KR102208698B1 - 신생아 Fc 수용체에 대해 향상된 결합을 지니는 변이체 Fc-폴리펩타이드 - Google Patents

신생아 Fc 수용체에 대해 향상된 결합을 지니는 변이체 Fc-폴리펩타이드 Download PDF

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마크 더블유. 레터
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Abstract

대조군 Fc-단편에 비해 pH 5 내지 6에서 더 높은 친화도 및/또는 더 높은 결합 활성 및 생리적 pH에서 거의 동일하거나 또는 더 낮은 친화도로, 즉 생리적 pH에서 결합 활성이 거의 또는 전혀 없는 신생아 Fc-수용체(FcRn)에 결합되는 루프 내이거나 또는 인접한 삽입을 함유하는 변이체 Fc-단편이 본 명세서에 기재된다. 또한 이들 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 기재된다. 추가로 이러한 Fc-단편을 제조하고 확인하는 방법 및 이러한 Fc-폴리펩타이드를 제조하고 사용하기 위한 방법이 기재된다.

Description

신생아 Fc 수용체에 대해 향상된 결합을 지니는 변이체 Fc-폴리펩타이드{VARIANT FC-POLYPEPTIDES WITH ENHANCED BINDING TO THE NEONATAL FC RECEPTOR}
우선권
본 출원은 2011년 12월 21일, 2012년 1월 12일 및 2012년 11월 21일에 각각 출원된 미국 가특허 출원 제61/578,780호, 제61/585,993호 및 제61/729,050호의 우선권을 주장하며, 이들 기초출원은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 대조군 Fc-단편에 비해 더 높은 친화도 및/또는 더 큰 결합 활성으로 신생아 Fc 수용체에 결합되는 변이체 Fc-단편을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 폴리펩타이드를 단리시키고, 제조하며, 사용하는 방법에 관한 것이다.
치료적 단클론성 항체는 다양한 질병에 대한 치료로서 성공적으로 사용되었다. 항체의 상대적으로 긴 생체내 반감기는 항체의 Fc 영역과 신생아 Fc-수용체(FcRn)의 상호작용에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. 예를 들어, 문헌[Ghetie et al. (1996), Eur. J. Immunol. 26: 690 내지 96] 참조. FcRn은 6.0 이하의 pH에서 나노몰 친화도(KD
Figure 112014066923892-pct00001
100nM)로 IgG 항체의 Fc 영역에 결합되지만, 혈액의 pH, 즉, 약 pH 7.4에서 결합되지 않는다. 문헌[Tesar and
Figure 112014066923892-pct00002
(2001), Curr. Opin. Struct. Biol. 20(2): 226-233]. 세포에 의한 항체의 내재화(internalization) 시, 예를 들어 음세포작용 시, IgG는 엔도솜의 산성 환경에서 FcRn에 의해 결합될 수 있다. 이하 참조. 엔도솜 내에서 FcRn에 의해 결합될 때, IgG는 엔도솜 내에서 디폴트 이화작용 경로(default catabolic pathway)로 들어가는 것과 반대로, 세포 표면으로 다시 향할 것이다. 이하 참조. 세포 표면에서 일반적으로 생리적 pH 환경에서, IgG는 FcRn으로부터 해리될 것이고, 순환으로 재유입될 것이다. 이 과정은 항체가 엔도솜 내 세포에서 분해되는 것과 반대로, 세포 내에서 내재화 후 순환으로 되돌아가게 한다.
투약량 및/또는 빈도를 감소시키기 위해 증가된 생체내 반감기를 지니는 치료적 항체에 대한 당업계의 필요가 있다. 이러한 항체는 증가된 환자 편의 때문에 유리하며, 따라서 또한 환자 순응도가 증가될 수 있고/있거나 비용이 감소될 수 있다. 기존의 가격에 민감한 건강관리 환경에서, 비용은 치료적 제품의 실용적 이용성에서 결정인자가 될 수 있다.
약간 산성인 pH에서 대조군 Fc-단편보다 더 큰 친화도 및/또는 더 큰 결합 활성으로 FcRn에 결합되고, 생리적 pH에서 대조군 Fc-단편보다 더 낮거나 또는 거의 동일한 친화도로, 즉, 결합 활성이 거의 없거나 전혀 없이 FcRn에 결합되는 변이체 Fc-단편이 제공된다. 또한 변이체 Fc-단편뿐만 아니라 표적 분자에 결합되는 결합 영역을 함유하는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 제공된다. 본 명세서에서 상기 언급한 결합 특성을 지니는 변이체 Fc-단편을 함유하는 변이체 Fc-폴리펩타이드는 또한 대조군 Fc-폴리펩타이드보다 생체내 반감기가 더 길다는 것이 입증된다. 추가로 이들 Fc-단편 및 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 이들 핵산을 사용하여 이들 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 또한 Fc-폴리펩타이드의 생체내 반감기를 연장하기 위한 방법 및 pH 5 내지 6에서 더 큰 친화도로 FcRn에 결합되고, 생리적 pH에서 대조군 Fc-단편에 비해 유사하거나 또는 더 낮은 친화도로 FcRn에 결합되는 변이체 Fc-단편을 확인하기 위한 방법이 또한 포함된다.
본 명세서에서 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 기재되되, 변이체 Fc-단편은 변이체 Fc-단편의 루프 5, 8 및/또는 10 내이거나 또는 인접한 3 내지 20, 10 내지 20, 20 내지 40, 40 내지 60, 또는 60 내지 80 아미노산의 삽입을 포함하되, 변이체 Fc-폴리펩타이드는, 루프 5, 8, 및/또는 10 내에서 또는 이들에 인접한 삽입을 함유하지 않는 것을 제외하고 약 5.0 내지 약 6.0의 pH에서 및/또는 약 5.0, 5.2, 5.5, 5.7 또는 6.0의 pH에서 변이체 Fc-폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가지는 대조군 Fc-폴리펩타이드보다 더 높은 친화도 및/또는 더 높은 결합 활성으로 인간 신생아 Fc-수용체(hFcRn)에 결합되며, 생리적 pH에서 및/또는 약 7.4, 7.5 또는 7.6의 pH에서 변이체 Fc-폴리펩타이드는 대조군 Fc-폴리펩타이드에 비해 거의 동일하거나 또는 더 낮은 친화도 또는 결합 활성으로, 즉, 결합 활성이 거의 없거나 또는 전혀 없이 인간 신생아 Fc-수용체(hFcRn)에 결합된다. 변이체 Fc-단편 내이거나 또는 인접한 삽입은 적어도 6개 아미노산 길이, 25개 이하의 아미노산 길이, 6 내지 16개 아미노산 길이, 및/또는 적어도 12개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 삽입은 메티오닌 및/또는 트립토판 잔기를 함유하지 않는다. 변이체 Fc-단편 내이거나 또는 인접한 삽입은 처음 4개의 삽입된 아미노산 중에서 적어도 하나의 시스테인 및 최종 4개의 삽입된 아미노산 중에서 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 선택적으로, 삽입은 처음 또는 마지막 4개의 삽입 아미노산에서 생기는 임의의 시스테인 잔기 이외의 시스테인 잔기가 없을 수 있다. 일부 실시형태에서, 삽입은 표 1에서 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용하여 변이체 Fc-단편의 루프 10, 선택적으로 변이체 Fc-단편의 아미노산 384 내지 385 내이거나 또는 인접한다. 삽입은 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 383 내지 387 내일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 인간 Fc-단편 내 삽입은 표 1에서 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 382 내지 383, 383 내지 384, 385 내지 386, 386 내지 387, 387 내지 388, 388 내지 389, 389 내지 390, 또는 390 내지 391일 수 있다. 대안적으로, 아미노산 384 내지 386은 결실될 수 있고, 삽입은 표 1에 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 383 내지 387일 수 있다. 변이체 Fc-단편 내 삽입은 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 90 내지 356 및 359 내지 379 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 변이체 Fc-단편 내 삽입은 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 41 내지 67; 서열번호 90 내지 246; 서열번호 247 내지 356; 서열번호 367, 369, 372, 373 및 375 내지 379; 서열번호 41 내지 53, 67, 90 내지 162, 90 내지 163, 165 내지 215, 164 내지 214, 217 내지 247, 216 내지 246, 359 내지 379 및 392 내지 399, 401 내지 409, 411 내지 426, 428 내지 439, 441 내지 447, 449 내지 453, 456, 459, 461, 464, 및 470, 475, 477 내지 489, 491 내지 496 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 9; 서열번호 164, 252 및 490의 아미노산 4 내지 10, 및 서열번호 215 또는 216의 아미노산 4 내지 8; 서열번호 248 내지 288, 290 내지 306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465 내지 469, 471 내지 474, 및 476 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 11; 서열번호 289 또는 307의 아미노산 4 내지 12; 및 서열번호 308 내지 341 및 343 내지 356 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 13.
본 명세서에서 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 추가로 기재되되, 변이체 Fc-단편은 루프 10 내이거나 또는 인접한 3 내지 20, 10 내지 20, 20 내지 40, 40 내지 60, 또는 60 내지 80 아미노산의 삽입을 포함하고, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 루프 10 내에 또는 인접한 삽입을 함유하지 않는 것을 제외하고 변이체 Fc-폴리펩타이드와 동일한 대조군 Fc-폴리펩타이드보다 약 5.0 내지 약 6.0 범위의 pH에서 및/또는 약 5.0, 5.2, 5.5, 5.7 또는 6.0의 pH에서 더 높은 친화도 및/또는 더 높은 결합 활성으로 hFcRn에 결합되며, 생리적 pH에서 및/또는 약 7.4, 7.5 또는 7.6의 pH에서 변이체 Fc-폴리펩타이드는 대조군 Fc-폴리펩타이드에 비해 거의 동일하거나 또는 더 낮은 친화도 또는 결합 활성으로, 즉, 결합 활성이 거의 없거나 또는 전혀 없이 hFcRn에 결합된다. 삽입은 적어도 6개 아미노산 길이일 수 있고, 25개 이하의 아미노산 길이일 수 있으며, 6 내지 16개 아미노산 길이일 수 있고, 적어도 12 아미노산 길이일 수 있으며/있거나 처음 4개의 삽입 아미노산 중에서 적어도 하나의 시스테인 및 마지막 4개의 삽입 아미노산 중에서 적어도 하나의 시스테인을 함유할 수 있다. 삽입은 삽입 내 다른 위치에서 시스테인 잔기가 없을 수 있다. 삽입은 메티오닌 및/또는 트립토판 잔기가 없을 수 있다. 변이체 Fc-단편 내 삽입은 EU 넘버링 시스템에 따라 아미노산 383 내지 387 내일 수 있다. 변이체 Fc-단편 내 삽입은 표 1에 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 382 내지 383, 383 내지 384, 384 내지 385, 385 내지 386, 386 내지 387, 387 내지 388, 388 내지 389, 389 내지 390, 또는 390 내지 391일 수 있다. 대안적으로 EU 넘버링 시스템을 사용하여, 아미노산 384 내지 386은 결실될 수 있고, 삽입은 아미노산 383 내지 387에서 일어날 수 있다. 변이체 Fc-단편 내 삽입은 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 90 내지 356, 359 내지 379, 및 392 내지 496 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 변이체 Fc-단편 내 삽입은 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: 서열번호 41 내지 67; 서열번호 90 내지 246; 서열번호 247 내지 356; 서열번호 367, 369, 372, 373, 및 375 내지 379; 서열번호 41 내지 53, 67, 90 내지 162, 90 내지 163, 165 내지 215, 164 내지 214, 217 내지 247, 216 내지 246, 359 내지 379 및 392 내지 399, 401 내지 409, 411 내지 426, 428 내지 439, 441 내지 447, 449 내지 453, 456, 459, 461, 464 및 470, 475, 477 내지 489, 491 내지 496 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 9; 서열번호 164, 252 및 490의 아미노산 4 내지 10, 및 서열번호 215 또는 216의 아미노산 4 내지 8; 서열번호 248 내지 288, 290 내지 306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465 내지 469, 471 내지 474, 및 476 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 11; 서열번호 289 또는 307의 아미노산 4 내지 12; 및 서열번호 308 내지 341 및 343 내지 356 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 13. 변이체 Fc-폴리펩타이드 비항체 폴리펩타이드를 포함하는 변이체 Fc 융합 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서, 변이체 Fc 융합 단백질에 대한 대조군 Fc 융합 단백질은 알레파셉트, 릴로나셉트, 아플리버셉트, 에타네르셉트, 로미플로스팀, 또는 아바타셉트일 수 있다. 다른 실시형태에서, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 임의의 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있고, 또한 제1 중쇄 불변 영역(CH1) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 (a) VH 영역, 제1 중쇄 불변 영역(CH1), 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함하는 중쇄, 및 (b) VL 영역 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 1가일 수 있다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 다이머일 수 있거나 또는 테트라머일 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 변이체 Fc-단편을 암호화하는 핵산뿐만 아니라 변이체 Fc-단편의 루프 내이거나 또는 인접한 삽입이 본 명세서에 기재된다. 또한 이러한 핵산을 함유하는 숙주 세포가 기재된다. 또한 (a) 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편을 암호화하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계, (b) 핵산이 발현되는 조건 하에서 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양시키는 단계, 및 (c) 배양 배지 또는 세포 덩어리로부터 발현된 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편을 회수하는 단계를 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 변이체 Fc-단편의 제조 방법이 고려되되, 변이체 Fc-단편, 또는 변이체 Fc-단편을 함유하는 변이체 Fc-폴리펩타이드는 변이체 Fc-단편의 루프 5, 8, 및/또는 10 내이거나 또는 인접한 3 내지 20, 10 내지 20, 20 내지 40, 40 내지 60, 또는 60 내지 80 아미노산의 삽입을 포함하며, 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편은 약 5.0 내지 약 6.0 범위의 pH에서 및/또는 약 5.0, 5.2, 5.5, 5.7 또는 6.0의 pH에서 대조군 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편보다 더 높은 친화도 또는 더 높은 결합 활성으로 hFcRn에 결합되고, 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편은 생리적 pH에서 및/또는 약 7.4, 7.5 또는 7.6의 pH에서, 대조군 Fc-폴리펩타이드 또는 대조군 Fc-단편에 비해 거의 동일 또는 더 낮은 친화도 또는 결합 활성으로, 즉, 결합활성이 거의 없이 또는 전혀 없이 인간 신생아 Fc-수용체(hFcRn)에 결합된다.
또한 (a) 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편을 암호화하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계, (b) 핵산이 발현되는 조건 하에서 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양시키는 단계, 및 (c) 배양 배지 또는 세포 덩어리로부터 발현된 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편을 회수하는 단계를 포함하는 본 명세서에 기재된 변이체 Fc-단편 또는 Fc-폴리펩타이드 중 어떤 것을 제조하기 위한 방법이 기재된다.
추가 실시형태에서, 본 명세서에서 다음의 단계: 삽입을 위해 루프 5, 8, 및/또는 10 내이거나 또는 인접한 부위를 선택하는 단계; 및 선택된 부위 내로 펩타이드를 삽입하는 단계를 포함하는 인간 IgG Fc-단편을 포함하는 Fc-폴리펩타이드의 반감기를 연장시키기 위한 방법이 기재되되, 펩타이드는 서열번호 41 내지 67; 서열번호 90 내지 246; 서열번호 247 내지 356; 서열번호 367, 369, 372, 373, 및 375 내지 379; 서열번호 41 내지 53, 67, 90 내지 162, 90 내지 163, 165-215, 164 내지 214, 217 내지 247, 216 내지 246, 359 내지 379 및 392 내지 399, 401 내지 409, 411 내지 426, 428 내지 439, 441 내지 447, 449 내지 453, 456, 459, 461, 464 및 470, 475, 477 내지 489, 491 내지 496 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 9; 서열번호 164, 252 및 490의 아미노산 4 내지 10, 및 서열번호 215 또는 216의 아미노산 4 내지 8; 서열번호 248 내지 288, 290 내지 306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465 내지 469, 471 내지 474 및 476 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 11; 서열번호 289 또는 307의 아미노산 4 내지 12; 및 서열번호 308 내지 341 및 343 내지 356 중 어느 하나의 아미노산 4 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 선택된 부위는 루프 10 내이거나 또는 인접할 수 있고, 삽입 부위는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 아미노산 384 내지 385일 수 있다. 삽입 부위는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 383 내지 387 내일 수 있다. 변이체 Fc-단편 내 삽입은 표 1에 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 382 내지 383, 383 내지 384, 384 내지 385, 385 내지 386, 386 내지 387, 387 내지 388, 388 내지389, 389 내지 390, 또는 390 내지 391일 수 있다. 대안적으로 아미노산 384 내지 386은 결실될 수 있고, 삽입은 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 383 내지 387에서 일어날 수 있다.
본 명세서에서 하기 단계를 포함하는, 대조군 Fc-폴리펩타이드에 비해 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드에서 더 긴 반감기를 부여하는 인간 IgG 변이체 Fc-단편을 확인하기 위한 방법이 추가로 제공된다: (a) 루프 10 내이거나 또는 인접한 4 내지 20, 10 내지 20, 20 내지 40, 40 내지 60 또는 60 내지 80개의 무작위 아미노산을 포함하는 삽입을 함유하는 Fc-단편을 암호화하는 핵산의 라이브러리를 만드는 단계; (b) (i) pH 5.5에서 및/또는 약 5 내지 6의 pH에서 더 높은 친화도 및/또는 더 높은 결합 활성으로 인간 FcRn에 결합되고, (ii) 생리적 pH에서 및/또는 7.4, 7.5 또는 7.6의 pH에서 대조군 Fc-단편에 비해 동일 또는 더 낮은 친화도 또는 결합활성에서, 즉, 거의 없거나 또는 전혀 없는 결합 활성으로 인간 FcRn에 결합되는 변이체 Fc-단편을 확인하기 위한 라이브러리에 의해 암호화된 Fc-단편을 스크리닝하는 단계; (c) (b)에서 확인된 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 구성하되, 변이체 Fc-단편보다는 대조군 Fc-단편을 포함하는 대조군 Fc-폴리펩타이드의 농도가 동물에 생체내 투여될 때 시간을 거쳐서 선형으로 감소되는 것으로 알려진 핵산을 구성하는 단계; (d) 숙주 세포 내로 (c)의 핵산을 도입하고 핵산에 의해 암호화된 변이체 Fc-폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양시키는 단계; (e) 세포 덩어리 또는 세포 배양 배지로부터 변이체 Fc-폴리펩타이드를 회수하는 단계; (f) 동물에 변이체 Fc-폴리펩타이드를 투여하고, 다른 동물에 대조군 Fc-폴리펩타이드를 투여하는 단계; 및 (g) 투여에 후속하여 시간을 거쳐서 말초 혈액 내 변이체 및 대조군 Fc-폴리펩타이드의 농도를 모니터링함으로써, 변이체 Fc-폴리펩타이드 상에서 더 긴 생체내 반감기를 부여하는 변이체 Fc-단편을 확인하는 단계. 단계 (a)의 삽입은 표 1에 예시된 바와 같이 EU 넘버링 시스템을 사용하여 위치 384 내지 385일 수 있다. 삽입 부위는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 383 내지 387일 수 있다. 변이체 Fc-단편 내 삽입은 표 1에 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 382 내지 383, 383 내지 384, 384 내지 385, 385 내지 386, 386 내지 387, 387 내지 388, 388 내지389, 389 내지 390, 또는 390 내지 391일 수 있다. 대안적으로 EU 넘버링 시스템을 사용하여 아미노산 384 내지 386은 결실될 수 있고, 삽입은 아미노산 383 내지 387일 수 있다.
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변이체 Fc-폴리펩타이드를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 만성 질병을 치료하기 위한 방법이 제공된다.
도 1: Fc-단편에 FcRn의 결합 시 가장 가깝게 접촉되는 인간 FcRn(hFcRn) 및 인간 IgG1 Fc-단편의 예측된 3차원 구조의 리본 다이어그램을 도시한 도면. 상부는 hFcRn의 3차 구조의 일부의 리본 다이어그램이다. 하부는 FcRn이 그것에 결합될 때 FcRn과 가장 가깝게 접촉되는 인간 IgG1 Fc-단편의 일부의 리본 다이어그램이다. 루프는 줄로서 나타내는 한편, 알파 나선 및 베타 시트는 리본으로서 나타낸다. 삽입이 만들어지는 6개 부위는 이하에 기재하는 바와 같이 구성되는 8개의 라이브러리의 명칭, 즉, L1, L2A, L2B, L3, L4, L5, L6A 및 L6B에 의해 표시된다.
도 2: 삽입 라이브러리의 형태를 도시한 도면. 상부는 인간 IgG1 Fc-단편의 서열(서열번호 1)을 나타낸다. 삽입이 만들어지는 루프 내이거나 또는 인접한 아미노산은 밑줄 및 볼드체로 표시한다. 라이브러리 명칭, 즉, L1, L2A 등은 특정 라이브러리에 대해 삽입이 만들어진 영역 위에 표시한다. 삽입 형태는 아래에 표시한다. 가장 왼쪽에 라이브러리 명칭, 즉, L1, L2A 등이 있다. 라이브러리 명칭의 바로 오른쪽은 임의의 아미노산의 삽입 전 삽입 부위 주변의 본래 서열이다. 이탤릭체는 삽입 전 결실된 아미노산을 표시한다. 수직 파선은 아미노산이 결실되지 않은 해당 라이브러리에서 삽입 부위를 표시한다. 가장 오른쪽은 삽입이 그 자리에 있는 삽입 부위 주변의 서열이다. 표기 "(19R)5" 또는 "(19R)6"은 각각 5 또는 6개의 무작위 아미노산을 의미하며, 이들은 시스테인 이외의 19가지 아미노산 중 어떤 것일 수 있다. 표기 "(20R)8"은 8개의 무작위 아미노산을 의미하며, 이는 20가지의 아미노산 중 어떤 것일 수 있다.
도 3: 라이브러리 L5로부터 변이체 Fc-단편의 pH 6 및 pH 7.4에서 각각 결합 및 해리는 곡선을 이루는 것을 도시한 도면. 왼쪽의 곡선은 실시예 4에 설명한 바와 같은 포르테바이오 옥텟(ForteBio Octet)(등록상표)을 사용하여 검출한 반응을 나타내며, 여기서 중앙의 수직선의 왼쪽에 대한 곡선의 일부는 pH 6에서 FcRn에 대한 다양한 Fc-단편의 결합의 상대적인 양을 나타내고, 중앙 수직선의 오른쪽에 대한 곡선의 일부는 pH 7.4에서 FcRn으로부터 Fc 단편의 해리를 나타낸다. 오른쪽에서 표는 각 변이체에 대해 및 야생형 Fc-단편(FcWT)에 대해 pH 6에서 검출된 최대 결합 반응을 제공한다.
도 4: 사이노몰거스 원숭이에서 주사 후 시간의 함수로서 변이체 및 대조군 Fc-단편을 함유하는 항체의 평균 농도를 도시한 도면. x 축은 주사 후 시간(hr)을 표시하며, y 축은 항체를 주사한 사이노몰거스 원숭이의 말초혈액에서 밀리리터 당 나노그램으로(ng/㎖)로 항체의 농도를 표시한다.
도 5: 루프 10의 변이체의 서열을 도시한 도면. 인간 IgG1 Fc-단편에서 루프의 야생형 또는 변이체 형태의 아미노산 서열 + 각 측면 상에서 3개의 인접한 아미노산을 도시한 도면. 나타낸 아미노산 서열은 도 2의 넘버링 계획에서 아미노산 잔기 166 내지 178, 또는 이 도면 및 표 1에 나타낸 바와 같은 EU 넘버링(서열번호 563)에 따른 아미노산 381 내지 393이다. 미변형, 야생형 루프 영역 서열은 "야생형 서열"을 표시한다. Fc 변이체 5-1(라이브러리 L5로부터의 단리물에 의해 암호화됨)에서 이 루프 영역의 서열은 "5-1"(서열번호 564)을 표시한다. 삽입된 아미노산 서열은 밑줄과 함께 볼드체 로 나타낸다. 5-1의 다양한 변이체로부터 이런 동일 루프 영역의 서열은 이 루프 내에 또는 인접한 상이한 위치에 삽입된 동일 펩타이드를 가지는데, 일부 경우에 일부 루프 아미노산은 결실되며, 이를 이하에 나타낸다.
도 6: 루프 10의 상이한 위치에서 동일한 삽입을 갖는 변이체 Fc- 단편의 pH 6 및 pH 7.4에서 각각 결합 및 해리가 곡선을 이루는 것을 도시한 도면. 왼쪽의 곡선은 다양한 변이체 Fc 단편 및 야생형 Fc 단편(FcWT)의 pH 6에서 결합 곡선(중앙 수직선의 왼쪽에 대해) 및 pH 7.4에서 해리 곡선(중앙 수직선의 오른쪽에 대해)을 나타낸다. 오른쪽에서 pH 6에서 각각의 변이체에 대해 검출된 최대 결합 반응을 목로표로 나타낸다.
도 7: 효모에서 선별한 라이브리 L5로부터 변이체 Fc-단편의 pH 6 및 pH 7.4에서 결합 및 해리 곡선을 도시한 도면. 왼쪽에서 다양한 변이체 Fc-단편 및 야생형 Fc-단편(FcWT)의 pH 6에서 결합 곡선(중앙 수직선의 왼쪽에 대해) 및 pH 7.4에서 해리 곡선(중앙 수직선의 오른쪽에 대해에서 결합 곡선을 나타낸다. 오른쪽에서 pH 6에서 각 변이체에 대해 검출한 최대 결합 반응을 목록표로 나타낸다.
도 8: 효모에서 선별한 라이브러리 L-8 및 L-10으로부터 변이체 Fc-단편의 pH 6 및 pH 7.4에서 결합 및 해리 곡선을 도시한 도면. 왼쪽에서 다양한 변이체 Fc-단편 및 야생형 Fc-단편(FcWT)의 pH 6에서 결합 곡선(중앙 수직선의 왼쪽에 대해) 및 pH 7.4에서 해리 곡선(중앙 수직선의 오른쪽에 대해에서 결합 곡선을 나타낸다. 오른쪽에서 pH 6에서 각 변이체에 대해 검출한 최대 결합 반응을 목록표로 나타낸다.
