KR101682496B1 - 혈관형성 유도인자를 길항하는 융합단백질 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관형성을 억제하는 융합단백질과 그 용도에 연관된다. 구체적으로 본 발명은 여러가지 혈관형성 억제인자인 융합단백질과 그 용도에 연관된다. 더 구체적으로 본 발명은 VEGF 수용체와 FGF수용체의 융합단백질과 및 융합단백질이 혈관형성 조절과 상관되는 질병을 치료하는 용도에 연관된다.

Description

혈관형성 유도인자를 길항하는 융합단백질 및 그 용도{FUSION PROTEIN FOR ANTAGONIZING ANGIOGENESIS INDUCIBLE FACTORS AND USES THEREOF}

본 발명은 혈관형성 유도인자를 길항하는 융합단백질 및 그 용도에 관련된다. 구체적으로 본 발명은 여러가지 혈관형성 억제인자인 융합단백질 및 그 용도에 연관된다. 더욱이 구체적으로 본 발명은 VEGF수용체와 FGF수용체의 융합단백질과 및 융합단백질이 혈관형성 조절과 상관되는 질병을 치료하는 용도에 관련된다.

혈관형성(Angiogenesis)은 악성종양의 생장과 전이하는 기본 요소 중의 하나이다. 혈관형성 과정에 여러가지 인자의 조절을 받고 어떤 인자는 혈관형성을 촉진하고 어떤 인자는 혈관형성을 억제하며 따라서 혈관형성의 조절은 한가기 매우 복잡한 동적인 평형 과정이다. 항혈관형성 치료는 모두 혈관형성 자극인자를 차단하거나 혈관형성 억제인자로 종양중의 혈관의 형성을 저지해서 종양 생장을 억제하는 목적에 달성한다. 현재 이미 상당한 수량의 혈관형성 자극인자를 알고 있고 예를 들면 혈관내피세포성장인자（Vascular endothelial growth factor, VEGF）、섬유모세포성장인자（Fibroblast growth factor, FGF）、간세포성장인자（Hepatocyte growth factor, HGF）、DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、Tie-1등이고 이런 인자는 혈관내피세포의 분열、분화와 혈관의 형태발생을 자극할수 있다. 그 중에 VEGF는 현재 이미 알고 있는 혈관형성에 대해 가장 특이하고、가장 효과가 있는 생장인자이다.

종양조직내의 산소 부족 환경에서 종양세포는 대량의 VEGF를 분비하고 혈관내피세포의 분열과 전이를 유도하고 최종 종양혈관망을 형성한다. 많은 동물실험에서 증명하다시피 VEGF를 억제하면 혈관형성을 저지하고 더 나아가 종양의 생장을 억제한다. 이 때문에 VEGF 및 수용체는 항혈관형성 약물의 중요한 표적이고 현재 임상실험에서 뚜렷한 치료 효과인 항혈관형성 약물은 베바시주맙（Bevacizumab，상품명 아바스틴(Avastin))이 있고 이는 VEGF를 직접 차단하여 종양의 혈관형성을 억제하고 2004년 미국의 FDA의 비준 받고 상장한 결직장암의 일선약물이고 처음으로 비준 받고 상장한 혈관형성 억제를 통해 항암작용을 발휘하는 신약이다. 아바스틴은 인간화인 항VEGF의 한가지 단클론항체이고 미국의 유명한 생물기술회사 Genentech에서 생산한다. 대규모의 삼차 임상실험에서 아바스틴과 화학요법 악혼합은 뚜렷하게 여러가지 종양환자의 생존시간을 연장할 수 있고 직장암, 폐암, 유방암, 신장암 등등을 포함한다. 아바스틴이 임상에서의 성공은 회기적인 의의가 있고 이는 종양혈관계통을 표적으로 한 항혈관형성 치료는 임상에서 효과적이라는 것을 증명했고 이미 종양치료에서 광범한 응용을 받았고 현재 전 세계에서 판매율이 제일 높은 약물 중의 하나이다.

아바스틴을 제외하고도 국제에서 VEGF신호를 길항하는 여러 개의 약물이 인체 임상실험후기에 처해있고 장래 몇년 내에 임상응용에 사용될 가능성이 있다. 그중에서도 미국생물기술회사 Regeneron와 Sanofi-Aventis 합작한 Aflibercept（또는VEGF-Trap）는 지금 대규모의 제3기 임상실험을 진행하고 있다. Imclone 회사의 항VEGF수용체II（VEGFR2）단일클론항체 약물 IMC-1121B도 제 3 임상실험 계단이다. 분명히 이런 신약은 암종증치료에 새로운 선택을 제공할것이고 환자에게 새로운 희망을 가져다 줄 것이다.

VEGF를 길항하는 약물이 종양의 임상치료에서 중대한 진보를 얻었다. 하지만 임상실험에서VEGF를 길항하는 치료도 상당히 큰 국한이 있다는 것도 보여주었다. 종양의 치료 효과로부터 보면 아바스틴(Avastin)은 직장암 결장암 환자의 중간생존시간(Median survival time)을 대략 3-4월 연장할수 있고 유방암 환자의 중간생존시간을 대략 7-8월 연장할 수 있다. 따라서 아바스틴이 장기적 유효적으로 종양혈관의 생장을 억제한다고 보장할 수 없다. 그래서 어떻게 항혈관형성의 임상치료 효과를 진일보 제고시킬 수 있는가 하는 것이 종양연구자들이 해결해야 할 문제이고 차세대 항혈관형성 약물을 연구 개발해야 할 중점이기도 하다.

VEGF 치료 실패 또는 항성이 나타나게 되는 근본적 원인은 아마 종양 혈관형성이 여려개 인자의 제어를 받기때문이다. 비록 VEGF가 혈관형성과정에서 중요한 역할을 하지만 결코 유일한 혈관형성 자극인자가 아니다. 동시에 종양세포의 불균질성과 종양의 미세환경의 복잡성 및 기질의 보상성 반응 메커니즘 때문에 VEGF 활성이 오랜 시간 억제당했을 경우 기타 혈관형성 자극인자들이 바로 발현된다[12]. 따라서 종양혈관의 생장이 다시 VEGF 신호경로에 의뢰하지 않게 된다. Hanahan 교수 연구팀의 연구에 의하면, 이자섬종양이 항VEGFR2 치료를 받는 과정 중에 종양이 변화된 혈관형성인자를 발현했고, 항VEGF 치료과정 중에 여러 개의 유전자 발현이 변화를 생겼고, 그 중에서 제일 돌출한 것은 FGF-2의 발현이 확실히 증가되었고, 연구에 의하면 항VEGF 치료 중에 내성종양이 나타났고 FGF 더욱이 FGF-2의 발현이 확실히 증가되었고, 따라서 혈관형성을 다시 활성시켰고 FGF 신호경로를 저단한 다음 종양 재생이 다시 억제당했다. 이로부터 FGF-2의 과도 발현과 종양이 항VEGF치료를 도주할수 있는 능력을 획득한 것과 밀접한 관계가 있다는 것을 알수 있다. 따라서 동시에 VEGF와 FGF-2를 억제하면 종양 등 혈관증식성 질병을 더욱 효과적으로 치료할수 있다.

현재 작은 분자 약물이 이중 또는 다중 표적 길항방면에서 이미 일정한 진보를 얻었고 동시에 VEGF와 FGF-2를 길항하는 항종양치료효과가 단일 표적 항종양치료보다 우수하다는 것을 증명했다. 하지만 작은 분자 다중 표적 길항제는 특이성이 결핍하기때문에 늘 예측하지 못할 부작용을 일으키고 이런 부작용이 어뜬때에는 임상실험후기에서야 나타나고 따라서 아주 큰 위험성이 있다. 그러나 큰 분자 단백질 약물 더욱이 Fc융합단백질과 단클론항체는 특이성이 강하고、체내에서 반감기가 긴 우점이 갖추어져 있어서 약물 연구 개발 영역의 중점이고 작은 분자 약물이 구비되지 못한 우점을 갖추고 있다.

섬유모세포성장인자는 헤파린을 결합한 성장인자 패밀리이고 포유동물중에서 22개의 패밀리성원(FGF 1-14, 16-23)이 구비되어 있다. FGF는 다종 생물학 기능상에서 중요한 작용을 지닌다 예를 들면 세포증식、 분화、이동、혈관형성과 종양 발생. 그는 세포 표면의 FGF 수용체（FGFR）와 결합 및 활성화를 통해 그의 다종한 생물학 기능을 발휘한다. (예를 들면 Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev. 16: 139-149, 2005 참조). 섬유모세포성장인자 수용체는（fibroblast growth factor receptor，FGFR） 섬유모세포성장인자 패밀리성원과 서로 결합하는 수용체이다. 섬유모세포성장인자 수용체중의 일부분이 질병과정에 참여한다. 포유동물중에 4개의FGFR유전자가 있다：fgfR1-fgfR4. 섬유모세포성장인자 수용체는 세포외 영역、막관통 구조영역과 세포내 구조영역으로 조성되였다. FGFR 패밀리성원중에 리간드의 결합 성질과 키나아제의 구조영역이 서로 다르지만 모두 비슷한 세포외 영역이 갖추어져 있다. 그들의 세포외 영역은 세개의 면역글로불린 같은 (Ig 같이) 구조영역: 제1 Ig 같은 구조영역、제2 Ig 같은 구조영역、제3 Ig 같은 구조영역，제1과 제2 같은 구조영역사이에 한단락의 서열이 포함되여 있고 본문에서 우리는 진술한 제1 Ig 같은 구조영역과 제2 Ig 같은 구조영역사이의 서열을 FGFR Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구라고 부른다. 진술한 중간기능성서열구는 산성 아미노산 구역을 포함하고 있고 이를 산성박스라고 부른다.（acidic box，AB).

VEGF와FGF（더욱이FGF-2）가 종양의 혈관형성에서 중요한 작용을 하는 것으로 보아 우리는 VEGF와FGF（더욱이FGF-2）를 이중 길항하는 큰 분자 단백질 약물이 장차 더욱 좋게 종양혈관형성을 억제할 것이라고 생각하지만 현재까지 성공적으로 VEGF와 FGF에 대해서 이중 저단 작용하는 큰 분자 융합단백질을 구성했다는 보도가 아직 없다.

따라서 본 연구는 VEGF와 FGF（더욱이FGF-2）를 동시에 길항하는 한가지 Fc융합단백질을 탐구하고 구성하자는 바이고 본 융합단백질은 수용체의 특이성과 높은 친화력을 이용해서 VEGF와 FGF신호를 동시에 저단할수 있다. 본 연구의 VEGF와 FGF의 이중 길항 융합단백질은 모든 인류 발생적 단백질 서열을 채용하고 Fc융합단백질의 우수한 약물 동력학 특성을 결합해서 훌륭한 재약조건과 임상응용 잠재능력을 갖출것이다. 다른 한편으로는 이중 표적 융합단백질에서 융합단백질이 각 표적에 대한 친화력은 정확한 단백질 구조에 달려있고 수용체 단편이 융합단백질 중에서 리간드와 결합하는 능력을 늘 잃어버리고 따라서 VEGF와 FGF（예를 들면 FGF-2）를 이중 길항하는 고효능하고、특이한 융합단백질 약물을 구성하는데 일정한 난이도가 있다. 본 연구의 전기작업 중 우리는 부동한 VEGFR단편、FGF단편과 IgG1 Fc를 포함한 20여개의 융합단백질을 구성했고 VEGF와 FGF（더욱이 FGF-2）에 대해 높은 친화력을 갖춘 융합단백질을 취득했다.

혈관형성을 억제하는 다양한 융합단백질이 이미 보도되어 있고, 예를 들면FGFR의 융합단백질에 근거하는 (WO/2008/065543)、Notch3 의 융합단백질에 근거하는 (WO/2010/021729)、VEGFR의 융합단백질에 근거하는 (WO/2010/105573)、LK8의 융합단백질에 근거하는 (WO/2008/075833) 등등이고 하지만 이러한 융합단백질은 모두 단일한 표적을 조준해서 단일한 혈관형성 억제제의 부분으로부터 생겨난 것과 면역글로불린의 Fc 단편을 융합시켜서 혈관형성 억제를 실현하는 것이다. 현재 기술중 아직 성공적으로 두개의 혈관형성 억제단원을 함께 융합시켜서 이중 표적을 억제시켜서 혈관형성 억제를 실현할수 있는 기능을 갖춘 융합단백질이 보도되지 않았다. 본 발명가는 최초 성공적으로 적어도 두가지 혈관형성 억제제에서 유래된 적어도 두가지 혈관형성 억제단원을 함께 융합시켜서 이중 표적을 억제하고 진일보 혈관형성을 억제하는 융합단백질을 형성했고 예상 밖에 아주 좋은 효과를 취득했다. 따라서 본 발명은 혈관형성을 억제하는 약물의 개발에 대해 새로운 사고의 방향을 제공했다.

한방면에서 본 발명은 한가지 융합단백질과 연관되고 그가 적어도 두가지 혈관형성 억제제에서 유래된 적어도 두가지 혈관형성 억제단원을 포함한다. 한개 실시방안 중 진술한 융합단백질은 혈관형성을 억제한다. 또 다른 실시방안중 진술한 융합단백질은 체내및/또는 체외에서 FGF와 VEGF를 결합한다.

한개 실시방안중 본 발명의 융합단백질은 적어도 두가지 혈관형성 억제제에서 유래된 적어도 두가지 혈관형성 억제단원을 포함하고 진술한 적어도 두가지 혈관형성 억제제는: VEGFR는 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 에서처럼 FGFR 는 FGFR1、FGFR2、FGFR4 에서처럼 선택한다. 본 발명의 융합단백질은 바람직하게는 VEGFR1、VEGFR2 와 FGFR1 로부터 유래된 적어도 두개의 혈관형성 억제단원을 포함한다. 본 발명의 융합단백질은 더욱이 바람직하게는 VEGFR1、VEGFR2 와 FGFR 로부터 유래된 두개 혈관형성 억제단원을 포함하고 그중의 하나 혈관형성 억제단원은 VEGFR1、VEGFR2 로부터 유래된 것이고 또 하나는 FGFR1 로부터 유래된 것이다.

또 다른 실시방안중 본 발명의 융합단백질은 적어도 두가지 혈관형성 억제제에서 유래된 적어도 두가지 혈관형성 억제단원을 포함하고 진술한 적어도 두가지 혈관형성 억제제는 혈관형성을 억제하는 가용성 수용체 단편이고 진술한 가용성 수용체 단편은:DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、Tie-1、HGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 및 대립유전자 변이에서 선택할 수 있다. 한개 구체적인 실시방안 중 진술한 혈관형성 억제제는 혈관형성을 억제하는 수용체 VEGFR 와 FGFR 이다.

일부 실시방안중 본 발명의 융합단백질은 적어도 두가지(바람직하게는 두가지 또는 세가지) 혈관형성 억제제에서 유래된 적어도 두가지 혈관형성 억제단원을 포함하고 진술한 적어도 두가지 혈관형성 억제단원은 적어도 한개의 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 혈관형성 억제단원과 한개의 FGFR 세포외 영역으로부터 유래된 혈관형성 억제단원을 포함하고 진술한 VEGFR 세포외 영역는 VEGFR1、VEGFR2 및/또는 VEGFR3세포외 영역이 바람직하고 진술한 FGFR세포외 영역은 FGFR1 및/또는 FGFR2 세포외 영역이 바람직하다.

또 다른 일부 실시방안 중 본 발명의 융합단백질은 적어도 두가지 (바람직하게는 두가지 또는 세가지) 혈관형성억 제제에서 유래된 적어도 두가지 혈관형성 억제단원을 포함하고 그중에 진술한 적어도 두가지 혈관형성 억제단원은 한개의 VEGFR1 및/또는 VEGFR2 세포외 영역으로부터 유래된 혈관형성 억제단원과 한개의FGFR1 세포외 영역으로부터 유래된 혈관형성 억제단원을 포함한다.

