EA023679B1

EA023679B1 - АНТИ-EpCAM АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Info

Publication number: EA023679B1
Application number: EA200970923A
Authority: EA
Inventors: Анна Мария Анастаси; Фиорелла Петронцелли; Рита Де Сантис; Саверио Альберти
Original assignee: Сигма-Тау Индустрие Фармасьютике Риуните С.П.А.
Priority date: 2007-04-04
Filing date: 2008-04-02
Publication date: 2016-06-30
Also published as: HRP20110620T1; AU2008235566B2; MX2009010444A; WO2008122551A3; SI2142570T1; DK2142570T3; WO2008122551A9; US8318911B2; CA2682296C; ATE512988T1; CA2682296A1; RS52040B; KR20100016237A; AU2008235566A1; CN101970497A; BRPI0810096A2; ES2367675T3; CN101970497B; WO2008122551A2; US20100092491A1

Abstract

Описывается анти-ЕрСАМ антитело, которое демонстрирует высокую аффинность в отношении нативного антигена и хорошую опухолевую специфичность. Также описаны варианты применения антитела, фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способ применения и набор.

Description

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам против ЕрСАМ человека и к его функциональным производным, к способам и материалам, используемым для их получения, к применению указанных антител для диагностики и лечения опухолей, экспрессирующих ЕрСАМ, и к материалам, подходящим для использования в медицине, которые содержат указанные антитела.

Предпосылки создания изобретения

Нацеливание антител на опухолевые ткани позволяет селективно распознавать антигены, сверхэкспрессирующиеся в сайте опухоли, которые являются мишенью противоопухолевой иммунотерапии. Молекула адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ, 8^188 ргоб.по. Р16422), также известная как опухолеассоциированный кальциевый сигнальный трансдуктор 1, ТРОР-1, ОА733-2 и т.п., представляет собой трансмембранный гликопротеин типа 1, экспрессирующийся на базолатеральной мембране простого эпителия, где он вовлечен в кальций-независимую гомофильную клеточную адгезию. Внеклеточный домен состоит одного повтора, аналогичного повтору эпидермального фактора роста, за которым следует тиреоглобулиновый повтор и обедненный цистеином участок, а внутриклеточный домен состоит из 26 аминокислот и включает два сайта связывания α-актинина, для присоединения к актиновому цитоскелету (^νίηΙΟΓ ΜΙ с1 а1. 2003). Клетки основных злокачественных опухолей человека устойчиво сверхэкспрессируют ЕрСАМ, как было недавно продемонстрировано νοηΐ и коллегами (2006), на основании результатов иммуногистохимического анализа большого числа образцов опухолевых тканей толстой кишки, желудка, предстательной железы и легкого. Клетки, сверхэкспрессирующие ЕрСАМ, стремятся отделиться от нормальных клеток, что коррелирует с развитием пролиферативного и злокачественного фенотипа (\νίηΐ0Γ с1 а1. 2003). На основании этих данных, была исследована возможность нацеливания на ЕрСАМ для иммунотерапии.

Антитело 1дО2а мыши, Эдреколомаб, имеющее некоторую антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в отношении ЕрСАМ-положительных клеток, было разрешено в Германии для клинического применения и используется для лечения пациентов с колоректальной или панкреатической карциномой, после оперативного хирургического вмешательства. Семилетнее наблюдение показало минимальные остаточные проявления заболевания у пациентов с колоректальным раком Дукса после лечения эдреколомабом и снижение смертности на 32%, а также снижение числа рецидивов на 23% (ΡίοίΗти11ег О с1 а1., 1998; ^ешет ЬМ с1 а1., 1993). Однако, общие результаты клинического испытания привели к отказу от этого лекарственного средства в качестве препарата для монотерапии, в связи с его ограниченной противоопухолевой эффективностью (Рий С1 е1 а1., 2002) и ввиду подготовки к новым клиническим испытаниям, в которых планировалось использовать антитело в качестве дополнительного средства в сочетании с другими активными химиотерапевтическим соединениями (Ρτοάίη ΙΕ еу а1., 2002).

Другие антитела, направленные на эту мишень, использовали в доклинических или клинических экспериментах. МТ-201 (Адекатумумаб) представляет собой полностью моноклональное антитело 1дО1 человека со средней степенью аффинности к ЕрСАМ (МшпбогГ δ е1 а1., 2002). Его эффективность была продемонстрирована на модели голых мышей с ксенотрансплантатом, используя линии клеток рака толстой кишки НТ-29 (М-шпбогГ δ е1 а1., 2002). В исследованиях ίη νίΐτο на различных линиях опухолевых клеток было показано, что МТ201 опосредует лизис мишеневых клеток по механизму АЭСС и комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) (Ртапд N еΐ а1., 2005). Это антитело в настоящее время проходит фазу клинической разработки для применения его при лечении гормоно-резистентного рака предстательной железы (Обетпебет Р еΐ а1., 2006).

ΙΝΟ-1 представляет собой сконструированное высокоаффинное моноклональное антитело человека, нацеленное на ЕрСАМ-положительные клетки. Указанное антитело использовалось на I фазе клинического испытания на пациентах с прогрессировавшей аденокарциномой, устойчивой к стандартной терапии, и полученные в результате этого испытания данные показали, что антитела с высокой аффинностью к ЕрСАМ, являющиеся цитотоксичными для опухолевых клеток, также могут индуцировать острое токсическое поражение поджелудочной железы, что ограничивает терапевтический диапазон их системного применения (Эе Вопо ίδ еΐ а1., 2004). Имеются различные мнения по поводу важности аффинности антител для достижения эффективной иммунотерапии. Так, Уе1бет8 еΐ а1. (1998) представили ш νίΐΓΌ данные о влиянии аффинности антитела и антигенной плотности на АЭСС, которые были получены при сравнении двух антител с разной аффинностью в отношении ЕрСАМ. Результаты данного исследования показывают, что высокоаффинное антитело может опосредовать гибель клетки при низких уровнях антигенной экспрессии или, при сравнимых уровнях связывания, с более высокой эффективностью. Поскольку гетерогенность экспрессии антигена-мишени является обычной характеристикой всех опухолей, то использование высокоаффинных антител может привести к улучшению клинических результатов. Возможные системные токсические эффекты, связанные с терапевтическим применением анти-ЕрСАМ антител, могут быть снижены при использовании стратегий предварительного мишеневого воздействия, которые включают стадию распознавания для удаления на определенной временной стадии циркулирующего антитела. Альтернативно, использование высокоаффинных аффинных антител может быть ограничено локально-региональным лечением.