도 9: 사이노몰거스 원숭이에서 주사 후 시간의 함수로서 변이체 및 대조군 Fc-단편을 함유하는 항체의 평균 농도를 도시한 도면. x 축은 주사 후 시간(hr)을 표시하고, y 축은 항체를 주사한 사이노몰거스 원숭이의 말초혈액에서 밀리리터 당 나노그램으로(ng/㎖)로 항체의 농도를 표시한다.
도 10: 사이노몰거스 원숭이에서 주사 후 시간의 함수로서 변이체 및 대조군 Fc-단편을 함유하는 항체의 평균 농도를 도시한 도면. x 축은 주사 후 시간(hr)을 표시하고, y 축은 항체를 주사한 사이노몰거스 원숭이의 말초혈액에서 밀리리터 당 나노그램으로(ng/㎖)로 항체의 농도를 표시한다. 표시한 바와 같이, 속을 채운 원은 Y-5-112를 주사한 사이노몰거스 원숭이에 대한 개별 데이터 지점을 나타내며, 실선은 이들 데이터의 평균을 나타낸다. 유사하게, 삼각형은 항체 Y를 주사한 사이노몰거스 원숭이에 대한 개개 데이터를 나타내고, 파선은 이들 데이터의 평균을 나타낸다.
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상세한 설명
생체내 반감기를 증가시킨 치료적 단백질의 변화는 이러한 단백질이 더 낮은 양에서 및/또는 덜 빈번하게 투약될 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 본 발명은, 예를 들어, pH 5.0 내지 6.0과 같은 약간 산성에서 증가된 친화도 및/또는 결합 활성으로 FcRn에 결합되고, 약 7.2 내지 7.6의 생리적 pH에서 FcRn에 결합되지 않는 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드를 제공한다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 변이체 Fc-단편을 함유하는 이러한 변이체 Fc-폴리펩타이드는 대조군 Fc-폴리펩타이드에 비해 더 긴 생체내 반감기를 가질 수 있다. 약 5 내지 6의 pH에서 대조군 Fc-폴리펩타이드와 비교하여 삽입(들)을 함유하지 않는다는 것만 다른 향상된 친화도 및/또는 결합 활성으로 FcRn에 결합되며, 루프 내이거나 또는 인접한 적어도 하나의 삽입을 함유하는, 변이체 인간 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 제공된다. 또한 이러한 변이체 Fc-단편 및 변이체 Fc-폴리펩타이드를 함유하는 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 핵산을 함유하는 숙주 세포, 및 변이체 Fc-폴리펩타이드 및 변이체 Fc-단편의 제조방법이 제공된다. 추가로, Fc-폴리펩타이드의 반감기를 연장하는 방법이 제공되고, pH 5 내지 6에서 더 높은 친화도 및/또는 결합 활성으로, 생리적 pH에서 대조군 Fc-단편에 비해 더 낮거나 또는 유사한 친화도 및/또는 결합 활성으로 FcRn에 결합되는 변이체 Fc-단편을 확인하는 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 변이체 Fc-단편은 루프 내 선택 부위에서 짧은 삽입을 함유한다. FcRn은 Fc-단편과 상호작용한다. CH2 또는 CH3 도메인과 같은 면역글로뷸린 도메인은 루프와 교대로 베타 시트 부분을 포함하는 배럴형(barrel-shaped) 구조를 가진다. 문헌[Hunkapiller and Hood (1989), Adv. Immunol. 44: 1-63; Williams and Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405] 참조. Fc-단편 내 삽입 부위는 그것이 Fc-단편에 결합될 때 FcRn과 상대적으로 밀접하게 접촉되는 부분인 루프에서 또는 이들 영역에 인접한 루프에서 선택되었다. 도 1은 FcRn의 일부(상부) 및 Fc-단편(하부)의 리본 다이어그램을 나타내며, 삽입을 위해 선택한 부위의 Fc-단편 내 위치를 표시한다.
이하에 나타내는 바와 같이, 라이브러리 L5 내 다수의 삽입은 pH 5 내지 6에서 FcRn에 대해 향상된 결합의 원하는 특성을 가지며, 생리적 pH에서 FcRn에 대한 결합은 거의 없거나 또는 전혀 없다. 라이브러리 L1, L2B, L3 및 L4를 포함하는 다른 라이브러리(도 1 및 2 참조)는 거의 동일한 수의 변이체를 선별한다고 해도 원하는 특성을 가지는 삽입을 수득하지 못했다. 라이브러리 L2A, L6A 및 L6B는, 해당되는 수가 라이브러리 L5로부터 얻은 수보다 훨씬 적다고 할지라도, 원하는 특성을 갖는 일부 삽입을 수득하였다. 놀랍게도, 원하는 특성을 지니는 가장 많은 삽입을 생성한 라이브러리, 즉, 라이브러리 L5는 FcRn과 가장 가깝게 접촉하게 되는 영역의 부분이 아닌 루프 영역에 놓인다. 도 1.
정의
본 명세서에 의미되는 바와 같은 용어 "친화도"는 실시예 3에서 설명하는 바와 같은 비아코어(BIAcore)(등록상표) T100(또는 유사한 기기)을 사용하여 측정된 EC50으로서 측정된 결합 친화도를 지칭한다. 대조군 Fc-폴리펩타이드(대조군 Fc-단편을 함유)에 비해, FcRn에 대해 변이체 Fc-폴리펩타이드(변이체 Fc-단편을 함유)의 "높은 친화도"는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 대조군 Fc-폴리펩타이드의 EC50의 50% 이하인 EC50을 가진다는 것을 의미한다. 유사하게, 대조군 Fc-폴리펩타이드에 비해 변이체 Fc-폴리펩타이드의 "낮은 친화도"는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 대조군 Fc-폴리펩타이드의 친화도보다 150% 초과인 EC50을 가지는 것을 의미한다. 변이체 Fc-폴리펩타이드의 친화도는 그것의 EC50이 대조군 Fc-폴리펩타이드의 EC50의 50% 내지 150%라면, 대조군 Fc-폴리펩타이드의 친화도와 "실질적으로 동일한" 것으로 고려된다.
본 명세서에서 의미하는 바와 같은 용어 "결합 활성"은 실시예 4에 기재된 바와 같은 옥텟 레드(Octet Red)(등록상표) 시스템에서 바이오티닐화된 인간 FcRn(hFcRn)으로 코팅된 스트렙타비딘 바이오센서를 사용하여 측정된 FcRn에 대한 Fc-폴리펩타이드의 결합 활성을 지칭하며, 여기서 결합은 pH 6에서 일어나고, 해리는 pH 7.4에서 일어난다. pH 6에서 변이체 Fc-폴리펩타이드의 결합 활성은, 관찰된 최대 반응이 대조군 Fc-폴리펩타이드에 대해 관찰된 최대 반응의 적어도 1.5, 1.75 또는 2.0배라면, 대조군 Fc-폴리펩타이드의 결합 활성보다 "더 높은" 것으로 고려된다. 야생형 Fc-단편을 포함하는 대조군 Fc-폴리펩타이드를 사용하여 관찰된 매우 소량의 잔여 결합 반응, 즉, 대부분의 단백질이 pH 7.4에서 hFcRn으로부터 해리된 후 남아있는 결합 반응은 "결합 활성이 거의 없는 또는 전혀 없는"으로서 지칭된다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 또한 검출된 일부 또는 모든 단백질이 pH 7.4에서 해리된 후 검출된 잔여 결합 반응이 실시예 4에서 기재한 바와 같은 포르테바이오(ForteBio) 시스템을 사용하는 대조군 Fc-폴리펩타이드를 사용하여 검출된 것보다 0.2 나노미터 이하 또는 0.1 초과라면, pH 7.4에서 "결합 활성이 거의 없거나 또는 전혀 없는" 것으로 고려된다.
본 명세서에서 의미되는 "아미노산"은 인간 단백질에서 보통 발견되는 20가지의 L-아미노산 중 어느 하나를 지칭하며, 다음의 알라닌, 알라닌, 알기닌, 아스파라긴, 아스팔트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린이다.
본 명세서에서 의미되는 "항체"는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 면역글로뷸린 가변 영역을 함유하는 단백질이다. 예를 들어, scFv, 2 이상의 scFv를 포함하는 분자, 및 본질적으로 단일 면역글로뷸린 가변 영역으로 이루어진 도메인 항체(예를 들어, 미국특허 제7,563,443호에 기재된 바와 같음)는 본 명세서에서 의미하는 바와 같은 "항체"이다. 다수의 경우에, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 + 인간 IgG Fc 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 함유하는 전장 항체, 예컨대 포유류에서 발견되는 자연적으로 생기는 IgG, IgA, IgD, IgD 또는 IgM 항체를 포함한다. 문헌[Carayannopoulos and Capra, Ch. 9, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3rd ed., Paul, ed., Raven Press, New York, 1993, pp. 284-286)]; 항체를 설명하는 이 참고문헌의 일부는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 예시적인 항체는 특히 아달리무맙, (후미라(HUMIRA)(등록상표), 애벗래버러토리스(Abbott Laboratories)), 인플릭시맙(레미케이드(REMICADE)(등록상표), 센토코 올소 바이오텍 인코포레이티드(Centocor Ortho Biotech Inc.)), 유스테키누맵(스텔라라(STELLARA)(등록상표), 센토코(Centocor)), 골리무맙(심포니(SIMPONI)(등록상표), 센토코 올소 바이오텍), 카나키누맙(일라리스(ILARIS)(등록상표), 노바티스 파마슈티컬스 코포레이션(Novartis Pharmceuticals Corporation)), 오파투무맙(아제라(ARZERRA)(등록상표), 글랙소 그룹 리미티드(Glaxo Group Ltd.)), 토실리주맙(악템라(ACTEMRA)(등록상표), 일본에 소재한 추가이 세이야쿠 카부시키 코포레이션(Chugai Seiyaku Kabushiki Corp.)), 벨리무맙(벤리스타(BENLYSTA)(등록상표), 림포스타트-B(LYMPHOSTAT-B)(등록상표), 휴먼 게놈 사이언스 인코포레이티드(Human Genome Sciences, Inc.)), 베바시주맙(아바스틴(AVASTIN)(등록상표), 제넨테크(Genentech)), 세툭시맙(얼비툭스(ERBITUX)(등록상표), 임클론 시스템즈 인코포레이티드(ImClone Systems Inc.)), 에펀구맙(efungumab)(마이코그랩(MYCOGRAB)(등록상표), 노바티스 AB 코포레이션(Novartis AB Corp.)), 에팔리주맙, (RAPTIVA(등록상표), Genentech Inc.), 에타라시주맙(아베그린(ABEGRIN)(등록상표), 메디뮨 엘엘씨(Medimmune LLC)), 겐투주맙 오조가미신(마일로타그주(MYLOTARG)(등록상표), 와이어스(Wyeth)), 기렌툭시맙(렌카렉스(RENCAREX)(등록상표), 독일에 소재한 윌릭스 아게 코포레이션(Wilex AG Corp.)), 나탈리주맙(티사브리(TYSABRI)(등록상표), 엘란 파마슈티칼스 인코포레이티드(Elan Pharmceuticals, Inc.)), 오말리주맙(졸레어(XOLAIR)(등록상표), 스위스에 소재한 노바티스 아게 코포레이션), 오레고보맙(OVAREX(등록상표), 캐나다에 소재한 알타렉스 코포레이션(AltaRex Corp.)), 팔리비주맙(시나기스(SYNAGIS)(등록상표), 아보시나기스(ABBOSYNAGIS)(등록상표), 메디뮨 인코포레이티드(Medimmune Inc.)), 파니투무맙(벡티빅스(VECTIBIX)(등록상표), 암젠 인코포레이티드(Amgen Inc.)), 라니비주맙(루센티스(LUCENTIS)(등록상표), 제넨테크 인코포레이티드), 리툭시맙(맙테라(MABTHERA)(등록상표), 리툭산(RITUXAN)(등록상표), 이데 파마슈티칼스 코포레이션(Idec Pharmaceuticals Corp.)), 테피바주맙(오렉시스(AUREXIS)(등록상표), 인히비텍스 코포레이션(Inhibitex Corp.)), 토시투모맙, (벡사르(BEXXAR)(등록상표), 글랙소스미스클라인 비첨 코포레이션(GlaxoSmithKline Beecham Corp.)), 트라스투주맙(헤르셉틴(HERCEPTIN)(등록상표), 제넨테크 인코포레이션(Genentech Inc.)) 및 데노수맙(프롤리아(PROLIA)(등록상표) 또는 엑스게바(XGEVA)(등록상표), 암젠 인코포레이티드)를 포함한다. 이러한 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입을 가질 수 있고, 키메라, 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다. 추가로, 용어 "항체"는 낙타, 기타 종, 및 상어에서 발견되는 자연적으로 생기는 항체와 같이 2개의 중쇄를 함유하며 경쇄가 없는 다이머 항체를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Muyldermans et al ., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al, 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90; Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909] 참조. 항체는 단일특이성(즉, 한 종류의 항원에만 결합) 또는 다중특이성(즉, 한 종류 이상의 항원에 결합)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 이중특이성(즉, 2가지 상이한 종류의 항체에 결합)일 수 있다. 추가로, 항체는 1가, 2가 또는 다가일 수 있으며, 이는 한 번에 1 또는 2 이상의 항원 분자에 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 항체에 대해 가능한 일부 형태는 다수의 다른 가능한 항체 형태 중에서 단일특이성 또는 이중특이성 전장 항체, 결합되는 분자를 저해하거나 또는 활성화할 수 있는 단일특이성 1가 항체(본 명세서에 적절한 일부가 참조로서 포함된 국제특허출원 WO 2009/089004호 및 본 명세서에 적절한 일부가 참조로서 포함된 미국특허 공개 제2007/0105199호, 및 본 명세서에 적절한 일부가 참조로서 포함된 미국특허 공개 제2005/0227324호에 기재된 바와 같음), 2가 단일특이성 또는 이중특이성 다이머 Fv-Fc, scFv-Fc 또는 다이아바디 Fc, 단일특이성 일가 scFv-Fc/Fc, 및 다중특이성 결합 단백질 및 미국특허 공개 제 2009/0311253호(이것의 적절한 일부가 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 이중 가변 도메인 면역글로뷸린을 포함한다.
본 명세서에서 의미하는 바와 같은 "결합 영역"은 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 암세포 상의 고수준에서 발현된 단백질, 자가면역 또는 염증성 질환을 매개하는 세포, 감염 세포, 감염성 작용제 또는 면역 효과기 기능을 매개하는 세포, 예를 들어 NK 세포와 같은 표적 분자에 결합되는 "Fc-폴리펩타이드", "대조군 Fc-폴리펩타이드" 또는 "변이체 Fc-폴리펩타이드"에 포함된 영역이다. 결합 영역은 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로뷸린 가변(VH 및/또는 VL) 영역 또는 비면역글로뷸린 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 예시적인 결합 영역은, 예를 들어 Fv(링커에 의해 결합된 VH 및 VL 영역을 포함) 또는 표적 분자에 결합되는 인간 수용체의 가용성 형태를 포함한다.
본 명세서에서 의미된 바와 같은 "Fc -단편"은 힌지 영역의 부분 또는 모두로 이루어진 폴리펩타이드 + 항체의 CH2 및 CH3 영역 + 선택적으로, IgA 또는 IgM 항체와 같은 일부 자연적으로 생기는 아이소타입 내 CH3 영역으로부터 하류에서 발견되는 영역이다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아이소타입을 포함하는 IgG 아이소타입, 또는 IgM, IgE, IgD 또는 IgA 아이소타입을 가질 수 있다. 항체는 인간 또는 동물 유래일 수 있다. 예를 들어, 항체는 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 염소 또는 양으로부터, 또는 낙타 종 또는 상어로부터 유래될 수 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc-단편의 서열은 각각 서열번호 1, 3, 5 및 7에 개시되어 있다. 이들 서열은 또한 이하의 표 1에 나타낸다. 일반적으로, Fc-단편은 힌지 영역 내 시스테인 잔기 사이에서 생기는 이황화 결합에 의해 안정화된 2개의 Fc-단편 내 CH3 도메인 사이의 상호작용을 통해 다이머를 형성한다. 본 명세서에서 "Fc 영역"으로서 지칭되는 Fc-단편은, Fc-단편이 일반적으로 생리적 조건 하에 이합체화된다는 것이 인식되더라도, 다이머 Fc-단편으로서 구체적으로 정의된다. 다이머는 강하게 환원되는 조건에서 해리될 수 있다.
본 명세서에서 의미되는 "Fc - 폴리펩타이드"는 Fc-단편 및 결합 영역을 포함하는 단백질이다. Fc-폴리펩타이드는 비펩타이드 유기 모이어티(즉, "소분자") 또는 펩타이드이고, 독소로서 작용할 수 있고/있거나 생물학적 경로의 활성을 모방하거나, 길항하거나 또는 작용화할 수 있으며, Fc-폴리펩타이드에 공유적으로 컨쥬게이트되거나 또는 융합된 추가적인 "약학적으로 활성인 모이어티"를 함유할 수 있는 항체 또는 융합 단백질, 항체, Fc 융합 단백질을 포함한다. Fc-단편과 같은 Fc-폴리펩타이드은 보통 2개의 Fc-폴리펩타이드의 힌지 영역 내 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 안정화되는 다이머를 형성한다.
본 명세서에 의미되는 "대조군 Fc -단편"은 변이체 Fc-단편이 루프 내 삽입을 가짐에 따라 루프 내 삽입을 가지지 않는 것을 제외하고, "변이체 Fc-폴리펩타이드"와 동일한 Fc-단편이다. 따라서, "대조군 Fc-단편"은 변이체 Fc-단편이 pH 5 내지 6에서 FcRn에 대한 변이체 Fc-단편의 친화도를 증가시키는 삽입을 가지는 경우, 루프에서 자연적으로 생기는 Fc-단편에서 발견되는 미변형 서열을 가진다. 대조군 Fc-단편은 삽입(들) 이외의 자연적으로 생기는 Fc-단편에 대한 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 이하에 기재되는 헤테로다이머화 변성 또는 다른 부수적 변형은 그것과 비교되는 변이체 Fc-단편과 대조군 Fc-단편 둘 다에 존재할 수 있다. 따라서, "대조군 Fc-단편"과 "변이체 Fc-단편" 사이의 차이는 단지 변이체 Fc-단편 내 루프 내이거나 또는 인접한 삽입이다. "대조군 Fc 영역"은, 대조군 Fc-단편이 다이머 형태에서 존재하는 것으로 일반적으로 예상되지만, 2개의 대조군 Fc-단편을 포함하는 다이머로 정의된다.
본 명세서에서 의미되는 "변이체 Fc -단편"은 Fc-단편의 루프 내이거나 또는 인접한 80 이하, 60 이하, 40 이하 또는 20개 이하의 아미노산의 삽입을 포함하는 Fc 단편이다. 인간 IgG Fc-단편 내 루프는 표 1에 나타내며, 삽입이 만들어지는 루프는 도 2에 나타낸다. 다른 Fc-단편 내 루프는 당업계에 공지되어 있다. 수많은 서열이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991]을 참조하며, 이것의 일부는 서열에 관한 것이고, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 3차 구조는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 문헌[Kabat et al.]은 수많은 서열의 배열을 제공한다. 문헌[Kabat et al.]에서 배열이 제공되면, 면역글로뷸린 도메인의 고도로 보존된 구조 및 본 명세서에 제공된 루프의 위치뿐만 아니라 당업계에서 입수가능한 흔한 추가적인 정보, 루프는 임의의 종으로부터 임의의 아이소타입의 Fc-단편에 위치될 수 있었다. 예를 들어, 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 웹사이트는 다수의 단백질의 3차 구조에 대한 흔한 정보를 함유한다. 일부 실시형태에서, 삽입된 아미노산은 루프 내에서 자연적으로 생기는 1 내지 10개의 아미노산을 대체할 수 있다. 삽입된 아미노산은 제거된 아미노산의 수보다 더 적거나, 더 많거나 또는 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 루프 내 모든 아미노산은 본래 남아있으며, 삽입된 아미노산은 단순히 첨가된다. 일부 실시형태에서, 변이체 인간 IgG Fc-단편은 다른 "추가적인 부수적 변형", 즉, 삽입이 일어나는 루프 이외의 위치에서 16개 이하의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 삽입이 일어나는 루프 이외의 위치에서 단일 아미노산의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이하의 삽입, 결실 또는 치환이 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 변이체 Fc-단편은 임의의 추가적인 부수적 변형을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 추가적인 부수적 변형은, 예를 들어 헤테로다이머 Fc 영역의 형성을 가능하게 하는 이하에 기재된 "헤테로다이머화 변성"일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 추가적인 부수적 변형은 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 다음을 포함한다: (1) 발린, 류신 또는 아이소류신을 알라닌으로; (2) 리신, 글루타민 또는 아스파라긴을 알기닌으로; (3) 글루타민, 글루타메이트, 또는 아스팔테이트를 아스파라긴으로; (4) 글루타메이트, 아스파라긴, 또는 글루타민을 아스팔테이트로; (5) 세린 또는 알라닌을 시스테인으로; (6) 아스파라긴, 글루타메이트, 또는 아스팔테이트를 글루타민으로; (7) 아스팔테이트, 글루타민, 또는 아스파라긴을 글루타메이트로; (8) 프롤린 또는 알라닌을 글라이신으로; (9) 아스파라긴, 글루타민, 리신 또는 알기닌을 히스티딘으로; (10) 류신, 발린, 메티오닌, 알라닌 또는 페닐알라닌을 아이소류신으로; (11) 아이소류신, 발린, 메티오닌, 알라닌 또는 페닐알라닌을 류신으로; (12) 알기닌, 아스파라긴 또는 글루타민을 리신으로; (13) 류신, 페닐알라닌 또는 아이소류신을 메티오닌으로; (14) 류신, 발린, 아이소류신, 알라닌 또는 티로신을 페닐알라닌으로; (15) 알라닌을 프롤린으로; (16) 트레오닌, 알라닌 또는 시스테인을 세린으로; (17) 세린을 트레오닌으로; (18) 티로신 또는 페닐알라닌을 트립토판으로; (19) 트립토판, 페닐알라닌, 트레오닌 또는 세린을 티로신으로; 및 (20) 아이소류신, 메티오닌, 류신, 페닐알라닌 또는 알라닌을 발린으로.
추가로, 일부 실시형태에서, 변이체 Fc-단편은 비펩타이드 유기 모이어티(즉, "소분자") 또는 펩타이드이고, 독소로서 작용할 수 있고/있거나 생물학적 경로의 활성을 모방하거나, 길항하거나 또는 작용화할 수 있으며, Fc-단편에 공유적으로 컨쥬게이트되거나 또는 융합된 추가적인 "약학적으로 활성인 모이어티"를 함유할 수 있다. 변이체 Fc-단편이 이러한 약학적으로 활성인 모이어티를 함유한다면, 그것의 "대조군 Fc-단편"은 또한 이러한 모이어티를 함유한다.
다른 실시형태에서, 변이체 인간 IgG Fc-단편은 삽입이 일어나는 루프에서 생기는 것의 밖에서 변성을 포함하지 않는다. "Fc-단편"과 같이, "변이체 Fc-단편"은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입을 포함하는 IgG 아이소타입, 또는 IgM, IgE, IgD 또는 IgA 아이소타입을 가질 수 있다. 이는 인간 또는 동물 유래일 수 있다. 예를 들어, Fc-단편은 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 염소 또는 양, 또는 낙타 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 상어는 변이체 Fc-단편을 생성하도록 변형될 수 있다. 다른 Fc-단편과 같이, 변이체 Fc-단편은 정상적으로 다이머이며, "변이체 Fc 영역"은 다이머 변이체 Fc-단편으로서 구체적으로 정의된다.
본 명세서에 의미되는 바와 같은 "변이체 Fc - 폴리펩타이드"는 변이체 Fc-단편 및 결합 영역을 포함한다. 선택적으로, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 다수의 결합 영역을 함유할 수 있다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 멀티머, 예컨대 다이머, 트라이머, 테트라머, 또는 더 고차의 멀티머일 수 있다. 다수의 경우에, Fc-폴리펩타이드의 변이체 Fc-단편의 일부는 다이머화되기 위한 이황화 결합을 형성할 수 있다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는, 예를 들어, 다이머 Fc 융합 단백질, 테트라머 전장 항체(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유), 다이머 scFv-Fc 등을 포함한다. 그것들은 헤테로멀티머 또는 호모멀티머, 예컨대 헤테로다이머 또는 호모다이머일 수 있다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 항체, Fc-융합 단백질일 수 있거나, 또는 추가적인 비항체 약학적으로 활성인 모이어티를 포함하는 항체 또는 Fc-융합 단백질일 수 있다. 이러한 "약학적으로 활성인 모이어티"는 Fc-폴리펩타이드에 공유적으로 컨쥬게이트되거나 또는 융합될 수 있고, 독소로서 작용할 수 있으며/있거나 생물학적 경로의 활성을 모방하거나, 길항하거나 또는 작용화할 수 있는 비펩타이드 유기 모이어티(즉, "소분자") 또는 펩타이드일 수 있다.