또 다른 일부 실시방안중 진술한 VEGFR（VEGFR1 및/또는 VEGFR2 같이）세포외 영역으로부터 유래된 부분은 다음중 선택한 한가지 또는 여러가지 또는 그것으로 조성됐다. VEGFR（VEGFR1 또는 VEGFR2 같이）의 제 1 Ig 같은 구조영역 또는 일부분、VEGFR（VEGFR1 또는 VEGFR2 같이）의 제 2 Ig 같은 구조영역 또는 일부분、VEGFR（VEGFR1 또는 VEGFR2 같이）의 제 3 Ig 같은 구조영역 또는 일부분、VEGFR（VEGFR1 또는 VEGFR2 같이）의 제 4 Ig같은 구조영역 또는 일부분、VEGFR（VEGFR1 또는 VEGFR2 같이）의 제 5 Ig 같은 구조영역 또는 일부분、VEGFR（VEGFR1 또는 VEGFR2 같이）의 제 6 Ig 같은 구조영역 또는 일부분과 VEGFR（VEGFR1 또는 VEGFR2같이）의 제 7 Ig 같은 구조영역 또는 일부분이다.

또 다른 일부 실시방안중 진술한 FGFR（FGFR1 같이）세포외 영역으로부터 유래된 부분은 다음중 선택한 한가지 또는 여러가지 또는 그것으로 조성된다. FGFR（FGFR1같이）제1Ig 같은 구조영역 또는 일부분、FGFR（FGFR1같이）Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분、FGFR（FGFR1같이）제2Ig 같은 구조영역 또는 일부분과 FGFR（FGFR1같이）제3Ig 같은 구조영역 또는 일부분이다. 특별히 본 발명의 융합단백질이 포함하고 있는 구조영역및/또는 구역 등 사이에서 직접 연결및/또는 링커를 통해서 연결된다. 한개 구체적인 실시방안중 본 발명의 융합단백질은 진술한 FGFR（FGFR1 같이）Ig 같은 구조영역 중간기능서서열구로 발원한 부분을 포함하고 진술한 FGFR（FGFR1 같이）Ig같은 구조영역 중간기능서서열구로 발원한 부분은 바람직하게는 산성박스（acidic box, AB）를 포함하지 않는다. 한개 구체적인 실시방안중 진술한 중간기능서서열구로 발원한 부분은 아래의 서열 SEQ ID NO:1제134부터 162위、145부터 162위 또는 151부터 162위에 대응되는 아미노산 서열을 갖추고 있다.

한개 실시방안중 진술한 VEGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분은 VEGFR1 또는 VEGFR2의 제 2 Ig 같은 구조영역과 VEGFR1 또는 VEGFR2의 제 3 Ig 같은 구조영역을 포함하고 진술한 FGFR（FGFR1같이）세포외 영역으로부터 유래된 부분은 FGFR Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분과 FGFR 제 2 Ig 같은 구조영역과 FGFR 제 3 Ig 같은 구조영역을 포함한다. 진술한 FGFR Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분은 바람직하게는 산성박스를 포함하지 않는다. 특별히 진술한 FGFR는 예를 들면 FGFR1또는 FGFR2 이다.

또 다른 실시방안중 진술한 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분은 VEGFR1 의 제 2 Ig 같은 구조영역과 VEGFR2 의 제 3 Ig 같은 구조영역을 포함하고 진술한 FGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분은 FGFR Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분과 FGFR 제 2 Ig 같은 구조영역과 FGFR 제 3 Ig 같은 구조영역을 포함한다. 진술한 FGFR Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분은 바람직하게는 산성박스를 포함하지 않는다. 특별히 진술한 FGFR는 예를 들면 FGFR1또는 FGFR2이다.

또 다른 실시방안 중 진술한 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분은 N쪽으로부터 C쪽 까지 순서에 따라 VEGFR1 제 2 Ig 같은 구조영역과 VEGFR2 제 3 Ig 같은 구조영역을 퐈함하고 진술한 FGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분은 N쪽으로부터 C쪽까지 순서에 따라 FGFR Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분과 FGFR 제 2 Ig 같은 구조영역과 FGFR 제 3 Ig 같은 구조영역을 포함한다. 진술한 FGFR Ig 같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분은 바람직하게는 산성박스를 포함하지 않는다. 특별히 진술한 FGFR는 예를 들면 FGFR1 또는 FGFR2 이다.

일부 구체적인 실시방안중 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분은 VEGFR1 제 1 Ig 같은 구조영역을 포함한다. 예를 들면 진술한 VEGFR1 제 1 Ig 같은 구조영역은 VEGFR1 제 2 Ig 같은 구조영역 앞이다. 바람직하게는 VEGFR1 제 1 Ig 같은 구조영역은: SEQ ID NO:2 제32부터 123위에 서로 대응되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:2 제32부터 123위에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 아미노산 서열이다.

또 다른 실시방안중 진술한 FGFR（FGFR1같은）세포외 영역으로부터 유래된 부분은 FGFR 제 1 Ig 같은 구조영역 또는 일부분을 포함한다. 바람직하게는 FGFR 제1 Ig 같은 구조영역 또는 일부분은 SEQ ID NO:1 제40부터 118위에 서로 대응되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1 제40부터 118위에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 적어도80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 아미노산 서열이 바람직하다.

또는, SEQ ID NO:1제77부터 118위 서로 대응되는 아미노산 서열이고 또는 SEQ ID NO:1제77부터 118위 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 적어도80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는99% 동일성이 있는 아미노산 서열이 바람직하다.

본 발명의 일부 바람직한 실시방안중 VEGFR1 제2Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO:2 제151부터 214위에 서로 대응되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:2 제151부터 214위에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 아미노산 서열이 바람직하다.

본 발명의 일부 바람직한 실시방안중 VEGFR2 제3Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO:3제224부터 320위에 서로 대응되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:3제224부터 320위에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 아미노산 서열이다.

본 발명의 일부 바람직한 실시방안중 FGFR1 제2Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO:1제163부터 247위에 서로 대응되는 아미노산 서열 또는SEQ ID NO:1제163부터 247위에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 아미노산 서열이 바람직하다.

본 발명의 일부 바람직한 실시방안중 FGFR1 제 3Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO:1 제270부터 359위에 서로 대응되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1 제270부터 359위에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는99% 동일성이 있는 아미노산 서열이 바람직하다.

바람직하게는 본 발명의 융합단백질은 융합사페로닌도 포함하고 예를 들면 면역글로불린 FC부위는 사람 IgG Fc부위가 바람직하고 더욱 바람직하게는 사람 IgG1 Fc부위이고, 더욱 바람직하게는: SEQ ID NO:7과 서로 대응되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:7에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고, 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 아미노산 서열이다.

또는, SEQ ID NO: 8에 서로 대응되는 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열 또는SEQ ID NO: 8에 서로 대응되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고, 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열을 갖춘다.

또 다른 일부 실시방안중 본 발명의 융합단백질은 분비 신호펩티드 영역도 포함하고 VEGFR1 신호펩티드 영역처럼 진술한 분비 신호펩티드 영역은 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 제1부터 제 26위의 아미노산 서열 또는SEQ ID NO: 25 제시된 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열이다.

또 일측면 본 발명은 Fc융합단백질을 제공했고 진술한 단백질은: SEQ ID NO: 9-24 에 제시된 어는 한 항의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하고 적어도80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는99% 동일성이 바람직하다.

SEQ ID NO: 26-41에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 바람직하다.

또는, SEQ ID NO: 9-24 에 제시된 어느 한 항의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 26-41에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열이다.

본 발명의 일부 실시방안중 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질에 포함된 각 부분및/또는 각 구조영역은 N쪽으로부터 C쪽까지 순서에 따라 임의일 수도 있고, 또는 도 1에 제시된 순서이다.

일부 실시방안중 본 발명의VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 신호펩티드（signal peptide, SP）도 포함하고 분비 신호펩티드가 바람직하고 VEGFR1 신호펩티드처럼 SEQ ID NO: 2 제 1부터 26위의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 25의 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열을 갖춘다. 바람직하게는 신호펩티드는 융합단백질의 N쪽에 있다.

바람직하게는 본 발명의 융합단백질은 N쪽으로부터 C쪽까지 순서에 따라VEGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분과 FGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분을 포함한다.

바람직하게는 본 발명의 융합단백질중 진술한 면역글로불린 FC부위는 사람 IgG1 Fc부위이고 예를 들면 사람 IgG Fc부위이고, 더욱 바람직하게는: SEQ ID NO:7에 서로 대응되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:7에 서로 대응되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 아미노산 서열이 바람직하다.

또는, SEQ ID NO: 8 에 서로 대응되는 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 8에 서로 대응되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열을 갖춘다.

본 발명의 한개 실시방안중 진술한 면역글로불린 FC부위는 융합단백질의C쪽에 위치하고 있다.

본 발명의 일부 실시방안중 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질에 포함된 각 구역및/또는 각 구조영역은 N쪽으로부터 C쪽까지의 순서는 임의일 수도 있다. 또 다른 일부 실시방안중 진술한 순서가 도 1에 제시된 순서일 수도 있다. 일부 구체적인 실시방안 중 N쪽으로부터 C쪽까지 VEGFR 부분과 FGFR 부분은 각각 상대편의 상류 또는 하류에 있을수도 있다. 그 밖에 진술한 Fc부위는 혈관형성 억제단원의 상류 또는 하류에 있을수도 있고 예를 들면 진술한 Fc부위는 융합단백질의 C쪽에 위치하고 있다.

일부 실시방안중 본 발명의 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 하나 또는 여러 개의 쇄내 이황화결합을 포함하고 바람직하게는 Ig같은 구조영역중에 하나 또는 여러 개의 쇠내 이황화결합을 포함한다.

본 발명의 한방면에서VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 원핵세포 또는 진핵세포 예를 들면 세균、진균(효모 같이) 또는 포유동물 세포계에서 본 발명의 융합단백질 발현을 통해 생산한다. 특별히 진술한 포유동물 세포계는 CHO세포계일수 있다. 재조합 단배질 발현방면에서 CHO세포는 늘 사용하는 세포계이다. 게다가 대규모의 발현중 다방면의 수요에 근거하여 원시 CHO세포를 재건했고, 따라서 일련의 특정 발현 목적으로 조준한 제조합 단백질 생산에 쓰이는 유래된 CHO세포계를 취득했고 예를 들면 무혈청배양 등이다. 이들은 모두 제조합 단백질 발현영역에서 누구가 다 알고 있는 것이다.

또 다른 한방면에서 본 발명의 융합단백질이 포함한 구조영역및/또는 구역사이는 직접 연결 및/또는 링커를 통해 연결되고 예를 들면 VEGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분 FGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분과 면역글로불린 FC부위로부터 유래된 부분은 링커를 통해 또는 통하지 않고 융합된다. 한개 실시방안중 VEGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분、FGFR세포외 영역으로부터 유래된 구역과 면역글로불린 FC부위는 직접 연결된다. 또 다른 한개 실시방안중 VEGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분、FGFR세포외 영역으로부터 유래된 구역과 면역글로불린 FC부위는 링커를 통해서 연결되고 예를 들면 (G4S)3링커를 통해서 연결된다.

다른 한편 본 발명은 진술한 융합단잭질의 분리된 핵산 분자를 코딩하는 것과 연관된다. 진술한 핵산 분자는 바람직하게는 SEQ ID NO: 26-41에서 제시된 어는 한 항의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 한편 본 발명은 진술한 핵산 분자를 포함한 벡터를 제공했다. 그리고 진술한 벡터로 전환/트랜스펙션한 세포를 제공했고 CHO세포가 바람직하다.

또 한편 본 발명은 한가지 약물 조합물을 제공했고 본 발명의 융합단백질、핵산 분자、벡터 또는 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체(Pharmaceutically acceptable carrier)를 포함한다.

본 발명은 또 혈관형성을 억제하는 융합단백질을 생산하는 방법과 연관되고 원핵세포 또는 진핵세포 예를 들면 세균、진균(효모 같이) 또는 포유동물 세포계에서 본 발명의 융합단백질 발현을 통해 진행한다. 진술한 포유동물 세포계는 CHO세포계가 바람직하다.

또 다른 한편 본 발명은 혈관형성을 억제하는 방법을 제공했고 이런 수요가 있는 상대에게 혈관형성을 억제하는 유효량의 본 발명의 융합단백질、핵산 분자、벡터、세포 또는 약물 조합물을 시용했다. 진술한 방법은 바람직하게는 포유동물에서 진행했다.

또 다른 한편 본 발명은 포유동물중 종양치료 또는 예방하는 방법을 제공했고 이런 수요가 있는 상대에게 유효량의 본 발명의 융합단백질、핵산 분자、벡터、세포 또는 약물 조합물을 시용해서 치료 또는 예방했고 진술한 종양은 바람직하게는 고형종양이다.

또 다른 한편 본 발명은 포유동물중 안과혈관형성과 상관되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공했고 이런 수요가 있는 상대에게 유효량의 본 발명의 융합단백질、핵산 분자、벡터、세포 또는 약물 조합물을 시용해서 치료 또는 예방했고 진술한 안과혈관형성과 상관되는 질병은 바람직하게는 연령과 관계되는 황반변성、당뇨병성망막병변 등이다.

또 다른 한편 본 발명은 체외 또는 체내에서FGF및/또는 VEGF를 결합하는 한가지 방법을 제공했고 FGF와 VEGF를 본 발명의 융합단백질과 서로 접촉하게 하는 것이 포함된다.

본 발명은 본 발명의 융합단백질、융합단백질을 코딩한 핵산 분자、 진술한 핵산 분자를 포함한 벡터、진술한 벡터로 전환/트랜스펙션한 세포 또는 그들을 포함한 약물 조합물을 혈관형성을 억제하는데 쓰이는 약물의 용도로 제조한 것과 연관된다. 그 밖에 본 발명은 본 발명의 융합단백질、융합단백질을 코딩한 핵산 분자、진술한 핵산 분자를 포함한 벡터、진술한 벡토로 전환/트랜스펙션한 세포 또는 그들을 포함한 약물 조합물을 혈관형성과 상관되는 질병을 치료 또는 예방하는데 쓰이는 약물의 용도로 제조한 것과 연관되고 진술한 혈관형성과 상관되는 질병은 바람직하게는 종양 또는 안중혈관형성과 상관되는 질병이다.

부동한 나라의 특허제도가 보호주제에 대해서 부동한 규정이 있다는것을 고려해서 공개된 본 내용은 이상의 방법과 서로 대응되는 제약용도 및 예정용도에 쓰이는 약물을 제공했다. 이런 각종 제약용도와 약물도 본 발명의 보호범위 내에 있으며 마치 그들이 이미 본 공개내용에 구체적으로 기록되여 있는 것과 같다.

본 공개 내용은 단지 보호를 요구하는 일부 구체적인 실시방안을 예를 들어서 설명했으며 그중 하나 또는 여러 개의 기술방안중 기록된 기술특징은 임의로 하나 또는 여러 개의 기술방안과 조합할수 있으며 조합을 거쳐 취득한 이런 기술방안도 본 보호신청범위 내에 있으며 마치 조합을 거쳐 취득한 이런 기술방안이 이미 본 공개 내용에 구체적으로 기록되여 있는 것과 같다.

부도를 결합해서 및 아래의 진일보 상세한 설명으로 본 발명을 예시할 것이다. 밝혀야 할 것은 아래의 설명은 단지 보호를 요구하는 본 발명의 기술방안에 대해 예를 들어서 설명했고 결코 이런 기술방안에 대한 어떠한 제한은 아니다. 본 발명의 보호범위는 부착된 권리요구서에 기록된 내용에 근거하여 기준으로 한다.

도 1은 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질 구조설명도이고 그중에 VEGFR1、VEGFR2、FGFR1단백질을 각각 열거했다. Fc 융합단백질은 실선으로 표시하고 잃어버린 아미노산은 점선으로 표시했고 항체 같은 구조영역은 고리모양으로 표시했고 부동한 항체같은 구조영역은 자모+수자로 표시하고 그중 VEGFR1의 구조영역은 a1-a7로 표시했고 VEGFR2의 구조영역은 b1-b7로 표시했고 FGFR1의 구조영역은 c1-c3로 표시했고 이황화결합은 s s로 표시했고 사람IgG1 Fc는 회색틀로 표시했고 SP는 신호펩티드를 표시하고 (G4S)3연결 서열은 세개의 검은색 마름모틀로 표시하고 산성박스 서열은 AB자모가 달린 네모난 틀로 표시한다.
도 2는 부동한 Fc 융합단백질이 VEGF와 FGF-2 결합한 비교도이다. 그중에 ELISA 방법을 통해 각 Fc융합단백질（20ng/mL）과 VEGF165및/또는 FGF-2（100ng/mL Heparin포함）를 외피한 결합정황을 검측한다.
도 3은 융합단백질의 SDS-PAGE 도을 보여준다.
도 4는 융합단백질 구배와 VEGF（A）과FGF-2（B）의 결합을 보여준다.
도 5는 융합단백질과 VEGF（A）와 FGF-2（B）의 친화력을 보여준다.
도 6은 VEGF 또는 FGF-2가 유도한 융합단백질이HUVEC 세포 분열에 대한 영향 및 상대억제율이다. 그 중에 도A는 VEGF가 유도한 융합단백질이 HUVEC세포 증식에 대한 영향이고 도B는 VEGF가 유도한 융합단백질이 HUVEC세포 증식에 대한 상대억제율이고 도C는 FGF2가 유도한 융합단백질이 HUVEC세포 증식에 대한 영향이고 도D는FGF2가 유도한 융합단백질이 HUVEC세포 증식에 대한 상대억제율이다.