- 1 023679

Был разработан одноцепочечный фрагмент Ρν гуманизированного антитела Мк-ЬИ-Ю, специфичный для антигена ЕрСАМ, сконструированный по рекомбинантной технологии в виде слитого белка со стрептавидином, предназначенный для проведения предварительного нацеливания в рамках радиоиммунотерапии или при проведении хирургической операции на молочной железе с визуализацией опухоли с помощью радиоактивных веществ. Результаты доклинического испытания показали, что однократная доза 800 мкКю 90У-ЭОТЛ-биотина, введенная после ΝΚ-Ьи-Ю, излечивала мышей с приживленными ксенотрансплантатами мелкоклеточного рака легкого или рака толстой кишки человека (Оокйоги 8 е! а1., 2001). Во втором отчете Вигак \УЕ 1г е! а1. (2001) было показано, по данным анализа отобранных в ходе операции проб для оценки локализации опухоли у 7 из 10 пациентов, что использованный при этом РаЬ, меченный ΝΚ-Ευ-10, демонстрирует способность в качестве направленно воздействующего агента.

Несмотря на успехи клинического использования моноклональных антител при ряде патологий, иммунотерапия солидных опухолей все еще остается неудовлетворительной. Радиоиммунотерапия с предварительным направленным воздействием антител (РАОК1™1) представляет собой многофакторную лечебную стратегию, позволяющую ограничить область накопления радиоактивных изотопов в опухоли, тем самым усиливая их действие. Специфичность и аффинность противоопухолевых моноклональных антител, используемых на первой стадии, представляет собой фундаментальный фактор, определяющий эффективность лечения.

Заявитель сообщил о достижении исключительно высокого и специфичного накопления антитенасциновых моноклональных антител 8Т214 6 в ксенотрансплантатах опухолей человека, экспрессирующих антиген как на низком, так и на высоком уровне (Эе 8апЙ5 е! а1., С11шса1 Сапсег КекеагсЬ, р 2191, 1 Аргй 2006).

На основании результатов, описанных в ЕР 0496074, С. РадапеШ е! а1 разработали трехстадийную процедуру проведения предварительного воздействия с целью системного и локально-регионального лечения опухолей (Сгешопе81 М. е! а1., Еиг. 1. №с1. Меб.26 (2).-110- 120, 1999; РадапеШ С. е! а1., Еиг. 1. №с1. Меб. 26 (4): 348-357, 1999; РадапеШ С., е! а1. Сапсег ВюШег. & КабюрЬагт. 16 (3): 227-235, 2001).

Другими ссылками на указанный трехстадийный метод предварительного мишеневого воздействия являются №0 94/04702 и и8 5578287.

Указанное трехстадийное лечение с предварительным нацеливанием основано на внутривенном последовательном введении биотинилированных анти-тенасциновых моноклональных антител, стрептавидина и ⁹⁰Υ -меченого биотина с двумя введениями авидина и биотинилированного альбумина, перед введением стрептавидина и ⁹⁰Υ -меченого биотина, соответственно, для снижения уровня неспецифического связывания.

Таким образом, в настоящее время в медицине имеется потребность в других улучшенных анти-ЕрСАМ антителах, которые могли бы использовать для диагностики и лечения рака, например в рамках стратегии РАСК1Т.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к анти-ЕрСАМ антителу, или его функционально активному фрагменту, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела с тремя гипервариабельными участками (СОК) с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:4 или 8ЕЦ ГО N0:6, и вариабельную область легкой цепи антитела по меньшей мере с одним гипервариабельным участком (СОК) с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:8, 8ЕЦ ГО N0:10 или 8ЕЦ ГО N0:12, Также изобретение относится к варианту указанного антитела, который способен полностью и постоянно ингибировать рост опухолей, экспрессирующих ЕрСАМ. Изобретение также относится к варианту указанного антитела, который представляет собой моноклональное антитело. Другим вариантом указанного антитела является антитело, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной в Центре биотехнологии (Абмапсеб Вю!есЬпо1оду Сеп!ег, Генуя, Италия) с номером доступа N0. Р006004. Еще одним вариантом указанного антитела или его фрагмента является 8сΡν, Ρν фрагмент, РаЬ фрагмент, Р(аЬ)₂ фрагмент, мультимерное антитело, пептид или протеолитический фрагмент, содержащий эпитоп-связывающий участок. Кроме того, изобретение относится к варианту, когда антитело представляет собой химерный белок, состоящий из участков антитела человека и мыши. Согласно еще одному варианту антитело связано с белком, который представляет собой цитокин, белок из семейства авидинов, биотин, меченый биотин или другие эффекторные белки. Согласно еще одному варианту антитело представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело.

Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, кодирующую любой указанный вариант антитела или его функционально активного фрагмента, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с указанной выше последовательностью нуклеиновой кислотой в жестких условиях, или последовательность нуклеиновой кислоты, полученная на основе указанной в соответствии с принципом вырожденности генетического кода. В качестве варианта указанная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: 8ЕС ГО N0:1, 8ЕС ГО N0:3, 8ЕС ГО N0:5, 8ЕС ГО N0:7, 8ЕС ГО N0:9 и 8ЕС ГО N0:11.

- 2 023679

Еще в одном из вариантов осуществления изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему указанную нуклеиновую кислоту.

Также изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной указанным вектором экспрессии.

Заявлены гибридомные клеточные линии, продуцирующие указанные анти-ЕрСАМ антитела. В частности, заявлена гибридома, депонированная в Центре биотехнологии в Генуе (Айуаисей Βίοίοοίιпо1оду СеШег, Генуя, Италия) с номером доступа Νο. ΡΌ06004.

В другом варианте осуществления изобретение относится к применению анти-ЕрСАМ антитела в качестве лекарственного средства для лечения опухоли. В частности, опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из карциномы толстой кишки, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы яичника, карциномы мочевого пузыря или карциномы легкого.

Изобретение относится к фармацевтической композиция для лечения опухоли, содержащая эффективное количество указанного антитела или его фрагментов и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В частности, композиция может быть использована для радиоиммунотерапии. Также композиция может содержать по крайней мере еще одно опухолеспецифическое антитело в той же или в стандартной дозе. В еще одном варианте указанная композиция отличается тем, что опухолеспецифическое антитело представляет собой ЕрСАМ антитело, отличное от указанных антител.

Анти-ЕрСАМ антитела можно использовать в качестве средства для диагностики опухолей.

Анти-ЕрСАМ антитела можно использовать в качестве средства для диагностики опухолей ίη νίνο.

Также изобретение относится к растворимой композиции для инъекции для проведения опухолевой диагностики ίη νίνο.

Также заявлен способ иммунодетекции в образце антигена, способного связываться с указанным антителом или его фрагментом, где способ включает стадию инкубации в соответствующих условиях данного образца с указанным антителом или его фрагментом и последующую детекцию комплекса антиген-антитело.

Изобретение также относится к диагностическому набору для использования в вышеуказанном способе. Набор включает указанное антитело или его фрагмент и средство детекции комплекса антигенантитело.