본 명세서에 의미하는 바와 같은 "Fc 융합 단백질"은 다른 비항체 폴리펩타이드에 융합된 Fc-단편을 함유하는 단백질이다. 비항체 폴리펩타이드는 표적 분자에 결합되고 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는 결합 영역을 포함한다. Fc 융합 단백질의 결합 영역은 비항체 폴리펩타이드, 예컨대 표적 분자에 결합되는 수용체 또는 하나 이상의 폴리펩타이드의 가용성 부분(예를 들어, 미국특허 제7,820,790호에 논의되는 바와 같이 선택될 수 있는 표적 단백질에 결합되는 미국특허 제7,820,790호에 정의된 바와 같은 "모노머 도메인"), 또는 다른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 모노머 도메인 및 그것이 선택되는 방법을 설명하는 미국특허 제7,820,790호의 부분은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 구체적 실시형태에서, Fc 융합 단백질은 에타네르셉트(암젠 인코포레이티드에 의해 시판되는 엔브렐(ENBREL)(등록상표)), 로미플로스팀(암젠 인코포레이티드에 의해 시판되는 엔플레이트(NPLATE)(등록상표)), 알레파셉트(아메바이브(AMEVIVE)(등록상표), 바이오겐 코포레이션(Biogen Corp.)), 아바타셉트(브리스톨-마이어 스큅(Bristol-Myers Squibb)에 의해 시판되는 오렌시아(ORENCIA)(등록상표)), 릴로나셉트(레게네론(Regeneron)에 의해 시판되는 아칼리스트(ARCALYST)(등록상표)), 또는 아플리버셉트(레게네론에 의해 시판되는 아일리아(EYLEA)(상표명))일 수 있다. Fc 융합 단백질의 결합 영역의 부분일 수 있는 다른 폴리펩타이드는 특정 위치에서 무작위화되고, 특정 표적 분자에 결합을 위해 선택되는 스캐폴드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 스캐폴드 도메인은, 예를 들어, T-림프구 결합 단백질-4(CTLA-4; Nuttall et al . (1999), Proteins 36: 217-227), 스타필로코커스 단백질 1의 Z 도메인(Nord et al . (1995), Protein Eng. 8: 601-608), 녹색 형광 단백질, 및 인간 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN3; Koide et al . (1998), J. Mol. Biol. 284: 1141-1151; Karatan et al . (2004), Chem. & Biol. 11: 835-844)을 포함한다. 스캐폴드 도메인 및 결합 도메인을 만들기 위한 그것의 사용을 기재하는 이들 참고문헌의 일부는 본 명세서에 참조로서 포함된다. Fc-단편을 함유하는 다른 단백질과 같은 Fc 융합 단백질은 멀티머를 형성할 수 있으며, 이는 다이머일 수 있다. 이들 멀티머는 헤테로멀티머 또는 호모멀티머일 수 있다. Fc 융합 단백질은 헤테로다이머 또는 호모다이머 및 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다.
본 명세서에서 의미되는 바와 같은 "변이체 Fc 융합 단백질"은 변이체 Fc-단편을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
본 명세서에 의미되는 바와 같은 "대조군 Fc 융합 단백질"은 변이체 Fc 융합 단백질의 Fc-단편 일부의 루프에서 삽입을 제외하고, 비교되는 변이체 Fc 융합 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 융합 단백질이다.
본 명세서에 의미되는 바와 같은 "전장 IgG 항체"는 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 IgG 항체이다.
"헤테로다이머화 변성"은 일반적으로 헤테로다이머 Fc 영역, 즉, Fc 영역의 A 쇄 및 B 쇄가 동일한 아미노산 서열을 가지지 않는 Fc 영역의 형성을 가능하게 하는 다이머 Fc 영역의 2개의 쇄, 즉, A 및 B 쇄를 지칭한다. 헤테로다이머화 변성은 비대칭일 수 있으며, 즉, 특정 변성을 갖는 A 쇄는 상이한 변성을 갖는 B 쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 이들 변성은 헤테로다이머화를 가능하게 하고, 호모다이머화를 배척한다. 형성된 헤테로- 또는 호모-다이머는, 하나의 폴리펩타이드 쇄가 Fc-단편이고(즉, 힌지, CH2 및 CH3 영역 이외의 서열이 없음) 나머지는 scFv-Fc인 상황에서 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 결정되는 바와 같이 크기 차이에 의해 평가될 수 있다. 이러한 짝지어진 헤테로다이머화 변성의 일 예는 소위 "노브(knob) 및 홀(hole)" 치환이다. 예를 들어, 미국특허 제7,695,936호 및 미국특허 공개 제2003/0078385호를 참조하며, 이러한 돌연변이를 기재하는 이것의 일부는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 명세서에 의미되는 바와 같이, 한 쌍의 노브 및 홀 치환을 함유하는 Fc 영역은 하나의 Fc-단편에서 하나의 치환(A쇄를 표기) 및 다른 Fc-단편에서 다른 것(B쇄를 표기)을 함유한다. 예를 들어, IgG1 Fc 영역의 A 및 B 쇄에서 다음의 노브 및 홀 치환은 미변형 A 및 B 쇄에 의해 발견된 것에 비해 헤테로다이머 형성을 증가시키는 것으로 발견되었다: 1) 하나의 쇄에서 Y407T 및 나머지에서 T366Y; 2) 하나의 쇄에서 Y407A 및 나머지에서 T366W; 3) 하나의 쇄에서 F405A 및 나머지에서 T394W; 4) 하나의 쇄에서 F405W 및 나머지에서 T394S; 5) 하나의 쇄에서 Y407T 및 나머지에서 T366Y; 6) 하나의 쇄에서 T366Y 및 F405A 및 나머지에서 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 쇄에서 T366W 및 F405W 및 나머지에서 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 쇄에서 F405W 및 Y407A 및 나머지에서 T366W 및 T394S; 및 9) Fc의 하나의 폴리펩타이드에서 T366W 및 나머지에서 T366S, L368A, 및 Y407V. 본 명세서에서 의미하는 바와 같이, 돌연변이의 다음의 방법으로 의미된다. EU 넘버링 시스템을 사용하여 Fc 단편에서 주어진 위치에서 정상적으로 존재하는 아미노산(한 글자 코드를 사용함)(이하의 표 1 참조) 다음에 EU 위치가 있으며, 그 다음에 해당 위치에 존재하는 대안의 아미노산이 있다. 예를 들어, Y407T는 EU 위치 407에 정상적으로 존재하는 티로신이 트레오닌으로 대체된다는 것을 의미한다. 대안적으로 또는 새로운 이황화 브릿지를 만드는 이러한 변성, 치환에 추가로 헤테로다이머 형성을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 출원 공개 제2003/0078385호를 참조하며, 이러한 돌연변이를 기재하는 이것의 일부는 본 명세서에 참조로서 포함된다. IgG1 Fc 영역 내 이러한 변성은, 예를 들어 다음의 치환: 하나의 Fc-단편에서 Y349C 및 나머지에서 S354C; 하나의 Fc-단편에서 Y349C 및 나머지에서 E356C; 하나의 Fc-단편에서 Y349C 및 나머지에서 E357C; 하나의 Fc-단편에서 L351C 및 나머지에서 S354C; 하나의 Fc-단편에서 T394C 및 나머지에서 E397C; 또는 하나의 Fc-단편에서 D399C 및 나머지에서 K392C를 포함한다. 유사하게, 예를 들어 CH3-CH3 계면에서 하나 이상의 잔기의 전하를 변화시키는 치환은 WO 2009/089004호에서 설명된 바와 같은 헤테로다이머 형성을 향상시킬 수 있으며, 이러한 치환을 설명하는 이것의 일부는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 이러한 치환은 본 명세서에서 "전하쌍 치환"으로서 지칭되며, 전하쌍 치환 중 하나의 쌍을 함유하는 Fc 영역은 A 쇄에서 하나의 치환 및 B 쇄에서 상이한 치환을 함유한다. 전하쌍 치환의 일반적 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 쇄에서 K409D 또는 K409E + 나머지에서 D399K 또는 D399R; 2) 하나의 쇄에서 K392D 또는 K392E + 나머지에서 D399K 또는 D399R; 3) 하나의 쇄에서 K439D 또는 K439E + 나머지에서 D356K 또는 D356R; 및 4) 하나의 쇄에서 K370D 또는 K370E + 나머지에서 E357K 또는 E357R. 추가로, 쇄 둘 다에서 치환 R355D, R355E, K360D 또는 K360R은 다른 헤테로다이머화와 함께 사용될 때 헤테로다이머를 안정화시킬 수 있다. 구체적 전하쌍 치환은 단독으로 또는 다른 전하쌍 치환과 함께 사용될 수 있다. 전하쌍 치환 및 이것의 조합의 단일쌍의 구체적 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 쇄에서 K409E + 나머지에서 D399K; 2) 하나의 쇄에서 K409E + 나머지에서 D399R; 3) 하나의 쇄에서 K409D + 나머지에서 D399K; 4) 하나의 쇄에서 K409D + 나머지에서 D399R; 5) 하나의 쇄에서 K392E + 나머지에서 D399R; 6) 하나의 쇄에서 K392E + 나머지에서 D399K; 7) 하나의 쇄에서 K392D + 나머지에서 D399R; 8) 하나의 쇄에서 K392D + 나머지에서 D399K; 9) 하나의 쇄에서 K409D 및 K360D + 나머지에서 D399K 및 E356K; 10) 하나의 쇄에서 K409D 및 K370D + 나머지에서 D399K 및 E357K; 11) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 나머지에서 D399K, E356K 및 E357K; 12) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 나머지에서 D399K; 13) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 나머지에서 D399K 및 E356K; 14) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 나머지에서 D399K 및 D357K; 15) 하나의 쇄에서 K409D 및 K370D + 나머지에서 D399K 및 D357K; 16) 하나의 쇄에서 D399K + 나머지에서 K409D 및 K360D; 및 17) 하나의 쇄에서 K409D 및 K439D + 나머지에서 D399K 및 E356K. 이들 헤테로다이머화 변성 중 어떤 것은 본 명세서에 설명된 바와 같은 변이체 Fc의 부분일 수 있으며, 이는 대조군 Fc 영역보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합될 수 있다.
본 명세서에 의미되는 바와 같은 "루프"는 코어 면역글로뷸린 폴딩의 베타 시트를 구성하는 베타 가닥을 연결하는 Fc-단편 내 3차 구조의 일부이다. 루프는 베터 시트에 수반되는 것으로 표기된 2개 이하의 연속적 잔기를 함유할 수 있으며(루프 10 및 11과 같이; 이하의 표 1 참조), 또한 a 나선, a 회전, 단리된 β 브릿지 또는 벤드(bend)로서 표기된 잔기를 함유할 수 있다. 본 명세서에 의미되는 바와 같은 인간 IgG Fc 영역의 루프 영역은 표 1에 나타낸다.
"루프 내 삽입" 또는 아미노산의 임의의 신장 "내에서", 예를 들어 루프 10 내의 삽입은, 루프 내에서 2개의 인접한 아미노산 간의 또는 루프 내의 아미노산과 루프의 부분이 아닌 인접한 아미노산 간의 3 내지 35, 3 내지 20, 6 내지 20, 6 내지 15, 6 내지 12, 3 내지 15, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 아미노산의 삽입이다. "루프 내 삽입"은 또한 아미노산이 루프로부터 제거되고, 다른 아미노산이 루프 내로 삽입되는 상황을 포함한다. 루프 내로 삽입된 아미노산의 수는 3 내지 35, 3 내지 22, 4 내지 20, 6 내지 18, 6 내지 15, 6 내지 12, 3 내지 15, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 아미노산일 수 있고, 루프로부터 제거된 아미노산의 수는 루프 내로 삽입된 아미노산의 수 미만이거나, 동일하거나 또는 초과일 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 루프로부터 제거될 수 있다. 추가로, "루프 내 삽입"은 하나 이상의 삽입이 동일한 루프 내에서 일어나는 경우, 예컨대 상기 기재한 바와 같이 루프 내에서 또는 루프에 인접한 2개의 상이한 아미노산 쌍 사이의 삽입, 또는 루프 내에서 하나 이상의 비인접 아미노산이 결실되고 결실된 것보다 더 적거나, 동일한 수이거나 또는 더 많은 아미노산으로 대체되는 경우를 포함한다. 라이브러리 L3(도 2에 도시한 바와 같음)은 이러한 삽입 계획의 일 예이다.
"루프 내이거나 또는 인접한 삽입"은 또한 삽입이 루프에 인접한 처음 아미노산과 처음 아미노산에 인접한 다른 아미노산에 있고, 루프의 바깥쪽인 상황을 포함하는 것을 제외하고, 상기 기재한 바와 같은 "루프 내 삽입"과 같다.
본 명세서에서 의미하는 바와 같은 "생리적 pH"는 약 7.2 내지 7.6의 pH이다.
"scFv - Fc / Fc"는 scFv-Fc + 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결된 Fc-단편으로 본질적으로 이루어진 다이머 단백질이다. 추가로, Fc-단편 및 scFv-Fc에 의해 형성된 Fc 영역은 기재된 바와 같은 CH3 도메인, 예컨대 전하쌍 치환의 1, 2, 3 이상의 쌍에서 "헤테로다이머화 변성"을 함유할 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 "펩타이드"는 짧은 폴리펩타이드이다. 일반적으로, 펩타이드는 길이로 2 내지 80개, 2 내지 60개, 2 내지 50개, 2 내지 40개, 2 내지 30개 또는 2 내지 20개 아미노산이다.
본 명세서에 의미되는 바와 같은 "표적 분자"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc-폴리펩타이드의 결합 영역이 결합되는 분자이다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는, 예를 들어 암 세포 상에서 고수준으로 발현되거나 또는 자가면역 또는 염증성 질환을 매개하는 세포 상 또는 감염된 세포 상에서, 감염성 작용제 상에서, 또는 면역 효과기 기능을 매개하는 세포, 예를 들어 NK 세포 상에서 발현되는 단백질이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 대조군 Fc-폴리펩타이드보다 FcRn에 대해 더 큰 친화도를 가지는 변이체 Fc-폴리펩타이드의 "치료적 유효량"은, 예를 들어 암 환자의 종양 부담을 감소시키거나 또는 제거하는 것 또는 단백질이 치료를 위해 사용되는 임의의 질병 상태의 증상을 감소시키거나 또는 제거하는 것의 효과를 가지는 양이다. 치료적 유효량은 모든 질환의 증상을 완전히 제거할 필요는 없지만, 치료된 질환 후, 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시킬 수 있거나 또는 일부 빈도로 생길 수 있는 더 심각한 증상 또는 더 심각한 질병의 개시를 지연시킬 수 있다. 대안적으로, 변형된 Fc-폴리펩타이드를 함유하는 단백질의 치료적 유효량은 생체내 치료가 필요한 환자에게 투여될 때 적절한 바이오마커의 발현을 검출가능하게 영향을 미치기에 충분하다.
본 명세서에 언급된 임의의 질병의 "치료"는 적어도 하나의 질병 증상의 완화, 질병 중증도의 감소, 또는 일부 경우에 질병을 수반하거나 또는 적어도 하나의 다른 질병을 야기할 수 있는 더 중증의 증상으로 질병 진행의 지연 또는 예방을 포함한다. 치료는 질병이 전체적으로 치유되는 것을 의미할 필요는 없다. 유용한 치료제는 단지 질병의 중증도를 감소시키거나, 질병 또는 그것의 치료와 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나 또는 더 중증의 증상 또는 치료되는 질환 후 일부 빈도로 일어날 수 있는 더 중증의 질병의 개시를 지연시킬 필요가 있다.
변이체 Fc - 폴리펩타이드
대조군 Fc-폴리펩타이드보다 5.0 내지 6.0의 pH에서 더 큰 친화도 및/또는 결합활성으로 FcRn에 결합되는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 제공된다. 대조군 Fc-폴리펩타이드와 같이 이러한 변이체 Fc-폴리펩타이드는 적어도 약 7.2 내지 7.6의 pH에서 낮은 친화도 및/또는 결합 활성으로 FcRn에 결합된다. 이들 변이체 Fc-폴리펩타이드는 인간 또는 동물 유래일 수 있고(변형 전), IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하는 IgG 아이소타입을 가질 수 있다. FcRn은 또한 인간 또는 동물 유래일 수 있다. 이들 변이체 Fc-폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 영역을 추가로 포함하며, 표적 분자에 의해 적어도 부분적으로 매개된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 치료되는 질환을 직접 매개할 수는 없지만, 표적 분자에 대한 결합은 그것이 결합되는 Fc-폴리펩타이드 또는 표적 분자(들)를 국소화하도록 작용할 수 있다. 예를 들어, 이중특이성 Fc-폴리펩타이드는 2가지 상이한 세포 유형, 예를 들어 암 세포 및 면역계 세포를 브릿지할 수 있으며, 이들 각각은 Fc-폴리펩타이드가 결합될 수 있는 그것의 표면 상에서 표적 분자를 발현시킨다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 변이체 Fc-단편을 포함하는 항체 또는 Fc 융합 단백질일 수 있다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 추가로 추가적인 비항체 결합 영역을 함유하는 항체일 수 있었다. 선택적으로, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 인간 IgG 변이체 Fc-단편을 함유할 수 있다.
이하의 표 1에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc-폴리펩타이드의 아미노산 서열(각각 서열번호 1, 3, 5 및 7)이 배열된다. 서열은 적절한 부분이 본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌[Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85]의 EU 시스템에 따라 넘버링된다. 표 1에서 나타낸 바와 같이, 선형 넘버링 계획이 각 아이소타입 내 이 위치에 대해 상이한 숫자를 지칭하도록 강요되었다고 할지라도, 모두 4개의 인간 IgG 아이소타입과 유사한 위치를 지칭하기 위해 단일의 숫자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 위치 297에서 아스파라긴은 인간 IgG 아이소타입이 논의하에 있음에도 불구하고 아스파라긴 297로서 지칭되는 모든 인간 IgG 항체 내 존재하는 잘 공지되고 고도로 보존된 글라이코실화 부위이다.
인간 IgG3 항체는 다른 인간 IgG 아이소타입보다 훨씬 더 긴 힌지 영역을 가지며, 단지 이 힌지 영역의 대부분의 카복시-말단 부분은 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타낸 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 서열은 전체 힌지 영역을 포함한다. 표 1에서 명백한 바와 같이, 인간 IgG4 항체의 힌지 영역은 IgG1 항체보다 3개의 아미노산이 더 짧다. 인간 IgG2 항체는 인간 IgG1과 비교하여 약간 더 짧은 힌지 영역 및 CH2 영역의 아미노산 말단 단부 근처에서 하나의 아미노산 갭을 가진다. IgG1 라인에 나타낸 아미노산 216 내지 447 및 표 1의 IgG4 라인 내 아미노산 224 내지 447은 각각 서열번호 1의 아미노산 1 내지 232 및 서열번호 7의 아미노산 6 내지 229에 대응된다. 표 1의 IgG3 라인 내 아미노산 216 내지 447은 서열번호 5의 아미노산 48 내지 279에 대응된다. 표 1의 IgG2 라인 내 아미노산 237 내지 447은 서열번호 3의 아미노산 18 내지 228에 대응된다.
표 1에서, 본 명세서에서 의미되는 바와 같은 루프 내 위치되는 아미노산은 볼드체로 나타내며, 밑줄로 표시된다. 각각의 루프는 그것 이하에 숫자, 즉, "루프 1", "루프 2" 등으로 표지된다. 더 상세하게는, 루프는 다음의 위치에서 생긴다: 루프 1, 서열번호 1의 아미노산 29 내지 43, 서열번호 3의 아미노산 25 내지 39, 서열번호 5의 아미노산 76 내지 90, 및 서열번호 7의 아미노산 26 내지 40; 루프 2, 서열번호 1의 아미노산 50 내지 58, 서열번호 3의 아미노산 46 내지 54, 서열번호 5의 아미노산 97 내지 105, 및 서열번호 7의 아미노산 47 내지 55; 루프 3, 서열번호 1의 아미노산 70 내지 72, 서열번호 3의 아미노산 66 내지 68, 서열번호 5의 아미노산 117 내지 119, 및 서열번호 7의 아미노산 67 내지 69; 루프 4, 서열번호 1의 아미노산 80 내지 84, 서열번호 3의 아미노산 76 내지 80, 서열번호 5의 아미노산 127 내지 131, 및 서열번호 7의 아미노산 77 내지 81; 루프 5, 서열번호 1의 아미노산 92 내지 103, 서열번호 3의 아미노산 88 내지 99, 서열번호 5의 아미노산 139 내지 150, 및 서열번호 7의 아미노산 89 내지 100; 루프 6, 서열번호 1의 아미노산 110 내지 116, 서열번호 3의 아미노산 106 내지 112, 서열번호 5의 아미노산 157 내지 163, 및 서열번호 7의 아미노산 107 내지 113; 루프 7, 서열번호 1의 아미노산 122 내지 131, 서열번호 3의 아미노산 118 내지 127, 서열번호 5의 아미노산 169 내지 178, 및 서열번호 7의 아미노산 119 내지 128; 루프 8, 서열번호 1의 아미노산 137 내지 146, 서열번호 3의 아미노산 133 내지 142, 서열번호 5의 아미노산 184 내지 193, 및 서열번호 7의 아미노산 134 내지 143; 루프 9, 서열번호 1의 아미노산 158 내지 162, 서열번호 3의 아미노산 154 내지 158, 서열번호 5의 아미노산 205 내지 209, 및 서열번호 7의 아미노산 155 내지 159; 루프 10, 서열번호 1의 아미노산 169 내지 175, 서열번호 3의 아미노산 165 내지 171, 서열번호 5의 아미노산 216 내지 222, 및 서열번호 7의 아미노산 166 내지 172; 루프 11, 서열번호 1의 아미노산 179 내지 188, 서열번호 3의 아미노산 175 내지 184, 서열번호 5의 아미노산 226 내지 235, 및 서열번호 7의 아미노산 176 내지 185; 루프 12, 서열번호 1의 아미노산 199 내지 207, 서열번호 3의 아미노산 195 내지 203, 서열번호 5의 아미노산 246 내지 254, 및 서열번호 7의 아미노산 196 내지 204; 루프 13, 서열번호 1의 아미노산 214 내지 221, 서열번호 3의 아미노산 210 내지 217, 서열번호 5의 아미노산 261 내지 268, 및 서열번호 7의 아미노산 211 내지 218.
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"DSSP"(단백질 2차 구조의 사전(Dictionary of Protein Secondary Structure)을 상징함)로 표기된 각 배열 그룹의 5번째 라인에서 표시는 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)로부터 입수가능한 1 HZH(쇄 H) 구조를 취하였으며, 다음의 의미를 가진다: "G"는 최소 3개 잔기 길이를 가지는 3회전 나선(310 나선)을 표기하며; "H"는 최소 4개 잔기 길이를 가지는 4회전 나선(α 나선)을 표기하고; "I"는 최소 5개 잔기 길이를 가지는 5회전 나선(π 나선)을 표기하며; "T"는 수소 결합 회전(3, 4 또는 5 회전)을 표기하고; "E" 최소 2개 잔기 길이를 가지는 평행 및/또는 역평행 β-시트 구조의 연장된 가닥을 표기하며; "B"는 분리된 β-브릿지(단일쌍 β-시트 수소 결합 형성) 내 잔기를 표기하고; "S"는 벤드(단지 비수소결합 기반 배정)를 표기한다. 상기 구조 중 어떤 것에 있지 않은 아미노산 잔기는 "DSSP" 라인 내 블랭크 공간을 부여한다. 이들 표기은 당업계에서 표준이며, 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank: PDB)에 대한 웹사이트에서 입수가능하다.
인간 IgG Fc-단편의 힌지 영역은 표 1에 넘버링된 바와 같이 아미노산 216 내지 230으로 실행된다. CH2 영역은 아미노산 231로부터 340으로 연장되고, CH3 영역은 아미노산 341로부터 447로 연장된다. 이는 인간 IgG Fc-단편의 서열이 고도로 보존된 표 1의 배열로부터 명백하다. 대부분의 서열 차이는 힌지 영역에서 생기며, CH2와 CH3 영역에서 매우 적은 서열 차이가 생긴다. 따라서, 하나의 인간 IgG 서브타입의 CH2 또는 CH3 영역 내 삽입을 포함하는 인간 IgG 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드를 사용하여 얻은 결과는 다른 인간 IgG 서브타입에 적용될 가능성이 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 변이체 인간 IgG Fc-폴리펩타이드 내 삽입은 루프 내인 것으로 알려진 위치에서 생길 수 있다. 삽입은 Fc-폴리펩타이드의 Fc-단편 일부의 루프 1 내지 13(상기 표 1에서 나타낸 바와 같음) 중 어떤 것 내이거나 또는 인접하여 생길 수 있다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 또는 1 내지 18, 6 내지 16, 10 내지 16, 12 내지 14, 3 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 50, 또는 50 내지 80 아미노산의 삽입은 2개의 인접한 아미노산 간에 만들어질 수 있으며, 이 중 적어도 하나는 Fc-단편의 루프 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 사이의 아미노산을 이황화 결합에 의해 결합된 단단한 루프로 제한하기 위해서 2개의 시스테인은 삽입 내에 비무작위로 포함되며, 각각은 처음 및 마지막 4개의 삽입 아미노산 사이에 있다. 일부 실시형태에서, 삽입의 처음 3개 아미노산은 Gly-Gly-Cys이며, 마지막 3개 아미노산은 Cys-Gly-Gly이다. 추가적인 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 10 내지 30개 아미노산의 삽입은 이들 2개의 시스테인 사이에 삽입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 루프로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 결실되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 또는 1 내지 18, 6 내지 16, 10 내지 16, 12 내지 14, 15 내지 30, 30 내지 50 또는 50 내지 80 아미노산의 삽입에 의해 및/또는 처음 및 마지막 4개의 삽입 아미노산 사이에 2개의 시스테인을 함유하는 삽입에 의해 결실되고 대체된다. 결실된 아미노산의 수는 삽입되는 아미노산의 수와 동일하거나, 미만이거나 또는 초과일 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 삽입이 단일 루프에서 생길 수 있다. 삽입을 함유하는 변이체 Fc-폴리펩타이드는 대조군 Fc-폴리펩타이드보다 pH 5 내지 6에서 더 높은 친화도로 인간 FcRn에 결합될 수 있다. 삽입된 아미노산은 임의의 모든 20개의 아미노산 또는 시스테인 이외의 임의의 모든 아미노산을 포함할 수 있다. 추가로, 변이체 Fc-단편은 단지 하나의 루프 또는 하나 이상의 루프, 예컨대 2, 3 또는 4개의 루프 내 삽입을 포함할 수 있다.