정의

다른 정의가 있는것을 제외하고 본문에서 사용한 모든 과학기술용어는 본 영역의 보통기술인원이 이해한 것과 일치한 함의를 갖추고 있다. 본 영역의 정의 및 용어에 관해서 전문가는 구체적으로 Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel）를 참고할수 있다. 아미노산 잔기의 단축은 본 영역중에서 사용한 20개 늘 쓰는 L-아미노산중의 하나인 3개 표준 자모및/또는 1개 자모 코드를 대신 지칭한다.

비록 본 발명의 광의의 범위내에 제시된 수자범위와 파라미터 근사치이지만 구체적 실시예중에서 제시된 수치가 최되한 정확하게 기록해야 한다. 하지만 어떠한 수치도 원래부터 필연적으로 일정한 오차를 포함하고 있고 그것은 그들 각자의 측정중 존재하는 표준편차로 인한것이다. 그 밖에 본문에서 공개된 모든 범위는 응당히 그중에 포함된 모든것과 모든 자범위를 포함한 것으로 이해해야 한다. 기록된 " 1부터 10까지" 의 범위처럼 응당히 최소치 1과 최대치 10 사이(단점을 포함)의 모든것과 모든 자범위를 포함한 것으로 이해해야 하고 바꾸어서 말하자면 최소치 1 또는 더 큰 자범위로 스타트한 1부터 6.1까지 처럼 및 최대치 10 또는 더 작은 자범위로 종지한 5.5부터 10까지 처럼이다. 그 밖에 "본문에 편입됐다"고 부르는 모든 참고문헌을 응당히 전부 편입?다고 이해해야 한다.

그 밖에 본 설명서에서 사용한것처럼 단수형식은 그가 지향한 대상인 복수형식을 포함하고 있다는 것을 응당히 주의해야 하고 분명하고 명백히 하나 지향 대상에 제한된 것을 제외한다. 용어 "또는" 은 용어 "및/또는"과 서로 바꾸어서 사용할 수 있고 문장의 앞뒤에서 따로 분명히 지적한 것을 제외한다.

본문에서 사용한 용어 "Fc","Fc부위", "Fc단편" 또는 "면역글로불린 FC부위" 등은 면역글로불린의 결정화 단편 이라는 것을 의미하며 본 발명중 진술한 FC부위는 바람직하게는 사람 IgG1의 Fc부위이다.

용어 "Fc 융합단백질"은 이질 단백질의 결합 특이성과 면역글로불린 고정 구조영역의 이펙터 기능을 서로 결합시킨 항체 같은 분자를 가리킨다. 구성상으로부터 보면 Fc 융합단백질은 필요한 결합 특이성을 갖춘 아미노산 서열 및 면역글로불린 고정 구조영역 서열을 포함한다. Fc 융합단백질 분자는 보통 수용체 또는 리간드의 결합장소를 포함한다. 진술한 면역글로불린 고정 구조영역 서열은 어떠한 면역글로불린으로부터 취득할수 있다. 예를 들면 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 아형，IgA (IgA-1와 IgA-2를 포함), IgE, IgD 또는 IgM.

본문에서 사용한 용어 "가용성" 단백질은 생물학과 관련되는 온도, pH 수준과 삼투압에서 수용액에 용해되는 단백질을 가리킨다. 본문에서 사용한 "가용성 융합단백질"은 융합단백질이 막횡단 부위와 세포내 부위를 포함하지 않는 것을 의미한다.

본문에서 사용한 것처럼 용어 "분리된"은 이하의 물질 및/또는 실체를 가리키고 (1)초기 생산할때와 (천연환경중에서 및/또는 실험설치중에서) 그것과 서로 관련된 적어도 일부분 요소가 서로 분리되거나/또는 (2) 인공생산을 통해 제조및/또는 제작한다. 분리된 물질및/또는 실체는 적어도 약10%、약20%、약30%、약40%、약50%、약60%、약70%、약80%、약90%、약95%、약98%、약99%、기본상 100% 또는 100% 의 초기와 서로 관련된 기타 요소와 서로 분리될수 있다.

용어 "부분"과 "단편"은 서로 바꿀수 있는 폴리펩티드、핵산 또는 기타 분자구성물의 일부분을 지칭한다.

분문에서 사용한 용어 "VEGFR"는 혈관내피성장인자 수용체를 가리키고 VEGFR1、VEGFR2 및/또는 VEGFR3 일 수 있다. 본 발명의 VEGFRsmss는 바람직하게는 VEGFR1 및/또는 VEGFR2 이고 바람직하게는 사람 VEGFR 이다.

본문에서 사용한 용어 "VEGFR"는 섬유모세포성장인자 수용체를 가리키고 FGFR1、FGFR2、FGFR3 및/또는 FGFR4 일 수 있다. 본 발명의 FGFR 는 바람직하게는 FGFR1 이고 더욱이 바람직하게는 사람 FGFR1 이다.

본문에서 사용한 용어 "Ig 같은 구조영역"은 면역글로불린 같은 구조영역을 의미하고 그는 다양한 단백질 패밀리에서 볼수 있고 다양한 생물학적 기능에 참여하고 세포-세포인식、세포 표면 수용체、면역기능 등을 포함한다.

본문에서 사용한 용어 "VEGFR 제1Ig 같은 구조영역"은 VEGFR 단백질의 N쪽으로부터 첫번째 Ig 같은 구조영역을 가리키고 바람직하게는 VEGFR1 단백질의 N쪽으로부터 첫번째 Ig 같은 구조영역（분문에서 VEGFR1 제 1 Ig 같은 구조영역이라고 부른다） 또는 VEGFR2 단백질의 N쪽으로부터 첫번째 Ig 같은 구조영역(분문에서 VEGFR2 제1 Ig같은 구조영역이라고 부른다)은 SEQ ID NO: 2처럼 제32부터 123위 또는 SEQ ID NO: 3 제46부터 110위의 아미노산 서열을 갖춘다. 유사하게 VEGFR 제 2 Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO: 2처럼 제151부터 214위 또는 SEQ ID NO: 3처럼 제141부터 207위의 아미노산 서열을 갖추고 VEGFR 제 3 Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO: 2처럼 제230부터 327위 또는 SEQ ID NO: 3제224부터 320위의 아미노산 서열을 갖추고 VEGFR 제 4 Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO: 2처럼 제 335부터 421위 또는 SEQ ID NO: 3 제 328부터 414위의 아미노산 서열을 갖추고 VEGFR 제 5 Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO: 2처럼 제 428부터 553위 또는 SEQ ID NO: 3 제 421부터 548위의 아미노산 서열을 갖추고 VEGFR 제 6 Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO: 2처럼 제 556부터 654위 또는 SEQ ID NO: 3 제 551부터 660위의 아미노산 서열을 갖추고 VEGFR 제7 Ig 같은 구조영역은 SEQ ID NO: 2처럼 제661부터 747위 또는 SEQ ID NO: 3 제 667부터 753위의 아미노산 서열을 갖춘다. 진술한 VEGFR는 바람직하게는 VEGFR1 또는 VEGFR2 일수 있다.

본문에서 사용한 용어 "FGFR 제 1 Ig 같은 구조영역" 또는"FGFR1 제 1 Ig 같은 구조영역"은 FGFR 또는 FGFR1 단백질의 N쪽으로부터 첫번째 Ig 같은 구조영역을 가리키고 SEQ ID NO: 1처럼 제 40부터 118위의 아미노산 서열을 갖춘다. 유사하게 용어 "FGFR 제2Ig 같은 구조영역" 또는 "제2Ig 같은 구조영역"은 FGFR 단백질의 N쪽으로부터 두번째 Ig 같은 구조영역을 가리키고 SEQ ID NO: 1처럼 제 163부터 247위의 아미노산 서열을 갖춘다. 용어 "FGFR 제3Ig 같은 구조영역" 또는"제 3 Ig 같은 구조영역"은 FGFR 단백질의 N쪽으로부터 세번째 Ig 같은 구조영역을 가리키고 SEQ ID NO: 1처럼 제 270부터 359위의 아미노산 서열을 갖춘다. 바람직하게는 진술한 FGFR는 FGFR1 이며 FGFR 제1Ig 같은 구조영역은 FGFR1 제1Ig 같은 구조영역이고 FGFR 제 2 Ig같은 구조영역은 FGFR1 제 2 Ig 같은 구조영역이고 FGFR 제 3 Ig 같은 구조영역은 FGFR1 제 2 Ig 같은 구조영역이다.

본문에서 사용한 용어 "FGFR Ig같은 구조영역 중간기능성서열구" 또는 "중간기능성서열구"는 FGFR 단백질의 제 1 Ig 같은 구조영역과 제 2 Ig 같은 구조영역사이의 서열을 가리키고 바람직하게는 IFS 서열은 SEQ ID NO: 1 제 118부터 162위에 대응하는 아미노산 서열을 갖춘다. 본 발명은 예상 밖으로 진술한 중간기능성서열구가 Ig 같은 구조영역의 기능에 대해 뚜렷한 영향을 끼치고 있다는 것을 발견했다. 진술한 FGFR 단백질은 FGFR1（SEQ ID NO: 1） 특별히 사람 FGFR1 단백질이 바람직하다. 사람 FGFR1 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1을 참조할수 있고 cDNA서열은 SEQ ID NO: 4를 참조할수 있다.

아래는 hFGFR1의 부분 서열을 제시하고 그림자 부분은 순서에 따라 각 Ig같은 구조영역을 가리키고 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH15035.1를 참조할수 있다.

FGFR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1을 참조할 수 있고 그를 코딩한 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4를 참조할수 있다.

아래는 h VEGFR1의 부분서열을 제시하고 그림자 부분은 순서에 따라 Ig같은 구조영역을 가리키며 각 구조영역사이의 천연연결서열은

http://www.uniprot.org/uniprot/P17948를 참조할수 있다.

VEGFR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2를 참조할수 있고 그를 코딩한 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 참조할수 있다.

아래는 h VEGFR2의 부분 서열을 제시하고 그림자 부분은 순서에 따라 Ig같은 구조영역을 가리키고 각 구조영역사이의 천연연결서열은

http://www.uniprot.org/uniprot/P35968를 참조할수 있다.

VEGFR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3을 참조할수 있고 그를 코딩한 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6을 참조할수 있다.

본문에서 사용한 용어 "혈관형성억제단원"은 혈관형성 억제 기능을 갖춘 폴리펩티드 구역、부분、유전자 순서、구조영역 등을 가리킨다. 혈관형성 억제단원은 본 발명 융합단백질의 모든 아미노산 서열을 가리키고 혈관형성 억제 능력을 갖추기만 하면 된다. 예를 들면 본 발명의 혈관형성 억제단원은 VEGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분과 FGFR 세포외 부위로부터 유래된 부분 등을 포함한다.

본문에서 사용한 용어 "축퇴변이"는 진술한 축퇴변이가 아미노산 코돈 제3위의 축퇴변화로 하여금 진술한 축퇴변이가 코딩한 같은 아미노산을 포함하고 예를 들어서 삼중자코드의 워블 위치（wobble position）는 하나 또는 여러 개의 개변된 변이를 포함하고 동의 변이라고도 부른다.

본문에서 사용한 용어 "대립유전자변이" 는 염색체의 특정위치에 나타난 두개 또는 여러개 유전자를 가리킨다.

본문에서 사용한 용어 "상대" 는 인류 같은 포유동물일수 있으며 사육동물 (개、고양이 같이) 가축 (소、양、돼지、말 같이) 또는 실험동물 (원숭이、큰 쥐、작은쥐、토끼、기니피그 등과 같이) 기타 동물일수도 있다.

본문에서 사용한 용어 "일치성", "백분율 일치성" "상동성" 또는 "동일성"은 두개 아미노산 서열사이 또는 뉴클레오티드 서열사이의 서열 동일성을 가리킨다. 두개 서열의 비교를 통해서 백분율 일치성을 확정하고 백분율 일치성은 서로 비교하는 서열의 공유위치의 같은 잔기 (즉 아미노산 또는 뉴클레오티드)의 수량을 가리킨다. 본 영역의 표준계산방법 (Smith 와 Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482; Needleman 와 Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48:443; Pearson 와 Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444 같이)을 사용할수 있으며 또는 이런 계산방식의 계산기화 판본(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)을 통해서 서열 대비와 비교를 진행하고 진술한 계산기화 판본은 BLAST와 FASTA를 공개적으로 사용할수 있다. 그 밖에 미국국가위생연구원（Bethesda MD）에서 사용할수 있는 ENTREZ를 통해 서열 비교에 사용할수 있다. BLAST와 갭 BLAST프로그램을 사용할때 각 프로그램 (BLASTN 같이 미국국가생물기술정보중심의 인터넷 웹사이트에서 사용할 수 있다)의 디폴트 파라미터를 사용할수 있다. 하나의 실시방안중 갭 가중이 1인 GCG를 사용해서 두개 서열의 백분율 동일성을 확정할수 있고 매개 아미노산 갭에 가중을 부여할수 있어서 마치 두개 서열사이의 단 아미노산이 어울리지 않은 것과 같다. 어쩌면 ALIGN 프로그램（2.0판）을 사용할수 있으며 그는 GCG（Accelrys，San Diego，CA）서열 대비 소프트웨어 패키지의 일부분이다.

본문에서 사용한 용어 "교잡"은 두개의 한가닥 폴리뉴클레오티드가 비공유결합으로 안정된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로 형성되는 과정을 가리킨다. 용어 "교잡"은 세가닥 교잡을 가리킬 수도 있다. 이로서 생긴 (보통은) 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드는 "교잡체" 또는 "이중체"이다. 교잡조건은 보통 대략 1M보다 낮은 염산도이고 더욱이 보통은 대략 500 mM보다 낮거나 대략 200 mM보다 낮은 염산도이다. 교잡온도는 5℃ 까지 내려올수 있지만 보통은 대략 22℃보다 높고 더욱이 보통은 대략 30℃ 보다 높고 바람직하게는 대략 37℃보다 높다. 교잡은 보통 엄격한 조건 (즉 탐색자가 표적 서열과 교잡하는 조건)하에서 진행한다. 엄격한 교잡조건은 서열에 의존하고 부동한 상황하에서 차이가 존재한다. 비교적 긴 단편은 아마 비교적 높은 교잡온도로 특이성 교잡을 진행할 수요가 있을것이다. 기타 요소에 따라서 (상보성 가닥의 염기쌍 조성과 길이、유기용제의 존재와 염기쌍의 틀린 짝맞추기 정도를 포함) 아마 교잡의 엄격도에 영향이 있을것이고 따라서 파라미터의 조합이 어떠한 단독 파라미터의 절대치보다 더욱이 중요할것이다. 보통은 엄격한 조건을 확정된 이온 강도와 pH하에서 특정된 서열의 Tm보다 대략 5℃ 낮게 선택한다. 예시성 엄격한 조건은 pH 7.0부터 8.3 까지에서 적어도 0.01 M에서 1M보다 높지 않은 Na이온 농도（또는 기타염）와 적어도 25℃의 온도를 포함한다. 엄격한 조건에 대해서 Sambrook, Fritsche와 Maniatis. "Molecular Cloning A laboratory Manual" 제2판 Cold Spring Harbor Press (1989) 및 Anderson "Nucleic Acid Hybridization" 제1판, BIOS Scientific Publishers Limited (1999)같은 것을 참조할수 있고 그들이 상술한 모든 목적에 대해서 모두 참조를 통해서 본문에 전부 합병한다.

