当該融合蛋白質の正確な性質など数多くの因子により決定される。

適切な投与経路の中には、経口投与、直腸投与、鼻噴投与、局部投与（口腔内投与および舌下投与を含む）、皮下投与、膣内投与または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、くも膜下投与または硬膜外投与を含む）が含まれるが、これらに限定されない。

静脈および病巣部位に対する注射のためには、活性成分は、発熱性因子を含まず、適当なｐＨ値、等張性および安定性を有する非経口投与上許容できる水溶液の形態にある。

本分野の当業者は、適切な溶剤または処方により本発明の融合蛋白質を製剤することができ、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張賦形剤を用いることができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／またはその他の添加剤を加えてもよい。経口投与の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤または経口液などの形態としうる。錠剤は、ゼラチンおよびアジュバントなどの固体キャリアを含んでいてもよい。液体医薬組成物は、通常、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油、または合成油などの液体キャリアを含む。また、生理食塩水、ブドウ糖その他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含んでいてもよい。

以上説明した技術と方案の例または本発明に用いられるその他の技術と方案はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ， Ａ． （ｅｄ） ， １９８０．に見いだされる。

融合蛋白質のクローニングと発現プラスミドの構築
ＶＥＧＦＲ受容体フラグメントとＦＧＦ受容体フラグメントは対応する受容体のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させて得られる。ＩｇＧ１のＦｃフラグメントはヒトＩｇＧ１のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅して得られる。ＰＣＲプライマーを設計する際、異なるフラグメント間には連結配列を挿入し、これらの異なるフラグメントを最後にオーバーラップＰＣＲで連結させて、それぞれの融合蛋白質のリーディングフレームを形成する。同時に、ｃＤＮＡの両端にエンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＰｓｔＩのサイトを付加させる。それぞれの融合蛋白質のｃＤＮＡはエンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＰｓｔＩで切断した後、発現プラスミドにクローニングする。クローニングしたプラスミドはエンドヌクレアーゼ消化、電気泳動、そして最後はＤＮＡシークエンシングで確認される。

本発明では、２＃、４＃、７＃、９＃、１０＃、１１＃、１２＃、１４＃、１５＃、１６＃、２０＃、２１＃、２４＃、２５＃、２７＃、２８＃の組み換え発現プラスミドを構築した。

２＃、４＃、７＃の融合蛋白質は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含み、９＃、１０＃、１６＃、２０＃、２１＃、２４＃、２５＃、および２８＃は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの部分、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。これら１１個の発現プラスミドには、同じＦＧＦＲ１細胞外ドメイン下流プライマー（２＃−ＦＧＦＲ１下流プライマー：ＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＴＣ）、ＩｇＧ１ Ｆｃ上流プライマー（ＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣ）およびＩｇＧ１ Ｆｃ下流プライマー（ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ）を用いた。

残りの融合蛋白質に用いたプライマーを以下に示す。
２＃融合蛋白質：
２＃−ＶＥＧＦＲ１の上流プライマー：
ＡＴＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧ

２＃ −ＶＥＧＦＲ１の下流プライマー：
ＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＧＧＧＴＧＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣ

２＃ −ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＣＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧ

４＃ 融合蛋白質：
４＃ ＶＥＧＦＲ１の上流プライマーは２＃：２＃−ＶＥＧＦＲ１の上流プライマーと同じ。

４＃−ＶＥＧＦＲ１の下流プライマー：
ＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＴＴＧ

４＃ ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＧＧＡＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴ

４＃ ＦＧＦＲ１の下流プライマーは２＃：２＃−ＦＧＦＲ１の下流プライマーと同じ。

７＃の融合蛋白質：
７＃ ＶＥＧＦＲ１の上流プライマーは２＃：２＃−ＶＥＧＦＲ１の上流プライマーと同じ。

７＃ ＶＥＧＦＲ１の下流プライマー：
ＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＡＧ

７＃ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧ

７＃ ＦＧＦＲ１の下流プライマーは２＃：２＃−ＦＧＦＲ１の下流プライマーと同じ。

９＃の融合蛋白質：
９＃の融合蛋白質はＶＥＧＦＲ１Ｄ１、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２、ＶＥＧＦＲ２Ｄ３、ＦＧＦＲ、およびＦｃの五つのフラグメントを含む。

以下のプライマーを用いて、ｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＴ１ｓ７ｃＤＮＡを用いてＶＥＧＦＲ１Ｄ１を増幅した：
９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマー：
ＴＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧ

９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の下流プライマー：
ＡＴＣＴＣＴＡＣＧＡＡＡＧＧＴＣＴＡＣＣＴＧＴＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＧ

以下のプライマーを用いて、ｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＴ１ｓ７ｃＤＮＡを用いてＶＥＧＦＲ１Ｄ２を増幅した：
９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の上流プライマー：ＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴ

９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の下流プライマー：
ＣＡＴＧＡＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴＴＧ

以下のプライマーを用いて、ｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＫ１ｓ７をテンプレートとしてＶＥＧＦＲ２Ｄ３を増幅した：
９＃−ＶＥＧＦＲ２Ｄ３の上流プライマー：
ＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ

９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の下流プライマー：ＡＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣ

９＃ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣ

１０＃の融合蛋白質：
１０＃ＶＥＧＦＲ１フラグメントドメイン配列のＰＣＲプライマーは９＃と同じ

１０＃−ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＡＡＡＡＴＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧＧ

１６＃融合蛋白質：
１６＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーは９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーと同じ。

１６＃ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒの下流プライマーは９＃−ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒ下流プライマーと同じ。

１６＃ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧＧＣＣＧＴＣＣＣＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＴＧ

２０＃の融合蛋白質：
２０＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーは９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーと同じ。

２０＃−ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒの下流プライマーは９＃− ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒの下流プライマーと同じ。