Fc-단편의 루프 5, 8 또는 10 내이거나 또는 인접한 삽입은 pH 5 내지 6에서 인간 FcRn에 대해 이러한 변이체 Fc-단편의 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 구체적 실시형태에서, 삽입은 아미노산 358 내지 359의 루프 8 내이거나 또는 인접한 또는 아미노산 384 내지 385의 루프 10 내이거나 또는 인접한 인간 IgG Fc-단편에서 만들어질 수 있다(표 1에 도시한 바와 같은 EU 넘버링 계획을 사용). 삽입은 4 내지 20, 1 내지 18, 6 내지 16, 10 내지 16, 12 내지 14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 아미노산을 함유할 수 있다. 선택적으로, 아미노산은 시스테인 이외의 모든 아미노산으로 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 삽입은 처음 및 마지막 4개의 삽입 아미노산 사이의 시스테인을 함유할 수 있고, 다르게는 삽입된 아미노산은 시스테인 이외의 아미노산으로 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 삽입은 시스테인을 함유할 수 없다. 일부 실시형태에서, 삽입은 CXXXXXXC(서열번호 13), CXXXXXXXC(서열번호 14), CXXXXXXXXC(서열번호 15), GCXXXXXXCG(서열번호 16), GCXXXXXXXCG(서열번호 17), GCXXXXXXXXCG(서열번호 18), GGCXXXXXXCGG(서열번호 19), GGCXXXXXXXCGG(서열번호 20) 및 GGCXXXXXXXXCGG(서열번호 21), GGGCXXXXXXCGGG(서열번호 22), GGGCXXXXXXXCGGG(서열번호 23) 및 GGGCXXXXXXXXCGGG(서열번호 24)로 이루어진 군으로부터 선택된 식을 가질 수 있으며, 여기서 X는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다. 실제 삽입 결과는 이하의 실시예에 기재하는 바와 같은 선별 과정으로부터 초래되기 때문에, 이는 Fc-단편의 특성에서의 관찰되는 변화에 지배적인 역할을 할 가능성이 있는 무작위화된 아미노산이다. 이와 같이, 상기 기재한 것과 같이 일부 비무작위 아미노산을 함유하는 삽입의 무작위화된 일부만을 함유하는 삽입을 갖는 변이체 Fc-단편은 또한 원하는 특성을 가질 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 서열의 예는 서열 번호 41 내지 53의 중간의 6개 아미노산을 포함하며, 이는 서열번호 54 내지 66으로서 나타낸다.
다른 실시형태에서, 루프 5 내이거나 또는 인접한 아미노산 308 및 309(표 1에 나타낸 바와 같은 EU 넘버링을 사용)은 결실되거나 4 내지 20, 1 내지 18, 6 내지 16, 10 내지 16, 12 내지 14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 15 내지 20, 20 내지 40, 40 내지 60 또는 60 내지 80 아미노산으로 대체되며, 이들은 시스테인 이외의 모든 아미노산으로 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 삽입은 처음 및 마지막 4개의 삽입 아미노산 중에서 시스테인을 함유할 수 있으며, 다르게는 삽입된 아미노산은 시스테인 이외의 아미노산으로 제한될 수 있다. 삽입은 서열번호 13 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 식을 가질 수 있다.
상기 및 이하에 기재된 아미노산 삽입을 포함하는, 이들 변이체 Fc-단편뿐만 아니라 그것을 함유하는 Fc-폴리펩타이드는 대조군 Fc-단편에 비해 더 높은 친화도 및/또는 결합 활성으로 pH 5 내지 6에서 인간 FcRn에 결합될 수 있고, 대조군 Fc-단편과 유사하거나 또는 더 낮은 친화도 및/또는 결합활성으로 생리적 pH에서 인간 FcRn에 결합될 수 있다. 추가로, 이들 변이체 Fc-단편은 pH 5 내지 6에서 인간 FcRn에 대해 훨씬 더 높은 친화도 및/또는 결합활성, 생리적 pH에서 인간 FcRn에 대해 더 낮은 친화도 및/또는 결합 활성, 또는 저장시 안정성과 같은 다른 바람직한 특성을 부여하는 변성에 대해 추가로 변경되고, 선별될 수 있다. 이하의 실시예에서, Fc-단편 내의 정해진 부위에서 특정 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 41 내지 66 및 90 내지 246)의 삽입은 pH 5 내지 6에서 인간 FcRn에 대해 Fc-단편의 증가된 친화도 및/또는 결합활성에서 효과적으로 된다는 것이 나타난다.
인간 IgG 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드는 또한 표적 분자에 결합되는 결합 영역을 포함한다. 표적 분자에 대한 이러한 변이체 Fc-폴리펩타이드의 결합은 조절될 수 있으며, 선택적으로 표적 분자의 생물학적 활성을 길항하거나 또는 작용화할 수 있고/있거나 표적 분자가 발현되는 위치에 Fc-폴리펩타이드를 국소화하는 작용을 할 수 있다. Fc-폴리펩타이드는 Fc-폴리펩타이드 내 1개 이상의 결합 영역, 예컨대 2, 3 또는 4개의 결합 영역을 포함할 수 있다. Fc-폴리펩타이드는 멀티머 형태일 수 있기 때문에, 일부 경우에, 상이한 Fc-폴리펩타이드의 다이머, 트라이머 또는 테트라머는 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있는 멀티머 Fc-폴리펩타이드를 형성할 수 있다. Fc-폴리펩타이드 내 다수의 결합 영역이 있다면, 그것들은 동일 또는 상이한 표적 분자 또는 표적 분자의 일부에 결합될 수 있다. 표적 분자의 활성의 조절은 표적 분자에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병 또는 질환의 과정에 영향을 미칠 수 있다. 인간 IgG 변이체 Fc-폴리펩타이드는 하나 이상의 표적 분자에 결합되는 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함하는 결합 영역을 포함할 수 있다. 이러한 인간 IgG 변이체 Fc-폴리펩타이드는, 예를 들어 전장 항체, 예컨대 인간, 인간화된, 또는 키메라 IgG 항체, scFc-Fv, 항체의 1가 형태, 예컨대 다이머 Fc 영역뿐만 아니라 VH, CH1, VL, CL 및 힌지 영역을 포함하는 국제특허출원 WO 2005/063816호 및 미국출원 공개 제2007/0105199호(이것의 적절한 부분이 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 것일 수 있다. 추가 형태는, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국특허 공개 제2010/0286374호의 도 2에서 도 2를 설명하고/하거나 언급하는 본문과 함께, 및 미국특허 제5,837,821호에서 기재되며, 이는 Fc 영역에 연결된 scFv를 포함하는 "미니바디"를 기재한다. 미니바디를 기재하는 미국특허 제5,837,821호의 일부는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 대안적으로, 결합 영역은 표적 분자에 결합되는 비항체 단백질, 선택적으로 인간 단백질의 모두 또는 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 영역은, 예를 들어, 인간 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포밖 영역(서열번호 13) 또는 인간 T-림프구 결합 단백질-4(CTLA4) 단백질(서열번호 14)과 같은 수용체의 세포밖 부분을 포함할 수 있었다.
결합 영역은 표적 분자(예를 들어, 미국특허 제7,820,790호에 논의된 바와 같이 선택될 수 있는 표적 단백질에 결합되는 미국특허 제7,820,790호에서 정의되는 "모노머 단백질"), 또는 다른 펩타이드에 결합되는 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 모노머 단백질 및 그것들을 선택하는 방법을 기재하는 미국특허 제7,820,790호의 부분은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 이러한 펩타이드의 일 예는 Fc 융합 단백질 로미플로스팀(NPLATE(등록상표), 캘리포니아주 사우전드오크에 소재한 암젠 인코포레이티드)의 결합 부분이다. 문헌[Prescribing Information, NPLATE(등록상표), Amgen Inc., 2008-2011]. Fc 융합 단백질의 결합 영역의 부분일 수 있는 다른 폴리펩타이드는 특정 위치에서 무작위화된 스캐폴드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하며, 특정 표적 분자에 결합을 위해 선택된다. 이러한 스캐폴드는, 예를 들어 CTLA-4(Nuttall et al . (1999), Proteins 36: 217-227), 스타필로코커스(Staphylococcal) 단백질 1의 Z 도메인(Nord et al . (1995), Protein Eng. 8: 601-608), 녹색 형광 단백질, 및 인간 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN3; Koide et al. (1998), J. Mol. Biol. 284: 1141-1151; Karatan et al . (2004), Chem. & Biol. 11 : 835-844)을 포함한다. 스캐폴드 도메인 및 결합 도메인을 만들기 위한 그것의 사용을 설명하는 이들 참고문헌의 부분은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
결합 영역이 결합되는 표적 분자는 분자의 생물학적 활성의 조절이 질병 또는 질환 과정에 영향을 미칠 수 있는 분자 또는 질병 영역에서 국소화된 분자, 예를 들어 암 세포의 표면 상에서 발현된 단백질 일 수 있다. 자가면역 또는 염증성 질환에서, 표적 분자는 질환을 매개하는 역할을 하는 경로 내 분자 작용일 수 있다. 표적 분자는 표적 분자에 대한 결합이 질병 과정에 영향을 미칠 수 있도록 Fc-폴리펩타이드를 적절하게 위치시키도록 국소화된 분자일 수 있다. 예를 들어, Fc-폴리펩타이드가 독소를 포함한다면, 그것을 암 세포 상에서 고도로 발현되는 단백질에 결합되는 결합 영역에 의해 암 세포 근처에 위치시키는 것이 유리할 수 있다. 표적 분자는, 예를 들어 단백질의 일반적 분류, 예컨대 가용성 리간드, 수용체 결합 리간드, 가용성 수용체, 막 결합 수용체, 막 채널 단백질, 가용성 및 막 결합 단백질, 및 세포밖 및 세포내 표적 분자를 포함하는 비단백질 항원을 포함한다. 예시적인 표적 분자는 다음의 인간 단백질: 특히 종양 괴사 인자 수용체, 인터류킨-1, 인터류킨-6(IL-6), IL-6 수용체, CD80/86, CD20, CD33, CD52, 인터류킨-12, 인터류킨-23, 인터류킨-17, HER2, HER2 neu 수용체, 표피성장인자 수용체(EGFR), 혈관내피세포 성장인자(VEGF), B 세포 활성화 인자(BAFF), RANK 리간드, OR51E2, 클라우딘, CDH3, CD22, 보체 인자 및 스클러로스틴을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
변이체 Fc-폴리펩타이드가 생성되고/되거나 정제 방법이 사용되는 숙주 세포에 부분적으로 의존하여, 변이체 Fc-폴리펩타이드는, 예를 들어 진핵 세포 내 분비를 가능하게 하는 신호 서열(단백질의 성숙 형태에서 제거됨), 박테리아에서 번역을 가능하게 하는 N-말단 메티오닌, 및/또는 단백질 정제 또는 확인을 가능하게 하는 태그 서열(예를 들어, 폴리히스티딘 태그 또는 FLAG(등록상표) 태그)와 같은 추가적인 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
변이체 Fc -단편의 라이브러리를 암호화하는 핵산
또한 Fc-단편의 루프 내의 또는 인접하여 생기는 적어도 부분적으로 무작위화된 삽입을 갖는 Fc-단편을 암호화하는 핵산의 라이브러리가 본 명세서에 기재된다. 도 2는 이하의 실시예에서 기재되는 바와 같이 만들어지는 8개 라이브러리의 각가에 대해 형태를 도시한다. 이들 라이브러리의 서열 및 그것들에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 25 내지 40에 개시된다. 이러한 라이브러리는 대조군 Fc-단편에 비해 pH 5.0 내지 6.0에서 FcRn에 대해 향상된 친화도로 결합되는 변이체 인간 IgG Fc-단편을 암호화하는 개개의 핵산을 선택하기 위한 패닝(panning)에 유용하다. 이러한 변이체 인간 IgG Fc-폴리펩타이드는 또한 대조군 Fc-단편과 같이 적어도 pH 7.2 내지 7.6에서 FcRn에 불량하게 결합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 루프 영역을 암호화하는 영역(표 1에 제시된 바와 같음) 내 삽입을 지니는 Fc-단편을 암호화하는 핵산의 이들 라이브러리는 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이 Fc-단편 또는 낙타 종으로부터의 Fc-단편을 포함하는 인간 또는 동물 유래일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암호화된 Fc-단편은 IgG Fc-단편, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-단편, 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM 아이소타입의 Fc-단편일 수 있다. 루프를 암호화하는 핵산의 부분 내 삽입은 표 1에 나타내는 바와 같이 루프 1, 루프 2, 루프 3, 루프 4, 루프 5, 루프 6, 루프 7, 루프 8, 루프 9, 루프 10, 루프 11, 루프 12 또는 루프 13을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내이거나 또는 인접할 수 있다.
라이브러리 내 상이한 변이체의 수에 비해 라이브러리의 크기는 중요한 고려사항이다. 최고의 경우에, 라이르러리에 실시되는 패닝 절차는 라이브러리 내 포함된 모든 상이한 변이체를 포함할 높은 확률을 가질 것이다. 라이브러리 내 상이한 변이체의 수는 라이브러리 내 무작위화된 위치의 수 및 각 무작위화된 위치에서 사용될 수 있는 상이한 아미노산의 수에 의존한다. 예를 들어, 임의의 19개의 상이한 아미노산을 함유할 수 있는 6개의 무작위 위치를 갖는 라이브러리는 이론적으로 196
Figure 112014066923892-pct00023
4.7 x 107 상이한 변이체를 가질 수 있다. 예를 들어, 109개의 독립적 파지 또는 이들 변이체를 발현시키는 박테리아가 패닝된다면, 선별에서 선택되는 특성을 지니는 모든 단리물이 회수될 확율이 매우 높다. 예를 들어, 문헌[Grossman and Turner, Mathematics for the Biological Sciences, Chapter 2, Section 2.9, pp. 97-104, Macmillan Publishing Co., Inc., New York and Collier Macmillan Publishers, London, 1974]을 참조하며, 이것의 부분은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 원하는 특성을 지니는 희귀 단리물을 검출하는데 충분한 단리물을 선별할 수 있는 크기의 라이브러리가 고려된다. 따라서, 105 내지 1013, 106 내지 1012, 또는 107 내지 1010개의 상이한 변이체를 암호화하는 라이브러리가 고려된다.
Fc-단편-암호화 부분의 루프 5, 8 및 10을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내이거나 또는 인접한 무작위화된 삽입을 지니는 라이브러리가 유리할 수 있다. 이러한 라이브러리는 20 내지 40, 4 내지 20, 1 내지 18, 6 내지 16, 10 내지 16, 12 내지 14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 무작위화된 아미노산을 함유하는 루프 5, 8 또는 10 내이거나 또는 인접한 삽입을 지니는 Fc-단편을 암호화할 수 있다. 이들 무작위화된 아미노산은 시스테인 잔기에 측접할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 비무작위 아미노산은 또한 무작위화된 아미노산 전에 또는 후에 삽입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암호화된 무작위화된 아미노산은 Gly-Gly-Cys 다음에 Cys-Gly-Gly에 앞설 수 있다.
변이체 Fc - 폴리펩타이드 , Fc -단편을 암호화하는 핵산, 및 삽입
변이체 Fc-폴리펩타이드의 부분일 수 있는 특이적 변이체 Fc-단편을 암호화하는 핵산, 및 변이체 Fc-단편 내이거나 또는 인접한 삽입을 암호화하는 핵산이 또한 기재된다. Fc-단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991] 참조), 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc-단편을 암호화하는 서열(각각 서열번호 2, 4, 6 및 8)이 본 명세서에서 보고된다. Fc-단편 내에서 루프의 위치는 상세히 기술되며(표 1), 이들 영역 내로 다양한 삽입 종류는 본 명세서에 기재된다. pH 5 내지 6의 범위에서 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 아미노산 삽입을 암호화하는 서열이 또한 보고된다(예를 들어, 서열번호 41 내지 53 참조).
더 일반적으로는, 루프 내이거나 또는 인접한 삽입을 갖는 변이체 Fc-단편을 암호화하는 핵산이 기재되되, Fc-단편은 대조군 Fc-단편보다 pH 5 내지 6에서 더 높은 친화도로 인간 FcRn에 결합될 수 있다. 이러한 삽입이 일어나는 위치는 Fc-폴리펩타이드 내에서 루프 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13을 포함한다.
변이체 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 및 핵산에 의해 암호화된 단백질(들)이 발현되는 조건 하에서 세포를 배양시키는 단계에 의해 변이체 Fc-폴리펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 세포 덩어리 또는 배양 상청액으로부터 회수될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는, 예를 들어 이용가능한 방법 중에서, 단백질 A 또는 단백질 G 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다.
변이체 Fc -단편 및 Fc - 폴리펩타이드를 단리 및 제조방법
변이체 Fc-단편은 이하의 실시예에서 상세하게 기재되는 선별을 사용하여 단리될 수 있다. 넓은 의미에서, 루프 내이거나 또는 인접한 무작위 아미노산을 포함하는 삽입을 지니는 Fc-단편을 암호화하는 핵산의 라이브러리가 제조된다. 그 다음에, 이 라이브러리는 라이브러리로부터 핵산이 발현되는 조건 하에서 배양되는 바이러스 또는 세포 내로 도입되며, 따라서 바이러스(예를 들어 바큘로바이러스 또는 섬유상 파지일 수 있음) 또는 세포(예를 들어, 박테리아, 효모 또는 포유류 세포일 수 있음)는 삽입을 함유하는 Fc-단편을 나타낼 수 있다. 대안의 실시형태에서, 라이브러리는 원하는 특성을 지니는 Fc-단편 및 그것을 암호화하는 핵산이 이 혼합물로부터 선택될 수 있도록 리보솜 디스플레이 시스템에서 시험관내 번역될 수 있다. 대안적으로, CIS 디스플레이 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Odegrip et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (9): 2806-2810]을 참조하며, 이것의 적절한 부분은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 발명의 방법에서, pH 5 내지 6의 범위 내에서 대조군 Fc-단편에 비해 더 높은 친화도로 인간 FcRn에 결합될 수 있는 변이체 Fc-단편은 이하의 실시예에서 기재되는 바와 같은 FcRn에 의해 패닝됨으로써 풍부화될 수 있고, 예를 들어 단리물의 그룹 상에서 또는 단일 단리물 상에서 처음에 수행될 수 있는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 선별될 수 있다. ELISA가 처음에 단리물의 그룹 상에서 수행된다면, 이들 단리물은 개별적으로 증폭되고 재선별되어 pH 5 내지 6에서 인간 FcRn에 대해 향상된 친화도로 및 대조군 Fc-단편에 비해 생리적 pH에서 인간 FcRn에 대해 더 낮거나 또는 거의 동일한 친화도로 변이체 Fc-단편을 발현시키는 개개의 단리물을 얻을 수 있다.
추가 단계에서, 변이체 Fc-단편을 암호화하는 핵산은 파지 또는 세포, 예컨대 박테리아, 효모 또는 포유류 세포로부터 단리될 수 있거나, 또는 리보솜 디스플레이의 경우에 RNA로부터 증폭될 수 있다. 이들 핵산은 정확한 위치 및 삽입 특성을 결정하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 이 정보를 사용하여, 원하는 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 변이체 Fc-단편을 암호화하는 핵산은 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 변이체 Fc-단편 또는 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 추가 변형이 원한다면 착수될 수 있다.
이러한 핵산은 Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편이 발현될 숙주 세포에 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이들 핵산은 당업계에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 사용될 수 있는 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 포함하는 박테리아, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함하는 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 및 중국 햄스터 난소(CHO)세포, 293 세포, 및 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포를 특히 포함한다. 이들 숙주 세포는 도입된 핵산이 발현되는 조건 하에서 배양될 수 있고, Fc-폴리펩타이드 또는 Fc-단편은 배양 상청액으로부터 또는 세포 덩어리로부터 회수될 수 있다.
일반적으로, 숙주 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 사용되는 절차는 핵산이 도입되는 숙주 세포에 의존할 수 있다. 박테리아 내로 핵산을 도입하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 전기천공법 또는 염화칼슘 형질전환이 보통 사용된다. 효모 내로 핵산의 도입을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 아세트산 리튬 및 폴리에틸렌 글라이콜을 사용하는 형질전환 방법을 포함한다. 포유류 세포 내로 이종성 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공법, 리포좀 내 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화 및 핵 내로 DNA의 직접적 미세주입법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
임의의 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지를 위한 및 외인성 뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 전형적으로 다음의 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제원점, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위를 함유하는 완전 인트론 서열, 폴리펩타이드 분비를 위해 리더 서열을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택가능한 마커 구성요소.
변이체 Fc - 폴리펩타이드의 치료적 용도
본 명세서에 기재된 변이체 Fc-폴리펩타이드는 다양한 질환을 위한 인간 치료제로서 사용될 수 있다. 질환이 Fc-폴리펩타이드의 결합 영역(들)의 결합 영역(들)뿐만 아니라 가능하게는, 예를 들어 부착된 독성 모이어티와 같은 그것의 구조의 다른 양태에 의해 결정되는 변이체 Fc-폴리펩타이드가 적절하다. 변이체 Fc-폴리펩타이드는 대조군 Fc-폴리펩타이드에 비해 증가된 생체내 반감기를 가질 수 있고, 따라서 대조군 Fc-폴리펩타이드보다 더 낮고/낮거나 덜 빈번한 투약량이 필요할 수 있다. 따라서, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 덜 빈번한 투약량이 특히 바람직한 만성 질환을 치료하는데 적합할 수 있다. 그러나, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 대조군 Fc-폴리펩타이드(루프 내 삽입을 가지지 않는 것을 제외하고 변이체 Fc-폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가짐)가 치료를 위해 사용될 수 있는 대부분의 또는 모든 질환의 치료로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변이체 Fc-폴리펩타이드는 또한 치료되는 질환을 치료하기 위해 사용되는 다른 의약과 동시에 사용될 수 있다.
예를 들어, 루프 내 삽입을 함유하는 변이체 Fc-폴리펩타이드인 Fc 융합 단백질은 대조군 Fc-폴리펩타이드가 사용되는 동일한 질환에 대한 치료로서 사용될 수 있다. 그러나, 변이체 Fc-폴리펩타이드의 투약량 및/또는 빈도는 그것의 증가된 반감기 때문에 상이할 수 있다. 예를 들어, 변이체 Fc-폴리펩타이드는 각각의 이들 분자의 Fc-단편 부분 내 루프에서 본 명세서에 개시된 FcRn 결합을 향상시키는 삽입 중 하나, 예를 들어, 서열번호 41 내지 53를 삽입함으로써 치료적 Fc 융합 단백질, 예컨대 에타네르셉트(중등증 내지 중증의 류마티스 관절염, 다발성 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 중등증 내지 중증의 판상형 건선증에 대해 표시됨), 아바타셉트(중증등 내지 중증의 류마티스 관절염, 중증등 내지 중증의 다발성 소아 특발성 관절염에 대해 표시됨) 또는 로미플로스팀(만성 면역 혈소판 감소성 자반증에 대해 표시됨)으로부터 시작되서 만들어질 수 있었다. 삽입은, 예를 들어 Fc 융합 단백질의 Fc-단편 부분의 루프 5, 8 또는 10 내에서 또는 인접하여 만들어질 수 있었다. 에타네르셉트, 아바타셉트 또는 로미플로스팀의 이러한 변이체 형태는 미변성 에타네르셉트, 아바타셉트, 또는 로미플로스팀이 치료를 위해 사용될 수 있는 것과 동일한 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있었다.
유사하게는, 변이체 Fc-폴리펩타이드가 예를 들어, 아달리무맙, 유스티키누맙, 골리무맙, 나탈리주맙, 인플릭시맙, 또는 데노수맙과 같은 치료적 항체라면, 변이체 Fc-단편을 포함하는 항체의 이러한 변이체 형태는 미변형 형태로 이들 항체가 치료를 위해 사용되는 것과 동일한 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변이체 Fc-단편은 치료의 투약량 또는 빈도를 변화시킬 수 있지만, Fc-폴리펩타이드가 치료를 위해 사용되는 질환은 변화시키지 않는다.
일반적으로, Fc-폴리펩타이드는 특히 종양 적응증, 자가면역 및 염증성 질환, 뼈 관련 질환, 질환, 대사 질환 및 신경질환, 예를 들어 만성 통증을 포함하는 매우 다양한 질병을 치료하기 위해 사용된다.
약제학적 조성물
본 발명은 본 명세서에 기재된 변이체 Fc-단편 또는 변이체 Fc-폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 하나 이상의 추가적인 성분과 함께 치료적 유효량의 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 변이체 Fc-단편을 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 성분은 다수의 가능물 중에서 완충제, 탄수화물, 폴리올, 아미노산, 킬레이트제, 안정제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
투여 방법
이들 분자를 함유하는 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 변이체 Fc-단편, 또는 약제학적 조성물은 임의의 실현가능한 방법에 의해 투여될 수 있다. 단백질을 함유하는 치료제는 보통 경구가 일부 특별한 제형 또는 환경의 부재시 위의 산 환경에서 단백질의 가수분해를 야기하기 때문에 보통 주사에 의해 투여될 것이다. 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 병변내 또는 복강 주사가 가능한 투여 경로이다. 국소 투여는 또한, 특히 피부와 연루되는 질병에 대해 가능하다. 대안적으로, 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 변이체 Fc-단편은 점막과 접촉을 통해, 예를 들어 비강내, 설하, 질 또는 직장 투여에 의해 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 변이체 Fc-폴리펩타이드 또는 변이체 Fc-단편을 포함하는 특정 약제학적 조성물은 경구로 투여될 수 있다.
상기에 본 발명을 일반적으로 기재하였으며, 다음의 실시예는 예시의 방법에 의해 제한 없이 제공한다.
실시예
실시예 1: 인간 FcRn .인간 IgG1 Fc 의 3차 구조 모델의 생성
이하에 기재된 라이브러리의 설계를 돕기 위해, 인간 IgG1 Fc-단편과 복합체로 3차 구조 인간 FcRn의 상동성 모델을 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)(PDB 등록 번호 1 FRT)에서 입수가능한 래트 FcRn 및 래트 IgG Fc-단편의 구조에 기반하여 만들었다. 단백질 데이터 뱅크(PDB)를 각각 인간 IgG1 Fc-단편의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 인간 FcRn α 및 β-2-마이크로글로뷸린(β2m) 쇄, 서열번호 9 및 10으로 검색하였다. 아미노산 서열 상동성 및 3차 구조를 기반으로 몇몇 주형을 얻었다. FcRn α 쇄 구조(1EXU(쇄 A), 1FRT(쇄 A), 및 1|1 A(쇄 A)), FcRn β2m 쇄 구조(1CE6(쇄 B), 1HSA(쇄 B), 1YPZ(쇄 B), 1HHG(쇄 B) 및 1|1A(쇄 B)), 및 Fc 구조 1 HZH(쇄 H), 1|1A(쇄 C), 10QO(쇄 A), 1T83(쇄 A) 및 2J6E(쇄 A))를 선택하였다. FcRn α 구조 1 EXU(쇄 A), 1 FRT(쇄 A) 및 1|1 A(쇄 A)를 겹쳐 놓았고, 얻어진 평균 평방근 편차(root mean square deviation: RMSD), 즉, 겹쳐진 단백질 구조 내 유사한 원자 사이의 평균 거리 값은 0.30Å 내지 0.76Å이며, 평균 값은 0.59Å이다. FcRn β2m 도메인 구조 1 CE6(쇄 B), 1 HSA(쇄 B), 1YPZ(쇄 B), 1 HHG(쇄 B)와 1|1 A(쇄 B) 사이의 RMSD 값은 0.30Å 내지 0.76Å의 범위에 있으며, 평균값은 0.59Å이다. Fc 구조 1 HZH(쇄 H), 1|1 A(쇄 C), 10QO(쇄 A), 1T83(쇄 A) 및 2J6E(쇄 A) 사이의 RMSD 값은 0.30Å 내지 0.76Å의 범위에 있으며, 평균값은 0.59Å이다. 이들 RMSD 값은 상이한 공급원으로부터 주형 FcRn 및 Fc 구조가 매우 유사한 3차 구조를 공유한다는 것을 표시한다.
