JP2016106128A - 血管新生誘導因子に拮抗する融合蛋白質およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
VEGFR(例えば、VEGFR1もしくはVEGFR2)の第一Ig様ドメインまたはその一部、
VEGFR(例えば、VEGFR1もしくはVEGFR2)の第二Ig様ドメインまたはその一部、
VEGFR(例えば、VEGFR1もしくはVEGFR2)の第三Ig様ドメインまたはその一部、
VEGFR(例えば、VEGFR1もしくはVEGFR2)の第四Ig様ドメインまたはその一部、
VEGFR(例えば、VEGFR1もしくはVEGFR2)の第五Ig様ドメインまたはその一部、
VEGFR(例えば、VEGFR1もしくはVEGFR2)の第六Ig様ドメインまたはその一部、および
VEGFR(例えば、VEGFR1もしくはVEGFR2)の第七Ig様ドメインまたはその一部。
FGFR(例えば、FGFR1)の第一Ig様ドメインまたはその一部、
FGFR(例えばFGFR1)のIg様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分、
FGFR(例えばFGFR1)の第二Ig様ドメインまたはその一部、および
FGFR(例えばFGFR1)の第三Ig様ドメインまたはその一部。
特に、本発明の融合蛋白質においては、ドメインおよび/またはフラグメントの間は直接連結されている、および/またはリンカーで連結されている。一つの具体的な実施方案においては、本発明の融合蛋白質はFGFR(例えば、FGFR1)Ig様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分を含み、好ましくは、前記FGFR(例えば、FGFR1)Ig様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分は酸性ボックス(acidic box,AB)を含まない。一つの具体的な実施方案において、前記中間機能性配列領域由来の部分は、配列番号1の134〜162位、145〜162位または151〜162位のアミノ酸から選択される配列を有する。
特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語は、当該技術分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。本分野の定義と用語に関して、当業者は具体的にはCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel)を参照できる。アミノ酸残基の略語は、本技術分野で用いられている、20個の常L−アミノ酸の一つを表す三文字コードおよび/または一文字コードで表される。
本発明の融合蛋白質は単独でも使用できるが、好ましくは医薬組成物として用いられ。該医薬組成物は通常、意図された投与計画方式に沿って選択された適切な医薬賦形剤、希釈剤またはキャリアを含む。融合蛋白質は、任意の適切な方法によって、必要とする患者に投与することができる。正確な投与量は、当該融合蛋白質の正確な性質など数多くの因子により決定される。
VEGFR受容体フラグメントとFGF受容体フラグメントは対応する受容体のcDNAをPCRで増幅させて得られる。IgG1のFcフラグメントはヒトIgG1のcDNAをPCRで増幅して得られる。PCRプライマーを設計する際、異なるフラグメント間には連結配列を挿入し、これらの異なるフラグメントを最後にオーバーラップPCRで連結させて、それぞれの融合蛋白質のリーディングフレームを形成する。同時に、cDNAの両端にエンドヌクレアーゼBspEIおよびPstIのサイトを付加させる。それぞれの融合蛋白質のcDNAはエンドヌクレアーゼBspEIおよびPstIで切断した後、発現プラスミドにクローニングする。クローニングしたプラスミドはエンドヌクレアーゼ消化、電気泳動、そして最後はDNAシークエンシングで確認される。
2#融合蛋白質:
2#−VEGFR1の上流プライマー:
ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG
2# −VEGFR1の下流プライマー:
CCTGTGATGCGGGTGCGATTTTTTTCATCAGGGTAACTCC
2# −FGFR1の上流プライマー:
CTGATGAAAAAAATCGCACCCGCATCACAG
4# VEGFR1の上流プライマーは2#:2#−VEGFR1の上流プライマーと同じ。
4#−VEGFR1の下流プライマー:
TTTTTCATCAGGGTAACTCCAGGTCATTTG
4# FGFR1の上流プライマー:
GGAGTTACCCTGATGAAAAACCAGAAAAGATGGAAAAGAAAT
4# FGFR1の下流プライマーは2#:2#−FGFR1の下流プライマーと同じ。
7# VEGFR1の上流プライマーは2#:2#−VEGFR1の上流プライマーと同じ。
7# VEGFR1の下流プライマー:
ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCACCACCTTTTTCATCAGGGTAACTCCAG
7#FGFR1の上流プライマー:
AGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCCCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTG
7# FGFR1の下流プライマーは2#:2#−FGFR1の下流プライマーと同じ。
9#の融合蛋白質はVEGFR1D1、VEGFR1D2、VEGFR2D3、FGFR、およびFcの五つのフラグメントを含む。
以下のプライマーを用いて、pBLAST45−hFLT1s7cDNAを用いてVEGFR1D1を増幅した:
9#−VEGFR1D1の上流プライマー:
TAGTTCCGGAAGCAAATTAAAAGATCCTGAACTGAG
9#−VEGFR1D1の下流プライマー:
ATCTCTACGAAAGGTCTACCTGTATCACTAATAAATATATAG
9#−VEGFR1D2R2D3の上流プライマー:GGTAGACCTTTCGTAGAGATGT
9#−VEGFR1D2の下流プライマー:
CATGAGACGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGTTTG
9#−VEGFR2D3の上流プライマー:
CAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG
9#−VEGFR1D2R2D3の下流プライマー:AGGTTTTTCATGGACCCTGAC
9#FGFR1の上流プライマー:
TCAGGGTCCATGAAAAACCTCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGC
10#VEGFR1フラグメントドメイン配列のPCRプライマーは9#と同じ
10#−FGFR1の上流プライマー:
TCAGGGTCCATGAAAAACCTAAAAATCGCACCCGCATCACAGG
16#VEGFR1D1の上流プライマーは9#−VEGFR1D1の上流プライマーと同じ。
16#VR1D2R2D3Rの下流プライマーは9#−VR1D2R2D3R下流プライマーと同じ。
16#FGFR1の上流プライマー:
GTCAGGGTCCATGAAAAACCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTG
20#−VEGFR1D1の上流プライマーは9#−VEGFR1D1の上流プライマーと同じ。
20#−VR1D2R2D3Rの下流プライマーは9#− VR1D2R2D3Rの下流プライマーと同じ。
20#−FGFR1の上流プライマー:
CCTGTGATGCGGGTGCGATTAGGTTTTTCATGGACCCTGAC
21#は10#をテンプレートとして用い,下記プライマーを用いて10#FGFR1D1h中の塩基の一つをCysからSerに変えた:
21#−mutF:
CTCCGGCCTCTATGCTTCCGTAACCAGCAGCCCCTC
21#−mutR:
GAGGGGCTGCTGGTTACGGAAGCATAGAGGCCGGAG
24#VEGFR1D1の上流プライマーは9#−VEGFR1D1の上流プライマーと同じ。
24#VR1D2R2D3Rの下流プライマーは9#−VR1D2R2D3Rの下流プライマーと同じ。
24#FGFR1の上流プライマー:
TCAGGGTCCATGAAAAACCTTCGGGCAGTGACACCACCTAC
25#VEGFR1D1の上流プライマーは9#−VEGFR1D1の上流プライマーと同じ。
25#VR1D2R2D3Rの下流プライマーは9#−VR1D2R2D3Rのプライマーと同じ。
25#FGFR1の上流プライマー:
TCAGGGTCCATGAAAAACCTAACCCCGTAGCTCCATATTGG
28#は、25#をテンプレートとして、2#−VEGFR1の上流プライマーと同じ上流プライマーおよびIgG1 Fcの下流プライマーと同じ下流プライマーを用いてPCRを行った。
11#−FGFR1の上流プライマー:
CTAGCTCCGGACCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGC
11#−FGFR1の下流プライマー:
TCAGGATCTTTTAATTTTGACTCCAGGTACAGGGGCGAGGTC
11#−VEGFR1D1の上流プライマー:TCAAAATTAAAAGATCCTGAACTG
11#−VEGFR1D1の下流プライマー:9#−VEGFR1D1の下流プライマーと同じ:
11#VEGFR1D2R2D3の上流プライマーは9#−VR1D2R2D3の上流プライマーと同じ。
11#VEGFR1D2D3の下流プライマー:
TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGTTTTTCATGGACCCTGAC
14#−FGFR1の上流プライマー:
TAGTTCCGGAAAAAATCGCACCCGCATCACAG
14#FGFR1の下流プライマーは11#−VEGFR1D1の下流プライマーと同じ。
14#VEGFR1D1の上流プライマーは11#−VEGFR1D1の上流プライマーと同じ。
14#VEGFR1D1の下流プライマーは9#−VEGFR1D1の下流プライマーと同じ。
14#VEGFR1D2R2D3の上流プライマーは9#−VEGFR1D2R2D3の上流プライマーと同じ。
14#VEGFR1D2R2D3の下流プライマーは11#−VEGFR1D2R2D3の下流プライマーと同じ。
27#は、14#をテンプレートとして、27#−FGFR1の上流プライマー(TAGTTCCGGAAAACCTAACCCCGTAGCTCCAT)およびIgG1 Fc下流プライマーと同じ下流プライマーを用いてPCRを行う:
