CN115925959A - 用于影响细胞增殖和迁徙的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于影响细胞增殖和迁徙的组合物。本发明针对Msi1蛋白制备了特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体具有较好的特异性以及和靶蛋白的亲和特性。将该单克隆抗体与癌细胞作用后，能够较好的抑制癌细胞的增殖以及癌细胞的迁徙能力，并且具有剂量依赖性。

Description

用于影响细胞增殖和迁徙的组合物

技术领域

本申请涉及生物领域，具体的涉及一种用于影响细胞增殖和迁徙的组合物。

背景技术

大肠癌是常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。大肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠以及横结肠，近年有向近端(右半结肠)发展的趋势。其发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。结直肠癌(CRC)是世界范围内常见的恶性肿瘤，近年来，尤其在亚洲，随着人们饮食结构及生态环境的改变，CRC的发病率及死亡率呈上升趋势。

Msi1是通过调节转录后的翻译过程来维持干细胞特性和肿瘤形成。Msi1相关基因主要参与细胞增殖(39％)、细胞分化(36％)、细胞周期(36％)和细胞凋亡(33％)，是各种肿瘤的重要生长调节剂，Msi1基因全长2950bp，含15个外显子，基因定位于人染色体12q24.1-q24.31，蛋白相对分子质量为39×10³。在真核生物中，人Msi1N端含有2个保守的RNA识别结构域(RRM)，在转录后的基因表达调控中起着重要的作用，可参与RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译控制等。相关研究证明，Msi1通过2个特异性RNA识别模序识别结合(G/A)UnAGU位点，阻止如CDKN2A、Numb等mRNA的翻译。Msi1通过结合定位3’UTR片段影响它们的翻译过程。Msi1含有＞800名RNA结合蛋白家族成员，与多种基因表达调控密切相关，而当异常表达时可导致疾病，如癌症。

Msi1和β1整联蛋白可能参与大肠肿瘤发生、发展过程。在结肠癌的研究中发现，Msi1的表达是通过涉及Notch3机制反过来诱导刺激DLL4，通过抑制Numb维持Notch1信号从而增加了Msi1的水平。这些观察突出Notch活性的调节是癌细胞的一种新颖的前馈回路。通过免疫印迹、免疫组化及RNA等测定Msi1蛋白的表达，证实Msi1是结肠癌症患者的一种新型的预后标志物，在结肠癌转移过程中异常表达，表明它是一个潜在的治疗目标。Msi1表达增高与结肠癌的TNM分期直接相关，CD133与Msi1双阳性表达在大肠癌的浸润与转移中起重要协同作用，并且对奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶方案化疗高度耐药，提示Msi1能诱导肿瘤转移和导致肿瘤细胞耐药，最终影响患者预后。此外，Msi1表达增高亦与Ki-67表达阳性及结肠癌的预后不良相关。Msi1的siRNA质粒表达载体可以有效阻断HCT116结肠癌细胞Msi1的mRNA表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。Msi1在人结肠癌SW-480细胞中有表达，沉默Msi1对癌细胞增殖有负性调节作用，可明显抑制其生长和增殖；后期实验结果证实，Msi1siRNA能有效抑制人结肠癌SW-480细胞中Msi1蛋白的表达；并且使其迁移和侵袭能力明显下降，和对照组相比差异有统计学意义。进一步证实，结肠癌Msi1的表达较正常癌旁组织高，差异有统计学意义。结肠癌中Msi1的表达与肿瘤浸润深度、Duke’s分期、淋巴转移、TNM分期和血管密度密切相关。Msi1蛋白可通过促进瘤内血管增生，从而促进结肠癌的生长和侵袭转移，并进一步影响患者的预后。

目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法，其毒副作用较大，患者在治疗过程中还可能造成肿瘤细胞的残留或对使用的药物产生抵抗，以至不能达到治疗的目的。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起，利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以，研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗大肠癌或者结肠癌是重要的研究方向。目前在临床上应用的针对结直肠癌的单克隆抗体主要有抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗和抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗以及帕尼单抗。贝伐单抗和西妥昔单抗作为对结直肠癌有明显抗肿瘤活性的单克隆抗体，首先在联合化疗的研究中获得了突破，发挥了出色的抗肿瘤活性，显著增强放、化疗的疗效。目前大量的临床研究已证实这两种单抗在转移性结直肠癌(mCRC)中疗效确切，西妥昔单抗已经在我国上市，贝伐单抗正在中国进行注册临床试验，帕尼单抗尚未申请在中国进行注册。目前的肠癌分子靶向治疗中，单克隆抗体占据了主要地位。但是提供的可选择治疗单抗种类还不够多，特别是针对新靶点的开发，还有待进一步的加强。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种针对结肠癌治疗的解决方案。