Ниже приведено подробное описание настоящего изобретения, в сочетании с неограничивающими примерами и со ссылкой на следующие чертежи.

Фиг. 1: профиль С8Т3232/10, полученного после очистки на колонке с белком А (МаЬ8е1ес1 8иКе, СЕ НеаИйсате) в 4-12% ΒίδΤτίδ §С8-РАСЕ (Ртесак!, ИгуПгодеп, США). Линии 1-3: очищенное моноклональное антитело 8Т3232/10 в невосстанавливающих условиях; линии 4-6: очищенное моноклональное антитело 8Т3232/10 в восстанавливающих условиях. Для разделения используется буфер 1х МЕ§. Для окрашивания геля используется краситель Кумасси (§1шрНе В1и, Ιηνίίτο^η, США).

Фиг. 2: гель-фильтрация на колонке с Т8СК3000 очищенного 8Т3232/10, при использовании для разделения ΡΒδ, рН 7. Показатели времени (минуты) приводятся на оси абсцисс, а на оси ординат показано поглощение в милли- единицах поглощения (мЕП).

Фиг. 3: тест на специфичность флуоресцентной сортировки анти-ЕрСАМ антител. δΤ3232/10 или другие контрольные антитела (М104, НТ29/26 и Т16) инкубируют (1 мкг/10⁶ клеток, 1 час, при 4°С) с клетками фибросаркомы Ь мыши, которые в естественном состоянии не экспрессирует ЕрСАМ и которые были трансфицированы молекулой ТКОР-1 человека (панели А-С), молекулой ТК.ОР2 человека (панели Ό-Ρ) или пустым вектором, в который не были введены экзогенные белки (С-Ι). Вторичное РЕ-конъюгированное антитело (ΒΌ, США) было использовано согласно инструкциям производителя и гибель клеток определяли при окрашивании красителем 7-ААЭ (РАС8Са11Ьит, ΒΌ Вюкшепсек, США). δΤ3232/10 демонстрирует положительную реакцию с ТКОР-1-положительными клетками (панель А) и отрицательную реакцию с Ь клетками дикого типа или с клетками, трансфицированными молекулами ТКОР2 (панели С и Ό соответственно). Аналогичный результат наблюдался с другими ЕрСАМ-специфичными антителами (панели В, Е, Н: М104; С, I: НТ29/26). Т16 антитело было использовано в качестве положительного контроля для ТКОР2-Ь клеток (панель Р).

Фиг. 4: конфокальная микроскопия δΤ3232/10, конъюгированного с А1еха488 на линии опухоли клеток молочной железы МСР7. МСР7 клетки помещают на планшеты размером 15 х 15 мм с покровным стеклами и фиксируют через 48 ч при инкубации в смеси ΡΒδ/4% параформальдегид в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем клетки подвергают пермеабилизации и окрашивают антителом, после чего анализируют несколько полей в конфокальном микроскопе. Конъюгат А1еха488-8Т3232 демонстрирует ожидаемую картину окрашивания и наибольшая интенсивность отмечается на границах клеткаклетка, а также выявляется окрашивание отдельных пятен. Два примера такого окрашивания отдельных пятен показаны на панелях А и В.

Фиг. 5: иммунореактивность 8Т3232/10 и анти-ЕрСАМ моноклонального антитела НТ29/26 в отношении антигена, экспрессированного на линии клеток карциномы толстой кишки НТ29. Данные представлены как изменение оптической плотности (ОП, измеренной при лине волны 405 нм) (линейная шкала, ось Υ) с возрастающими концентрациями двух антител (мкг/мл, логарифмическая шкала, ось X) при

- 3 023679 инкубации с клетками карциномы толстой кишки НТ29.

Фиг. 6: кинетический анализ и определение параметров связывания 8Т3232/10 с внеклеточным доменом молекулы ЕрСАМ, иммобилизованной на сенсорном чипе СМ5. Панель А: сенсограммы инъецированного моноклонального антитела в разных концентрациях (500, 250, 62,5, 15,6 и 7,8 нМ) в виде функции времени (мин, ось X) и резонансных единиц (КИ, ось Υ). Панель В: бивалентная модель при оценке в рамках программы В1аЕуа1иа1юп была использована для построения кривых на основе полученных данных; остаточные значения, отражающие различия в значениях КИ между полученными и ожидаемыми кривыми представлены в виде графика (ось Υ) для каждой временной точки (ось X). Кинетические константы имеют следующие значения: ка1=7,75Е+04±297, кф=7,20Е-05±8,48Е-06, К_с=9,3Е-10, χ²=1,97.

Фиг. 7: реактивность 8Т3232/10 на тканях опухоли человека и на нормальных тканях. В качестве примера, приведены результаты иммуногистохимического анализа клеток карциномы толстой кишки и легкого (панели А и С соответственно), в сравнении с нормальными для них вариантами (панели В и Ό соответственно.) Ткани опухоли человека сильно окрашиваются коричневым цветом.

Фиг. 8: аллогенный трансплантат у голых мышей и результаты лечения с использованием 8Т3232/10, в сравнении с Эдреколомабом (ЕФесо1отаЬ (Рапогех®)). Линия клеток фибросаркомы Ь мыши, трансфицированная (Ь/Ттор-1) или не трансфицированная (Ь/вектор) человеческим Тгор-1, была инъецирована подкожно голым мышам. В день инокуляции животным ввели 200 мкг 8Т3232/10 (Ь/вектор+8Т3232 и Ь/Ттор-1+8Т3232), Эдреколомаб (Ь/Ттор-1+Рапогех) или неродственный 1дО мыши (Ь/вектор и Ь/Ттор-1). Три других введения были выполнены в дни 7, 15 и 22, как указано стрелками. Прогрессирование опухоли оценивают до 50 дня.

Фиг. 9: ксеногенные трансплантаты у голых мышей и результаты лечения с использованием 8Т3232/10, в сравнении с использованием антитела М104. Линия клеток карциномы толстой кишки человека КМ12-8М, которая в нативном состоянии экспрессирует Тгор-1, была подкожно трансплантированаголым мышам. Было проведено четыре варианта лечения, один раз в неделю с использованием 200 мкг 8Т3232/10 (группа введения 8Т3232), М104 (группа введения М104) или носителя (контрольная группа), начиная с дня инокуляции. Прогрессирование опухоли оценивают до 30 дня.

Методы

Г ибридомные клетки.