12#融合蛋白質は、VEGFR1の細胞外ドメインの部分、VEGFR2の細胞外ドメインの部分およびIgG1のFcを含む。用いられたプライマーを以下に示す:
12#VEGFR2の下流プライマーは11#VEGFR1D2D3の下流プライマーと同じ。
Fcの上流プライマー1:FcFor1:GACAAAACTCACACATGCCCACC
Fcの下流プライマー:前記のIgG1 Fc下流プライマーと同じ。
15#の上流プライマーは2#−VEGFR1の上流プライマーと同じ:
ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG
15#VEGFR2の下流プライマーは11#VEGFR1D2D3の下流プライマーと同じ
Fc下流プライマー:前述のIgG1 Fcの下流プライマーと同じ。
本発明の融合蛋白質は、本分野で常用されている技術により発現および精製できる。Qiagenのプラスミド精製キット(MAX)を用いて、前記融合蛋白質プラスミドに対応するDNAを精製し、紫外可視分光光度法でプラスミドDNAの濃度を確認した、FUGENE6リボソーム(Roche)を用いてプラスミドをCHO細胞にトランスフェクトした。具体的な形質転換方法については製品の取扱説明書を参照した。求められる蛋白質発現量に基づき、本研究では二種類の方法を用いて蛋白質発現を行った:第一の方法は一過性の発現であり、通常、トランスフェクトした48〜72時間後に融合蛋白質を含む培養液上清を収穫し、ヒトIgG ELISAで融合蛋白質の相対含有量を確認し、これにより迅速かつ効率的に融合蛋白質が得られる;第二の方法では、組み換え蛋白質薬物の発現を用いて、常用のDHFR欠陥型CHO細胞発現システムを生産し、安定発現細胞系を構築する。その基本的なプロセスは、細胞のトランスフェクション、安定にトランスフェクトした細胞の選択、クローンの選択、ストレスによる増幅、培地とプロセスの最適化などを含み、最終的に無血清培地でのCHO工程細胞株の大規模懸濁培養を実現する。培養産物を回収し、プロテインAアフィ二ティーカラムを用いて融合蛋白質を精製した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いて、精製した蛋白質を分析した。次に、必要な発現産物を含む溶出液を全て合わせて、0.22μm口径のフィルターで濾過し、Lowry法など種々の方法で蛋白質定量を行った。本研究のCHO細胞培養の体積は10リットルのバイオリアクターの規模に達し、精製で得られた融合蛋白質は動物試験に必要な蛋白量を満足した。また、将来的に、この精製方法を拡大するための基礎を築いた。
CHO細胞により発現された融合蛋白質を得た後、本研究においては蛋白質レベルで融合蛋白質のVEGFRおよびFGFへの結合能について評価した。本研究では、結合実験および親和力実験を検証のために行った。結合実験の手順は:まず、96穴ELISAプレートにVEGFおよびFGF−2をコーティングし、BSAを用いてコーティングされたウェルをブロッキングし、同濃度の各融合蛋白質を加えた。洗浄後、抗ヒトIgG Fc−HRP二次抗体をさらに加え、現像し、現像を停止し、ELISAリーダーで450nmにおける吸光度を測定し、信号の強さによって、VEGFRおよびFGF−2への結合能を有する融合蛋白質をスクリーニングした。親和力実験は溶液系における融合蛋白質のVEGFまたはFGF−2への親和力を決定することを目的として行われた。まず、96穴ELISAプレートにVEGFまたはFGF−2の捕捉抗体を吸着させ、ウェルをBSAでブロッキングした。次に、予め調製またはインキュベートした融合蛋白質とVEGFまたはFGF−2との混合液および希釈勾配標準品を添加し、インキュベートした。次に、HPRラベルした検出抗体(遊離VEGFまたはFGF−2を特異的に検出する抗体2を使用)を添加し、現像し、現像停止し、ELISAリーダーで450nmにおける吸光度を測定し、融合蛋白質とVEGFまたはFGF−2との混合液における遊離のVEGFまたはFGF−2の相対濃度を検出した。以上の実験によって、VEGFおよびFGF−2に対する双遮断作用を有する融合蛋白質がスクリーニングされた。
融合蛋白質のVEGFおよびFGF−2への結合能を蛋白レベルで確認した後、本研究では融合蛋白質の血管新生に対する抑制作用を細胞レベルで検証した。本研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)分裂試験とHUVEC細胞遊走試験を用いて、融合蛋白質が血管内皮細胞の分裂力と遊走力を抑制する能力を検証した。融合蛋白質がHUVEC細胞の分裂を抑制する能力は、HUVEC細胞分裂試験によって測定できる。この実験では、まず、96穴プレートにウェル当たり3000個のHUVEC細胞を播種し、37℃、5%のCO2のインキュベーターで培養し、VEGFまたはFGF−2および種々の濃度の融合蛋白質とVEGFRもしくはFGF−2との混合液をそれぞれ加え、3〜4日培養した。次に、10%のCCK−8を添加し、2時間培養した後に、ELISAプレート上で450nmの吸光度を測定した。吸光度の差異によって、当該融合蛋白質が有する、VEGFまたはFGF−2に誘導される血管内皮細胞の分裂を抑制する能力を評価し、VEGFまたはFGF−2抑制についての融合蛋白質の半数効果濃度が得られた。融合蛋白質がHUVEC細胞の遊走を抑制する能力をHUVEC細胞遊走試験により測定した。