具体的，本发明提供了一种特异性针对Msi1蛋白的单克隆抗体。

具体的，所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

在一些实施方式中，所述单克隆抗体与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与Mis1具K_D≤1×10^-8mol/L，K_D值也可以选择1×10^-9mol/L、2×10^{- 9}mol/L、3×10^-9mol/L、4×10^-9mol/L、4.5×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、6×10^-9mol/L、7×10^{- 9}mol/L、8×10^-9mol/L、9×10^-9mol/L、1×10^-10mol/L、3×10^-10mol/L、5×10^-10mol/L、7×10^{- 10}mol/L、9×10^-10mol/L或1×10^-8mol/L。

在一些实施方案中，本文所述的抗体部分可以进一步被修饰以包含现有技术中已知且容易获得的其他非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例，包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量的，也可以是支链或非支链的。与抗体连接的聚合物数量可有所不同，如果连接有多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据考虑因素(包括但不限于：待改善的抗体的具体特性或功能，在确定的条件下该抗体衍生物是否将用于诊断，等)来确定用于衍生化的聚合物的数量和/或类型。

进一步的，本发明还提供了所述的Msi1单克隆抗体在制备用于治疗个体癌症的药物组合物中的用途。

在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物(例如人、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述个体是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施方案中，所述个体年龄小于约60岁(例如包括小于约50岁、40岁、30岁、25岁、20岁、15岁或10岁中的任一个)。在一些实施方案中，所述个体年龄大于约60岁(包括例如，大于约70岁、80岁、90岁或100岁任一个)。在一些实施方案中，所述个体被诊断为或在遗传上易患本文所述的一种或多种疾病或病况(如黑素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈肿瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌、肝癌或宫颈癌)。在一些实施方案中，所述个体具有与本文所述一种或多种疾病或病症相关的一个或多个风险因素。