본문에서 사용한 용어 “링커”、“펩티드 링커”、“연결 서열”또는“링커 서열”은 본 발명의 융합단백질이 포함한 각 구조영역및/또는 구역을 서로 연결시키는 짧은 아미노산 서열을 가리키고 보통은 0-20개의 아미노산 길이이며 2-10개 아미노산이 바람직하다.

본문에서 사용한 용어 융합단백질 또는 부분 또는 구조영역은 “ SEQ ID NO: N에 대응되는 아미노산 서열”을 의미하고 진술한 융합단백질 또는 부분 또는 구조영역은 대부분 SEQ ID NO: N처럼 제시된 아미노산 서열을 갖추고 바람직하게는 그중에 1、2、3、4、5、10 또는 20개 아미노산 대체、첨가 또는 결실을 초과하지 않은것을 포함하고 더 바람직하게는 진술한 융합단백질 또는 부분 또는 구조영역은 SEQ ID NO: N에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99%의 동일성이 있고 더욱이 바람직하게는 진술한 융합단백질 또는 부분 또는 구조영역은 SEQ ID NO: N에 제시된 서열을 갖추고 있다.

본문에서 사용한 용어 "VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질"은 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분, FGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분과 면역글로불린 FC부위를 포함한 융합단백질을 가리킨다. 일부 실시방안중에서 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분과 FGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분은（1）SEQ ID NO: 9의1-443위、SEQ ID NO: 10의 1-364위、SEQ ID NO: 11의 1-379위、SEQ ID NO: 12의 1-531위、SEQ ID NO: 13의 1-611위、SEQ ID NO: 14의 1-531위、SEQ ID NO: 15의 1-312위、SEQ ID NO: 16의 1-611위、SEQ ID NO: 17의 1-207위、SEQ ID NO: 18의 1-665위、SEQ ID NO: 19의 1-610위、SEQ ID NO: 20의 1-611위、SEQ ID NO: 21의 1-580위、SEQ ID NO: 22의 1-540위、SEQ ID NO: 23의 1-542위와 SEQ ID NO: 24의1-435위에 제시된 어느 한 항의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 26의 1-1326위、SEQ ID NO: 27의 1-1092위、SEQ ID NO: 28의 1-1137위、SEQ ID NO: 29의 1-1593위、SEQ ID NO: 30의 1-1833위、SEQ ID NO: 31의 1-1593위、SEQ ID NO: 32의 1-936위、SEQ ID NO: 33의 1-1833위、SEQ ID NO: 34의 1-621위、SEQ ID NO: 35의 1-1995위、SEQ ID NO: 36의 1-1830위、SEQ ID NO: 37의 1-1833위、SEQ ID NO: 38의 1-1740위、SEQ ID NO: 39의 1-1620위、SEQ ID NO: 40의 1-1626위와 SEQ ID NO: 41의 1-1305위에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열 코드를 갖추고；（2）SEQ ID NO: 9의 1-443위、SEQ ID NO: 10의 1-364위、SEQ ID NO: 11의 1-379위、SEQ ID NO: 12의 1-531위、SEQ ID NO: 13의 1-611위、SEQ ID NO: 14의 1-531위、SEQ ID NO: 15의 1-312위、SEQ ID NO: 16의 1-611위、SEQ ID NO: 17의 1-207위、SEQ ID NO: 18의 1-665위、SEQ ID NO: 19의 1-610위、SEQ ID NO: 20의 1-611위、SEQ ID NO: 21의 1-580위、SEQ ID NO: 22의 1-540위、SEQ ID NO: 23의 1-542위와 SEQ ID NO: 24의 1-435위에 제시된 어느 한 항의 아미노산 서열이 적어도 70% 동일성인 아미노산 서열 또는 그것으로 조성?고 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성을 포함하고；또는（3）SEQ ID NO: 26의 1-1326위、SEQ ID NO: 27의 1-1092위、SEQ ID NO: 28의 1-1137위、SEQ ID NO: 29의 1-1593위、SEQ ID NO: 30의 1-1833위、SEQ ID NO: 31의 1-1593위、SEQ ID NO: 32의 1-936위、SEQ ID NO: 33의 1-1833위、SEQ ID NO: 34의 1-621위、SEQ ID NO: 35의 1-1995위、SEQ ID NO: 36의 1-1830위、SEQ ID NO: 37의 1-1833위、SEQ ID NO: 38의 1-1740위、SEQ ID NO: 39의 1-1620위、SEQ ID NO: 40의 1-1626위와 SEQ ID NO: 41의 1-1305위에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열이 적어도 70% 동일성인 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열 또는 그것으로 조성?고 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성을 포함한다.

본 발명의 일부 바람직한 실시방안중 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은（1）SEQ ID NO: 9-24에 제시된 어느 한 항의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 26-41에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열 코드를 갖추고（2）SEQ ID NO: 9-24에 제시된 어느 한 항의 아미노산 서열이 적어도 70% 동일성인 아미노산 서열 또는 그것으로 조성?고 바람직하게는 적어도 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성을 포함하고 또는（3）SEQ ID NO: 26-41에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열이 적어도 70% 동일성인 뉴클레오티드 서열이 코딩한 아미노산 서열 또는 그것으로 조성?고 바람직하게는 80%、90%、93%、95%、97%、98% 또는 99% 동일성을 포함한다.

일부 바람직한 실시방안중 진술한 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 핵산으로 코딩할수 있고 진술한 핵산은 그 상보물이 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO: 26-41에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열과 교잡한 서열을 포함하고 또는 SEQ ID NO: 26-41 에 제시된 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열의 축퇴변이를 포함한다. 일부 바람직한 실시방안중 진술한 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질중 면역글로불린FC부위로부터 유래된 부분은 핵산으로 코딩할수 있고 진술한 핵산은 그 상보물이 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO: 8에 제시된 뉴클레오티드 서열과 교잡한 서열을 포함하고 또는 SEQ ID NO: 8 에 제시된 뉴클레오티드 서열의 축퇴변이를 포함한다.

또 다른 일부 바람직한 실시방안중 진술한 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질 변이를 포함하고 SEQ ID NO: 26-41에 제시된 어느 한 항에 대응되는 아미노산 서열중 2、3、4、5、10、20、30 또는 50개 아미노산 대체、첨가 또는 결실을 초과하지 않는 변이를 포함하고 진술한 변이는 바람직하게는 혈관혈성 억제하는 능력을 유지해야 한다. 한개 실시방안중 진술한 대체、첨가 또는 결실은 VEGFR 세포외 부위로부터 유래된 부분에 위치한다. 또 다른 실시방안중 진술한 대체、첨가 또는 결실은 FGFR 세포외 부위로부터 유래된 부분에 위치한다. 또 다른 실시방안중 진술한 대체、첨가 또는 결실은 면역글로불린FC로부터 유래된 부분에 위치한다. 또 다른 실시방안중 진술한 대체、첨가 또는 결실은 링커 또는 연결 부분에 위치한다.

VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 FGFR 세포외 부위로부터 유래된 부분 및 면역글로불린FC부위로부터 유래된 부분중 천연적으로 존재한 수식을 제외하고 변역한다음의 수식을 포함할수 있다. 이러한 수식은 아세틸화、하이드록실화、당화、인산화、에스테르화、아실화를 포함하지만 한정되지 않는다. 결과 수식을 거친 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 비아미노산 성분을 포함할수 있고 예을 들어서 폴리에틸렌 글리콜、지질、다당、단당 및 인산이다. 이러한 비아미노산 성분이 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질의 기능에 대한 작용은 본문에서 기타 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질 변이를 조준해서 진술한 것처럼 테스트를 진행할수 있다. VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질이 세포중에서 생길때 번역한다음의 처리가 정확한 접기및/또는 단백질 기능에 대해 아마도 중요한것이다. 부동한 세포 (CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3 또는 HEK293같이)는 이런 번역한다음의 활성에 조준한 특정세포기계와 특유 메커니즘을 소유하며 게다가 부동한 세포를 선택해서 VEGFR-FGFR-Fc 융융합단백질의 정확한 수식과 처리를 확보한다.

본문에서 진술한 융합단백질은 본 영역에서 이미 알고 있는 어떠한 방법을 통해서라도 생산할수 있다. 예를 들어서 화학합성 또는 핵산 발현로 생산한다. 본 영역에서 이미 알고 있는 완벽한 표준액체 또는 바람직한 고체상 펩티드 합성방법은 본 발명의 펩티드의 제조에 쉽게 쓰일수 있다（J. M. Stewart 와 J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984) , in M. Bodanzsky 와 A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984) 같은 것을 참조). 본 영역에서 이미 알고 있는 기술을 사용해서 진술한 융합단백질중의 폴리펩티드 서열내에 포함된 시스테인 잔기사이에 하나 또는 여러개의 분자내의 교차결합을 형성해서 진술한 융합단백질이 예상된곳에 위치하게 생산한다 (미국특허 No. 5478925 같은 것을 참조). 그 밖에 본문에서 진술한 단백질은 진술한 단백질의 C쪽 또는 N쪽을 통해서 시스테인이든가 비오틴을 첨가해서 상규적인 수식을 진행한다.

본문에서 사용한 "치료유효량" 또는 "유효량"은 시용대상에 이로운 사용량을 충분히 제시하는 것을 가리킨다. 시용한 실제 사용량 및 시용한 속율과 시간과정은 치료자의 자신 상황과 엄중정도에 결정된다. 치료의 처방 (사용량에 대한 결정 등과 같은)은 최종은 가정의학과 전문의 및 기타 의사의 책임 및 책임에 의존해서 결정을 하고 보통은 치료하는 질병、환자의 개인 상황、전달부위、시용방법 및 의사에 대해 이미 알고 있는 기타 요소를 고려한다.

한편 본 발명은 혈관형성을 억제하는 융합단백질을 제공하였으며 적어도 두가지 혈관형성억제제로부터 유래된 혈관형성억제단원을 포함한다. 바람직하게는 진술한 적어도 두가지 혈관형성억제제는 혈관형성의 수용체이며 진술한 수용체는 예를 들어서 다음에서 선택할수 있습니다. DDR1、EphA1、EphA2、EphA8、EphB1、EphB4、EGFR、HER2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、Tie1、HGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Notch수용체、LK8、혈관생성억제인자（angiostatin）、앤도스타틴（endostatin）、플라스미노겐（plasminogen）、콜라겐XVIII 및 대립유전자 변이입니다. 하나의 구체적인 실시방안중 진술한 혈관형성억제제는 혈관형성을 억제하는 수용체 VEGFR와 FGFR이다.

특별히 본 발명자는 일련의 VEGFR-FGFR-Fc융합단백질을 구성했으며 그것이 높은 친화력으로 VEGF와 FGF와 결합할수 있으며 그리고 유효적으로 VEGF와 FGF가 유도하는 세포 분열을 억제할수 있다.

일부 실시방안중 본 발명자는 예상밖에 N쪽으로부터 C쪽까지 순서에 따라 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분과 FGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분의 융합단백질이 VEGF와 FGF와 특별히 잘 결합하는 성질을 갖추고 있다는것을 발견했으며 바람직하게는 진술한 VEGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분은 VEGFR1 제1Ig같은 구조영역、VEGFR1 제2Ig같은 구조영역과 VEGFR1 제3Ig같은 구조영역을 포함하며 더욱이 바람직하게는 FGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분은 FGFR1 Ig같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분、FGFR1 제2Ig같은 구조영역、FGFR1 제3Ig같은 구조영역을 포함한다. 더욱이 바람직하게는 진술한 FGFR1 Ig같은 구조영역 중간기능성서열구로부터 발원한 부분은 산성박스를 포함하지 않으며 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:1 제134부터 162위까지、145부터 162위까지 또는 151부터 162위까지에 대응되는 아미노산 서열을 갖추고 있다.

일부 실시방안중 본 발명은 혈관혈성의 매개 또는 그것과 상관되는 질병을 치료하는데 쓰이는 조합물 또는 약물의 용도로 아래항을 제조한 것이 포함되고 진술한 항은 즉:（i）VEGFR-FGFR-Fc융합단백질; 또는（ii）이 융합단백질을 코딩한 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들면 하나의 실시방안중 본 발명은 혈관형성 억제제로 쓰이는 약물의 용도로 아래항을 제조한것이 포함되고 진술한 항은 （i）VEGFR-FGFR-Fc융합단백질; 또는（ii）이 융합단백질을 코딩한 폴리뉴클레오티드이다.

일부 실시방안중 본 발명의 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질은 포유동물세포계중의 SEQ ID NO: 26-41 모든 핵산발현을 통해서 생산한다. 특별히 진술한 포유동물세포계는 CHO세포계이다.

그 밖에 본 발명은 아래처럼 진술한 VEGFR-FGFR-Fc융합단백질을 제공했으며 그중에 VEGFR세포외 영역으로부터 유래된 부분、 FGFR 세포외 영역으로부터 유래된 부분과 면역글로불린 Fc뷔위로부터 유래된 부분은 링커를 통해서 또는 통하지않고 연결됩니다.

또 일부 실시방안중 본 발명은 VEGFR-FGFR-Fc융합단백질의 분리된 핵산 분자를 코딩하는것을 포함하며 본 발명은 이런 분자가 약물을 제조하는 용도에도 포함한다. 진술한 핵산은 재조합、합성 또는 본 영역에서 사용할수 있는 모든 방법을 통해서 생산한것일수도 있으며 진술한 방법은 표준기술을 사용한 클론을 포함한다.

또 다른 일부 실시방안중 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 함유한 벡터를 포함한다. 진술한 벡터는 발현 벡터일수도 있으며 진술한 핵산은 진술한 핵산이 숙주세포중에서 발현하는 통제 서열을 제공할수 있는것과 유효적으로 연결된다. 여러가지 벡터를 사용할수 있다. 예를 들어서 합리한 벡터는 바이러스 (예를 들어서 마마바이러스、아데노바이러스、배큘로바이러스 등); 효모 벡터、박테리오파지、염색체、인공염색체、플라스미드、코스미드를 포함한다.

일부 실시방안중 본 발명은 이런 벡터를 트렌스펙션한 세포를 포함하며 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질을 발현할수 있도록 한다. 본 발명에 적용되는 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일수 있다. 그들은 세균을 포함하며 대장균、효모、곤충세포와 포유동물 세포같은 것이다. 사용할수 있는 포유동물 세포계는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포、어린 햄스터 신장 세포、NS0작은 쥐 골수종 세포、원숭이 또는 사람 세포계 및 기타 유래된 세포계 등등을 포함하지만 그것에 한정하지 않는다.

또 다른 한편 본 발명은 혈관형성을 억제하는 방법을 제공했고 이런 수요가 있는 상대에게 본 발명의 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질을 시용하는 것을 포함한다. 진술한 방법은 바람직하게는 포유동물에 진행한다.

또 다른 한편 본 발명은 포유동물중에서 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공했고 이런 수요가 있는 샹대에게 본 발명의 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질을 시용하는 것을 포함하고 그중에 진술한 종양은 바람직하게는 고형종양이다.

또 다른 한편 본 발명은 포유동물중에서 안중혈관형성과 상관되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공했고 이런 수요가 있는 상대에게 본 발명의 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질을 시용하는 것을 포함하고 진술한 안중혈관형성과 상관되는 질병은 바람직하게는 연령과 관계되는 황반변성、당뇨병성망막병변 등이다.

본 발명은 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질이 혈관형성을 억제하는데 쓰이는 약물을 제조하는 용도에 연관된다. 그 밖에 본 발명은 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질이 혈관형성과 상관되는 질병을 치료 또는 예방하는데 쓰이는 약물을 제조하는 용도에도 연관되고 진술한 혈관형성과 상관되는 질병은 바람직하게는 종양 또는 안과혈관형성과 상관되는 질병이다.

본 발명중에서 진술한 혈관형성과 상관되는 질병은 혈관혈성 의존성 암종증을 포함하지만 한정되지 않고 예를 들면 고형종양、혈행성종양 (백혈병 같은)과 종양전이를 포함: 양성종양은 예를 들면 혈관종、청신경종（acoustic neuroma）、신경섬유종증（neurofibroma）、트라코마（trachoma）와 고름육아종（pyogenic granuloma）；류마티스관절염；마른비늘증；피부홍조（rubeosis）；오슬러-웨브증후군（Osler-Webber Syndrome）；심근혈관형성（myocardial angiogenesis）；동맥경화죽상판혈관형성（plaque neovascularization）；모세혈관확장증（telangiectasia）；혈우병성관절（hemophiliac joint）과 혈관섬유증（angiofibroma）이다.