２０＃−ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＧＧＧＴＧＣＧＡＴＴＡＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣ

２１＃融合蛋白質：
２１＃は１０＃をテンプレートとして用い，下記プライマーを用いて１０＃ＦＧＦＲ１Ｄ１ｈ中の塩基の一つをＣｙｓからＳｅｒに変えた：

２１＃−ｍｕｔＦ：
ＣＴＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣ

２１＃−ｍｕｔＲ：
ＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＡＧ

２４＃融合蛋白質：
２４＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーは９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーと同じ。

２４＃ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒの下流プライマーは９＃−ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒの下流プライマーと同じ。

２４＃ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣ

２５＃融合蛋白質：
２５＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーは９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーと同じ。

２５＃ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒの下流プライマーは９＃−ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３Ｒのプライマーと同じ。

２５＃ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＴＧＧ

２８＃の融合蛋白質：
２８＃は、２５＃をテンプレートとして、２＃−ＶＥＧＦＲ１の上流プライマーと同じ上流プライマーおよびＩｇＧ１ Ｆｃの下流プライマーと同じ下流プライマーを用いてＰＣＲを行った。

１１＃、１４＃、２７＃はＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。これら３つの組み換えプラスミドには、同じＩｇＧ１ Ｆｃ上流プライマーおよびＩｇＧ１ Ｆｃ下流プライマーを用いた。

使用したプライマーのうち残りのものを以下に示す：

１１＃の融合蛋白質：
１１＃−ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣ

１１＃−ＦＧＦＲ１の下流プライマー：
ＴＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＴＣ

１１＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマー：ＴＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧ

１１＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の下流プライマー：９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の下流プライマーと同じ：

１１＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の上流プライマーは９＃−ＶＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の上流プライマーと同じ。

１１＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｄ３の下流プライマー：
ＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣ

１４＃の融合蛋白質：
１４＃−ＦＧＦＲ１の上流プライマー：
ＴＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧ

１４＃ＦＧＦＲ１の下流プライマーは１１＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の下流プライマーと同じ。

１４＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーは１１＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーと同じ。

１４＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の下流プライマーは９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の下流プライマーと同じ。

１４＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の上流プライマーは９＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の上流プライマーと同じ。

１４＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の下流プライマーは１１＃−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３の下流プライマーと同じ。

２７＃融合蛋白質：
２７＃は、１４＃をテンプレートとして、２７＃−ＦＧＦＲ１の上流プライマー（ＴＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＣＴＣＣＡＴ）およびＩｇＧ１ Ｆｃ下流プライマーと同じ下流プライマーを用いてＰＣＲを行う：

１２＃融合蛋白質は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。用いられたプライマーを以下に示す：

１２＃の上流プライマーは９＃−ＦＧＦＲ１の上流プライマーと同じ。

１２＃ＶＥＧＦＲ２の下流プライマーは１１＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｄ３の下流プライマーと同じ。

Ｆｃの上流プライマー１：ＦｃＦｏｒ１：ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣ

Ｆｃの下流プライマー：前記のＩｇＧ１ Ｆｃ下流プライマーと同じ。

１５＃の融合蛋白質は、ＶＥＧＦＲ１細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１ Ｆｃを含む。使用したプライマーを以下に示す：

１５＃の上流プライマーは２＃−ＶＥＧＦＲ１の上流プライマーと同じ：
ＡＴＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧ

１５＃ＶＥＧＦＲ２の下流プライマーは１１＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｄ３の下流プライマーと同じ

Ｆｃの上流プライマー１：ＦｃＦｏｒ１：ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣ
Ｆｃ下流プライマー：前述のＩｇＧ１ Ｆｃの下流プライマーと同じ。

融合蛋白質の発現と精製
本発明の融合蛋白質は、本分野で常用されている技術により発現および精製できる。Ｑｉａｇｅｎのプラスミド精製キット（ＭＡＸ）を用いて、前記融合蛋白質プラスミドに対応するＤＮＡを精製し、紫外可視分光光度法でプラスミドＤＮＡの濃度を確認した、ＦＵＧＥＮＥ６リボソーム（Ｒｏｃｈｅ）を用いてプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。具体的な形質転換方法については製品の取扱説明書を参照した。求められる蛋白質発現量に基づき、本研究では二種類の方法を用いて蛋白質発現を行った：第一の方法は一過性の発現であり、通常、トランスフェクトした４８〜７２時間後に融合蛋白質を含む培養液上清を収穫し、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡで融合蛋白質の相対含有量を確認し、これにより迅速かつ効率的に融合蛋白質が得られる；第二の方法では、組み換え蛋白質薬物の発現を用いて、常用のＤＨＦＲ欠陥型ＣＨＯ細胞発現システムを生産し、安定発現細胞系を構築する。その基本的なプロセスは、細胞のトランスフェクション、安定にトランスフェクトした細胞の選択、クローンの選択、ストレスによる増幅、培地とプロセスの最適化などを含み、最終的に無血清培地でのＣＨＯ工程細胞株の大規模懸濁培養を実現する。培養産物を回収し、プロテインＡアフィ二ティーカラムを用いて融合蛋白質を精製した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、精製した蛋白質を分析した。次に、必要な発現産物を含む溶出液を全て合わせて、０．２２μｍ口径のフィルターで濾過し、Ｌｏｗｒｙ法など種々の方法で蛋白質定量を行った。本研究のＣＨＯ細胞培養の体積は１０リットルのバイオリアクターの規模に達し、精製で得られた融合蛋白質は動物試験に必要な蛋白量を満足した。また、将来的に、この精製方法を拡大するための基礎を築いた。