具体的，所述的癌症是结肠癌。

进一步的，本发明提供的药物组合物还含有第二药剂或疗法。

在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法选自：本妥昔单抗(Brentuximab)、BMS-986016、Urelumab单抗、Mogamulizumab单抗、Varlilumab单抗、DS-8273a、泊马度胺(Pomalidomide)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾卡哚司他(Epacadostat)、BMS-986205、吲哚莫德(Indoximod)、ABT-399、莫托莫德(Motolimod)、西妥昔单抗(cetuximab)、BMS-986012、格列巴单抗-维多汀(Glembatumumabvedotin)、BMS-986148、ALT-803、卡比拉珠单抗(Cabiralizumab)、ABBV-085、贝伐单抗、培美曲塞(pemetrexed)、厄洛替尼(erlotinib)、克唑替尼(crizotinib)、BMS-986156、利瑞鲁单抗(Lirilumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、干扰素-γ、BMS-986179、BMS-986178、ABBV-368、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、白介素2、达雷木单抗(Daratumumab)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、NKTR-214、ABBV-927、JTX-2011、安德西昔单抗(Andecaliximab)、BMS-986207、迪妥昔单抗(Dinutuximab)-β、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、ABBV-428、X4P-001、曲妥珠单抗-DM1、伊匹单抗(Ipilimumab)、干扰素α-2b、MK-4166、吲哚莫德、利妥昔单抗、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、埃诺珠单抗(Enoblituzumab)、GSK3174998、乌妥昔单抗(Ublituximab)、TGR-1202、MK-1248、PV-10、米妥昔单抗-索拉维坦(Mirvetuximabsoravtansine)、AFM13、马戈昔单抗(Margetuximab)、IMP321、APX005M、AMG820、sEphB4-HAS、MK-4280、登赛珠单抗(Demcizumab)、GSK3359609、重组EphB4-HSA融合蛋白、Resimmune、放射疗法、AM0010、白介素12、干扰素γ-1b、MK-7684、IMM-101、恩替诺特(entinostat)、考比替尼(cobimetinib)、凡鲁珠单抗(vanucizumab)、PEG-干扰素α-2b、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、乙酰水杨酸、MOXR0916、RO6874281、他泽司他(tazemetostat)、依鲁替尼(ibrutinib)、泊洛妥珠单抗-维多汀(polatuzumabvedotin)、来那度胺(lenalidomide)、苯达莫司汀(Bendamustine)、CHOP、RG7888、凡鲁珠单抗、RO7009789、依米妥珠单抗(Emactuzumab)、色妥珠单抗-阿木留金(Cergutuzumabamunaleukin)、RO6958688、达雷木单抗、达雷木单抗、CDX-1401、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗-恩坦辛(Trastuzumabemtansine)、阿霉素、环磷酰胺、多西他赛、RG6058、ALX148、达雷木单抗、埃非佐莫德(Efizonerimod)、莫加利珠单抗、奥来克单抗(Oleclumab)、莫那利珠单抗(Monalizumab)、MEDI0562、IMC-CS4、MEDI5083、乌托鲁单抗(Utomilumab)、PF-04518600、PD0360324、阿扎胞苷(Azacitidine)、苯达莫司汀、M9241、维莫非尼、PDR001、LY3321367、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、洛扎利珠单抗(Plozalizumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、TAK-580、洛瓦妥珠单抗-特昔林(Rovalpituzumabtesirine)、本妥昔单抗-维多汀(Brentuximabvedotin)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、MBG453、GWN323、地西他滨、康纳单抗(Canakinumab)、CJM112、曲美替尼、EGF816、NIS793、REGN1979、REGN3767、阿卡替尼(Acalabrutinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、伏立诺他(Vorinostat)、迪纳昔克利(Dinaciclib)、达拉非尼(dabrafenib)、阿西替尼(Axitinib)、依鲁替尼、阿贝马昔克利(Abemaciclib)、艾瑞布林(Eribulin)、BL-8040、地塞米松、CMP-001、阿法替尼、安卡舍替(Amcasertib)、ARRY-382、阿扎胞苷、罗米地辛(romidepsin)、B-701、BGB324、比美替尼(Binimetinib)、比瑞纳畔(Birinapant)、卡非佐米(Carfilzomib)、GM-CSF、德伐替尼(Defactinib)、恩科拉非尼(Encorafenib)、依诺波沙(Enobosarm)、依西美坦(Exemestane)、亮丙瑞林(leuprolide)、G100、GR-MD-02、伊马替尼(Imatinib)、IMO-2125、INCB054828、伊他替尼(Itacitinib)、INCB050465、来曲唑、帕博西尼(palbociclib)、MK-1454、纳帕布卡辛(Napabucasin)、尼达尼布(Nintedanib)、尼拉帕尼(Niraparib)、奥拉帕尼(Olaparib)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、泼尼松、帕唑帕尼(Pazopanib)、PEGPH20、PLX3397、普瑞莱登(Preladenant)、鲁索替尼(Ruxolitinib)、沙格司亭(Sargramostim)、SCH900353、SD-101、维莫德吉(Vismodegib)、X4P-001、XL888、Ziv-阿柏西普(Ziv-aflibercept)、依鲁替尼、达沙替尼、普那布林(Plinabulin)、维尼帕尼(Veliparib)、PT2385、EGF816、INC280、色瑞替尼(Ceritinib)、加仑赛替(Galunisertib)、替西罗莫司(Temsirolimus)、伊立替康、卡培他滨、安卡舍替、IPI-549、西达本胺(Chidamide)、CB-839、TAK-659、司曲替尼(Sitravatinib)、格列替尼(Glesatinib)、司曲替尼、莫西汀(mocetinostat)、阿瓦度胺(Avadomide)、RRX-001、奥马索龙(Omaveloxolone)、丙戊酸盐(Valproate)、CB-1158、阿扎胞苷、米哚妥林、阿糖胞苷、依鲁替尼、莫西汀、奥西替尼(Osimertinib)甲磺酸酯、吉非替尼、AZD6738、西地尼布、MEDI9197、AZD5069、白蛋白结合型紫杉醇、AZD4547、AZD1775、维斯赛替(vistusertib)、加仑赛替、LY2510924、AZD4635、泊西达替尼(Pexidartinib)、司美替尼(Selumetinib)、曲贝替定(Trabectedin)、恩沙替尼(Ensartinib)、阿莱替尼(Alectinib)、罗西莱替尼(Rociletinib)、CPI-444、依托泊苷、卡铂、崔莱克利(trilaciclib)、卢卡帕尼(Rucaparib)、维尼帕尼、劳拉替尼(lorlatinib)、舒尼替尼(Sunitinib)、Beigene-290、BGB-3111、萨沃替尼(Savolitinib)、阿帕替尼(Apatinib)、美瑞替尼(merestinib)、西他司他(Citarinostat)、恩罗非尼(Emurafenib)、卡博替尼(Cabozantinib)、帕唑帕尼、WNT974、FGF401、PBF509、LXH254、瑞戈非尼(Regorafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、LCL101、依维莫司、帕比司他(panobinostat)、卡普替尼(Capmatinib)、BLZ945、Ad-CEA疫苗、Axalimogenefilolisbac、Vigil、TPIV200、PVX-410、Hiltonol、DC/AML融合细胞疫苗、LTX-315、LV305、膀胱内BCG治疗、ADXS-PSA、p53MVA、pTVG-HP质粒DNA疫苗、6MHP、GVAX胰腺、GVAX、DNX-2401、DPX-Survivac疫苗、树突状细胞疗法、冷冻手术、Prevnar13、mDC3/8、NY-ESO-1、gp100:280-288、CRS-207、ISA101、Viagenpumatucel-L、树突状细胞疫苗、WT1疫苗、TG4010、CV-301、PD-L1/IDO肽疫苗、DCVax-L、NEO-PV-01、CimaVax-EGF疫苗、减毒麻疹病毒、Prostvac、CMB305、Sipuleucel-T、ONCOS-102、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒A22、Pelareorep、Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3、Talimogenelaherparepvec、表达HSV-tk的腺病毒、Pexa-Vec、Enadenotucirev、MCPyVTAg特异性自体CD8+T细胞、IMCgp100、TIL治疗、iC9-GD2T细胞、E7TCRT细胞、pIL-12、ISF35、NY-ESO-1TCRPBMC、HPV特异性T细胞、NK免疫疗法、Axicabtageneciloleucel、AZD9150、聚ICLC和ImprimePGG。