この、実験では、まず、上室に5000個のHUVEC細胞と種々の濃度の融合蛋白質とを接種し、下室にVEGFまたはFGF−2を含有する培養液を600μL添加し、37℃、5%CO2のインキュベーターで20〜24時間培養し、上室の膜の正面にある細胞を除去し、膜の背面の細胞を固定、染色し、PBSで洗浄した。そして、倒立顕微鏡で観察、計数した。膜の背面のHUVEC細胞数を計数することによって、VEGFまたはFGF−2刺激により誘導されたHUVEC細胞の遊走状況が分かり、培養液に種々の濃度の融合蛋白質を添加することによって、融合蛋白質が血管内皮細胞の遊走を抑制する能力を検証できた。以上の実験によって、本研究で構築される新規融合蛋白質がVEGFおよびFGF−2によって誘導される血管内皮細胞の分裂と遊走を抑制する能力を検証した。このことは、次の動物実験のために基礎を築いた。
蛋白質レベルと細胞レベルでの実験により、本研究の新規融合蛋白質がVEGFRおよびFGF−2信号を遮断する作用を証明した後、本研究では動物腫瘍モデルでその抗腫瘍力を検証した。本研究では、血管新生と腫瘍の治療薬研究で一般的なモデル、例えば、LLCマウス肺癌由来腫瘍細胞、U87悪性ヒト神経膠芽腫細胞、B16黒色腫など、を用いて、融合蛋白質の抗血管新生および抗腫瘍効果を検証した。動物試験では、一般な対象群の他に、同類薬物対象群、例えばVEGF−Trap、FP−1039、も含み、抗腫瘍力の比較性データを得た。実験中、100μLの適切な数の腫瘍細胞を皮下注射でC57マウスの背中後ろの側面に注入し、ノギスで毎週二回、腫瘍の体積を測定した。腫瘍が約200立方ミリメートルに成長したら、種々の濃度の融合蛋白質は皮下注射し、2〜3週後にマウスを致死させた。ノギスで腫瘍の体積を測定し、腫瘍の大きさによって融合蛋白質の抗腫瘍効果を検証した。さらに、免疫組織化学などの手法を用いて各種腫瘍組織を分析し、血管新生の調節機構を探索した。
市販のcDNA(PCR Ready First Strand cDNA, 成人結腸癌常組織由来、BioChain社)をFGFR1フラグメントのテンプレートとし、市販のプラスミドpBLAST45−hFLT1s7cDNA (InvivoGen社)をVEGFR1フラグメントのテンプレートとし、市販のプラスミドpBLAST45−hFLT1s7(InvivoGen社)をVEGFR2フラグメントのテンプレートとした。ヒト血液RNA抽出キット(QIAGEN社)を用いて健康人血液からトータルRNAを抽出した。逆転写キット(Promega社)の取扱説明を参照して、M−MLV逆転写酵素(Promega社)を用いてRT−PCRを行い、RNAをcDNAに逆転写し、得られたcDNAをIgG1のFcフラグメントのテンプレートとした。逆転写キットの取扱説明によって、RT−PCRを行った、具体的な手順は:Oligo dT、dNTP、トータルRNAおよびDEPC H2Oを均一に混合し、70℃で10分間反応させ、氷上に5分間置いて、RNase抑制剤、M−MLV逆転写酵素および反応緩衝液を添加し、42℃で1時間反応させ、次に70℃で15分間反応させ、得られたcDNAをテンプレートとして用いた。
MAXプラスミド抽出キット(Qiagen社)を用いて、各融合蛋白質プラスミドのDNAを精製した。紫外分光光度法によってプラスミドDNAの濃度を確認した、組換プラスミド1μgおよび6μLリポソーム(FuGENE 6 Transfection Reagent, Roche社)を100μLの新鮮IMDM培養液(GIBCO社)に均一に混合し、15分間放置した。次に、これを3×105/mLの細胞密度で6穴プレートに播種された後に一晩培養したCHO細胞(ATCC)に加えた。88%IMDM、10%FBS、1%HTおよび1%グルタミン(GIBCO社商品)を含む細胞完全培養液を用い、37℃、5%CO2のインキュベーターで48時間培養した後、上清液を収集した。ヒトIgG ELISA蛋白質定量キット(BETHYL社)を用いて、CHO細胞により発現および分泌された融合蛋白質の相対含有量を決定した。具体的な手順としては:アフィニティー精製された濃度10μg/mLの抗ヒトIgG−Fc蛋白質を100μL、96穴ELISAプレート(IMMULON社)にコーティングし、一晩経過させた。300μLのPBST洗浄液を用いて五回洗浄した後、コーティングされた各ウェルを200μLの新たに調製したブロッキング溶液(ブロッキング原液:PBS=1:19)でブロッキングし、37℃で1時間インキュベートした。300μLのPBST洗浄液で5回洗浄し、そして各ウェルに、標準としての勾配希釈された(初期濃度は200ng/mL,PBSで2倍ずつ希釈)IgG100μL、および勾配希釈された各融合蛋白質の培養上清(各培養上清の濃度からスタートして、PBSで5倍ずつ希釈)100μLを加え、37℃で2時間インキュベートした。300μLのPBST洗浄液を用いて五回洗浄した後、PBSで1:10000希釈された抗ヒトIgG Fc−HRP二次抗体(BETHYL社)100μLを添加し、37℃で1時間インキュベートした。300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した後、100μLの現像液(KPL社)で現像し、最後に100μL停止液(KPL社)を添加して、現像を停止させた。そして、ELISAプレートの波長450nmにおける吸光度をELISAリーダーを用いて測定した。標準曲線により、種々の融合蛋白質の濃度が決定された。