이들 주형 구조 및 인간 FcRn(hFcRn) 및 인간 IgG1 Fc-단편(hIgG1 Fc)의 아미노산 서열을 기반으로, hFcRn:hIgG1 Fc 복합체의 상동성 모델은 컴퓨터 소프트웨어 Molecular Operating Environment(MOE; 캐나다 퀘벡주 몬트리올에 소재한 케미컬 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group))의 리눅스 기반 분자 모델링 모듈을 사용하여 만들었다. 도 1은 hIgG1 Fc(이하) 및 hFcRn(상기)이 가장 가깝게 접촉되는 이 모델링된 복합체의 일부뿐만 아니라 이들 단백질의 일부 인접한 영역을 나타낸다.
실시예 2: 삽입 라이브러리의 구성
변이체 인간 IgG1 Fc 영역을 암호화하는 8개의 라이브러리(각각의 라이브러리는 상이한 삽입 종류를 가짐)를 구성하였다. 도 2는 인간 IgG1 Fc 영역의 서열 및 6개 삽입 라이브러리의 위치 및 형태를 나타낸다. 이하에 기재된 삽입 라이브러리가 삽입되는 루프의 위치는 L1, L2A, L2B, L3, L4, L5, L6A 및 L6B으로서 도 1 및 도 2에 표시한다. Fc 내 일부 삽입 부위는 hIgG1 Fc과 hFcRn(예컨대 L1, L2A, L2B 및 L3) 사이의 가장 가까운 접촉점 사이에 있으며, 다른 것(L4, L5, L6A 및 L6B)은 hFc와 hFcRn 사이의 가장 가까운 접촉점으로부터 일정한 거리에 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 라이브러리, 예컨대 L1, L2A, L2B 및 L3의 일부에서, 루프 내의 아미노산은 결실되거나 무작위 아미노산으로 대체되고, 약간 더 큰 수의 아미노산에 의한 대부분의 경우에 결실되었다. 무작위화된 아미노산은 시스테인 이외의 모든 아미노산을 포함하였다. 라이브러리 L2B에서, 6개의 무작위 아미노산은 서열 Gly-Gly-Cys에 앞서며, 그 다음에 서열 Cys-Gly-Gly이 온다. 2개의 시스테인이 이황화 브릿지를 형성하는 것으로 형성하여 그것의 근접성을 제공하는 것으로 예상되기 때문에, 시스테인 사이의 6개 무작위 아미노산은 공간적으로 제한된 루프를 형성하는 것으로 예상되었다. 예를 들어, L2B에서, 6개의 무작위 아미노산은 서열 Gly-Gly-Cys에 앞서며, 그 다음에 서열 Cys-Gly-Gly이 오고, 따라서 무작위 아미노산을 함유하는 공간적으로 제한된 루프를 만들었다. 다른 라이브러리, 즉, L4 및 L5에서, 무작위화된 아미노산을 정상적으로 존재하는 임의의 아미노산을 결실시키지 않고 삽입하였다.
PCR의 2회 라운드를 사용하여 인간 IgG1 변이체 Fc-단편의 그룹을 암호화하는 L1, L2A, L2B, L3, L4 및 L5 라이브러리를 구성하였다. 반응의 제1 라운드에서 PCR 반응의 제1 및 제2 세트에 사용된 주형은 인간 IgG1 Fc-단편을 암호화하는 DNA(서열번호 2)가 적절한 박테리아 균주(pIgG1-Fc) 내 파지 코트 단백질의 부분으로서 그것을 발현시키도록 삽입된 플라스미드 벡터였다. 라이브러리를 만들기 위해 사용한 반응의 제1 라운드에서 PCR 반응의 제1 세트는 상류 단부에서 ApaLI 제한 효소 부위를 함유하는 PCR 단편을 만들기 위해 순방향 및 역방향 프라이머(forward and reverse primers)를 이용하였다. Fc-단편을 암호화하는 영역 상류의 벡터 서열을 매칭한 역방향 프라이머 다음에 반응의 제1 라운드에서 PCR 반응의 모든 제1 세트에 대해 사용하였다: 5'-GTTCCT TTC TAT TCTCAC-3'(서열번호 521). Fc-암호화 서열 내에 있는 역방향 프라이머는 다음과 같다: 5'-GAG GGT GTC CTT GGG TTT TGG GGG-3'(서열번호 522; 라이브러리 L1); 5'-GGT GAG GAC GCT GAC CAC ACG GTA-3'(서열번호 523; 라이브러리 L2A 및 L2B); 5'-ATG CAT CAC GGA GCA TGA GAA GAC-3'(서열번호 524; 라이브러리 L3); 5'-ATT ATG CAC CTC CAC GCC GTC CAC-3'(서열번호 525; 라이브러리 4); 및 5'-ATT GCT CTC CCA CTC CAC GGC GAT-3'(서열번호 526; 라이브러리 L5).
또한 반응의 제1 라운드에서 PCR 반응의 제2 설정은 주형으로서 pIgG1-Fc를 사용하였고, 역방향 프라이머로서 Fc-암호화 서열 하류의 벡터 서열의 보체를 매칭한 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 이 역방향 프라이머는 다음의 서열을 가졌다: 5'-CCC ATT CAG ATC CTC TTC-3'(서열번호 527). 이들 반응을 위해 사용한 순방향 프라이머는 다음과 같았다: 라이브러리 L1, 5'-AAA CCC AAG GAC ACC CTC(TRIM)6 ACC CCT GAG GTC ACA TGC-3'(서열번호 528); 라이브러리 L2A, 5'-GTG GTC AGC GTC CTC ACC (TRIM)6 CAC CAG GAC TGG CTG AAT-3'(서열번호 529); 라이브러리 L2B, 5'-GTG GTC AGC GTC CTC ACC GGT GGT TGT(TRIM)6 TGT GGT GGT CAC CAG GAC TGG CTG AAT-3'(서열번호 530); 라이브러리 L3: 5'-TCA TGC TCC GTG ATG CAT(TRIM)5 CAC (TRIM)1 CAC TAC ACG CAG AAG AGC-3'(서열번호 531); 라이브러리 L4: 5'-GGC GTG GAG GTG CAT AAT GGT GGT TGT(TRIM)6 TGT GGT GGT GCC AAG ACA AAG CCG CGG-3'(서열번호 532); 및 라이브러리 L5: 5'-GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT(TRIM)6 TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC AAC-3'(서열번호 533). 이들 올리고뉴클레오타이드에서, "TRIM"은 시스테인을 제외한 모든 아미노산을 암호화하는 트라이뉴클레오타이드의 혼합물을 나타낸다(트라이머 포스포르아미다이트 혼합 2, 글렌 리서치(Glen Research) 카탈로그 번호 13-1992-95). 혼합물은 다음의 트라이뉴클레오타이드의 등몰 혼합물이다: AAA, AAC, ACT, ATC, ATG, CAG, CAT, CCG, CGT, CTG, GAA, GAC, GCT, GGT, GTT, TAC, TCT, TGG, TTC. 따라서, 시스테인을 제외한 모든 아미노산을 암호화하는 코돈은 TRIM 혼합물에서 거의 동일하게 나타났다. 따라서, "(TRIM)6"은 시스테인을 제외한 임의의 아미노산을 암호화하는 6개 무작위 트라이뉴클레오타이드가 올리고에 포함된다는 것을 의미한다.
PCR 반응의 제2 라운드(각 라이브러리에 대해 하나)에서, 상기 기재한 제1 라운드로부터의 PCR 반응의 제1 및 제2 세트로부터의 산물은 주형으로서 작용하였다. 사용한 프라이머는 모든 라이브러리에 대해 동일하였고, 다음과 같았다: 5'-GTT CCT TTC TAT TCT CAC-3'(순방향; 서열번호 534) 및 5'-CCC ATT CAG ATC CTC TTC-3'(역방향; 서열번호 535).
라이브러리 L6A 및 L6B를 주형으로서 pIgG1-Fc를 사용하여 PCR의 1 라운드에서 구성하였다. 이하에 기재된 PCR 반응에서, Fc-단편에 대한 암호 영역 내 XmaI 제한 부위(5'-CCCGGG-3')는 프라이머의 서열에 기인하여 XhoI 제한 부위(5'-CTCGAG-3")로 변화되었다. 이들 변성은 미변형 pIgG1-Fc로부터 상이한 아미노산을 암호화하지 않는 침묵 돌연변이였으며, XhoI + NotI 제한 분해가 XmaI + NotI 분해보다 더 효율적이기 때문에 만들어졌다. 이들 반응에 대해 사용된 순방향 프라이머는 다음과 같았다: 라이브러리 L6A: 5'-CTG CCC CCA TCT CGA GAT GAG CTG GGT TGT (TRIM)8 TGT GGT GGT ACC AAC CAG GTC AGC CTG ACC-3'(서열번호 536); 및 라이브러리 L6B: 5'-CTG CCC CCA TCT CGA GAT GAG CTG GGT TGT(NNK)8 TGT GGT GGT ACC AAC CAG GTC AGC CTG ACC-3'(서열번호 537). 역방향 프라이머 서열은 5'-GGC CCC GTG ATG GTG ATG ATG-3'(서열번호 538)이었다. 32개의 축퇴성 코돈에서 모두 20가지 아미노산을 암호화하는 트라이뉴클레오타이드를 함유하는 L6B에서 NNK로 불리는 트라이뉴클레오타이드의 혼합물이 사용되었다. 이 트라이뉴클레오타이드 혼합물에서, "N"은 아데노신, 구아니딘, 사이티딘 또는 티미딘 중 하나인 무작위 위치를 나타내며, "K"는 구아니딘 또는 티미딘 중 하나인 부분적으로 제한된 위치를 나타낸다.
모든 PCR 반응에 대해, PCR 코어 키트를 다음의 반응 조건에 의해 사용하였다(로슈(Roche), 카탈로그 번호 11 578 553 001): 95℃에서 5분 동안 다음에, 30주기의 95℃에서 45초- 55℃에서 45초- 72℃에서 90초, 및 최종적으로 72℃에서 10분. PCR 반응으로부터의 DNA를 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠(QIAGEN), 28104)를 사용하여 정제하였다. 약 200㎍의 파지미드 벡터 DNA 및 10g의 정제된 PCR 산물(PCR 반응의 제3 라운드로부터)을 ApaLI 및 NotI(라이브러리 L1 내지 L5에 대해) 및 XhoI 및 NotI(라이브러리 L6A 및 L6B에 대해)로 분해시켰다. 분해한 DNA를 QIAquick Gel 정제 키트(퀴아젠, 28704)로 겔 정제하였다.
1:2의 몰 비에서 분해된 벡터 DNA 및 라이브러리 PCR 산물을 T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 사용하여 결찰시켰다. 혼합물을 16℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. DNA를 에탄올 침전에 의해 정제시켰다. 전체 25㎍의 DNA를 200Ω 저항 및 25μF 전기용량을 사용하여 2.5 kV 전기장에서 1000㎕의 전기천공적격 XL1 청색 이콜라이 세포(스트라타겐) 내로 전기천공시켜서 약 1 x 109 이콜라이 형질전환체를 얻었다. 라이브러리의 정확한 크기는 7 x 108(L5에 대해) 내지 1.8 x 109(L4에 대해)의 범위에 있었다. 세포를 100㎍/㎖ 암피실린 및 2% 글루코스를 함유하는 1000㎖의 2x YT 배지(이는 pH 7.0 내지 7.2에서 16 g/ℓ 박토(Bacto) 트립톤, 10 g/ℓ 박토 효모 추출물, 및 5 g/ℓ NaCl을 함유) 내에서 접종시켰고, OD600이 약 0.5가 될 때까지 성장시켰다. 밀리리터 당 약 3 x 109 플라크 형성 단위(PFU/㎖)의 M13 헬퍼 파지를 그 다음에 첨가하였고, 배양물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 감염 세포를 원심침전시켰고, 100㎍/㎖ 암피실린 및 40㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 1000㎖의 2x YT 배지와 함께 재현탁시켰다. 세포를 30℃에서 밤새 성장시켰다. 그 다음에 파지를 PEG 6000로 침전시켰다.
L6A 및 L6B 이외에, 이들 형질전환에서 사용한 모든 라이브러리는 6개의 무작위 코돈을 함유하였고, 이들 각각은 19개의 상이한 아미노산 중 어떤 것에 의해 암호화되었으며, 따라서 약 4.7 x 107(196)개의 상이한 변이체 Fc-단편을 암호화하는 것으로 예상되었다. 유사하게, L6A는 약 1.76 x 1010(208)개의 상이한 변이체 Fc-단편을 암호화하는 것으로 예상되었는데, 그것이 20개의 상이한 아미노산 중 어떤 것을 암호화한 8개의 무작위 코돈을 함유하였기 때문이다. 라이브러리 L6A 및 L6B 이외의 라이브러리에 대해, 각 라이브러리에서 예상된 수의 상이한 변이체가 주어지면, 약 109(7 x 108 내지 1.8 x 109의 범위)의 라이브러리 크기는 변이체 수의 7 내지 33배였다.
실시예 3: Fc 루프 라이브러리의 선별
pH 6.0에서 야생형 Fc-단편에 비해 증가된 친화도로(pH 7.4에서 낮은 결합 친화도를 가짐) FcRn에 결합되는 변이체 Fc-단편을 발현시키는 파지에 대해 패닝의 2 라운드를 다음과 같이 수행하였다. 제1 라운드에서, 파지를 0.4 ㎖ 20mM MES, pH 6.0, 5% 탈지유, 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유하는 액체 중에서 재현탁시켰다. MAXISORP(상표명) 면역플레이트(뉴욕주 로체스터에 소재한 눈크(Nunc))의 4개 웰의 각각을 10㎍의 hFcRn으로 코팅하였고, 5% 탈지유로 차단시켰으며, 5 x 1011 PFU/㎖에서 100㎕의 파지를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션시킨 후, 웰을 20mM MES, pH 6.0, 0.2% 트윈(Tween) 20으로 3 내지 10회 세척하였다. 100㎕ 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션시킴으로써 파지를 용리시켰다. 이들 파지를 사용하여 이콜라이 XL1-블루 배양물을 기하급수적으로 성장시키도록 재감염시켰고, 이를 약 0.5의 OD600에 도달될 때까지 배양시켰다. 약 3 x 109 PFU/㎖의 M13 헬퍼 파지를 그 다음에 첨가하였고, 배양물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 감염 세포를 원심침전시켰고, 100㎍/㎖ 암피실린 및 40㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 1000㎖의 2x YT 배지로 재현탁시켰다. 세포를 30℃에서 밤새 성장시켰다. 그 다음에 파지를 PEG6000으로 침전시켰다.
이들 파지를 사용하여, 패닝의 제2 라운드를 제1 라운드에서 사용한 것과 본질적으로 동일한 방법을 사용하여 수행하였다. 약하게 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된 FcRn의 농도를 감소시키고 세척 수를 증가시킴으로써 패닝의 엄격도를 약간 증가시켰다. 몇 번의 세척 후 용리 파지를 사용하여 약 0.5의 OD600에서 기하급수적으로 성장하는 이콜라이 XL1-블루 배양물을 재감염시킨 다음, 37℃에서 1시간 동안 배양시켰고, 약 100㎍/㎖ 암피실린 및 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 플레이팅하여 콜로니를 얻었다.
100㎍/㎖ 암피실린 및 2% 글루코스를 함유하는 120㎕/웰 2x YT 배지를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트 내로 단일 콜로니를 접종시켰다. 약 0.5의 OD600에 도달되었을 때, 진탕기 상의 37℃에서 세포를 성장시켰다. 그 다음에 3 x 109/㎖ M13 헬퍼 파지를 각 웰에 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 세포를 원심침전시켰고, 100㎍/㎖ 암피실린 및 40㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 180㎕/웰 2x YT 배지와 함께 재현탁시켰다. 그 다음에 배양물을 진탕기 상에서 30℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
2㎍/㎖에서 대략 100㎕의 바이오티닐화된 인간 FcRn을 10㎍/㎖ 스트렙타비딘으로 코팅한 MAXISORP(상표명) 플레이트의 웰에 첨가하였다. PBS + 0.05% 트윈(Tween) 20(PBST)로 5회 세척 후, pH 6.0 또는 pH 7.4에서 MES 완충제 중의 밤새 배양시킨 배양물로부터의 파지를 플레이트에 첨가하였고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 호스래디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase: HRP)-컨쥬게이트된 항-M13 항체를 사용하여 결합 파지를 검출하였고, 플레이트를 시각적 범위에서 파장을 사용하여 마이크로타이터 플레이트 판독기에 의해 스코어링하였다. pH 5.5에서 더 높은 신호(대조군 Fc-단편에 의해 만들어진 대략 150%의 신호) 및 pH 7.4에서 대조군 Fc-단편과 비슷하거나 또는 더 낮은 신호를 기반으로 양성을 선택하였다. 단리된 콜로니의 단일 96웰 마이크로타이터 플레이트를 각 라이브러리에 대해 시험한 스크리닝의 제2 라운드에서, 라이브러리 L2B, L3 또는 L4에 대해 양성이 검출되지 않았다. 라이브러리 L2A에 대해 선정한 약 20%의 콜로니는 양성이었고, 라이브러리 L6A 및 L6B에 대해 선정한 약 10%의 콜로니와 같았다. 라이브러리 L5는 모든 다른 라이브러리와 명확하게 구별될 수 있었는데, 약 90%의 선정된 콜로니는 양성이었기 때문이다. 따라서, 라이브러리 L5는 큰 차이에 의해 가장 양성으로 생성된 라이브러리였다. 이들 데이터는 라이브러리 5가 삽입되는 부위가 pH 5 내지 6에서 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 변이체의 단리에 대해 특히 바람직한 한편, 생리적 pH에서 FcRn에 대한 Fc-단편의 낮은 친화도를 유지한다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 라이브러리 L2A, L5, L6A 및 L6B로부터 양성을 선택하였는데, 이를 시퀀싱시켰고, 이하에 기재하는 바와 같이 추가로 특성규명하였다. 정량적 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결합을 평가하였다. ELISA 스코어는 결합 친화도를 반영하며, 더 큰 스코어는 더 큰 친화도를 의미한다. 전형적으로, 약 3 내지 5보다 더 높은 스코어는 배경 초과의 결합을 나타낸다. ELISA에서 이들 양성의 삽입 순서 및 그것의 스코어를 이하의 표 2에 나타낸다. 라이브러리 L5에 대해, 삽입은 도 2에서 넘버링에 따라 N169 내지 G170이다. 라이브러리 6A 및 6B에 대해, 삽입은 도 2에서 넘버링에 따라 L143 내지 T144이다.
Figure 112014066923892-pct00024
Figure 112014066923892-pct00025
Figure 112014066923892-pct00026
실시예 4: 결합 및 해리 속도에 대한 연구
파지 ELISA에 의해 확인된 변이체 Fc-단편의 일부를 추가로 특성규명하기 위해, pH 6 및 7.4에서 FcRn에 대한 변이체 Fc-단편의 결합을 확인한 변이체 Fc-단편의 서브세트에 대해 특성규명하였다. 선택된 변이체 Fc-단편 단리물을 암호화하는 DNA, 라이브러리 L5로부터의 모두를 포유류 발현 벡터 내로 도입하였고, 이를 적절한 부분이 본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌[Thomas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 102(16): 5679-5684, 2005)]에 의해 기재된 바와 같이 본질적으로 디아실화된 PEI를 사용하여 293 6E 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. FcRn에 결합을 위해 높은 ELISA 스코어를 갖는 단리물을 선택하였다. 조건화된 배지(CM) 내 변이체 Fc-단편의 농도를 옥텟 레드(Octet Red)(등록상표)(캘리포니아주 멘로 파크에 소재한 포르테바이오 인코포레이티드(ForteBio Inc.)) 상에서 단백질 A 바이오센서(Protein A Biosensors)(포르테바이오 인코포레이티드, 카탈로그 번호 18-5010)로 1:2 및 1:10 희석 CM 샘플을 사용하여 측정하였다. 정제된 Fc 융합 단백질로 만든 표준 곡선을 사용하여 농도를 계산하였다.
100nM에서 바이오티닐화된 hFcRn을 실온에서 2시간 동안 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(포르테바이오 인코포레이티드, 18-5019) 오프라인 상에서 포획하였다. 옥텟 레드(Octet Red)(등록상표) 시스템에서 이들 바이오티닐화된 hFcRn-코팅된 SA 바이오센서를 사용하여, 비표지 단백질의 결합 및 해리는 빛의 회절을 통해 실시간으로 검출할 수 있다. 변이체 및 대조군 Fc-단편 CM 샘플을 pH 6 또는 pH 7.4에서 10㎍/㎖로 희석시켰다. 3가지의 결합 및 해리 조건을 설정하였다: (1) pH 6에서 결합 및 pH 6에서 해리; (2) pH 6에서 결합 및 pH 7.4에서 해리; 및 (3) pH 7.4에서 결합 및 pH 7.4에서 해리. 바이오틴화된 hFcRN로 코팅된 SA 바이오센서를 특이적 pH에서 1분 동안 완충제에 담근 다음, 특이적 pH에서 5분 동안 변이체 Fc-단편 또는 대조군을 함유하는 샘플 중에서 침지시켜 FcRn에 결합시켰다. 그 다음에 Fc 바이오센서를 5분 더 특이적 pH에서 완충제 중에서 침지시켜 결합된 Fc-단편을 FcRn으로부터 해리시켰다. 옥텟 레드(Octet Red)(등록상표) 시스템을 사용하여 보충한다면 Fc-단편의 결합 및 해리의 검출은 바이오층 간섭측정의 사용을 통해 가능하였고, 따라서 결합 및 해리를 실시간으로 검출하였다.
상이한 pH에서 변이체 Fc-단편의 결합 및 해리 속도를 대조군과 비교하였다. 대조군 Fc-단편에 비해 pH 6에서 더 높은 결합, pH 6에서 더 느린 오프 속도, pH 7.4에서 매우 약한 결합, pH 7.4에서 더 빠른 오프 속도를 추가 특성규명을 위한 변이체 Fc-단편의 선택을 위해 사용하였다. 시험한 다수의 61개 변이체 Fc-단편은 대조군 Fc-단편에 대해 pH 6에서 결합 후, pH 6에서 더 많은 결합 및 더 느린 해리 및 pH 7.4에서 비슷하거나 또는 더 느린 해리를 나타내었다. 도 3은 가장 바람직한 특성을 가진 시험한 24 변이체 Fc-단편에 대해 pH 6(중앙 수직선의 왼쪽에 대해)에서 결합 및 pH 7.4(중앙 수직선의 오른쪽) 곡선에서 해리를 나타낸다. 곡선의 오른쪽에 대해 시험한 각 변이체 Fc-단편의 명칭은 실험의 결합 단계 동안 관찰한 최대 결합 반응(나노미터(㎚))에 따라 열거한다. 최대 반응에 대한 절대 수는 실험에 따라 다소 다를 수 있으며, kon, kdis, 또는 KD(kdis/kon)와 같은 결합 상수에 직접 비례하지 않는다. 도 3에서, 야생형 Fc-단편에 의해 가장 낮은 결합 반응을 관찰하였고, 나타낸 모든 변이체는 pH 6에서 더 높은 반응을 가졌다. 야생형 Fc-단편이 해리된 것과 같이 대부분의 변이체 Fc-단편은 pH 7.4에서 빠르게 해리되었다. 그러나, 변이체 5-1은 명확하게 임의의 다른 변이체보다 pH 7.4에서 훨씬 더 느리게 해리된 반면, 모든 다른 변이체는 야생형 Fc-단편이 해리된 것과 같이 pH 7.4에서 빠르게 해리되었다. Fc 변이체 5-85는 pH 6에서 가장 큰 반응을 지니며 또한 pH 7.4에서 빠르게 해리된 변이체로서 두드러졌다. 다수의 다른 변이체, 예컨대 특히 5-106, 5-104, 5-112, 5-79, 5-51 및 5-69는 pH 6에서 높은 반응 및 pH 7.4에서 빠른 해리를 가졌다. 따라서, 개선된 특성을 지니는 다수의 변이체 Fc-단편은 라이브러리 L5로부터 단리되었다.
실시예 5: 변이체 Fc -단편의 생성
선택된 단리물을 암호화하는 DNA, 즉, 라이브러리 L5로부터의 모두를 포유류 발현 벡터에 도입하였고, 적절한 부분이 본 명세서에 참조로서 포함된 문헌[Thomas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 102(16): 5679-5684, 2005)]에 의해 기재된 바와 같은 본질적으로 데아실화된 PEI를 사용하여 293 세포를 형질감염시키는데 사용하였다. 이 시스템에서 발현의 용이함 및 번역 후 처리에 기인하여 포유류 세포를 선택하였다. 사용된 단백질 발현 및 생성 방법은 적절한 부분이 본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌[Durocher et al. (Nucl. Acids Res. 30(2): e9, 2002)]에서 기재된다. 분비된 변이체 Fc-단편을 단백질 A 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 배양 배지로부터 정제하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography: HPLC)를 사용하여 Fc-단편의 순도를 확인하였다. 정제 방법에서 일반적 가이드를 위해, 문헌[Methods in Molecular Biology: Protein Purification Protocols v.244, Cultler, ed., Humana, New Jersey, 2004] 참조. Fc 변이체의 단백질 역가를 폴리아크릴아마이드 겔의 쿠마씨 블루 염색에 의해 평가하였다. 모든 단리물을 시험을 위해 적절한 수준에서 발현시켰다.