有益效果

本发明针对Msi1蛋白制备了特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体具有较好的特异性以及和靶蛋白的亲和特性。将该单克隆抗体与癌细胞作用后，能够较好的抑制癌细胞的增殖以及癌细胞的迁徙能力，并且具有剂量依赖性。

附图说明

图1 M2D012单克隆抗体特异性鉴定结果图

图2单抗对人结肠癌细胞SW480细胞的增殖抑制率

图3单抗对人结肠癌细胞SW480细胞迁徙的影响

具体实施方式

在本说明书中已经详细说明了关于本发明的特定实施方式，但应该理解为，上述说明实际上是示例性且说明性的，旨在说明本发明与其优选的实施方式。通过常规的实验，本领域技术人员在不脱离本发明的精神与范围的情况下，可以容易地在其中进行各种变更与修正。因此，本发明不被上述说明所限定，旨在由添附的权利要求的范围及其等价物所限定。

以下，将参考实施例来更详细地说明本发明。然而，尽管以下材料、方法和实施例在本发明的某实施方式的制备与使用中能够帮助本领域技术人员，但它们仅用于说明本发明的实施方式，绝对没有限定本发明的范围的意图。本领域技术人员可以使用与本说明书中记载的那些相类似或等同的方法和材料来在本发明的实施或试验中使用。

实施例1Msi1单克隆抗体的研究

将100μg购买的重组Msi1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合,充分乳化,经腹腔注射免疫BALB/c小鼠。以后每隔2周进行1次免疫,采用100μg重组Msi1蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合、乳化后经腹腔注射免疫,共免疫4次。Msi1重组蛋白购买自Hzbscience，货号HZ00004440。

末次免疫后3d取脾,将小鼠脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞按8:1比例混合于50mL离心管中,置于37℃水浴中,于1min内缓慢滴入1mL预热的PEG4000,静置4min,用无血清RPMI1640液终止作用,离心收集细胞。将细胞首先悬于含HAH的选择培养基中,接种于96孔培养板中,100μL/孔,接种密度为每孔1个或2个细胞,10d后改用HT培养液,3周后改用普通RPMI1640培养液(含10％胎牛血清)培养。应用间接ELISA法来筛选阳性克隆。具体的，融合后待融合细胞生长到培养孔的一半时,取上清进行筛选。包被用抗原为重组Msi1蛋白蛋白100ng/孔,融合细胞上清加100μL/孔,以Sp2/0细胞培养上清液作为阴性对照,阳性对照为商品化的Msi1抗体M08，H00004440-M08，Abnova；二抗为1:5000HRP山羊抗小鼠IgG,100μL/孔,经TMB底物显色后,酶标仪测定A450值。凡A450值大于阴性对照(Sp2/0细胞培养上清)2倍以上者,初步判定为阳性克隆。计算得杂交瘤细胞阳性率为28.3％。选择阳性孔较强的20株用有限稀释法进行4次亚克隆,至所有杂交瘤细胞上清液均呈阳性为建株标准，获得了一株稳定并且高阳性分泌抗Msi1的的杂交瘤细胞株M2D012,扩大培养后液氮冻存。