ELISA法を用いて、上記で構築された融合蛋白質のVEGFおよびFGF−2への結合能を測定した。まず、96穴ELISAプレート(IMMUON社)に、20ng/mLのVEGF(R&D Systems社)および50ng/mLのFGF−2(R&D Systems社)を含有する溶液(100ng/mLのヘパリン(Sigma社)含有)100μLを別々にコーティングし、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄し、200μLの新たに調製したブロッキング液(KPL社)(ブロッキング原液:PBS=1:19)を用いてコーティングされたマイクロウェルをブロッキングし、37℃で1時間インキュベートし、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄し、20ng/mLの各融合蛋白質(PBSに溶解、pH=7.2)を100μL添加し、37℃で2時間インキュベートし、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した。そして、PBSで1:10000希釈された抗ヒトIgG Fc−HRP二次抗体(BETHYL社)100μLを添加した。37℃で1時間インキュベートし、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した後、100μLの現像液(KPL社)で現像し、最後に100μLの停止液(KPL社)を添加して、現像を停止させた。そして、ELISAプレートの波長450nmでの吸光度をELISAリーダーで測定した。融合蛋白質のVEGFまたはFGF−2への結合能が強ければ、吸光度が高く、信号も強い。信号の強さに基づいて、25#および28#の融合蛋白質はVEGFおよびFGF−2の両者に対し高い結合能を有することが分かった。融合蛋白質のVEGFおよびFGF−2への結合の比較を図2に示した。
高い結合能を有する25#融合蛋白質ならびにコントロールとしての12#および15#融合蛋白質の組み換えプラスミドをリボソーム(Roche社)により、DHFR欠陥型CHO細胞(ATCC)にトランスフェクトした。具体的には、組み換えプラスミド5μgおよび30μLのリボソーム(FuGENE 6 Transfection Reagent, Roche社)を100μLの新鮮なIMDM培養液(GIBCO社)に均一に混合し、15分放置した。そして、これを10cm細胞培養皿(Corning社)に3×105/mLの細胞密度で播種された後に一晩培養したDHFR欠陥型CHO細胞(ATCC)に添加し、10%FBS、1%HTおよび1%グルタミンをIMDM培地(GIBCO社)に含む細胞完全培養液を用いて37℃、5%CO2のインキュベーターで2〜3日培養した。次に、トリプシン(GIBCO社)で細胞を消化し、30mLの無血清302培地(SAFC社)を入れたフラスコに3×105/mLの細胞密度で接種し、100回転/分、37℃、5%CO2のインキュベーターで106/mLの細胞密度まで選択的に培養した。3000個の細胞を10cm細胞培養皿(Corning)に接種(培養液は10%のFBSおよび1%グルタミンをIMDM培地中に含む)し、37℃、5%CO2のインキュベーターで培養してモノクローンを形成した。これらのモノクローンと取り、96穴プレート(Corning社)で培養した、ヒトIgG ELISA蛋白定量キット(BETHYL社)を用いて、それぞれのモノクローンが発現および分泌した融合蛋白質の相対含有量を確認した。この際の具体的な条件と手順は、実施例2における融合蛋白質の相対含有量の測定の場合と同じである、発現量が最も高い融合蛋白質をスクリーニングし、6穴プレートに移して約70%コンフルエンスまで培養し、トリプシンで細胞を消化し、10cm培養皿に移した。種々の濃度(10nM,20nM,50nM,100nM,200nMおよび500nM)のメトトレキサート(methotrexate, MTX)(Sigma社)を添加することで、徐々にストレスを増加させた。ストレスを増幅させた後、トリプシンで細胞を消化し、3×105/mLの細胞濃度でフラスコに播種した。単一細胞の発現レベルを測定し、特定の融合蛋白質を発現する遺伝的操作CHO細胞株が得られた。最終的に、遺伝的操作CHO細胞株は、pH7.0の無血清302培地(SAFC社)で37℃、5%CO2、40%溶存酸素および80回転/分で大規模懸濁培養(培養体積は10Lに達する)した。遠心で培養産物を回収し、上清を取って0.45μmフィルター(Millipore社)で濾過した後、ProteinAアフィニティークロマトグラフィー(GE社)の取扱説明書に従って、アフィニティークロマトグラフィーを行った。具体的には、まず、PBS緩衝液(pH:7.0)でProteinA親和カラムを平衡化し、そして上清をカラムにロードして、PBS緩衝液で平衡化し、最後に、クエン酸緩衝液(pH:3.0)で溶出して、溶出液を回収し、0.45μmフィルターで濾過した。S/D(0.3%リン酸トリプチル/1%Tween80)を添加し24℃で6時間放置してウィルスを不活性化した。そして、分子篩を用いて、目的蛋白質をさらに精製した。まず、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーの溶出液を透析袋(Millipore社)に入れて、PBS緩衝液で透析した。10KD限外ろ過カップ(Millipora社)で蛋白質を濃縮し、限外ろ過カップにより濃縮された試料をPBS緩衝液で平衡化した分子篩クロマトクラムSuperdex 200(CE社)にロードし、そしてPBS緩衝液で溶出し、溶出ピークを回収した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いて、精製蛋白質を分析した(図3)。次に、必要な発現産物を含有する溶出液を合わせ、0.22μmのフィルター(Millipore社)で濾過した後、Lowry法など種々の方法で蛋白質の定量を行った。