蛋白質レベルでの、融合蛋白質のＶＥＧＦとＦＧＦに対する中和作用の検証
ＣＨＯ細胞により発現された融合蛋白質を得た後、本研究においては蛋白質レベルで融合蛋白質のＶＥＧＦＲおよびＦＧＦへの結合能について評価した。本研究では、結合実験および親和力実験を検証のために行った。結合実験の手順は：まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートにＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２をコーティングし、ＢＳＡを用いてコーティングされたウェルをブロッキングし、同濃度の各融合蛋白質を加えた。洗浄後、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体をさらに加え、現像し、現像を停止し、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、信号の強さによって、ＶＥＧＦＲおよびＦＧＦ−２への結合能を有する融合蛋白質をスクリーニングした。親和力実験は溶液系における融合蛋白質のＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２への親和力を決定することを目的として行われた。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートにＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２の捕捉抗体を吸着させ、ウェルをＢＳＡでブロッキングした。次に、予め調製またはインキュベートした融合蛋白質とＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２との混合液および希釈勾配標準品を添加し、インキュベートした。次に、ＨＰＲラベルした検出抗体（遊離ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２を特異的に検出する抗体２を使用）を添加し、現像し、現像停止し、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、融合蛋白質とＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２との混合液における遊離のＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２の相対濃度を検出した。以上の実験によって、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２に対する双遮断作用を有する融合蛋白質がスクリーニングされた。

細胞レベルでの、融合蛋白質のＶＥＧＦとＦＧＦに対する中和作用の検証
融合蛋白質のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合能を蛋白レベルで確認した後、本研究では融合蛋白質の血管新生に対する抑制作用を細胞レベルで検証した。本研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）分裂試験とＨＵＶＥＣ細胞遊走試験を用いて、融合蛋白質が血管内皮細胞の分裂力と遊走力を抑制する能力を検証した。融合蛋白質がＨＵＶＥＣ細胞の分裂を抑制する能力は、ＨＵＶＥＣ細胞分裂試験によって測定できる。この実験では、まず、９６穴プレートにウェル当たり３０００個のＨＵＶＥＣ細胞を播種し、３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターで培養し、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２および種々の濃度の融合蛋白質とＶＥＧＦＲもしくはＦＧＦ−２との混合液をそれぞれ加え、３〜４日培養した。次に、１０％のＣＣＫ−８を添加し、２時間培養した後に、ＥＬＩＳＡプレート上で４５０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の差異によって、当該融合蛋白質が有する、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２に誘導される血管内皮細胞の分裂を抑制する能力を評価し、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２抑制についての融合蛋白質の半数効果濃度が得られた。融合蛋白質がＨＵＶＥＣ細胞の遊走を抑制する能力をＨＵＶＥＣ細胞遊走試験により測定した。この、実験では、まず、上室に５０００個のＨＵＶＥＣ細胞と種々の濃度の融合蛋白質とを接種し、下室にＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２を含有する培養液を６００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２０〜２４時間培養し、上室の膜の正面にある細胞を除去し、膜の背面の細胞を固定、染色し、ＰＢＳで洗浄した。そして、倒立顕微鏡で観察、計数した。膜の背面のＨＵＶＥＣ細胞数を計数することによって、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２刺激により誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の遊走状況が分かり、培養液に種々の濃度の融合蛋白質を添加することによって、融合蛋白質が血管内皮細胞の遊走を抑制する能力を検証できた。以上の実験によって、本研究で構築される新規融合蛋白質がＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２によって誘導される血管内皮細胞の分裂と遊走を抑制する能力を検証した。このことは、次の動物実験のために基礎を築いた。

腫瘍モデルによる融合蛋白質の腫瘍増殖に対する抑制力の検証
蛋白質レベルと細胞レベルでの実験により、本研究の新規融合蛋白質がＶＥＧＦＲおよびＦＧＦ−２信号を遮断する作用を証明した後、本研究では動物腫瘍モデルでその抗腫瘍力を検証した。本研究では、血管新生と腫瘍の治療薬研究で一般的なモデル、例えば、ＬＬＣマウス肺癌由来腫瘍細胞、Ｕ８７悪性ヒト神経膠芽腫細胞、Ｂ１６黒色腫など、を用いて、融合蛋白質の抗血管新生および抗腫瘍効果を検証した。動物試験では、一般な対象群の他に、同類薬物対象群、例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＦＰ−１０３９、も含み、抗腫瘍力の比較性データを得た。実験中、１００μＬの適切な数の腫瘍細胞を皮下注射でＣ５７マウスの背中後ろの側面に注入し、ノギスで毎週二回、腫瘍の体積を測定した。腫瘍が約２００立方ミリメートルに成長したら、種々の濃度の融合蛋白質は皮下注射し、２〜３週後にマウスを致死させた。ノギスで腫瘍の体積を測定し、腫瘍の大きさによって融合蛋白質の抗腫瘍効果を検証した。さらに、免疫組織化学などの手法を用いて各種腫瘍組織を分析し、血管新生の調節機構を探索した。

実施例１：双標的融合蛋白質の組み換えプラスミドの構築
市販のｃＤＮＡ（ＰＣＲ Ｒｅａｄｙ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ， 成人結腸癌常組織由来、ＢｉｏＣｈａｉｎ社）をＦＧＦＲ１フラグメントのテンプレートとし、市販のプラスミドｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＴ１ｓ７ｃＤＮＡ （ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）をＶＥＧＦＲ１フラグメントのテンプレートとし、市販のプラスミドｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＴ１ｓ７（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）をＶＥＧＦＲ２フラグメントのテンプレートとした。ヒト血液ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて健康人血液からトータルＲＮＡを抽出した。逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の取扱説明を参照して、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、得られたｃＤＮＡをＩｇＧ１のＦｃフラグメントのテンプレートとした。逆転写キットの取扱説明によって、ＲＴ−ＰＣＲを行った、具体的な手順は：Ｏｌｉｇｏ ｄＴ、ｄＮＴＰ、トータルＲＮＡおよびＤＥＰＣ Ｈ_２Ｏを均一に混合し、７０℃で１０分間反応させ、氷上に５分間置いて、ＲＮａｓｅ抑制剤、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素および反応緩衝液を添加し、４２℃で１時間反応させ、次に７０℃で１５分間反応させ、得られたｃＤＮＡをテンプレートとして用いた。