실시예 6: 변이체 Fc -단편의 열 안정성
시차주사 열량법(DSC)은 열 변성에 기인하여 언폴딩의 엔탈피(ΔH)를 측정한다. 용액 중의 단백질(또는 다른 마크로-) 분자는 천연의 폴딩 집단과 변성 언폴딩 집단 사이의 평형상태에 있다. 50%의 단백질 분자가 언폴딩될 때, 열 전이 중심점(Tm)이 높을 수록, 분자는 더 안정하다. DSC는 또한 변성의 열 용량(ΔCp)에서 변화를 결정하기 위해 사용된다. MicroCal VP-Capillary DSC(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 GE 헬스케어(GE Helathcare))에 의해 DSC 실험을 수행하여 다양한 Fc-단편의 Tm을 측정하였다. 각 실험에서 정제된 대조군(Fc-WT) 또는 변이체 Fc-단편의 농도는 10mM 아세트산나트륨에서 0.5 ㎎/㎖, pH 5에서 9% 수크로스였다. 샘플을 60℃/시간의 가열 속도에서 20℃로부터 95℃로 가열하였다. 개개 도메인의 50%가 언폴딩일 때, 개개의 도메인의 열 전이 중심점(Tm)을 결정하였다. 변이체 Fc-단편 및 대조군 야생형 Fc-단편의 Tm 값을 이하의 표 3에 열거한다.
Figure 112014066923892-pct00027
이들 데이터는 CH2 도메인의 Tm이 CH3 도메인에 있는 라이브러리 L5 삽입에 의해 실질적으로 영향받지 않는다는 것을 나타낸다. CH3 도메인의 Tm이 대조군 Fc-단편(Fc-WT)에 비해 변이체 Fc-단편에서 약간 감소되었지만, 변이체 Fc-단편 내 CH3 도메인의 Tm 값은 CH2 도메인의 Tm 값보다 대략 10℃ 더 높았다. 따라서, 전체 Fc 도메인의 열 안정성의 더 낮은 역치, 즉, CH2 도메인의 Tm은 영향받지 않는다.
실시예 7: 인간 또는 사이노몰거스 FcRn 에 대한 변이체 Fc -단편의 결합
인간 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn에 대한 변이체 Fc-단편의 결합을 pH 5.5와 pH 7.4 둘 다에서 비아코어(BIAcore)(등록상표) T100 분석 시스템(스웨덴 웁살라에 소재한 GE 헬스케어 바이오-사이언스 AB 프라이베이트 리미티드 리어빌리티 컴퍼니(GE Healthcare Bio-Sciences AB Private Limited Liability Company))을 사용하여 시험하였다. 시험은 결합 조건 하에 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 FcRn의 고정량과 함께 다양한 농도의 변이체 Fc-단편 또는 대조군 Fc-단편을 인큐베이션하는 단계 및 후속적으로 Fc-단편이 고정된 표면에(CM5(비아코어) 칩의 유동세포에서) 결합에 의해 이들 혼합물 중의 유리, 미결합 FcRn의 양을 측정하는 단계로 이루어졌다. 칩 상에 고정된 Fc-단편은 혼합물 중의 본질적으로 모든 유리, 미결합 FcRn으로 결합을 위해 충분한 양이었다. 따라서, 혼합물 중의 미결합 FcRn의 양을 비아코어(BIAcore)(등록상표) T100 분석 시스템의 사용을 통해 표면 형광 공명에 의해 정량적으로 알아내었다. 이 정보로부터, EC50, 즉, 혼합물 중의 FcRn의 50%가 결합된 변이체 또는 대조군 Fc-단편의 농도를 계산하였다. 처음에, 상기 기재한 실험에서 확인한 23개의 변이체-Fc-단편의 그룹(Fc-5-1은 대조군으로 고려됨)을 인간 FcRn에 결합을 위해 시험하였다. 이들 데이터를 기반으로, 14개의 변이체 Fc-단편을 선택하였고, 사이노몰거스 원숭이 FcRn에 대한 결합을 위해 추가로 시험하였다.
실험 프로토콜을 이하에서 더욱 상세하게 기재한다. 시험하는 Fc-단편을 293 세포에서 생성하였고, 상기 기재한 바와 같이 정제하였다. 야생형 인간 대조군 Fc-단편(Fc-WT) 및 변이체 Fc-단편(Fc-5-1)을 6000 공명 유닛(resonance unit: RU) 주위의 밀도와 결합되는 아민을 사용하여 CM5 칩(비아코어)의 유동 세포 상에 고정시켰다. Fc-5-1을 사용하였는데, 그것은 Fc-WT과 달리 pH 7.4에서 FcRn 웰에 결합되기 때문이다. 결합된 고정 단백질이 없는 하나의 유동 세포를 배경 대조군으로서 사용하였다. pH 7.4에서 용액으로 샘플 간의 세척에 의해 연속적 샘플에 대해 단일 유동 세포를 사용하여 유동 세포 상에 고정시킨 Fc-단편에 결합된 FcRn을 방출시키는 것이 가능하였다.
상이한 분자 및 시험 조건에 대해 합리적인 신호를 얻기 위해, 상이한 분석 조건을 사용하였다. pH 5.5에서 분석에 대해, 10nM의 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 FcRn을 시험되는 변이체 및 대조군 Fc-단편의 단계 희석물(0.1 ~ 2,000nM의 범위에 있음)과 혼합하였고, 10mM 아세트산나트륨, pH 5.5, 150mM NaCl, 0.005% P20, 0.1 ㎎/㎖ BSA 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로서, 10mM 인간 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn을 동일한 용액 중에서 동시에 그리고 바로 위에 기재한 동일한 온도에서 각각 인큐베이션시켰지만, Fc-단편을 첨가하지 않았다. 이들 샘플에서, 추정적으로 모든 FcRn은 미결합이었다. 고정 Fc-WT 및Fc-5-1에 이들 혼합물의 각각에서 유리 미결합 FcRn의 결합을 유세포 상의 표면을 거쳐서 혼합물을 주입하고, 표면 플라즈몬 공명을 통해 표면에 결합된 FcRn을 검출함으로써 측정하였다.
pH 7.4에서 분석을 위해, 10nM 인간 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn을 시험되는 변이체 및 대조군 Fc-단편의 단계 희석물(0.1 ~ 2,000nM의 범위에 있음)과 혼합하였고, 0.005% 폴리솔베이트 20, 0.1㎎/㎖ BSA와 함께 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로서, 10mM 인간 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn을 동일 용액 중에서 동시에 그리고 바로 위에 기재한 동일한 온도에서 각각 인큐베이션시켰지만, 첨가한 Fc-단편은 없었다. 이들 혼합물에서 유리, 미결합 FcRn의 양을 고정된 Fc-5-1 Fc-단편에 대한 결합에 의해 결정하였고, 이를 Fc-5-1으로 코팅한 유세포 표면을 거쳐서 이들 혼합물을 주사하고 표면 플라즈몬 공명을 통해 표면에 결합된 FcRn을 검출함으로써 측정하였다. Fc-5-1을 이들 분석에서 사용하였는데, 그것이 pH 7.4에서 Fc-WT에 대한 친화도보다 훨씬 더 큰 친화도로 FcRn에 결합되기 때문에 이들 분석에서 사용하였다.
혼합물에서 Fc-단편의 농도가 증가됨에 따라 FcRn 결합 반응이 감소되는 것은 FcRn이 용액 중에서 Fc-단편에 결합된다는 것을 나타내는데, 이는 FcRn이 유동 세포의 표면 상에 고정된 Fc-단편에 대해 결합되는 것을 차단한다. FcRn 결합 신호 대 Fc-단편 농도를 플롯팅하여, GraphPad Prism 5(상표명) 소프트웨어에서 일 부분 경쟁의 비선형 회귀를 사용하여 EC50을 계산하였다. 이들 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure 112014066923892-pct00028
표 4에서 데이터는 시험한 다수의 변이체 Fc-단편이 pH 5.5에서 인간 FcRn에 대해 실질적으로 개선된 결합을 가지고(즉, Fc-WT에 비해 실질적으로 더 낮은 EC50을 가짐), pH 7.4에서 낮은 결합을 유지한다는(즉, Fc-WT과 같이 높은 EC50을 가짐) 것을 나타낸다. 그러나, 그 중 5(Fc-5-57, Fc-5-64, Fc-5-66, Fc-5-73 및 Fc-5-110)은 pH 5.5에서 훨씬 개선된 결합을 나타내지 않았다. 그 중 8(Fc-5-55, Fc-5-60, Fc-5-79, Fc-5-91, Fc-5-92, Fc-5-96, Fc-5-101 및 Fc-5-112)은 pH 5.5에서 결합에서 단지 약 2~5x의 개선을 나타내었다. 이들 데이터는 인간 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn에 대한 결합에 대해 변이체 Fc-단편의 ED50이 유사하다는 것을 추가로 나타낸다. 모든 변이체 Fc-단편을 시험하였고(대조군으로서 고려한 Fc-5-1 이외), pH 7.4에서 인간과 사이노몰거스 원숭이 FcRn 둘 다에 대해 낮은 결합을 유지하였다.
실시예 8: 추가로 변형된 변이체 Fc -단편의 구성
변이체 Fc-단편 Fc-5-69 및 Fc-5-106의 추가로 변형된 형태를 만들었다. Fc-5-69의 변이체를 다음과 같이 만들었다. 변이체 Fc-단편 Fc-5-69를 암호화하는 DNA를 이콜라이 중에서 증식될 수 있는 포유류 발현 벡터 내로 삽입하였고, 이를 주형으로서 사용하였다. 변이체 Fc-5-69-W1F에 대해, 다음의 2개 프라이머를 사용하였다: 순방향, GAG AGC AAT GGT GGT TGT TTC CCG CTG CAG GAC TAC(서열번호 497); 및 역방향, GTA GTC CTG CAG CGG GAA ACA ACC ACC ATT GCT CTC(서열번호 498). Fc-5-69-W1Y에 대해, 다음의 2개의 프라이머를 사용하였다: 순방향, GAG AGC AAT GGT GGT TGT TAC CCG CTG CAG GAC TAC(서열번호 499); 및 역방향, GTA GTC CTG CAG CGG GTA ACA ACC ACC ATT GCT CTC(서열번호 500). 퀵체인지 부위 지정 돌연변이유발 키트(Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit)(스트라타겐, 200518) 프로토콜을 사용하였다. 반응 혼합물은 전체 50㎕의 용적에서 200nM dNTP, 100nM 프라이머, 1 ng DNA 주형, 1㎕ DNA 폴리머라제 및 물이었다. 반응을 95℃에서 30초에서 실행한 다음, 16 주기의 95℃의 30초, 55℃에서 60초, 68℃에서 6분, 후에 68℃에서 10분 동안 실행하였다. 그 다음에 1㎕의 Dpnl를 첨가하였고, 반응을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 2㎕의 혼합물을 사용하여 30㎕의 XL1-블루 슈퍼컴피턴트 세포(스트라타겐)를 42℃에서 45초 동안 형질전환시켰다. 그 후에, 0.5㎖ SOC를 첨가하였고, 세포를 분당 300 회전에서(rpm) 진탕기 상의 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 형질전환 세포를 LB-암피실린 한천 플레이트 상에 펼쳤고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
개개의 콜로니를 선택하였고, 플라스미드 DNA를 준비하였으며, 시퀀싱하였다. DNA 서열은 변이체 Fc-단편이 다음의 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 이는 Fc-5-69: Fc-5-69-W1F, GGCFPLQDYCGG(서열번호 367); 및 Fc-5-69-W1Y, GGCYPLQDYCGG(서열번호 368)에서 하나의 아미노산만큼 다르다는 것을 나타내었다. 이들 변이체 Fc-단편을 암호화하는 DNA는 293 세포 내로 도입하였고, 정제된 Fc-단편을 상기 기재한 바와 같이 수행한 비아코어(등록상표) 결합 분석에서 사용을 위해 상기 기재한 바와 같이 생성하였다.
Fc-5-106의 변형 형태를, PCR 반응에 대한 주형이 포유류 발현 벡터 내로 삽입된 Fc-5-106을 암호화하는 DNA였다는 것을 제외하고, 유사한 방법에 의해 만들었다. PCR에 대해 사용한 프라이머는 다음의 서열을 가졌다: Fc-5-106-M4A, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC GCG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 501) 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CGC GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 502); Fc-5-106-M4G, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC GGG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 503), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CCC GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 504); Fc-5-106-M4H, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC CAT TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 505), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA ATG GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 506); FC-5-106-M4I, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC ATC TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 507), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA GAT GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 508); Fc-5-106-M4L, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC TTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 509), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAA GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 510); Fc-5-106-M4N, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC AAC TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 511), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA GTT GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 512); Fc-5-106-M4Q, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC CAG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 513), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CTG GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 514); Fc-5-106-M4S, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC TCG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 515), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CGA GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 516); Fc-5-106-M4T, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC ACG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 517), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CGT GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 518); Fc-5-106-M4V, 순방향, GGT GGT TGT GTT TTC AAC GTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(서열번호 519), 및 역방향, CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAC GTT GAA AAC ACA ACC ACC(서열번호 520).
상기 기재한 바와 같이 PCR 반응을 수행하였고, 이콜라이를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 개개 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 시퀀싱하였다. 다음의 삽입 서열을 갖는 Fc-단편을 암호화하는 단리물을 선택하였다: Fc-5-106-M4A, GGCVFNAFNCGG(서열번호 369); Fc-5-106-M4G, GGCVFNGFNCGG(서열번호 370); Fc-5-106-M4H, GGCVFNHFNCGG(서열번호 371); Fc-5-106-M4I, GGCVFNIFNCGG(서열번호 372); Fc-5-106-M4L, GGCVFNLFNCGG(서열번호 373); FC-5-106-M4N, GGCVFNNFNCGG(서열번호 374); Fc-5-106-M4Q, GGCVFNQFNCGG(서열번호 375); Fc-5-106-M4S, GGCVFNSFNCGG(서열번호 376); Fc-5-106-M4T, GGCVFNTFNCGG(서열번호 377); Fc-5-106-M4V, GGCVFNVFNCGG(서열번호 378).
Fc-5-69 및 Fc-5-106의 이들 유도체를 만들었고, 실시예 7에서 기재한 방법을 사용하여 pH 5.5 및 7.4에서 인간 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn에 대한 상대적 결합 친화도를 시험하였다.
Figure 112014066923892-pct00029
Fc-5-69 유도체는 둘 다 pH 5.5에서 Fc-5-69 그 자체보다 더 약한 결합 친화도를 나타내었다. 2개의 Fc-5-106 유도체(Fc-5-106-M4I 및 Fc-5-106-M4L)는 Fc-5-106에 비해 pH 7.4에서 인간과 사이노몰거스 FcRn 둘 다에 대해 더 높은 친화도를 나타내었다. 또한 이들 둘을 포함하는 Fc-5-106 유도체 중 4(Fc-5-106-M4I, Fc-5-106-M4L, Fc-5-106-M4T 및 Fc-5-106-M4V)은 Fc-5-106 그 자체에 비해 pH 5.5에서 개선되거나 또는 거의 동일한 결합 활성을 나타내었다. 이들 4가지를 사이노몰거스 원숭이 FcRn에 대한 결합 친화도에 대해 시험하였다. 모두 4가지는 pH 5.5 및 7.4 둘 다에서 인간 FcRn과 유사한 사이노몰거스 원숭이 FcRn에 대한 EC50을 가졌다.
실시예 9: 변이체 Fc -단편의 생체내 특성규명
상기 확인한 변이체 Fc-단편을 함유하는 항체가 생체내 개선된 약동학적(PK) 특성을 가지는지 여부를 결정하기 위해, 미변형 항체 X(인간 IgG2 항인간 IL-23 항체임) 및 변이체 Fc-단편을 함유하는 항체 X의 변이체 형태를 사이노몰거스 원숭이 생체내에서 시험하여 약동학적 변수를 정하였다. 항체 X를 적절한 항체로서 선택하였는데, 변이체 Fc-단편의 약동학적 변수를 시험하기 위해, 그것이 선형 PK 프로파일을 가지는 것으로 알려져 있고, IL-23은 생체내에서 저수준에서 발현되는 것으로 알려져 있기 때문이다. 따라서, PK 변수에 대한 표적 관련 효과는 최소인 것으로 예상되었는데, 이는 변이체 Fc-단편에 기인하는 pK 효과를 더 용이하게 검출하게 한다.
(X-5-51, X-5-69, X-5-104, X-5-106 및 X-5-112)로 불리는 5가지 변이체 IgG2 항체를 만들었다. 이들 IgG2 항체는 각각 변이체 IgG1 Fc-단편 Fc-5-51, Fc-5-69, Fc-5-104, Fc-5-106 및 Fc-5-112로서 동일한 위치에서(표 1의 배열에 따라) 동일한 삽입을 가졌다. 더 구체적으로, 삽입은 인간 IgG2 Fc-단편에서 아미노산 384 내지 385(표 1에서와 같은 EU 넘버링)이었다. 항체 X의 중쇄를 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 다음의 프라이머를 사용하여 행한 5가지 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용하였다: X-5-51에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CAT CTG CCG TTC GCT GTT TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 539), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA AAC AGC GAA CGG CAG ATG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 540); X-5-69에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT TGG CCG CTG CAG GAC TAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 541), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTA GTC CTG CAG CGG CCA ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 542); X-5-104에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GGT CAT GAA TAC ATG TGG TGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 543), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACA CCA CAT GTA TTC ATG ACC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 544); X-5-106에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GTT TTC AAC ATG TTC AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 545), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAT GTT GAA AAC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 546); 및 X-5-112에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GCT CTG TAC CCG ACT AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 547), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTT AGT CGG GTA CAG AGC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 548). 퀵체인지 부위 지정 돌연변이유발 키트(스트라타겐, 200518) 프로토콜을 사용하였다. 반응 혼합물은 50㎕의 전체 용적에서 200nM dNTP, 100nM 프라이머, 1ng DNA 주형, 1㎕ DNA 폴리머라제 및 물이었다. 반응을 95℃에서 30초 동안 실행한 다음, 16주기의 95℃에서 30초 동안, 55℃에서 60초 동안, 68℃에서 6분 동안, 다음에 68℃에서 10분 동안 실행하였다. 그 다음에 1㎕의 Dpnl을 첨가하였고, 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 2㎕의 혼합물을 사용하여 42℃에서 45초 동안 30㎕의 XL1-블루 슈퍼컴피턴트 세포(스트라타겐)를 형질전환시켰다. 그 후에, 0.5㎖ SOC를 첨가하였고, 세포를 300 rpm에서 진탕기 상에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 형질전환 세포를 LB-암피실린 한천 플레이트 상에 펼쳤고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 개개의 콜로니를 선택하였고, 플라스미드 DNA를 준비하였고 시퀀싱하여 선택한 단리물이 예상 DNA 서열을 가지다는 것을 확인하였다.
변이체 또는 대조군 Fc-단편 중 하나를 암호화하는 부분, 및 항체 X의 경쇄를 포함하는, 포유류 숙주 세포가 IgG2 중쇄를 둘 다 암호화하는 DNA로 형질감염된 것을 제외하고, Fc-단편에 대해 상기 기재한 것과 본질적으로 동일한 방법으로 항체를 준비하였다. 항체의 발현에 적절한 조건 하에서 숙주 세포를 인큐베이션시켰고, 항체를 배양 배지로부터 회수하였으며, 상기 기재한 바와 같이 정제하였고, 다음의 실험을 위해 사용하였다.
사이노몰거스 원숭이(n=2/그룹)는 1 ㎎/㎏에서 항체 X의 미변형 또는 변이체 형태의 1회 정맥내 용량을 받았고, 8주 생전 단계를 따랐다. 실험 과정을 거쳐 구체화된 시점에 혈액 샘플을 수집하였다. 사전 투약, 투약 후 0.25, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 408, 504, 576, 672, 744, 840, 1008, 1176 및 1344시간에 샘플을 수집하였다.
항-인간 IgG 샌드위치 ELISA를 사용하여 동일 분자로부터 유래된 표준 곡선에 비교에 의해 주입한 항체의 전체 농도를 결정하였다. 구체적으로, 마우스 항인간 Fc 항체를 PBS 중에서 희석시켰고, 플레이트 상에 코팅하였으며, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰 내용물을 버렸고, PBS-트윈(Tween) 20(슈퍼블록(SuperBlock)(등록상표), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 차단 완충제로서 웰에 첨가하였다. 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트 웰을 PBS-트윈(Tween)-20으로 세척하였으며, 혈청 샘플을 웰에 첨가하였고 진탕시키면서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 다시 세척하였고, 호스래디쉬 페록시다제 표지 마우스 항인간 Fc 항체를 플레이트에 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 후, 웰을 세척하였고, 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine: TMB) 기질을 사용하여 10분 동안 진행시켰다. 얻어진 비색 반응을 플레이트에 첨가된 인산 또는 황산으로 퀀칭시켰다. 광학 밀도(Optical density: OD)를 450㎚ 및 650㎚에서 결정하였고, 650㎚에서의 OD를 450㎚에서 OD로부터 차감하였다. 연구 샘플에 대한 농도로 OD 값은 변환을 왓슨(Watson) LIMS 버전 7.0.0.04로 1/Y2로 설정하여 가중치를 두는 로지스틱 모델을 사용하여 데이터 회귀를 통해 달성하였다.
왓슨 LIMS, 버전 7.0.0.04 내에서 제공된 PK 분석 패키지를 사용하여 약동학적 분석을 수행하였다. 노출(곡선하 면적(AUC)) 및 클리어런스(㎖/㎏/시간) 값을 이 분석으로부터 유도하였다. 각 사이노몰거스 원숭이에 대해 마지막 5회 샘플링 시점에 대한 농도 대 시간 데이터를 사용하여 반감기(T1/2) 값을 계산하였다.
도 4에서 나타낸 바와 같이, 변이체 Fc-단편 X-5-51, X-5-69, X-5-104, X-5-106 및 X-5-112를 함유하는 항체 X의 변이체 형태는 모두 미변형 항체 X에 비해 주어진 샘플링 시점에 사이노몰거스 원숭이에서 더 높은 mAb 농도를 입증하였다. 표 6에서 나타낸 바와 같이, 증가된 노출 값 및 감소된 클리어런스 값을 미변형 항체 X에 비해 시험한 항체 X의 모든 변이체 형태에 대해 입증하였다. 추가로, 항체 X의 5가지 변이체 형태 중 4가지는 반감기가 증가되었다. 증가된 반감기를 나타내지 않은 하나의 변이체(X-5-106)는 주입한 항체에 대해 항약물 항체가 하나의 원숭이에서 진행될 수 있는 상황을 나타낼 수 있는데, 시험한 2마리의 원숭이 중 하나로부터의 데이터는 매우 짧은 반감기(48시간)를 나타낸 반면, 다른 원숭이로부터의 데이터는 증가된 반감기(538 시간)를 나타내었다. 항약물 항체의 존재를 측정하기 위한 추가 실험은 이 문제를 명확하게 할 수 있었다.
Figure 112014066923892-pct00030
일반적으로, 이들 데이터는 pH 5.5 내지 6.0에서 FcRn에 대한 변이체 Fc-단편의 증가된 결합(대조군 Fc-단편에 비해) 및 pH 7.4에서 FcRn으로부터의 빠른 해리가 사이노몰거스 원숭이에서 변이체 Fc-단편을 함유하는 항체의 더 긴 생체내 반감기와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 그러나, IgG1 변이체 Fc-단편의 pH 5.5 또는 6에서 결합의 개선 정도와 변이체 Fc-단편과 동일한 삽입을 갖는 전장 IgG2 항체에 대해 약동학적 변수의 개선 정도 사이의 정확한 정량적 관계는 이들 데이터에 의해 나타나지 않는다. 그러나, 이들 데이터는 X-5-51, X-5-69, X-5-104 및 X-5-112가 비변성 항체 X에 비해 증가된 반감기를 가진다는 것을 나타내며, 이것이 X-5-106에 대해 사실이라는 것을 시사한다. 게다가, 시험한 모든 변이체 항체는 대조군 항체에 비해 더 낮은 클리어런스율 및 더 높은 노출을 가졌다.
실시예 10: 대안의 부위에서 삽입을 지니는 변이체 Fc -단편의 구성
라이브러리 L5로부터의 다수의 변이체가 바람직한 특성을 가진다는 사실은 이들 삽입 위치가 바람직하다는 것을 나타내었다. L5 삽입 부위와 동일한 루프 내이거나 또는 인접한 다른 부위가 더 양호한 특성을 가지는지 여부를 결정하기 위해 다음의 실험을 행하였다. 이런 생각을 시험하기 위해, 선택한 펩타이드 중 하나를 이 루프 내 상이한 위치에서 삽입하였고, 얻어진 변이체 Fc-단편을 FcRn 결합을 위해 시험하였다. 변이체 Fc-단편 5-1의 펩타이드 삽입을 삽입을 위한 펩타이드로서 선택하였다. 이 펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 가졌다: GGCGMPIEFCGG(서열번호 67). 도 5에서 나타내는 바와 같이(표 1에 예시한 바와 같은 EU 넘버링 시스템을 사용함), 이 펩타이드를 라이브러리 L5 삽입 부위 이외의 라이브러리 L5 루프 내이거나 또는 인접한 부위에 삽입하였다. 얻어진 Fc-단편의 FcRn에 대한 결합을 상기 실시예 4에서 기재한 바와 같은 SA 바이오센서(포르테바이오 인코포레이티드 18-5019) 코팅 바이오티닐화된 huFcRn을 사용하여 분석하였다.