実施例3と同様に、ELISA法を用いて、上記で構築した融合蛋白質のVEGFおよびFGF−2への結合能を検出した。まず、96穴ELISAプレートに、20ng/mLのVEGFおよび50ng/mLのFGF−2(R&D Systems社)を含有する溶液を100μLコーティングし、そして300μLのPBST洗浄液で五回洗浄し、200μLの新たに調製されたブロッキング液(KPL社)(ブロッキング原液:PBS=1:19)を用いてコーティングされた各ウェルをブロッキングし、37℃で1時間インキュベートした。300μLのPBST洗浄液で五回洗浄し、100μLの種々の融合蛋白質を種々の濃度で含有する(蛋白質の初期濃度は1000000pMであり、1:5の比で希釈)を加え、37℃で2時間インキュベートした。300μLのPBST洗浄液で5回洗浄し、PBSで1:10000に希釈した抗ヒトIgG Fc−HPR二次抗体(BETHYL社)を100μL添加し、37℃で2時間インキュベートした。300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した後、100μLの現像液(KPL社)を添加して現像した。最後に、100μLの停止液(KPL社)を添加し、現像を停止させた。そして、ELISAプレートの波長450nmでの吸光度をELISAリーダーで測定した。信号の強さによって、融合蛋白質のVEGFおよびFGF−2への勾配結合能を確認した。12#、15#および25#の融合蛋白質のVEGFおよびFGF−2への勾配結合能の比較を図4Aに示す。そして、25#の融合蛋白質はFGFR−Fc融合蛋白質(26#と表記)とも比較し、図4Bに示した。ここで、26#FGFR−Fc融合蛋白質は、FGFRの第二Ig様ドメイン、FGFRの第三Ig様ドメインおよびFc領域を含み、そのアミノ酸配列は配列番号71に示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号72に示されている。前記26#融合蛋白質は次のようにして得られる:実施例1と同様に、ヒト結腸癌常組織由来cDNAをテンプレートとして、PCRによってFGFR1フラグメントを増幅し(プライマーは配列番号73と配列番号74)、ヒト血液cDNAをテンプレートとして、PCRによってIgG1のFcフラグメントを増幅した(プライマーは配列番号43と配列番号44)。これらをオーバーラップPCRで連結し、発現ベクターにクローニングした。本実施例では、450nmにおける信号がより強いことから分かるように、VEGFR−FGFR−Fc融合蛋白質モル濃度の増加に伴い、VEGFおよびFGF−2への結合能は増大し、融合蛋白質モル濃度の勾配希釈に伴い、VEGFおよびFGF−2への結合能は弱くなることが示された。
親和性実験により、溶液系における融合蛋白質のVEGFまたはFGF−2への親和力を決定した。まず、96穴ELISAプレートに1.0μg/mLのVEGFを100μLまたは2.0μg/mLのFGF−2キャプチャー抗体(R&D Systems社)を100μLコーティングした。次に、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した、そしてブロッキング液(KPL社)を用いて、コーティングされた各ウェルをブロッキングし(実施例3を参照)、37℃で1時間インキュベートし、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した。次に、予め調製およびインキュベートした融合蛋白質とFGF−2との混合液および勾配希釈の標準品を添加した。具体的な調整方法としては:12#、15#および25#のFc融合蛋白質の開始濃度は、800000pMとし(PBSに溶解)、10倍ずつの希釈勾配系列を作り、20pMのVEGF溶液と1:1混合した。つまり、それぞれの蛋白質の開始濃度は400000pMであり、VEGFの終濃度は10pMであった。25#および26#のFc融合蛋白質の開始濃度は200pMとし(PBSに溶解)、2倍ずつの希釈勾配系列を作り、各融合蛋白質は20pMのFGF−2溶液と1:1で混合させた。つまり、蛋白質の開始濃度は200pMであり、FGF−2の終濃度は10pMであった。プレートを37℃で2時間インキュベートし、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した。次に、100ng/mLのVEGF検出抗体100μLまたは250ng/mLのFGF−2検出抗体100μL(R&D System社)(特異的に遊離のVEGFまたはFGF−2抗体を検出できる)を添加した。プレートを、37℃で2時間インキュベートし、300μLのPBST洗浄液で五回洗浄した。次に、HRPラベルしたストレプトアビジン(R&Dシステムズ社)を添加した(PBSで1:200希釈)。プレートを37℃で2時間インキュベートし、300μLのPBST洗浄液で5回洗浄し、そしてウェルに100μL現像液(KPL社)を添加して適切な時間(約15〜30分)現像した。