成人結腸癌常組織由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによって種々のＦＧＦＲ１フラグメントを増幅し（プライマーは下記表１に記載）、市販のプラスミドをテンプレートとして種々のＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２フラグメント（プライマーは下記表１に記載）、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによって、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントを増幅した（プライマーは下記表１及び表２に記載）。ＰＣＲプライマーを設計する際、ＶＥＧＦＲ１フラグメント、ＶＥＧＦＲ２フラグメント、ＦＧＦＲ１フラグメントおおびＩｇＧ１のＦｃフラグメントの間に２０個またはそれ以上の数の相補的塩基対を連結配列として導入し、各フラグメントを後でオーバーラップＰＣＲで連結して、それぞれの融合蛋白質のリーディングフレームを形成し、同時に、ＰＣＲ産物の両端にＢｓｐＥ ＩとＰｓｔ Ｉの制限酵素サイトを添加した。

その後、オーバーラップＰＣＲを行い、増幅によって各ＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質フラグメントを得た。オーバーラップＰＣＲの反応条件は、９８℃で５分間予備変性し、９８℃で３０秒変性、５６℃で４５秒アニーリング、および７２℃で２分間伸長というサイクルを３０回行い、最後にさらに１０分間伸長反応するというものであった。ＰＣＲプライマーを設計する際、それぞれの断片の間に連結配列を導入し、各断片を最後にオーバーラップＰＣＲにより連結できるようにした。オーバーラップＰＣＲの反応プロセスは２つのラウンドに分かれ、第１のラウンドでは、連結に必要なフラグメントは含まれるが、プライマーは含まれず、条件は：９８℃で５分間予備変性し、９８℃で３０秒変性、５６℃で４５秒アニーリング、および７２℃で５分間伸長というサイクルを６回行い、最後に７２℃でさらに１０分間伸長するというものであった。第１ラウンドの後に、両端用のプライマーを添加して、第二ラウンドのＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は：９８℃で５分間予備変性し、９８℃で３０秒変性、５６℃で４５秒アニーリング、および７２℃で２分間伸長のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間伸長するというものであった。これにより、それぞれの融合蛋白質のリーディングフレームを形成し、同時に、ｃＤＮＡの両端にＢｓｐＥ ＩおよびＰｓｔ Ｉヌクレアーゼサイトを添加した。

増幅の後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＬＡＧＥＮ社）を用いて、ＰＣＲ増幅フラグメントを精製した。それぞれの融合蛋白質のｃＤＮＡおよび真核発現プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ）を、それぞれ、ＢｓｐＥ ＩおよびＰｓｔ Ｉで消化した。９０Ｖの電圧下で、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＬＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＬＡＧＥＮ社）を用いて目的フラグメントを回収し、１６℃で１時間リガーゼ（ＮＥＢ社）によるライゲーションを行った。ライゲーション反応の混合物を、大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテントセルに形質転換し、ここで形質転換の条件は：４２℃で９０秒反応させ、３分間氷上に置き、無菌で抗体を含有しないＬＢ培養液を添加し、３７℃で２５０回転／分の培養シェーカーで１時間培養した。次に、アンピシリン添加ＬＢプレートに塗付し、３７℃のインキュベーターで一晩培養した。単一コロニーを採取し、アンピシリン含有のＬＢ培養液に添加し、３７℃で２５０回転／分のシェーカーで一晩培養し、アルカリ溶菌法によってプラスミドを抽出した。制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、９０Ｖの電圧で１％アガロースゲル電気泳動で検定し、エンドヌクレアーゼ消化結果が正しい組み換えプラスミドは、ＤＮＡシークエンシングで確認した。以上の手順によって、組み換え発現プラスミド２＃、４＃、７＃、９＃、１０＃、１１＃、１２＃、１４＃、１５＃、１６＃、２０＃、２１＃、２４＃、２５＃、２７＃、２８＃を構築した。

その中、２＃、４＃および７＃の融合蛋白質は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、およびＩｇＧ１のＦｃを有する。ｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＴ１ｓ７ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによってＶＥＧＦＲ１部分の細胞外ドメインを増幅し、ヒト結腸癌組織ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによってＦＧＦＲ１部分の細胞外ドメインを増幅し、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅した。その後、オーバーラップＰＣＲで三つのフラグメントが連結したＰＣＲ産物が得られる。これを消化およびライゲーションして、発現ベクターに導入した。使用されたプライマーを表１に示した。