더 상세하게는, 이들 변이체 Fc-단편을 암호화하는 DNA 작제물을 다음과 같이 만들었다. 퀵체인지(Quikchange)(등록상표) 부위 지정 돌연변이유발 키트(스트라타겐, 200518) 프로토콜을 사용하였다. 반응 혼합물은 전체 50㎕의 용적으로 200nM dNTP, 100nM 프라이머, 1 ng DNA 주형, 1㎕ DNA 폴리머라제 및 물로 구성되었다. 각 변이체에 대해 이들 반응에서 사용한 프라이머는 이하의 표 7에서 나타낸다. DNA 주형은 벡터 내로 삽입된 야생형 인간 IgG1 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA였다. 반응을 95℃에서 30초 동안 실행한 다음, 95℃에서 30초 동안 16 주기, 55℃에서 60초 동안, 및 68℃에서 6분 동안, 그 다음에 68℃에서 10분 동안 최종 주기를 실행하였다. 그 다음에 1㎕의 Dpnl을 첨가하였고, 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 2㎕의 혼합물을 사용하여 30㎕의 XL1-블루 슈퍼컴피턴트 이콜라이 세포(스트라타겐)를 42℃에서 45초 동안 형질전환시켰다. 그 후에, 이화대사산물 억제를 지니는 슈퍼 옵티멀 브로스(Super Optimal Broth with Catabolite repression: SOC; 2% 박토-트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2 및 20mM 글루코스를 함유) 0.5㎖를 첨가하였고, 세포를 분 당 300 회전에서(rpm) 진탕기 상에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 형질전환 세포를 LB-암피실린 한천 플레이트 상에 펼쳤고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
Figure 112014066923892-pct00031
개개의 콜로니를 선택하였고, 플라스미드 DNA를 제조하였으며 시퀀싱하였다. 이들 변이체 Fc-단편의 DNA를 293-6E 세포 내에 도입하였고, 이들 세포로부터 조건화된 배지(CM) 내 Fc-단편을 상기 기재한 바와 같이 수행한 포르테바이오 결합 분석에서 사용하였다. 실시예 4 참조.
pH 6에서 결합 및 pH 7에서 해리를 위한 결과를 도 6에 나타낸다. 변이체 Fc-단편 중 둘, 즉, 5-1-10 및 5-1-2는 pH 6에서 변이체 5-1보다 더 큰 최대 반응을 가졌지만, pH 7.4에서 더 느리게 해리되었다. 도 6 참조. 모든 다른 작제물은 pH 6에서 변이체 5-1에 비해 다소 더 적은 최대 반응을 나타내었지만, 이들 반응은 모두 야생형 Fc-단편(도 6에서 FcWT를 표기)과 유사하거나 또는 더 높았다. 추가로, 5-1과 달리 pH 7.4에서 이들 작제물의 해리는 FcWT와 유사하였다. 따라서, 루프 10 내이거나 또는 인접한 삽입을 지니는 5-1-2 및 5-1-10(이들 둘 다 위치 383 내지 384의 삽입을 가짐) 이외의 대부분의 Fc 변이체는 변이체 5-1보다 pH 7.4에서 더 빠르게 해리되었다. 또한, 변이체 5-1-1, 5-1-2, 5-1-3, 5-1-9 및 5-1-10은 pH 6 변이체 5-1에서 FcWT보다 더 높은 최대 반응을 가지는 반면, 변이체 5-1-6, 5-1-7 및 5-1-8은 FcWT와 유사한 최대 반응을 가졌다. 변이체 5-1-4 및 5-1-5는 FcWT보다 단지 미미하게 더 높은 반응을 가졌다. 이들 데이터는 펩타이드의 삽입이 루프 10 내의 특정 부위에서 더 바람직한 효과를 가졌다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 위치 382 내지 383, 383 내지 384, 384 내지 385, 385 내지 386(표 1 및 도 5에서 도시하는 바와 같이 EU 넘버링 시스템을 사용함)의 삽입은 pH 7.4에서 FcWT + 빠른 해리보다 pH 6에서 더 큰 최대 반응을 가지는 Fc 변이체를 생성하였다. 대조적으로, 위치 388 내지 389, 389 내지 390, 또는 390 내지 391 사이의 삽입을 갖는 Fc 변이체는 FcWT과 유사한 특성을 가졌다. 최종적으로, 386 내지 387 또는 387 내지 388의 삽입을 갖는 Fc 변이체는 pH 6에서 미미하게 더 높은 반응 및 pH 7.4에서 빠른 해리를 나타내었다. 추가로, 변이체 5-1-9 및 5-1-10에서와 같이, 변이체의 위치 내 아미노산 384 내지 386의 제거 및 펩타이드의 삽입은 또한 FcWT에 비해 이들 Fc 변이체의 특성을 개선시켰다. 삽입의 시작 및 마지막에 5-1-9에서와 같은 2개의 글라이신 잔기보다 3개를 포함하는 5-1-10의 약간 더 긴 삽입은 위치 383 내지 384의 삽입을 갖는(수반되는 결실 없음) 5-1-2를 포함하는 임의의 다른 변이체보다 더 높은 반응을 가졌다. 이들 데이터는 위치 382 내지 387의 영역 내에서 FcRn에 대한 결합을 향상시킬 수 있는 펩타이드의 삽입이 pH 6에서 FcRn에 대한 Fc-단편의 결합을 향상시키는 한편 pH 7.4에서 FcRn으로부터 그것의 빠른 해리를 방지할 수 있다는 것을 나타낸다. 반면에, 위치 388 내지 391의 이러한 펩타이드의 삽입은 FcWT에 비해 pH 6에서 FcRn에 대한 Fc-단편의 결합 활성 및/또는 친화도를 실질적으로 향상시키지 않았고, 또한 pH 7.4에서 해리에 대해 효과를 거의 또는 전혀 가지지 않았다. 따라서, 위치 382 내지 386, 387 또는 388(EU 넘버링)인 루프 10의 일부에 대한 이들 데이터 지점은 pH 6에서 FcRn에 대한 결합 활성 및/또는 친화도를 향상시킬 수 있는 삽입을 만들기 위한 특히 바람직한 부위를 함유하였다.
실시예 11: 효모 디스플레이에 의한 변이체 Fc -단편의 선택
변이체 Fc-폴리펩타이드의 상이한 그룹을 얻기 위해, 효모 디스플레이를 사용하여 선택을 수행하였다. 효모에서 선별을 위한 라이브러리를 만들기 위해, 3가지의 이전에 만든 라이브러리를 시작점으로서 사용하였다. 이들 중 하나는 상기 기재한 라이브러리 L5였다. 도 2 및 실시예 2 참조. 2개의 다른 라이브러리는 라이브러리 L5와 정확히 동일한 부위에서 삽입을 가졌고, 라이브러리 L5를 만들기 위해 사용한 동일한 일반적 방법을 사용하여 만들었지만, 삽입 형태는 라이브러리 L5가 6가지 무작위 아미노산을 지니는 삽입을 암호화하는 한편, 라이브러리 L-8 및 L-10가 각각 8가지 및 10가지 아미노산을 지니는 삽입을 암호화한다는 점에서 상이하였다. 구체적으로, 이들 라이브러리는 다음의 형태로 삽입을 암호화하였다: 라이브러리 L-8, GGC(19R)8CGG(서열번호 88); 및 라이브러리 L-10, GGC(19R)10CGG(서열번호 89). 라이브러리 L5에서의 삽입과 같이 이들 삽입은 도 2에서 넘버링 계획에 따라 위치 169에서 "N"과 위치 170에서 "G"였다. "(19R)8" 및 "(19R)10"은 8 및 10개의 각각 무작위화된 아미노산을 나타내는데, 이는 시스테인 이외의 임의의 아미노산 일 수 있다.
라이브러리 L5, L-8 및 L-10를 SacII 및 NotI로 분해시켰고, 변이체 Fc-단편을 암호화한 얻어진 단편을 에스케리키아 콜라이와 사카로마이세스 세레비시애 둘 다에서 발현을 위해 적절한 벡터 내로 정제하였으며 결찰시켰다. 벡터는 또한 삽입을 지니는 프레임 내 HA 태그(인간 인플루엔자 혈구응집수로부터의 짧은 펩타이드 서열(YPYDVPDYA)(서열번호 575))를 암호화하였고, 이를 Fc 영역이 효모 세포의 표면 상에 디스플레이된다는 것을 확인하기 위해 사용하였다. 이들 3개의 새로운 라이브러리를 이콜라이 내로, 구체적으로는 XL1-블루 슈퍼컴피턴트 이콜라이 세포 내로 도입하였다. 약 5 x 108개 이콜라이 형질전환체로부터의 DNA를 사용하여 표준 아세트산리튬 방법을 사용하여 약 1 내지 2 x 109개 사카로마이세스 세레비시애 세포를 형질전환시켰다. 사카로마이세스 세레비시애의 밤새 배양시킨 배양물을 100 밀리리터의 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 배지(20 g/ℓ 박토-펩톤, 10 g/ℓ 효모 추출물, 2% 글루코스(YPD)을 함유 중에서 0.2 내지 0.3의 OD600으로 희석시켰으며, OD600이 1.0 내지 2.0에 도달될 때까지 분당 300회 회전(rpm)에서 30℃에서 진탕시키면서 성장시켰다. 그 다음에 세포를 30 밀리리터의 물로 및 30 밀리리터의 100mM LiOAc로 세척하였다. 각 라이브러리에 대해, 1M LiOAc, 50% PEG, 단일 가닥 운반체 DNA, 물, 및 25㎍의 라이브러리 DNA를 함유하는 형질전환 혼합물을 세포에 첨가하였다. 각 형질전환에 42℃에서 45분 동안 열 충격을 가하였다. 세포를 펠렛화한 다음 30℃에서 1시간 동안 50 밀리리터 YPD 배지 중에서 성장시켰다. 세포를 다시 펠렛화하였고, 30 밀리리터 SD-leu 배지(14.7g/ℓ 시트르산 나트륨, 4.29g/ℓ 시트르산, 2% 덱스트로스, 6.7g/ℓ 효모 질소 베이스(yeast nitrogen base: YNB), 1.6 g/ℓ 류신이 없는 효모 합성 드롭-아웃 배지 상청액(시그마(Sigma), Y1376))으로 세척하였다. 그 다음에 세포를 10 밀리리터의 SD-leu 배지에서 재현탁시켰다. 그 다음에 10 밀리리터의 형질전환 세포를 300 밀리리터 SD-leu 배지에 접종하였고, 30℃에서 밤새 성장시켰다.
효모 형질전환체 내 변이체 Fc-단편의 발현 유발은 유도 배지(5.4g/ℓ Na2HPO4, 8.56 g/ℓ NaH2PO4, 2% 갈락토스, 6.7 g/ℓ YNB, 및 1.6 g/ℓ 류신이 없는 효모 합성 드롭-아웃 배지 상청액(시그마, Y1376))내로 밤새 배양시킨 배양물(약 108개 세포)의 알리쿼트를 접종하고, 20℃에서 약 48시간 동안 세포를 배양시킴으로써 수행하였다.
이들 유도 세포를 원심침전시켰고, pH 7.4에서 인산염 완충 식염수(PBS) 완충제(+0.5% BSA) 중에서 재현탁시켰다. 그 다음에, 0.5 내지 1 x 108개 유발 세포를 1μM 바이오티닐화된 FcRn(바이오틴-FcRn)과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 세포를 세척하였고, 2㎍/㎖ 표지 스트렙타비딘(스트렙타비딘(SA)-알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 647(카탈로그 번호 S32357, 인비트로젠(Invitrogen)))과 함께 15분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 세포를 세척하였고, 항-Cy5/항-알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 647 마이크로비드(카탈로그 번호 130-091-395, MACS 밀텐이 바이오텍(Miltenyi Biotec))와 함께 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하였고, LS 컬럼(카탈로그 번호 130-042-401, MACS 밀텐이 바이오텍) 및 QuadroMACS(등록상표) 분리 유닛(Separation Unit)(카탈로그 번호 130-091-051, MACS 밀텐이 바이오텍)을 사용하여 분리시켰다. 전치 컬럼의 알리쿼트를 유동시키고, 세척하였으며, 용리 분획을 FACS 분석을 위해 수집하였다. 유동 및 세척물을 본 발명자들의 고갈 집단으로서 수집하였는데, 이는 pH 7.4에서 매우 낮은 친화도로 FcRn에 결합된 변이체 Fc-폴리펩타이드를 발현시키는 세포를 함유하였다.
그 다음에 세포의 이런 고갈 집단을 SD-leu 배지 내 30℃에서 밤새 성장시켰다. 그 다음에 세포를 상기 기재한 바와 같은 유발 배지 내 20℃에서 약 48시간 동안 유발시켰다. 후속 세척 및 인큐베이션 단계를 pH 5.5에서 MES 완충제(20mM MES, 137mM NaCl, 0.5% BSA) 중에서 수행하였다. 유발 세포를 1시간 동안 250nM 바이오틴-FcRn과 함께 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 후속적으로, SA-알렉사 플루오르(등록상표) 647(2㎍/㎖) 및 항-HA-FITC(1㎍/㎖)를 첨가하였고, 세척시키고 셀 스트레이터(cell strainer)를 통과시킨 후, 세포에 pH 5.5에서 FACS 분석을 실시하였다. FITC와 알렉사 플루오르(등록상표) 둘 다에 대해 강한 신호를 나타낸 세포를 수집하기 위해 게이트를 설정하였다. 그 다음에 이들 세포를 SD-leu 배지 내 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, 유도 배지 내 20℃에서 약 48시간 동안 유도하였다. 그 다음에, 제2 라운드에서, 유도 세포를 한 시간 동안 25nM 바이오틴-FcRn과 함께 얼음 상에서 인큐베이션시켰고, 상기 기재한 바와 같이, 표지 단계, 세척 단계, 거르기 단계, FACS 단계, 배양 단계 및 유도 단계를 반복하였다. 최종적으로, 제3 라운드에서, 유도 세포를 한 시간 동안 5nM 바이오틴-FcRn과 함께 얼음 상에서 인큐베이션시킨 다음, 상기 기재한 바와 같이 표지 단계, 세척 단계, 거르기 단계, FACS 단계, 배양 단계 및 유도 단계를 실행하였다. 따라서, 마지막 결과는 Fc-단편을 발현시키는 세포의 집단이 야생형 Fc-단편이 pH 5.5에서 결합할 수 있는 것보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합할 수 있다는 것이었다.
이 세포 집단을 플레이팅하였고, 라이브러리 L5로부터의 500개 콜로니 및 라이브러리 L-8 및 L-10 각각으로부터 400개 콜로니를 추가 분석을 위해 선택하였다. 각각의 이들 개개 콜로니를 상기 기재한 바와 같은 SD-leu 배지 내 30℃에서 밤새 배양시켰다. 각각의 이들 단리물 내 삽입 서열을 효모 플라스미드 DNA로부터 결정하였다. 모두에서, 317, 265 및 313의 독특한 서열을 각각 라이브러리 L5, L-8 및 L-10의 각각에서 이들 단리물 중에서 발견하였다. 그 다음에 세포를 상기 기재한 유도 배지 내 20℃에서 48시간 동안 유도하였다. 후속 세척 및 인큐베이션 단계를 pH 5.5에서 MES 완충제(20mM MES, 137mM NaCl, 0.5% BSA) 및 pH 7.4에서 PBS 완충제(+0.5% BSA)와 동시에 수행하였다. 샘플 당 약 5 x 105 세포를 250nM 바이오틴-FcRn 및 1㎍/㎖ 항-HA-FITC와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 세포를 세척하였고, 2㎍/㎖ SA-알렉사 플루오르(등록상표) 647과 함께 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하였고, FACS를 통해 결합에 대해 분석하여 그것이 pH 5.5에서 강하게, 그리고 pH 7.4에서 약하게 FcRn에 결합되었는지 여부를 결정하였다. 메티오닌 또는 트립토판 잔기가 거의 또는 전혀 없이 pH 7.4에서 FcRn에 대한 결합에 대해 낮은 신호와 함께 pH 5.5에서 FcRn에 결합에 대해 가장 높은 신호를 나타내는 개개의 세포주를 추가 분석을 위해 각 라이브러리로부터 선택하였다. 이들 선택 단리물은 각각 L5, L-8 및 L-10로부터 158, 59 및 50 세포주를 포함하였고, 이들 단리물 내 삽입 서열을 이하의 표 8에서 나타낸다. (클론 명칭 5y-37은 그것이 적절한 벡터 내로 성공적으로 재클로닝되지 않았기 때문에, 추가 분석에 포함하지 않았음을 주목한다.)
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각 라이브러리로부터 선택한 개개 클론을 풀링시켰고, 자이모프렙(Zymoprep) 효모 플라스미드 미니프렙 II 키트(D2004, 자이모 리서치(Zymo Research))를 사용하여 DNA를 단리시켰다. 순방향 프라이머(5' GGA AAA GTC GAC TAG ACC ACC ATG GA 3'(서열번호 357)) 및 역방향 프라이머(5' CTT TGC GGC CGC TCA TTA TTT 3'(서열번호 358))를 사용하여 풀링한 DNA 상에서 PCR을 수행하였다. PCR 코어 키트(로슈, 카탈로그 번호 11 578 553 001)를 다음의 반응 조건에 의해 사용하였다: 95℃에서 5분 동안, 다음에 30 주기의 95℃에서 45초 동안, 55℃에서 45초 동안, 72℃에서 90초 동안, 및 최종적으로 72℃에서 10분 동안. PCR 반응 밀 포유류 발현 벡터를 SaiI 및 NotI 제한 효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스)와 함께 37℃에서 밤새 분해하였다. 분해한 DNA를 QIAquick 겔 정제 키트(28704, 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. 분해한 벡터 DNA 및 PCR 산물을 T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩)를 사용하여 결찰시켰고, 16℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 결찰시킨 DNA를 사용하여 XL10-골드 울트라컴피턴트 이콜라이 세포(#200315, 스트라타겐)를 형질전환시켰고, 개개 클론을 선택하였다. 각각의 선택한 변이체 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유하는 이콜라이 클론으로부터 플라스미드 DNA를 293-6E 포유류 세포에 도입하였다. 구체적으로는, 293-6E 세포를 폴리-D-리신-코팅된, 96웰 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 내 5 x 104개 세포/웰에서 씨딩하였고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 다음에 200ng의 플라스미드 DNA를 퓨겐(Fugene)(등록상표) HD 형질감염 시약(#E2312, 프로메가(Promega))을 사용하여 세포 내로 형질감염시켰고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날 성장 배지를 0.5% 트립톤을 함유하는 무혈청 배지로 변화시켰다. 37℃에서 다른 6일의 성장 후 조건화된 배지를 수집하였다. 변이체 Fc-단편을 함유한 조건화된 배지를 그 다음에 실시예 4에서 기재한 포르테바이오 기술을 사용하여 FcRn에 결합에 대해 시험하였다. 가장 바람직한 결합 프로파일을 갖는 변이체 Fc-단편으로부터의 각각 pH 6 및 7.4에서 결합 및 해리 곡선을 도 7에 나타낸다.
도 7은 효모 라이브러리 L5로부터 28개의 최상의 변이체 Fc-단편뿐만 아니라 야생형 Fc-단편(FcWT)의 각각 pH 6 및 pH 7.4에서 FcRn 결합에 대한 결합 및 해리 프로파일을 나타내며, 도 8은 효모 라이브러리 L-8 및 L-10로부터 선택된 18개의 최상의 변이체 Fc-단편에 대한 FcRn 결합 프로파일을 나타낸다. L5 변이체 Fc-단편 모두는 pH 6에서 훨씬 더 높은 최대 반응을 가지며, 즉, FcWT보다 결합 활성이 더 높다. pH 7.4에서, 모두 빠르게 해리되며, 즉 FcWT과 유사하게 결합 활성이 거의 없거나 전혀 없었다. 모든 L-8 및 L-10 변이체 Fc-단편은 pH 6에서 훨씬 더 높은 최대 반응을 가졌으며, 즉, FcWT보다 결합 활성이 더 높다. pH 7.4에서, 대부분은 FcWT에서 관찰되지 않은 낮은 잔여 결합 수준을 나타내었지만, 모두 빠르게 해리되었다. 따라서, 이들 변이체 Fc-단편은 모두 FcWT에 비해 바람직한 특성을 가졌다. 따라서, 상이한 길이를 지니는 펩타이드의 삽입은 pH 6에서 FcRn에 대한 결합 활성을 향상시키는 한편, 잔여 결합이 거의 또는 전혀 없이 pH 7.4에서 FcRn로부터 빠른 해리를 보존하기 위해 성공적으로 사용될 수 있다.
실시예 12: 효모에서 선택된 변이체 Fc -단편의 생체내 특성규명
상기 기재한 효모 선별에서 확인한 변이체 Fc-단편을 함유하는 항체가 생체내 약동학적(PK) 특성을 가지는지 여부를 결정하기 위해, 미변형 항체 X(인간 IgG2 항인간 IL-23 항체임) 및 변이체 Fc-단편을 함유하는 항체 X의 변이체 형태를 사이노몰거스 원숭이에서 생체내 시험하여 약동학적 변수를 정하였다. 선형 pK 프로파일을 가지는 것으로 알려져 있고, IL-23이 낮은 생체내 수준에서 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에 변이체 Fc-단편의 약동학적 변수를 시험하기 위해 항체 X를 적절한 항체로서 선택하였다. 따라서, PK 변수에 대한 표적 관련 효과는 최소이며, 이는 변이체 Fc-단편에 기인하여 pK 효과를 검출하는 것을 더 용이하게 만드는 것으로 예상되었다.
(X-5y-8, X-5y-132, X-5y-38, X-5y-91, X-5y-119 및 X-5y-127)로 불리는 6가지 변이체 IgG2 항체를 만들었다. 이들 IgG2 항체는 각각 변이체 IgG1 Fc-단편 5y-8, 5y-132, 5y-38, 5y-91, 5y-119 및 5y-127과 동일한 위치에서 동일한 삽입을 가졌다. 항체 X의 중쇄를 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 다음의 프라이머를 사용하여 행하는 5회 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다: X-5y-8에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CCG GTT CTG CTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 380), 및 역방향, 5'- GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAG CAG AAC CGG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC -3'(서열번호 381); X-5y-132에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GTT TTC TCT GCT CTG TGG TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 382), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA CCA CAG AGC AGA GAA AAC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 383); X-5y-38에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GAA ACT TAC TGG TTG TTC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 384), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GAA CAA CCA GTA AGT TTC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 385); X-5y-91에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CCG CAT TGG CCG TTC GAA TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 386), 및 역방향, 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA TTC GAA CGG CCA ATG CGG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 387); X-5y-119에 대해, 순방향, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GCT TTC GAA TTC ATC TAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 388), 및 역방향, 5'- GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTA GAT GAA TTC GAA AGC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC -3'(서열번호 389); 및 X-5y-127, 순방향에 대해, 5'-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CAG TAC TTC TTG CCG TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3'(서열번호 390), 및 역방향 5'-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA CGG CAA GAA GTA CTG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3'(서열번호 391). 퀵체인지 부위 지정 돌연변이유발 키트(스트라타겐, 200518) 프로토콜을 사용하였다. 반응 혼합물은 전체 50㎕의 용적으로 200nM dNTP, 100nM 프라이머, 1ng DNA 주형, 1㎕ DNA 폴리머라제 및 물이었다. 반응을 95℃에서 30초 동안 실행하였고, 그 다음에 16 주기의 95℃에서 30초 동안, 55℃에서 60초 동안, 68℃에서 6분 동안, 다음에 68℃에서 10분 동안 실행하였다. 그 다음에 1㎕의 Dpnl을 첨가하였고, 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에 2㎕의 혼합물을 사용하여 30㎕의 XL1-블루 슈퍼컴피턴트 세포(스트라타겐)를 42℃에서 45초 동안 형질전환시켰다. 그 후에, 0.5㎖ SOC를 첨가하였고, 세포를 300 rpm에서 진탕기 상에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 형질전환된 세포를 LB-암피실린 한천 플레이트 상에 펼쳤고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 개개의 콜로니를 선택하였고, 플라스미드 DNA를 준비하였으며, 시퀀싱하여 선택한 단리물이 예상된 DNA 서열을 가진다는 것을 보장하였다.
포유류 숙주 세포를 변이체 또는 대조군 Fc-단편 중 하나를 암호화하는 부분을 포함하는 IgG2 중쇄와 항체 X의 경쇄를 둘 다 암호화하는 DNA로 형질감염시킨 것을 제외하고, Fc-단편에 대해 상기 기재한 것과 본질적으로 동일한 방법으로 항체를 준비하였다. 항체의 발현에 적절한 조건 하에서 숙주 세포를 인큐베이션시켰고, 항체를 상기 기재한 바와 같이 정제한 배양물 배지로부터 회수하였으며, 다음의 실험을 위해 사용하였다.
사이노몰거스 원숭이(n=2/그룹)는 1㎎/㎏의 용량에서 항체 X의 미변형 또는 변이체 형태의 1회 정맥내 용량을 받았고, 8주 생전 단계에 따랐다. 이전에 시험한 항체 X-5-112뿐만 아니란 항체 X 그 자체를 대조군으로서 사용하였다. 혈액 샘플을 실험 과정을 거쳐서 구체화된 시점에 수집하였다. 사전 투약, 투약 후 0.25, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 408, 504, 576, 672, 744, 840, 1008, 1176 및 1344시간에 샘플을 수집하였다. 항체를 혈액 샘플에서 검출하였고, 본질적으로 상기 실시예 9에서 기재한 바와 같이 약동학적 분석을 수행하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 시험한 모든 변이체 Fc-단편을 함유하는 항체 X의 변이체 형태는 미변형 항체 X에 비해 400시간 이상의 모든 시점을 포함하는 대부분의 샘플링 시점에 사이노몰거스 원숭이에서 더 높은 mAb 농도를 입증하였다. 추가로, X-5y-8, X-5y-127 및 X-5y-91을 포함하는 일부 변이체는 앞서 시험한 X-5-112와 유사하였다.
이하의 표 11은 연구에서 각각의 사이노몰거스 원숭이에서 항체 X 및 이의 변이체의 반감기(T½), 노출(곡선하면적(AUC)) 및 클리어런스율(CI)을 나타낸다.
Figure 112014066923892-pct00040
모든 변이체는 각각을 주사한 2마리의 원숭이 중 적어도 하나에서 항체 X에 비해 증가된 반감기 및 AUC를 나타내었다. 원숭이 #207 및 #213에서, X-5y132 및 X-5y-119는 각각 항체 X보다 더 짧은 반감기를 가졌다. 이는 이들 특정 원숭이가 항체의 더 빠른 클리어런스를 유발하는 항-약물 항체를 발생시켰다는 것을 의미하는 것으로 해석될 수 있었다. AUC 값은 또한 시험한 대부분의 변이체에 대해 항체 X보다 더 컸다.