最後に、100μLの停止液(KPL社)で現像を停止し、ELISAプレートの波長450nmにおける吸光度をELISAリーダーで測定した。融合蛋白質とVEGFまたはFGF−2との混合液中における遊離のVEGFまたはFGF−2の相対濃度を決定した。溶液系における12#、15#および25#の融合蛋白質のVEGFまたはFGF−2への親和力を比較し、5Aおよび5Bに示した。そして、25#融合蛋白質はFGFR−Fc融合蛋白質(26#と表記)とも比較し、5Cおよび5Dに示した。ここで、26#のFGFR−Fc融合蛋白質は、FGFRの第二Ig様ドメイン、FGFRの第三Ig様ドメインおよびFc領域を含む。本実施例から、本発明で構築されたVEGFR−FGFR−Fc融合蛋白質(例えば、12#、15#、25#)は溶液系においてVEGFおよびFGF−2に対し高い親和力を有することが示された。遊離のVEGFおよびFGF−2の量が融合蛋白質濃度の増加に伴い少なくなることから分かるように、親和力は濃度の上昇に伴って増加する。溶液系における本発明のVEGFR−FGFR−Fc融合蛋白質12#、15#および25#の、VEGFまたはFGF−2への親和力を図5に示す。本実施例から分かるように、本発明で構築されたVEGFR−FGFR融合蛋白質は、溶液系においてVEGFおよびFGF−2への親和力を有する。遊離のVEGFおよびFGF−2の量が少なくなることから分かるように、濃度の上昇に伴い親和力は増加する。
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)分裂試験を用いて、融合蛋白質が血管内泌細胞の分裂を抑制する能力を調べた。HUVEC完全培地(AllCells社)を用いて、HUVEC細胞(AllCells社)を37℃、5%CO2のインキュベーターで対数増殖期まで培養した。トリプシンによる消化の後に、HUVECをカウントした、ウェル当たり3000個のHUVEC細胞を、96穴プレート中の1%FBS含有HUVEC基本培地(AlleCells社)に接種し、37℃、5%CO2のインキュベーターで一晩培養した。100μLの1%FBSを含有するHUVEC基本培地で希釈した100μLのVEGF(終濃度は20ng/mL、R&D System社)または100μLのFGF−2(終濃度は5ng/mL、R&D System社)、および種々の量の融合蛋白質およびFGF−2との混合液100μL(融合蛋白質の終濃度は40pM、1%FBS含有HUVEC基本培地で10倍希釈、FGF−2の終濃度は5ng/mL)を添加し、さらに3〜4日培養した。次に、培地を取って、10%CCK−8試薬(DOJINDO社)を含有する培地を加えて2時間培養し、ELISAプレートの波長450nmでの吸光度をELISAリーダーで測定した。吸光度の差異によって、VEGFまたはFGF−2に誘導されるHUVEC細胞分裂を抑制する融合蛋白質の能力を決定した。融合蛋白質が、VEGFまたはFGF−2に誘導されるHUVEC細胞分裂を抑制する効果および相対的抑制率を図6に示した。本実施例から分かるように、本発明で構築されたVEGFR−FGFR−Fc融合蛋白質(例えば、12#、15#および25#)は、細胞レベルで生物学的活性および機能を有し、VEGFまたはFGF−2により誘導されるHUVEC細胞分裂を抑制でき、VEGFおよびFGF−2への結合能を有する。VEGFまたはFGF−2により誘導されるHUVEC細胞分裂の抑制から分かるように、前記結合能は融合蛋白質のモル濃度の増加に伴い増加する。
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Claims (31)
- VEGFRの細胞外ドメイン由来部分を少なくとも1つと、FGFRの細胞外ドメイン由来部分を少なくとも1つ含み、
前記VEGFRの細胞外ドメイン由来部分が、VEGFR1またはVEGFR2の第二Ig様ドメインおよびVEGFR1またはVEGFR2の第三Ig様ドメインを含み、
前記FGFRの細胞外ドメイン由来部分が、FGFRのIg様ドメインの中間機能性配列領域由来の部分、FGFRの第二Ig様ドメイン、およびFGFRの第三Ig様ドメインを含み、
前記FGFRのIg様ドメインの中間機能性配列領域が、FGFR蛋白質中の、第一Ig様ドメインと前記第二Ig様ドメインの間の配列である、
血管新生抑制融合蛋白質。 - N末端からC末端へと順番に、前記VEGFRの細胞外ドメイン由来の部分と前記FGFRの細胞外ドメイン由来の部分とを含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
- 前記VEGFRの細胞外ドメイン由来の部分が、N末端からC末端へと順番に、VEGFR1またはVEGFR2の第二Ig様ドメインと、VEGFR1またはVEGFR2の第三Ig様ドメインとを含み、
前記FGFRの細胞外ドメイン由来の部分が、N末端からC末端へと順番に、FGFRのIg様ドメイン中間機能性配列領域由来の部分と、FGFRの第二Ig様ドメインと、FGFRの第三Ig様ドメインとを含む、請求項2に記載の融合蛋白質。 - 前記VEGFRの細胞外ドメイン由来部分が、VEGFR1またはVEGFR2の第一Ig様ドメインをさらに含む、請求項2または請求項3に記載の融合蛋白質。