９＃、１０＃、１６＃、２０＃、２１＃、２４＃、２５＃、および２８＃は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの部分、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。まず、９＃を構築した。ｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＴ１ｓ７ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによってＶＥＧＦＲ１Ｄ１フラグメントおよびＶＥＧＦＲ１Ｄ２フラグメントを増幅し、ｐＢＬＡＳＴ４５−ｈＦＬＫ１ｓ７をテンプレートとして、ＰＣＲによってＶＥＧＦＲ２Ｄ３フラグメントを増幅し、ヒト結腸癌組織ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによって、ＦＧＦＲ１部分の細胞外ドメインを増幅し、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅した。そして、オーバーラップＰＣＲによって５つのフラグメントが連結したＰＣＲ産物が得られた。消化およびライゲーションして、発現ベクターに導入した。更に、９＃をテンプレートとして、ＰＣＲによってＶＥＧＦＲフラグメントを増幅し、ヒト結腸癌組織ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分を増幅し、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅した。そして、オーバーラップＰＣＲによって、三つのフラグメントが連結したＰＣＲ産物が得られ、消化およびライゲーションして発現ベクターに導入し、１０＃、１６＃、２０＃、２１＃、２４＃および２５＃の構築物が得られた。次に、１０＃をテンプレートとして、表１に示すプライマーを用いたＰＣＲにより１０＃ＦＧＦＲ１Ｄ１ｈ中の塩基の一つを変異させた。特に、２１＃構築物は、部位特異的突然変異キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＳＴＡＲＴＡＧＥＮ社）の取扱説明に従って、ＣｙｓをＳｅｒに変換して得られた。具体的なプロセスは以下のとおりである：ＰＣＲチューブに脱イオン水、１０＃プラスミド、ｄＮＴＰ、表１に示す突然変異プライマー、反応緩衝液、Ｐｆｕ酵素を添加し、以下の条件でＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は：９５℃で２分間予備変性し、９５℃で５０秒変性、６０℃で５０秒アニーリング、および６８℃で８分間伸長のサイクルを１８回行い、最後に１０分間伸長させた。ＰＣＲ終了後、１μＬのＤｐｎ Ｉ（ＮＥＢ社）を添加し、３７℃で１時間反応させ、反応産物を２μＬ取って、大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテントセルに形質転換させた。形質転換の条件は：４２℃で９０秒反応させ、３分間氷上に置き、無菌で抗体を含有しないＬＢ培養液を添加し、３７℃、２５０回転／分の培養シェーカーで１時間培養し、アンピシリン添加ＬＢプレートに塗付し、３７℃のインキュベーターで一晩培養した。単一コロニーを採取し、アンピシリン含有ＬＢ培養液に添加し、３７℃、２５０回転／分のシェーカーで一晩培養し、アルカリ溶菌法によってプラスミドを抽出し、そしてＤＮＡシークエンシングで確認した。２５＃をテンプレートとし、２＃ＶＥＧＦＲ１の上流プライマーおよびＩｇＧ１ Ｆｃの下流プライマーを用いてＰＣＲを行い、２８＃構築物が得た。使用したプライマーは表１に示した。

１１＃、１４＃および２７＃は、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。ヒト結腸癌組織ｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲによってＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分を増幅し、９＃をテンプレートとしたＰＣＲによってＶＥＧＦＲフラグメントを増幅し、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅した。そして、オーバーラップＰＣＲによって三つのフラグメントが連結したＰＣＲ産物を得て、消化およびライゲーションして発現ベクターに導入した。これにより、１１＃と１４＃が構築された。更に、１４＃をテンプレートとしたＰＣＲによって２７＃の構築物を増幅した。使用したプライマーは表１に示した。

１２＃融合蛋白質は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。９＃構築物をテンプレートとして、９＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ１の上流プライマーおよび１１＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｄ３の下流プライマーを用いて、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅した。そして、オーバーラップＰＣＲによって、二つのフラグメントが連結したＰＣＲ産物が得られた。これを、消化およびライゲーションして、発現ベクターに導入し、これにより１２＃を構築した。

１５＃の融合蛋白質は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。９＃構築物をテンプレートとして、２＃ＶＥＧＦＲ１上流プライマーおよび１１＃ＶＥＧＦＲ１Ｄ２Ｄ３Ｄ下流プライマーを用いて、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとしてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅した。さらに、オーバーラップＰＣＲにより、二つのフラグメントが連結したＰＣＲ産物が得られた。これを、消化およびライゲーションして、発現ベクターに導入し、これにより１５＃を構築した。

２６＃融合蛋白質は、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインの部分およびＩｇＧ１のＦｃを含む。ヒト結腸癌組織のｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによってＦＧＦＲ１細胞外ドメインの部分を増幅し、配列番号７３の上流プライマーおよび配列番号７４の下流プライマーにより、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅した。そして、オーバーラップＰＣＲによって、二つのフラグメントが連結したＰＣＲ産物が得られた。これを、消化およびライゲーションして、発現ベクターに導入し、これにより２６＃を構築した。

それぞれの融合蛋白質中のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃの蛋白質配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を表２に示した。融合蛋白質の構造の模式図を図１に示す。

実施例２：融合蛋白質の一過性発現および定量
ＭＡＸプラスミド抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、各融合蛋白質プラスミドのＤＮＡを精製した。紫外分光光度法によってプラスミドＤＮＡの濃度を確認した、組換プラスミド１μｇおよび６μＬリポソーム（ＦｕＧＥＮＥ ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ， Ｒｏｃｈｅ社）を１００μＬの新鮮ＩＭＤＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社）に均一に混合し、１５分間放置した。次に、これを３×１０^５／ｍＬの細胞密度で６穴プレートに播種された後に一晩培養したＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に加えた。８８％ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ、１％ＨＴおよび１％グルタミン（ＧＩＢＣＯ社商品）を含む細胞完全培養液を用い、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで４８時間培養した後、上清液を収集した。ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ蛋白質定量キット（ＢＥＴＨＹＬ社）を用いて、ＣＨＯ細胞により発現および分泌された融合蛋白質の相対含有量を決定した。具体的な手順としては：アフィニティー精製された濃度１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ蛋白質を１００μＬ、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ＩＭＭＵＬＯＮ社）にコーティングし、一晩経過させた。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液を用いて五回洗浄した後、コーティングされた各ウェルを２００μＬの新たに調製したブロッキング溶液（ブロッキング原液：ＰＢＳ＝１：１９）でブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で５回洗浄し、そして各ウェルに、標準としての勾配希釈された（初期濃度は２００ｎｇ／ｍＬ，ＰＢＳで２倍ずつ希釈）ＩｇＧ１００μＬ、および勾配希釈された各融合蛋白質の培養上清（各培養上清の濃度からスタートして、ＰＢＳで５倍ずつ希釈）１００μＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液を用いて五回洗浄した後、ＰＢＳで１：１００００希釈された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）１００μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した後、１００μＬの現像液（ＫＰＬ社）で現像し、最後に１００μＬ停止液（ＫＰＬ社）を添加して、現像を停止させた。そして、ＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定した。標準曲線により、種々の融合蛋白質の濃度が決定された。