Для получения нового клона гибридомных клеток против ЕрСАМ, мышей Ва1Ь/с иммунизируют линией клеток фибросаркомы мышей Ь (А1Ьетй 8 е! а1., 1988), стабильно трансфицированных молекулой человеческого ЕрСАМ (ΝΟΒΙ РеГ8ес] ΝΜ_002354). Спленоциты иммунизированных мышей сливают с миеломными клетками 8р2/0Ад14 по стандартному методу (СлапГпдйа М. е! а1., 1986), и гибридомную популяцию скринируют цитофлуориметрией на наличие линии опухолевых клеток, экспрессирующих ЕрСАМ, такой как НТ29. ЕрСАМ-специфичные гибридомы клонируют при проведении ограниченного двукратного разведения в РС8-содержащей среде и четырехкратного разведения в безбелковой среде (Ашта1 Эепуеб Сотропеп! Ргее МеФит НуС1опе, НуЦКРетЬю). Один из положительных клонов, полученных на стадии четвертого ограниченного разведения, с последующим клонированием, был обозначен как С8Т3232, и далее этот клон был подвергнут ферментации в минибиореакторе. Стабильность клеточной линии С8Т3232 составляет 98,65%. В этой связи, положительный клон С8Т3232/10 был выбран для амплификации с целью дальнейшей работы с ним.

Антитело.

8Т3232/10 представляет собой мышиный иммуноглобулин 1дО1/к изотипа, по данным определения с использованием коммерческого набора (КосЬе, Оегтапу). Вариабельный участок легкой каппа-цепи был амплифицирован на основе кольцевой кДНК с использованием пары праймеров (5'-ТОТСААОАОСТТСААСАООА-3' (8ЕО ГО N0:13), 5'-ААОАТООАТАСАОТТООТОС-3' (8ЕО ГО N0:14)), который был подвергнут отжигу с получением константного участка антитела, по методу М. 8а88апо е! а1 (1994).

Вариабельный участок тяжелой гамма-цепи был амплифицирован на основе кольцевой кДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров мыши у1СН1 5'-АТООАОТТАОТТТОООСАОСАО-3' (8ЕО ГО N0:15) и олигонуклеотида мыши у1СН3 5'- ОСАСААССАССАТАСТОАОААО-3' (8ЕО ГО N0:16), который был подвергнут отжигу до получения константного участка антитела по методу М. 8а§8апо е! а1. (1994).

ПЦР проводят с использованием следующих условий: 40 с при температуре 94°С, 40 с при температуре 62°С, 1 мин при температуре 72°С, в течение 30 циклов.

Амплифицированные фрагменты клонируют непосредственно в векторе клонирования ПЦР11 с использованием набора для клонирования ТА с двойным праймером ПЦР11 ДпуЦтодеп, #К2050-01). Девять клонов, содержащих вариабельные участки легкой каппа-цепи, и семь клонов, содержащих вариабельные участки тяжелой гамма-цепи, секвенировали. Секвенирование проводили на оборудовании М\УО Вю!есЬ, Германия. Секвенируют обе цепи. Были получены ожидаемые результаты.

- 4 023679 δΌδ-ΡΛΟΕ анализ.

Антитело анализируют в 4-12% градиенте с использованием ΒίδΤήδ ΝιιΡΑΟΕ с помощью 1х МЕ8 в качестве буфера для анализа и окрашивают раствором кумасси-красителя (все реактивы получены от компании ΙηνίΙΐΌβοη. США) как в невосстановительных условиях, так и в восстановительных условиях.

Хроматографический профиль.

8Τ3232/10 прогоняли на колонке с Τ80Κ3000 (Τοδοίι Вю8С1еисе СшЬН, 81и11даг1, Германия) со скоростью потока 1 мл/мин при использовании в качестве буфера для элюции ΡΒ8 + ΝαΝ₃ 0,05%.

Трансфекция клеток.

Трансфекцию с использованием Τιυρ-1 или Τίορ-2 проводят по методу А1Ьегй 8 е! а1., 1988.

РАС5 анализ.

Связывание антитела 8Τ3232/10 с нативными молекулами Τίορ-1 на поверхности клеток анализируют методом проточной цитометрии на наборе линий клеток человека. Указанную реакцию проводят в 96-луночных планшетах с У-дном в виде двух стадий с использованием 3 х 10⁵ клеток на лунку. Клеточную суспензию вначале инкубируют с 1 мкг/лунку антитела 8Τ3232/10, затем с 2 мкл вторичного РЕ-конъюгированного противомышиного антитела (550589, ΒΌ Рйагт1п§еи, ЕгетЬобедет, Бельгия). На каждой стадии клетки инкубируют в течение 30 мин при температуре 4°С и промывают РВ8, содержащим 1% РС8. После окончательной промывки, клетки ресуспендируют в РВ8 для подготовки их к анализу с использованием прибора РАС8Аггау с использованием соответствующего программного обеспечения (ΒΌ Вю8шеисе8, ЕгетЬобедет, Бельгия). Другие Τίορ1, Τίορ2 или нерелевантные антитела используют в качестве контролей и к образцам добавляют 7-ААЭ (ΒΌ Β^08С^еηсе8, Ε^етЬούедет, Бельгия) (5 мкл/10⁶ клеток) для окрашивания с целью определения жизнеспособности.

Конфокальная микроскопия.

Линию клеток опухоли молочной железы МСР7 окрашивают с использованием Α1еxаί1иο^-488-меченого 8Τ3232/10 и анализируют с использованием конфокального микроскопа. Клетки МСР7 наносят на пластину размером 15 х 15 мм с покровными стеклами и фиксируют через 48 ч при инкубации в смеси ΡΒ8/4% параформальдегид в течение 30 мин при комнатной температуре. После пермеабилизации в течение 30 мин при комнатной температуре в 8М (10% сыворотка в ΡΒ8) с содержанием 0,05% сапонина, проводят инкубацию первичного антитела (1 мкг 8Τ3232-ΑΤ\;·ι488 в расчете на пластинку) в течение 30 мин при комнатной температуре в среде 8М+Сапонин. После 3 промывок в 8М, препарат закрывают покровными стеклами и проводят обследование под конфокальным микроскопом.

ЕЫ8А клеток.

96-луночный планшет вначале блокируют с использованием 200 мкл/лунку 1χΡΒ8 с 10% РС8 в течение 30 мин при температуре 37°С и затем высевают с плотностью 250000 клеток/лунку, плюс первичное антитело с достижением общего объема 100 мкл. Планшет инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С и затем промывают три раза 1 χ ΡΒ8 с 1% РС8 и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение нескольких секунд. Противомышиный 1§С, конъюгированный с щелочной фосфатазой (81дта А2429, разведение 1/1000), добавляют к комплексу первичное антитело-клетка и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре и затем, после пяти промывок, к каждой лунке добавляют по 200 мкл субстрата ρΝρρ (81дта А3496) и проводят инкубацию при температуре 37°С в течение 30 мин. Проводят окончательное центрифугирование планшетов и переносят 170 мкл супернатанта на новый планшет и подсчитывают поглощение при длине волны 405 нм в спектрофотометре для ЕЬ18А (8ЕАС 8ίήο 8).

Поверхностный плазмонный резонанс.