진술한 방법의 일부 실시방안중 함께 (동시에) 또는 부동한 시간에 (순서에 따라) 한가지 또는 여러가지 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질을 시용할수 있다. 그 밖에 진술한 융합단백질은 암종증 치료 또는 혈관형성을 억제하는 그 외의 약물과 같이 시용할수 있다.

일부 실시방안중 공개된 주제 방법은 단독으로 사용할수 있다. 또는 진술한 주제 방법과 기타 증식성 질병 치료 또는 예방에 쓰이는 상규적인 항암치료법은 조합으로 사용할수 있다. 예를 들면 이런 방법은 암종증 예방、암종증 재발을 예방과 수술한다음 전이 및 기타 암종증 치료의 보조수단으로 쓸수 있다. 공개된 본 발명은 목표 펩티드 치료제 사용을 통해 상규적인 암종증 치료 (예를 들면 화학요법、방사선요법、광선요법、면역요법 및 수술)의 유효성을 강화한다.

안중에서 혈관형성은 당뇨병성 망막병、미숙아 망막증（retinopathy of prematurity）、연령과 관계되는 황반변성、각막이식배척、혈관형성성 녹내장과 수정체 섬유 증식증 （retrolental fibroplasia）같은 것과 연관된다. 본문에서 공개된 FGFR-Fc 융합단백질은 안내에서 시용할수 있고 또는 다른 경로를 거쳐서 시용할수 있다. 안중혈관형성과 관련이 있는 기타 질병을 포함하지만 유행각막결막염 （epidemic keratoconjunctivitis）、비타민A 결핍증（Vitamin A deficiency）、콘택트렌즈 과도착용（contact lens overwear）、아토피각막염（atopic keratitis）、상윤부각막염（superior limbic keratitis）、건성 익상편각막염（pterygium keratitis sicca）、쇼그렌 （sjogren）、장미여드름（acne rosacea）、플릭텐증、매독（syphilis）、미코박테륨 감염（Mycobacteria infection）、지질변성（lipid degeneration）、화학화상（chemical bum）、세균성궤양（bacterial ulcer）、진균성궤양（fungal ulcer）、단순헤르페스감염（Herpes simplex infection）、띠헤르페스감염（Herpes zoster infection）、　　원충감염（protozoan infection）、카포시육종（Kaposi sarcoma）、무렌각막궤양（Mooren ulcer）、Terrie변연각막변성（Terrien? marginal degeneration）、번연성각막분리（mariginal keratolysis）、류마티스관절염、전신홍반루푸스（systemic lupus）、다발동맥염（polyarteritis）、외상（trauma）、Wegeners사르코이드증（Wegeners sarcoidosis）、공막염（Scleritis）、Steven's Johnson병（Steven's Johnson disease）、유천포창방사성각막절개술（periphigoid radial keratotomy）와 각막이식배척（comeal graph rejection）、낫적혈구빈혈（sickle cell anemia）、사르코이드증（sarcoid）、탄력섬유거짓황색종（pseudoxanthoma elasticum）、파제트병（Pagets disease）、정맥폐쇄증（vein occlusion）、동맥폐쇠증（artery occlusion）、경동맥 폐쇠병（carotid obstructive disease）、만성포도막염/유리체염（chronic uveitis/vitritis）、미코박테륨 감염（mycobacterial infections）、라임 질환（Lyme's disease）、전신성 홍반성 낭창 （systemic lupus erythematosis）、미숙아망막병증（retinopathy of prematurity）、일스병（Eales disease）、베세트병（Bechets disease）、색소성망막염（retinitis）또는 맥락막염（choroiditis）의 감염, 　(추정) 눈 히스토플라스마증（presumed ocular histoplasmosis）、베스트병（Bests disease）、근시（myopia）、시각오목（optic pit）、Stargarts병（Stargarts disease）、주변포도막염（pars planitis）、만성적인망막박리（chronic retinal detachment）、과다점성증후군（hyperviscosity syndromes）、톡소포자충증（toxoplasmosis）、외상（trauma）와레이저수술후 합병증（post-laser complication）에 한정되지 않는다. 기타 질병도 포함하지만 레드스테인과 （각 신혈관 형성 （neovasculariation of the angle））연관되는 질병 및 섬유혈관증식（fibrovascular） 또는 섬유조직 （fibrous tissue）의 비상적인 증식으로 일으킨 질병에 한정되지 않으며 모든 형식의 증식유치체망막병（vitreoretinopathy）을 포함한다.

본 발명의 융합단백질은 단독으로 시용할수 있지만 바람직하게는 약물 조합물로 시용하고 보통은 시용한 계획방식에 근거하여 선택한 적합한 약물 부형제、희석제 또는 벡터를 포함한다. 융합단백질은 어떠한 적합한 방법을 통해 치료가 필요한 환자에 적용한다. 정밀한 계량은 여러가지 요소에 결정되고 융합단백질의 정밀한 성질도 포함한다.

일부 적합한 사용방식은 내복、직장、코、국부 (구강과 혀및을 포함)、피하、질 또는 위장외의 (피하、근욕、정맥、진피내、경막내와 경질막바깥을 포함) 시용을 포함한다. (하지만 한정되지 않는다.)

정맥주사와 병고위치의 주사에 대해서 활성성분은 위장외에서 접수하는 한가지 수용제 형식일것이고 발열원을 포함하지 않고 적합한 pH치、등장성과 안정성을 갖춘다.

본 영역과 상관되는 기술인원은 적합한 용제 또는 제재를 사용해서 융합단백질을 만들수 있고 예를 들면: 염화나트륨 주사액、링거주사액、링거젖산 주사액과 같은 등장부형제이다. 요구에 근거하여 방부제、안정제、완충제、항산화제및/또는 기타 첨가제를 가입할수 있다. 내복을 시용하는 약물 조합물은 정제、캡슐、가루약 또는 내복액 등 형식일수 있다. 정제는 젤라틴 또는 보조제와 같은 고체벡터를 포함할수 있다. 액체 약물 조합물은 보통 물、석유、동물 또는 식물유、광질유 또는 합성유와 같은 액체벡터를 포함한다. 생리 식염수 용액、포도당 또는 기타 당용액 또는 에틸렌 글리콜、프로필렌 그리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜류도 포함할수 있다.

이상에서 언급한 기술과 방안의 예와 및 기타 일부 본 발명에 근거해서 사용한 기술과 방안은 Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. (ed) , 1980.에서 찾을수 있다.

융합단백질의 클론과 발현 플라스미드를 구성

VEGF수용체와 FGF수용체단편은 PCR을 통해 상응하는 수용체의 cDNA 템플릿 증폭으로 취득할수 있고 IgG1Fc 단편은 PCR 방법을 통해 인류 발생적 IgG1인 cDNA 증폭으로 취득할수 있다. PCR 시발체를 설계할때에 부동한 단편사이에 연결 서열을 도입하여 부동한 단편이 최종 오버랩 PCR을 통해서 서로 연결되서 부동한 융합단백질 해독틀이 형성되고 동시에 cDNA의 양단에 각각 BspE I、Pst I 엔도뉴클레아제의 유전자자리를 붙인다. 부동한 융합단백질의 cdna는 BspE I、Pst I 엔자임 절단을 거친다음 발현 플라스미드에 클론할수 있다. 클론한다음의 플라스미드는 엔도뉴클레아제로 소화、전기영동의 감정을 거친다음 최종 DNA 염기서열 분석을 거쳐서 확정된다.

본 발명중에서 2#、4#、7#、9#、10#、11#、12#、14#、15#、16#、20#、21#、24#、25#、27#、28# 재조합 발현 플라스미드를 구성했다：

그 중에 2#、4#、7# 융합단백질은 VEGFR1세포외 구조영역 부분、FGFR1세포외 구조영역 부분과 IgG1 Fc를 포함하고；9#、10#、16#、20#、21#、24#、25#、28#은 VEGFR1세포외 구조영역 부분、VEGFR2세포외 구조영역 부분、FGFR1세포외 구조영역 부분과IgG1 Fc로 ?고 이상의 11개 재조합 발현 플라스미드는 FGFR1 FGFR1 세포외 구조영역 하류시발체（2#-FGFR1하류시발체：GTTTTGTCCTCCAGGTACAGGGGCGAGGTC）、IgG1 Fc의 상류시발체（CTGTACCTGGAGGACAAAACTCACACATGC）와 IgG1 Fc하류시발체（GATATCTGCAGTCATTTACCCGGAGACAGG）와 같은 것을 사용한다.

사용한 기타 시발체는 아래와 같다:

2# 융합단백질：

2#-VEGFR1상류시발체：

ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG

2# -VEGFR1하류시발체：

CCTGTGATGCGGGTGCGATTTTTTTCATCAGGGTAACTCC

2# -FGFR1상류시발체：

CTGATGAAAAAAATCGCACCCGCATCACAG

4#융합단백질：

4# VEGFR1상류시발체는 2#：2#-VEGFR1상류시발체와 같다.

4#-VEGFR1하류시발체：

TTTTTCATCAGGGTAACTCCAGGTCATTTG

4# FGFR1상류시발체：

GGAGTTACCCTGATGAAAAACCAGAAAAGATGGAAAAGAAAT

4# FGFR1하류시발체는 2#：2#-FGFR1하류시발체와 같다.

7#융합단백질：

7# VEGFR1상류시발체는 2#：2#-VEGFR1 상류시발체와 같다.

7# VEGFR1하류시발체：

ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCACCACCTTTTTCATCAGGGTAACTCCAG

7#FGFR1상류시발체：

AGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCCCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTG

7# FGFR1하류시발체는 2#：2#-FGFR1하류시발체와 같다.

9#융합단백질：9#융합단백질은 VEGFR1D1、VEGFR1D2、VEGFR2D3、FGFR、Fc다섯 개 구역을 포함한다.

pBLAST45-hFLT1s7cDNA으로 VEGFR1D1 증폭하고 시발체：

9#-VEGFR1D1상류시발체：

TAGTTCCGGAAGCAAATTAAAAGATCCTGAACTGAG

9#-VEGFR1D1하류시발체：

ATCTCTACGAAAGGTCTACCTGTATCACTAATAAATATATAG

pBLAST45-hFLT1s7cDNA으로 VEGFR1D2 증폭하고 시발체：

9#-VEGFR1D2R2D3상류시발체：GGTAGACCTTTCGTAGAGATGT

9#-VEGFR1D2하류시발체：

CATGAGACGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGTTTG

pBLAST45-hFLK1s7를 템플릿으로 VEGFR2D3 증폭하고 시발체：

9#-VEGFR2D3상류시발체：

CAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG

9#-VEGFR1D2R2D3하류시발체：AGGTTTTTCATGGACCCTGAC

9#FGFR1상류시발체：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGC

10#융합단백질：

10#VEGFR1구역의 구조영역 서열 PCR시발체는 9#와 같다.

10#-FGFR1상류시발체：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTAAAAATCGCACCCGCATCACAGG

16#융합단백질：

16#VEGFR1D1상류시발체는 9#-VEGFR1D1상류시발체와 같다.

16# VR1D2R2D3R하류시발체는 9#- VR1D2R2D3R하류시발체와 같다.

16#FGFR1상류시발체：

GTCAGGGTCCATGAAAAACCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTG

20#융합단백질：

20#-VEGFR1D1상류시발체는 9#-VEGFR1D1상류시발체와 같다.

20#-VR1D2R2D3R하류시발체는 9#- VR1D2R2D3R하류시발체와 같다.

20#-FGFR1상류시발체：

CCTGTGATGCGGGTGCGATTAGGTTTTTCATGGACCCTGAC

21#융합단백질：

21#는 10#을 템플릿으로 아래와 같은 시발체를 사용하고 10#FGFR1D1h 중의 하나 염기 Cys로 하여금 Ser로 되게 한다：

21#-mutF：

CTCCGGCCTCTATGCTTCCGTAACCAGCAGCCCCTC

21#-mutR：

GAGGGGCTGCTGGTTACGGAAGCATAGAGGCCGGAG

24#융합단백질：

24#VEGFR1D1상류시발체는 9#-VEGFR1D1상류시발체와 같다.

24# VR1D2R2D3R하류시발체는 9#- VR1D2R2D3R하류시발체와 같다.

24#FGFR1상류시발체：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTTCGGGCAGTGACACCACCTAC

25#융합단백질：

25#VEGFR1D1상류시발체는 9#-VEGFR1D1상류시발체와 같다.

25# VR1D2R2D3R하류시발체는 9#- VR1D2R2D3R하류시발체와 같다.

25#FGFR1상류시발체：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTAACCCCGTAGCTCCATATTGG

28#융합단백질：

28#는 25#를 템프릿으로 상류시발체는 2#-VEGFR1상류시발체와 IgG1 Fc하류시발체를 사용해서 PCR을 진행한다.

11#、14#、27# FGFR1세포외 구조영역 부분、VEGFR1세포외 구조영역 부분、VEGFR2세포외 구조영역 부분과 IgG1 Fc를 포함한다. 이상3개 재조합 발현 플라스미드는 IgG1 Fc의 상류시발체와 IgG1 Fc하류시발체와 같은 것을 사용한다.

사용한 기타 시발체는 아래와 같다:

11#융합단백질：

11#-FGFR1상류시발체：

TAGCTCCGGACCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGC

11#-FGFR1하류시발체：

CAGGATCTTTTAATTTTGACTCCAGGTACAGGGGCGAGGTC

11#-VEGFR1D1상류시발체：TCAAAATTAAAAGATCCTGAACTG

11#-VEGFR1D1하류시발체：9#-VEGFR1D1하류시발체와 같다：

11#VEGFR1D2R2D3상류시발체는 9#-VR1D2R2D3상류시발체와 같다.

11#VEGFR1D2D3하류시발체：

GGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGTTTTTCATGGACCCTGAC

14#융합단백질：

14#-FGFR1상류시발체：

AGTTCCGGAAAAAATCGCACCCGCATCACAG

14#FGFR1하류시발체는 11#-VEGFR1D1하류시발체와 같다.

14#VEGFR1D1상류시발체는 11#-VEGFR1D1상류시발체와 같다.

14#VEGFR1D1하류시발체는 9#-VEGFR1D1하류시발체와 같다.

14#VEGFR1D2R2D3상류시발체는 9#-VEGFR1D2R2D3상류시발체와 같다.

14#VEGFR1D2R2D3하류시발체는 11#-VEGFR1D2R2D3하류시발체와 같다.

27#융합단백질：

27#는 14#를 템플릿으로 상류시발체는 27#-FGFR1상류시발체（TAGTTCCGGAAAACCTAACCCCGTAGCTCCAT）와 IgG1 Fc하류시발체를 사용해서 PCR을 진행한다：

12#융합단백질은 VEGFR1 세포외 구조영역 부분、VEGFR2 세포외 구조영역 부분과 IgG1 Fc를 포함한다. 사용한 시발체는 아래과 같다.

12#상류시발체는 9#-FGFR1상류시발체와 같다.

12#VEGFR2하류시발체는 11#VEGFR1D2D3하류시발체와 같다.

Fc상류시발체1：FcFor1：GACAAAACTCACACATGCCCACC

Fc하류시발체：상술한 IgG1 Fc하류시발체와 같다.

15#융합단백질은 VEGFR1세포외 구조영역 부분과 IgG1 Fc를 포함한다. 사용한 시발체는 아래와 같다：

15#상류시발체는 2#-VEGFR1상류시발체와 같다：

ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG

15#VEGFR2하류시발체는 11#VEGFR1D2D3하류시발체와 같다.

Fc상류시발체1：FcFor1：GACAAAACTCACACATGCCCACC

Fc하류시발체：상술한 IgG1 Fc하류시발체와 같다.