将杂交瘤细胞培养至对数生长期加入终浓度为0.3mg/L的秋水仙素,于37℃继续培养5h,收集细胞,加入预热的0.075mol/L KCl,37℃保温30min。用甲醇与冰醋酸混合液(二者比例为3∶1)固定3次,制片,Giemsa染色,进行观察。每份标本计数100个完整的中期细胞,计算染色体的平均数量。结果检测得染色体数目为105条,基本符合脾细胞和Sp2/0细胞染色体数目之和，说明制备获得是正确的融合细胞。

小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只,10d左右后,经腹腔接种杂交瘤细胞(10⁷个/0.5mL)。待小鼠出现腹部肿胀时,开始收集腹水,3000r/min离心8min,收集上清采用Capturem^TMProtein A柱纯化抗体，经SDS-PAGE鉴定抗体纯度达到98.5％以上，分装保存于-70℃备用。

实施例2抗体效价及亚型鉴定

(一)、Ig亚类(型)的鉴定：采用小鼠单抗快速分型试剂盒对单克隆抗体亚型进行鉴定。

(1)样品稀释腹水稀释：将0.5μL腹水加入4mL样品稀释液，按1:8000稀释后充分混匀。细胞培养上清稀释：将5μL细胞培养上清加入0.5mL样品稀释液，按1:100稀释后充分混匀。

(2)实验前，将试纸从冰箱中取出，置室温充分平衡后使用。

(3)在各样品孔中分别加入150μL稀释样品；

(4)静置等待10min，当有条带出现时，立即记录结果。红色质控条带为“C”,颜色稍暗的条带即为抗体亚型。

(二)、mAb效价的测定用间接ELISA法测定,设立4个平行孔,酶标仪测定OD450的吸光值，阳性反应的最大稀释度为所测纯化抗体样品的效价。结果如表1所示。

表1 抗体效价和亚型结果

实施例3M2D012单克隆抗体特异性鉴定

以结肠癌SW480细胞作为实验组，正常小鼠血液为对照组。收集细胞，用PBS洗两遍，然后加入100μL 1×SDS上样buffer充分吹打，随后将样品置沸水中煮5min，随后4℃、12000rpm离心5min。取上清跑SDS-PAGE电泳，随后转PVDF膜，取出PVDF膜，置室温摇床用含5％脱脂奶粉的封闭液封闭2h，封闭完成后，孵育本发明一抗(1：2000稀释)，于摇床上孵育2h。随后用TBST洗3次，每次5min。随后孵育二抗(IRDye800CW羊抗鼠IgG，1:5000稀释)，摇床上室温避光孵育1h。TBST漂洗3次，每次5min。随后取出PVDF膜，夹于双层滤纸中，置暗处避光干燥。然后用LI-COROdyssey红外荧光扫描成像系统扫描条带，检测蛋白的表达情况。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，Western blot结果表明其识别结肠癌细胞中的Msi1蛋白，而不能与小鼠血液蛋白反应，说明本发明的单克隆抗体具有特异性，且与其他蛋白没有交叉反应。

实施例4M2D012单克隆抗体亲和力鉴定

使用生物膜干涉技术来测量M2D012单抗与Msi1蛋白的亲和力，将表达纯化得到的M2D012单克隆抗体20nM固化到AHC传感器上，Msi1两倍连续稀释物(最低0.1nM)以按照样品板排列加样，按照“基线检测-加载检测-淬火-淬火-洗板-基线检测-结合检测-解离检测”的程序设定进行操作。计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(kd)、平衡解离常数(KD)，结果如表2所示。结果显示，M2D012单克隆抗体与Msi1蛋白的KD为3.19×10^-10M。

表2：抗体的结合动力学参数

抗体名称	<![CDATA[K<sub>D</sub>(M)]]>	<![CDATA[K<sub>on</sub>(1/Ms)]]>	Kd(1/s)
				M2D012	<![CDATA[3.19×10<sup>-10</sup>]]>	<![CDATA[7.46×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[2.38×10<sup>-4</sup>]]>