Аффинность 8Τ3232/10 для ЕрСАМ оценивают по процедуре поверхностного плазмонного резонанса (8ΡΚ, Βί;κοΐΌ X, ΒίίκοΐΌ, υρρ8а1а, Швеция) при проведении иммобилизации на чипе СМ5 внеклеточного домена коммерчески доступного химерного слитого белка Ρс-ΕρСΑΜ (Κ&Ό, США). Оценивают в рамках бивалентной модели кривые, полученные при инъекции 8Τ3232/10 в диапазоне концентраций 500-7,8 нМ (программное обеспечение Β^аеνа1иаΐ^οη 8οΠ\γа^е. версия 3.1, ΒίίκοΐΌ, υρρ8а1а, Швеция).

Иммуногистохимия.

Для определения степени селективности используют замороженные срезы из технологической лаборатории ΤΚΙ8ΤΑΚ (ΤΚ.Ι8ΤΑΚ ΤесЬηο1ο§у 1аЬο^аΐο^^е8 (США)), выполненные на основе 35 образцов из ткани рака легкого и 10 образцов ткани нормального легкого (Τού. # 49561006), 35 образцов из ткани рака толстой кишки-прямой кишки и 10 образцов из ткани нормальной толстой кишки (Τού. # 49561004), 35 образцов из ткани с раком яичника и 10 образцов из нормальной ткани (Τού. # 49561006) и слайдов, содержащих нормальную ткань (Τού. # 49561001). 8Τ3232/10 разбавляют до концентрации 5 мкг/мл с использованием блокирующего раствора (ΡΒ8+2,5% нормальной лошадиной сыворотки). Изотип сравнивают с отрицательным контролем, используя одинаковые копии микроскопических препаратов при такой же концентрации тестируемых элементов.

Препараты обрабатывают в соответствии с инструкцией производителя и выявляют связывание антитела при использовании набора Уес1а81аш АБС Е1йе Κίΐ ^ύ. ΡΚ6102 (УесЮг ^аЬο^аΐο^^е8). После гидратации ткани гасят активность эндогенной пероксидазы путем погружения препаратов в 0,3% раствор гидрогенпероксидазы на 5 мин. После промывки в ΡΒ8 в течение 5 мин в трехкратном повторе и блоки- 5 023679 рования среза образца путем обработки смесью РВ§+2,5% лошадиной нормальной сыворотки, добавляют первичное антитело, разбавленное блокирующим раствором до концентрации 5 мкг/мл, на 2 ч при комнатной температуре. После 3 промывок РВ§, препараты инкубируют со вторичным козьим противомышиным антителом, конъюгированным с биотином, в течение 30 мин и затем с комплексом авидинбиотин-пероксидаза в течение 30 мин. После дополнительной промывки, препараты инкубируют со свежим раствором ИАВ. входящим в субстратный набор УссЮг®® ИАВ/Νί (Са1. 8К-4100), в течение 2 мин и реакцию останавливают в водопроводной воде. Противоточное окрашивание проводят при погружении в гематоксилин Мейера на 10 с. В итоге, препараты подвергают дегидратации в 75%, 80%, 95% и 100% этаноле, каждый раз по 1 мин, осветляют ксилолом, наслаивают синтетический агент и исследуют под микроскопом.

Модель ίη νίνο: аллотрансплантат бестимусных голых мышей.

Линию клеток фибросаркомы Ь мыши, трансфицированную с использованием Тгор-1 (Ь/Тгор-1) или нетрансфицированную (Ь/вектор) человеческим Тгор-1, инъецируют подкожно мышам в трех группах, где указанные мыши представляют собой бестимусных голых мышей (10 животных/группа). В день инокуляции животным вводят 200 мкг 8Т3232/10 (Ь/вектор+8Т3232 и Ь/Тгор-1+8Т3232), эдреколомаб (Ь/Тгор-1+Рапогех) или неродственный 1дС мыши (Ь/вектор и Ь/Тгор-1). Три других введения осуществляют в дни 7, 15 и 22, как показано на чертеже стрелками. Во всех группах, рост опухоли оценивают при измерении циркулем на 50 день.

Модель ίη υΑό: ксенотрансплантат линии колоректальных клеток человека.

Линию клеток карциномы толстой кишки человека КМ12-8М, которая в нативном состоянии экспрессирует Тгор-1, трансплантируют подкожно голым мышам. Проводят четыре обработки, один раз в неделю, с использованием 200 мкг 8Т3232/10 (группа введения 8Т3232), М104 (группа введения М104) или носителя (контрольная группа введения), начиная со дня введения инокулята. Прогрессирование опухоли оценивают до 30 дня.

Результаты.

Последовательности 8Т3232/10 участков, определяющих комплементарность гипервариабельного домена тяжелой цепи (УН) и участков, определяющих комплементарность вариабельного домена легкой цепи (УЬ), показаны в табл. I.

Таблица I

Последовательности гипервариабельных участков УН и УЬ антитела 8Т3232/10

	Нуклеотидная последовательность	Аминокислотная последовательность
Вариабельный участок тяжелой цепи
СЛЕ1	А6СССТТАТТАСТ6СААС (ЗЕЙ ΙΠ 1)	3 С Υ Υ И Ν (ЗЕЙ ΙΠ 2)
СЛЕ2	ТАТАТАА6ТТАССАС6СТАСЕААТ ААСТАСААСССАТАТСТСАААААТ (ЗЕЙ ΙΠ 3)	ΥΙ5Υ06ΚΝΚΥΝΡΥ Ь К Η (ЗЕЙ 1Л 4)
СЛЕЗ	ССССТС565С6С6АТТАССАТССТ ТТ6САСТСС (ЗЕЙ 5)	АЬбЕЛУОАЬОС (ЗЕЙ 1Л 6,
Вариабельный участок легкой цепь
СЛЕ1	ААССТСАСТАТСАССТеСААЕТСС АбТСАСАбТСТСТТАААСАСТАбА АСТСААААСААСТАСТТСАСС (ЗЕЙ ΙΠ 7)	КУТМЗСКЗЗЙЗЬЬ N 3 К Е О К Ν Ϊ Ь Т (ЗЕЙ 1Л 8)
СЛЕ2	тссссатссастасссаатст (ЗЕЙ 1Л 9)	И А 5 Т К Е 3 (ЗЕЙ 1Л 10)
СЛЕЗ	САСААТСАТТАТАТТТАТССССТСАСС (ЗЕЙ 1Л 11)	й И Л Υ I Υ Р Ь Т (ЗЕЙ 1Л 12)

- 6 023679

Как было показано по результатам анализа в 8Ό8-ΡΑΟΕ и по картине хроматографического профиля (фиг. 1 и 2), 8Т3232/10 является гомогенным по составу легкой и тяжелой цепи. Фактически, антитело подвергают аналитическому разделению в электрофорезе в тройном повторе в градиенте 4-12% Βίδ-Τπδ ΝηΡΑΟΕ с использованием 1 х ΜΕ8, в качестве буфера для разделения, и окрашивания раствором кумасси-красителя (все реактивы от компании 1пуйтодеи, США), при этом, анализ в невосстановительных условиях (линии 1-3) выявил полосу с ожидаемой молекулярной массой (150 кДа) . В восстановительных условиях (линии 4-6) выявлялись лишь две полосы, соответствующие тяжелой (50 кДа) и легкой (25 кДа) цепям, и, таким образом было продемонстрировано отсутствие других контаминирующих продуктов. Этот результат был подтвержден хроматографическим профилем, где был элюирован единственный гомогенный пик при анализе 8Т3232/10 на колонке Т80К3000 (фиг. 2).