융합단백질의 발현과 정화

본 발명의 융합단백질은 본 영역에서 늘 쓰는 기술을 통해 발현과 정화를 할수 있다. Qiagen 플라스미드 정화키트（MAX）로 상응하는 융합단백질 플라스미드의 DNA를 정화하고 자외선 분광 광도법으로 플라스미드 DNA의 농도을 확정하고 FUGENE 6 리포솜（Roche）으로 플라스미드를 CHO세포에 트랜스펙션한다. 트랜스펙션의 구체적인 방법은 제품설명대로이다. 단백질 발현량의 요구가 부동함에 근거하여 본 연구는 두가지 발현방법을 채용해서 단백질 발현을 진행한다: 첫번째는 순식발현법이고 보통은 트랜스펙션한 48-72시간후에 융합단백질을 포함한 배양액상청을 수확하고 사람 IgG ELISA로 융합단백질의 상대함량을 확정하고 따라서 신속하고 유효적으로 융합단백질을 얻을수 있다； 두번째 방법은 안정한 세포계를 건립하는 것이고 재조합 단백질 약물을 채용해서 늘 쓰는 DHFR 핸디캡형 CHO세포 발현계통을 발현 생산하고 기본 과정은 세포의 트랜스펙션、안정한 세포를 선택、클론 선별、압박증폭、배양기와 공예 최적화 등을 포함하고 최종은CHO공정세포주가 무혈청 배양기에서 대규모의 현탁배양을 실현한다. 배양산물을 수집해서Protein A 친화크로마토그래피 컬럼으로 융합단백질을 정화한다. 로릴황산나트륨-폴라아크릴아미드 젤란틴법（SDS-PAGE）으로 정화한 단백질을 분석하고 필요한 발현산물을 함유한 유출물을 합병하고 구경이 0.22 ㎛인 막여과기로 여과한다음 Lowry법 등 여러가지 방법으로 단백질 정량을 진행한다. 본 연구의 CHO세포 배양체적은 장차 10리터 생물반응규모에 달성하고 획득한 융합단백질을 정화하는 것은 동물실험의 단백질 수요에 만족할수 있고 장래 진일보의 공예 확장을 위해서 기초를 다진다.

단백질 수준에서 융합단백질이 VEGF 와 FGF 의 중화작용을 검정

CHO가 발현한 융합단백질을 획득한다음 본 연구는 단백질 수준에서 융합단백질과 VEGF와FGF의 결합 능력에 대해 평가를 진행한다. 본 연구에서 결합 실험과 친화력 실험을 사용해서 검정을 진행하고 결합 실험의 절차는 먼저 96개 구멍인 ELISA판에 각각 VEGF와FGF-2로 외피한다음 BSA로 외피구멍을 밀봉하고 똑 같은 농도인 각종 융합단백질을 가입해서 세척한다음 항인 IgG Fc-HRP이항을 다시 가입하고 현색、종지한다음 엔자임표시판에서 450nm파장의 흑광도를 검색하고 신호의 강약에 근거해서VEGF와FGF-2와 결합 능력을 갖춘 융합단백질을 선별한다. 친화력 실험은 용액체계중에서 융합단백질과 VEGF또는FGF-2의 친화력을 확정하기 위한 것이고 우선 96개 구멍인 ELISA판에 각각 VEGF 또는 FGF-2 포착항체를 외피한다음 BSA로 외피구멍을 밀봉하고 그리고 사전에 조제하고 부화한 융합단백질과 VEGF 또는 FGF-2의 혼합액 및 희석구배 표준품을 가입하고 부화한다음 HRP 표기를 한 측정항체 (유리한 VEGF 또는 FGF-2 항체2 를 특이성적으로 측정하는 것을 이용)를 다시 가입하고 현색、종지한 다음 엔자임표시판에서 450nm파장의 흑광도를 검색하고 따라서 융합단백질과 VEGF 또는 FGF-2 항체2의 혼합액중에서 유리한 VEGF 또는 FGF-2 항체2의 상대농도를 측정해서 확정한다. 이상의 실험을 통해 VEGF와 FGF-2에 대해서 이중 저단 작용을 갖춘 융합단백질을 선별해서 취득한다.

세포 수준에서 융합단백질이 VEGF 와 FGF 에 대한 중화작용을 검증

단백질 수준에서 융합단백질이 VEGF와 FGF-2에 대한 결합 능력을 확정한다음 본 연구는 세포 수준으로 융합단백질이 혈관형성에 대한 억제작용을 진일보 검정한다. 본 연구는 사람 탯줄 정맥 혈관내피세포 분열 실험과 HUEVC세포의 전이 실험으로 융합단백질이 혈관내피세포 분열、전이를 억제하는 능력을 검증한다. HUVEC 세포 분열 실험은 융합단백질이 HUVEC세포 분열을 억제하는 능력을 검증할수 있고 실험할때에 우선 96개 구멍인 판에 매 구멍마다 3000개 HUVEC세포를 접종하고 37℃，5% CO₂ 배양기에서 배양하고 각각 VEGF 또는 FGF-2 및 부동한 농도의 융합단백질과 VEGF 또는 FGF-2의 혼합액을 가입하고 계속 3~4일 배양한다음 10% CCK-8을 가입하고 계속 2시간 배양한다음 엔자임표시판에서 450nm파장의 흑광도를 검색한다. 흡광도의 차이에 근거하여 VEGF 또는 FGF-2가 유도한 혈관내피세포 분열을 억제하는 능력을 평가할수 있고 융합단백질이VEGF 또는 FGF-2에 대한 억제 중간유효농도를 취득할수 있다. HUVEC세포 전이 실험은 융합단백질이 HUVEC세포 전이를 억제하는 능력을 검증하고 실험할때에 우선 트랜스웰 쳄버에 50000개 HUVEC세포와 부동한 농도의 융합단백질을 접종하고 배양판에 VEGF 또는 FGF-2를 함유한 600μL의 뱅양액을 가입하고 37℃，5% CO₂배양기에서 20~24시간 배양한다음 트랜스웰 쳄버 막 정면의 세포를 닦아내고 막 뒤쪽의 세포를 고정、염색하고 PBS로 세척한다음 현미경에 거꾸로 놓고 관찰하며 계산하고 막 뒤쪽에 있는 HUVEC세포수 계산을 통해 HUVEC세포가 VEGF 또는 FGF-2의 자극을 받고 전이하는 정황을 바로 알수 있고 또 배양액에 부동한 농도의 융합단백질을 가입해서 융합단백질이 혈관내피세포의 전이를 억제하는 능력을 바로 알수 있다. 이상의 실험을 통해 본 연구에서 구성한 신형 융합단백질이 VEGF 또는 FGF-2가 유도한 혈관내피세포 분열과 전이를 억제하는 능력을 검증할수 있고 동시에 진일보적인 동물실험을 위해 기초를 다진다.

종양모형이 융합단백질의 종양생장을 억제하는 능력을 검증

단백질 수준과 세포 수준의 실험이 본 연구의 신형 융합단백질이 VEGF와 FGF-2의 신호에 대해 차단 작용이 있다는 것을 검증한다음 본 연구는 동물종양모형에서 융합단백질의 항종양능력을 검증할 것이다. 본 연구는 혈관형성과 종양약물의 연구중에서 늘 쓰는 모형을 채용해서 융합단백질의 항혈관형성과 항종양 효과를 검증하고 예를 들면 LLC작은 쥐 페암、U87교모세포증、B16멜라닌종 등이다. 동물실험중에서 상규적인 대조군외에 VEGF-Trap、FP-1039 같은 동류약물 대조도 포함되고 항종양능력의 비교성 수치를 얻기 위해서이다. 실험할때에 적당한 수량의 종양세포 100 μL 를 C57작은 쥐 등의 뒤쪽옆에 피하 주입한다음 노기스로 종양의 체적을 매주 두번씩 측정하고 종양이 200입방밀리리터까지 자랐을때 피하에 부동한 농도의 융합단백질을 주사하고 2~3주 후에 작은 쥐를 죽이고 노기스로 종양의 체적을 측정하고 종양의 크기에 근거하여 융합단백질의 항종양 효과를 검한다. 그 밖에 면역조직화학법 등 방법으로 각종 종양조직을 분석하고 혈관형성의 조절체제를 탐구한다.

실시예

실시예 1：이중표적 융합단백질 재조합 발현 플라스미드를 구성

상업화된 cDNA（성인 결장암 조직으로 내원 PCR Ready First Strand cDNA , BioChain회사）를 사용해서FGFR1단편의 템플릿으로 한다. 상업화된 플라스미드 pBLAST45-hFLT1s7cDNA（InvivoGen회사）를 사용해서 VEGFR1단편의 템플릿으로 하고 상업화된 플라스미드 pBLAST45-hFLK1s7（InvivoGen회사）를 사용해서 VEGFR2 단편의 템플릿으로 한다. 사람 피 RNA 추출키트 （QIAGEN）를 사용해서 건강한 사람 혈액중의 총 RNA를 추출한다. 역전사키트 （Promega회사）의 사용설명에 따라 M-MLV역전사 효소（Promega회사）로 RT-PCR을 진행하고 RNA를 cDNA로 역전사해서 증폭해야 할 IgG1 Fc단편의 템플릿으로 한다. 역전사키트의 사용설명에 근거하여 RT-PCR를 진행하고 구체적인 절차는: Oligo dT、dNTP、총RNA 및 DEPC H2O을 혼합해서 70 ℃에서 10분 반응한다음 얼음위에 5분 놓고 또 RNA효소 억제제、M-MLV역전사 효소와 반응 완충액을 가입하고 42℃에서 1시간 반응하고 70℃에서 15분 반응한다음 취득한cDNA를 템플릿으로 사용할수 있다.

성인 결장암 조직 cDNA를 템플릿으로 PCR을 통해 각각 부동한 FGFR1단편 (아래의 도1에서 시발체를 본다)을 증폭하고 상업화된 플라스미드를 템플릿으로 각각 부동한 VEGFR1와 VEGFR2단편(아래의 도표 1에서 시발체를 본다)을 증폭하고 사람 피 cDNA를 템플릿으로 PCR을 통해 IgG1 Fc단편(시발체는 아래의 도1과 2에서 실발체를 본다) 을 증폭한다. PCR시발체를 설계할때에 VEGFR1단편、VEGFR2단편、FGFR1단편과 IgG1 Fc단편사이에 20개 또는 그 이상의 상보성 염기 서열을 도입해서 연결 서열로 하고 각 단편으로 하여금 뒤이어서 오버랩 PCR 을 통해 서로 연결될수 있고 부동한 융합단백질의 해독틀이 형성되고 동시에 PCR 산물의 양쪽에 각각 BspE I와 Pst I 엔도뉴클레아제의 유전자자리를 붙인다.

뒤이어 오버랩 PCR을 진행하고 증폭해서 각 FGFR1-Fc 융합단백질 단편을 취득한다. PCR의 반응조건은 98 ℃에서 5분 예비 변성 98℃에서 30초 변성 그리고 56 ℃에서 45초 열처리 72 ℃에서 2분 연장하고 모두 30번의 순환을 거쳐 최종 다시 10분 연장한다. PCR 시발체를 설계할때에 부동한 단편사이에 연결 서열을 도입해서 부동한 단편이 최종 오버랩PCR을 통해 서로 연결될수 있고 오버랩PCR 반응은 두차례로 나뉘고 첫번째는 연결이 필요한 단편이 있지만 시발체를 포함하지 않고 조건은: 98 ℃에서 5분 예비 변성 98 ℃에서 30초 변성 그리고 56 ℃에서 45초 열처리 72 ℃에서 5분 연장하고 모두 6번의 순환을 거쳐 최종 72 ℃에서 다시 10분 연장한다음 양쪽의 시발체를 가입하고 두번째PCR을 진행하고 반응조건은: 98 ℃에서 5분 예비 변성 98 ℃에서 30초 변성 그리고 56 ℃에서 45초 열처리 72 ℃에서 2분 연장하고 따라서 부동한 융합단백질의 해독틀이 있어서 형성되며 동시에 cDNA의 양쪽에 각각 BspE I과Pst I엔도뉴클레아제의 유전자자리를 붙인다.

증폭을 완성한다음 QIAquick PCR정화키트（QIAGEN회사）를 사용해서 PCR 증폭단편을 정화하고 부동한 융합단백질의 cDNA와 진핵 발현 플라스미드 pSV2-dhfr（ATCC）는 각각 BspE I、Pst I효소로 절단하고 90V전압、1% 우무겔전기이동을 거쳐서 QIAquick젤라틴추출키트（QIAGEN회사）를 사용해서 목적단편을 회수한다음 라이게이스（NEB회사）를 사용해서 16℃에서 1시간 연결하고 연결반응 혼합물을 대장균Top10 캄피턴스 세포로 전환하고 전환조건은 42℃에서 90초 반응한 다음 다시 얼음위에 3분 놓고 무균이고 무항권인 LB배양액을 가입해서 37℃、250전/분 진탕기속에서 1시간 배양한다음 암피실린을 함유한 LB판유리에 바르고 37 ℃ 항온 배양기속에서 하루 밤 배양하고 단집락을 골라서 암피실린을 함유한 LB배양액에서 37℃、250전/분 진탕기속에서 하루 밤 배양한다음 알칼리성 용해법으로 플라스미드를 추출하고 엔도뉴클레아제 효소 절단을 거친 다음 90V전압、1% 우무겔 전기이동을 거쳐서 감증하고 효소 절단 감정이 정확한 재조합 플라스미드를 골라서 DNA 염기서열 분석을 진행해서 확정한다. 이상의 절차에 근거하여 각각 2#、4#、7#、9#、10#、11#、12#、14#、15#、16#、20#、21#、24#、25#、27#、28#인 재조합 발현 플라스미드를 구성한다.

그중에 2#、4#、7# 융합단백질은 VEGFR1부분의 세포외 구조영역、FGFR1 부분의 세포외 구조영역과 IgG1 Fc를 포함하며 pBLAST45-hFLT1s7cDNA를 템플릿으로 PCR을 통해서 VEGFR1 부분의 세포외 구조영역을 증폭하고 사람결장암조직 cDNA를 템플릿으로 PCR을 통해서 FGFR1 부분의 세포외 구조영역을 증폭하며 사람 피cDNA를 템플릿으로 사람IgG1 Fc부위를 증폭한다. 그리고 겹침PCR를 통해서 3개단편가 서로 연결된 PCR산물을 취득할수 있으며 엔자임 절단、연결을 통해서 발현벡터에 도입한다. 사용한 시발체는 도표1에서 볼수 있다

9#、10#、16#、20#、21#、24#、25#、28#는 VEGFR1부분의 세포외 구조영역、VEGFR2 부분의 세포외 구조영역、FGFR1부분의 세포외 구조영역과 IgG1 Fc를 포함한다. 우선 9#구성체를 구성하고 pBLAST45-hFLT1s7cDNA을 템플릿으로 PCR 통해서 VEGFR1D1단편와 VEGFR1D2단편를 증폭하며 pBLAST45-hFLK1s7 을 템플릿으로 PCR 통해서VEGFR2D3단편를 증폭하며 사람결장암조직 Cdna를 템플릿으로 PCR 통해서 FGFR1부분의 세포외 구조영역을 증폭하며 사람 피cDNA을 템플릿으로 사람IgG1 Fc부위를 증폭한다. 그리고 오버랩 PCR을 통해서 다섯개 단편가 서로 연결된 PCR산물을 취득할수 있으며 엔자임 절단、연결을 통해서 발현벡터에 도입한다. 그리고 9#구성체를 템플릿으로 PCR을 통해서 VEGFR단편를 증폭하며 사람결장암조직Cdna를 템플릿으로PCR 통해서 FGFR1부분의 세포외 구조영역을 증폭하며 사람 피cDNA을 템플릿으로 사람IgG1 Fc부위를 증폭한다. 그리고 겹침PCR을 통해서 세개 단편가 서로 연결된PCR산물을 취득할수 있으며 엔자임 절단、연결을 통해서 발현벡터에 도입하여 10#、16#、20#、24#、25#구성체를 취득할수 있습니다. 그리고 10#을 템플릿으로 PCR을 통해서 도표 1에 제시한 시발체돌연변이 10#FGFR1D1h중의 하나의 염기를 사용해서 정점돌연변이키드(QuikChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit，STRATAGEN회사）의 조작설명대로 Cys를 Ser로 변하게 하며 21#구성체를 취득하며 구체적인 구성과정은 PCR관중에 탈이온수、10#플라스미드、dNTP、도표1에 제시된 돌연변이시발체、반응완충액、Pfu엔자임을 가입해서 PCR을 진행하며 PCR반응조건은 95℃에서 예비변성 2분 95℃에서 변성 50초 그다음 60℃에서 열처리 50초 그리고 68℃에서 8분 연장 모두 18번의 순환을 거친다음 최종 72℃에서 다시 10분 연장해서 PCR이 끝난다음 1μL Dpn I（NEB회사）를 가입하고 37℃에서 1시간 반응하고 2Ml의 반응산물을 취해서 대장균 Top10 수행능력 세포로 전환하며 전환조건은 42℃에서 90초 반응한 다음 다시 얼음위에 3분 놓고 무균이고 항원이 없는 LB배양액을 가입해서 37℃、250전/분 진탕기속에서 1시간 배양한 다음 암피실린을 함유한 LB판유리에 바르고 37℃ 항온배양기속에서 하루저녁 배양하며 단집락을 골라서 암피실린을 함유한 LB배양액에서 37℃、250전/분 진탕기속에서 하루저녁 배양한다음 알칼리성용해법으로 플라스미드를 추출한다음 DNA측정을 거쳐서 확정한다. 25#를 템플릿으로 2#-VEGFR1상류시발체와 IgG1 Fc 하류시발체 사용을 통해서 PCR을 진행하며28# 구성체를 취득한다. 사용한 시발체는 도표 1에서 볼수 있다.