원숭이 #207 및 #213을 생략한 이들 약동학적 변수에 대한 평균 데이터를 이하의 표 12에 나타낸다. 상기 표 6에서 보고한 이전의 연구로부터의 값은 항체 X 및 X-5-112에 대해 포함하는데, 값은 하나의 연구로부터 다음까지 상대적으로 일정한 것으로 나타난다.
Figure 112014066923892-pct00041
이들 데이터는 항체 X에 대한 및 X-5-112에 대한 약동학적 변수가 하나의 연구로부터 다음까지 상대적으로 일정하였다는 것을 나타낸다. 그것들은 또한 반감기 및 노출이 모든 시험한 변이체에서 증가된다는 것을 나타낸다. 따라서, 이들 데이터는 일반적으로 pH 5.5 내지 6.0에서 FcRn에 대한 변이체 Fc-단편의 증가된 결합(대조군 Fc-단편에 대해) 및 pH 7.4에서 FcRn으로부터의 빠른 해리가 사이노몰거스 원숭이에서 변이체 Fc-단편을 함유하는 항체의 더 긴 생체내 반감기와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 비선형 PK 프로파일을 갖는 변이체 Fc -함유 항체의 생체내 특성규명
비선형 PK 프로파일을 갖는 항체의 PK 특성이 본 명세서에 기재된 펩타이드 중 하나의 삽입에 의해 개선될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 변이체 Fc 단편 Fc-5-112 내 삽입을 항체 Y, 비선형 PK 프로파일을 갖는 인간 IgG2 항체 내로 옮겼다. Y-5-112로 불리는 변이체 IgG2 항체인 항체 Y의 이 변이체 형태는 항체 Y에서 필요한 변성을 만드는데 적절한 상이한 PCR 프라이머를 사용하는 것을 제외하고 본질적으로 상기 기재한 바와 같이 만들어졌다.
항체를 실시예 9에서 상기 기재한 바와 같이 준비하였다. 사이노몰거스 원숭이(n=2/그룹)는 10 ㎎/㎏의 용량에서 항체 Y 또는 항체 Y-5-112의 1회 정맥내 용량을 받았고, 8주 동안 생전 단계를 따랐다. 혈액 샘플을 사전 투약 및 투약 후 0.083(5분), 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312, 336, 384, 432, 480, 528, 576, 624, 672, 720, 768, 816, 864, 912, 960, 1008, 1056, 1104, 1152, 1200, 1248, 1296 및 1344시간에 샘플을 수집하였다.
사이노몰거스 원숭이 혈청 내 농도를 샌드위치 ELISA를 사용하여 결정하였다. 마우스 항인간 항체를 PBS 중에서 희석시켰고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다. 명목상 5℃ 인큐베이션을 밤새 또는 3일까지 지속한 후, 웰 내용물을 버렸고, 차단제 BLOTTO(써모(Thermo)(등록상표) 사이언티픽)을 포함하는 차단 완충제를 플레이트 웰에 제공하였다. 주위 실온에서 최소 1시간 인큐베이션 후(ART), 플레이트 웰을 비웠고, 1X 세척 용액(2mM 이미다졸, 0.02% 트윈(Tween) 20, 0.5mM EDTA, 160mM NaCl, 20X 용액으로서 KPL, Inc.에 의해 판매됨)으로 6회 세척하였다. 100% 원숭이 혈청 중에서 제조한 연구 표본, 분석 표준 및 품질 관리 샘플을 플레이트 웰에 첨가하기 전 차단제 BLOTTO 중에서 50배로 희석시켰다. 플레이트 웰의 내용물을 혼합하는 한편, 플레이트 진탕기 상에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 다음에, 플레이트 웰을 세척하였고, 호스래디쉬 페록시다제-표지 마우스 항인간 항체를 플레이트 웰에 첨가하였다. 최종 1시간 인큐베이션 후, 플레이트 웰을 세척하였고, 한 성분 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액을 사용하여 진행하였다. 황산을 플레이트 웰에 첨가함으로써 얻어진 비색 반응을 퀀칭시켰다. 450㎚ 및 650㎚의 이중 파장에서 광학 밀도를 결정하였고, 650㎚에서 얻은 값을 450㎚에서 얻은 값으로부터 차감하였다. 왓슨 LIMS 버전 7.0.0.01에서 1/Y2로 설정한 가중치를 둔 로지스틱 모델을 사용하여 데이터 회귀를 통해 희석 연구 표본에 대한 농도로 OD 값의 전환을 달성하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 항체 Y는 0 시간 내지 약 216 시간으로 연장되는거의 선형 단계에 의한 2상 PK 프로파일을 가진다. 그 후에, 항체 Y 농도는 가파르게 떨어졌다. 항체 Y-5-112는 선형의 점진적으로 내려가는 프로파일의 일부가 약 0 시간 내지 약 432 시간으로 연장되는 것을 제외하고 유사한 프로파일을 가진다. 따라서, 항체 Y-5-112 so 삽입은 PK 프로파일의 선형 부분의 기울기를 감소시키며, 따라서 항체 Y에 비해 전반적인 노출을 증가시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> VARIANT FC-POLYPEPTIDES WITH ENHANCED BINDING TO THE NEONATAL FC RECEPTOR <130> A-1688-WO-PCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2012-12-17 <150> 61/729,050 <151> 2012-11-21 <150> 61/585,993 <151> 2012-01-12 <150> 61/578,780 <151> 2011-12-21 <160> 575 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 2 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 699 <210> 3 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 4 <211> 687 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcatgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg 240 ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaatga 687 <210> 5 <211> 279 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 85 90 95 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp 100 105 110 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 115 120 125 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 145 150 155 160 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 165 170 175 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 180 185 190 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 195 200 205 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser 245 250 255 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 <210> 6 <211> 840 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gagctcaaaa ccccacttgg tgacacaact cacacatgcc cacggtgccc agagcccaaa 60 tcttgtgaca cacctccccc gtgcccacgg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct 120 cccccatgcc cacggtgccc agagcccaaa tcttgtgaca cacctccccc gtgcccaagg 180 tgcccagcac ctgaactcct gggaggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 240 gataccctta tgatttcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac 300 gaagaccccg aggtccagtt caagtggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 360 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 420 ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 480 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggac agccccgaga accacaggtg 540 tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 600 gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcagcgg gcagccggag 660 aacaactaca acaccacgcc tcccatgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 720 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaaca tcttctcatg ctccgtgatg 780 catgaggctc tgcacaaccg cttcacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 840 <210> 7 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 8 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690 <210> 9 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30 Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60 Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys 85 90 95 Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu 100 105 110 Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly 115 120 125 Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 145 150 155 160 His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 165 170 175 Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly 180 185 190 Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 195 200 205 Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly 210 215 220 Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 225 230 235 240 Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His 245 250 255 Ala Gly 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respect to those in the annotations for said positions" <400> 22 Gly Gly Gly Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(11) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (5)..(11) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 23 Gly Gly Gly Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(12) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or 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for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 25 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 420 tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 480 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 705 <210> 26 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (37)..(42) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (37)..(42) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 26 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 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<222> (277)..(294) <223> /note="nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> source <223> /note="see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 27 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccaaaa aaaaaaaaaa aaaacaccag 300 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 360 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 420 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 480 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 540 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 600 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 660 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 711 <210> 28 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (93)..(98) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (93)..(98) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 28 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 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"ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (289)..(291) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (292)..(294) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (295)..(297) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (298)..(300) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (301)..(303) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> misc_feature <222> (286)..(303) <223> /note="nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> source <223> /note="see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 29 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccggtg gttgtaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaatgtggtg gtcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 360 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca 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tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 420 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 480 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 540 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 600 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 660 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 720 tctccgggta aatga 735 <210> 34 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (75)..(80) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (75)..(80) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 34 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 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gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggt ggttgtaaaa aaaaaaaaaa aaaatgtggt 540 ggtgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 600 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 660 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 720 tctccgggta aatga 735 <210> 36 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (173)..(178) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or 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the annotations for said positions" <220> <221> source <223> /note="see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 37 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctgg gtggttgtaa aaaaaaaaaa aaaaaatgtg gtggtaccaa gaaccaggtc 480 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 540 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 600 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 660 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 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Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 73 gttgttctcc ggctgaccac cacagaattc gatcggcata ccacaaccac ccccattgct 60 ctccca 66 <210> 74 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 74 gagagcaatg ggcagggtgg ttgtggtatg ccgatcgaat tctgtggtgg tccggagaac 60 aactac 66 <210> 75 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 75 gtagttgttc tccggaccac cacagaattc gatcggcata ccacaaccac cctgcccatt 60 gctctc 66 <210> 76 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 76 agcaatgggc agccgggtgg ttgtggtatg ccgatcgaat tctgtggtgg tgagaacaac 60 tacaag 66 <210> 77 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 77 cttgtagttg ttctcaccac cacagaattc 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misc_feature <222> (19)..(36) <223> /note="nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> source <223> /note="see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 529 gtggtcagcg tcctcaccaa aaaaaaaaaa aaaaaacacc aggactggct gaat 54 <210> 530 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> Variation <222> (28)..(30) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (31)..(33) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (34)..(36) <223> /replace="AAC" or "ACT" or 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as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 530 gtggtcagcg tcctcaccgg tggttgtaaa aaaaaaaaaa aaaaatgtgg tggtcaccag 60 gactggctga at 72 <210> 531 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> Variation <222> (19)..(21) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (22)..(24) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (25)..(27) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (28)..(30) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (31)..(33) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> misc_feature <222> (19)..(33) <223> /note="nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> Variation <222> (37)..(39) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> /note="nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> source <223> /note="see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 531 tcatgctccg tgatgcataa aaaaaaaaaa aaacacaaac actacacgca gaagagc 57 <210> 532 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> Variation <222> (28)..(30) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (31)..(33) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (34)..(36) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (37)..(39) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (40)..(42) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (43)..(45) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> misc_feature <222> (28)..(45) <223> /note="nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> source <223> /note="see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 532 ggcgtggagg tgcataatgg tggttgtaaa aaaaaaaaaa aaaaatgtgg tggtgccaag 60 acaaagccgc gg 72 <210> 533 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> Variation <222> (28)..(30) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (31)..(33) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (34)..(36) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (37)..(39) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (40)..(42) <223> 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 535 cccattcaga tcctcttc 18 <210> 536 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> Variation <222> (31)..(33) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (34)..(36) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (37)..(39) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (40)..(42) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (43)..(45) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (46)..(48) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (49)..(51) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> Variation <222> (52)..(54) <223> /replace="AAC" or "ACT" or "ATC" or "ATG" or "CAG" or "CAT" or "CCG" or "CGT" or "CTG" or "GAA" or "GAC" or "GCT" or "GGT" or "GTT" or "TAC" or "TCT" or "TGG" or "TTC" <220> <221> misc_feature <222> (31)..(54) <223> /note="nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> source <223> /note="see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 536 ctgcccccat ctcgagatga gctgggttgt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgtggt 60 ggtaccaacc aggtcagcct gacc 84 <210> 537 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> modified_base <222> (31)..(32) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (34)..(35) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (37)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (40)..(41) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (43)..(44) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (46)..(47) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (49)..(50) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (52)..(53) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 537 ctgcccccat ctcgagatga gctgggttgt nnknnknnkn nknnknnknn knnktgtggt 60 ggtaccaacc aggtcagcct gacc 84 <210> 538 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 538 ggccccgtga tggtgatgat g 21 <210> 539 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 539 gagtgggaga gcaatggtgg ttgtcatctg ccgttcgctg tttgtggtgg tgggcagccg 60 gagaac 66 <210> 540 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 540 gttctccggc tgcccaccac cacaaacagc gaacggcaga tgacaaccac cattgctctc 60 ccactc 66 <210> 541 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 541 gagtgggaga gcaatggtgg ttgttggccg ctgcaggact actgtggtgg tgggcagccg 60 gagaac 66 <210> 542 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 542 gttctccggc tgcccaccac cacagtagtc ctgcagcggc caacaaccac cattgctctc 60 ccactc 66 <210> 543 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 543 gagtgggaga gcaatggtgg ttgtggtcat gaatacatgt ggtgtggtgg gcagccggag 60 aac 63 <210> 544 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 544 gttctccggc tgcccaccac accacatgta ttcatgacca caaccaccat tgctctccca 60 ctc 63 <210> 545 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 545 gagtgggaga gcaatggtgg ttgtgttttc aacatgttca actgtggtgg tgggcagccg 60 gagaac 66 <210> 546 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 546 gttctccggc tgcccaccac cacagttgaa catgttgaaa acacaaccac cattgctctc 60 ccactc 66 <210> 547 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 547 gagtgggaga gcaatggtgg ttgtgctctg tacccgacta actgtggtgg tgggcagccg 60 gagaac 66 <210> 548 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 548 gttctccggc tgcccaccac cacagttagt cgggtacaga gcacaaccac cattgctctc 60 ccactc 66 <210> 549 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 549 Leu Met Ile Ser Arg Thr 1 5 <210> 550 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(7) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 550 Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr 1 5 <210> 551 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 551 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 552 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(7) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 552 Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys His Gln Asp Trp Leu 1 5 10 <210> 553 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(10) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 553 Thr Gly Gly Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys Gly Gly His Gln Asp 1 5 10 15 Trp Leu <210> 554 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 554 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 1 5 <210> 555 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(7) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (3)..(7) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to the annotations for said position" <400> 555 Met His Lys Lys Lys Lys Lys His Lys His Tyr 1 5 10 <210> 556 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 556 Glu Val His Asn Ala 1 5 <210> 557 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(13) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 557 Glu Val His Asn Gly Gly Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys Gly Gly 1 5 10 15 Ala <210> 558 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 558 Asn Gly Gln Pro Glu Asn 1 5 <210> 559 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(10) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 559 Asn Gly Gly Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys Gly Gly Gly Gln Pro 1 5 10 15 Glu Asn <210> 560 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 560 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 1 5 <210> 561 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(14) <223> Any amino acid <400> 561 Asp Glu Leu Gly Gly Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly 1 5 10 15 Gly Thr Lys Asn Gln 20 <210> 562 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(14) <223> /replace="Phe" or "Asn" or "Arg" or "Ser" or "Thr" or "Met" or "Ile" or "Glu" or "Asp" or "Gly" or "Ala" or "Val" or "Gln" or "His" or "Pro" or "Leu" or "Tyr" or "Trp" <220> <221> misc_feature <222> (7)..(14) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <400> 562 Asp Glu Leu Gly Gly Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys Gly 1 5 10 15 Gly Thr Lys Asn Gln 20 <210> 563 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 563 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 1 5 10 <210> 564 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 564 Trp Glu Ser Asn Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe Cys Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 565 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 565 Trp Glu Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe Cys Gly Gly Ser Asn 1 5 10 15 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 566 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 566 Trp Glu Ser Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe Cys Gly Gly Asn 1 5 10 15 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 567 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 567 Trp Glu Ser Asn Gly Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe Cys Gly 1 5 10 15 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 568 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 568 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe Cys 1 5 10 15 Gly Gly Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 569 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 569 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe 1 5 10 15 Cys Gly Gly Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 570 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 570 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu 1 5 10 15 Phe Cys Gly Gly Asn Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 571 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 571 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile 1 5 10 15 Glu Phe Cys Gly Gly Asn Tyr Lys Thr 20 25 <210> 572 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 572 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Gly Gly Cys Gly Met Pro 1 5 10 15 Ile Glu Phe Cys Gly Gly Tyr Lys Thr 20 25 <210> 573 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 573 Trp Glu Ser Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe Cys Gly Gly Pro 1 5 10 15 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 <210> 574 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 574 Trp Glu Ser Gly Gly Gly Cys Gly Met Pro Ile Glu Phe Cys Gly Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 20 <210> 575 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 575 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5

Claims (48)

  1. 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드이며,
    상기 변이체 Fc-단편은 12 내지 18개 아미노산의 삽입부를 포함하고,
    표 1에 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용할 때, 상기 삽입부가 아미노산 382 내지 383, 아미노산 383 내지 384, 아미노산 384 내지 385, 아미노산 385 내지 386, 아미노산 386 내지 387, 아미노산 387 내지 388, 또는 아미노산 388 내지 389 사이에 존재하거나, 또는
    상기 EU 넘버링 시스템을 사용할 때, 아미노산 384 내지 386이 결실되고 상기 삽입부가 아미노산 383 내지 387 사이에 존재하고,
    상기 삽입부는
    (1) 처음 3개의 아미노산이 Gly-Gly-Cys이고, 마지막 3개의 아미노산이 Cys-Gly-Gly이거나, 또는
    (2) 처음 4개의 아미노산이 Gly-Gly-Gly-Cys이고, 마지막 4개의 아미노산이 Cys-Gly-Gly-Gly이고,
    상기 삽입부를 함유하지 않는 것을 제외하고는 변이체 Fc-폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 대조군 Fc-폴리펩타이드보다 pH 6.0에서 더 높은 결합 활성으로 인간 신생아 Fc-수용체 (hFcRn)에 결합하며,
    pH 7.4에서 검출되는 잔여 결합 반응이 상기 대조군 Fc-폴리펩타이드를 사용하여 검출되는 것보다 0.1 나노미터 이하로 더 많으며, 여기서 상기 결합 반응은 바이오층 간섭측정(bio-layer interferometry)으로 결정되는 것인
    변이체 Fc-폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    EU 넘버링 시스템을 사용할 때, 변이체 인간 Fc-단편 내의 삽입부가 아미노산 384 내지 385 사이에 존재하는 것인
    변이체 Fc-폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 삽입부의 처음 3개의 아미노산이 Gly-Gly-Cys이고,
    상기 삽입부의 마지막 3개의 아미노산이 Cys-Gly-Gly인
    변이체 Fc-폴리펩타이드.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 삽입부의 처음 3개의 아미노산이 Gly-Gly-Cys이고,
    상기 삽입부의 마지막 3개의 아미노산이 Cys-Gly-Gly인
    변이체 Fc-폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 변이체 Fc-단편 내의 삽입부가,
    서열번호 19 내지 24, 41 내지 53, 67, 90 내지 198, 200 내지 202, 204 내지 215, 217 내지 249, 251, 253 내지 256, 258 내지 265, 268, 269, 271, 273, 274, 277 내지 288, 290, 291, 293, 294, 298 내지 303, 306, 307, 309 내지 311, 314, 317, 320, 321, 323, 324, 327, 329 내지 333, 336, 338 내지 341, 344, 346, 349, 352, 353, 355, 359 내지 367, 369, 372, 373, 및 375 내지 379
    중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 Fc-폴리펩타이드.
  6. 제2항에 있어서, 변이체 Fc-단편 내의 삽입부가,
    서열번호 19 내지 24, 41 내지 53, 67, 90 내지 198, 200 내지 202, 204 내지 215, 217 내지 249, 251, 253 내지 256, 258 내지 265, 268, 269, 271, 273, 274, 277 내지 288, 290, 291, 293, 294, 298 내지 303, 306, 307, 309 내지 311, 314, 317, 320, 321, 323, 324, 327, 329 내지 333, 336, 338 내지 341, 344, 346, 349, 352, 353, 355, 359 내지 367, 369, 372, 373, 및 375 내지 379
    중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 Fc-폴리펩타이드.
  7. 제3항에 있어서, 변이체 Fc-단편 내의 삽입부가,
    서열번호 19 내지 24, 41 내지 53, 67, 90 내지 198, 200 내지 202, 204 내지 215, 217 내지 249, 251, 253 내지 256, 258 내지 265, 268, 269, 271, 273, 274, 277 내지 288, 290, 291, 293, 294, 298 내지 303, 306, 307, 309 내지 311, 314, 317, 320, 321, 323, 324, 327, 329 내지 333, 336, 338 내지 341, 344, 346, 349, 352, 353, 355, 359 내지 367, 369, 372, 373, 및 375 내지 379
    중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 Fc-폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 변이체 Fc-단편 내의 삽입부가
    서열번호 41 내지 45, 97, 127, 180, 208 및 221
    중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인 변이체 Fc-폴리펩타이드.
  9. 제1항에 있어서,
    비-항체 폴리펩타이드를 포함하는 변이체 Fc 융합 단백질이거나,
    VH 영역, VL 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 항체이거나,
    1가 또는 2가이거나, 또는
    다이머 또는 테트라머인
    변이체 Fc-폴리펩타이드.
  10. 제2항에 있어서,
    비-항체 폴리펩타이드를 포함하는 변이체 Fc 융합 단백질이거나,
    VH 영역, VL 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 항체이거나,
    1가 또는 2가이거나, 또는
    다이머 또는 테트라머인
    변이체 Fc-폴리펩타이드.
  11. 제1항의 변이체 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  12. 제2항의 변이체 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  13. 제11항의 핵산을 함유하는 숙주 세포.
  14. 제12항의 핵산을 함유하는 숙주 세포.
  15. 제13항의 숙주 세포를, 상기 핵산이 발현되는 조건 하에 배양하는 단계, 및
    배양 배지 또는 세포 덩어리(cell mass)로부터 상기 발현된 변이체 Fc-폴리펩타이드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 변이체 Fc-폴리펩타이드의 제조 방법.
  16. 제14항의 숙주 세포를, 상기 핵산이 발현되는 조건 하에 배양하는 단계, 및
    배양 배지 또는 세포 덩어리로부터 상기 발현된 변이체 Fc-폴리펩타이드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 변이체 Fc-폴리펩타이드의 제조 방법.
  17. 표 1에 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용할 때, 아미노산 382 내지 383, 아미노산 383 내지 384, 아미노산 384 내지 385, 아미노산 385 내지 386, 아미노산 386 내지 387, 아미노산 387 내지 388, 또는 아미노산 388 내지 389 사이의 부위를 선택하거나, 또는
    상기 EU 넘버링 시스템을 사용할 때, 아미노산 384 내지 386을 결실시키고 아미노산 383 내지 387 사이의 부위를 선택하는 단계, 및
    상기 선택된 부위 내로 펩타이드를 삽입하는 단계
    를 포함하는, 인간 IgG Fc-단편을 포함하는 Fc-폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 방법이며, 여기서 상기 펩타이드는,
    서열번호 41 내지 53, 67, 90 내지 198, 200 내지 202, 204 내지 215, 217 내지 249, 251, 253 내지 256, 258 내지 265, 268, 269, 271, 273, 274, 277 내지 288, 290, 291, 293, 294, 298 내지 303, 306, 307, 309 내지 311, 314, 317, 320, 321, 323, 324, 327, 329 내지 333, 336, 338 내지 341, 344, 346, 349, 352, 353, 355, 359 내지 367, 369, 372, 373, 및 375 내지 379
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  18. 대조군 Fc-폴리펩타이드와 비교할 때 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드에 더 긴 생체내 반감기를 부여하는 인간 IgG 변이체 Fc-단편을 확인하는 방법이며,
    (a) 12 내지 18개 아미노산의 삽입부를 함유하는 Fc-단편을 암호화하는 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계이며,
    표 1에 나타낸 EU 넘버링 시스템을 사용할 때, 상기 삽입부가 아미노산 382 내지 383, 아미노산 383 내지 384, 아미노산 384 내지 385, 아미노산 385 내지 386, 아미노산 386 내지 387, 아미노산 387 내지 388, 또는 아미노산 388 내지 389 사이에 존재하거나, 또는
    상기 EU 넘버링 시스템을 사용할 때, 아미노산 384 내지 386이 결실되고 상기 삽입부가 아미노산 383 내지 387 사이에 존재하고,
    상기 삽입부는
    (1) 처음 3개의 아미노산이 Gly-Gly-Cys이고,
    마지막 3개의 아미노산이 Cys-Gly-Gly이거나, 또는
    (2) 처음 4개의 아미노산이 Gly-Gly-Gly-Cys이고,
    마지막 4개의 아미노산이 Cys-Gly-Gly-Gly
    인 단계,
    (b) 상기 라이브러리에 의해 암호화된 Fc-단편을 스크리닝하여
    (i) 대조군 Fc-단편보다 pH 6에서 더 높은 결합 활성으로 hFcRn에 결합하며
    (ii) pH 7.4에서 검출되는 잔여 결합 반응이 상기 대조군 Fc-폴리펩타이드를 사용하여 검출되는 것보다 0.1 나노미터 이하로 더 많으며, 여기서 상기 결합 활성은 바이오층 간섭측정으로 결정되는 것인
    변이체 Fc-단편을 확인하는 단계,
    (c) 상기 단계 (b)에서 확인된 변이체 Fc-단편을 포함하는 변이체 Fc-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 구성하는 단계이며,
    여기서 상기 변이체 Fc-단편이 아닌 대조군 Fc-단편을 포함하는 대조군 Fc-폴리펩타이드는 동물에게 생체내 투여될 때 그 농도가 시간 경과에 따라 선형으로 감소되는 것으로 알려진 것인 단계,
    (d) 숙주 세포 내로 상기 단계 (c)의 핵산을 도입하고, 상기 핵산에 의해 암호화된 상기 변이체 Fc-폴리펩타이드가 발현될 수 있는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,
    (e) 세포 덩어리 또는 세포 배양 배지로부터 상기 변이체 Fc-폴리펩타이드를 회수하는 단계,
    (f) 동물에게 상기 변이체 Fc-폴리펩타이드를 투여하고, 다른 동물에게 상기 대조군 Fc-폴리펩타이드를 투여하는 단계, 및
    (g) 투여 후 시간 경과에 따라 말초 혈액 내 상기 변이체 및 대조군 Fc-폴리펩타이드의 농도를 측정함으로써 변이체 Fc-폴리펩타이드에 더 긴 생체내 반감기 및 더 큰 노출을 부여하는 변이체 Fc-단편을 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 단계 (a)의 삽입부가 표 1에 예시된 바와 같은 EU 넘버링 시스템을 사용할 때 위치 384 내지 385 사이에 존재하는 것인 방법.
  20. 제1항의 변이체 Fc-폴리펩타이드를 포함하는, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 대사 질환 또는 신경질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  21. 제2항의 변이체 Fc-폴리펩타이드를 포함하는, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 대사 질환 또는 신경질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
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