Специфичность 8Т3232/10 для представителей семейства ЕрСАМ оценивали при проведении анализа РАС8 с использованием на линии клеток мыши, не экспрессирующих данный антиген, которые были трансфицированы ЕрСАМ (ТКОР-1) или высоко гомологичной молекулой ТК.ОР2. Как видно из фиг. 3, 8Т3232/10 обладает специфичностью в отношении ЕрСАМ, поскольку реагирует только с Тгор-1-положительными клетками (панель А) и не реагирует с Тгор-1-отрицательными клетками, такими как Ь-клетки (панель О) или Ь-Ттор2 клетки (панель Ό). Аналогичный результат наблюдался с другими ЕрСАМ-специфичными антителами (панели В, Е, Н: М104; С, I: НТ29/26). В случае ТРОР2-Б клеток в качестве положительного контроля было использовано антитело Т16 (панель Р).

Дополнительно, 8Т3232/10 обладал сравнимой связывающей активностью для других ЕрСАМ антител, таких как М104 (К1еш СЕ. е1 а1., 1990). Было продемонстрировано эффективное распознавание нативного антигена при проведении цитофлуорометрического анализа на панели линий раковых клеток, где наблюдались разные уровни ЕрСАМ молекул (табл. II).

Таблица II

Результаты анализа РАС8, проведенного на панели линий опухолевых клеток различного происхождения с использованием 8Т3232/10 или М104 антиТКОР-1 антитела

++++ 100% положительные, +++ > 90% положительные, ++ > 50% положительные, + > 20% положительные, +/- < 15% положительные - отрицательные, пб = не определяли

- 7 023679

Линию клеток опухоли молочной железы МСР7 окрашивают А1ехайиог-488-меченым 8Т3232/10 и анализируют под конфокальным микроскопом (фиг. 4). Конъюгат А1еха488-8Т3232/10 демонстрирует ожидаемую картину окрашивания, при этом наибольшая интенсивность отмечается на границах клеткаклетка, а также выявляется окрашивание изолированных пятен (два примера показаны на фиг. 4А и В).

Иммунореактивность 8Т3232/10 оценивают по процедуре клетка-ЕЬ18А, в сравнении с другими доступными анти-ЕрСАМ антителами, на линиях опухолевых клеток, которые в естественном состоянии экспрессируют ЕрСАМ или которые трансфицированы человеческим транскриптом. В качестве репрезентативного примера, на фиг. 5 показаны результаты оценки 8Т3232/10 по процедуре клетка-ЕЬ18А на линии клеток карциномы толстой кишки человека НТ29/26 (К1еш СЕ е( а1., 1990), при использовании анти-ЕрСАМ антител. Показано, что 8Т3232/10 способен связываться с экспрессируемым клетками НТ29, в природном состоянии, ЕрСАМ зависимым от дозы образом. В рамках данного теста, НТ29/26, по всей видимости, связывается с ЕрСАМ с более высокой аффинностью, чем 8Т3232/10, как и другие антитела (данные не показаны).

Аффинность 8Т3232/10 для ЕрСАМ оценивали по процедуре поверхностного плазмонного резонанса (8РК). Кривые, полученные при инъекции 8Т3232/10 в диапазоне концентраций 500-7,8 нМ, оценивают в рамках бивалентной модели (фиг. 6А), при этом была продемонстрирована хорошая сочетаемость с данными анализа сЫ² (1,97) и остаточными значениями <10% от наивысшего значения КИ (140), зарегистрированного в данном эксперименте (фиг. 6В). Значение К_с для 8Т3232/10 составило 9,3Е-10 (к_оп,= 7,75Е±04±297; к_ой=7,2Е-05±8,48Е-06). Аффинность 8Т3232/10 для ЕрСАМ была в 274 раза выше, чем выявленная при использовании 8РК аффинность эдреколомаба (К_с 2,55Е-07, ИаипбогР е( а1, 2002), тогда как для других анти-Тгор-1 антител в литературе отсутствовала какая-либо информация относительно их аффинности.

Что касается интернализации 8Т3232/10, был проведен тест с использованием РАС8 при инкубации антитела с ЕрСАМ-экспрессирующей клеточной линией при температуре 4°С и затем полученный комплекс был перенесен в условия температуры 37°С, где выдерживался в течение 30-120 мин. Не было выявлено различий по проценту положительных клеток или по среднему значению интенсивности флуоресценции инкубированных при температуре 37°С образцов относительно контрольного образца при температуре 4°С (табл. III), что указывало на отсутствие интернализации комплекса ЕрСАМ/антитело.

Таблица III

Оценка интернализации 8Т3232/10 в клеточной линии ЬоУо

Селективность 8Т3232/10 также была исследована по процедуре иммуногистохимического анализа на микрочипах со срезами тканей, репрезентативных для нескольких твердых опухолей и нормальных тканей. Результаты обобщены в табл. IV и V, и соответствующие примеры проиллюстрированы на фиг. 7.

Таблица IV

Реактивность 8Т3232/10 на опухолях

	Число случаев	Положительный результат (%)
Легкое	32	19 (59,3%)
Толстая кишка	34	32 (94,1%)
Яичник	35	31 (88,6%)
Общее число исследованных	101	82 (81,2%)
тканей

- 8 023679

Таблица V

Реактивность 8Т3232/10 на нормальных тканях

	Число случаев	Положительный результат (%)
Легкое	8	1 (12,5%)
Толстая кишка	8	5 (62,5%)
Яичник	8	0 (0%)
Общее число исследованных тканей	24	6 (25,0%)

Криостатические препараты тканей солидного рака часто встречаемого типа (табл. IV) оценивают в сравнении с препаратами тканей соответствующего гистотипа нормальных органов (табл. V). Показано, что 8Т3232/10 способно связываться практически со всеми тестируемыми образцами тканей рака толстой кишки (94,1%) и карциномы яичника (88,6 %) и с большей частью препаратов ткани карциномы легкого (59,3%). Селективность 8Т3232/10 в отношении раковых клеток крайне высока для образцов тканей яичников, где ни один из образцов нормальной ткани не прореагировал с антителом, тогда как 88,6% опухолевых образцов были положительны в отношении 8Т3232/10. Кроме того, 8Т3232/10 прореагировал с более высокой частотой с достижением более сильного окрашивания с раковыми клетками относительно нормальных клеток в опухолях другого типа. Селективность для опухолей толстой кишки и легкого, в сравнении с нормальными тканями, продемонстрирована на фиг. 7, где показана явно положительная реакция на образцах опухолевой ткани, для которой характерна сверхэкспрессия ЕрСАМ, и отсутствие окрашивания нормальных тканей.