11#、14#、27#는 FGFR1부분의 세포외 구조영역、VEGFR1부분의 세포외 구조영역、VEGFR2부분의 세포외 구조영역과 IgG1 Fc를 포함한다. 사람결장암조직Cdna를 템플릿으로PCR 통해서 FGFR1부분의 세포외 구조영역을 증폭하며 9#구성체를 템플릿으로 PCR 통해서 VEGFR단편를 증폭하며 사람 피cDNA을 템플릿으로 사람IgG1 Fc부위를 증폭한다. 그리고 겹침PCR을 통해서 세개 단편이 서로 연결된PCR산물을 취득하며 엔자임 절단、연결을 통해서 발현벡터에 도입하여서 11#와 14#구성물을 취득한다. 그리고 14#구성물을 템플릿으로PCR 증폭을 통해서 27#구성물을 취득한다. 사용한 시발체는 도표 1에서 볼수 있다.

12#융합단백질은 VEGFR1 부분의 세포외 구조영역、VEGFR2부분의 세포외 구조영역과 IgG1 Fc를 포함한다. 9#구성체를 템플릿으로 및 9#-VEGFR1D1상류시발체 11#VEGFR1D2D3하류시발체 사람 피cDNA를 템플릿으로 사람IgG1 Fc부위를 증폭한다. 그리고 겹침PCR를 통해서 두개 단편가 서로 연결된 PCR산물을 취득하며 엔자임 절단、연결을 통해서 발현벡터에 도입하여서 12#를 구성해서 취득한다.

15#융합단백질은 VEGFR1 부분의 세포외 구조영역、VEGFR2부분의 세포외 구조영역과 IgG1 Fc를 포함한다. 9#구성체를 템플릿으로 및 2#-VEGFR1상류시발체 11#VEGFR1D2D3하류시발체 사람 피cDNA를 템플릿으로 사람IgG1 Fc부위를 증폭한다. 그리고 겹침PCR를 통해서 두개 단편가 서로 연결된 PCR산물을 취득하며 엔자임 절단、연결을 통해서 발현벡터에 도입하여서 15#를 구성해서 취득한다.

26# 융합단백질은 FGFR1 부분의 세포외 구조영역과 IgG1Fc를 포함한다. 사람 결장암조직 cDNA를 템플릿으로 PCR를 통해서 FGFR1부분의 세포외 구조영역을 증폭하며 SEQ ID NO: 73를 상류시발체로 SEQ ID NO: 74를 하류시발체로 사용하여 사람 피cDNA를 템플릿으로 사람IgG1Fc부위를 증폭한다. 그리고 겹침PCR를 통해서 두개 단편가 서로 연결된 PCR산물을 취득하며 엔자임 절단、연결을 통해서 발현벡터에 도입하여서 26#를 구성해서 취득한다.

각 융합단백질중 VEGFR-FGFR-Fc의 단백질 서열과 그것을 코딩한 뉴클레오티드 서열을 도 2에서 본다. 융합단백질의 구조안내도는 도 1에서 본다.

실시예 2: 융합단백질의 순식간 발현 및 정량

MAX 플라스미드 정화 키트(Qiagen회사)를 사용해서 상응한 융합단백질 플라스미드의 DNA를 정화하고 자외선 분광 광도법으로 플라스미드DNA의 농도를 확정하고 1㎍ 재조합 플라스미드와 6μL 리포솜(FuGENE 6 Transfection Reagent，Roche회사）을 100ML 신선한 IMDM 배양액(GIBCO회사)에 혼합하고 15분 정지시킨 다음 세포밀도에 따라 3×105/mL를 6 개 구멍판에서 하루 밤 배양한 CHO(ATCC)세포에 접종하고 세포 완전배양액은 88% IMDM、10% FBS、1% HT와 1% 글루타민(모두 GIBCO회사에서 생산한 산품이다）포함하고 37℃，5% CO₂ 배양기속에서 48시간 배양한 다음 상청을 수집하고 사람 IgG ELISA 단백질 정량키트（BETHYL회사)로 CHO분비 발현 융합단백질의 상대함량을 확정한다. 구체적인 절차는: 친화농도가 10 μL/mL인 항인 IgG-Fc단백질 100 ML를 96개 구멍인 ELISA판（IMMULON회사）에 각각 외피하고 밤을 지내고 300μL PBST 세정제로 5번 세정한다음 200μL 신선조제한 차단액(KPL회사) (블로킹 스타크설루선：PBS=1:19) 로 각 외피구멍을 차단하고 37℃에서 1h 보육하고 300μL PBST 세정제로 5번 세정한 다음 매 구멍에 100μL 희석구배（기점이 200ng/mL이고 PBS 로 2배수 비례 희석）한 IgG를 표준으로 및 100μL 희석구배한 각종 융합단백질의 세포 배양 상청（기점이 각종 배양상청이고 PBS로 5배수 배례 희석)을 37℃에서 2h 보육하고 300μL PBST 세정제로 5번 세정한 다음 100uL PBS로 1:10000 희석한 항인IgG Fc-HRP이항（BETHYL회사）을 가입하고 37℃에서 1h 보육하고 300μL PBST 세정제로 5번 세정한 다음 100Ul 현색액（KPL회사）으로 현색하고 마지막으로 100μL 종지액（KPL회사）으로 종지 현색한 다음 ELISA판을 효소 라벨 인스트루먼트에 놓고 450nm 파장의 흡광도를 검색하고 표준곡선에 근거하여 부동한 융합단백질의 농도를 알수 있다.

실시예 3: 융합단백질의 결합 실험

ELISA 방법을 사용해서 이상 구성한 융합단백질과 VEGF와 FGF-2의 결합 능력을 측정한다. 먼저 96개 구멍인 ELISA판(IMMULON회사)에 각각 100Ul 20ng/mL VEGF（R&D Systems회사）와 50ng/mL FGF-2（R&D Systems회사）（100ng/mL헤파린을 포함（Sigma회사））를 함유한 용액를 외피한 다음 300μL PBST 세정제로 5번 세정한다음 200μL 신선조제한 차단액(KPL회사) (블로킹 스타크설루선：PBS=1:19) 각 외피구멍을 차단하고 37℃에서 1h 보육하고 300 Ml PBST 세정제로 5번 세정한다음 100uL 농도가 모두 20Ul/Ml인 각종 융합단백질 (PBS에 용해하고 PH=7.2)을 가입하고 37℃에서 2h 보육하고 300μL PBST 세정제로 5번 세정한다음 100uL PBS로 1:10000로 희석한 항인IgG Fc-HRP이항（BETHYL회사）을 가입하고 37℃에서 1h보육하고 300μL PBST 세정제로 5번 세정한다음 100Ul 현색액（KPL회사）을 가입해서 현색하고 마지막으로 100L종지액（KPL회사）을 가입해서 종지 현색한다음 ELISA판을 효소 라벨 인스트루먼트에 놓고 450nm 파장의 흡광도를 검색하고 융합단백질이 VEGFG 또는 FGF2와 결합하는 능력이 강하면 흡광도도 높고 신호도 강해지고 신호의 강약에 근거해서 25호 28호 융합단백질이 동시에 VEGFG와 FGF2를 고효율적으로 결합하는 능력을 갖추고 있다는 것을 확정한다. 융합단백질이 VEGFG와FGF2를 결합하는 비교는 도표2에서 본다.

실시예 4: 융합단백질의 안정한 발현과 정화

고효률적으로 결합하는 능력을 갖춘 25호 융합단백질 및 대조인 12호、15호 융합단백질의 재조합 발현 플라스미드를 리포솜 (Roche회사)을 거쳐 DHFR핸디캡형 CHO세포(ATCC)에 트렌스펙션한다. 구체적으로 재조합 플라스미드 5ug와 30uL 리포솜（FuGENE 6 Transfection Reagent，Roche회사）을 100uL 신선한 IMDM 배양액(GIBCO회사)에 혼합하고 15분 정지시킨다음 세포농도에 따라 3×105/Ml를 10cm세포 페트리접시(Corning회사)에서 하루 밤 배양한 DHFR 핸디캡형 CHO세포(ATCC)에 접종하고 세포 완전배양액은 10% FBS、1%HT와 1%글루타민（모두 GIBCO회사에서 생산한 산품이다）을 함유한 IMDM배양액이고（모두 GIBCO회사에서 온다）37℃，5%CO2 배양기속에서 2~3밤 배양한다음 펜크레아틴（GIBCO회사）으로 세포를 소화하고 3×105/mL에 따라 30Ml 무혈청 302배양기(SAFC회사) 진탕플라스크속에 접종하고 100전/분 37℃，5%CO2배양기속에서 세포밀도가106/mL일때까지 선별 배양하고3000개 세포를 매개10cm세포 페트리접시（Corning회사）속에 접종하고 （배양액은 10%의 FBS、1% 글루타민 IMDM를 함유한 배양기）37℃，5% CO₂배양기속에서 단클론이 형성될때까지 배양하고 단클론을 선택해서 96개 구멍인 세포 배양판（Corning회사）에서 배양하고사람IgG ELISA 단백질 정량키트（BETHYL회사）를 사용해서 각 단클론 분비 발현 융합단백질의 상대함량을 확정하고 구제적인 조건과 절차는 실시예 2에서 융합단백질의 상대함량을 측정한 것과 같고 발현량이 제일 높은 클론을 선별해서 6개 구멍판에서 세포 융합도가 70% 좌우에 도달하게 배양하고 펜크레아틴으로 세포를 소화하고 10cm 페트리접시에 전이하고 배양하며 메토르렉세이트（methotrexate，MTX）를 가입해서（Sigma회사）점차적으로 가압증폭을 진행한다（MTX의 농도가 각각 10nM, 20nM, 50nM, 100nM, 200nM, 500nM). 가압증폭이 끝난 다음 펜크레아틴으로 세포를 소화하고 3×105/mL를 진탕 플라스크에서 배양하고 단세포 발현량을 측정하고 따라서 특정 융합단백질을 발현한 CHO공정세포주를 취득하고 최종 CHO고정세포주를 Ph7.0 무혈청 302 배양기(SAFC회사)중 37℃，5% CO₂，40%산소 용양 80전/분에서 대규모로 현탁배양하고 배양체적이 10L에 도달한다. 분리해서 배양산물을 수집하고 상청액을 얻어서 0.45 ㎛ 여과막으로（Millipore회사) 여과한 다음 ProteinA 친화크로마토그래피 컬럼（GE회사）의 사용안내서에 따라 친화크로마토그래피를 진행하고 우선 PBS완충액(Ph:7.0)을 사용해서 ProteinA 친화크로마토그래피를 평형한 다음 상청을 컬럼을 초과하고 또 다시 PBS완충액으로 평형하고 최종 시트르산 완충액(Ph:3.0)으로 세정을 진행하고 세정액을 수집해서 구경이 0.45um 여과막으로 여과한다음 S/D（0.3%린산트리부틸/1%트윈80）를 가입해서 24℃에 놓고 바이러스를 6시간 사멸하고 분자체 크로마토그래피를 사용해서 목적단백질을 진일보 정화하고 우선 ProteinA 친화크로마토그래피를 거친 세정액을 투석 봉지(Millipore회사）에 넣고 PBS완충액으로 투석을 하고 다시 10KD초미세여과컵（Millipore회사）에 두고 단백질을 농축한다: PBS완충액을 사용해서 분자체 크로마토그래피 컬럼 Superdex 200（GE회사）을 평형하고 초미세여과컵으로 농축한 액체에 샘플한다음 다시 PBS완충액으로 세정하고 용출정점을 수집한다. 로릴황산나트륨-폴리아크릴아미드겔법（SDS-PAGE）으로 정화한 단백질을 분석하고（도3에서 본다） 그리고 발현 산물을 포함한 용출물을 합병하고 구경이 0.22㎛ 인 여과막으로(Millipore회사）여과한 다음 Lowry법 등 여러가지 방법으로 단백질 정량을 진행한다.

실시예 5: 융합단백질의 구배결합 실험

실시예 3과 유사하게 ELISA방법을 사용해서 이상 구성한 융합단백질과 VEGF와 FGF-2의 결합 능력을 측정한다. 먼저 96개 구멍인 ELISA판에 100μL 20ng/mL VEGF와50ng/mL FGF-2（R&D Systems회사）를 각각 외피한 다음 300μL PBST 세정액으로 다섯번 세정한다음 200μL 신선조제한 차단액(KPL회사) (블로킹 스타크설루선：PBS=1:19) 각 외피구멍을 차단하고 37℃에서 1h 보육하고 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정한다음 100μL 부동한 단백질량을 함유한 각종 융합단백질을 가입하고（단백질 기점은 1000000pM이고5배수 비례로 희석）37℃에서 2h 보육하고 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정한다음 100μL PBS로 1:10000 희석한 항인 IgG Fc-HRP이항（BETHYL회사）을 가입하고 37℃에서 2h 보육하고 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정한다음 100μL 현색액을（KPL회사）가입해서 현색하고 최종 100μL종지액（KPL회사）가입해서 종지 현색하고 ELISA판을 효소 라벨 인스트루먼트에 놓고 450nm파장의 흡광도를 검색하고 신호의 강약에 근거하여 융합단백질이 VEGF와 FGF-2의 구배결합 능력을 확정한다. 12호、15호、25호 융합단백질이 VEGF와 FGF-2의 구배결합 비교는 도 4A에서 나타낸다. 그리고 25호와 FGFR-Fc 융합단백질과（26호로 표시）비교를 진행하고 도4B에서 나타낸다. 그중에 26호 FGFR-Fc 융합단백질은 FGFR 제2Ig 같은 구조영역、FGFR 제3Ig 같은 구조영역과 Fc부위를 포함하고 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 71에 나타나고 뉴클레오티드 서열 코드는 SEQ ID NO: 72에 나타난다. 진술한 26호 융합단백질은 아래와 같은 절차를 통해 취득한다. 실시예1과 유사하게 성인 결장암조직 cDNA를 템플릿으로 PCR 통해 FGFR1단편을 증폭하고（시발체는SEQ ID NO: 73와 SEQ ID NO: 74） 사람 피cDNA를 템플릿으로 PCR통해 IgG1 Fc단편을 증폭하고（시발체는 SEQ ID NO: 43와 SEQ ID NO: 44） 그리고 오버랩PCR를 통해 서로 연결되고 발현 벡터에 클론한다. 본 실시예는 본 발명의 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질의 몰농도가 증가에 따라 융합단백질이 VEGF와 FGF-2를 결합 능력이 더욱 강해짐을 밝히고 450nm파장하에서 신호가 더욱 강해지는 것에 나타나고 융합단백질의 몰농도의 구배희석에 따라 융합단백질이 VEGF와 FGF-2를 결합 능력이 상응하게 약해진다.