実施例３：融合蛋白質の結合実験
ＥＬＩＳＡ法を用いて、上記で構築された融合蛋白質のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合能を測定した。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ＩＭＭＵＯＮ社）に、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）および５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有する溶液（１００ｎｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ社）含有）１００μＬを別々にコーティングし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、２００μＬの新たに調製したブロッキング液（ＫＰＬ社）（ブロッキング原液：ＰＢＳ＝１：１９）を用いてコーティングされたマイクロウェルをブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、２０ｎｇ／ｍＬの各融合蛋白質（ＰＢＳに溶解、ｐＨ＝７．２）を１００μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した。そして、ＰＢＳで１：１００００希釈された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）１００μＬを添加した。３７℃で１時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した後、１００μＬの現像液（ＫＰＬ社）で現像し、最後に１００μＬの停止液（ＫＰＬ社）を添加して、現像を停止させた。そして、ＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。融合蛋白質のＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２への結合能が強ければ、吸光度が高く、信号も強い。信号の強さに基づいて、２５＃および２８＃の融合蛋白質はＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２の両者に対し高い結合能を有することが分かった。融合蛋白質のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合の比較を図２に示した。

実施例４：融合蛋白質の安定発現と精製
高い結合能を有する２５＃融合蛋白質ならびにコントロールとしての１２＃および１５＃融合蛋白質の組み換えプラスミドをリボソーム（Ｒｏｃｈｅ社）により、ＤＨＦＲ欠陥型ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。具体的には、組み換えプラスミド５μｇおよび３０μＬのリボソーム（ＦｕＧＥＮＥ ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ， Ｒｏｃｈｅ社）を１００μＬの新鮮なＩＭＤＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社）に均一に混合し、１５分放置した。そして、これを１０ｃｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に３×１０^５／ｍＬの細胞密度で播種された後に一晩培養したＤＨＦＲ欠陥型ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に添加し、１０％ＦＢＳ、１％ＨＴおよび１％グルタミンをＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）に含む細胞完全培養液を用いて３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２〜３日培養した。次に、トリプシン（ＧＩＢＣＯ社）で細胞を消化し、３０ｍＬの無血清３０２培地（ＳＡＦＣ社）を入れたフラスコに３×１０^５／ｍＬの細胞密度で接種し、１００回転／分、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで１０^６／ｍＬの細胞密度まで選択的に培養した。３０００個の細胞を１０ｃｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種（培養液は１０％のＦＢＳおよび１％グルタミンをＩＭＤＭ培地中に含む）し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養してモノクローンを形成した。これらのモノクローンと取り、９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で培養した、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ蛋白定量キット（ＢＥＴＨＹＬ社）を用いて、それぞれのモノクローンが発現および分泌した融合蛋白質の相対含有量を確認した。この際の具体的な条件と手順は、実施例２における融合蛋白質の相対含有量の測定の場合と同じである、発現量が最も高い融合蛋白質をスクリーニングし、６穴プレートに移して約７０％コンフルエンスまで培養し、トリプシンで細胞を消化し、１０ｃｍ培養皿に移した。種々の濃度（１０ｎＭ，２０ｎＭ，５０ｎＭ，１００ｎＭ，２００ｎＭおよび５００ｎＭ）のメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ， ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ社）を添加することで、徐々にストレスを増加させた。ストレスを増幅させた後、トリプシンで細胞を消化し、３×１０^５／ｍＬの細胞濃度でフラスコに播種した。単一細胞の発現レベルを測定し、特定の融合蛋白質を発現する遺伝的操作ＣＨＯ細胞株が得られた。最終的に、遺伝的操作ＣＨＯ細胞株は、ｐＨ７．０の無血清３０２培地（ＳＡＦＣ社）で３７℃、５％ＣＯ_２、４０％溶存酸素および８０回転／分で大規模懸濁培養（培養体積は１０Ｌに達する）した。遠心で培養産物を回収し、上清を取って０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濾過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ社）の取扱説明書に従って、アフィニティークロマトグラフィーを行った。具体的には、まず、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．０）でＰｒｏｔｅｉｎＡ親和カラムを平衡化し、そして上清をカラムにロードして、ＰＢＳ緩衝液で平衡化し、最後に、クエン酸緩衝液（ｐＨ：３．０）で溶出して、溶出液を回収し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｓ／Ｄ（０．３％リン酸トリプチル／１％Ｔｗｅｅｎ８０）を添加し２４℃で６時間放置してウィルスを不活性化した。そして、分子篩を用いて、目的蛋白質をさらに精製した。まず、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの溶出液を透析袋（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に入れて、ＰＢＳ緩衝液で透析した。１０ＫＤ限外ろ過カップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒａ社）で蛋白質を濃縮し、限外ろ過カップにより濃縮された試料をＰＢＳ緩衝液で平衡化した分子篩クロマトクラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＣＥ社）にロードし、そしてＰＢＳ緩衝液で溶出し、溶出ピークを回収した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、精製蛋白質を分析した（図３）。次に、必要な発現産物を含有する溶出液を合わせ、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濾過した後、Ｌｏｗｒｙ法など種々の方法で蛋白質の定量を行った。