Были использованы две разных модели животных для исследования активности антител ίη νίνο в отношении опухолевого роста. В первом эксперименте, в трех группах бестимусных голых мышей (10 животных на группу) проводили подкожную (п/к) трансплантацию линии клеток мышиной фибросаркомы Ь-йТгор-1 и далее им вводили 8Т3232/10. эдреколомаб или не родственный мышиному 1§О, один раз в неделю (200 мкг на мышь) в течение 4 недель, начиная с дня инокуляции. Ь клетки, не трансфицированные ЕрСАМ, были трансплантированы мышам в двух дополнительных группах и затем животным вводили 8Т3232/10 или контрольное антитело. Как показано на фиг. 8, ЕрСАМ-экспрессирующая опухоль (Ь/Тгор) характеризуется более быстрым развитием, в сравнении с нетрансфицированными опухолями (Ь/вектор или Ь/вектор + 8Т3232). Дополнительно, 8Т3232/10 полностью и постоянно ингибировало рост ЕрСАМ-экспрессирующей опухоли и не препятствовало росту ЕрСАМ-отрицательных опухолей. С другой стороны, эдреколомаб (Рапогех) также влиял на рост ЕрСАМ-экспрессирующей опухоли. Однако, опухоль продолжала быстро расти при прерывании лечения эдреколомабом.

Вторая модель животных включала голых мышей, которым вводили ксенотрансплантат линии колоректальных клеток человека КМ128М и которые были использованы для подтверждения и дальнейшего развития полученных результатов. Указанным мышам вводили 8Т3232/10, мышиный 1§О и другие анти-ЕрСАМ антитела, М104, с использованием доз и режимов, идентичных таковым, описанным в предыдущем эксперименте (табл. VI, фиг. 9). Как показано в табл. VI, уровень образования опухоли у животных в группе введения 8Т3232/10 была ниже (56%), чем у животных в двух других группах (90-100%).

Таблица VI

Дополнительно, как видно из фиг. 9, 8Т3232/10 снижало рост опухоли и повышало латентность в развитии опухоли в сравнении с животными в других группах. Приведенные результаты поддерживают предположение относительно непосредственного терапевтического эффекта 8Т3232/10, который отличается от простого связывания с целевой молекулой.

- 9 023679

Список литературы

А1Ьетй 8 е! а1., 1988, ΡΝΆ8 85: 8391-8394 Вигак АЕ 1т е! а1., 2001, Типюп 87: 142-146 С1апГйдЦа М. е! а1., 1986, Мейюйз Еп/утоЕ 121: 193210 Ие Вопо 18 е! а1., 2004, С1т Сапсег Кез 10: 7555-7565 Όί Мазз1то А.М. е! а1., 1997, Вг 1 Сапсег 75: 822-828 Реттег С е! а1., 1996, 1. Вю1есЬпо1. 52: 51-60 Ртойш 1Е е! а1.,

2002, НуЬпй НуЬпйотюз 21: 99-101 СозНогп 8 е! а1., 2001, Сапсег Вю! Кайюрйатт 16: 109-123 К1еш СЕ е! а1., 1990, 1 1пуез! Иетта!о1 95: 74-82. №шпйогГ 8 е! а1., 2002, 1п! 1 Сапсег 100:101-110 ОЬегпейег К е! а1., 2006, Еиг 1 Сапсег 42: 2530-8 О1й, Ы, 1996, 8с Ат 275: 136-143. РадапеШ е! а1., 1999, Еиг 1 №с1 Мей 26: 348-357 Рагеп!е Ό. е! а1., 1997, Апйсапсет КезеатсЬ 17: 4073-4074 Раи1, А. Е., Рипйатеп!а1 1ттипо1оду, Кауеп Ргезз, ΝΥ, Ν.Υ. 1993, сйар!ег 23;

РетсЬе! МЬ. е! а1., 1999, 1. 1ттипо1., 163: 4421-4426;

Ргапд N е! а1., 2005, Вг 1 Сапсег 92: 342-9;

Рип! С1 е! а1., 2002, Ьапсе! 360: 671-7;

К1е!Ьти11ег С е! а1., 1998, 1 С1ш Опсо1 16: 1788-1794;

8аззапо е! а1., 1994, №с1ею Лайз Кез 22: 1768-1769;

8р|//о С е! а1., 2004, Вгеаз! Сапсег Кез Тгеа! 86: 207-213 Уе1йетз е! а1., 1998, Вг 1 Сапсег 78: 478-483 Аешет ЬМ е! а1., 1993, 1 1ттипо!Ьет 13:110-116 Аеп! е! а1., 2006, Вг 1 Сапсег, 94: 128-35 Ат!ет М1 е! а1.,

2003, Л1Р 163: 2139-2148.

- 10 023679

Список последовательностей

- 11 023679 <400> 3

Са£ аЬа аде Ьас дас ддс адд ааС аад Сас аае сса ЬаЬ сСс ааа аае 48

Туг Не Зег Туг Азр О1у Агд Азп Ьуз Туг Азп Рго Туг Ьеи Ьуз Азп 15 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> Велок <2]3> Искусетвенная <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 4

Туг Не Зег Туг Азр С1у Агд Азп Ьуз Туг Азп Рго Туг Ьеи Ьуз Азп 15 10 15 <210> 5 <211> 33 <?]2> ДНК <2 ] 3> Искусственная <220>

<223> синтетический СОНЗ УН <220>

<221> сиз <222> (1)..(33) <4 0 0> 5 дсс с£с ддд ддд даЬ Рас да! дсС ££д дас Сдс А1а Ьеи С1у С1у Азр Туг Азр А1а Ьеи Азр Суз 15 10 с210> 6 ^211> И <212> Гулок <213> Искусственная <220>

<223> Синтетическая конструкция <40С> 6

А1а Ьеи <31у 51у Азр Туг Азр А1а Ьеи Азр Суз 1 5 10 <ς210> Ί <211> 69 <Д.2> ДНК а1 3 > Искусственная <220>

<223> синтетический СОЕ1 УЬ <220>

<221> СОЗ

- 12 023679 <222; (1)..(69) <400? 7

аад д£с Ьуз А/а1 1

асС ТНг

аСд аде

Ьдс Суз

аад Ьуз

Ссс Зег

адС Зег

сад аде С1п Зег 10

сСд Ьеи

ЬСа Ьеи

аас аде Азп Зег 15

ада Агд

МеЬ

Зег 5

адь

саа

аад

аас

Сас

ССд

асе

Бег

С1п

Ьуз

Авп

Туг

Ьеи

ТЬг

20

<210>	5
<211>	23
<212>	УЛ? ГЮК
··.:·]·'?	Искусственная
<220>
<223>	Синтетическая конструкция
<4С0>	8
Ьуз Уа1	ТНг Меь Зег Суз Ьуз Зег Зег	С1п Зег	Ьеи Ьеи Азп Зег Агд
1	5	10	15

Зег С1п Ьуз Азп Туг Ьеи ТЬг 20 <210? 9 <211? 21 <212> ДНК <21 3> Искусственная <220?