실시예 6: 융합단백질의 친화력 실험

친화력 실험을 사용해서 융합단백질이 용액체계중에서 VEGF 또는 FGF2의 친화력을 확정하고 우선 96개 구멍 ELISA판에 100μL 농도가 1.0 ㎍/mL 인 VEGF 또는 100μL 농도가 2.0 ㎍/mL인 FGF-2 포착항체（R&D Systems회사）로 각각 외피한다음 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정한다음 차단액(KPL회사) 각 외피구멍을 차단하고（실시예 을 참조）37℃에서 1h 보육하고 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정하고 사전에 제조하고 부화한 융합단백질과 FGF-2의 혼합액과 희석구배한 표준품을 가입하고（R&D Systems회사） 구체적인 제조방법은 아래와 같다: 12#、15#、25# Fc융합단백질은 각각 800000 pM를 기점으로（PBS에 용해）10배 희석구배하고 각각 20pM VEGF용액과 1：1로 혼합하고 즉 각 단백질의 기점 최종 농도가 400000pM이고 VEGF 최종 농도는 10pM이고 25#、26# Fc융합단백질은 각각 200pM를 기점으로（PBS에 용해）2배 희석구배하고 각각 20pM FGF-2용액과 1：1로 혼합하고 즉 각 단백질의 기점 최종 농도가 200pM이고 FGF-2의 최종 농도는 10Pm이다. 37℃에서 2h 보육하고 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정한다음 100μL농도가 100ng/mL인 VEGF 또는 100μL 농도가 250ng/mL인 FGF-2검측항체（R&D Systems회사）를 가입하고(특이성적으로 유리한 VEGF 또는 FGF-2항체를 검측한다) 37℃에서 2h 보육하고 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정한다음 HRP표기한 스트렙타아비딘（R&D Systems회사）（PBS로 1:200로 희석）을 가입하고 37℃에서 2h 보육하고 300μL PBST세정액으로 다섯번 세정한다음 100μL 현색액（KPL회사）을 가입하고 적당한 시간 현색하고（대략15~30분）최종 100μL 종지액（KPL회사）을 가입하고 종지 현색한다음 ELISA판을 효소 라벨 인스트루먼트에 놓고 450nm파장의 흡광도를 검색하고 따라서 융합단백질과 VEGF또는 FGF-2의 혼합액속에 유리한 VEGF 또는 FGF-2의 상대농도를 확정한다. 12호、15호、25호 융합단백질이 용액체계중에서VEGF 또는 FGF-2와의 친화력 비교는 도 5A와 5B에서 본다. 그리고 25호와 FGFR-Fc 융합단백질과（26호로 표시 비교를 진행하고 도 5C와 5D에서 나타낸다. 그중에 26호 FGFR-Fc 융합단백질은 FGFR제2Ig 같은 구조영역、FGFR제3Ig 같은 구조영역과 Fc부위를 포함한다. 본 실시예는 본 발명에서 구성한 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질이(12#、15#와 25# 같이）용액체계중에서 VEGF와 FGF-2에 대해 높은 친화력을 갖추고 있다는 것을 밝히고 친화력이 농도의 증가에 따라 증가되고 유리한 VEGF와 FGF-2의 량이 융합단백질 농도의 증가에 따라서 줄어드는 것을 표현한다. 본 발명의 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질 12#、15#와 25#는 용액체계중에서 VEGF 또는 FGF-2와의 친화력도표는 도 5에서 본다. 본 실시예는 본 발명에서 구성한 VEGFR-FGFR 융합단백질이 용액체계중에서 VEGF와 FGF-2에 대해 친화력을 갖추고 있다는 것을 밝히고 친화력이 농도의 증가 따라 증가되고 유리한 VEGF와 FGF-2의 량이 줄어드는 것에 표현한다.

실시예 7: 사람 탯줄 정맥 혈관내피세포 분열 억제 실험

사람 탯줄 정맥 혈관내피세포（HUVEC）분열 실험을 사용해서 융합단백질이 혈관내피세포의 분렬을 억제하는 능력을 검증한다. HUVEC완전배양기（AllCells회사）를 사용해서 37℃，5% CO₂ 배양기에서 HUVEC세포（AllCells회사）를 세포 대수증식기까지 배양한다. 펜크레아틴으로 HUVEC 세포를 소화하고 통계하며 매개 구멍에 3000개 HUVEC세포를 96개 구멍판에 접종하고 37℃，1%FBS를 포함한 HUVEC기초배양기（AllCells회사)，5% CO₂배양기에서 하루 밤 배양하고 100μL 1%FBS를 포함한 HUVEC 기초배양기로 희석해서 최종 농도가 20ng/mL인 VEGF 또는 최종 농도가 5ng/mL인 FGF-2（R&D Systems회사）를 각각 가입하고 및 부동한 량의 융합단백질과 FGF-2의 혼합액을 각 100μL 가입하고 각각 융합단백질을 함유한 최종 농도가 40pM이고 1%FBS를 포함한 HUVEC 기초배양기로 10배수 비례 희석하고 FGF-2의 최종 농도가 모두 5 ng/mL이고 계속 3~4일 배양한 다음 배양기를 섭취해서 10% CCK-8시약（DOJINDO회사）을 함유한 배양기를 가입해서 2시간 배양하고 ELISA판을 효소 라벨 인스트루먼트에 놓고 450nm파장의 흡광도를 검색한다. 흡광도의 차이에 근거하여 융합단백질이 VEGF 또는 FGF-2가 유도하는 혈관내피세포 분열을 억제하는 능력을 확정한다. 융합단백질이 VEGF 또는 FGF-2가 유도하는 HUVEC세포 분열에 대한 영향 및 상대억제율은 도 6에서 본다. 본 실시예는 본 발명에서 구성한 VEGFR-FGFR-Fc 융합단백질이（12#、15#호 25# 같이） 세포 수준에서 생물학 활성과 기능을 갖추고 있다는 것을 밝히고 VEGF 또는 FGF-2가 유도한 HUVEC세포 분열 능력을 억제할수 있고 VEGF와 FGF-2를 결합하는 능력을 갖추고 있고 이런 결합 능력은 융합단백질 몰농도의 증가에 따라 증가되고 VEGF 또는 FGF-2가 유도한 HUVEC세포 분열이 억제를 받는 것에 표현한다.

본 발명은 이미 각 구체적인 실시예를 통해 예를 들어서 설명했다. 하지만 본 발명은 각각 구체적인 실시방식에 한정되지 않고 보통 기술인원이 본 발명의 범위내에서 각종 변동 또는 변형을 할수 있고 본 설명서의 각 곳에 언급한 각 기술특징은 본 발명의 정신과 범위를 어긋나지 않은한 서로 결합할수 있다는 것을 본 영역의 보통 기술인원은 애해할수 있다. 이러한 변동 또는 변형은 모두 본 발명의 범위내에 있다.

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gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1320 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1380 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1440 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1500 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1560 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1620 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1680 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1740 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1800 ggtaaatga 1809 <210> 29 <211> 2265 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of fused protein <400> 29 tcaaaattaa aagatcctga actgagttta aaaggcaccc agcacatcat gcaagcaggc 60 cagacactgc atctccaatg caggggggaa gcagcccata aatggtcttt gcctgaaatg 120 gtgagtaagg aaagcgaaag gctgagcata actaaatctg cctgtggaag aaatggcaaa 180 caattctgta gtactttaac cttgaacaca 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Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of fused protein <400> 41 ggtagaccat tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 60 agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120 tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180 ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240 aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300 gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360 tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420 aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480 aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540 acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600 gaaaaaccta accccgtagc tccatattgg acatccccag aaaagatgga aaagaaattg 660 catgcagtgc cggctgccaa gacagtgaag ttcaaatgcc cttccagtgg gaccccaaac 720 cccacactgc gctggttgaa aaatggcaaa gaattcaaac ctgaccacag aattggaggc 780 tacaaggtcc gttatgccac ctggagcatc ataatggact ctgtggtgcc ctctgacaag 840 ggcaactaca cctgcattgt ggagaatgag tacggcagca tcaaccacac ataccagctg 900 gatgtcgtgg agcggtcccc tcaccggccc atcctgcaag cagggttgcc cgccaacaaa 960 acagtggccc tgggtagcaa cgtggagttc atgtgtaagg tgtacagtga cccgcagccg 1020 cacatccagt ggctaaagca catcgaggtg aatgggagca agattggccc agacaacctg 1080 ccttatgtcc agatcttgaa gactgctgga gttaatacca ccgacaaaga gatggaggtg 1140 cttcacttaa gaaatgtctc ctttgaggac gcaggggagt atacgtgctt ggcgggtaac 1200 tctatcggac tctcccatca ctctgcatgg ttgaccgttc tggaagccct ggaagagagg 1260 ccggcagtga tgacctcgcc cctgtacctg gaggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1320 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 1380 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1440 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1500 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1560 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1620 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1680 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1740 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1800 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1860 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1920 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1977 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 42 gttttgtcct ccaggtacag gggcgaggtc 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer <400> 43 ctgtacctgg aggacaaaac tcacacatgc 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer <400> 44 gatatctgca gtcatttacc cggagacagg 30 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 45 atagttccgg aggtagacca ttcgtagaga tg 32 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 46 cctgtgatgc gggtgcgatt tttttcatca gggtaactcc 40 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 47 ctgatgaaaa aaatcgcacc cgcatcacag 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 48 tttttcatca gggtaactcc aggtcatttg 30 <210> 49 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 49 ggagttaccc tgatgaaaaa ccagaaaaga tggaaaagaa at 42 <210> 50 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 50 accgccagag ccacctccgc ctgaaccgcc accacctttt tcatcagggt aactccag 58 <210> 51 <211> 55 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 51 aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc cccagaaaag atggaaaaga aattg 55 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 52 tagttccgga agcaaattaa aagatcctga actgag 36 <210> 53 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 53 atctctacga aaggtctacc tgtatcacta ataaatatat ag 42 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 54 ggtagacctt tcgtagagat gt 22 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 55 aggtttttca tggaccctga c 21 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 56 tcagggtcca tgaaaaacct ccagaaaaga tggaaaagaa attgc 45 <210> 57 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 57 tcagggtcca tgaaaaacct aaaaatcgca cccgcatcac agg 43 <210> 58 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 58 gtcagggtcc atgaaaaacc taggccgtcc ccgaccttgc ctg 43 <210> 59 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 59 cctgtgatgc gggtgcgatt aggtttttca tggaccctga c 41 <210> 60 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer <400> 60 ctccggcctc tatgcttccg taaccagcag cccctc 36 <210> 61 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 61 gaggggctgc tggttacgga agcatagagg ccggag 36 <210> 62 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 62 tcagggtcca tgaaaaacct tcgggcagtg acaccaccta c 41 <210> 63 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 63 tcagggtcca tgaaaaacct aaccccgtag ctccatattg g 41 <210> 64 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 64 ctagctccgg accagaaaag atggaaaaga aattgc 36 <210> 65 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 65 tcaggatctt ttaattttga ctccaggtac aggggcgagg tc 42 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 66 tcaaaattaa aagatcctga actg 24 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer <400> 67 tgggcatgtg tgagttttgt caggtttttc atggaccctg ac 42 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 68 tagttccgga aaaaatcgca cccgcatcac ag 32 <210> 69 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 69 tagttccgga aaacctaacc ccgtagctcc at 32 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer <400> 70 gacaaaactc acacatgccc acc 23 <210> 71 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 26# fused protein <400> 71 Asn Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys 1 5 10 15 Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu 35 40 45 Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr 50 55 60 Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr 65 70 75 80 Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln 85 90 95 Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly 100 105 110 Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met 115 120 125 Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His 130 135 140 Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr Val 145 150 155 160 Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Met Glu 165 170 175 Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr 180 185 190 Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp Leu 195 200 205 Thr Val Leu Glu Ala Leu Glu Glu Arg Pro Ala Val Met Thr Ser Pro 210 215 220 Leu Tyr Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 72 <211> 1374 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 26# fused protein <400> 72 aaacctaacc ccgtagctcc atattggaca tccccagaaa agatggaaaa gaaattgcat 60 gcagtgccgg ctgccaagac agtgaagttc aaatgccctt ccagtgggac cccaaacccc 120 acactgcgct ggttgaaaaa tggcaaagaa ttcaaacctg accacagaat tggaggctac 180 aaggtccgtt atgccacctg gagcatcata atggactctg tggtgccctc tgacaagggc 240 aactacacct gcattgtgga gaatgagtac ggcagcatca accacacata ccagctggat 300 gtcgtggagc ggtcccctca ccggcccatc ctgcaagcag ggttgcccgc caacaaaaca 360 gtggccctgg gtagcaacgt ggagttcatg tgtaaggtgt acagtgaccc gcagccgcac 420 atccagtggc taaagcacat cgaggtgaat gggagcaaga ttggcccaga caacctgcct 480 tatgtccaga tcttgaagac tgctggagtt aataccaccg acaaagagat ggaggtgctt 540 cacttaagaa atgtctcctt tgaggacgca ggggagtata cgtgcttggc gggtaactct 600 atcggactct cccatcactc tgcatggttg accgttctgg aagccctgga agagaggccg 660 gcagtgatga cctcgcccct gtacctggag gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 720 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 840 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1020 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1080 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1260 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 1374 <210> 73 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 26# Fw <400> 73 tagttccgga aaacctaacc ccgtagctcc at 32 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 26# Rev <400> 74 gttttgtcct ccaggtacag gggcgaggtc 30 <210> 75 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 9#-VEGFR1D2 downstream primer <400> 75 catgagacgg actcagaacc acatctatga ttgtattggt ttg 43 <210> 76 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 9#-VEGFR2D3 upstream primer <400> 76 caaaccaata caatcataga tgtggttctg agtccgtctc atg 43

Claims (11)

1. VEGFR의 세포외 영역으로부터 유래된 적어도 하나의 단편, 및 FGFR의 세포외 영역으로부터 유래된 적어도 하나의 단편을 포함하는, 혈관형성을 억제하는 융합단백질로서,
   상기 VEGFR의 세포외 영역으로부터 유래된 단편은, VEGFR1의 제1 Ig 같은 구조영역; VEGFR1의 제2 Ig 같은 구조영역; 및 VEGFR2의 제3 Ig 같은 구조영역;으로 이루어지고,
   상기 FGFR의 세포외 영역으로부터 유래된 단편은, FGFR의 Ig 같은 구조영역의 중간기능성서열구로부터 발원된 부분; FGFR의 제2 Ig 같은 구조영역; 및 FGFR의 제3 Ig 같은 구조영역;으로 이루어지며, 여기서 상기 FGFR의 Ig 같은 구조영역의 중간기능성서열구는 FGFR 단백질의 제1 Ig 같은 구조영역 및 제2 Ig 같은 구조영역 사이의 서열이고,
   상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 부위를 더 포함하고,
   상기 VEGFR1의 제1 Ig 같은 구조영역은, SEQ ID:2의 제32위부터 제123위까지의 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 VEGFR1의 제2 Ig 같은 구조영역은, SEQ ID:2의 제151위부터 제214위까지의 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 VEGFR2의 제3 Ig 같은 구조영역은, SEQ ID NO:3의 제224위부터 제320위까지의 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 FGFR의 Ig 같은 구조영역의 중간기능성서열구로부터 발원된 부분은, SEQ ID NO:1의 제145위 내지 제162위의 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 FGFR의 제2 Ig 같은 구조영역은, SEQ ID NO:1의 제163위부터 제247위까지의 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 FGFR의 제3 Ig 같은 구조영역은, SEQ ID NO:1의 제270위부터 제359위까지의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 FGFR의 Ig 같은 구조영역의 중간기능성서열구로부터 발원된 부분은 산성박스를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 면역글로불린 Fc 부위는, SEQ ID NO:7의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:8의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
4. 혈관형성을 억제하는 융합단백질로서,
   SEQ ID NO:22에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:39에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 융합단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
6. 청구항 5에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
7. 청구항 6에 따른 벡터를 포함하는, 분리된 재조합 숙주 세포.
8. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 융합단백질; 및
   약학적으로 허용가능한 담체;를 포함하고,
   포유동물의 혈관형성을 억제하는 용도, 또는 종양 또는 안과혈관형성성질병의 치료 또는 예방 용도로서, 상기 종양은 고형종양이고, 상기 안과혈관형성성질병은 연령과 관계되는 황반변성 및 당뇨변성 망막병변 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
9. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 융합단백질로서, 포유동물의 혈관형성을 억제하는 용도, 또는 종양 또는 안과혈관형성성질병의 치료 또는 예방 용도로서, 상기 종양은 고형종양이고, 상기 안과혈관형성성질병은 연령과 관계되는 황반변성 및 당뇨변성 망막병변 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
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