実施例５：融合蛋白質の勾配結合実験
実施例３と同様に、ＥＬＩＳＡ法を用いて、上記で構築した融合蛋白質のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合能を検出した。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦおよび５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有する溶液を１００μＬコーティングし、そして３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、２００μＬの新たに調製されたブロッキング液（ＫＰＬ社）（ブロッキング原液：ＰＢＳ＝１：１９）を用いてコーティングされた各ウェルをブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、１００μＬの種々の融合蛋白質を種々の濃度で含有する（蛋白質の初期濃度は１００００００ｐＭであり、１：５の比で希釈）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で５回洗浄し、ＰＢＳで１：１００００に希釈した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＰＲ二次抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）を１００μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した後、１００μＬの現像液（ＫＰＬ社）を添加して現像した。最後に、１００μＬの停止液（ＫＰＬ社）を添加し、現像を停止させた。そして、ＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。信号の強さによって、融合蛋白質のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への勾配結合能を確認した。１２＃、１５＃および２５＃の融合蛋白質のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への勾配結合能の比較を図４Ａに示す。そして、２５＃の融合蛋白質はＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質（２６＃と表記）とも比較し、図４Ｂに示した。ここで、２６＃ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインおよびＦｃ領域を含み、そのアミノ酸配列は配列番号７１に示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号７２に示されている。前記２６＃融合蛋白質は次のようにして得られる：実施例１と同様に、ヒト結腸癌常組織由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによってＦＧＦＲ１フラグメントを増幅し（プライマーは配列番号７３と配列番号７４）、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによってＩｇＧ１のＦｃフラグメントを増幅した（プライマーは配列番号４３と配列番号４４）。これらをオーバーラップＰＣＲで連結し、発現ベクターにクローニングした。本実施例では、４５０ｎｍにおける信号がより強いことから分かるように、ＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質モル濃度の増加に伴い、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合能は増大し、融合蛋白質モル濃度の勾配希釈に伴い、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合能は弱くなることが示された。

実施例６：融合蛋白質の親和力実験
親和性実験により、溶液系における融合蛋白質のＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２への親和力を決定した。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに１．０μｇ／ｍＬのＶＥＧＦを１００μＬまたは２．０μｇ／ｍＬのＦＧＦ−２キャプチャー抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１００μＬコーティングした。次に、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した、そしてブロッキング液（ＫＰＬ社）を用いて、コーティングされた各ウェルをブロッキングし（実施例３を参照）、３７℃で１時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した。次に、予め調製およびインキュベートした融合蛋白質とＦＧＦ−２との混合液および勾配希釈の標準品を添加した。具体的な調整方法としては：１２＃、１５＃および２５＃のＦｃ融合蛋白質の開始濃度は、８０００００ｐＭとし（ＰＢＳに溶解）、１０倍ずつの希釈勾配系列を作り、２０ｐＭのＶＥＧＦ溶液と１：１混合した。つまり、それぞれの蛋白質の開始濃度は４０００００ｐＭであり、ＶＥＧＦの終濃度は１０ｐＭであった。２５＃および２６＃のＦｃ融合蛋白質の開始濃度は２００ｐＭとし（ＰＢＳに溶解）、２倍ずつの希釈勾配系列を作り、各融合蛋白質は２０ｐＭのＦＧＦ−２溶液と１：１で混合させた。つまり、蛋白質の開始濃度は２００ｐＭであり、ＦＧＦ−２の終濃度は１０ｐＭであった。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した。次に、１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ検出抗体１００μＬまたは２５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２検出抗体１００μＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）（特異的に遊離のＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２抗体を検出できる）を添加した。プレートを、３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した。次に、ＨＲＰラベルしたストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加した（ＰＢＳで１：２００希釈）。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で５回洗浄し、そしてウェルに１００μＬ現像液（ＫＰＬ社）を添加して適切な時間（約１５〜３０分）現像した。最後に、１００μＬの停止液（ＫＰＬ社）で現像を停止し、ＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。融合蛋白質とＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２との混合液中における遊離のＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２の相対濃度を決定した。溶液系における１２＃、１５＃および２５＃の融合蛋白質のＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２への親和力を比較し、５Ａおよび５Ｂに示した。そして、２５＃融合蛋白質はＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質（２６＃と表記）とも比較し、５Ｃおよび５Ｄに示した。ここで、２６＃のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインおよびＦｃ領域を含む。本実施例から、本発明で構築されたＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質（例えば、１２＃、１５＃、２５＃）は溶液系においてＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２に対し高い親和力を有することが示された。遊離のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２の量が融合蛋白質濃度の増加に伴い少なくなることから分かるように、親和力は濃度の上昇に伴って増加する。溶液系における本発明のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質１２＃、１５＃および２５＃の、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２への親和力を図５に示す。本実施例から分かるように、本発明で構築されたＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ融合蛋白質は、溶液系においてＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への親和力を有する。遊離のＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２の量が少なくなることから分かるように、濃度の上昇に伴い親和力は増加する。

実施例７：正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の分裂抑制試験
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）分裂試験を用いて、融合蛋白質が血管内泌細胞の分裂を抑制する能力を調べた。ＨＵＶＥＣ完全培地（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を用いて、ＨＵＶＥＣ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで対数増殖期まで培養した。トリプシンによる消化の後に、ＨＵＶＥＣをカウントした、ウェル当たり３０００個のＨＵＶＥＣ細胞を、９６穴プレート中の１％ＦＢＳ含有ＨＵＶＥＣ基本培地（ＡｌｌｅＣｅｌｌｓ社）に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで一晩培養した。１００μＬの１％ＦＢＳを含有するＨＵＶＥＣ基本培地で希釈した１００μＬのＶＥＧＦ（終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）または１００μＬのＦＧＦ−２（終濃度は５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）、および種々の量の融合蛋白質およびＦＧＦ−２との混合液１００μＬ（融合蛋白質の終濃度は４０ｐＭ、１％ＦＢＳ含有ＨＵＶＥＣ基本培地で１０倍希釈、ＦＧＦ−２の終濃度は５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、さらに３〜４日培養した。次に、培地を取って、１０％ＣＣＫ−８試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を含有する培地を加えて２時間培養し、ＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。吸光度の差異によって、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２に誘導されるＨＵＶＥＣ細胞分裂を抑制する融合蛋白質の能力を決定した。融合蛋白質が、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２に誘導されるＨＵＶＥＣ細胞分裂を抑制する効果および相対的抑制率を図６に示した。本実施例から分かるように、本発明で構築されたＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質（例えば、１２＃、１５＃および２５＃）は、細胞レベルで生物学的活性および機能を有し、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞分裂を抑制でき、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２への結合能を有する。ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞分裂の抑制から分かるように、前記結合能は融合蛋白質のモル濃度の増加に伴い増加する。