- 前記VEGFRの細胞外ドメイン由来の部分は、N末端からC末端へと順番に、VEGFR1またはVEGFR2の第一Ig様ドメインと、VEGFR1またはVEGFR2の第二Ig様ドメインと、VEGFR1またはVEGFR2の第三Ig様ドメインとを含み、前記FGFRの細胞外ドメイン由来の部分は、N末端からC末端へと順番に、FGFRのIg様ドメイン中間機能性配列領域由来の部分と、FGFRの第二Ig様ドメインと、FGFRの第三Ig様ドメインとを含む、請求項4に記載の融合蛋白質。
- 前記FGFRの細胞外ドメイン由来の部分が、FGFRの第一Ig様ドメインまたはその一部を含まない、請求項2または請求項3に記載の融合蛋白質。
- 前記VEGFR1の第二Ig様ドメインが、配列番号2の151〜214位に対応するアミノ酸配列を有し、
前記VEGFR2の第三Ig様ドメインが、配列番号3の224〜320位に対応するアミノ酸配列を有し、
前記FGFRの第二Ig様ドメインが、配列番号1の163〜247位に対応するアミノ酸配列を有し、且つ
前記FGFRの第三Ig様ドメインが、配列番号1の270〜359位に対応するアミノ酸配列を有する、請求項2または3に記載の融合蛋白質。 - 前記VEGFR1の第一Ig様ドメインが、配列番号2の32〜123位に対応するアミノ酸配列を有する、請求項4または請求項5に記載の融合蛋白質。
- 前記FGFRの第一Ig様ドメインまたはその一部が、配列番号1の40〜118位に対応するアミノ酸配列を有する、あるいは配列番号1の77〜118位に対応するアミノ酸配列を有する、請求項6に記載の融合蛋白質。
- 前記FGFRのIg様ドメインの中間機能性配列に由来する部分が酸性ボックスを含まない、請求項1に記載の融合蛋白質。
- さらに融合パートナーを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の融合蛋白質。
- 前記融合パートナーが、免疫グロブリンFc領域である、請求項11に記載の融合蛋白質。
- 前記免疫グロブリンFc領域が、ヒトIgGのFc領域である、請求項12に記載の融合蛋白質。
- 前記ヒトIgGのFc領域が、ヒトIgG1のFc領域である、請求項13に記載の融合蛋白質。
- 配列番号7に対応するアミノ酸配列、または配列番号8に対応するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
- 配列番号9〜24のいずれか1つに記載のアミノ酸配列もしくは配列番号26〜41のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
- さらに分泌シグナルペプチド領域を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の融合蛋白質。
- 前記分泌シグナルペプチド領域がVEGFR1シグナルペプチド領域である、請求項17に記載の融合蛋白質。
- 前記分泌シグナルペプチド領域が配列番号2の1〜26位に対応するアミノ酸配列または配列番号25で表されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の融合蛋白質。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の融合蛋白質をコードする、単離核酸分子。
- 配列番号26〜41のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列を含む、請求項20に記載の核酸分子。
- 請求項20または請求項21に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項22に記載のベクターで形質転換された細胞。
- CHO細胞である、請求項23に記載の細胞。
- 有効量の、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項20または請求項21に記載の核酸分子、請求項22に記載の発現ベクターまたは請求項23または請求項24に記載の細胞、および
医薬的に許容可能なキャリア、
を含む、血管新生を阻害するための医薬組成物。 - 原核細胞または真核細胞によって、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合蛋白質を発現させる、抗血管新生融合蛋白質の調製方法。
- 前記原核細胞または真核細胞が、細菌、酵母または哺乳類動物細胞系である、請求項26に記載の方法。
- 前記の哺乳動物細胞系はCHO細胞系である、請求項27に記載の方法。
- 哺乳類動物において血管新生を抑制する医薬の製造における、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項20もしくは請求項21に記載の核酸分子、請求項22に記載のベクター、請求項23または請求項24に記載の細胞、または請求項25に記載の医薬組成物の使用。
- 腫瘍および/または眼内血管新生性疾患の治療もしくは予防のための医薬の製造における、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項20もしくは21に記載の核酸分子、請求項22に記載のベクター、請求項23または請求項24に記載の細胞または請求項25に記載の医薬組成物の使用。
- 前記腫瘍が固形腫瘍であり、前記眼内血管新生性疾患が加齢黄斑変性(AMD)および糖尿病網膜症からなる群から選択される、請求項30に記載の使用。
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