<223? синтетический СЬК2 \/Ь <220?

<221? СОН <222? (1) , ,(21) <400? 9

Сдд дса Ссс асС адд даа СсС 21

Тгр А1а Зег ТНг Агд (31и Зег 1 5 <210? 10 <211? 7 <212? Ьелок <?13? Искусственная <220?

<223? Синтетическая конструкция <400? 10

Тгр А1а Зег ТНг Агд С1и Еег 1 5 <210? 11

- 13 023679 <211 = 27 ίν·' лик /13 = Искусственная <220 = <223 = синтетический ΟϋΚ3 УЪ

<220 =
<221 =	спз
<222 =	(1) ·	. (27)
<400 =	11
сад аа!	да!	Сак нс':	раЪ	сед	сЬс	асд	27
С1п Азп	Азр	Туг Не	Туг	Рго	Ъеи	ТЬг

1	5
<210 =	12
<211 =	9
<212 =	Вело к
<2.1 3 =	Искусственная
<220 =
<223>	Синтетически« конструкция
<400>	12

С1п Аеп Азр Туг Не Туг Рго Ъеи ТЬг 1 5 <210 = 13 <211=· 20 <7127 ДИК · 21 Н > Искусственная <220 = <223> синтетический праймер <400=· 13 сдссаададс ЪСсаасадда 20 <210 = 14 <211 = 20

-.212= ЛИК <213= Искусственная <220 = <223=· синтетический праймер <400=· 14 аадасддаса садСГддъдс 20 <210> 15 <211= 22 <212= ДНК <713.= Искусственная <220 = <223= синтетический праймер

- 14 023679 <4С0.= 15 аЬддадьеад ЬСЬдддсадс ад 22 <210> 16 <211> 22 ДНК <213⁵ Искусственная < 22 0 >

<223 > синтетический праймер <400> 16 дсасаассас саЬасЬдада ад 22

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Анти-ЕрСАМ антитело или его функционально активный фрагмент, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит все три гипервариабельных участка (СИК) с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:4 или 8ЕЦ ГО N0:6, а вариабельная область легкой цепи антитела содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (СИК) с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:8, 81Т) ГО N0:10 или 81Т) ГО N0:12.
2. Анти-ЕрСАМ антитело или его функционально активный фрагмент по п.1, которое способно полностью и постоянно ингибировать рост опухолей, экспрессирующих ЕрСАМ.
3. Анти-ЕрСАМ антитело по любому из пп.1, 2, которое представляет собой моноклональное антитело.
4. Анти-ЕрСАМ антитело по п.3, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной в Центре биотехнологии (Абуаисеб Вю1есЬпо1оду СсШсг. Генуя, Италия) с номером доступа РИ06004.
5. Анти-ЕрСАМ антитело или его фрагмент по п.2, представляющее собой 8сРу, Εν фрагмент, РаЬ фрагмент, Р(аЬ)₂ фрагмент, мультимерное антитело, пептид или протеолитический фрагмент, содержащий эпитоп-связывающий участок.
6. Анти-ЕрСАМ антитело по п.5, отличающееся тем, что химерный белок представляет собой химерный белок, состоящий из участков антитела человека и мыши.
7. Анти-ЕрСАМ антитело по п.2, отличающееся тем, что антитело представляет собой химерный белок, слитый с цитокином, белком из семейства авидинов, биотином, меченым биотином или другими эффекторными белками, или соединен с маркером для визуализации.
8. Анти-ЕрСАМ антитело по п.2, где антитело представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело.
9. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антитело или его функционально активный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с указанной выше последовательностью нуклеиновой кислотой в жестких условиях, или последовательность нуклеиновой кислоты, полученная на основе указанной в соответствии с принципом вырожденности генетического кода.
10. Нуклеиновая кислота по п.9, содержащая по меньшей мере одну из следующих последовательностей: 81Т) ГО N0:1, 81Т) ГО N0:3, 81Т) ГО N0:5, 81Т) ГО N0:7, 81Т) ГО N0:9 и 81Т) ГО N0:11.
11. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.9 или 10.
12. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.11.
13. Гибридомная клеточная линия, продуцирующая анти-ЕрСАМ антитело по пп.1-3.
14. Гибридомная клеточная линия по п.13, представляющая собой гибридому, депонированную в Центре биотехнологии в Генуе (Абνаηсеб Вю1есЬпо1оду СсШсг, Генуя, Италия) с номером доступа РИ06004, продуцирующая моноклональное антитело по п.8.
15. Применение анти-ЕрСАМ антитела по пп.1-8 в качестве лекарственного средства для лечения опухоли.
16. Применение анти-ЕрСАМ антитела по п.15, где опухоль выбрана из группы, состоящей из карциномы толстой кишки, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы яичника, карциномы мочевого пузыря или карциномы легкого.
17. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли, содержащая эффективное количество антитела или его фрагментов по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
18. Фармацевтическая композиция по п.17, используемая при радиоиммунотерапии.
19. Фармацевтическая композиция по п.17 или 18, содержащая по крайней мере еще одно опухолеспецифическое антитело в той же или в стандартной дозе.
20. Фармацевтическая композиция по п.19, отличающаяся тем, что опухолеспецифическое антитело

- 15 023679 представляет собой ЕрСАМ антитело, отличное от антитела по пп.1-8.
21. Применение анти-ЕрСАМ антитела по пп. 1-8 в качестве средства для диагностики опухолей.
22. Применение анти-ЕрСАМ антитела по п.21 в качестве средства для диагностики опухолей ίη У1Уо.
23. Растворимая композиция для инъекции для проведения опухолевой диагностики ίη У1уо, содержащая анти-ЕрСАМ антитело по п.22.
24. Способ иммунодетекции в образце антигена, способного связываться с антителом или его фрагментом по любому из пп.1-7, включающий стадию инкубации в соответствующих условиях данного образца с антителом или его фрагментом по пп.1-8 и последующую детекцию комплекса антиген-антитело.
25. Диагностический набор для использования в способе по п.24, включающий антитело или его фрагмент по любому из пп.1-8 и средство детекции комплекса антиген-антитело.