实施例5M2D012单克隆抗体序列鉴定

提取M2D012单克隆杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

P1：5’-CAGGAGTCAGGACCTGAGCT-3’；

P2：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGG-3’。

设计轻链可变区引物序列：

P3：5’-TCAGACACACTGCTGTTAT-3’；

P4：5’-GGATGGTGGGAAGATGGATACAGT-3’。

通过分子克隆技术分别做的单克隆抗体的可变区序列，送爱默生物科技测序。测定单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

实施例5M2D012单克隆抗体的生物学功能鉴定

将人结肠癌细胞SW480用含10％胎牛血清的DMEM完全培养液中常规培养。将对数生长期的结肠癌细胞消化、离心，调整细胞悬液浓度，铺板使待测细胞调密度为4000个/孔，每孔体积200μl，边缘孔用无菌PBS填充。5％CO₂，37℃孵育24h后，加入0、25、50、100、200μg/ml的M2D012单抗，设置5-FU 50μg/ml作为阳性对照，每孔体积为200μl，继续培养24h、48h和72h，各设3个复孔，不加细胞加培养基和抗体孔为空白孔。贴壁向每孔加入20μlCCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育3个小时。(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。实验重复三次。计算：抑制率＝(1-实验组的A值/对照组的A值)×100％。

CCK8法测细胞增殖，阴性对照对SW480细胞没有抑制作用。其余治疗组统计结果如图2所示，随着本发明单抗的作用时间和给药浓度的增加，抗体对肿瘤细胞增殖抑制作用越提高，呈一定浓度和时间依赖性。与阴性对照组比，各加药组均具有较强的增殖抑制作用，在200μg/ml的M2D012单抗处理72h时细胞抑制率最高，达到了56％的水平，比阳性对照组的抑制效果还要好。

Transwell检测：种板前人结肠癌细胞SW480细胞先经2％FBS的培养基处理24h，同时准备0.1％BSA的DMEM基础培养基。侵袭实验需先往下室内铺基质胶100μl。胰酶消化细胞，1000rmp、离心5min，沉淀细胞；小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞；加入约1ml冰浴预冷的PBS洗2遍，重悬细胞，再次离心沉淀细胞；细胞经消化、PBS洗涤离心后，加入0.1％BSA的基础培养基吹打混匀成细胞悬液，并计数20×10⁴个/ml。将小室放入24孔板内，往小室上室内加入150μl的细胞悬液(内含终浓度分别为0、25、50、100、200μg/ml的M2D012单抗或者5-FU 50μg/ml作为阳性对照)，同时加650μl的10％FBS培养基至下室内，37℃孵育14h。移去小室内的培养基，PBS洗涤2遍，用棉签轻轻擦净小室的内未迁移的细胞；4％多聚甲醛常温固定15min后移去，PBS洗涤2遍，用棉签轻轻擦净小室的内未迁移的细胞。瑞氏吉姆萨染色15min后移去，PBS洗涤2遍，用棉签轻轻擦净小室的内未迁移的细胞。倒置显微镜下计数。

Transwell检测本发明的单抗对SW480细胞的迁移作用，结果如图3显示，单抗对SW480细胞作用后，与对照组相比，随着给药浓度的增加，单抗对细胞的迁移抑制作用逐渐增加。与空白对照组比较，25μg/ml以上浓度给药组即具有抑制细胞迁移作用(P<0.05),在单抗200μg/ml浓度组抑制作用更明显，迁移细胞数只有56个，与空白对照组的510个差异极其显著(P<0.01)，也比阳性对照组的迁移细胞数要少，说明单抗对细胞的迁移抑制作用呈一定浓度依赖性。

工业实用性

本发明成功地制备了能够高特异性结合Msi1蛋白的抗体。通过使用本发明的抗Msi1蛋白抗体，可以有效抑制细胞中的Msi1蛋白活性，进而抑制癌细胞的生物学特性，因此，本发明的抗体可以用于对癌症的治疗，相应的可以用于制备成为相应的药物组合物。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims (5)

1.一种针对Msi1的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体命名为M2D012，所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.一种用于抑制Msi1蛋白表达的药物组合物，其特征在于含有针对Msi1的单克隆抗体，该单克隆抗体命名为M2D012，所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.一种针对Msi1的单克隆抗体在制备用于抑制结肠癌SW480细胞增殖和迁徙的药物组合物中的用途，其中Msi1的单克隆抗体命名为M2D012，所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的药物组合物中还含有第二抗癌药剂。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

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