本発明を具体例（実施例）によって説明した。但し、本分野における当業者は、本発明が各々の具体的な実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において当業者が種々の修正や変更を行うことが可能で、本発明の精神と範囲から外れることなく、本明細書に記載の各技術的特徴を組み合わせることが可能であることを理解する。そのような修正および変更もまた、本発明の範囲内である。

参考文献
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［９］ Ｈｕｒｗｉｔｚ Ｈ， Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ Ｌ， Ｎｏｖｏｔｎｙ Ｗ， Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ Ｔ， Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ Ｊ， Ｈｅｉｍ Ｗ， Ｂｅｒｌｉｎ Ｊ， Ｂａｒｏｎ Ａ， Ｇｒｉｆｆｉｎｇ Ｓ， Ｈｏｌｍｇｒｅｎ Ｅ， Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ， Ｆｙｆｅ Ｇ， Ｒｏｇｅｒｓ Ｂ， Ｒｏｓｓ Ｒ， Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ Ｆ． Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ， ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ， ａｎｄ ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２００４， ３５０（２３）：２３３５−４２．
［１０］ Ｓａｎｄｌｅｒ Ａ， Ｇｒａｙ Ｒ， Ｐｅｒｒｙ ＭＣ， Ｂｒａｈｍｅｒ Ｊ， Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ＪＨ， Ｄｏｗｌａｔｉ Ａ， Ｌｉｌｅｎｂａｕｍ Ｒ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＨ． Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ａｌｏｎｅ ｏｒ ｗｉｔｈ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２００６， ３５５（２４）：２５４２−５０．
［１１］ Ｊｅｎａｂ−Ｗｏｌｃｏｔｔ Ｊ， Ｇｉａｎｔｏｎｉｏ ＢＪ． Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００９， ９（４）：５０７−１７．
［１２］． Ｄｏｒｒｅｌｌ ＭＩ， Ａｇｕｉｌａｒ Ｅ， Ｓｃｈｅｐｐｋｅ Ｌ， Ｂａｒｎｅｔｔ ＦＨ， Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ Ｍ． Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｃｕｌａｒ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００７， １０４（３）：９６７−７２．
［１３］ Ｃａｓａｎｏｖａｓ Ｏ， Ｈｉｃｋｌｉｎ ＤＪ， Ｂｅｒｇｅｒｓ Ｇ， Ｈａｎａｈａｎ Ｄ． Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＶＥＧＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｔｕｍｏｒｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２００５， ８（４）：２９９−３０９．
［１４］ Ｗｅｌｔｉ ＪＣ， Ｇｏｕｒｌａｏｕｅｎ Ｍ， Ｐｏｗｌｅｓ Ｔ， Ｋｕｄａｈｅｔｔｉ ＳＣ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｐ， Ｂｅｒｎｅｙ ＤＭ， Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＡＲ． Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． ２０１０， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１０．５０３．

Claims (11)

1. ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来部分を少なくとも１つと、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来部分を少なくとも１つ含む血管新生抑制融合蛋白質であって、
   前記ＶＥＧＦＲの細胞外ドメイン由来部分が、ＶＥＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメイン、ＶＥＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインおよびＶＥＧＦＲ２の第三Ｉｇ様ドメインからなり、
   前記ＦＧＦＲの細胞外ドメイン由来部分が、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン、およびＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインからなり、
   前記ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域が、ＦＧＦＲ蛋白質中の、第一Ｉｇ様ドメインと前記第二Ｉｇ様ドメインの間の配列であり、
   前記血管新生抑制融合蛋白質は免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、
   前記ＶＥＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメインは、配列番号２の３２位〜１２３位のアミノ酸配列を有し、
   前記ＶＥＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインは、配列番号２の１５１位〜２１４位のアミノ酸配列を有し、
   前記ＶＥＧＦＲ２の第三ＩｇＧ様ドメインは、配列番号３の２２４位〜３２０位のアミノ酸配列を有し、
   前記ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分は、配列番号１の１４５位〜１６２位のアミノ酸配列を有し、
   前記ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインは配列番号１の１６３位〜２４７位のアミノ酸配列を有し、
   前記ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインは、配列番号１の２７０位〜３５９位のアミノ酸配列を有する、
   血管新生抑制融合蛋白質。
2. 前記ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域に由来する部分が酸性ボックスを含まない、請求項１に記載の血管新生抑制融合蛋白質。
3. 前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の血管新生抑制融合蛋白質。
4. 配列番号２２で表されるアミノ酸配列または配列番号３９で表されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列からなる血管新生抑制融合蛋白質。
5. 請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の血管新生抑制融合蛋白質をコードする単離核酸分子。
6. 請求項５に記載の核酸分子を含むベクター。
7. 請求項６に記載のベクターを含む、単離された組換え宿主細胞。
8. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の血管新生抑制融合蛋白質、請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクターまたは請求項７に記載の単離された組換え宿主細胞、および
   医薬的に許容可能なキャリア、
   を含む、医薬組成物。
9. 哺乳類において血管新生を抑制するための、および／または、腫瘍および／または眼内血管新生性疾患の治療もしくは予防のための、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記眼内血管新生性疾患が加齢黄斑変性および糖尿病網膜症からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。